BRPI1013673B1 - Microorganismo que produz l-aminoácido e método para a produção de l-aminoácido usando o mesmo - Google Patents
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Abstract
microorganismo que produz l-aminoácido e método para a produção de l-aminoácido usando o mesmo. a presente invenção é relacionada a um microorganismo que pertence ao gênero escherichia sp. e um método para a produção de l-aminoácido que usa o mesmo. o microorganismo que pertence ao gênero escherichia sp. tem uma assimilabilidade de sacarose e capacidade de produção de l-aminoácido, que é obtido por introdução de um gene que codifica uma enzima metabólica de sacarose derivada de microorganismo que assimila sacarose ao microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero escherichia sp. que tem uma capacidade de produção de l-aminoácido e atividade de sacarose pts (sacarose fosfotransferase dependente de sistema fosfoenolpiruvato).
Description
A presente invenção relaciona-se a um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido, que é obtido por introdução de um gene que codifica uma enzima metabólica de sacarose derivada de microorganismo que assimila sacarose a um microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma capacidade de produção de L- aminoácido e uma atividade de sacarose PTS (sacarose fosfotransferase dependente de sistema fosfoenolpiruvato), e um método para a produção de um L-aminoácido que usa o mesmo.
Devido à crescente demanda por produção de biocombustível e quebras de safras por climas incomuns, o preço do açúcar de amido usado principalmente em fermentação industrial tem aumentado rapidamente. Alternativamente, o uso de sacarose ou melaço que contém uma alta concentração de sacarose, mais barato que o açúcar de amido, como uma fonte de carbono em fermentação industrial é vantajoso para assegurar a competitividade de custo.
Aproximadamente 50% das E. coli de ocorrência natural do tipo selvagem são capazes de metabolizar sacarose, mas a cepa K12 de E. coli, cepa B, cepa C ou outras comumente usadas em fermentação industrial não têm capacidade de assimilar sacarose {Mol. Microbiol. (1998) 2:1-8, Can. J. Microbiol. (1999) 45:418-422). Portanto, um dos desafios mais importantes na indústria da fermentação é a identificação de genes envolvidos na assimilação de sacarose, o estabelecimento de genes relacionados à assimilação de sacarose aumentados por melhoria, e a aplicação dos genes às cepas de E. coli industriais, não assimiladoras de sacarose, para a produção de metabólitos desej ados.
Para transmitir uma assimilabilidade de sacarose às cepas industriais de E. coli, métodos de introdução de genes ou grupos de genes envolvidos em assimilação de sacarose, derivada de microorganismos que têm uma assimilabilidade de sacarose foram geralmente usados. Por exemplo, um método de transmissão de assimilabilidade de sacarose a E. coli K12 por transformação com o regulon scr que está presente na espécie Salmonella que pertence à família Enterobacteriaceae {J. Bacteriol. (1982) 151:68-76, Mol. Microbiol. (1998) 2:1-8, J. Bacteriol. (1991) 173:7464-7470, Patente US No. 7.179.623), Klebsiella pneumoniae {J. Gen. Microbiol. (1988) 134:1.635-1.644) e Erwinia amylovora {J. Bacteriol. (2000) 182:5.351-5.358) tem sido bem conhecido na técnica. A introdução do regulon esc derivado de E. coli não K12 ou E. coli patogênica que tem a assimilabilidade de sacarose {Appl. Environ. Microbiol. (1992) 58:2.081-2.088, Patente US No. 6.9604.55), introdução de grupos de genes envolvidos em assimilação de sacarose que está presente em plasmídeo de conjugação scr53 isolado de E. coli AB1281 (Patente US No. 4.806.480) e a introdução de regulon scr e operon sac derivado de Microorganismos gram-positivos, Streptococcus mutans (J. Bacteriol. (1989) 171:263-271) e Bacillus subtilis (J. Bacteriol. (1989) 171:1.519-1.523) são também conhecidos. A Patente US No. 7.179.623 revela um método de produção de lisina, isoleucina e valina com o uso de E. coli K12 que é preparada por introdução de um regulon scr derivado de E. coli VKPM B-7915 a ela.
No entanto, há ainda uma necessidade de um microorganismo industrial que tenha um sistema de utilização eficiente de sacarose e um método de fermentação que usa o mesmo. Portanto, os presentes inventores descobriram que um L-aminoácido pode ser produzido a partir de sacarose em um alto rendimento com o uso de um microorganismo de produção de L-aminoácido que pertence ao gênero Escherichia sp., que é preparado por introdução de um grupo de genes envolvidos em assimilação de sacarose, derivada de uma Klebsiella pneumoniae que assimila sacarose, assim completando a presente invenção.
Um objetivo da presente invenção é o de fornecer um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido, que é preparado por transmissão de assimilabilidade de sacarose a um microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido.
Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de um L-aminoácido a partir de sacarose com o uso do microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido.
A FIG.l mostra a construção de um plasmídeo recombinante pAscrKP que contém scrKYABR derivado de Klebsiella pneumoniae (ATCC700721) de acordo com uma modalidade específica da presente invenção.
Para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido, que é obtida por introdução de um gene que codifica uma enzima metabólica de sacarose derivada de microorganismo que assimila sacarose a um microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido e uma atividade de sacarose PTS (sacarose fosfotransferase dependente do sistema fosfoenolpiruvato).
Como aqui usado, o termo "microorganismo que não assimila sacarose" significa um microorganismo que não utiliza sacarose como uma fonte de carbono, e o termo "microorganismo que tem assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido" significa um microorganismo que pode metabolizar sacarose como uma fonte de carbono de modo a produzir um L-aminoácido.
Como aqui usado, o termo "enzima metabólica de sacarose" significa uma enzima necessária para utilização de sacarose como uma fonte de carbono, e ele inclui frutoquinase, sacarose porina, sacarose PTS permease, sacarose hidrolase, invertase, ou outras, mas não é limitado a estas.
Na presente invenção, a "enzima metabólica de sacarose" é também chamada "enzima de Scr-PTS".
Um sistema metabólico que utiliza sacarose como uma fonte de carbono pode ser dividido em sistema metabólico de sacarose baseado em PTS (sacarose fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato) (sistema Scr-PTS) e sistema metabólico de sacarose não baseado em PTS (sistema Scr-não PTS) de acordo com uma fonte de fosfato para fosforilação de sacarose influente em uma célula. A maioria dos microorganismos capazes de utilizar sacarose tem o sistema Scr-PTS.
Um exemplo representativo do sistema Scr-PTS baseado em PTS que usa fosfoenolpiruvato (PEP) como uma fonte de fosfato para a fosforilação de sacarose inclui um plasmídeo conjugado pUR400 de Salmonella typhimurium gram-negativa, um regulon scr presente no cromossomo de Klebsiella pneumoniae, ou outros. 0 regulon scr é composto de 5 genes, scrK (frutoquinase), scrY (sacarose porina), scrA (componente EIIBC específico para sacarose), scrB (sacarose-6-fosfato hidrolase) e scrR (repressor específico para sacarose relacionado a LacI), e dois óperons, scrK e scrYAB, são negativamente controlados pelo repressor ScrR (Mol. Microbiol. (1993) 9:195-209). De acordo com um mecanismo do regulon scr, sacarose externa é transportada para um espaço periplásmico através de uma proteína de membrana externa (OMP), ScrY. A sacarose transportada é transportada para uma célula na forma de sacarose-6 - fosfato através de um ciclo de sacarose PTS que inclui ScrA. Sacarose-6-fosfato é então hidrolisado a glicose-6-fosfato e frutose que são metabolizados por ScrB, e a frutose é convertida em frutose-6-fosfato por uma ScrK ATP- dependente, e a frutose-6-fosfato resultante é metabolizada por meio de glicólise, junto com glicose-6-f osf ato (J. Biotechnol. (2001) 92:133-158). O ciclo de sacarose PTS, que funciona para converter sacarose em sacarose-6-fosfato e então a transporta para a célula, é composto de Enzima I (EI) , proteína histidina (HPr) , enzima IIA específica para glicose (EIIAcrrGlc) e enzima IIBC específica para sacarose (EIIBCscr) (J. Biotechnol. (2001) 92:133-158/ J. Biotechnol. (2004) 110:181-199) .
O sistema Scr-PTS de um microorganismo gram-positivo é exemplificado pelo regulon scr de Streptococcus mutans, que é composto de genes scrK, scrA, scrB e scrR (J. Bacteriol. (2003) 185:5791-5799).
O sistema PTS não Scr, que não requer PTS para captação de sacarose na célula, é exemplificado pelo regulon esc bem conhecido. O regulon esc é principalmente derivado de uma E. coli que assimila sacarose, e exemplificado por regulon esc da E.coli do tipo selvagem EC3132 (Mol. Gen. Genet. (1992) 235:22-32, Patente US No. 6.960.455), regulon esc de E.coli KO11 (Biotechnol. Lett. (2004) 26:689-693), regulon esc da E.coli patogênica 0157:H7 (J. Bacteriol. (2002) 184:5.307-5.316), regulon esc de ATCC13281 (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74:1.031- 1.040) ou outros. O regulon esc consiste em cscB (sacarose permease do tipo próton symport) , cscK (frutoquinase), cscA (sacarose hidrolase) e cscR (repressor específico para sacarose relacionado a LacI), e dois operons, cscKB e cscA, são negativamente controlados por CscR (J. Bacteriol. (2002) 184 : 5.307-5.316) .
O sistema PTS não Scr não é vantajoso porque ele não é eficiente para captação de um baixo nível de sacarose. Foi relatado que E. coli introduzida com o regulon esc tem um tempo de duplicação de 2 0 horas em um meio que contém sacarose de 0,2% ou menos (J. Bacterial. (2002) 184:5.307- 5.316). Diferente do sistema PTS não Scr, o sistema Scr-PTS permite captação eficiente de até mesmo um baixo nível de sacarose na célula, porque ScrA como uma sacarose PTS permease funciona para converter sacarose em uma sacarose- 6-fosfato com o uso de um fosfato livre produzido por conversão de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato por meio do ciclo sacarose PTS composto de Enzima I, proteína histidina, e enzima IIA específica para glicose, enquanto ela transporta sacarose do periplasa para a célula. Ou seja, embora a captação de sacarose externa por CscB do sistema PTS não Scr seja dirigida por um gradiente de hidrogênio, o sistema Scr-PTS requer PEP usado como uma fonte de energia para a captação de sacarose na célula, e assim permite a captação eficiente de até mesmo um baixo nível de sacarose. 0 CscB do sistema PTS não Scr, que transporta a sacarose externa para a célula por um gradiente de hidrogênio, tem um valor de Km para sacarose de 1,0 mH (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1995) 208:1.116- 1.123) . Em contraste, ScrA tem um valor de Km de 10 μm (J. Bacterial. (1982) 151:68-76), que é 100 vezes menor que aquele de CscB. No sistema Scr-PTS, a proteína ScrY é também envolvida em captação eficiente de um baixo nível de sacarose, além de ScrA. Ao que consta, ScrY é uma sacarose porina que funciona para transportar sacarose externa para o periplasma, e a expressão anormal da sacarose porina reduz amplamente o transporte de sacarose (J. Bacteriol. (1991) 173:449-456). Ou seja, no sistema Scr-PTS, ScrY transporta sacarose externa para o periplasma, e ScrA transporta rapidamente a sacarose periplásmica para a célula por meio do sistema PTS, assim utilizando de modo eficiente um nível ainda menor de sacarose.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o gene que codifica uma enzima metabólica de sacarose derivada de microorganismo que assimila sacarose é um gene derivado de um microorganismo que possui uma capacidade de assimilação de sacarose, e preferivelmente um gene derivado de um microorganismo que possui um sistema Scr-PTS baseado em PTS.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o gene que codifica uma enzima metabólica de sacarose derivada de microorganismo que assimila sacarose refere-se a um gene derivado de um microorganismo que assimila sacarose que pertence ao gênero Klebsiella ou Erwinia, e mais preferivelmente um gene derivado de Klebsiella pneumoniae ATCC700721 ou Erwinia carotovora ATCCBAA-672.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o gene que codifica uma enzima metabólica de sacarose derivada de microorganismo que assimila sacarose pode ser combinações dos genes que codificam frutoquinase, sacarose porina, sacarose PTS permease, sacarose hidrolase, e regulador da transcrição de sacarose, que são derivados de Klebsiella pneumoniae.
Em uma modalidade específica da presente invenção, os genes que codificam a frutoquinase derivada de microorganismo que assimila sacarose, sacarose porina, sacarose PTS permease, sacarose hidrolase e regulador da transcrição de sacarose podem ser scrK de Id. de Seq. N° : 6, scrY de Id. de Seq. N° : 7, scrA de Id. de Seq. N° : 8, scrB de Id. de Seq. N°: 9 e scrR de Id. de Seq. N° : 10, respectivamente.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. deve ter uma atividade de um ciclo de sacarose PTS que é composto de Enzima I (EI) , proteína histidina (HPr) e enzima IIA específica para glicose (EIIAcrrGlc) , excluindo ScrA. Preferivelmente, a expressão normal do gene que codifica enzima I (ptsl, Id. de Seq. N°: 19) , o gene que codifica proteína histidina (ptsH, Id. de Seq. N°: 20), e o gene que codifica a enzima IIA específica para glicose (err, Id. de Seq. N° : 21) deve ocorrer no microorganismo Escherichia sp. de sacarose.
Para a preparação do microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido de acordo com a presente invenção, a introdução dos genes que codificam a sacarose porina, sacarose PTS permeasse, sacarose hidrolase, frutoquinase e regulador da transcrição de sacarose derivada de microorganismo que assimila sacarose no microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. pode ser realizada pelo método bem conhecido na técnica.
Em uma modalidade específica da presente invenção, seqüências que codificam a sacarose porina, sacarose PTS permease, a sacarose hidrolase, a frutoquinase e o regulador da transcrição de sacarose são introduzidas em um vetor para construir um vetor recombinante, e o microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia, sp. que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido é transformado com o vetor recombinante construído de modo a preparar um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido.
O vetor usado para a preparação do microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. da presente invenção não é particularmente limitado, e quaisquer vetores de expressão conhecidos podem ser usados. Preferivelmente, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322 ou pMW118 podem ser usados.
Como aqui usado, o termo "transformação" significa um método em que um gene é introduzido em uma célula hospedeira a ser expressa na célula hospedeira. 0 gene transformado, se ele puder ser expresso na célula hospedeira, pode ser inserido no cromossomo da célula hospedeira ou pode existir independente do cromossomo. Em adição, o gene transformado é definido como um polinucleotídeo capaz de codificar um polipeptídeo, e inclui DNA e RNA. O gene transformado pode estar em uma forma adequada que pode ser introduzida na célula hospedeira e expressa nela. Por exemplo, o gene transformado pode ser introduzido na célula hospedeira no tipo de cassete de expressão que é um expressomo de polinucleotídeo que inclui elementos inteiros para a expressão do gene em si. Tipicamente, o cassete de expressão inclui um promotor, um sinal de terminação da transcrição, um sítio de ligação de ribossomo e um sinal de terminação de tradução, que são operacionalmente ligados ao gene transformado. O cassete de expressão pode estar no tipo do vetor de expressão capaz de auto-replicação. O gene transformado também pode ser introduzido na célula hospedeira por si ou no tipo de expressomo de polinucleotídeo de modo a ser operacionalmente ligado à sequência necessária para expressão na célula hospedeira.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser transformado com um vetor recombinante que abriga um gene que codifica uma enzima Scr-PTS derivada de Klebsiella pneumoniae para adquirir uma assimilabilidade de sacarose.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o microorganismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser transformado com um plasmídeo recombinante que inclui uma seqüência de Id. de Seq. N°: 17 para adquirir uma assimilabilidade de sacarose. Especificamente, o plasmídeo recombinante de Id. de Seq. N°: 17 inclui scrKYABR derivado de Klebsiella pneumoniae (ATCC700721), ou seja, o scrK que codifica frutoquinase de Id. de Seq. N° : 6, o scrY que codifica sacarose porina de Id. de Seq. N° : 7, o scrA que codifica sacarose PTS permease de Id. de Seq. N°: 8, o scrB que codifica sacarose hidrolase de Id. de Seq. N° : 9, e o regulador da transcrição de scrR que codifica sacarose de Id. de Seq. N° : 10.
O microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que possui uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido de acordo com a presente invenção é um microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que é capaz de produzir L- aminoácido, retém as atividades de sacarose porina, sacarose PTS permease, sacarose hidrolase, frutoquinase e regulador da transcrição de sacarose, e mantém uma atividade de sacarose PTS ao mesmo tempo, e ele pode ser preferivelmente Escheichia coli.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o L-aminoácido pode ser L-treonina, O-succinil-homosserina, O-acetil-homosserina, L-metionina, L-lisina, L-homosserina, L-isoleucina, L-valina ou L-triptofano.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o L-aminoácido pode ser L-treonina.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que possui uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser Escherichia coli CA03- 0207 (KCCM 10993) que é obtido por transformação de Escherichia coli ABA5G que possui uma capacidade de produção de L-treonina com um vetor que tem a seqüência de Id. de Seq. N° : 17 que inclui os grupos de genes de SCrKYABR
Além disso, a presente invenção fornece um método para a produção de um L-aminoácido, que compreende as etapas de cultura do microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que possui uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido em um meio que contém sacarose como uma fonte de carbono; e recuperação de um L-aminoácido a partir do meio de cultura.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o L-aminoácido pode ser L-treonina, O-succinil-homosserina, O-acetil-homosserina, L-metionina, L-lisina, L-homosserina, L-isoleucina, L-valina ou L-triptofano.
Em uma modalidade específica da presente invenção, o L-aminoácido pode ser L-treonina.
O método para a produção de um L-aminoácido de acordo com a presente invenção inclui a etapa de cultura de microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. que possui assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido.
Em uma modalidade específica da presente invenção, a etapa de cultura de microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. pode ser conduzida em um meio e sob condições de cultura que são adequadas para o microorganismo correspondente. 0 meio e condições de cultura adequados para o microorganismo correspondente podem ser prontamente selecionados e ajustados por qualquer pessoa habilitada na técnica à qual ele pertence. Exemplos do método de cultura incluem modos do tipo em lote, do tipo contínuo e do tipo em lote nutrido, mas não são limitados a estes.
Em uma modalidade específica da presente invenção, a etapa de cultura de microorganismo que pertence ao gênero Escherichia sp. pode ser conduzida por cultura da cepa em um meio típico que é suplementado com fontes adequadas de carbono que incluem sacarose, fontes de nitrogênio, aminoácidos, e vitaminas sob condições aeróbicas e temperatura ou controle de pH.
O meio usado na presente invenção inclui sacarose ou melaço que contém uma alta concentração de sacarose como uma fonte principal de carbono, e pode incluir várias fontes de carbono além da fonte principal de carbono. A fonte de nitrogênio incluída no meio pode ser usada isoladamente ou em combinação de fontes de nitrogênio orgânico como peptona, extrato de levedura, caldo, extrato de malte, milhocina e grão de soja, e fontes de nitrogênio inorgânico como uréia, sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. No meio, as fontes de fósforo como fosfato dihidrogênio de potássio, fosfato dihidrogênio dipotássico ou sais que contêm sódio correspondentes podem ser incluídos. Além disso, o meio pode ser suplementado com aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. Esses componentes principais podem ser adicionados ao meio em uma forma de tipo em lote ou tipo contínuo.
Durante o cultivo, compostos como hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, amónia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adequadamente adicionados de modo a ajustar o pH das culturas. Durante o cultivo, agentes anti- espuma, como éster de poliglicol de ácido graxo podem ser usados para prevenir a formação de espumas. Geralmente, a temperatura de cultivo pode ser mantida em 27°C a 37°C, e preferivelmente em 30°C a 35°C. 0 cultivo pode ser continuado desde que uma quantidade de produção do material desejado, L-aminoácido, seja aumentada sob as condições dadas, e, por exemplo, por 10 a 100 horas.
O método para a produção de um L-aminoácido de acordo com a presente invenção inclui a etapa de recuperação do L- aminoácido a partir da cultura do microorganismo. O método de recuperação do L-aminoácido a partir da cultura pode ser realizado por um método adequado conhecido na técnica, dependendo dos procedimentos de cultura, por exemplo, de tipo em lote, de tipo contínuo ou de tipo em lote nutrido.
A seguir, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses Exemplos são apenas ilustrativos, e a invenção não deve ser limitada por esses Exemplos.
Para transmitir uma assimilabilidade de sacarose a um microorganismo Escherichia sp. que não assimila sacarose, o grupo de genes envolvido em assimilação de sacarose, regulon scr foi obtido a partir de um microorganismo que assimila sacarose. 0 regulon scr é composto de cinco genes, scrK (frutoquinase), scrY (sacarose porina), scrA (componente EIIBC específico para sacarose), scrB (sacarose-6-fosfato hidrolase) e scrR (Repressor específico para sacarose relacionado a LacI), e dois óperons, scrK e scrYAB, são negativamente controlados pelo repressor ScrR (Mol. Microbiol. (1993) 9:195-209).
O sistema Scr-PTS, genes scrKYABR foram obtidos por PCR (reação de cadeia de polimerase) com o uso de cada cromossomo de Klebsiella pneumoniae (ATCC700721D-5) e Erwinia carotobora (ATCCBAA-672D) adquiridos de "American Type Culture Collection" como um modelo. 0 gene scrKYABR que é o regulon scr de Klebsiella. pneumoniae foi amplificado por PCR com o uso de urn par de iniciadores de Id. de Seq. N° : 1 e Id. de Seq. N°: 2, e o gene scrKYABR de Erwinia carotobora foi amplificado por PCR com o uso de urn par de iniciadores de Id. de Seq. N°: 3 e Id. de Seq. N° : 4, de modo a obter cinco tipos de genes, que são consecutivamente presentes em cada genoma, como um polinucleotídeo único. Os iniciadores de Id. de Seq. N° : 1 e 3 têm o sítio de restrição ApaLI, e os iniciadores de Id. de Seq. N° : 2 e 4 têm o sítio de restrição Stul. Os iniciadores usados foram preparados com base em informação sobre scrKYABR e sua sequência circundante de Klebsiella pneumoniae (organismo KEGG, kpn) e Erwinia carotobora (organismo KEGG, eca) disponíveis no KEGG ("Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes").
PCR foi realizada sob as condições que incluem desnaturação a 94 °C por 3 minutos, 2 5 ciclos de desnaturação a 94°C por 3 0 segundos, anelamento a 56°C por 3 0 segundos, e polimerização a 72°C por 5 minutos, e então polimerização a 72°C por 7 minutos. Como um resultado, um polinucleotídeo de 7046 bp foi obtido de Klebsiella pneumoniae e um polinucleotídeo de 7223 bp foi obtido de Erwinia carotobora. Cada polinucleotídeo obtido por PCR foi tratado com ApaLI e FspI, e então clonado nos sítios ApaLI e FspI de um vetor pACYC177. Logo depois, E. coli DH5a foi transformada com o vetor, e espalhada em uma placa de agar MacConkey contendo 1% sacarose. Entre as colônias, colônias de cor roxa escuro foram selecionadas, e então plasmídeos derivados de Klebsiella pneumoniae e Erwinia carotobora foram obtidos com o uso de um miniprep de plasmídeo típico.
O plasmídeo que contém o regulon scr de Klebsiella pneumoniae obtido em (1) foi designado como pAscrKP, e a seqüência (Id. de Seq. N° : 5) de scrKYABR clonada nos sítios ApaLI e FspI foi determinada por um método de determinação de seqüência tipicamente usado na técnica. A FIG. 1 mostra a construção de um plasmídeo recombinante pAscrKP que contém scrKYABR derivado de Klebsiella pneumoniae (ATCC700721). Na seqüência de scrKYABR de Id. de Seq. N°: 5, a posição de 307 a 1230 foi determinada como o gene scrK (Id. de Seq. N° : 6) , a posição de 1395 a 2912 foi identificada como o gene scrY (Id. de Seq. N° : 7), a posição de 3017 a 43872 foi identificada como o gene scrA (Id. de Seq. N°: 8), a posição de 4387 a 5787 foi identificada como o gene scrB (Id. de Seq. N° : 9) e a posição de 5817 a 6821 foi identificada como o gene scrR (Id. de Seq. N°: 10).
O plasmídeo que contém o regulon scr de Erwinia carotobora obtido em (1) foi designado como pAscrEC, e a seqüência (Id. de Seq. N° : 11) de scrKYABR clonada nos sítios ApaLI e FspI foi determinada por um método de determinação de seqüência tipicamente usado na técnica. Na seqüência de scrKYABR de Id. de Seq. N° : 11, a posição de 412 a 1347 foi identificada como o gene scrK (Id. de Seq. N° : 12), a posição de 1538 a 3073 foi identificada como o gene scrY (Id. de Seq. N° : 13), a posição de 3153 a 4523 foi identificada como o gene scrA (Id. de Seq. N° : 14), a posição de 4523 a 5932 foi identificada como o scrB gene (Id. de Seq. N° : 15) , e a posição de 5963 a 6982 foi identificada como o gene scrR (Id. de Seq. N°: 16).
Para examinar se uma E. coli que produz treonina cresce com o uso de sacarose e produz treonina eficientemente, quando a E. coli é transformada com cada um dos grupos de genes envolvidos em assimilação de sacarose, pAscrKP que contém regulon scr (Id. de Seq. N° : 17) e pAscrEC (Id. de Seq. N°: 18) obtidos no Exemplo 1, cada um dos plasmídeos foi introduzido em E. coli ABA5G por um método de transformação típico. A E. coli ABA5G transformada com pAscrKP ou pAscrEC foi espalhada em uma placa de agar MacConkey contendo 1% sacarose. Entre as colônias, colônias de cor roxa escuro foram selecionadas. PCR foi realizada para confirmar que as colônias selecionadas tinham o plasmídeo que contém gene relacionado à assimilação de sacarose.
A colônia obtida em (1) foi cultivada em um meio sólido LB (1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g/100 ml de extrato de levedura, 1,5% agar) em um incubador a 33°C de um dia para o outro. Uma alça da cepa cultivada foi inoculada em 25 ml de meio de titulação que possui a composição da Tabela 1 a seguir e sacarose como a principal fonte de carbono, e então cultivada em um incubador a 33 °C a 200 rpm por 70 horas. [Tabela 1]
Como um grupo de controle, a cepa parental de E. coli ABA5G transformada sem plasmídeo foi usada, e cultivada no meio que possui a composição da Tabela 1 com o uso de glicose em vez de sacarose, para comparar a taxa de utilização de sacarose à taxa de utilização de glicose e produtividade de treonina. Os resultados são resumidos na Tabela 2 a seguir. [Tabela 2]
Como mostrado na Tabela 2, a E. coli ABASG/pAscrEC que abriga pAscrEC utilizou 44,3 g/1 de sacarose (dados não mostrados) e produziu 12,2 g/1 de L-treonina, e a E. coli ABA5G/pAscrKP que abriga pAscrKP utilizou 70 g/L de sacarose que é toda da sacarose contida no meio de cultura, e produziu 26,5 g/1 de L-treonina durante 70 horas de cultivo. Foi constatado que a E. coli ABA5G que abrigada pAscrEC ou pAscrKP utilizou sacarose, enquanto a cepa parental de E. coli ABA5G transformada sem plasmídeo não utilizou sacarose. Além disso, ABA5G que abriga pAscrKP mostra melhor utilização de sacarose e produtividade de treonina que ABA5G que abriga pAscrEC. Em particular, ABA5G que abriga pAscrKP produziu 21,2 g/1 de L-treonina no meio de titulação que contém glicose, mas 26,5 g/1 de L-treonina no meio de titulação que contém sacarose, indicando um aumento de 1,3 vez na produtividade de L-treonina.
Portanto, a cepa recombinante que abriga pAscrKP mostrou excelente utilização de sacarose e produtividade de L-treonina, e assim o microorganismo transformado foi designado como CA03-0207, depositado na autoridade depositória internacional, "Korean Culture Center of Microorganisms", que é a Coleção de Cultura Auxiliar da "Korean Federation of Culture Collections" (localizada em 361-221, Hongje-l-dong, Seodaemon-gu, Seul, Coréia), em 23 de fevereiro de 2009, e que recebeu o número de acesso KCCM 10993.
Será aparente para aqueles habilitados na técnica que várias modificações e alterações podem ser feitas sem fugir do escopo e espírito da invenção. Portanto, deve-se entender que as modalidades acima não são limitantes, mas ilustrativas em todos os aspectos.
As seqüências de Id. de Seq. Nos: 1 a 21 aqui descritas são listadas na listagem de seqüência em anexo.
O microorganismo que possuiu uma assimilabilidade de sacarose e uma capacidade de produção de L-aminoácido de acordo com a presente invenção é usado para produzir economicamente um L-aminoácido com o uso de sacarose barata como uma fonte de carbono.
Claims (4)
1. Micro-organismo que pertence ao gênero Escherichia sp. caracterizado por possuir uma capacidade de assimilar sacarose e uma capacidade de produção de L- treonina, que é obtida por introdução de um gene scrK que codifica frutoquinase, um gene scrY que codifica sacarose porina, um gene scrA que codifica sacarose PTS permease, um gene scrB que codifica sacarose hidrolase, e um gene scrR que codifica regulador da transcrição de sacarose em uma Escherichia coli que não assimila sacarose tendo uma capacidade de produção de L-treonina e uma atividade de sacarose PTS (sacarose fosfotransferase dependente de sistema fosfoenolpiruvato), em que os referidos genes são genes de Klebsiella pneumonia, e em que a sacarose PTS é composta de Enzima I (EI), proteína histidina e enzima IIA específica para glicose (EIIAcrrGlc), em que os genes que codificam frutoquinase, sacarose porina, sacarose PTS permease, sacarose hidrolase e regulador da transcrição de sacarose são scrK de Seq. Id. N°: 6, scrY de Seq. Id. N°: 7, scrA de Seq. Id. N°: 8, scrB de Seq. Id. N°: 9 e scrR de Seq. Id. N°: 10, respectivamente.
2. Micro-organismo que pertence ao gênero Escherichia sp., de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é obtido por transformação do micro-organismo que não assimila sacarose que pertence ao gênero Escherichia sp. com um vetor recombinante que inclui uma sequência de Seq. Id. N°: 17.
3. Micro-organismo que pertence ao gênero Escherichia sp., de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a E. coli é E. coli CA03- 0207 (KCCM 10993).
4. Método para a produção de uma L-treonina, 5 caracterizado por compreender as etapas de cultura do micro-organismo que pertence ao gênero Escherichia sp., como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em um meio que contém sacarose como uma fonte de carbono; e recuperação de uma L-treonina a partir do meio de cultura.
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