BR9816222B1 - processo para melhorar o crescimento em plantas - Google Patents

Description

"PROCESSO PARA MELHORAR O CRESCIMENTO EM PLANTAS"

"Dividido do PI9807292-7, depositado em 27/01/1998"

Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente US provisório número de série 60/036,048, depositado em 27 de janeiro de 1997.

Esta invenção foi feita com o apoio do governo dos U.S. sob a bolsa USDA NRI Competitive Research Grant n° 91-37303-6430.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao melhoramento do crescimento de plantas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A melhora do crescimento de plantas pela aplicação de fertilizantes orgânicos é conhecida e tem sido realizada há séculos (H. Marschner, "Mineral Nutrition of Higher Plantas," Academic Press: New York pág. 674 (1986). O homem moderno desenvolveu um sistema de produção de fertilizantes inorgânicos complexo para produzir um produto fácil, que agricultores e fazendeiros podem aplicar a solos ou culturas em crescimento para melhorar o desempenho por meio da melhora do crescimento. Tamanho, coloração, maturação e produção das plantas podem também ser melhorados pela aplicação de produtos fertilizantes. Fertilizantes inorgânicos incluem os produtos químicos comumente aplicados como nitrato de amônio. Fertilizantes orgânicos podem incluir estrumes de animais e resíduos de gramados adubados, dentre muitas outras fontes.

Nos anos mais recentes, pesquisadores pensaram em melhorar o crescimento de plantas através do uso de produtos biológicos. Agentes de controle de doenças e insetos como Beauveria bassiana e Trichoderma harizamum foram registrados para o controle de problemas de doenças e insetos e, assim, melhoram indiretamente o desempenho e crescimento de plantas (Fravel et al., "Formulation of Microorganisms to Control Plant Diseases, "Formulation of Microbial Biopesticides, Beneficiai Microorganisms, and Nematodes. H.D. Burges, ed. Chapman and Hall: Londres (1996).

Existe alguma indicação da melhora do crescimento de plantas por meio de aplicação microbiana ou subprodutos microbianos. Bactérias de nodulação são adicionadas às sementes de culturas de leguminosas quando introduzidas em um sítio novo (Weaver et al., "Rhizobium."Methods of Soil Analysis, Part 2, Chemical and Microbiological Properties, 2â ed., American Society of Agronomy: madison (1982)). Estas bactérias podem melhorar a eficácia de nodulação da planta e, desse modo, melhorar a capacidade da planta de converter nitrogênio livre em uma forma utilizável, um processo denominado fixação de nitrogênio. Culturas de não leguminosas, como uma regra, não se beneficiam deste tratamento. Bactérias adicionadas como Rhizobium parasitizam diretamente os pelos radiculares, iniciando então uma relação mutualística provendo benefício à planta enquanto recebendo proteção e sustento.

Fungos micorrizais são também reconhecidos como microorganismos necessários para crescimento opcional de muitas culturas, especialmente coníferas em solos que sofreram depleção de nutrientes. Mecanismos incluindo biossíntese de hormônios de plantas (Frankenberger et al., "Biosynthesis of Indole-3-Acetic Acid by the Pine Ectomycorrhizal Funges Pisolithus tinctorius," Appl. Environ. Microbiol. 53: 2908-13 (1987)), absorção aumentada de minerais (Harley et al., "The Uptake of Phosphate by Excised Mycorrhizal Roots of Beech," New Phytologist 49:388-97 (1950) e Harley et al., "The Uptake of Phosphate by Excised Mycorrhizal Roots of Beech. IV. The Effect of Oxygen Concentration Upon Host and Fungus," New Phytologist 52: 124-32 (1953)), e água (A.B. Hatch, "The Physical Basis of Mycotrophy in Pinus " Black Rock Forest Buli. ns 6, 168 pp. (1937)) foram postulados. Fungos micorrizais não obtiveram a freqüência comum de uso que as bactérias de nodulação tiveram devido a resultados variáveis e inconsistentes com qualquer cepa micorrizal dada e a dificuldade de estudo dos organismos.

Rizobactérias promotoras do crescimento de plantas ("PGPR") reconheceram em anos recentes a melhora do desenvolvimento e crescimento de plantas. Mecanismos hipotéticos estão na faixa de influências diretas (por exemplo, absorção de nutrientes aumentada) para mecanismos indiretos (por exemplo, substituição de patógenos). O melhoramento do crescimento por aplicação de uma PGPR se refere, geralmente, à inoculação com uma bactéria viva no sistema radicular e à obtenção de crescimento melhorado através de efeitos hormonais produzidos por bactéria, sideróforos, ou por prevenção de doença através da produção de antibióticos, ou competição. Em todos os casos acima, o resultado é efetuado através da colonização radicular, algumas vezes através da aplicação de revestimentos de semente. Existe informação limitada para sugerir que algumas cepas de PGPR podem ser promotores diretos de crescimento que melhoram o alongamento da raiz em condições gnotobióticas (Anderson et al., "Responses of Bean to Root Colonization With Pseudomonas putida in a Hydroponic System," Phytopathology 75: 992-95 (1985), Lifshitz et al., "Growth Promotion of Canola (rapeseed) Seedlings by a Strain of Pseudomonas putida Under Gnotobiotic Conditions," Can. J. Microbiol. 33: 390-95 (1987). Young et al., "PGPR": Is There Relationship Between Plant Growth Regulators and the Stimulation of Plant Growth or Biological Activity?, " Promoting Rhizobacteria: Progress and Prospects. Second International Workshop on Plant Growth-promoting Rhizobacteria, pp. 182-86 (1991), Loper et al., "Influence of Bacterial Sources of Indole-3-Acetic Acid on Root Elongation of Sugar Beet," Phytopathology 76: 386-89 (1986), e Müller et al., "Hormonal Interactions in the Rhizosphere of Maize (Zea Mays L.) and Their Effect on Plant Development," Z. Pflanzenernahrung Bodenkunde 152: 247-54 (1989); no entanto, a produção de reguladores do crescimento de plantas foi proposta como o mecanismo mediando estes efeitos. Muitas bactérias produzem vários reguladores do crescimento de plantas in vitro (Atzorn et al., "Production of Gibberellins and Indole-3-Acetic Acid by Rhizobium phaseoli in Relation to Nodulation of Phaseolus vulgaris Roots," Planta 175: 532-38 (1988) e M.E. Brown, "Piant Growth Substances Produced by Micro-Organism of Solid and Rhizosphere," J. Appl. Bact. 35: 443-51 (1972) ou antibióticos (Gardner et al., "Growth Promotion and Inhibition by Antibiotic-Producing Fluorescent Pseudomonadas on Citrus Roots," Plant Soil 77: 103-13 (1984)). Produção de sideróforos é outro mecanismo proposto para cepas de PGPR (Ahl et al., "Iron Bound-Siderophores, Cyanid Acid, and Antibiotics Involved in Supression of Thievaliopsis basicola by a Pseudomonas fluorescens Strain," J. Phytopathol. 116: 121-34 (1986), Kloepper et al., "Enhanced Plant Growth by Siderophores Produced by Plant Growth-Promoting Rhizobacteria," Nature 286: 885-86 (1980), e Kloepper et al., "Pseudomonas siderophores: A Mechanism Explaining Disease-Suppressive Soils," Curr. Microbiol. 4: 317- 20 (1980)). A colonização de superfícies de raízes e, assim, a competição direta com bactérias patogênicas sobre as superfícies é outro mecanismo de ação (Kloepper et al., "Relationship of in vitro Antibiosis of Plant Growth- Promoting Rhizobacteria to Plant Growth and the Displacement of Root Microflora," Phytopathology 71: 1020-24 (1981), Weller et al., "Increased Growth of Wheat by Seed Treatments With Fluorescent Pseudomonads, and Implications of Pythium Control," Can. J. Microbiol. 8: 328-34 (1986), e Suslow et al., "Rhizobacteria of Sugar Beets: Effects of Seed Application and Root Colonization on Yield," Phytopathology 72: 199-206 (1982)). Estudos de canola (colza) indicaram parâmetros de crescimento de plantas aumentados em PGPR incluindo produção, vigor e emergência de arbustos, crescimento de plantas com amadurecimento prematuro (número de folhas e comprimento de estolho médio), e área da folha (Kloepper et al., "Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Canola (rapeseed)," Plant Disease 72: 42-46 (1988)). Estudos com batata indicaram rendimentos da produção maiores quando cepas de Pseudomonas foram aplicadas a semente de batatas (Burr et al., "Increased Potato Yields by Treatment of Seed Pieces With Specific Strains of Pseudomonas Fluorescens and P. Putida," Phytopathology 68: 1377-83 (1978), Kloepper et al,, "Effect of Seed Piece Inoculation With Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Populations of Erwinia carotovora on Potato Roots and in Daughter Tubers," Phytopathology 73: 217-19 (1983), Geers et al., "Reduction of Yield Depressions in High Frequency Potato Cropping Soil After Seed Tuber Treatments With Antagonistic Fluorescent Pseudomonas spp.," Phytopathol. Z. 108: 207-38 (1983), Howie et al., "Rhizobacteria"Influence of Cultivar and Soil Type on Plant Growth and Yield of Potato," Soil. Biol. Biochem. 15: 127-32 (1983), e Vrany et al., "Growth and Yield of Potato Plants Inoeulated With Rhizosphere Bactéria," Folia Microbiol. 29: 248-53 (1984)). Aumento em produção foi aparentemente devido aos efeitos competitivos de PGPR eliminarem bactérias patogênicas no tuberculo da semente, possivelmente por antibiose (Kloepper et al., "Effect of Seed Piece Inoculation With Plant Growth-Promoting Rhizobacteria on Populations of Erwinia carotovora on Potato Roots and in Daughter Tubers," Phytopathology 73: 217-19 (1983), Kloepper et al., "Effects of Rhizosphere Colonization by Plant Growth- Promoting Rhizobacteria on Potato Plant Development and Yield," Phytopathology 70: 1078-82 (1980), Kloepper et al., "Emergence-Promoting Rhizobacteria: Description and Implications for Agriculture," pp. 155-164, Iron, Siderophores, and Plant Disease, T.R., Swinburne, ed. Plenum, New York (1986), e Kloepper et al., "Relationship of in vitro Antibiosis of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria to Plant Growth and the Displacement of Root Microflora," Phytopathology 71: 1020-24 (1981)). Em vários estudos, a emergência da planta foi melhorada usando PGPR (Tipping et al., "Development of Emergence-Promoting Rhizobacteria for Supersweet Corn," Phytopathology 76: 938-41 (1990) (resumo) e Kloeppet et al., "emergence- Promoting Rhizobacteria: Description and Implications for Agriculture,"pp. 155-164, Iron, Sideropheres. and Plant Disease, T.R. Swinburne, ed. Plenum, New York (1986)). Numerosos outros estudos indicaram saúde das plantas melhorada quando do tratamento com rizobactéria, devido ao biocontrole dos patógenos das plantas (B. Schippers, "Biological Control of Pathogens With Rhizobacteria," Phil. Trans. R. Soe. Lond. B. 318: 283-93 (1988), Schroth et al., "Disease-Supressive Soil and Root-Colonizing Bactéria," Science 216: 1376-81 (1982), Stutz et al., "Naturally Occurring Fluorescent Pseudomonads Involved in Suppression of Black Root Rot of Tobacco," Phytopathology 76: 181-85 (1986), e D.M. Weller, "Biological Control of Soilborne Plant Pathogens in the Rhizosphere With Bacteria," Annu. Rev. Phytopathol. 26: 379-407 (1988)).

Verificou-se que imunização induzida por patógenos de uma planta promove crescimento. Injeção de Peronospora tabacina externamente ao xilema de tabaco não somente aliviou a paralisação do crescimento, mas também promoveu crescimento e desenvolvimento. Plantas de tabaco imunizadas, tanto em experiências de estufa como de campo, eram 40% mais altas, tiveram um aumento de 40% em peso seco, um aumento de 30% em peso novo, e 4-6 mais folhas do que as plantas de controle (Tuzun, S., et al., "The Effect of Stem Injection with Peronospora tabacina and Matalaxyl Treatment on Growth of Tobacco and Protection Against Blue Mould in the Field," Phytopathology 74: 804 (1984). Estas plantas floresceram aproximadamente 2-3 semanas mais cedo do que plantas de controle (Tuzun, S., et al., "Movement of a factor in Tobacco Infected with Peronospora tabacina Adam which Systemically Protects Against Blue Mould," Phvsiological Plant Pathology, 26: 321-30 (1985)).

A presente invenção é dirigida a um aperfeiçoamento com relação aos procedimentos anteriores para melhora do crescimento de plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para melhorar o crescimento em plantas. Este processo envolve aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em uma forma não infecciosa a plantas ou sementes de planta em condições para conferir crescimento melhorado às plantas ou a plantas em crescimento a partir de sementes de planta.

Como uma alternativa para aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível a plantas ou sementes de planta, a fim de conferir crescimento melhorado às plantas ou a plantas em crescimento a partir de sementes, sementes de planta ou plantas transgênicas podem ser utilizadas. Quando se utiliza plantas transgênicas, isto envolve prover uma planta transgênica transformada com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeos elicitor de resposta hipersensível e o crescimento da planta em condições eficazes para permitir à molécula de DNA melhorar o crescimento. Alternativamente, uma semente de planta transgênica transformada com um molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser provida e plantada no solo. Uma planta é então propagada da semente plantada em condições eficazes para permitir à molecula de DNA melhorar o crescimento.

A presente invenção é dirigida a efetuar qualquer forma de promoção ou melhora no crescimento de plantas. Isto pode ocorrer o mais cedo possível quando o crescimento da planta começa das sementes ou depois na vida de uma planta. Por exemplo, o crescimento de plantas de acordo com a presente invenção engloba produção maior, quantidade aumentada de sementes produzidas, porcentagem aumentada de sementes germinadas, tamanho de planta aumentado, biomassa maior, mais e maiores frutas, coloração prematura dos frutos e maturação de plantas e de frutos prematura. Como um resultado, a presente invenção provê benefícios econômicos significativos aos agricultores. Por exemplo, germinação prematura e maturação prematura permitem que as culturas cresçam em áreas onde as estações curtas de crescimento podem de outro modo impossibilitar seu crescimento naquele local. Porcentagem aumentada da germinação de sementes resulta em culturas melhoradas permanentes e uso das sementes mais eficaz. Produção maior, tamanho aumentado e produção de biomassa melhorada permite maior geração de receita de um dado lote de terra. E evidente que a presente invenção constitui um avanço significativo na eficácia agrícola.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 é um mapa do vetor de plasmídeo pCPP2139 que contém o gene elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora.

Figura 2 é um mapa do vetor de plasmídeo pCPP50 que não contém o gene elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora, mas é, de outro modo, o mesmo vetor de plasmídeo pCPP2139 mostrado na figura 1. Ver Masui et al., Bio/Technology 2: 81-85 (1984), que é incorporado aqui por referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo para melhorar o crescimento em plantas. Este processo envolve aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em uma forma não infecciosa a toda ou parte de uma planta ou uma semente de planta em condições para conferir crescimento melhorado à planta ou um crescimento de planta a partir da semente de planta. Alternativamente, plantas podem ser tratadas deste modo para produzir sementes que, quando plantadas, conferem crescimento melhorado em plantas de progênie.

Como uma alternativa para aplicar uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível a plantas ou sementes de plantas a fim de conferir crescimento melhorado às plantas ou a crescumento de plantas a partir de sementes, sementes de plantas ou plantas transgênicas podem ser utilizadas. Quando se utiliza plantas transgênicas, isto envolve prover uma planta transgênica transformada com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível e crescimento de planta em condições eficazes para permitir à molécula de DNA melhorar o crescimento. Alternativamente, uma semente de planta transgênica transformada com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser provida e plantada no solo. Uma planta é então propagada da semente plantada em condições eficazes para permitir à molécula de DNA melhorar o crescimento.

A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível utilizado na presente invenção pode corresponder proteínas ou polipeptídeos elicitores de resposta hipersensível derivados de uma ampla variedade de patógenos bacterianos e fungicos. Estas proteínas ou polipeptídeos são capazes de elicitar necrose local no tecido da planta contactado com o elicitor.

Exemplos de fontes bacterianas apropriadas de elicitores de proteína ou polipeptídeo incluem espécies Erwinia, Pseudomonas e Xanthamonas (por exemplo, as seguintes bactérias: Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia stewartii, Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas campestris, e misturas dos mesmos).

Como exemplo de uma fonte fungica de um polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível é Phytophthora. Espécies apropriadas de Phytophthora pythium, Phytophthora cryptogea, Phytophthora cinnamoni, Phytophtora capsici, Phytophthora megasperma e Phytophthora citrophthora.

A forma de realização da presente invenção em que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensivel é aplicado à planta ou semente de planta pode ser realizada de numerosos modos, incluindo: 1) aplicação de uma proteína ou polipeptídeo elicitor isolado; 2) aplicação de bactérias que não causam doença e são transformadas com genes codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível; e 3) aplicação de bactérias que causam doença em algumas espécies de plantas (mas não nas em que elas são aplicadas) e contêm um gene codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível. Além disso, sementes de acordo com a presente invenção podem ser recuperadas de plantas que foram tratadas com um polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível com a presente invenção.

Em uma forma de realização da presente invenção, as proteínas ou polipeptídeos elicitores de resposta hipersensível podem ser isolados de seus organismos correspondentes e aplicados a plantas ou sementes de plantas. Os procedimentos de isolamento são bem conhecidos, como descrito em Arlat, M., F. Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet e C.A. Boucher, "PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-Iike Response in Specific Petunia Genotypes is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum.," EMBO J. 13: 543-553 (1994); He, S.Y., H. C. Huang, e A. Collmer, iiPseudomonas syringae pv. syringae HarpinPss: a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Cell 73: 1255-1266 (1993); and Wei, Z.-M, RJ. Labya, C.H. Zumoff, D.W. Bauer, S.-Y. He, A. Collmer, e S.V. Beer, "Harpin Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora, Science 257: 85-88 (1992), que são incorporados aqui por referência. Ver também pedidos de patente US pendentes números de série 08/200.024 e 08/062.024, que são incorporados aqui por referência. Preferivelmente, no entanto, as proteínas ou polipeptídeos elicitores de resposta hipersensível da presente invenção são produzidos recombinantemente e purificados como descrito abaixo.

Em outras formas de realização da presente invenção, a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível da presente invenção pode ser aplicada a plantas ou sementes de plantas aplicando-se genes contendo bactérias codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível, Estas bactérias devem ser capazes de secretar ou exportar o polipeptídeo ou proteína de modo que o elicitor pode contactar células de sementes de plantas ou plantas. Nestas formas de realização, a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é produzido pelas bactérias nas plantas ou nas sementes ou exatamente antes da introdução das bactérias nas plantas ou sementes de plantas.

Em uma forma de realização do modo de aplicação bacteriana da presente invenção, as bactérias não causam a doença e são transformadas (por exemplo, recombinantemente) com genes codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível. Por exemplo, E. coli, que não elicita uma resposta hipersensível em plantas, pode ser transformado com genes codificando uma proteína ou polipeptídeo de resposta hipersensível e depois aplicado em plantas. Espécies bacterianas diferentes de E. coli também podem ser usadas nesta forma de realização da presente invenção.

Em outra forma de realização do modo de aplicação bacteriano da presente invenção, as bactérias causam doença e, naturalmente, contêm um gene codificando uma proteína ou polipeptídeo de resposta hipersensível. Exemplos destas bactérias são indicados acima. No entanto, nesta forma de realização, estas bactérias são aplicadas a plantas ou suas sementes que não são suscetíveis a doença conduzida pelas bactérias. Por exemplo, Erwinia amylovora causa doença em maçã ou pera, mas não em tomate. No entanto, estas bactérias elicitarão uma resposta hipersensível em tomate. Consequentemente, de acordo com esta forma de realização da presente invenção, Erwinia amylovora pode ser aplicada a sementes ou plantas de tomate para melhorar o crescimento sem causar doença nesta espécie. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Erwinia chrysanthemi tem uma seqüência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 1, como a seguir:

Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser. 1 5 10 15

Gly Leu Gly Ala Gly Glv Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser 20 25 30

Leu Cy Ser Ser Val Aso Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr 35 40 45

Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Glv Gly Ala Leu Ala Gln Glv Leu 50 55 60

Gly Ala Ssr Ser Lvs Glv Leu Gly Mer Ser Asn Gln Leu Glv Glr. Ser 65 70 75 80

Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys 85 90 25

Ser Glv Glv Asp Ala Leu Ser Lvs Met Phe Asp Lvs Ala Leu Aso Aso 100 105 110

Leu Leu Glv Eis Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln 115 120 125

Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met 130 135 140

Asn Ala Phe Gly Ser Glv Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly 145 150 155 150

Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Glv Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly 165 170 175

Ala Glv Glv Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala C-Iy Ala Phe Asn Gln Leu 180 185 190

Glv Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala 195 200 205

Leu Ser Asn Val Ser Thr Kis Val Asp Glv Asn Asn Arc His Phe Val 210 215 220

Aso Lvs Glu Asp Arc Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Glr. Phe Met Asp 225 230 225 240

Gln Tvr Pro Glu Ile Phe Gly Lvs Pro Glu Tyr Gln Lys Aso Gly Trp 245 250 255

Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys 250 2S5 270

Pro Aso Asp Aso Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lvs Phe Arg Gln 275 280 285 Ala Met Giy Met Ils Lys Ser AIa Val Als Glv Aso Thr Gly Asr. Thr 250 255 300

Asr Leu Asn Leu Arg GIy AIa Giy Gly Aia Ser Leu GIy Ile Asp Ala

305 310 315 320

Ala Val Val Giy As? Lys IIe Ala Asn Mec Ser Leu Glv Lys Leu Aia 325 330 335

Asn Ala

A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tem um peso molecular de 34 kDa, é estável ao calor, tem um teor de glicina maior do que 16% e contém substancialmente nenhuma cisteína. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Erwinia chrysanthemi é codificado por uma molécula de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos correspondente à SEQ ID NO: 2, como a seguir:

CTACC cGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCnTCA CGGTATTCC-A CACCGTTACG 60

GCGTTTATGG CCGCGATG--A CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120

gatctggtat T-CAGTTTC-G GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGC- 180

C1C-CAATATC CCGGCATG ACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240

TGCGATGGCT GCCATCTGTG Cw a GAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300

CCGTCGGATC CCGGCAGTTA CAGGTG AAACGTT TG-TTGAACT GGCGGGAATG 350

ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC ACACAGGGAA CGGACGCGCC 420

CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480

CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540

GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600

AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660

TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720

GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780

GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA G—TCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840

TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900 TGtGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960

CAAGCTGACT AACCAGAGA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAA.CGCCA GCCAGATGAC 1020

CCAGGGTAAT ATGAATGGGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080

CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140

GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AA.TGCCA.TCG GCATGGGCGT 1200

GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TA-ACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAJkCAA 1260

CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320

TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCCAA 1380

GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440

CGCCAGGATG GACAAA.TTCC GTCAGGGGAT GGGTATGATC AAAA.GCGCGG TGGCGGGTGA 1500

TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGaww CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1550

GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA. ACGCCTGATA 1560

ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1620

TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC- CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740

ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800

GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860

CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920

CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980

GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040

AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100

GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141

A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado de Erwinia amylovora tem uma seqüência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 3, como a seguir: Μet Leu Asn Thr Ser Glv Leu C-Iy Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser 1 5 10 15

Ile Glv Gly Ala Glv Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln 20 25 30

Asn Ala Glv Leu Glv Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Glv Gly Asn 35 40 45

Cn Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Glv Mer Met 50 55 60

Mec Met Met Ser Met Met Glv Gly Glv Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu S5 70 75 80

Gly Glv Glv Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu 85 90 95

Glv Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asd Met Leu Gly Gly Ser Leu. Asn Thr 100 105 110

Leu Glv Ser Lys Gly Gly Asn Asa Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro 115 120 125

Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asa Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asd Ser 130 135 140

Thr Ser Glv Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln 145 150 155 160

Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser LeU Phe Gly Asp Gly 165 170 175

Gln Asp Gly Thr Gln Glv Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu 180 185 190

Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lvs Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly 195 200 205

Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly 210 215 220

Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Glv Leu Asp Gly Ser Ser Leu 225 230 235 240

Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Glv Pro Val Aso Tyr Gln Gln 245 250 255

Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lvs Ala Gly Ile Gln 2S0 265 270

Ala Leu Asn Asp Ile Glv Thr Kis Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe 275 280 285

Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met 290 295 300

Asd Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lvs Pro Gln Tyr Gln Lvs Glv Pro 305 310 315 320

Glv Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser TrD Ala Lys Ala Leu Ser 325 330 335

Lvs Pro Asd Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn 340 345 350 Lvs Ala Lvs Gly Msr Ile Lvs Arg Pro Met Ala Glv Asp Thr Glv Asn 355 360 365

Gly Asn Leu Gln Ala Ars Glv Ala Glv Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asρ 370 375 380

Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Glv Lys Leu

385 390 395 400

Gly Ala Ala

Esta proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tem um peso molecular de cerca de 39 kDa, tem um pi de aproximadamente 4,3 e é estável ao calor a IOO0C durante pelo menos 10 minutos. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível não tem substancialmente 5 cisteína. A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado de Erwinia amylovora é mais completamente descrita em Wei, Z.- M, R.J. Laby, C.H. Zumoff, D.W. Bauer, S. -Y. He, A. Collmer e S.V. Beer, "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora," Science 257: 85-88 (1992), que é incorporado 10 aqui por referência. A molécula de DNA codificando este polipeptídeo ou proteína tem uma seqüência de nucleotídeos correspondente à SEQ ID NO: 4, como a seguir: AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60

GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT 120

ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG 180

GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG 240

GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATC-Λ. TGGGCGGTGG TGGGCTGATG 300

GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG^GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA 360

GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA 420

GGCGGCAACA ATACCACTTC AACA-ACA-ViT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC 480

TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540

CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG 600

CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660

GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG 720

CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC 780

GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840

TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 900

ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG 960

GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020

CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC 1080

AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140

ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200

GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA 1260

CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288

A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível

derivada de Pseudomonas syringae tem uma seqüência de aminoácidos correspondente à SEQID NO: 5, como a seguir: Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gin Thr Prc Ala Met 1 5 10 15

Als Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser 20 25 30

Ser Lvs Ala Leu Gln Glu Val Val Tal Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met 35 40 45

Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lvs Leu Leu Ala 50 55 60

Lvs Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Glv Glv Ile Glu Asp Val 65 70 75 80

Ile Ala Ala Leu Aso Lvs Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe 85 90 95

Glv Ala Ser Ala Aso Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met 100 105 110

Thr Gln Val Leu Asn Glv Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu 115 120 125

Thr Lys Gln Asd Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met 130 135 140

Leu Asn Lvs Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro 145 150 155 160

Lvs Pro Asd Ser Glv Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe 165 170 175

Leu Asp Gly Asd Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile 180 185 190

Glv Gln Gln Leu Glv Asr Gln Gln Ser Asp Ala Glv Ser Leu Ala Gly 195 200 205

Thr Glv Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser 210 215 220

Val Met Glv Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Glv Asp Ser 225 230 235 240

Glv Asn Thr Arg Glv Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp 245 250 255

Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Glv Gly Leu Gly Thr Pro Val 260 265 270

Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Glv Glv Gln Ser Ala Gln 275 280 285

Asp Leu Asp Gln Leu Leu Glv Glv Leu Leu Leu Lvs Gly Leu Glu Ala

290 255 300

Thr Leu Lvs Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala 305 310 315 320

Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg 325 330 335

Asn Gln Ala Ala Ala 340 A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tem um peso molecular de 34-35 kDa. É rico em glicina (cerca de 13,5%) e desprovido de cisteína e tirosina. Outra informação sobre o elicitor de resposta hipersensível derivado de Pseudomonas syringae é encontrada em He, S.Y., H.C. Huang e A. Collmer, iiPseudomonas syringae pv. syringae HarpinPss: a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Çell 73: 1255-1266 (1993), que é incorporado aqui por referência. A molécula de DNA codificando o elicitor de resposta hipersensível de Pseudomonas syringae tem uma seqüência de nucleotídeos correspondente à SEQID NO: 6, como a seguir:

ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60 GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120 GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180 AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240 ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300 GACAGCGCC7 CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360 AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420 GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480 AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540 GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600 A3TGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660 AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720 GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780 TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840

A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado de Pseudomonas solanacearum tem uma seqüência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 7, como a seguir:

GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG GCCTGA

GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG CAAACnGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA Met Ser Val Glv Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln 1 5 10 15

Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser 20 25 30

Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lvs Asp Ile Leu Asn Ile Ile 35 40 45

Ala Ala Leu Val Gln Lvs Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly 50 55 60

Asn Thr Glv Asn Ala Pro Ala Lys Asp Glv Asn Ala Asn Ala Glv Ala 65 70 75 SO

Asn Asp Pro Ser Lvs Asn Aso Pro Ser Lvs Ser Gln Ala Pro Gln Ser 85 90 55

Ala Asn Lvs Thr Glv Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro MeC 100 105 HO

Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Aso Leu Val Lys Leu Leu Lvs Ala 115 120 125

Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val 130 135 140

Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lvs Gly Ala Gly Gly Gln Glv Glv Leu Ala 145 150 155 l£0

Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Glv 165 170 175

Gly Ala Glv Ala Gly Glv Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly 180 185 190

Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala 195 200 205

Aso Gly Gly Asn Gly Val Asn Glv Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn 210 215 220

Ala Glv Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp 225 230 235 240

Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lvs Ile Leu Asn 245 250 255

Ala Leu Val Gln Met Met Gln C-In Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln 260 265 270

Gly Asn Ala Ser Pro 275 280 285

Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Glv

Ala 0ly Ala Asn Gln Pro Ser ASD Asd Gln Se 290 295 300

Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ils Met Asp Val Val Lys Glu Val 30a 310 315

320

Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala C-In Asn Gly Gly Se- Gin 325 330 335

Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met 340

É codificado por uma molécula de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos correspondente à SEQID NO: 8, como a seguir:

ATGTCAGTCG GrtAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60 AACAC CAACK CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCC-7GC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120 GAGAAGGrv1-A TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180 GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240 AACGACCwGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAG7CGGC CAACAAGACC 300 GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGA7 CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 350 GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420 GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG G>_GGCCAG>jG CGGCCTGGCC 480 GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCC7C GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540 GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT SOO GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660 GGCCCGCAGA ACGCAGCCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720 CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780 ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840 GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGG CG CGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900 GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 960 GTCCAGATCC TG CAG CAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG G CAG CCAG CA GTCCACCTCG 1020 ACGCAGCCGA TGTAA 1035

Outra informação com respeito a uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível derivado de Pseudomonas solanacearum é descrita em Arlat, M., F. Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet e C.A. Boucher, "PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-Iike Response in Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearumEMBO J. 13: 543-533 (1994), que é incorporado aqui por referência.

A uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Xanthomonas campestris pv. glicinas tem uma seqüência de aminoácidos correspondente à SEQ ED NO: 9, como a seguir:

Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15

Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tvr Gln Asp Tyr 20 25 Esta seqüência é uma seqüência terminal amino tendo 26 resíduos somente da proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Xanthomonas campestris pv. glicinas. Ela se iguala com proteínas de subunidades fimbriais determinadas em outros patovares de Xanthomonas campestris.

A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Xanthomonas campestris pv. pelargonii é estável ao calor, sensível a protease e tem um peso molecular de 20 kDa. Ele inclui uma seqüência de aminoácidos correspondente à SEQID NO: 10, como a seguir:

<formula>formula see original document page 23</formula>

Isolamento do polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível de Erwinia carotovora é descrito em Cui et al., "The RsmA Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress hrp Necc and Elicit a Hypersensitive Reaction-Iike Response in Tobacco Leaves," MPML 9(7): 565-73 (1996), que é incorporado aqui por referência. O polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível é mostrado em Ahmad et al., "Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize," 8th. Int'l. Cong. Molec. Plant-Microbe Internet., 14-19 de julho de 1996 e Ahmad et al., "Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity of Ewrinia stewartii on Maize," Ann. Mtg. Am. Phvtopath. Soc., 27-31 de julho de 1996, que são incorporados aqui por referência.

Polipeptídeos ou proteínas elicitores de resposta hipersensível de Phytophthora parasitica, Phytophthora cryptogea, Phytophthora cinnamoni, Phytophthora capsici, Phytophthora megasperma e Phytophthora citrophtora são descritos em Kaman et al., "Extracellular Protein Elicitors from Phytophthora: Most Specificity and Induction of Resistance to Bacterial and Fungai Phytopathogens," Molec. Plant-Microbe Interact., 6(1): 15-25 (1993), Rieei et al., "Structure and Aetivity of Proteins from Pathogenie Fungi Phytophthora Elieiting Neerosis and Aequired Resistanee in Tobacco," Eur. J. Biochem., 183: 555-63 (1989), Ricei et al., "Differencial Produetion of Parasiticein, and Elieitor of Neerosis and Resistance in Tobacco, by Isolates of Phytophthora parasitica," Plant Path. 41: 298-307 (1992), Baillreul et al., "A New Elieitor of the Hypersensitive Response in Tobacco: A Fungai Glycoprotein Elicits Cell Death, Expression of Defense Genes, Production of Salicylic Acid, and Induction of Systemic Acquired Resistance," Plant. J., 8(4): 551-60 (1995), e Bonnet et al., "Acquired Resistance Triggered by Elicitors in Tobacco and Other Plants," Eur. J. Plant. Path., 102: 181-92 (1996), que são incorporados aqui por referência.

Os elicitores acima são ilustrativos. Outros elicitores podem ser identificados por bactérias ou fungos em crescimento que elicitam uma resposta hipersensível na qual genes codificando um elicitor são expressados. Preparações isentas de células de sobrenadantes de cultura podem ser testadas para atividade de elicitor (isto é, necrose local) usando os mesmos para infiltrar tecidos de planta apropriados.

E também possível usar fragmentos das proteínas ou polipeptídeos elicitores de resposta hipersensível acima bem como fragmentos de elicitores de comprimento completo de outros patógenos, no processo da presente invenção.

Fragmentos apropriados podem ser produzidos por vários meios. No primeiro, subclones do gene codificando uma proteína elicitora conhecida são produzidos por manipulação genética molecular convencional subclonando fragmentos genéticos. Os subclones são então expressados in vitro ou in vivo em células bacterianas para dar uma proteína menor ou um peptídeo que pode ser testado para atividade elicitora de acordo com o procedimento descrito abaixo. Como uma alternativa, fragmentos de uma proteína elicitora podem ser produzidos por digestão de uma proteína elicitora de comprimento completo com enzimas proteolíticas como quimotripsina ou proteinase A de Staphylococcus, ou tripsina. Enzimas proteolíticas diferentes clivam provavelmente proteínas elicitoras em sítios diferentes com base na seqüência de aminoácidos da proteína elicitora. Alguns dos fragmentos que resultam de proteólise podem ser elicitores ativos de resistência.

Em outra abordagem, com base no conhecimento da estrutura primária da proteína, fragmentos do gene da proteína elicitora podem ser sintetizados usando a técnica PCR junto com conjuntos específicos de iniciadores escolhidos para representar porções particulares da proteína. Estes então podem ser clonados em um vetor apropriado para aumento e expressão de uma proteína ou peptídeo trancado.

Síntese química pode também ser usada para preparar fragmentos apropriados. Esta síntese é realizada usando seqüências de aminoácidos para o elicitor sendo produzido. Alternativamente, submetendo- se um elicitor de comprimento completo a pressões e temperaturas elevadas serão produzidos fragmentos. Estes fragmentos podem, então, ser separados por procedimentos convencionais (por exemplo, cromatografia, SDS-PAGE).

Um exemplo de um fragmento útil é o fragmento popAl da proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível de Pseudomonas solanaeearum. Ver Arlat, M., F. Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet e C.A. Boucher, "PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-Iike Response in Specific Petunia Genotypes is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanaeearum," EMBO J. 13: 543-53 (1994), que é incorporado aqui por referência. Como para Erwinina amylovora, um fragmento apropriado pode ser, por exemplo, qualquer um ou ambos polipeptídeo se estendendo entre e incluindo aminoácidos 1 e 98 da SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo se estendendo entre e incluindo aminoácidos 137 e 204 da SEQ ID NO: 3.

Variantes podem também (ou alternativamente) ser modificadas, por exemplo, pela deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima sobre as propriedades, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma seqüência de sinal (ou líder) na extremidade terminal N da proteína que dirige co-translacionalmente ou pós-translacionalmente a transferência da proteína. O polipeptídeo pode ser também conjugado a uma seqüência ligadora ou outra para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo.

A proteína ou polipeptídeo da presente invenção é, preferivelmente, produzida na forma purificada (preferivelmente pelo menos cerca de 60%, mais preferivelmente 80%, pura) por técnicas convencionais. Tipicamente, a proteína ou polipeptídeo da presente invenção é produzida, mas não secretada, no meio de crescimento de células hospedeiras recombinantes. Alternativamente, a proteína ou polipeptídeo da presente invenção é secretada no meio de crescimento. No caso de proteína não secretada, isolar a proteína, a célula hospedeira (por exemplo, E. coli) conduzindo um plasmídeo recombinante é propagada, lisada por tratamento por som, tratamento a quente ou químico, e o homogenado é centrifugado para remover resíduos bacterianos. O sobrenadante é então submetido a tratamento a quente e a proteína elicitora de resposta hipersensível é separada por centrifugação. A fração do sobrenadante contendo o polipeptídeo ou proteína da presente invenção é submetida a filtragem com gel em uma dextrano apropriadamente dimensionado ou coluna de poliacrilamida para separar as proteínas. Se necessário, a fração de proteína pode ser ainda purificada por troca iônica ou HPLC.

A molécula de DNA codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser incorporada nas células usando tecnologia de DNA recombinante convencional. Geralmente, isto envolve inserir a molécula de DNA em um sistema de expressão em que a molécula de DNA é heteróloga (isto é, não normalmente presente). A molécula de DNA heteróloga é inserida no vetor ou sistema de expressão na orientação de sentido próprio e quadro de leitura correto. O vetor contém os elementos necessários para a transcrição e tradução de seqüências de codificação de proteína inseridas.

Patente US n° 4.237.224 para Cohen e Boyer, que é incorporada aqui por referência, descreve a produção de sistemas de expressão na forma de plasmídeos recombinantes usando clivagem de enzimas de restrição e ligação com ligase de DNA. Estes plasmídeos recombinantes são então introduzidos por meio de transformação e replicados em culturas unicelulares incluindo organismos procarióticos e células eucarióticas crescendo na cultura de tecidos.

Genes recombinantes podem também ser introduzidos em vírus, como vírus de vacina. Vírus recombinantes podem ser gerados por transfecção de plasmídeos em células infectadas com vírus.

Vetores apropriados incluem, mas não estão limitados aos seguintes vetores virais como sistema de vetor lambda gtll, gt WES.tB, Charon 4, e vetores de plasmídeos como pBR322, pBR325, pACYC177, pAÇYC1084, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKClOl, SV 40, pBluescript II SK +/- ou KS +/- (ver Catálogo "Stratagene Cloning Systems" (1993) de Stratagene, La Jolla, Calif, que é incorporado aqui por referência), séries pQE, pIH821, pGEX, pET (ver F.W. Studier et al., "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes," Gene Expression Techonology vol. 185 (1990), que é incorporado aqui por referência), e quaisquer derivados dos mesmos. Moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células via transformação, particularmente transdução, conjugação, mobilização ou eletroporação. As seqüências de DNA são clonadas no vetor usando procedimentos de clonagem padrões na arte, como descrito por Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1989), que é incorporado aqui por referência.

Uma variedade de sistemas de vetor-hospedeiro pode ser utilizada para expressar a(s) sequência(s) codificando proteínas. Primeiramente, o sistema de vetor deve ser compatível com a célula hospedeira usada. Sistemas vetor-hospedeiro incluem, mas não estão limitados aos seguintes: bactérias transformadas com DNA de bacteriófago, DNA de plasmídeo, ou DNA de comídeo; microorganismos como levedura contendo vetores de levedura; sistemas de células de mamíferos infectadas com vírus (por exemplo, vírus vacínia, adenovírus, etc.); sistemas de células de insetos infectadas com vírus (por exemplo, baculovírus); e células de plantas infectadas por bactérias. Os elementos de expressão destes vetores variam em sua resistência e especificidades. Dependendo do sistema vetor- hospedeiro utilizado, qualquer um de um número de elementos de tradução e transcrição apropriados pode ser usado.

Sinais genéticos diferentes e eventos de processamento controlam muitos níveis de expressão de genes (por exemplo, transcrição de DNA e tradução de RNA mensageiro (mRNA).

Transcrição de DNA depende da presença de um promotor que é uma seqüência de DNA que dirige a ligação de polimerase RNA e, assim, promove síntese de mRNA. As seqüências de DNA de promotores eucarióticos diferem das dos promotores procarióticos. Além disso, promotores eucarióticos e sinais genéticos que os acompanham podem não ser reconhecidos em ou podem não funcionar em um sistema procariótico, e, ainda, promotores procarióticos não são reconhecidos e não funcionam em células eucarióticas.

Similarmente, tradução de mRNA em procarióticos depende da presença dos sinais procarióticos próprios que diferem dos de eucarióticos. Tradução eficaz de mRNA em procarióticos requer um sítio de ligação de ribossomas denominado a seqüência Shine-Dalgarno ("SD") no mRNA. Esta seqüência é uma seqüência de nucleotídeos curta do mRNA que está localizado antes do códon de partida, geralmente AUG, que codifica a metionina terminal amino da proteína. As seqüências SD são complementares à extremidade 3' do rRNA 16S (RNA ribossomal) e, provavelmente, promove ligação de mRNA a ribossomas por duplexação com o rRNA para permitir posicionamento correto do ribossoma. Para um estudo na maximização da expressão de genes, ver Roberts and Lauer, Methods in Enzymology., 68: 473 (1979), que é incorporado aqui por referência.

Promotores variam em sua "resistência" (isto é, sua capacidade de promover transcrição). Para os fins de expressar um gene clonado, é desejável usar promotores fortes a fim de obter um nível alto de transcrição e, consequentemente, expressão do gene. Dependendo do sistema de célula hospedeira utilizado, qualquer um dentre vários promotores apropriados pode ser usado. Por exemplo, quando clonando em E. coli, seus bacteriófagos, ou plasmídeos, promotores como o promotor de fago T7, promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor de DNA ribossomal, os promotores Pr e Pl de lambda colifago e outros, incluindo mas não limitado, a lacVN5, ompF, bla, lpp, e outros, podem ser usados para dirigir níveis altos de transcrição de segmentos de DNA adjacentes. Adicionalmente, um promotor (tac) trp-lacUV5 híbrido ou outros promotores de E. coli produzidos por DNA recombinante ou outras técnicas de DNA sintéticas podem ser usados para prover transcrição do gene inserido.

Cepas de células hospedeiras bacterianas e vetores de expressão podem ser escolhidos, os quais inibem a ação do promotor, a menos que especificamente induzidos. Em algumas operações, a adição de indutores específicos é necessária para transcrição eficaz do DNA inserido. Por exemplo o operon Iac é induzido pela adição de lactose ou IPTG (isopropiltio-beta-D-galactosídeo). Uma variedade de outros operons, como trp,pro, etc., estão sob controles diferentes.

Sinais de iniciação específicos são também requeridos para translação e transcrição de genes eficazes em células procarióticas. Estes sinais de iniciação para translação e transcrição podem variar na "resistência" quando medidos pela quantidade de RNA mensageiro específico de genes e proteína sintetizada, respectivamente. O vetor de expressão de DNA, que contém um promotor, pode também conter qualquer combinação de vários sinais de iniciação para translação e/ou transcrição "fortes". Por exemplo, translação eficaz em E. coli requer uma seqüência SD de cerca de 7-9 bases 5' no códon de iniciação (ATG) para prover um sítio de ligação de ribossoma. Assim, qualquer combinação SD-ATG que pode ser utilizada pelos ribossomas de células hospedeiras pode ser empregada. Estas combinações incluem, mas não estão limitadas à combinação SD-ATG do gene cro ou do gene N de lambda colifago, ou dos genes E, D, C, B ou A triptofano E. coli. Adicionalmente, qualquer combinação SD-ATG produzida por técnicas de DNA recombinante ou outras envolvendo incorporação de nucleotídeos sintéticos pode ser usada.

Uma vez a molécula de DNA isolada codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível tenha sido clonada em um sistema de expressão, ela está pronta para ser incorporada em uma célula hospedeira. Esta incorporação pode ser realizada pelas várias formas de transformação acima indicadas, dependendo do sistema vetor/célula hospedeira. Células hospedeiras apropriados incluem, mas não estão limitadas a, bactérias, vírus, levedura, células de mamíferos, inseto, planta, e outros.

O processo da presente invenção pode ser utilizado para tratar uma ampla variedade de plantas ou suas sementes para melhorar o crescimento. Plantas apropriadas incluem dicotiledôneas e moncotiledôneas. Mais particularmente, plantas de cultura utilizáveis pode incluir: arroz, trigo, cevada, centeio, algodão, girassol, amendoim, milho, batata, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete, espinafre, cebola, alho, berinjela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, abóbora-moranga, zuccini, pepino, maçã, pera, melão, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, sorgo e cana-de-açúcar. Exemplos de plantas ornamentais apropriadas são: rosa, Saintpaulia, petúnia, pelargônio, poinsétia, crisântemo, cravo e zínia.

O processo da presente invenção envolvendo aplicação da proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser realizado através de uma variedade de procedimentos quando toda ou parte da planta é tratada, incluindo folhas, caules, raízes, etc. Isto pode (mas não necessita) envolver infiltração da proteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível na planta. Processos de aplicação apropriados incluem aplicação tópica (por exemplo, pulverização alta e baixa pressão), injeção, polvilhamento, e abrasão da folha próxima quando a aplicação do elicitor se realiza. Quando do tratamento de sementes de planta, de acordo com a forma de realização da aplicação da presente invenção, o polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado por aplicação tópica (pulverização em baixa ou alta pressão), revestimento, imersão, polvilhamento ou injeção. Outros procedimentos de aplicação apropriados podem ser considerados pelos versados na arte com a condição de que eles sejam capazes de efetuar o contacto da proteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível com células da planta ou sementes da planta. Uma vez tratadas com o elicitor de resposta hipersensível da presente invenção, as sementes podem ser plantadas em solo natural ou artificial e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir plantas. Após as plantas terem se propagado das sementes tratadas de acordo com a presente invenção, as plantas podem ser tratadas com uma ou mais aplicações do polipeptídeo ou proteína elicitor de resposta hipersensível para melhorar o crescimento nas plantas. As plantas propagadas podem, por sua vez, ser úteis na produção de sementes ou propágulos (por exemplo, mudas) que produzem plantas capazes de crescimento melhorado.

A proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado a plantas ou sementes de plantas, de acordo com a presente invenção, sozinho ou em mistura com outros materiais. Alternativamente, a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado separadamente a plantas com outros materiais sendo aplicados em períodos diferentes.

Uma composição apropriada para tratar plantas ou sementes de plantas de acordo com a forma de realização de aplicação da presente invenção contém uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em um veículo. Veículos apropriados incluem água, soluções aquosas, suspensões ou pós secos. Nesta forma de realização, a composição contém mais do que 0,5 nM de proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível.

Apesar de não requerido, esta composição pode conter aditivos adicionais incluindo fertilizante, inseticida, fungicida, nematicida, herbicida e misturas dos mesmos. Fertilizantes apropriados incluem (NH4)2NOs. Um exemplo de um inseticida apropriado é Malathion.

Fungicidas úteis incluem Captan.

Outros aditivos apropriados incluem agentes de tamponamento, agentes umectantes, agentes de revestimento e agentes de abrasão. Estes materiais podem ser usados para facilitar o processo da presente invenção. Além disso, a proteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível pode ser aplicado a sementes de plantas com outra formulação de semente convencional e materiais de tratamento, incluindo argilas e polissacarídeos.

Na forma de realização alternativa da presente invenção envolvendo o uso de plantas transgênicas e sementes transgênicas, uma proteína ou polipeptídeo de elicitor de resposta hipersensível não necessita ser aplicado topicamente às plantas ou sementes. Em vez disso, plantas transgênicas transformadas com uma molécula de DNA codificando uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível são produzidas de acordo com procedimentos bem conhecidos na arte, como por biolísticos ou transformação mediada por Agrobacterium. Exemplos de vasoínas ou polipeptídeos elicitores de resposta hipersensível e as seqüências de ácido nucleico para seu DNA de codificação são descritos supra. Uma vez que plantas transgênicas deste tipo são produzidas, as plantas propriamente ditas podem ser cultivadas de acordo com procedimento convencional com a presença do gene codificando o elicitor de resposta hipersensível resultando no crescimento melhorado da planta. Alternativamente, sementes transgênicas são recuperadas de plantas transgênicas. Estas sementes podem então ser plantadas no solo e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir plantas transgênicas. As plantas transgênicas são propagadas das sementes transgênicas plantadas em condições eficazes para conferir crescimento melhorado. Apesar de não se desejar estar ligado por teoria, a melhora do crescimento pode ser mediada por RNA ou pode resultar da expressão da proteína ou polipeptídeo elicitor.

Quando plantas transgênicas e sementes de plantas são usadas de acordo com a presente invenção, elas, além disso, podem ser tratadas com os mesmos materiais como são usados para tratar as plantas e sementes às quais uma proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é aplicada. Estes outros materiais, incluindo elicitores de resposta hipersensível podem ser aplicados às plantas transgênicas e sementes de plantas pelos procedimentos indicados acima, incluindo pulverização com alta ou baixa pressão, injeção, revestimento, polvilhamento e imersão. Similarmente, após as plantas serem propagadas de sementes de plantas transgênicas, as plantas podem ser tratadas com uma ou mais aplicações do elicitor de resposta hipersensível para melhorar o crescimento das plantas. Estas plantas podem ser também tratadas com agentes de tratamento de plantas convencionais (por exemplo, inseticidas, fertilizantes, etc.). As plantas transgênicas da presente invenção são utilizáveis em propágulos ou sementes em produção (por exemplo, mudas) dos quais as plantas capazes de crescimento melhorado podem ser produzidas.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora sobre a porcentagem de germinação

Sementes da variedade tomate Marglobe foram submergidas em 40 ml da solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora ("harpin"). Harpin foi preparado cultivando a cepa DH5 de E. coli contendo o plasmídeo pCPP2139 (ver figura 1), lisando as células por tratamento com som, tratando com calor mantendo-se em água quente durante 5 minutos antes de centrifugar para remover resíduos celulares, e precipitando proteínas e outros componentes instáveis ao calor. A preparação resultante ("CFEP") foi diluída em série. Estas diluições (1:40, 1:80, 1:160, 1:320 e 1:640) continham 20, 10, 5, 2,5 e 1,25 μgm/ml, respectivamente, de harpin com base em teste Western Blot. Sementes foram embebidas em harpin ou tampão em béquers no dia 0, durante 24 h a 28°C, em uma câmara de crescimento. Após embaimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1. Este procedimento foi realizado em 100 sementes por tratamento.

Tratamentos:

1. Sementes em harpin (1:40) (20 μgm/ml). 2. Sementes em harpin (1:80) (10 μgm/ml).

3. Sementes em harpin (1:160) (5 μgm/m1).

4. Sementes em harpin (1:320) (2,5 μgm/m1).

5. Sementes em harpin (1:640) (1,25 μgm/m1),

6. Sementes em harpin (KPO4 5mM, pH 6,8).

TABELA 1 - Número de arbustos após tratamento das sementes

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Como mostrado na tabela 1, o tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora reduziu o tempo necessário para germinação e aumentou grandemente a porcentagem de germinação.

Exemplo 2 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na altura do tomateiro

Sementes da variedade de tomate Marglobe foram submergidas em tampão ou harpin de Erwinia amylovora (1:15, 1:30, 1:60 e 1:120) em béquers no dia 0 durante 24 h a 28°C em uma câmara de crescimento. Após embebimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1.

Dez plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e medidas. Os arbustos foram medidor por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos: 1. Harpin (1:15) (52 ugm/ml).

2. Harpin (1:30( (26 μgm/ml).

3. Harpin (1:60) (13 μgm/ml).

4. Hamin (1:120) (6,5 ugm/ml).

5. Tampão (KPO4 5mM, pH 6,8) Tabela 2

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Tabela 3

<table>table see original document page 37</column></row><table> Tabela 4

<table>table see original document page 38</column></row><table> TABELA 5 -Sumário - Altura média dos tomateiros após tratamento. Tratamento Altura média dos tomateiros (cm)

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Como mostrado nas tabelas 2-5, o tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível de Erwinia amylovora aumentou o crescimento das plantas. Uma diluição 1:30 teve o efeito maior - um aumento de 16% na altura dos arbustos.

Exemplo 3 - Efeito do tratamento de tomateiros com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na altura dos tomateiros

Quando tomateiros Marglobe tinham 4 semanas de idade, foram pulverizados com 6 ml/solução de harpin de Erwinia amylovora contendo 13 μ§ιτι/πι1 (1:60) ou 8,7 μgm/ml (1:90) de harpin ou tampão (KPO4 5mM) em uma câmara de crescimento a 28°C. As alturas dos tomateiros foram medidas 2 semanas após pulverização com harpin (tomateiros com 6 semanas de idade) e 2 semanas mais 5 dias após pulverização. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e medidas. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos:

1. Harpin (1:60) 13 μgm/ml).

2. Harpin (1:90) 8,7 μgm/ml).)

3. Tampão (KPO4 5mM, pH 6,8). TABELA 6 - Altura média dos tomateiros após tratamento com harpin.

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Como mostrado na tabela 6, pulverização de arbustos de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. Aumentos similares no crescimento foram observados para as duas doses do elicitor de resposta hipersensível testado comparado com o controle tratado com tampão.

Exemplo 4 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na altura de tomateiros.

Sementes de tomate Marglobe foram submergidas em solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora ("harpin") (1:40, 1:80, 1:160, 1:320 e 1:640) ou tampão em béquers no dia 0 durante 24 h a 28°C na câmara de crescimento. Após embeber as sementes em harpin ou tampão, elas foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e medidas. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos:

1. Harpin (1:40) (20 μgm/ml).

2. Harpin (1:80) (10 μgm/ml).

3. Harpin (1:160) (5 μgm/ml).

4. Harpin (1:320) (2,5 μgm/ml).

5. Harpin (1:640) (1,25 μgm/ml).

6. Tampão (KPO4 5mM, pH 6,8). Tabela 7

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Tabela 8

<table>table see original document page 41</column></row><table> Tabela 9

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Tabela 10

<table>table see original document page 42</column></row><table> Como mostrado nas tabelas 7-10, o tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. Uma diluição 1:160 (5 μgm/ml harpin) teve o o maior efeito - altura do arbusto foi aumentada em mais do que 20% sobre as plantas tratadas com tampão.

Exemplo 5 - Efeito do tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora na porcentagem de geração de sementes

Sementes de tomate Marglobe foram submergidas em 40 ml de solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora ("harpin") (diluições de CFEP de DH5 E. coli (pCPP2139) de 1:50 ou 1:100 que continha, respectivamente, 8 μgm/ml e 4 μgm/l do elicitor de resposta hipersensível ) e tampão em béquers no dia 0 durante 24 h a 28°C em uma câmara de crescimento. Após embebimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 1. Este tratamento foi realizado em 20 sementes por vaso e 4 vasos por tratamento.

Tratamentos:

1. Harpin (8 μgm/ml).

2. Harpin (8 μgm/ml).

3. Harpin (8 μgm/ml).

4. Harpin (8 μgm/ml).

5. Harpin (4 μgm/ml).

6. Harpin (4 μgm/ml).

7. Harpin (4 μgm/ml).

8. Harpin (4 μgm/ml).

9. Tampão (KPO4 5mM, pH 6,8).

10. Tampão (KPO4 5mM, pH 6,8).

11. Tampão (KPO4 5mM, pH 6,8).

12. Tampão (KPO4 5mM, pH 6,8). TABELA 11 - Número de arbustos após tratamento das sementes com harpin.

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Como mostrado na tabela 11, tratamento de sementes de tomate com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar a taxa de germinação e o nível de tomateiros. A dose mais alta usada pareceu ser mais eficaz do que tampão ao término da experiência.

Exemplo 6 - Efeito no crescimento de plantas do tratamento de sementes de tomate com proteínas preparadas de E. coli contendo uma construção codificando o elicitor de resposta hipersensível, pCPP2139, ou vetor de plasmídeo pCPP50

Sementes de tomate Marglobe foram submergidas no elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora ("harpin") (de DH5a E. coli (pCPP2139) (figura 1) ou preparação de vetor (de DH5a (pCPP50) (figura 2) com proteína BSA adicionada como controle. A preparação do vetor de controle continha, por ml, 33,6 μl de BSA (10 mg/l) para prover cerca da mesma quantidade da proteína contida na preparação de pCPP2139 devido a harpin. Diluições de 1:50 (8,0 μg/ml), 1:100 (4,0 μg/ml) e 1:200 (2,0 μg/ml) foram preparadas em béquers no dia 1, e a semente foi submergida durante 24 horas a 28°C, em uma câmara com ambiente controlado.

Após embebimento, as sementes foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 2. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento, foram escolhidas aleatoriamente e medidas três vezes após transplante. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos:

1. Harpin 1:50 (8,0 μg/ml)

2. Harpin 1:100 (4,0 μg/ml)

3. Harpin 1:200 (2,0 μg/ml)

4. Vetor + BSA 1:50 (0 harpin)

5. Vetor + BSA 1:100 (0 harpin)

6. Vetor + BSA 1:200 (0 harpin) <table>table see original document page 46</column></row><table> Tabela 14

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Tabela 15

<table>table see original document page 47</column></row><table> Como mostrado nas tabelas 12-15, tratamento com E. coli contendo o gene codificando o elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. A diluição 1:100 (4,0 ug/ml) teve o efeito maior, enquanto concentrações mais baixas e mais altas tiveram efeito menor. Altura média de arbustos para tratamento com 4,0 μ g/ml de harpin foi aumentada a cerca de 20% com relação à preparação do vetor de controle que continha uma quantidade similar de proteína não- harpin. Componentes de preparação de célula lisada da cepa DH5a de E. coli (pCPP50), que abrigam o vetor do gene hrpN na cepa DH5a de E. coli (pCPP2139), não têm o mesmo efeito promotor de crescimento como a preparação contendo harpin, mesmo dado que é suplementado com proteína BSA na mesma extensão que a preparação de DH5a (pCPP2139), que contém quantidades grandes da proteína harpin.

Exemplo 7 - Efeito no crescimento de tomateiros do tratamento de sementes de tomate com proteínas preparadas de E. coli contendo uma construção codificando um elicitor, pCPP2139, ou seu vetor de plasmídeo pCPP50

Sementes de tomate Marglobe foram submergidas em solução de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora ("harpin") (do vetor de plasmídeo pCPP2139 codificando harpin) e da solução contendo o vetor pCPP50 em diluições de 1:25, 1:50 e 1:100 em béquers, no dia 1 durante 24 h a 28oC em uma câmara de crescimento. Após embebimento das sementes, elas foram semeadas em vasos de germinação com solo artificial no dia 2. Dez plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e medida. Os arbustos foram medidos por régua da superfície do solo ao topo da planta.

Tratamentos:

1. Harpin 16 μgm/ml

2. Harpin 8 μgm/ml

3. Harpin 4 μgm/ml 4. Vetor 16 μgm/ml

5. Vetor 8 μgm/ml

6. Vetor 4 μgm/ml Tabela 16

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Tabela 17

<table>table see original document page 50</column></row><table> TABELA 18 - Altura média dos tomateiros após tratamento.

Operação e Tratamento Altura média de tomateiros (cm)

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Como mostrado nas tabelas 16-18, o tratamento com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora pode aumentar o crescimento de tomateiros. Uma diluição de 1:50 (8 μg/ml de elicitor de resposta hipersensível ) teve o efeito maior com a altura do arbusto sendo aumento por cerca de 20% sobre o controle.

Exemplo 8 - Efeito do elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora isento de célula no crescimento de batata

Tomateiros com 3 semanas de idade, variedade Norchip, cresceram em pedaços de tubérculos em recipientes individuais. A folhagem de cada planta foi pulverizada com uma solução contendo elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora ("harpin"), ou uma solução de controle contendo proteínas de E. coli e as do vetor pCPP50 ("vetor"), diluída 1:50, 1:100 e 1:200. No dia 20, 12 plantas parecendo uniformes foram escolhidas aleatoriamente para um dos seguintes tratamentos. Uma planta de cada tratamento foi mantida a 16°C em uma câmara de crescimento, enquanto duas plantas de cada tratamento foram mantidas em um banco de estufa a 18-25°C. Vinte e cinco dias após tratamento, os brotos (caules) de todas as plantas foram medidos individualmente.

Tratamentos:

1. Harpin 1:50 16 μgm/ml 2. Harpin 1:100 8 μgm/ml

3. Harpin 1:200 4 μgm/ml

4. Vetor 1:50 0 harpin

5. Vetor 1:100 0 harpin

6. Vetor 1:200 0 harpin <table>table see original document page 53</column></row><table> Como mostrado nas tabelas 19 e 20, o tratamento de plantas de batata com elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora melhorou o crescimento dos brotos (caules). Assim, o crescimento total, como julgado tanto pelo número e comprimentos médios dos caules, foi maior nas plantas tratadas com harpin tanto em plantas crescendo em câmara de crescimento como em estufa. As plantas de batata tratadas com a dose média de harpin (6 μgm/ml) pareceram melhorar em seu crescimento de caule mais do que as tratadas tanto com doses mais altas como mais baixas. Tratamento com a dose média de harpin resultou em crescimento maior em ambas as condições de crescimento.

Exemplo 9 - Efeito da pulverização de tomates com uma preparação de elicitor isenta de célula contendo o harpin de Erwinia amylovora

Tomateiros Marglobe foram pulverizados com preparação de harpin (de DH5a de E. coli (pCPP2139)) ou preparação de vetor (de DH5 α de E. coli (pCPP50)) com proteína BSA adicionada como controle 8 dias após transplante. A preparação do vetor de controle continha, por ml, 33,6 μl de BSA (10 mg/ml) para prover cerca da mesma quantidade de proteína como contida na preparação de pCPP2139 devido a harpin. Diluições de 1:50 (8,0 μ g/ml), 1:100 (4,0 μg/ml), e 1:200 (2,0 μg/ml) foram preparadas e pulverizadas nas plantas até escoar com um atomizador em pó com eletricidade. Quinze plantas parecendo uniformes por tratamento foram escolhidas aleatoriamente e designadas para tratamento. As plantas foram mantidas a 28°C em uma câmara com ambiente controlado antes e após o tratamento.

Alturas totais foram medidas várias vezes após tratamento da superfície do solo ao topo da planta. Os topos dos tomateiros foram pesados imediatamente após cortar os caules próximo à superfície do solo.

Tratamentos: (Diluições e teor de harpin)

1. Harpin 1:50(8,0 μg/ml) 2. Harpin 1:100 (4,0 μg/ml)

3. Harpin 1:200 (2,0 μg/ml)

4. Vetor + BSA 1:50 (0 harpin)

5. Vetor + BSA 1:100 (0 harpin)

6. Vetor + BSA 1:200 (0 harpin) Tabela 21

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 22

<table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table> <table>table see original document page 58</column></row><table> Uma pulverização única de arbustos de tomate com harpin, em geral, resultou no crescimento subsequente maior do que tratamento com pulverização com a preparação de controle (vetor), que foi suplementada com proteína B SA, Crescimento melhorado em plantas tratadas com harpin foi observado em ambas as medições de altura e de peso novo. Das três concentrações testadas, as duas mais baixas resultaram em mais crescimento das plantas (com base em qualquer medição) do que a dose mais alta (8,0 μ g/ml). Houve uma diferença pequena no crescimento das plantas tratadas com as duas concentrações mais baixas (2 e 4 μg/ml). Componentes de preparação de célula lisada de DH5a de E. coli (pCPP50), que abriga o vetor do gene hrpN na cepa DH5a de E. coli (pCPP2139), não têm o mesmo efeito de promoção de crescimento como a preparação contendo harpin, ainda que ele seja suplementado com proteína BSA na mesma extensão como a preparação com DH5a (pCPP2139), que contém quantidades grandes da proteína harpin.

Assim, esta experiência demonstra que harpin é responsável pelo crescimento de plantas melhorado.

Exemplo 10 - Amadurecimento e coloração prematuros de frutas pequenas

Uma tentativa de campo foi conduzida para avaliar o efeito do tratamento ("harpin") com elicitor de resposta hipersensível nos parâmetros e amadurecimento e produção de framboesas cv. Canby. Plantas estabelecidas foram tratadas com harpin a 2,5 mg/9,3 m em pedaços de 1200 cm de comprimento χ 90 cm de largura), não tratadas ("Controle"), ou tratadas com o produto químico padrão na indústria Ronilam nas taxas recomendadas ("Ronilan"). Os tratamentos foram replicados quatro vezes e dispostos por rep em um sítio de campo experimental. Os tratamentos foram feitos iniciando a 5-10% de floração seguidos por duas aplicações em intervalos de 7-10 dias. As primeiras duas colheitas foram usadas para avaliar o controle de doenças e dado de produção de frutas foi coletado das últimas duas colheitas. Observações indicaram que frutas tratadas com harpin eram maiores e demonstravam mais vermelhidão do que frutas não tratadas, indicando que o amadurecimento foi acelerado por 1-2 semanas. O número de frutas maduras por agrupamentos carregando um mínimo de dez frutas foi determinado neste período e está resumido na tabela 26. Lotes de terra tratados com harpin tinham mais frutas maduras por 10 agrupamentos de framboesa do que tratamentos tanto com controle como com Ronilan. Rendimentos da produção combinados das duas últimas colheitas indicaram produção aumentada em plantas tratadas com Ronilan e harpin sobre o controle não tratado (tabela 27).

TABELA 26 - Número de frutas framboesa maduras por agrupamentos com dez framboesas ou mais em 20 de junho de 1996

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TABELA 27 - Produção de frutas framboesa médio em peso (kg) combinado com as duas últimas colheitas)

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Exemplo 11 - Melhora no crescimento para feijões em vagem

Feijões da variedade Blush Blue Lake foram tratadas por vários processos, plantadas em vasos de plástico de 25 cm-d carregados com mistura de vaso comercial, e colocadas em uma estufa aberta para a avaliação dos parâmetros de crescimento. Tratamentos incluíram sementes de feijão não tratadas ("Controle"), sementes tratadas com uma suspensão de 1,5% metil celulose preparada com água como diluente ("M/C"), sementes tratadas com 1,5% metil celulose seguidas por aplicação foliar do elicitor de resposta hipersensível ("harpin") a 0,125 mg/ml ("M/C+H"), e sementes tratadas com 1,5% metil celulose mais harpin secadas por pulverização a 5,0 μg harpin por 50 sementes seguido por uma aplicação foliar de harpin a 0,125 mg/ml ("M/C-SD+H"). As sementes foram semeadas no dia 0, plantadas 3 por vaso, e reduzidas a 1 planta por vaso quando em germinação. Os tratamentos foram replicados 10 vezes e randomizados por replicação em uma estufa aberta.

Vagens de feijão foram colhidas após 64 dias, e pesos novos de vagens de feijão de tamanho comercializável (> 10 cm χ 5 cm em tamanho) foram colhidos como produção. Os dados foram analisados por análise de variação com LSD de Fisher usado para separar os meios de tratamento.

TABELA 28 - Efeito do tratamento com harpin de Erwinia amylovora por vários processos na produção de vagens de feijão de tamanho comercializável

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1Produção comercializável incluiu todas as vagens de feijão de 10 cm χ 0,5 cm ou maiores. Médias seguidas pelo mesma letra não são significativamente diferentes em p=0,05 de acordo com LSD de Fisher.

Como mostrado na tabela 28, a aplicação de harpin de Erwinia amylovora por vários processos de aplicação resultou em um aumento no produção de vagens de feijão de tamanho comercializável. Tratamento com metil celulose sozinho também resulta em um aumento na produção de feijão, mas foi substancialmente aumentado quando combinado com harpin como tratamentos de semente (sedado por pulverização) e foliares.

Exemplo 12 - Aumento na produção em pepineiros de aplicação foliar de HP- 1000™ a pepineiros

Transplantes e arbustos de pepineiros foram tratados com pulverizações foliares de HP-1000™ (EDEN Bioscience. Bothell, Washington) (formulações do elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) em taxas de 15, 30 ou 60 μg/ml do ingrediente ativo (a.i.). A primeira pulverização foi aplicada quando as primeiras folhas verdadeiras se expandiram. A segunda aplicação foi feita 10 dias depois da primeira pulverização. Todas as pulverizações foram aplicadas usando um pulverizador de mochila e um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Três dias após a segunda aplicação de HP-1000™, dez plantas de cada tratamento foram transplantadas em lotes de terra randomizados replicados três vezes. Isto deu um total de trinta plantas por tratamento. Sete dias após transplante, uma terceira pulverização foliar de HP-1000™ foi aplicada. Apesar da seca grave seguinte resultando em uma tensão de água significativa, um total de seis colheitas foram feitas seguindo um padrão de colheita comercial padrão. O peso total de frutas colhidas de cada tratamento é apresentado na tabela 29. Resultados indicam que plantas tratadas com HP-1000™ em taxas de 15 e 30 μ£/πι1 deram significativamente mais frutas do que UTC. Plantas tratadas com HP-1000™ deram um aumento em produção moderada. Estes resultados indicaram que plantas tratadas com HP-1000™ eram significativamente mais tolerantes a condições de tensão de seca do que plantas não tratadas.

TABELA 29 - Produção aumentada de pepineiros após tratamento com HP- 1000™

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Ingrediente ativo (a.i.). Médias seguidas por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=O,05.

Exemplo 13 - Aumento na produção em algodão do tratamento com HP-1000™

Algodão foi plantado em quatro lotes de terra replicados de 3,66 m χ 6,1 m em uma tentativa de campo em bloco completo randomizado (RCB). As plantas foram tratadas com HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amyJovora), HP- 1000™ + Pix® (Pix® (BASF Corp., Mount Olive, NJ.) é um regulador de crescimento aplicado para manter plantas de algodão compactas em altura) ou Early Harvest® (Griffen Corp., Valdosta, Ga.) (um agente melhorador de crescimento competitivo). Um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Usando um pulverizador de mochila, aplicações foliares foram feitas de todos os tratamentos em três estágios de crescimento de culturas; primeiro as folhas verdadeiras, pré-florescência, e florescência prematura. Todos os fertilizantes e produtos de controle de ervas daninhas foram aplicados de acordo com práticas de agricultura convencionais durante todos os tratamentos. O número de bolas de algodão por planta dez semanas antes da colheita foi significativamente maior para as plantas tratadas com HP-1000™ comparado a outros tratamentos. Por colheita, tratamento com HP-1000™ mostrou ter uma produção de fibras de algodão significativamente melhorada (43%) comparado a UTC (tabela 30). Quando HP-1000™ foi combinado com Pix®, a produção de fibras de algodão aumentou em 20% sobre UTC. Uma vez que Pix® é comumente aplicado em grandes extensões de acre de algodão, este resultado indica que HP-1000™ pode ser misturado em tanques com Pix® com sucesso. Aplicação do agente melhorador de crescimento competitivo, Early Harvest® produziu somente um aumento de 9% na produção de fibras de algodão vs. UTC. TABELA 30 - Produção de fibras de algodão aumentada de algodão após tratamento com HP-1000™, HP-1000™ + Pix®, ou Earli Harvest®.

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1 Taxas para HP-1000™ são para ingrediente ativo (a.i.); taxas para Early Harvest® e Pix® são produto formulado.

Exemplo 14 - Aumento na produção de beringela da China do tratamento com HP-1000™

Arbustos de beringela da China crescendo em sementeiras foram pulverizados uma vez com HP-1000™ a (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) 15, 30 ou 60 μg/ml (a.i.), depois transplantados em lotes de terra replicados três vezes para cada tratamento. Duas semanas após transplante, uma segunda aplicação de HP-1000™ foi preparada. Uma terceira e final aplicação de HP- 1000™ foi aplicado aproximadamente duas semanas após a segunda pulverização. Todas as pulverizações foram aplicadas usando um pulverizador de mochila; controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Como o amadurecimento progrediu, um total de oito colheita para cada tratamento foi feito. Dados destas colheitas indicam que tratamento com HP-1000™ resultou em produção maior de fruta por planta. TABELA 31 - Produção aumentada para beringela da China após tratamento com HP-1000™

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Exemplo 15 - Produção aumentada de arroz do tratamento com HP-1000™

Arbustos de arroz foram transplantados em lotes de terra replicados três vezes, depois tratados com pulverizações foliares de HP-1000 ™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora), em três taxas diferentes, usando um pulverizador de mochila. Um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. A primeira aplicação de HP-1000™ foi feita uma semana após transplante, a segunda, três semanas após a primeira. Uma terceira e final pulverização foi feita exatamente antes dos grãos de arroz começarem a encher as cabeças. Resultados de colheita demonstraram que aplicações foliares de HP-1000™, ambas de 30 e 60 μg/ml, aumentaram significativamente a produção em 47 a 56%, respectivamente (tabela 32).

TABELA 32 - produção aumentada de arroz após tratamento foliar com HP- 1000™

<table>table see original document page 65</column></row><table> Exemplo 16 - Aumento da produção de feijões do tratamento com HP-1000™ Feijões foram plantados em lotes de terra randomizados replicados três vezes para cada tratamento. Um pulverizador de mochila foi usado para aplicar pulverizações foliares de HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) e um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Três taxas de HP-1000™ foram aplicadas começando em quatro folhas verdadeiras quando plantas tinham aproximadamente 20,24 cm de altura. Uma segunda pulverização de HP-1000™ foi aplicada dez dias após a primeira aplicação e uma terceira pulverização dez dias após a segunda. A altura das plantas medida dez dias após o tratamento com primeira pulverização indicou que aplicação de HP-1000™ resultou em melhoria de crescimento significativa (tabela 33). Além disso, plantas tratadas com HP-1000™ na taxa de 60 μg/ml começaram a florescer cinco dias antes do que com outros tratamentos.

Aproximadamente dez dias após aplicação da terceira pulverização, o número de vagens de feijão por planta foi contado de dez plantas selecionadas aleatoriamente por replicação. Estes resultados indicaram que a melhora no crescimento do tratamento com HP-1000™ resultou em produção significativamente mais alto (tabela 34).

TABELA 33 - Altura aumentada de plantas de feijão após tratamento foliar com HP-1000™

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MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 34 - Conjunto de vagens aumentadas de feijões após tratamento foliar com HP-1000™ .

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1 Médias seguidas por diferente letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=O,05.

Exemplo 17 - Aumento na produção de morangos do tratamento com HP-1000™

Duas tentativas de campo com HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) foram conduzidas em duas variedades de morango., Camarosa e Selva. Para cada variedade, um projeto em bloco completo randomizado (RCB) foi estabelecido tendo quatro lotes de terra replicados (1,62 m χ 3,05 m) por tratamento em um campo de morangos de produção comercial. Em cada lote de terra, plantas de morango foram plantadas em uma disposição em fileiras duplas. Um controle não tratado (UTC) foi também incluído na tentativa. Antes das aplicações começarem, todas as plantas foram limpadas de todas as flores e morangos. Pulverizações de HP-1000™ na taxa de 40 μ§/ηύ foram aplicadas em seis vezes por semana usando um pulverizador de mochila. Exatamente antes da aplicação de cada pulverização, todas as frutas maduras de cada tratamento foram colhidas, pesadas e classificadas em padrões comerciais. Em três semanas da primeira aplicação de HP-1000™ em plantas de morango Selva, a melhoria no crescimento foi discernível como biomassa acima do solo maior e uma aparência mais vigorosa, mais verde e mais saudável. Após seis colheitas (isto é, tempo de vida determinado para estas plantas), todos os dados de produção foram somados e analisados. Para a variedade Camarosa, produção de frutas comercializáveis de plantas tratadas com HP-1000™ foi significativamente aumentada (27%) sobre UTC, quando medido durante as últimas quatro colheitas (tabela 35). Diferenças significativas entre tratamentos não foram aparentes para esta variedade durante as primeiras duas colheitas. A variedade Selva foi mais respondente aos efeitos de melhora no crescimento do tratamento com HP-1000™; plantas de morango Selva deram uma fruta 64% mais comercializável estatisticamente significativa vs. o UTC quando medidos durante seis colheitas (tabela 35).

TABELA 35 - produção aumentada de morangos após tratamento foliar com HP-1000™

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1Médias seguidas por diferente letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 18 - Maturidade prematura e produção aumentada de tomates do tratamento com HP-1000™

Tomates de mercado novos (var. Solar St) cresceram em lotes de terra (0,6 Im χ 9,15 m) replicados 5 vezes em uma tentativa de campo de bloco completo randomizado (RCB) em um campo de produção de tomate comercial. Tratamentos incluíram HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora), um produto competitivo experimental (Actigard™ (Novartis, Greensboro, N.C.)) e um produto químico padrão (Kocide® (Griffen Corp., Valdosta, GA)) + Maneb® (DuPont Agricultural Products, Wilmington, D.E.)) para controle de doenças. A aplicação inicial de HP-1000™ foi feita como uma poção de 50 ml (de 30 μg/ml a.i.) despejada diretamente sobre o arbusto imediatamente após o transplante. A seguir, onze pulverizações foliares semanais foram aplicadas usando um pulverizador de mochila. A primeira colheita de todos os tratamentos foi feita aproximadamente seis semanas após transplante e somente tomates maduros, completamente maduros foram colhidos de cada tratamento. Resultados indicaram que plantas tratadas com HP-1000™ tiveram uma quantidade significativamente maior de tomates prontos para a primeira colheita (tabela 36). Estima-se que os tomates colhidos de plantas tratadas com HP-1000™ tinham 10-14 dias à frente de outros tratamentos.

TABELA 36 - produção aumentada de tomates na primeira colheita após tratamento foliar com HP-1000™

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1 Taxas de Kocide® e Maneb® são para produto formulado. 2 Médias seguidas por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P = 0,05.

Exemplo 19 - Florescimento prematuro e melhora no crescimento de morangos do tratamento com HP-1000™ quando plantados em solo não fumigado

Plantas de morango ("de cala aberta" e "com raiz sem vegetação") cv. Commander foram transplantadas em lotes de terra (0,61 m χ 9,15 m) replicadas 5 vezes em uma tentativa de campo de bloqueio completo randomizado. Aproximadamente sessenta plantas individuais foram transplantadas em cada replicata. Tratamentos aplicados nesta tentativa de campo são relacionados abaixo:

Tratamento Processo de Aplicação

HP-1000™

(Plantas "de "cala aberta"")

HP-1000™ Solução em poção de 50 ml de HP-1000™ (DEN (40 plantas "com raiz sem Bioscience) (formulação de elicitor de resposta vegetação") hipersensível a Erwinia amylovora) a 40 μg/ml

(a.i.)) despejada diretamente sobre as plantas individuais imediatamente após transplante em solo não fumigadol, seguido por aplicações foliares de HP-1000™ a 40 μg/ml a cada 14 dias.

HP-1000™ Embeber a raiz em uma solução de HP-1000™ (40 (plantas "com raiz sem em μg/ml (a.i.) durante 1 h, imediatamente antes vegetação") de transplantar em solo não fumigado, 1 seguido por aplicações foliares de HP-1000™ a 40 μg/ml a cada 14 dias.

Brometo de Fumigação do solo a 136,2 kg/0,4047 ha via metila/clorpicrina 75/25 injeção antes de transplantar, nenhum tratamento com HP-1000™ aplicado.

Telone/cloropicrina 70/30 Fumigação do dolo a 170 litros/0,4047 ha via injeção antes de transplantar, nenhum tratamento com HP-1000™ aplicado.

Controle não tratado (UTC) Nenhuma fumigação, nenhum tratamento com HP-1000™

1 Solo não fumigado foi cultivado para ervilha durante os dois primeiros anos. O transplante foi feito no final do outono, quando o tempo frio tornava mais lento o crescimento das plantas. Duas semanas após transplante, a primeira aplicação foliar de HP-1000™ foi feita a 40 μg/ml (a.i.) com um pulverizador de mochila,. Três semanas após transplante, resultados preliminares foram reunidos comparando tratamento com HP-1000™ contra brometo de metil e UTC contando-se o número de flores em todas as plantas de morango "com a cala aberta" em cada replicação. Uma vez que o florescimento não tinha ocorrido em planta "com raiz sem vegetação", cada planta em replicadas para este tratamento foi avaliada para crescimento de folha prematuro medindo-se a distância da ponta da folha ao caule na folha central de 3 agrupamentos de folhas. Resultados (tabelas 37 e 38) indicaram que tratamento com HP-1000™ forneceu crescimento de flores prematuro melhorado e tamanho de folha para plantas de morango "de "cala aberta"" e "com raiz sem vegetação", respectivamente.

TABELA 37 - Florescimento prematuro de transplantes de morangos "de "cala aberta"" após tratamento foliar com HP-1000™.

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1Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 38 - Crescimento de folha aumentado em transplantes de morangos "com raiz sem vegetação" após tratamento foliar com HP-1000™ .

Tratamento Taxa (a.i.) Comprimento da folha1 % acima

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Γ Médias seguidas por letras "diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 20- Melhoria de crescimento prematura de pimentas Jalapeno da aplicação de HP-1000™

Transplantes de pimenta Jalapeno (cv. Mittlya) foram tratados com uma porção de raiz de HP-1000 (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Ewrinia amylovora) (30 μg/ml a.i.) durante 1 h, depois transplantados em lotes de terra randomizados replicados quatro vezes. Um controle não tratado (UTC) foi também incluído. Iniciando- se 14 dias antes do transplante, plantas tratadas receberam três pulverizações foliares de HP-1000™ em intervalos de 14 dias usando um pulverizados de mochila. Uma semana após a terceira aplicação de HP-1000™ (54 dias após transplante), a altura da planta foi medida de quatro plantas selecionadas aleatoriamente por replicação. Resultados destas medições indicaram que plantas tratadas com HP-1000™ eram aproximadamente 26% mais altas do que plantas UTC (tabela 39). Além disso, o número de brotos, flores ou frutas em cada planta foi contado. Estes resultados indicaram que as plantas tratadas com HP-1000™ tiveram acima de 61% mais flores, frutas ou brotos comparadas a plantas UTC (tabela 40). TABELA 39 - Altura das plantas aumentada em pimentas Jalapeno após tratamento com HP-1000™.

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1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=O,05.

TABELA 40 - Número aumentado de flores, frutos ou brotos em pimentas Jalapeno após tratamento com HP-1000™.

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1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 21 - Melhora no crescimento de tabaco da aplicação de HP-1000™

Arbustos de tabaco foram transplantados em lotes de terra randomizados replicados três vezes. Uma pulverização foliar de HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) foi aplicada após transplante em uma das três taxas: 15, 30 ou 60 μg/ml a.l. Sessenta dias depois, uma segunda aplicação foliar de HP-1000 foi feita. Dois após a segunda aplicação, altura da planta, número de folhas por planta e o tamanho da folha (área) foram medidos de dez plantas selecionadas aleatoriamente por tratamento. Resultados destas medições indicaram que tratamento com HP-1000™ melhorou significativamente o crescimento de plantas de tabaco (tabelas 41, 42 e 43). A altura da planta foi aumentada em 6-13%, enquanto plantas tratadas com HP-1000™ a 30 e 60 μ g/ml estavam na média de exatamente acima de 1 folha por planta do que UTC. Mais significativamente, no entanto, tratamento com HP-1000™ a 15, 30 e 60 μm resultou em aumentos correspondentes na área da folha.

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TABELA 41 - Altura de plantas aumentada em tabaco após tratamento com HP-1000™.

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TABELA 42 - Número aumentado de folhas de tabaco por planta após tratamento com HP-1000™.

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TABELA 43 - Área de folhas aumentada em tabaco planta após tratamento com HP-1000™.

<table>table see original document page 74</column></row><table> Exemplo 22 - Melhora no crescimento de trigo semeado no outono da aplicação de HP-1000™

Semente de trigo semeado no outono foi "polvilhada" com HP-1000™ seco (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) em pó na taxa de 85 gramas do produto formulado (3% a.i.) por 45,4 kg de semente, depois plantada usando equipamento de semeadura convencional em lotes de terra com teste randomizado de 356 cm χ 3050 cm de comprimento. Tratamentos adicionais incluíram um "polvilhamento" da semente com HP-1000™ em pó (3% a.i.) a 28,34 gramas do produto formulado por 45,4 kg de semente, um embebimento da semente em uma solução de HP-1000™ a uma concentração 20 μg/ml, a.l., durante quatro horas, depois secado ao ar antes do plantio, um "polvilhamento" com fungicida químico (Dividend®) padrão, e um controle não tratado (UTC). Oito dias após o plantio, sementes tratadas com HP-1000 ™ começam a emergir, enquanto que a semente tratada com produto químico padrão e UTC não emergiram até aproximadamente 14 dias após o plantio, o tempo normal esperado. A 41 dias após plantio, arbustos foram removidos do solo e avaliados. Massa de raiz para trigo tratada com HP-1000™ como um "polvilhamento" a 85 g/45,4 kg foi visualmente inspecionada e julgada ser aproximadamente duas vezes tão grande como quaisquer dos outros tratamentos.

Após a tentativa de campo, uma experiência em estufa foi designada para ganhar confirmação destes resultados. Tratamentos incluíram semear trigo polvilhado com HP-1000™ seco (10% a.i.) a uma taxa de 85 gramas por 45,4 kg de semente, embebimento da semente de HP-1000™ em concentração em solução de 20 mg/ml durante quatro horas antes do plantio, e um controle não tratado (UTC). Sementes de trigo de cada tratamento foram plantadas na taxa de 25 sementes por vaso, com cinco vasos servindo como replicadas para cada tratamento. Quinze dias após o plantio, dez arbustos selecionados aleatoriamente de cada vaso de tratamento foram removidos, limpados cuidadosamente e medidos para altura da raiz. Uma vez que a porção de solo acima de arbustos individuais não demonstrou qualquer efeito do tratamento, crescimento de raiz aumentado do tratamento com HP-1000™ não influencia a seleção de amostras. O aumento no crescimento da raiz de qualquer tratamento com HP-1000™ foi significativamente maior do que UTC (tabela 49); no entanto, o tratamento com polvilhamento da semente pareceu dar resultados ligeiramente melhores.

TABELA 44 - Tamanho de raiz aumentado em arbustos de trigo após tratamento com HP-1000™.

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1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

Exemplo 23 - Melhora no crescimento de pepineiros da aplicação de HP- 1000™

Uma tentativa de campo de pepineiros produzidos comercialmente consistiu de quatro tratamento, HP-1000™ (EDEN Bioscience) (formulação de elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora) em duas taxas (20 ou 40 μg/ml), um produto químico padrão para controle de doenças (Bravo® (Zeneca Ag Products, Wilmington, Del.) + Maneb®) e um controle não tratado (UTC). Cada tratamento foi replicado quatro vezes em lotes de terra de 0,915 m χ 22,87 m com um espaço entre as plantas de aproximadamente 0,61 m para cada tratamento. Pulverizações foliares de HP-1000™ foram aplicadas iniciando na primeira folha verdadeira e repetido em intervalos de 14 dias até a última colheita durante um total de seis aplicações. A mistura fungicida padrão foi aplicada a cada sete dias, ou mais cedo, se garantidas as condições. Colheita comercial começa aproximadamente dois meses após a primeira aplicação de HP-1000™ (após cinco pulverizações de HP-1000™ terem sido aplicadas), e uma colheita final foi feita aproximadamente 14 dias após a primeira colheita.

Resultados da primeira colheita indicaram que tratamento com HP-1000™ melhorou a produção médio dos pepineiros aumentando o número total de pepinos colhidos e não o peso médio de pepineiros individuais (tabelas 45-47). A mesma tendência foi observada na colheita final (tabelas 48-49). Foi comercialmente importante que o aumento na produção resultante do tratamento com HP-1000™ não foi obtido pelo tamanho de pepino médio aumentar significativamente.

TABELA 45 - Produção de pepinos aumentada após tratamento com HP- 1000™, primeira colheita.

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1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 46 - Número aumentado de frutos em pepineiros após tratamento com HP-1000™, primeira colheita.

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1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=O, 05.

TABELA 47 - Peso médio dos pepinos após tratamento com HP-1000™, primeira colheita.

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TABELA 48 - Produção de pepinos aumentada após tratamento com HP- 1000™, terceira colheita.

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1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05. TABELA 49 - Número aumentado de frutos em pepineiros após tratamento com HP-1000™, terceira colheita.

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1 Médias seguidas por letras diferentes são significativamente diferentes de acordo com MRT de Duncan, P=0,05.

TABELA 50 - Peso médio dos pepinos após tratamento com HP-1000™, primeira colheita.

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Exemplo 24 - Harpinpss de Pseudomonas syringae pv syringae induz melhora no crescimento em tomate

Para testar se Iiarpinpss (isto é, o elicitor de resposta hipersensível a Pseudomonas syringae pv syringae (He, S.Y. et al., iiPseudomonas syringae pv syringae Harpinpss. A Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Cell 73:1255-66 (1993), que é incorporado aqui por referência, também estimula o crescimento de planta, sementes de tomate (variedade Marglobe) foram semeadas em vasos de 20,24 cm com solo artificial. Dez dias após semeadura, os arbustos foram transplantados em vasos individuais. Por toda a experiência, fertilizante, irrigação de água, temperatura e umidade do solo foram mantidos uniformemente entre as plantas. Dezesseis dias após transplante, a altura da planta inicial foi medida e a primeira aplicação de harpiripss foi feita, isto é referido como dia 0. Uma segunda aplicação foi feita no dia 15. Dado de crescimento adicional foi coletado no dia 10 e dia 30. A coleta do dado final no dia 30 incluiu ambos altura da planta e peso novo.

O harpinpss usado para aplicação durante a experiência foi produzido fermentando DH5 de E. coli contendo o plasmídeo com o gene codificando harpinpss (isto hrpZ). As células foram coletadas, ressuspensas em tampão de fosfato de potássio 5 mM, e rompidas por tratamento com som. O material tratado com som foi fervido durante 5 minutos e depois centrifugado durante 10 min a 10.000 rpm. O sobrenadante foi considerado como preparação de elicitor isento de célula (CFEP). Solução de 20 e 50 μ g/ml de harpinpss foi preparada com o mesmo tampão usado para preparar a suspensão de células. CFEP preparado da mesma cepa contendo o mesmo plasmídeo, mas sem o gene hrpZ foi usado como o material para tratamento de controle.

O agente umectante, Pinene II (Drexel Chemical Co., Memphis, Tenn.) foi adicionado à solução de Iiarpinpss na concentração de 0,1%, depois harpinpss foi pulverizado em tomateiros até escoar.

A tabela 51 mostra que houve uma diferença significativa entre grupos de tratamento com harpinpss e o grupo de controle. Tomate tratado com harpinpss aumentou mais do que 10% em altura. O dado suporta a reivindicação de que Iiarpinpss não age similar ao elicitor de resposta hipersensível a Erwinia amylovora, em que, quando aplicado a tomateiros e muitas outras espécies de plantas, existe um efeito melhorador do crescimento. Além de um aumento significativo de tomate tratado com harpinpss na altura do tomate e mais biomassa, folhas grandes, conjunto de flores prematuro e aparência total saudável. TABELA 51 - Harpinpss melhora o crescimento de tomateiros.

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1 Altura da planta foi medida próxima a 0,5 cm. Dia 0 refere-se ao dia em que as alturas da planta iniciais foram registradas e a primeira aplicação foi feita.

2 Médias são dadas com SD entre parênteses (n=20 para todos os grupos de tratamento.

Letras diferentes (a e b) indicam diferenças significativas (P=0,05) entre as médias. As diferenças foram avaliadas por ANOVA seguido por LSD Fisher.

Apesar da invenção ser descrita em detalhes para os fins de ilustração, compreende-se que os detalhes são somente para estes fins, e variações podem ser feitas na mesma pelos versados na arte sem sair do espírito e escopo da invenção que é definida pelas seguintes reivindicações.

Claims (38)

1. Processo para melhorar o crescimento em plantas, caracterizado pelo fato de compreender: aplicar uma proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível em uma forma não infecciosa a uma planta ou semente de planta sob condições efetivas para melhorar o crescimento da planta ou plantas cultivada a partir da semente da planta.

2.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível corresponde ao derivado de um patógeno selecionado dentre o grupo consistindo de Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Phytophthora e misturas dos mesmos.

3.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Erwinia chrysanthemi.

4.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Erwinia amylovora.

5.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Pseudomonas syringae.

6.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Pseudomonas solanacearum.

7.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível corresponde à derivada de Xanthomonas campestris.

8.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo eiicitor de resposta hipersensível

corresponde a espécie Phytophthora.

9.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de dicotiledôneas e monocotiledôneas.

10.

Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de arroz, trigo, cevada, centeio, algodão, girassol, amendoim, milho, batata, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívias, repolho, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete, espinafre, cebola, alho, beringela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, moranga, zucchini, pepino, maçã, pera, melão, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, sorgo, e cana de açúcar.

11.

Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de rosas, Saintpaulia, petúnia, pelargônio, poinsétia, crisântemo, cravo e zinia.

12.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas são tratadas durante referida aplicação que é realizada por pulverização, injeção, ou abrasão da folha em um tempo próximo a quando referida aplicação ocorre.

13.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sementes de planta são tratadas durante referida aplicação que é realizada por pulverização, injeção, revestimento, polvilhamento ou imersão.

14.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é aplicada a plantas ou sementes de plantas como uma composição ainda compreendendo um veículo.

15.

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o veículo é selecionado dentre o grupo consistindo de água, soluções aquosas, suspensões e pós.

16.

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a composição contém mais do que 0,5 nM de proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível.

17.

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a composição ainda contém aditivos selecionados dentre o grupo consistindo de fertilizador, inseticida, fungicida, nematicida, e misturas dos mesmos.

18.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível está em forma isolada.

19.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é aplicada como bactéria que não provoca doença e é transformada com um gene codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível. 20. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível é aplicada como uma bactéria que provoca doença em algumas espécies de planta, mas não são submetidas a referida aplicação, e contém um gene codificando a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível. 21. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação provoca infiltração do polipeptídeo ou proteína na planta. 22. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação afeta a altura da planta aumentada. 23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as plantas são tratadas durante referida aplicação. 24. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as sementes de plantas são tratadas durante a referida aplicação, referido processo ainda compreendendo: plantas as sementes tratadas com o elicitor de resposta hipersensível em solo natural ou artificial e propagar as plantas das sementes plantadas no solo. 25. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sementes de plantas são tratadas durante a referida aplicação para aumentar as quantidades de semente de planta que germinam, referido processo ainda compreendendo: plantar as sementes tratadas com a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em solo natural ou artificial e propagar as plantas das sementes plantadas no solo. 26. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referia aplicação efetua uma maior produção. 27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as plantas são tratadas durante a referida aplicação. 28. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as sementes de planta são tratadas durante a referida aplicação, o referido processo ainda compreendendo: plantar as sementes tratadas com a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em solo natural ou artificial e propagar as plantas das sementes plantadas no solo. 29. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação efetua uma germinação prematura. 30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as sementes de planta são tratadas durante a referida aplicação, o referido processo ainda compreendendo: plantar as sementes tratadas com a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em solo natural ou artificial, e propagar as plantas das sementes plantadas no solo. 31. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação efetua uma maturação prematura. 32. Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que as plantas são tratadas durante a referida aplicação. 33. Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que as sementes de planta são tratadas durante a referida aplicação, o referido processo ainda compreendendo: plantar as sementes tratadas com a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em solo natural ou artificial e propagar as plantas das sementes plantadas no solo. 34. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sementes de planta são tratadas durante a referida aplicação, referido processo ainda compreendendo: plantar as sementes tratadas com a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em solo natural ou artificial e propagar as plantas das sementes plantadas no solo. 35. Processo de acordo com a reivindicação 34, ainda caracterizado pelo fato de compreender: aplicar a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em uma forma não infecciosa para as plantas propagadas para melhorar ainda o crescimento. 36. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação afeta a coloração da fruta e planta. 37. Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que as sementes de planta são tratadas durante a referida aplicação, o referido processo ainda compreendendo: plantar as sementes tratadas com a proteína ou polipeptídeo elicitor de resposta hipersensível em solo natural ou artificial e propagar as plantas das sementes plantadas no solo. LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Cornell Research Foundation, Inc. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MELHORIA DO CRESCIMENTO EM PLANTAS (iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 10 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Nixon, Hargrave, Devans & Doyle LLP (B) RUA: Clinton Square, P.O. Box 1051 (C) CIDADE: Rochester (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: U.S.A. (F) CEP: 14603 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO MEIO: Floppy disk (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versão #1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO ATUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 60/036.048 (B) DATA DO DEPÓSITO: 27 de JANEIRO de 1997 (viii) INFORMAÇÃO ADVOGADO/AGENTE (A) NOME: Goldman, Michael L. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 30.727 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/DOCUMENTO: - 19603/1502 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (716) 263-1304 (B) TELEFAX: (716) 263-1600 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 1: (A) COMPRIMENTO: 338 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQID NO: 1: Met Gln Ils Thr Ile Lys Ala Eis Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser -1 5 10 15 Glv Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser -20 25 30 Leu Gly Ser Ser Val Asp Lvs Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lvs Leu Thr -35 40 45 Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phé Gly Glv Ala Leu Ala Gln Gly Leu -50 55 60 Glv Ala Ser Ser Lvs Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser -65 70 75 80 Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lvs -85 90 95 Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp -100 105 110 Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln -115 120 125 Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met -130 135 140 Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly -145 150 155 160 Asn Gly Leu Glv Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly -165 170 175 Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu -180 185 190 Gly Asn Ala Ile Gly Met Glv Val Glv Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala -195 200 205 Leu Ser Asn Val Ser Thr Kis Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val -210 215 220 Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Glv Gln Phe Met Asp -225 230 235 240 Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lvs Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trn -245 250 255 Ser Ser Pro Lvs Thr Asp Asp Lvs Ser Trp Ala Lvs Ala Leu Ser Lys -260 255 270 Pro Asd Asp- Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lvs Phe Arg Gln -275 280 285 Ala Met Glv Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asd Thr Glv Asn Thr -290 295 300 Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala -305 310 315 320 Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala -325 330 335 Asn Ala (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2141 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2: CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60 GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120 GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180 CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240 TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300 CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360 ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420 CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480 CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540 GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600 AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660 TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720 GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780 GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840 TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900 TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960 CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC 1020 CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCA.TTCTCGG 1080 CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140 GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200 GCGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260 CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320 TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATAC CAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380 GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440 CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500 ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1550 GGCTGTCGTC GG CGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620 ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680 TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740 ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800 GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860 CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1S20 CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980 GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040 AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100 GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 3: (A) COMPRIMENTO: 403 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQID NO: 3: Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser -1 5 10 15 Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Cn -20 25 30 Asn Ala Glv Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn -35 40 45 Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met -50 55 60 MeC Mat Mst Ser Met Met Gly Glv Gly Glv Leu Met Gly Gly Gly Leu -65 70 75 80 Gly Gly Glv Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Glv Gly Leu Gly Glu -85 90 95 Glv Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Glv Gly Ser Leu Asn Thr -100 105 110 Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro -115 120 125 Leu Aso Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser -130 125 140 Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln -145 150 155 160 Leu Leu Lvs Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Glv -155 170 175 Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lvs Gln Pro Thr Glu -180 185 190 Glv Glu Gln Asn Ala Tvr Lvs Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly -195 200 205 Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly -210 215 220 Gly Glv Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu -225 230 235 240 Gly Gly Lvs Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln -245 250 255 Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln -260 265 270 Ala Leu Asn Aso Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe -275 280 285 Val Asn Lvs Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met -290 295 300 Asd Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro -305 310 315 320 Gly Gln Glu Val Lvs Thr Asp Asd Lvs Ser TrD Ala Lys Ala Leu Ser -325 330 335 Lys Pro Asp Asd Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn -340 345 350 Lvs Ala Lys Glv Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Glv Asp Thr Gly Asn -355 360 365 Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Glv Glv Ser Ser Lèu Gly Ile Asd -370 375 380 Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu -385 390 295 400 Gly Ala Ala (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1288 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQID NO: 4: AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60 GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT 120 ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG 180 GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG 240 GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG 300 GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA 360 GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA 420 GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC 480 TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540 CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG 600 CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660 GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG 720 CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC 780 GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840 TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 900 ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG 960 GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020 CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC 1080 AAG CCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140 ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200 GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA Ci1ATATGGCA 1260 CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 341 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQID NO: 5: Met Glii Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met -1 5 10 15 Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser -20 25 30 Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met -35 40 45 Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala -50 55 60 Lvs Ser Met Ala Ala Aso Glv Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val -65 70 75 80 Ile Ala Ala Leu Aso Lvs Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe -85 90 95 Gly Ala Ser Ala Asd Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met -100 105 110 Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lvs Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu -115 120 125 Thr Lvs Gln Asd Gly Glv Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met -130 135 140 Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro -145 150 155 160 Lys Pro Asd Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe -165 170 175 Leu Asd Glv Asd Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile -180 155 130 Glv Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asd Ala Gly Ser Leu Ala Gly -195 200 205 Thr Gly Gly Gly Leu Glv Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser -210 215 220 Val Met Glv Asd Pro Leu Ile Asd Ala Asn Thr Gly Pro Glv Asp Ser -225 230 235 240 Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp -245 250 255 Arg Gln Ser Val Leu Ala Glv Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val -260 265 270 Aro Gin Thr Glv Thr Ser Ala Asn Gly Glv Gln Ser Ala Gln -275 280 285 Aso Leu Aso Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala -290 295 300 Leu Lvs Aso Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala -305 310 315 320 Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Árg -325 330 335 Asn Gln Ala Ala Ala -340 2. INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1026 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 6: ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60 GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120 GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180 AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240 ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300 GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCÁGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360 AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420 GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480 AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540 GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600 AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660 AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720 GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780 TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840 GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900 GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960 GCGCJAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020 GCCTGA 1025 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 7: (A) COMPRIMENTO: 344 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQID NO: 7: Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln -1 5 10 15 Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser -20 25 30 Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile -35 40 45 Ala Ala Leu Val Gln Lvs Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly -50 55 60 Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala -65 70 75 80 Asn Aso Pro Ser Lvs Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser -5 90 55 Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn A.sn Gln Asp Pro Met -100 105 HO Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala. -115 120 125 Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Glv A.sn Asp Lys Glv Asn Gly Val -130 135 140 Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Glv Leu Ala -145 150 155 I60 Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly -165 170 175 Gly Ala Glv Ala Gly Gly A-Ia Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly -180 185 190 Ala Aso Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glv Ala Gly Gly Ala Asn Glv Ala 195 200 205 Aso Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn 210 215 220 Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Glv Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp 225 230 235 240 Gln Glv Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lvs Leu Met Lys Ile Leu Asn 245 250 255 Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln 260 255 270 Ala Gln Gly Gly Ser Lvs Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Glv 275 280 285 Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser 290 295 300 Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val 305 310 315 320 Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln 325 330 335 Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met 340 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 8: (A) COMPRIMENTO: 1035 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 8: ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60 AACACCAACA CCAACAGCCA GaAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120 GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180 GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240 AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300 GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360 GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420 GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480 GAAGCGCTGC AGGAGA7CGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC GGCGGCGCC-G GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGC-TGCC-C-C-T GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC g£0 GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 72Q CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 78Q ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 84Q GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 90Q GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT C-AAGGAGGTC 9g0 GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCC- 1020 ACGCAGCCGA TGTAA 1035 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (A) COMPRIMENTO: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQID NO: 9: Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ai 1 5 10 15 A-Ia Ile Ala Leu Pro Ala Tvr Gln Aso Tyr 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína Ixi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 10: Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala C-Iy Ser C-Iu Gln Gln Leu As? Gln 1 5 10 15 Leu Leu Ala Met 20