KR20010083949A - 과민성 반응 유발인자에 의하여 유도되는 스트레스 내성 - Google Patents
과민성 반응 유발인자에 의하여 유도되는 스트레스 내성 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물에 스트레스 내성을 부여하는 것에 관한 것으로서, 이는 식물 또는 상기 식물의 종자로부터 생장한 식물에 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 상기 식물 또는 식물 종자에 비감염성 형태의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 적용함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 상기 유발인자를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자를 제공하고, 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자로부터 얻어지는 식물을 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 재배할 수 있다.
Description
자연 및 농업 조건 하에서, 식물은 다양한 형태의 환경 스트레스에 노출된다. 스트레스는 주로 생장(즉, 생물량 축적) 또는 1차 동화과정(즉, 이산화탄소 및 미네랄 흡수)에 대하여 측정된다. 토양수 부족, 최적 이하 및 최적 이상의 온도, 염분 및 토양의 불충분한 통기 등은 각각 성장기(growing season) 동안 다소의 성장 제한을 초래함으로써, 성장기 말에 식물의 생산량에 있어서 그들의 유전적 잠재력의 일부만이 발현되도록 할 수 있다. 실제로, 미국에서 밭작물의 생산량은 유전적 잠재력의 단지 22%에 불과한 것으로 추정된다. 사막 및 습지와 같은 몇몇 산지에서는 상기에서 언급된 물리화학적 인자가 극단적일 수 있어서, 오직 환경에 특별히 적응한 식물만 특히 불리한 조건에서 그것의 수명주기를 채울 수 있다. 보다 덜 극단적인 환경에서, 개개의 식물은 수분 잠재력, 온도, 염분 및 산소 부족시 이러한 환경에 대한 그들의 적합성이 개선되도록 변화함으로써 순응해 나갈 수 있다. 몇몇 종들은 다른 종들보다 더 잘 적응할 수 있으며, 해부학적, 구조적 및 생화학적으로 다양한 메커니즘이 이러한 순응을 설명해 준다.
천연 및 농업 조건 하에서, 식물은 끊임없이 스트레스를 견뎌 내야 한다. 어떤 환경 인자(예를 들면 고온 또는 저온)는 매우 단시간 내에 많은 스트레스를 줄 수 있고, 또 다른 스트레스(예를 들면, 토양수 함유량 또는 미네랄 영양분)는 식물에 스트레스를 주는데 장시간이 소요될 수 있다. 일반적으로, 식물에 영향을 주는 환경 스트레스는 기후 관련 스트레스, 공기오염 스트레스, 화학적 스트레스 및 영양적 스트레스의 형태가 있을 수 있다. 기후 관련 스트레스의 예로는 가뭄, 홍수, 서리, 저온, 고온, 과도한 빛 및 불충분한 빛을 들 수 있다. 공기오염 스트레스는 이산화탄소, 일산화탄소, 이산화황, NOx, 탄화수소, 오존, 자외선 및 산성비의 형태일 수 있다. 화학적 스트레스는 살충제, 살균제, 제초제 및 중금속의 살포로부터 초래될 수 있다. 영양적 스트레스는 비료, 미량 영양소(micronutrient) 및 다량 영양소(macromutrient)에 의하여 초래될 수 있다.
대부분 식물의 경우, 물은 성장에 있어 필수적이다. 몇몇 식물들은 추후의 사용을 위하여 토양에 약간의 물을 저장하는 반면, 그 밖의 식물들은 가뭄이 시작되기 전의 우기 동안에 그들의 수명주기를 마친다. 또 다른 식물들은 자신들을 지키기 위해 같은 장소의 다른 식물로부터 수분을 탈취하면서 적극적으로 물을 소비할 수 있다. 이러한 능력이 없는 식물은 수분 결핍에 의해 심각한 제한을 받는다.
정상적으로 성장하기에는 너무 낮고 얼 정도까지는 낮지 않은 온도에서 감수성 종들은 냉해(冷害)를 입는다. 이러한 손상은 통상적으로 열대지방 또는 아열대지방 기원의 종들에게서 발생한다. 냉각되는 경우, 잎에서 탈색 현상 또는 병반 현상이 나타나게 되고, 이는 이들 잎에 수침지(water-soaked) 외관을 부여한다. 뿌리가 냉각되면, 식물이 시들 수 있다. 반면, 동결 온도 및 이에 수반되는 식물체 내에서의 얼음 결정의 형성은 얼음 결정이 원형질체로 확장되거나 장시간 동안 유지되는 경우 치명적일 수 있다.
스트레스는 또한 그 이외의 과도한 온도에 의해서도 초래될 수 있으며, 거의 모든 식물은 고온에서 생존할 수 없다. 고등 식물의 세포 또는 조직이 탈수되거나 성장하지 않은 경우, 이들 세포는 수화 세포, 영양 세포 및 성장 중의 세포들보다는 고온에서 잘 생존할 수 있다. 활발하게 성장하고 있는 조직은 45℃를 넘는 온도에서는 거의 생존이 불가능하다.
고농도의 염은 식물을 괴롭힐 수 있는 또 다른 형태의 환경 스트레스이다. 천연 상태에서, 이러한 고농도의 염은 해안과 강어귀 인근에서 발견된다. 이보다 내륙에서는 농업 지역과 인접한 지질 퇴적물로부터 천연염이 스며 나올 수 있다. 또한, 토양으로부터 순수한 물이 증발 또는 발산되는 경우, 관개용수 내에 염이 축적될 수 있다. 관개된 거의 모든 농지는 고농도의 염에 의해 영향을 받게 된다. 고함량의 염은 공극률과 수분 투과율을 감소시킴으로써 식물에 손상을 줄 뿐 아니라 토양의 구조를 열화시킨다.
오존, 이산화탄소, 일산화탄소, 이산화황, NOx및 탄화수소 형태의 공기오염은 스모그 형성 및 주위 온난화를 통해 식물의 성장에 역효과를 초래할 수 있다.
본 발명은 다양한 형태의 환경 스트레스를 극복하고 식물에 이러한 스트레스에 대한 내성을 부여하는 것에 관련된 것이다.
본 발명은 과민성 반응 유발인자(hypersensitive response elicitor)를 사용하여 식물에 스트레스 내성을 부여하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 식물에 스트레스 내성을 부여하기 위한 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 구현예에서, 과민성 반응 유발인자의 단백질 또는 폴리펩타이드는 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 식물 또는 식물 종자에 적용된다. 대안적으로, 스트레스 내성은 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스제닉(transgenic) 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자를 제공하고, 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자로부터 생장한 식물을 재배함으로써 부여된다.
스트레스는 식물의 생리 및 발달에 역효과를 주는 임의의 환경 인자를 포함한다. 이러한 환경 스트레스의 예로는 기후 관련 스트레스(예를 들면, 가뭄, 물, 서리, 저온, 고온, 과도한 빛 및 불충분한 빛), 공기오염 스트레스(예를 들면, 이산화탄소, 일산화탄소, 이산화황, NOx, 탄화수소, 오존, 자외선 및 산성비), 화학적 스트레스(예를 들면, 살충제, 살균제, 제초제 및 중금속) 및 영양적 스트레스(비료, 미량 영양소 및 다량 영양소)가 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따르는 과민성 반응 유발인자를 사용하면 식물에 이러한 형태의 환경 스트레스에 대한 내성이 부여된다는 사실을 발견하였다.
본 발명은 식물에 스트레스 내성을 부여하기 위한 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 구현예에서, 과민성 반응 유발인자의 단백질 또는 폴리펩타이드는 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 식물 또는 식물 종자에 적용된다. 대안적으로, 스트레스 내성은 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자를 제공하고, 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자로부터 생장한 식물을 재배함으로써 부여된다.
본 발명에 따르는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 다양한 진균류 및 박테리아 병원체의 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래된다. 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 유발인자에 접촉된 식물 조직 내에서 국부적인 괴사를 유도할 수 있다. 폴리펩타이드 또는 단백질 유발인자의 적절한 박테리아 공급원의 예로는Erwinia,Pseudomonas, 및Xanthomonas종(예를 들면, 다음과 같은 박테리아:Erwinia amylovora,Erwinia chrysanthemi,Erwinia stewartii,Erwinia carotovora,Pseudomonas syringae,Pseudomonas solancearum,Xanthomonas campestris, 및 이들의 혼합체)을 들 수 있다. 이러한 그람 음성 박테리아 유래의 과민성 반응 유발인자 외에도, 그람 양성 박테리아 유래의 유발인자가 사용될 수 있으며, 이러한 박테리아의 한 예가Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus이다.
과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드의 진균류 공급원의 예로는Phytophthora가 있다. 적절한Phytophthora종에는Phytophthora parasitica,Phytophthora cryptogea,Phytophthora cinnamomi,Phytophthora capsici,Phytophthora megasperma및Phytophthora citrophthora가 있다.
Erwinia chrysanthemi로부터의 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 다음과 같은 SEQ. ID. No. 1에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다:
이러한 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 34kDa의 분자량을 가지며, 열에 안정하고, 16% 이상의 글리신 함량을 가지며, 실질적으로 시스테인을 함유하지 않는다.Erwinia chrysanthemi과민성 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 다음과 같은 SEQ. ID. No. 2에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 DNA 분자에 의하여 코딩된다:
Erwinia amylovora로부터 유래되는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 3에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다:
이러한 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 약 39 kDa의 분자량을 가지며, 약 4.3의 pI를 가지며, 100℃에서 적어도 10분간 열에 안정하다. 이러한 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 실질적으로 시스테인을 실질적으로 함유하지 않는다.Erwinia amylovora로부터 유래되는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant PathogenErwinia amylovora,"(Wei, Z.-M. R.J.Laby, C.H. Zumoff, D.W.Bauer, S.-Y.He, A. Collmer, 및 S.V.Beer,Science257:85-88, 1992)에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 인용된다. 이 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 DNA는 하기와 같은 SEQ. ID. No. 4에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
Erwinia amylovora로부터 유래되는 다른 잠재적으로 적절한 과민성 반응 유발인자는 본 명세서에 참고로 인용된 미국특허출원 제09/120,927호에 제시되어 있다. 이 단백질은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 5에 해당하는 핵산 서열을 가지는 DNA분자에 의하여 코딩된다:
GenBank의 승인번호 제U94513호을 참조한다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 하기와 같은 SEQ. ID. No. 6의 아미노산 서열을 가지는 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩한다:
상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 산성으로서, 글리신 및 세린이 풍부하고 시스테인이 결핍되어 있으며, 열에 안정하고, 프로테아제에 대하여 감수성이고, 식물의 대사 억제제에 의하여 억제된다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드는 약 4.5 kDa의 예상 분자크기를 갖는다.
Erwinia amylovora로부터 유래되는 또 다른 잠재적으로 적절한 과민성 반응 유발인자는 본 명세서에 참고로 인용된 미국특허출원 제09/120,633호에 제시되어 있다. 이 단백질은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 7의 핵산 서열을 가지는 DNA 분자에의하여 코딩된다:
상기 DNA 분자는Erwinia amylovora에 대한 dspE 유전자로서 공지되어 있다. 이러한 본 발명의 분리된 DNA 분자는 하기와 같은 SEQ. ID. No. 8의 아미노산 서열을 가지는 식물 병원체의 과민성 반응을 유발하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩한다:
상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 약 198 kDa이며 8.98의 pI를 갖는다.
본 발명은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 9의 핵산 서열을 가지는 분리된 DNA 분자에 관한 것이다:
상기 DNA 분자는 dspE 유전자로 공지되어 있다. 이러한 본 발명의 분리된 DNA 분자는 하기 SEQ. ID. No. 10의 아미노산 서열을 가지는 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩한다:
이러한 단백질 또는 폴리펩타이드의 분자량은 약 16 kDa이며 4.45의 PI를 갖는다.Pseudomonas syringae로부터 유래되는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 11에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다:
상기 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 34-35 kDa의 분자량을 가지며, 글리신이 풍부하고(약 13.5%), 시스테인과 티로신이 결핍되어 있다.Pseudomonas syringae로부터 유래되는 과민성 반응 유발인자에 대한 추가의 정보는 "Pseudomonas syringaepv.syringaeHarpinPss: a Protein that is secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants,"(He,S.Y., H.C. Huang, 및 A.Collmer,Cell73:1255-1266, 1993)에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 인용된다.Pseudomonas syringae로부터 유래되는 과민성 반응 유발인자를 코딩하는 DNA 분자는 하기와 같은 SEQ. ID. No. 12에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
Pseudomonas syringae로부터 유래되는 다른 적절한 과민성 반응 유발인자는 본 명세서에 참고로 인용된 미국출원 제09/120,817호에 제시되어 있다. 이 단백질은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 13의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
상기 DNA 분자는Pseudomonas syringae에 대한 dspE 유전자로서 공지되어 있다. 이러한 본 발명의 분리된 DNA 분자는 하기와 같은 SEQ. ID. No. 14의 아미노산 서열을 가지는 식물 병원체의 과민성 반응을 유발하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩한다:
상기 단백질 또는 폴리펩타이드의 분자량은 약 42.9 kDa이다.
Pseudomonas solanacearum으로부터 유래되는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 15에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다:
이는 하기와 같은 SEQ. ID. No. 16에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 DNA 분자에 의하여 코딩된다:
Pseudomonas solanacearum으로부터 유래되는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질에 대한 자세한 정보는 "PopA1, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway ofPseudomonas solanacearum,"(Arlat, M.,F.Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet, 및 C.A. Boucher,EMBO J. 13:543-533, 1994)에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 인용된다.
Xanthomonas campestrispv. glydines 유래의 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 17에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다:
이 서열은Xanthomonas campestrispv. glycines의 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질로부터의 단지 26개의 잔기를 가지는 아미노 말단 서열이다. 이것은 다른Xanthomonas campestris pathovars에서 결정된 가장자리의(fimbrial) 서브유닛 단백질과 일치한다.
Xanthomonas campestris pv. pelargonii유래의 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 열에 안정하고, 프로테아제에 민감하며, 20 kDa의 분자량을 갖는다. 이것은 하기와 같은 SEQ. ID. No. 18에 해당하는 아미노산 서열을 포함한다:
Erwinia carotovora의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드의 분리 방법은 본 명세서에 참고로 인용된 "The RsmA Mutants ofErwinia carotovorasubsp.carotovoraStrain Ecc71 OverexpresshrpNEccand Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tabacco Leaves."(Cui et al.,MPMI, 9(7):565-73, 1996)에 제시되어 있다.Erwinia stewartii의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드는 본 명세서에 참고로 인용된 "Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity ofErwinia stewartiion Maize,"(Ahmad et al.,8th Int'l. Cong. Molec. Plant-Microbe Interact., July 14-19, 1996) 및 "Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity ofErwinia stewartiion Maize,"(Ahmad, et al.,Ann. Mtg. Am. Phytopath. Soc., July 27-31, 1996)에 기재되어 있다.
Phytophthora parasitica,Phytophthora cryptogea,Phytophthora cinnamomi,Phytophthora capsici,Phytophthora megasperma, 및Phytophthora citrophthora유래의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드는 "Extracellular Protein Elicitors from Phytophthora: Most Specificity and Induction of Resistance to Bacterial and Fungal Phytopathogens,"(Kaman, et al.,Molec. Plant-Microbe Interact.,6(1):15-25, 1993), "Structure and Activity of Proteins from Pathogenic fungi Phytophthora Eliciting Necrosis and Acquired Resistance in Tabacco,"(Ricci et al.,Eur. J. Biochem., 183:555-63, 1989), "Differential Production of Parasiticein, and Elicitor of Necrosis and Resistance in Tabacco, by Isolates of Phytophthora parasitica,"(Ricci et al.,Plant Path.41:298-307, 1992), "A New Elicitor of HypersensitiveResponse in Tabacco: A Fungal Glycoprotein Elicits Cell Death, Expression of Defence Genes, Production of Salicylic Acid, and Induction of Systemic Aquired Resistance,"(Baillreul et al.,Plant J., 8(4):551-60, 1995), 및 "Acquired Resistance Triggered by Elicitors in Tabacco and Other Plants,"(Bonnet et al.,Eur.J. Plant Path., 102:181-92, 1996)에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용된다.
본 발명에 따르는 또 다른 과민성 반응 유발인자는 본 명세서에 참고로 인용된 미국특허출원 제09/136,625호에 상세히 기재된Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus로부터 유래된다.
상기의 유발인자들은 예시적인 것이다. 다른 유발인자들은 유발인자를 코딩하는 유전자가 발현되는 조건 하에서 과민성 반응을 유도하는 진균류 또는 박테리아의 성장에 의하여 동정될 수 있다. 배양물의 상청액으로부터 얻은 무세포 조제액을 적합한 식물 조직에 침윤시킴으로써, 이들의 유발인자 활성(즉 국부 괴사)에 대하여 테스트할 수 있다.
상기 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질의 단편뿐 아니라 다른 병원체로부터 유래되는 완전한 길이를 가지는 유발인자의 단편들도 본 발명에 포함된다.
적절한 단편들은 몇몇 다른 방법에 의하여 제조될 수 있다. 먼저, 종래의 분자 유전자 조작법을 사용해 유전자 단편을 서브클로닝하여 공지된 유발인자 단백질을 코딩하는 유전자의 서브클론을 제조한다. 이어서, 상기 서브클론을 박테이아세포 내에서 시험관내 또는 생체내 발현시켜 보다 작은 단백질 또는 펩타이드를 제조하여, 하기 기재된 절차에 따라 유발인자의 활성에 대하여 테스트할 수 있다.
대안적인 방법으로, 키모트립신이나 스타필로코코스(Staphylococcus) 프로테이나아제 A, 또는 트립신과 같은 단백질 분해효소를 사용해 완전한 길이의 유발인자 단백질을 분해하여 유발인자 단백질의 단편들을 제조할 수 있다. 서로 다른 단백질 분해효소는 유발인자 단백질의 아미노산 서열에 기초하여 서로 다른 자리에서 유발인자 단백질을 분해한다. 단백질 분해로부터 얻어지는 단편들 중 몇몇은 내성을 가지는 활성 유발인자일 수 있다.
단백질의 1차 구조에 대한 지식에 기초하는 또 다른 방법에서는, 단백질의 특정 부분을 나타내도록 선택된 특정 프라이머 세트와 PCR 기술을 이용하여 유발인자 단백질 유전자의 단편들을 합성할 수 있다. 그런 다음, 이들은 절단된 펩타이드 또는 단백질을 발현시키기 위하여 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
또한, 적합한 단편을 제조하는 데 화학적 합성이 이용될 수 있다. 이러한 합성 방법은 생성되는 유발인자에 대한 공지된 아미노산 서열을 사용하여 수행된다. 대안적으로, 완전한 길이의 유발인자를 고온과 고압에 노출시킴으로써 단편을 제조할 수 있다. 이어서, 이들 단편들은 종래의 방법(예를 들면, 크로마토그래피, SDS-PAGE)에 의하여 분리될 수 있다.
과민성 반응을 유도하지 않는 과민성 반응 유발인자의 적절한 단편의 예로는Erwinia의 단편이 있다. 적절한 단편들은 SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 C-말단 단편, SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 N-말단 단편, 또는 SEQ. ID. No. 3의아미노산 서열의 내부 단편(internal fragment)을 포함한다. SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 C-말단 단편은 SEQ. ID. No. 3의 아미노산 169와 403, 210과 403, 267과 403, 또는 343과 403에 걸치는 범위일 수 있다. SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 내부 단편은 SEQ. ID. No. 3의 105와 179, 137과 166, 121과 150, 또는 137과 156에 걸치는 범위일 수 있다. 다른 적절한 단편들도 본 발명에 따라 동정될 수 있다.
과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자의 다른 적절한 단편의 예로는Erwinia amylovora의 단편들이 있으며, 이들 단편은 SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 C-말단 단편, SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 N-말단 단편, 또는 SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 내부 단편을 포함한다. SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 C-말단 단편은 SEQ. ID. No. 3의 아미노산 105와 403에 걸치는 범위일 수 있다. SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 N-말단 단편은 SEQ. ID. No. 3의 아미노산 1과 98, 1과 104, 1과 122, 1과 168, 1과 218, 1과 266, 1과 342, 1과 321 및 1과 372에 걸치는 범위일 수 있다. SEQ. ID. No. 3의 아미노산 서열의 내부 단편은 SEQ. ID. No. 3의 아미노산의 76과 209, 105와 209, 99와 209, 137과 204, 137과 200, 109와 204, 109와 200, 137과 180 및 105와 180에 걸치는 범위일 수 있다.
적합한 DNA 분자는 엄격한 조건 하에서 SEQ. ID. No. 2, 4, 5, 7, 9, 12, 13 및 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자와 혼성화하는 것들이다. 매우 엄격한 조건의 예는 65℃하의 1M NaCl, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 10 mM EDTA, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 0.2% 피콜(ficoll), 0.2% 폴리비닐필롤리돈, 0.2%의소의 혈청 알부민 및 50 ㎛g/㎖의E. coliDNA를 함유하는 배지 내에서 20시간 동안 혼성화가 수행되는 경우이다.
예를 들면, 폴리펩타이드의 특성, 2차 구조 및 수치료법 특성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가에 의하여 변종(variant)이 만들어질 수 있다. 예를 들면, 단백질의 번역과 동시에 또는 번역된 후에 전달되는 단백질의 N-말단에 위치하는 신호(또는 리더) 서열에 폴리펩타이드를 결합시킬 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위하여 링커 또는 다른 서열에 연결될 수 있다.
본 발명의 과민성 반응 유발인자는 종래의 방법에 의하여 분리된 형태(즉, 그들의 숙주 유기체로부터 분리된 형태), 보다 바람직하게는 정제된 형태(바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 바람직하게는 80% 순수한 형태)로 제조되는 것이 바람직하다. 통상적으로, 본 발명의 과민성 반응 유발인자는 생성되기는 하지만, 재조합 숙주 세포의 성장배지로 분비되지는 않는다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드는 대안적인 방법으로 성장배지로 분비된다. 분비되지 않는 단백질의 경우, 단백질 단편을 분리하기 위하여 재조합 플라스미드를 가지는 숙주 세포(예를 들면,E. coli)를 증식시키고, 초음파 처리, 열처리 또는 화학적 처리로 용균시켜서, 균등액을 원심분리하여 박테리아 잔해를 제거한다. 이어서, 상층액을 열처리한 뒤, 원심분리하여 과민성 반응 유발인자를 분리한다. 상기 과민성 반응 유발인자를 함유하는 상층 분액을 적절한 크기의 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 칼럼에서 겔 여과하여 단편을 분리한다. 필요에 따라 단백질 분액을 이온 교환 또는 HPLC에 의해추가 정제할 수 있다.
과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 종래의 재조합 DNA 기술을 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 일반적으로, 이 방법은 DNA 분자가 이질적인(heterologous)(즉, 정상적으로는 존재하지 않는) 발현 시스템에 상기 DNA 분자를 삽입하는 단계를 포함한다. 이러한 이질 DNA 분자는 인식 배향(sense orientation)으로 정확한 리딩 프레임의 발현 시스템 또는 벡터에 삽입된다. 상기 벡터는 삽입된 단백질-코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유한다.
본 명세서에 참고로 인용된 미국특허 제4,237,224호(발명자: Cohen and Boyer)는 제한 효소 절단 및 DNA 리가아제에 의한 결찰을 이용하여 재조합 플라스미드 형태의 발현 시스템을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 이어서, 이들 재조합 플라스미드는 형질전환에 의하여 도입되어 조직 배양액 내에서 성장한 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함하는 단세포 배양액 내에서 복제된다.
또한, 재조합 유전자는 우두(vaccina) 바이러스와 같은 바이러스에 도입될 수도 있다. 재조합 바이러스는 바이러스에 감염된 세포 내로 플라스미드를 트랜스펙션(transfection)시켜 만들 수 있다.
적절한 벡터로는 람다 백터 시스템 gt11, gtWES.tB, Charon 4와 같은 바이러스 벡터 및 pBR322, pBR325, pVAYC177, pACYC1084, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101, pBluescript Ⅱ SK +/- 또는 KS +/-와 같은 플라스미드 벡터, SV 40("Stratagene Cloning Systems" Catalog(1993) from Stratagene,La Jolla, Calif 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), pQE, PIH821, pGEX, pET 시리즈(F.W. Studier et al., "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes,"Gene Expression Technologyvol. 185(1990) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 및 이들의 유도체가 사용될 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 형질전환, 특히 형질도입, 접합(conjugation), 이동(mobilization) 또는 전기천공법(electroporation)에 의하여 도입될 수 있다. DNA 서열은 본 명세서에 참고로 인용된Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(Sambrook et al., Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York, 1989)에 제시된 바와 같이 당 기술분야의 표준 클로닝 방법에 따라 벡터에 클로닝된다.
단백질-코딩 서열(들)을 발현시키기 위해서는 다양한 숙주-벡터 시스템이 사용될 수 있다. 우선, 벡터 시스템으로는 사용되는 숙주 세포에 적합해야 한다. 숙주-벡터 시스템은 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물; 바이러스(예를 들면, 우두 바이러스, 아데노바이러스 등)에 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예를 들면, 배쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 및 박테리아로 감염된 식물 세포가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들 벡터의 발현 인자들은 그들의 강도 및 특이성에 있어서 다양하다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라 많은 적합한 전사 및 번역 요소들 중 어느 것이라도 사용될 수 있다.
상이한 유전 신호 및 프로세싱 현상이 유전자 발현에 있어 많은 단계[예를들면, DNA 전사 및 전령 RNA(mRNA) 번역]를 조절한다.
DNA의 전사는 RNA 폴리머라아제를 결합시켜 mRNA의 합성을 촉진하는 DNA 서열인 프로모터의 존재에 따라 결정된다. 진핵생물의 프로모터의 DNA 서열은 원핵생물의 프로모터의 서열과 상이하다. 더욱이, 진핵생물의 프로모터와 이에 수반되는 유전 신호는 원핵생물의 시스템에서 인식되지 못하거나 기능하지 못할 수 있으며, 원핵생물의 프로모터는 진핵생물의 세포에서 인식되지 못하고 기능하지 못한다.
유사하게, 원핵생물 내에서 mRNA의 번역은 진핵생물의 신호와 다른 적절한 원핵생물의 신호의 존재에 따라 좌우된다. 원핵생물 내에서 효과적인 mRNA의 번역에는 mRNA 상에 Shine-Dalgano("SD") 서열로 불리는 리보솜 결합 자리가 요구된다. 이 서열은 단백질의 아미노 말단 메티오닌을 코딩하는 개시 코돈, 일반적으로 AUG의 앞에 위치하는 mRNA의 짧은 뉴클레오타이드 서열이다. SD 서열은 16S rRNA(리보솜 RNA)의 3' 말단에 상보적이며, rRNA와 이중나선을 형성함으로써 리보솜과 mRNA의 결합을 촉진하여 리보솜이 정확하게 위치하도록 한다. 유전자 발현을 최대화하는 방법은Method in Enzymology(Robert and Lauer, 68:473, 1979)에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 인용된다.
프로모터는 "강도(strength)"(즉, 전사를 촉진하는 능력)에 있어서 다양하다. 클로닝된 유전자를 발현시키기 위하여, 강한 프로모터를 사용하여 높은 수준의 전사 및 유전자 발현을 유도하는 것이 바람직하다. 사용되는 숙주 세포 시스템에 따라 다수의 적절한 프로모터 중 어느 것이라도 사용될 수 있다. 예를 들면,E. coli,E. coli의 박테리오파아지, 또는 플라스미드 내에 클로닝되는 경우, T7 파아지 프로모터,lac프로모터,trp프로모터,recA프로모터, 리보솜 RNA 프로모터, 콜리파아지 람다의 PR및 PL프로모터 및lacUV5,ompF,bla,lpp등과 같은 그 밖의 프로모터가 인접 DNA 분절의 높은 수준의 전사를 유도하는 데 사용될 수 있다. 부가적으로, 재조합 DNA 또는 기타 합성 DNA 기술에 의하여 제작되는 하이브리드trp-lacUV5(tac) 프로모터 또는 다른E. coli프로모터가 삽입된 유전자의 전사를 유도하는 데 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포 균주 및 발현 벡터는 특이적으로 유도되지 않는 한, 프로모터의 작용을 저해하도록 선택될 수 있다. 일정 작동에 있어서, 삽입된 DNA의 효과적인 전사에는 특정 유도인자(inducer)의 부가가 필요하다. 예를 들면,lac오페론은 락토오스 또는 IPTG(이소프로필티오-베타-D-갈락토사이드)의 부가에 의하여 유도된다.trp,pro등과 같은 그 밖의 다양한 오페론은 상이한 통제하에 있다.
또한, 원핵생물 세포 내에서의 효과적인 유전자의 전사 및 번역에는 특정 개시 신호가 요구된다. 이러한 전사 및 번역 개시 신호는 합성된 각각의 유전자 특이적 mRNA 및 단백질의 양에 의하여 측정되는 "강도"에 있어서 다를 수 있다. 프로모터를 함유하는 DNA 발현 벡터는 다양한 "강한" 전사 및/또는 번역 개시 신호의 임의의 조합체를 함유할 수 있다. 예를 들면,E. coli내에서의 효과적인 번역에는 리보솜 결합 자리를 제공하는 개시 코돈("ATG")의 5' 쪽으로 약 7개 내지 9개염기의 SD 서열이 요구된다. 따라서, 숙주 세포의 리보솜에 의하여 사용될 수 있는 임의의 SD-ATG 조합체가 사용될 수 있다. 이러한 조합체는 콜리파아지 람다의cro유전자나N유전자, 또는E.coli트립토판 E, D, C, B 또는 A 유전자 유래의 SD-ATG 조합체를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 재조합 DNA 또는 합성 뉴클레오타이드의 결합을 포함하는 기타 방법에 의하여 제조되는 SD-ATG 조합체도 사용될 수 있다.
과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 분리된 DNA 분자는 발현 시스템에 클로닝되면, 숙주 세포로 도입될 수 있는 상태로 된다. 그러한 도입은 벡터/숙주 세포 시스템에 따라 상기에서 언급된 다양한 형태의 형질전환에 의하여 수행될 수 있다. 숙주 세포로는 박테리아, 바이러스, 효모, 포유류 세포, 곤충, 식물 등이 적합하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
식물에 스트레스 내성을 부여하는 본 발명의 방법은 상기 유발인자가 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서, 비감염성 형태의 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 식물 또는 식물 종자의 일부 또는 전체에 적용하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 식물에 적용하여 그 식물로부터 회수되는 종자 자체가 식물에서 스트레스 내성 부여하도록 할 수 있다.
식물 또는 그의 종자로부터 생장한 식물에 스트레스 내성을 부여하기 위하여 식물 또는 식물 종자에 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 적용하는 대안적인 방법으로서, 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자가 사용될수 있다. 트랜스제닉 식물을 사용하는 경우, 이러한 방법에는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스제닉 식물을 제공하고, DNA 분자가 식물에 스트레스 내성을 부여하는 데 효과적인 조건 하에서 상기 식물을 재배하는 단계가 수반된다. 대안적으로, 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스제닉 식물의 종자를 제공하거나 토양에 심을 수 있다. 그런 다음, DNA 분자가 식물에 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 심어진 종자로부터 식물을 증식한다.
과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질이 식물 또는 식물 종자에 적용되는 본 발명의 구현예는 1) 분리된 과민성 반응 유발인자의 적용 또는 2) 질병을 야기하지 않고 유발인자를 코딩하는 유전자로 형질전환된 박테리아의 적용를 포함하는 여러 가지 방식으로 수행될 수 있다. 후자의 방식으로 실시되는 구현예에서, 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 함유하는 박테리아의 적용에 의하여 상기 유발인자가 식물 또는 식물 종자에 적용될 수 있다. 이러한 박테리아는 상기 유발인자를 분비하거나 배출하여 상기 유발인자를 식물 또는 식물 종자 세포와 접촉시킬 수 있어야 한다. 이들 구현예에서, 상기 유발인자는 식물내(in planta) 또는 종자 상에서 박테리아에 의하여 생성되거나, 식물 또는 식물 종자에 박테리아를 도입하기 직전에 생성된다.
본 발명의 방법은 다양한 식물 또는 식물 종자를 처리하여 스트레스 내성을 부여하는 데 사용될 수 있다. 적합한 식물로는 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물이 포함된다. 그 중에서도 자주개자리, 쌀, 밀, 보리, 호밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 강낭콩, 완두, 치커리, 상추, 꽃상추, 캐비지, 양배추, 비트, 파스닙, 순무, 콜리플라워, 브로콜리, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 샐러리, 당근, 스쿼시, 호박, 서양호박, 오이, 사과, 배, 멜론, 감귤, 딸기, 포도, 나무딸기, 파인애플, 대두, 담배. 토마토, 수수, 및 사탕수수와 같은 농작물이 특히 유용하다. 적당한 관상식물의 예로는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 세인트폴리아(Saintpaulia), 페츄니아, 펠라고늄, 포인세티아, 국화, 카네이션, 및 지니아를 들 수 있다.
본 발명에 따르면, "스트레스"라는 용어는 가뭄, 염, 저온(예를 들면, 서리), 화학물질 처리(예를 들면, 살충제, 살균제, 제초제, 비료), 물, 과도한 빛 및 불충분한 빛을 의미한다.
과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질의 적용을 포함하는 본 발명의 방법은 잎, 줄기, 뿌리 등을 비롯한 식물 전체 또는 일부에 처리하는 경우, 다양한 절차를 통하여 수행될 수 있다. 이것은 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 식물에 침윤시키는 것을 포함할 수 있으나, 꼭 필요한 것은 아니다. 적절한 적용방법으로는 유발인자가 적용될 시기에 고압 또는 저압 분사법, 주입법 및 잎의 마모법이 있다. 본 발명의 적용예에 따라 식물 종자 또는 영양 번식체[propagule; 예를 들면, 꺾꽂이(cuttings)]를 처리하는 경우, 본 발명에 따르는 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드는 저압 또는 고압 분사, 코팅, 침지 또는 주입법에 의하여 적용될 수 있다. 식물 또는 식물 종자의 세포와 상기 유발인자를 접촉시킬 수 있는 다른 적당한 적용방법이 당업자에 의하여 구상될 수 있다. 일단, 본 발명의 과민성 반응 유발인자로 처리되면, 종자를 천연 또는 인공 토양에 심을 수 있고 종래의 방법에 의하여 재배하여 식물을 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 처리된 종자로부터 식물이 증식된 후 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 1회 이상 적용하여 식물에 질병 내성을 부여할 수 있다.
상기 본 발명에 따르는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 단독으로 또는 다른 물질과 혼합되어 식물 또는 식물 종자에 적용될 수 있다. 대안적으로, 상기 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질은 다른 물질과 개별적으로 서로 다른 시기에 식물에 적용될 수도 있다.
본 발명의 적용예에 따라 식물 또는 식물 종자를 처리하는 데 적합한 조성물은 담체 내에 과민성 반응을 유도하지 않는 과민성 반응 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질을 함유한다. 적절한 담체로는 물, 수용액, 슬러리 또는 건조 분말이 있다. 이 구현예에서 상기 조성물은 500 nM 이상의 유발인자를 함유한다.
필요한 것은 아니지만, 상기 조성물은 비료, 살충제, 살균제, 살선충제(nematacide) 및 이들의 혼합물을 포함하는 부가의 첨가제를 함유할 수 있다. 적절한 비료로는 (NH4)2NO3를 들 수 있다. 적절한 살충제의 예로는 말라티온(Malathion)이 있다. 살균제로는 캡탄(Captan)이 유용하다.
다른 적당한 첨가제로는 완충제, 습윤제, 코팅제, 및 마모제를 들 수 있다. 이들 물질들은 본 발명의 방법을 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 과민성 반응 유발인자는 종래의 종자 제형(formulation) 및 점토와 다당류를 포함하는 처리물질과 함께 식물 종자에 적용될 수 있다.
트랜스제닉 식물 및 트랜스제닉 종자의 사용이 수반되는 본 발명의 다른 구현예에서, 과민성 반응 유발인자는 통상적으로 상기 식물 또는 종자에 적용될 필요는 없다. 그 대신, 이러한 유발인자를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스제닉 식물이 당 기술분야에 공지된 방법에 의하여 제조된다.
상기 기재된 벡터는 재조합 DNA를 기계적으로 전달하는 마이크로피펫을 사용하여 식물세포에 직접 마이크로인젝션될 수 있다(Crossway,Mol. Gen. Genetic,202:179-85(1985) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다). 상기 유전 물질은 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 식물세포에 전달될 수 있다(Krens, et al.,Nature, 296:72-74(1982) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다).
유전자로 식물 세포를 형질전환하는 다른 방법으로 숙주 세포의 입자 충격법(particle bombardment; biolistic transformation라고도 함)이 있다. 이는 여러 가지 방법 중 하나로 수행될 수 있다. 그 첫 번째로는 세포에서 불활성 또는 생물학적으로 활성인 입자를 추진시키는(propelling) 것이 있다. 이 기술은 미국특허 제4,945,050호, 제5,036,006호 및 제5,100,792호(발명자: Sanford et al.)에 기재되어 있으며, 상기 특허들은 본 명세서에 참고로 인용된다. 일반적으로, 이 방법은 세포의 외부 표면을 관통하여 그 내부에 주입되기에 효과적인 조건 하에서 세포에서 불활성 또는 생물학적으로 활성의 입자를 추진시키는 과정을 수반한다. 불활성 입자가 사용되는 경우, 벡터는 이질 DNA를 함유하는 벡터로 입자를 코팅하여 세포로 도입될 수 있다. 대안적인 방법으로, 표적 세포를 벡터로 둘러쌈으로써 상기 벡터가 입자의 웨이크(wake)를 통해 세포 내로 도입되도록 할 수 있다. 생물학적으로 활성인 입자(예를 들면, 벡터 또는 이종 DNA를 함유하는 건조 박테리아 세포)도 식물 세포 내로 추진될 수 있다.
또 다른 도입 방법으로는, 미니 세포(minicell), 세포, 리소좀 또는 다른 융합 가능한 지질-표면 물질 중 어느 하나와 원형질체(protoplast)를 융합하는 방법이 있다(Fraley, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1859-63(1982) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다).
DNA 분자는 전기천공법에 의하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다(Fromm et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5284(1985) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다). 이 방법에서 식물 원형질체는 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 존재하에서 전기천공된다. 높은 전기장 강도의 전기 충격은 생체막을 가역적으로 투과성이 되도록 하여 플라스미드를 도입시킨다. 전기 천공된 식물 원형질체는 세포벽을 재형성하고, 분열 및 재생한다.
DNA 분자를 식물 세포로 도입하는 또 다른 방법은 상기 유전자로 미리 형질전환된Agrobacterium tumefaciens또는A. rhizogenes로 식물 세포를 감염시키는 것이다. 당 기술분야에 공지된 적합한 조건 하에서 상기 형질전환된 식물 세포는 가지(shoot)와 뿌리를 형성하고, 더 나아가 식물로 생장한다. 일반적으로, 이 방법에는 박테리아의 현탁액을 식물조직에 접종하고 항생제가 존재하지 않는 25-28℃의 재생(regeneration) 배지에서 48 내지 72 시간 동안 상기 조직을 배양하는 단계가 수반된다.
아그로박테리아는 그람-음성류의 라이조비아세아(Rhizobiaceae)의 대표적인 종이다. 이 종들은 근두암종(A. tumefaciens) 및 모근(hairy root) 질환(A. rhizogenes)의 원인이 된다. 근두암종 종양과 모근 내의 식물세포는 박테리아에 의해서만 대사 분해되는 오파인(opines)이라 알려진 아미노산 유도체를 생산하도록 유도된다. 오파인의 발현을 담당하는 박테리아 유전자는 키메라 발현 카세트에 대한 조절 요소(control elements)의 용이한 공급원이다. 또한, 오파인의 존재여부에 대한 분석은 형질전환된 조직을 동정하는 데 사용될 수 있다.
이종 유전자 서열이A. tumefaciens의 Ti 플라스미드 또는A. rhizogenes의 Ri 플라스미드에 의하여 적합한 식물 세포로 도입될 수 있다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 아그로박테리아에 의하여 감염된 식물세포에 전달되어 식물의 게놈에 안정적으로 통합된다(J. Schell,Science, 237:1176-83(1987), 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨).
형질전환 후, 상기 형질전환된 식물 세포는 재생산되어야 한다.
배양된 원형질체로부터의 식물 재생산은Handbook of Plant Cell, Vol. 1: (Evans et al., MacMillan Publishing Co., New York, 1983); 및Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants(Vasil I.R.(ed.), Acad. Press, Orlando, Vol. Ⅰ, 1984, and Vol. Ⅲ, 1986)에 제시되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용된다.
실질적으로 모든 식물들은 사탕수수, 사탕무, 목화, 과수, 및 콩과식물의 주요한 모든 종들을 포함하는 배양 세포 또는 조직으로부터 재생산될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
재생산 수단은 식물의 종에 따라 다양하지만, 일반적으로는 형질전환된 원형질체의 현탁액 또는 형질전환된 외식편(explant)을 함유하는 페트리 플레이트가 1차적으로 제공된다. 유합(癒合) 조직이 형성되고 가지가 유합 조직으로부터 유도된 다음 뿌리가 형성될 수 있다. 대안적으로, 상기 유합 조직 내에서 배(embryo) 형성이 유도될 수 있다. 이들 배는 자연적으로 형성된 배로서 발아하여 식물이 된다. 상기 배양액은 일반적으로 다양한 아미노산 및 옥신과 시토키닌과 같은 호르몬을 함유한다. 또한, 옥수수 및 자주개자리와 같은 종들의 경우에는 특히, 글루타민산과 프롤린을 배지에 첨가하는 것이 유리하다. 효과적인 재생산은 배지, 유전자형, 배양 내력에 따라 좌우될 것이다. 이들 세 가지 변수가 조절되면, 일반적으로 재생산은 재현 가능하고 반복 가능하다.
상기 발현 카세트는 트랜스제닉 식물에 안정적으로 주입된 후, 성 교배에 의하여 다른 식물로 옮겨진다. 교배되는 종에 따라 다수의 표준 육종(breeding) 방법 중 하나가 사용될 수 있다.
이러한 유형의 트랜스제닉 식물이 생산되면, 그 식물 자체는 식물에 질병 내성, 식물의 생장 증진, 및/또는 곤충 방제능을 부여하는 과민성 반응 유발인자를 코딩하는 유전자가 존재하도록 종래의 방법에 의하여 재배될 수 있다. 대안적으로, 트랜스제닉 종자 또는 영양 번식체(예를 들면, 꺾꽂이)를 트랜스제닉 식물로부터 회수한다. 그런 다음, 상기 종자를 토양에 심고 종래의 방법에 따라 재배하여트랜스제닉 식물을 생산한다. 식물에 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 심겨진 트랜스제닉 종자로부터 트랜스제닉 식물을 증식시킨다. 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 이러한 스트레스 내성은 RNA에 의하여 매개될 수 있으며, 상기 유발인자 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현에 기인할 수도 있다.
트랜스제닉 식물 또는 식물 종자가 본 발명에 따라 사용되는 경우, 본 발명에 따르는 과민성 반응 유발인자가 적용되는 식물 및 종자를 처리하는 데 사용된 것과 동일한 물질을 상기 트랜스제닉 식물 또는 식물 종자에 부가적으로 처리할 수 있다. 본 발명에 따르는 과민성 반응 유발인자를 포함하는 이러한 기타 물질들은 고압 또는 저압 분사법, 주입법, 코팅법, 및 침지법을 포함하는 상기에 기재된 방법에 의하여 트랜스제닉 식물 및 식물 종자에 적용될 수 있다. 유사하게, 트랜스제닉 식물 종자로부터 식물이 증식된 후, 본 발명에 따르는 하나 이상의 과민성 반응 유발인자를 스트레스 내성을 부여할 수 있다. 이러한 식물들은 또한 종래의 식물 처리제(살충제, 비료 등)로 처리될 수 있다.
실시예 1- 과민성 반응 유발인자 처리된 목화는 살충제 스트레스에 의해 초래되는 손상에 대하여 보다 큰 내성을 갖는다.
진딧물(Aphids gossypii)은 목화의 성장기 전반에 걸쳐 감염을 일으킨다. 진딧물 감염에 의한 피해의 범위는 조면(繰綿)을 오염시키고 작물의 가치를 하락시키는 감로의 침착에서부터 작물을 감소 또는 파괴하는 고엽에까지 이른다. 진딧물 감염으로부터 식물을 보호하기 위하여, 감염 정도가 그다지 크지 않은 경우에는 예를 들면 Asana XL과 같은 살충제가 목화에 분무되고, 감염 정도가 큰 경우에는 Admire와 같은 살충제가 분무되는 것이 일반적이다. 무작위적인 완전 차단 과정을 수반하는 실험을 통해 목화에서 진딧물에 대한 과민성 반응 유발인자의 효과를 연구하였다. 상기 실험에는 20, 60 및 80 ppm의Erwinia amylovora과민성 반응 유발인자(즉, HP-1000™) 및 화학 살충제인 Asana XL을 8 oz./ac.의 비율로 처리하는 과정이 수반되었다. 각각의 처리에는 배낭 분무기를 사용하여 떡잎 시기 내지 3개의 참잎이 나온 시기에 시작되어 이후부터 14일 간격으로 이루어지는 잎면 살포가 수반된다. 첫 번째 처리("DAT 1") 후 14일, 28일, 35일 및 42일 뒤의 분무 살포 직전에 진딧물의 수를 세고 목화의 전반적인 성장을 측정하였다. 처음 세 차례의 시험 당일에 구획마다 무작위적으로 선택된 25개의 잎을 수집하고, 마지막 시험 당일에 구획 당 상기 잎들을 수집하였다.
결 과
1. 진딧물 방제(control): 과민성 반응 유발인자 처리된 목화에 대한 진딧물의 수는 화학 처리된 목화에 비하여 현저하게 감소되었다(표 1 참조).
< 표 1 > Asana XL™ 또는 HP-1000™ 처리 후 목화 잎사귀 한 개당 진딧물의 수
| 잎사귀 한 개당 진딧물의 수1분무 횟수/처리후 경과일수 | |||||
| 처리 | 비율2 | 1/14 DAT1 | 2/28 DAT1 | 3/35 DAT1 | 4/42 DAT1 |
| Asana XL™ | 8 oz/ac | 0.2 a | 32.2 a | 110.0 a | 546.9 a |
| HP-1000™ | 20 ㎍/㎖ | 0.2 a | 7.8 b | 22.9 b | 322.1 a |
| HP-1000™ | 60 ㎍/㎖ | 0.1 a | 4.9 b | 34.6 b | 168.3 a |
| HP-1000™ | 80 ㎍/㎖ | 0.0 a | 2.7 b | 25.8 b | 510.2 a |
문자의 뒤에 오는 윗첨자 1은 Duncan's MRT(p = 0.05)에 대하여 현저하게 상이함을 의미한다. 비율2에 있어서, Asana XL™에 대한 비율은 제형화된 제품에 대한 것이며, HP-1000™에 대한 비율은 활성 성분(a.i.)에 대한 것이다.
DAT 1 후 14일이 경과한 뒤 진딧물의 총수는 모든 처리군에서 비교적 작게 나타났으나, DAT 1 후 28일이 경과한 뒤(이때까지 2회의 분무가 행해짐) 잎사귀 한 개당 진딧물의 수는 과민성 반응 유발인자 처리된 목화에 비해 Asana XL 처리된 식물에서 현저하게 높게 나타났다. DAT 1 후 35일이 경과한 뒤에는(이때까지 3회의 분무가 행해짐) 모든 처리군에서 진딧물의 총수가 증가하였지만, 과민성 반응 유발인자 처리된 목화의 경우에는 잎사귀 한 개당 진딧물의 총수가 Asana XL™ 처리군에 비해 여전히 현저하게 낮았다. 끝으로, DAT 1 후 42일이 경과한 뒤(이때까지 4회의 분무가 행해짐)에는 표준 화학 살충제가 처리된 경우조차도 잎사귀 한 개당 진딧물의 수가 식물을 전복시킬 정도의 위협적인 수준으로 높아졌다. 실험에 사용된 식물을 살리기 위하여, 또 다른 화학물질인 Pravado(Admire)를 모든 구획에 살포하여 농지로부터 진딧물을 박멸하였다.
2. 과민성 반응 유발인자 처리된 목화는 Pravado(Admire) 및 Asana에 의하여 초래되는 손상에 대해 보다 큰 내성을 가지고 있었다. 두 번째 화학물질 분무 후, 목화 식물은 살충제에 의해 가해지는 스트레스를 받은 것으로 관찰되었다. Asana로 사전 처리된 목화 식물과 비처리 대조군에서 고엽 현상이 나타났다. 화학물질 처리된 대부분의 목화에는 잎이 전혀 없거나, 식물의 저부에 극히 일부의 잎이 남아 있었다. 그러나, 과민성 반응 유발인자 처리된 식물, 특히 과민성 반응유발인자가 80 ppm 농도로 적용된 구획에서는 고엽 현상이 전혀 나타나지 않았으며, 목화 식물은 원기 왕성하고 건강하였다. 성숙된 볼(ball)의 수를 세어본 결과, (80 ppm 농도의) 과민성 반응 유발인자가 처리된 식물의 경우에 화학물질 및 비처리 대조군보다 더 많은 수의 볼이 맺혀 있는 것이 확인되었으며(표 2), 이는 과민성 반응 유발인자 처리된 식물이 살충제에 의해 유발되는 스트레스에 대해 보다 내성임을 의미한다.
< 표 2 > 처리당 각각 4개의 반복구획 내 10그루의 식물에 대하여 계수된 형성된 목화 볼의 수
| 처리 | 볼의 수/10그루의 식물/반복구획 |
| UTC | 28 |
| 화학적 표준 | 6 |
| 과민성 반응 유발인자 | 35 |
실시예 2 - 과민성 반응 유발인자 처리된 오이는 가뭄에 대해 보다 큰 내성을 갖는다.
질병 억제, 가뭄 스트레스에 대한 내성 및 생산량에 대한Erwinia amylovora과민성 반응 유발인자의 효과를 테스트하기 위하여 오이밭 실험을 착수하였다. 15, 30 및 60 ㎍/㎖의 3가지 비율로 테스트하였다. 과민성 반응 유발인자 처리 외에도, 비처리 대조군이 사용되었다. 각각의 처리는 3개의 반복구획에서 수행되었다. 첫 번째 참잎이 발아했을 때, 배낭형 분무기를 사용하여 과민성 반응 유발인자를 분무하였다. 첫 번째 분무 후 10일 뒤에 두 번째 분무가 이루어졌다. 세 번째 살포는 오이 실생묘를 회수하여 밭에 이식한 직후 이루어졌다. 개개의 처리는밭에 무작위 적으로 할당되었다.
첫 번째 참잎이 발아했을 때(기준일), 첫 번째 살포가 이루어졌다. 일반적으로, 오이 실생묘는 2개의 참잎이 나왔을 때 이식된다. 이식 후 회수율은 거의 실생묘의 크기에 비례하는 것으로 공지되어 있다. 가뭄으로 인하여, 추가 10일 동안 실생묘를 모판에 보관하고, 10일째 되는 날에 두 번째 분무가 이루어졌다. 두 번째 분무 후 2일 뒤, 식물들을 밭에 이식하고 플라스틱 시트를 덮어주었다. 식물들은 4개 내지 5개의 참잎을 갖고 있었다.
결 과
이식된 오이 실생묘의 회수율은 비처리 대조군의 경우보다 과민성 반응 유발인자 처리된 식물의 경우에 더 높았다. 과민성 반응 유발인자 처리된 오이 실생묘의 80% 이상이 생존한 반면, 비처리 대조군은 단지 57%만이 생존하였다.
성장기임에도 불구하고, 극심한 가뭄이 문제가 되었다. 초기의 밭 검진에서 과민성 반응 유발인자 처리된 식물은 뿌리의 양이 많고 전반적인 모든 면에서의 성장이 보다 우수한 것으로 나타났다. 과민성 반응 유발인자 처리된 오이는 비처리 대조군의 오이보다 14일 먼저 꽃이 피기 시작하였다. 이른 개화는 이른 수확으로 이어졌다. 첫 수확에서, 과민성 반응 유발인자 처리된 오이로부터는 그루 당 0.4 kg 이상의 오이 열매가 수확되었으나, 비처리 대조군으로부터는 실질적인 열매 수확이 없었다. 성장기 말까지, 비처리 식물은 가뭄으로 인하여 죽었으나, 과민성 반응 유발인자 처리된 식물은 여전히 생존하여 한차례의 수확을 더 가져왔다.
과민성 반응 유발인자 처리된 식물과 비처리 식물간의 최종 생산량에서는 현저한 차이가 나타났다. 30 ppm 비율로 투여된 과민성 반응 유발인자는 대조군 식물보다 3배 이상의 생산량을 산출하였다(표 3).
< 표 3 > 과민성 반응 유발인자 처리된 식물로부터의 오이 열매의 생산량 증가
| 처리 | 반복구획 | kg/그루 | 생산량/반복구획 | 생산량 증가율(%) |
| HP 15 | Ⅰ | 1.25 | 37.5 | |
| Ⅱ | 1.00 | 30.0 103.8 | 241 | |
| Ⅲ | 1.21 | 36.3 | ||
| HP 30 | Ⅰ | 1.54 | 46.2 | |
| Ⅱ | 1.43 | 42.9 133.2 | 339 | |
| Ⅲ | 1.47 | 44.1 | ||
| 대조군 | Ⅰ | 0.43 | 12.9 | |
| Ⅱ | 0.41 | 12.3 39.3 | ||
| Ⅲ | 0.47 | 14.1 |
일반적으로, 과민성 반응 유발인자에 의해 유도되는 성장 증진에 의한 생산량 증가는 10% 내지 40%이기 때문에, 증가된 생산량은 부분적으로는 과민성 반응 유발인자에 의해 유도되는 성장 증진으로부터 기인되고, 부분적으로는 과민성 반응 유발인자 처리된 오이의 가뭄에 대한 내성으로부터 기인되었다.
실시예 3 - 과민성 반응 유발인자 처리된 후추는 제초제 스트레스에 대해 보다 큰 내성을 갖는다.
이식되기 7일 전, 후추 실생묘를 20 ppm 농도의 과민성 반응 유발인자에 침지하고, 이식 후 7일 뒤에 분무하고, 이후 14일 주기로 분무하였다. 표준 화학물질들인 Brave, Maneb, Kocide 및 Admire를 나머지 처리에 사용하였다. 과민성 반응 유발인자 처리된 후추는 높은 생산량, 큰 열매 및 여러 질병에 대한 내성을 가져오는 성장 증진 외에도, 제초제 손상에 대해 보다 큰 내성을 갖고 있었다. 후추용으로 지정되지 않은 SENCOR 제초제를 후추밭에 살포하였다. 상기 제초제는 화학적으로 처리된 식물 중 과민성 반응 유발인자 처리된 식물을 제외한 후추에 있어 심각한 잎의 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다.
제초제의 역효과에 있어서 과민성 반응 유발인자 처리된 식물과 과민성 반응 유발인자가 처리되지 않은 식물간에는 상당한 차이가 있다. 하기 표 4를 참조한다. 유발인자 처리된 60그루의 식물 중 39그루가 제초제에 의해 작은 손상만을 나타내었고, 손상된 잎은 20% 미만이었다. 반면, 화학적으로 처리된 60그루의 후추 식물 중 53그루가 심각한 손상을 입었으며, 잎의 40% 내지 57%가 손상되었고, 20그루의 식물이 죽었다. 작물이 제초제의 식물 독성 효과를 견딜 수 있게 보조하는 과민성 반응 유발인자의 능력은 농업 산업에서 매우 중요한 이점이 된다.
< 표 4 > 과민성 반응 유발인자 처리된 후추는 제초제 손상에 대하여 보다 큰 내성을 갖는다.
| 처리 | 손상 등급 | 손상율(%) | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| 과민성 반응 유발인자 | 1 | 38 | 17 | 3 | 1 | 0 | 41 |
| 화학물질 | 0 | 1 | 6 | 16 | 19 | 18 | 87 |
손상 등급: 1 = 손상 없음, 2 = 0-20%의 잎이 손상됨, 3 = 20-40%의 잎이 손상됨, 4 = 40-50%의 잎이 손상된, 6 = 75% 이상의 잎이 손상되거나 식물 전체가 죽음.
손상율 = Σ(각 등급×그 등급에 해당하는 식물의 수)/(식물의 총수×6).
과민성 반응 유발인자 처리된 식물에 대한 손상율
=1×1+2×38+3×17+4×3+5×1+6×0×100% = 41%
실시예 4 - 과민성 반응 유발인자 처리된 후추는 제한된 실험 조건 하에서 제초제 스트레스에 대해 보다 큰 내성을 갖는다.
과민성 반응 유발인자 처리된 후추가 제초제 스트레스에 대하여 보다 큰 내성을 가지는 지의 여부를 테스트하기 위하여 밭 실험을 수행하였다. 실험에는 6회의 처리가 수반되었으며, 각각의 처리는 4개의 반복구획에서 이루어졌다. 처리는 다음과 같이 이루어졌다:
1. 과민성 반응("HR") 유발인자와 LEXONE™ 제초제(DuPont Agricultural Products, Wilmington, Delaware) 중 어느 것도 적용되지 않은 대조군 후추.
2. 에이커당 0.15 파운드의 LEXONE™ 제초제가 적용된 대조군 후추.
3. 에이커당 0.3파운드의 LEXONE™ 제초제가 적용된 대조군 후추.
4. LEXONE™ 제초제가 적용되지 않고, MESSENGER™ 생살충제(Eden Bioscience Corporation, Bothell, Washington)로서 공지된 3%의 HR 유발인자 단백질을 함유하는 제형화된 제품을 사용하는 HR 유발인자 처리군이 사용되었다.
5. 에어커당 0.15 파운드의 LEXONE™ 제초제가 적용된 HR 유발인자 처리군.
6. 에이커당 0.3파운드의 LEXONE™ 제초제가 적용된 HR 유발인자 처리군.
LEXONE™은 실시예 3에서 사용된 SENCOR™ 제초제(Bayer, Kansas City, Missouri)와 동일한 활성성분을 함유한다. 밭으로 이식되기 7일 전, 후추 실생묘를 약 20 ppm의 HR 유발인자 단백질을 함유하는 MSSENGER™ 용액에 침지하고, 이식 후 14주기로 살포하였다. LEXONE을 높은 수준(0.3 파운드/에이커) 및 낮은 수준(0.15 파운드/에이커)으로 살포하였다. 밭에 이식하고 5주 후, 개별적인 처리 시 각 식물의 뿌리 영역에 50 갤론의 물과 100 ㎖의 제초제 용액을 주입하였다.
처리군을 LEXONE™ 제초제 살포에 의해 초래되는 백화의 비율 및 후추 생산량에 대해 평가하였다. 높은 비율의 제초제에 노출된 HR 유발인자 처리된 식물은 동량의 제초제에 노출된 HR 유발인자 비처리 식물에 비해 백화율이 현저하게 낮았으며 108% 이상의 열매를 생산하였다. 하기 표 5 및 6을 참조한다. 제초제의 비율이 낮은 경우, HR 유발인자 처리된 후추와 HR 유발인자가 처리되지 않은 후추간의 백화 감소에 있어 현저한 차이는 없었다. 그러나, HR 유발인자 처리된 식물은 동량의 제초제에 노출된 상응하는 대조군 식물보다 15% 이상 많은 열매를 생산하였다. LEXONE™ 제초제가 처리되지 않은 HR 유발인자 처리된 식물 또는 대조군은 어느 쪽에서도 백화 현상이 나타나지 않았다.
제초제의 비율이 높은 경우, HR 유발인자 처리된 식물은 개개의 대조군 식물보다 제초제 살포에 의한 영향을 훨씬 덜 심하게 받았다. 그러나, 가시적인 백화의 양은 대조군과 HR 유발인자 처리된 식물 모두 비슷하게 낮았다. 보다 중요한 점은, 높은 비율 및 낮은 비율의 제초제가 처리된 모든 HR 유발인자 처리된 식물은 생산량에 있어서 대조군보다는 제초제의 영향을 덜 심각하게 받았다는 것이다. 이러한 발견은 HR 유발인자가 작물이 제초제에 의한 식물독성의 영향을 견딜 수 있게 보조할 수 있으며 농업 산업에 매우 유용하다는 것을 더욱 입증한다.
< 표 5 > LEXONE™ 제초제에 노출된 후 과민성 반응 유발인자 처리된 식물에서 잎의 백화 감소 및 생산량 증가
| 후추 잎의 백화율(%) 및 생산량 | |||||||
| 처리 | A | B | C | D | E | 생산량(파운드) | 각 대조군과의차(%) |
| 6(MESSENGER™+높은 비율의 LEXONE™) | 13.75 | 30.00 | 37.50 | 36.25 | 40.00 | 8.31 | 108% |
| 3(높은 비율의 LEXONE™) | 26.25 | 43.75 | 51.25 | 50.00 | 51.25 | 4.00 | - |
| 5(MESSENGER™+낮은 비율의 LEXONE™) | 16.25 | 22.50 | 28.75 | 23.75 | 27.50 | 8.00 | 15% |
| 2(LEXONE™) | 12.50 | 20.00 | 25.00 | 25.00 | 23.75 | 6.81 | - |
< 표 6 > LEXONE™ 제초제에 노출된 후 과민성 반응 유발인자 처리된 식물에서 대조군 식물에 비해 증가된 수확 후추의 중량
| 처리 | 12/1/98 수확된 후추의 중량(파운드 단위) |
| HP20 + 높은 비율의 LEXONE™ | 8.31 |
| 대조군 + 높은 비율의 LEXONE™ | 4.00 |
| HP20 + 낮은 비율의 LEXONE™ | 8.00 |
| 대조군 + 낮은 비율의 LEXONE™ | 6.81 |
실시예 5 - 과민성 반응 유발인자 처리된 목화는 가뭄 스트레스에 대해 보다 큰 내성을 갖는다.
26일간의 계속된 가뭄중에도 목화에 관개하지 않고 실험을 수행하였다. 밭의 식물에 가해지는 스트레스에 부가되는 일 평균 열지수는 100℉ 이상이었다.
밭에서의 관찰 결과, 15 ppm 농도의 HR 유발인자(3%의 활성성분 HR 유발인자 단백질을 함유하는 2.2 oz의 제형화된 제품인 MESSENGER™)가 처리된 식물은 열과 가뭄 스트레스에서의 결과와 같이 대조 식물보다 원기 왕성하였고 고엽 현상도 더적게 나타났다. MESSENGER™ 처리된 구획 및 MESSENGER™ 처리되지 않은 구획으로부터 동수의 식물을 조심스럽게 밭에서 제거하고, 마디와 꼬투리의 수를 위치로 표시하였다. Metler 분석용 저울을 사용하여 식물의 중량 측정함으로써 식물 전체, 뿌리 및 새로 나온 가지의 중량을 측정하였다.
MESSENGER™ 처리된 식물은 더위 및 가뭄 스트레스에도 불구하고 비처리 식물보다 훨씬 더 잘 생존하였다. MESSENGER™로 처리된 식물은 대조군 식물보다 37.6% 이상의 뿌리 및 새로 나온 가지의 양을 갖고 있었다(표 7). 또한, MESSENGER™ 처리된 식물은 대조군 식물보다 현저하게 많은 목화 꼬투리를 갖고 있었다(표 8). 1위치 및 2위치에서의 목화 꼬투리의 수는 전체 생산량에 상당한 기여를 하였다. 표 8에 따르면, MESSENGER™ 처리된 식물은 재배 표준 처리법(즉, MESSENGER™을 처리하지 않음)을 사용한 경우 달성된 생산량에 비해 1위치 및 2위치에서는 47% 이상, 전체 식물로부터는 57% 이상의 꼬투리를 갖고 있는 것으로 나타났다. 목화에 있어서 스트레스에 대한 보편적인 반응은 그루를 위하여 꼬투리를 퇴화시키는 것이다. 결과는 MESSENGER™ 처리된 식물이 가뭄 스트레스에 대하여 보다 큰 내성을 가지는 것으로 나타났다.
< 표 7 > 26일간의 가뭄 뒤 관개되지 않은 목화 식물의 중량
| 처리 | 뿌리의 중량(파운드/그루) | 차(%) | 새로 나온가지의 중량(파운드/그루) | 차(%) | 전체 식물의중량(파운드/그루) | 차(%) |
| MESSENGER™2.2 oz/acre | 0.041 a* | 37.6% | 0.505 a | 37.5% | 0.546 | 37.5% |
| 대조군(재배 표준) | 0.0298 b | 0.367 b | 0.397 | |||
| 통계학적중요도 | p = 0.119 | p = 0.034 | p=0.033 |
*동일한 문자는 규정된 수준의 두 처리군간에 통제학적 차이가 없음을 의미하고; 상이한 문자는 규정된 수준의 두 처리군간에 통계학적 차이가 있음을 의미한다.
< 표 8 > 1번과 2번 위치의 5그루의 식물에 대한 꼬투리의 수 및 26일간의 가뭄 뒤 관개되지 않은 목화에서 전체 식물에 대한 꼬투리 총수
| 처리 | 1번과 2번 위치에서의꼬투리의 평균수 | 차(%) | 5그루에 대한총 꼬투리의 평균수 | 차(%) |
| MESSENGER™ 2.2 oz. | 18.4 a | +46.0% | 21.4 a | +57.0% |
| 대조군 | 12.6 b | 13.6 b | - | |
| 통계학적 중요도 | p = 0.032 | p = 0.01 |
*동일한 문자는 규정된 수준의 두 처리군간에 통제학적 차이가 없음을 의미하고; 상이한 문자는 규정된 수준의 두 처리군간에 통계학적 차이가 있음을 의미한다.
실시예 6 - 과민성 반응 유발인자 처리된 토마토는 칼슘 결핍에 대하여 보다 큰 내성을 갖는다.
칼슘은 식물의 생리 및 발생에 있어 중요한 구성요소이다. 칼슘 부족은 여러 식물에 질병을 초래할 수 있다. 예를 들면, 개화 말기의 부패는 토마토 열매의 말단 부분에서의 국부적인 칼슘 부족에 의해 초래된다. 칼슘은 가동성이 큰 성분이 아니기 때문에, 그 결핍은 수분 공급에 있어서의 변동과 함께 발생할 수 있다. 지금까지 토마토 재배자들은 드문 폭풍우로 인해 홍수가 내린 뒤 곧바로 고온 건조한 상태로 전환된 경우의 건조한 기후 조건에서 더욱 심각한 개화 말기의 부패를 경험해 왔다. 고온 건조한 성장기 동안의 관개용수 지하수면의 불규칙적인 감소 또는 증가도 질병을 증가시킬 수 있다.
HR 유발인자 단백질이 처리된 토마토가 고온 건조한 성장기 동안 칼슘 부족에 대해 보다 큰 내성을 가질 수 있는지의 여부를 테스트하기 위하여 밭 실험을 구상하였다. 3%의 HR 유발인자를 함유하는 제형화된 제품인 MESSENGER™를 실험에 사용하였다. MESSENGER™의 살포율은 에이커당 2.27 oz이었다. MESSENGER™의 살포는 이식되기 7일 전에 처음 수행되었으며, 이식 후에는 14일을 주기로 수행되었다. MESSENGER™ 처리된 토마토를 MESSENGER™가 사용되지 않은 표준 재배 처리군과 비교하였다. 각각의 처리는 4개의 반복구획에서 이루어졌다.
100 평방 피트의 밭에서 감염된 열매의 수를 세었다. 통상적으로, 부패는 일광에 그을린 수분 침지 병소에서 시작된 뒤, 확장되고 검게 변했다. 조사 결과, 열매의 약 20%가 감염되었다. 표준 처리군에서는 말기 부패 증세가 심각하였으나, MESSENGER™ 처리된 식물에서는 평균 2.5%의 열매만이 감염되었다. 수확 데이터에는 MESSENGER™ 처리된 식물이 8% 이상의 상품화 열매를 생산하는 것으로 나타나있다(표 9). 테스트 결과로부터 MESSENGER™ 처리가 칼슘 부족으로 인한 스트레스를 감소시킬 수 있으며 개화 말기의 부패에 대한 식물의 내성을 증가시킬 수 있음이 입증되었다.
< 표 9 > 과민성 반응 유발인자 처리는 개화 말기의 부패에 인한 감염을 감소시키고 토마토 열매의 생산량을 증가시켰다.
| 처리 | 개화 말기의 감염된 열매* | 토마토 열매의 생산량 | ||||
| 반복구획Ⅰ | 반복구획Ⅱ | 반복구획Ⅲ | 반복구획Ⅳ | Bin/에어커 | 차(%) | |
| MESSENGER™ | 0 | 9 | 0 | 1 | 35 | 8 |
| 표준 처리 | 24 | 22 | 16 | 17 | 31.5 | - |
*데이터는 100 평방 피트 구획 내의 열매로부터 수집되었다.
본 발명은 예시를 목적으로 상세히 설명되어 있으며, 첨부된 특허청구범위에 한정된 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 이 분야의 당업자에 의하여 본 발명에 변형이 이루어질 수 있다.
Claims (30)
- 스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 비감염성 형태(non-infectious form)의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 종자에 적용하는 단계를 포함하는 식물에 스트레스 내성을 부여하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 스트레스 내성이 기후 관련 스트레스, 공기오염 스트레스, 화학적 스트레스 및 영양적 스트레스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트레스에 대한 내성인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제2항에 있어서,상기 스트레스가 살충제, 살균제, 제초제 및 중금속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학물질에 의한 화학적 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제2항에 있어서,상기 스트레스가 가뭄, 물, 서리, 저온, 고온, 과도한 빛 및 불충분한 빛으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기후 관련 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제2항에 있어서,상기 스트레스가 이산화탄소, 일산화탄소, 이산화황, NOx, 탄화수소, 오존, 자외선 및 산성비로 이루어지는 군으로부터 선택되는 공기오염 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제2항에 있어서,상기 스트레스가 비료, 소량 영양소(micronutrient) 또는 다량 영양소 (macronutrient)에 의하여 초래되는 영양적 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제1항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Phytophthora또는Clavibacter로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제7항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia chrystanthemi및Erwinia stewartii로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제7항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Pseudomonas syringae또는Pseudomonas solancearum으로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제7항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Xanthomonas종으로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제7항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Phytophthora로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제7항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Clavibacter michiganesissubsp.sepedonicus로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제1항에 있어서,상기 적용 단계에서 식물이 처리되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제1항에 있어서,상기 적용 단계에서 식물 종자가 처리되고,과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드로 처리된 종자를 천연 또는 인공 토양에 심는 단계; 및토양에 심어진 종자로부터 식물을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제1항에 있어서,상기 식물이 자주개자리, 쌀, 밀, 보리, 호밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 강낭콩, 완두, 치커리, 상추, 꽃상추, 캐비지, 양배추, 비트, 파스닙, 순무, 콜리플라워, 브로콜리, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 샐러리, 당근, 스쿼시, 호박, 서양호박, 오이, 사과, 배, 멜론, 감귤, 딸기, 포도, 나무딸기, 파인애플, 대두, 담배. 토마토, 수수, 및 사탕수수로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제1항에 있어서,상기 식물이 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 세인트폴리아(Saintpaulia), 페츄니아, 펠라고늄, 포인세티아, 국화, 카네이션, 및 지니아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 식물에 스트레스 내성을 부여하는 방법에 있어서,과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스제닉(transgenic) 식물 또는 트랜스제닉 식물의 종자를 제공하는 단계; 및스트레스 내성을 부여하기에 효과적인 조건 하에서 상기 트랜스제닉 식물의 종자로부터 생성된 트랜스제닉 식물 또는 식물들을 성장시키는 단계를 포함하는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제17항에 있어서,트랜스제닉 식물이 제공되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제17항에 있어서,트랜스제닉 식물의 종자가 제공되고,상기 트랜스제닉 종자를 천연 또는 인공 토양에 심는 단계; 및토양에 심어진 종자로부터 식물을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제17항에 있어서,상기 스트레스 내성이 기후 관련 스트레스, 공기오염 스트레스, 화학적 스트레스 및 영양적 스트레스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트레스에 대한 내성인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제20항에 있어서,상기 스트레스가 살충제, 살균제, 제초제 및 중금속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학물질에 의한 화학적 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제20항에 있어서,상기 스트레스가 가뭄, 물, 서리, 저온, 고온, 과도한 빛 및 불충분한 빛으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기후 관련 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제20항에 있어서,상기 스트레스가 이산화탄소, 일산화탄소, 이산화황, NOx, 탄화수소, 오존, 자외선 및 산성비로 이루어지는 군으로부터 선택되는 공기오염 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제20항에 있어서,상기 스트레스가 비료, 소량 영양소 또는 다량 영양소에 의하여 초래되는 영양적 스트레스인 스트레스 내성 부여 방법.
- 제20항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Phytophthora또는Clavibacter로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제25항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia chrystanthemi및Erwinia stewartii로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제25항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Pseudomonas syringae또는Pseudomonas solancearum으로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제25항에 있어서,상기 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩타이드가Xanthomonas종으로부터 유래되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제20항에 있어서,상기 식물이 자주개자리, 쌀, 밀, 보리, 호밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 강낭콩, 완두, 치커리, 상추, 꽃상추, 캐비지, 양배추, 비트, 파스닙, 순무, 콜리플라워, 브로콜리, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 샐러리, 당근, 스쿼시, 호박, 서양호박, 오이, 사과, 배, 멜론, 감귤, 딸기, 포도, 나무딸기, 파인애플, 대두, 담배. 토마토, 수수, 및 사탕수수로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트레스 내성 부여 방법.
- 제20항에 있어서,상기 식물이 아라비돕시스 탈리아나, 세인트폴리아, 페츄니아, 펠라고늄, 포인세티아, 국화, 카네이션, 및 지니아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스트레스 내성 부여 방법.
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