CN102365363A - 产生l-氨基酸的微生物和利用其生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及埃希氏菌属某种(Escherichia sp.)的微生物和利用其产生L-氨基酸的方法。埃希氏菌属某种的微生物具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力，其通过将编码从蔗糖同化微生物得到的蔗糖代谢酶的基因引入到具有L-氨基酸产生能力和蔗糖PTS(磷酸烯醇丙酮酸依赖的蔗糖磷酸转移酶系统)活性的非蔗糖同化的埃希氏菌属某种微生物中而被获得。

Description

产生L-氨基酸的微生物和利用其生产L-氨基酸的方法
发明背景
1.发明领域
本发明涉及具有蔗糖可同化性(sucrose assimilability)和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种(Escherichia sp.)的微生物，其通过将编码从蔗糖同化微生物得到的蔗糖代谢酶的基因引入具有L-氨基酸产生能力和蔗糖PTS(磷酸烯醇丙酮酸依赖的蔗糖磷酸转移酶系统)活性的属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物中而获得；以及利用所述微生物产生L-氨基酸的方法。
2.相关领域的说明
由于对生物燃料生产日益增长的需求以及由不正常的气候引起的农业欠收，主要用于工业发酵的淀粉糖的价格增长快速。可选地，蔗糖或含有高浓度蔗糖的糖蜜——比淀粉糖便宜——作为碳源在工业发酵中的使用对于保证成本竞争是有利的。
大约50％的野生型天然形成的大肠杆菌(E.coli)能够代谢蔗糖，但是通常用于工业发酵的大肠杆菌K12菌株、B菌株、C菌株或类似物没有同化蔗糖的能力(Mol.Microbiol.(1998)2：1-8，Can.J.Microbiol.(1999)45：418-422)。因此，发酵工业的最重要的挑战之一是鉴别涉及蔗糖同化作用的基因，通过改进而建立提高的蔗糖同化作用相关基因以及将该基因应用到非蔗糖同化的工业大肠杆菌菌株中，以产生期望的代谢物。
为了赋予工业大肠杆菌菌株蔗糖可同化性，引入涉及蔗糖同化作用的基因或基因簇——得自具有蔗糖可同化性的微生物——的方法已被普遍使用。例如，通过用存在于属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的沙门氏菌属(Salmonella)某种(J.Bacteriol.(1982)151：68-76，Mol.Microbiol.(1998)2：1-8，J.Bacteriol.(1991)173：7464-7470，美国专利号7179623)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(J.Gen.Microbiol.(1988)134：1635-1644)和解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)(J.Bacteriol.(2000)182：5351-5358)中的scr调节子转化而赋予大肠杆菌K12蔗糖可同化性的方法在本领域中是悉知的。得自具有蔗糖可同化性的非K12大肠杆菌或致病大肠杆菌的csc调节子(Appl.Environ.Microbiol.(1992)58：2081-2088，美国专利号6960455)的引入、存在于分离自大肠杆菌ABl281的接合质粒scr53中的涉及蔗糖同化作用的基因簇(美国专利号4806480)的引入，以及得自革兰氏阳性微生物、变异链球菌(Streptococcus mutans)(J.Bacteriol.(1989)171：263-271)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)(J.Bacteriol.(1989)171：1519-1523)的scr调节子和sac操纵子的引入也是已知的。美国专利号7179623公开了利用大肠杆菌K12产生赖氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的方法，所述大肠杆菌K12通过在其中引入从大肠杆菌VKPMB-7915得到的scr调节子而被制备。
然而，仍然需要具有有效的蔗糖利用系统的工业微生物和利用其进行发酵的方法。因此，本发明人发现，可以利用属于埃希氏菌属某种的产生L-氨基酸的微生物从蔗糖中以高产量生产L-氨基酸，所述微生物通过引入得自蔗糖同化的肺炎克雷伯氏菌的涉及蔗糖同化作用的基因簇而被制备，从而完成本发明。
发明概述
本发明的一个目的是提供具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物，所述微生物通过赋予具有L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物蔗糖可同化性而被制备。
本发明的另一个目的是提供这样一种方法：其利用具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物，从蔗糖中生产L-氨基酸。
附图简介
图1显示根据本发明的一个具体实施方式的含有从肺炎克雷伯氏菌(ATCC700721)得到的scrKYABR的重组质粒pAscrKP的构建。
发明详述
为了实现以上目标，本发明提供具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物，其通过将编码从蔗糖同化微生物得到的蔗糖代谢酶的基因引入到具有L-氨基酸产生能力和蔗糖PTS(磷酸烯醇丙酮酸依赖的蔗糖磷酸转移酶系统)活性的属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物中而得到。
如本文所使用的，术语“非蔗糖同化微生物”意为不能利用蔗糖作为碳源的微生物，术语“具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的微生物”意为能将蔗糖作为碳源代谢以产生L-氨基酸的微生物。
如本文所使用的，术语“蔗糖代谢酶”意为需要利用蔗糖作为碳源的酶，而且，它包括果糖激酶、蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶、转化酶或类似物，但并不限于此。
在本发明中，“蔗糖代谢酶”也被称为“Scr-PTS酶”。
根据用于磷酸化细胞中的流入蔗糖的磷酸盐源(phosphate source)，可将利用蔗糖作为碳源的代谢系统主要分成基于PTS(磷酸烯醇丙酮酸依赖的蔗糖磷酸转移酶)的蔗糖代谢系统(Scr-PTS系统)和非基于PTS的蔗糖代谢系统(非Sc PTS系统)。大部分能够利用蔗糖的微生物具有Scr-PTS系统。
基于PTS的Scr-PTS系统——利用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)作为用于磷酸化蔗糖的磷酸盐源——的代表例子包括革兰氏阴性鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的接合质粒pUR400、存在于肺炎克雷伯氏菌染色体上的scr调节子或类似物。scr调节子由5个基因——scrK(果糖激酶)、scrY(蔗糖孔蛋白)、scrA(蔗糖特异性EIIBC组分)、scrB(蔗糖-6-磷酸水解酶)和scrR(LacI相关的蔗糖特异性阻抑物)和两个操纵子组成，scrK和scrYAB由ScrR阻抑物负控制(Mol.Microbiol.(1993)9：195-209)。根据scr调节子的机制，外部蔗糖通过外膜蛋白(OMP)——ScrY被转运到壁膜间隙中。被转运的蔗糖通过包括ScrA的蔗糖PTS循环以蔗糖-6-磷酸的形式被转运到细胞中。然后，蔗糖-6-磷酸被水解成葡糖-6-磷酸和果糖，它们被ScrB代谢，并且果糖通过ATP依赖的ScrK被转化成果糖-6-磷酸，而且，产生的果糖-6-磷酸与葡糖-6-磷酸一起通过糖酵解被代谢(J.Biotechnol.(2001)92：133-158)。蔗糖PTS循环——起将蔗糖转化成蔗糖-6-磷酸，然后将其转运到细胞中的作用——由酶I(EI)、组氨酸蛋白(HPr)、葡萄糖特异性酶IIA(EIIAcrrGlc)和蔗糖特异性酶IIBC(EIIBCscr)组成(J.Biotechnol.(2001)92：133-158/J.Biotechnol.(2004)110：181-199)。
通过变异链球菌的scr调节子示例革兰氏阳性微生物的Scr-PTS系统，所述scr调节子由scrK、scrA、scrB和scrR基因组成(J.Bacteriol.(2003)185：5791-5799)。
非Scr PTS系统——不需要PTS以将蔗糖摄取到细胞中——通过悉知的csc调节子而被示例。csc调节子主要得自蔗糖同化大肠杆菌，并且，通过来自野生型大肠杆菌EC3132的csc调节子(Mol.Gen.Genet.(1992)235：22-32，美国专利号6960455)、来自大肠杆菌KO11的csc调节子(Biotechnol.Lett.(2004)26：689-693)、来自致病大肠杆菌O157:H7的csc调节子(J.Bacteriol.(2002)184：5307-5316)、来自ATCC13281的csc调节子(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2007)74：1031-1040)或类似物而被示例。csc调节子由cscB(质子同向转运型蔗糖通透酶)、cscK(果糖激酶)、cscA(蔗糖水解酶)和cscR(LacI相关蔗糖特异性阻抑物)以及两个操纵子组成，cscKB和cscA由CscR负控制(J.Bacteriol.(2002)184：5307-5316)。
非Scr PTS系统是不利的，因为其对于低水平蔗糖的摄取是无效的。据报道，与csc调节子一起引入的大肠杆菌在含有0.2％或更少的蔗糖的培养基中具有20小时的倍增时间(J.Bacteriol.(2002)184：5307-5316)。与非Scr PTS系统不同，Scr-PTS系统允许将甚至低水平的蔗糖有效地摄取到细胞中，因为ScrA作为蔗糖PTS通透酶起利用游离磷酸盐——由通过由酶I、组氨酸蛋白和葡萄糖特异性酶IIA组成的蔗糖PTS循环将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化成丙酮酸而产生——将蔗糖转化成蔗糖-6-磷酸的作用，同时，其将蔗糖从外周胞质转运到细胞中。也就是说，虽然通过非Scr PTS系统的CscB对外部蔗糖的摄取是由氢梯度(hydrogen gradient)引发的，但Scr-PTS系统需要用作能源的PEP，以将蔗糖摄取到细胞中，因而允许有效地摄取甚至低水平的蔗糖。非Scr PTS系统的CscB——通过氢梯度将外部蔗糖转运到细胞中——针对蔗糖具有1.0mM的Km值(Biochem.BiophysRes.Commun.(1995)208：1116-1123)。相反地，ScrA具有10μm的Km值(J.Bacteriol.(1982)151：68-76)，这比CscB的值低100倍。在Scr-PTS系统中，除了ScrA之外，ScrY蛋白也涉及有效摄取低水平的蔗糖。据报道，ScrY是蔗糖孔蛋白，其起将外部蔗糖转运到外周胞质中的作用，而蔗糖孔蛋白的异常表达大大降低蔗糖的转运(J.Bacteriol.(1991)173：449-456)。也就是说，在Scr-PTS系统中，ScrY将外部蔗糖转运到外周胞质中，而ScrA通过PTS系统将周质蔗糖快速转运到细胞中，从而有效地利用甚至低水平的蔗糖。
在本发明的具体实施方式中，编码从蔗糖同化微生物得到的蔗糖代谢酶的基因是得自具有蔗糖同化能力的微生物的基因，而优选为得自具有基于PTS的Scr-PTS系统的微生物的基因。
在本发明的具体实施方式中，编码从蔗糖同化微生物得到的蔗糖代谢酶的基因指得自属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)或欧文氏菌属(Erwinia)的蔗糖同化微生物的基因，而更优选为得自肺炎克雷伯氏菌ATCC700721或胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)ATCCBAA-672的基因。
在本发明的具体实施方式中，编码从蔗糖同化微生物得到的蔗糖代谢酶的基因可以是得自肺炎克雷伯氏菌的编码果糖激酶、蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶和蔗糖转录调节子的基因的组合。
在本发明的具体实施方式中，编码从蔗糖同化微生物得到的果糖激酶、蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶和蔗糖转录调节子的基因可以分别是SEQ IDNO.6的scrK、SEQ ID NO.7的scrY、SEQ ID NO.8的scrA、SEQ ID NO.9的scrB和SEQ ID NO.10的scrR。
在本发明的具体实施方式中，属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物应该具有蔗糖PTS循环活性，所述蔗糖PTS循环由酶I(EI)、组氨酸蛋白(HPr)和葡萄糖特异性酶IIA(EIIAcrrGlc)组成，不包括ScrA。优选地，酶I编码基因(ptsI，SEQID NO.19)、组氨酸蛋白编码基因(ptsH，SEQ ID NO.20)和葡萄糖特异性酶IIA编码基因(crr，SEQ ID NO.21)的正常表达应该发生在蔗糖埃希氏菌属某种微生物中。
为了制备根据本发明的具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物，可以通过本领域悉知的方法，进行将编码从蔗糖同化微生物得到的蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶、果糖激酶和蔗糖转录调节子的基因引入到属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物中。
在本发明的具体实施方式中，编码蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶、果糖激酶和蔗糖转录调节子的序列被引入到载体中，以构建重组载体，并且，用构建的重组载体转化具有L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物，以制备具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物。
用于制备本发明的属于埃希氏菌属某种的微生物的载体并不被特别限制，而且，任何已知的表达载体均可被使用。优选地，pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322或pMW118可被使用。
如本文所使用的，术语“转化”意为将基因引入宿主细胞，以在宿主细胞中表达的方法。如果能在宿主细胞中表达，转化基因可以被插入到宿主细胞染色体中或者可以独立于染色体而存在。此外，转化基因被定义为能够编码多肽的多核苷酸，而且包括DNA和RNA。转化基因可以是能被引入宿主细胞并在其中表达的合适形式。例如，转化基因可以以表达盒的类型被引入到宿主细胞中，所述表达盒是包含用于独自表达基因的全部元件的多核苷酸表达体(expressome)。通常，表达盒包括启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号，其被可操作地连接到转化基因。表达盒可以是能自我复制的表达载体的类型。转化基因也可以独自被引入到宿主细胞中，或者以多核苷酸表达体类型被引入到宿主细胞中，以可操作地被连接到在宿主细胞中表达所需的序列。
在本发明的具体实施方式中，可以用含有编码从肺炎克雷伯氏菌得到的Scr-PTS酶的基因的重组载体转化具有L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物，以获得蔗糖可同化性。
在本发明的具体实施方式中，可以用包含SEQ ID NO.17序列的重组质粒转化具有L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物，以获得蔗糖可同化性。尤其地，包含SEQ ID NO.17序列的重组质粒含有从肺炎克雷伯氏菌(ATCC700721)得到的scrKYABR，即，SEQ ID NO.6的编码果糖激酶的scrK、SEQID NO.7的编码蔗糖孔蛋白的scrY、SEQ ID NO.8的编码蔗糖PTS通透酶的scrA、SEQ ID NO.9的编码蔗糖水解酶的scrB以及SEQ ID NO.10的编码蔗糖转录调节子的scrR。
根据本发明的具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物是这样的属于埃希氏菌属某种的微生物：其能够产生L-氨基酸，保持蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶、果糖激酶和蔗糖转录调节子的活性，并同时维持蔗糖PTS活性，而且，它可以优选地是大肠杆菌(Escheichia coli)。
在本发明的具体实施方式中，L-氨基酸可以是L-苏氨酸、O-琥珀酰-高丝氨酸、O-乙酰-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-色氨酸。
在本发明的具体实施方式中，L-氨基酸可以是L-苏氨酸。
在本发明的具体实施方式中，具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物可以是大肠杆菌CA03-0207(KCCM 10993)，其通过以具有包含scrKYABR基因簇的SEQ ID NO.17序列的载体转化具有L-苏氨酸产生能力的大肠杆菌ABA5G而获得。
此外，本发明提供用于生产L-氨基酸的方法，其包括在含有蔗糖作为碳源的培养基中培养具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物的步骤，以及从培养基中回收L-氨基酸的步骤。
在本发明的具体实施方式中，L-氨基酸可以是L-苏氨酸、O-琥珀酰-高丝氨酸、O-乙酰-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-色氨酸。
在本发明的具体实施方式中，L-氨基酸可以是L-苏氨酸。
根据本发明的生产L-氨基酸的方法包括培养具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的属于埃希氏菌属某种的微生物的步骤。
在本发明的具体实施方式中，培养属于埃希氏菌属某种的微生物的步骤可以在适于相应微生物的培养基中和培养条件下进行。适于相应微生物的培养基和培养条件可以被所属领域的技术人员容易地选择和调整。培养方法的例子包括分批型(batch type)、连续型(continuous type)和分批补料型方式(fed-batch type manner)，但并不限于此。
在本发明的具体实施方式中，培养属于埃希氏菌属某种的微生物的步骤可以通过在需氧条件和温度或pH控制下在补充有合适的碳源——包括蔗糖、氮源、氨基酸和维生素的典型培养基中培养菌株而进行。
本发明中使用的培养基包含蔗糖或含有高浓度蔗糖的糖蜜作为主要碳源，而且可以包含除了主要碳源以外的多种碳源。培养基中包含的氮源可以被单独使用，或者与有机氮源如胨、酵母提取物、肉汤、麦芽汁、玉米浆和大豆以及无机氮源如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵组合使用。在培养基中，可以包含磷源，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐。此外，培养基可以被补充有氨基酸、维生素和合适的前体。可以以分批型或连续型将这些主要组分加入到培养基中。
在培养过程中，可以适当地加入化合物，如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸，以调节培养物的pH。在培养过程中，可以使用消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，以防止泡沫形成。通常，培养温度可以维持在27℃到37℃，而优选为在30℃到35℃。只要期望物质——L-氨基酸的产量在给定条件下增长，就可以继续进行培养，例如，培养10到100小时。
根据本发明的生产L-氨基酸的方法包括从微生物培养物中回收L-氨基酸的步骤。可以通过本领域已知的合适方法实施从培养物中回收L-氨基酸的方法，这取决于培养方法，例如，分批型、连续型或分批补料型。
在下文中，将通过参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，而本发明并不意图被这些实施例所限制。
实施例1：涉及蔗糖同化作用的scr调节子序列的克隆和鉴别
(1)从蔗糖同化微生物得到的scr调节子的克隆
为了赋予非蔗糖同化的埃希氏菌属某种微生物蔗糖可同化性，从蔗糖同化微生物中获取涉及蔗糖同化作用的基因簇——scr调节子。scr调节子由5个基因——scrK(果糖激酶)、scrY(蔗糖孔蛋白)、scrA(蔗糖特异性EIIBC组分)、scrB(蔗糖-6-磷酸水解酶)和scrR(LacI相关蔗糖特异性阻抑物)以及两个操纵子组成，scrK和scrYAB由ScrR阻抑物负控制(Mol.Microbiol.(1993)9：195-209)。
通过PCR(聚合酶链反应)，利用购自American Type Culture Collection的肺炎克雷伯氏菌(ATCC700721D-5)和胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotobora)(ATCCBAA-672D)染色体作为模板获得Scr-PTS系统、scrKYABR基因。通过PCR，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物对扩增scrKYABR基因——肺炎克雷伯氏菌的scr调节子，而通过PCR，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物对扩增胡萝卜软腐欧文氏杆菌的scrKYABR基因，以获得5种类型的基因，所述基因作为单一多核苷酸连续存在于每个基因组上。SEQ ID NOs.1和3引物具有ApaLI限制位点，而SEQ ID NOs.2和4引物具有StuI限制位点。根据关于肺炎克雷伯氏菌(KEGG生物体，kpn)和胡萝卜软腐欧文氏杆菌(KEGG生物体，eca)——可从KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)购买——的scrKYABR及其周围序列的信息而制备使用的引物。
在以下条件下进行PCR，所述条件包括：94℃变性3min；94℃变性30sec，56℃退火30sec以及72℃聚合5min，25个循环；然后，72℃延伸7min。结果，从肺炎克雷伯氏菌中获得7046bp的多核苷酸，而从胡萝卜软腐欧文氏杆菌中获得7223bp的多核苷酸。经PCR获得的每一条多核苷酸均通过ApaLI和FspI处理，然后克隆到pACYC177载体的ApaLI和FspI位点。其后，用载体转化大肠杆菌DH5α，并将其涂铺到含有1％蔗糖的麦康凯琼脂平皿(MacConkey agar plate)上。在菌落中，选择深紫色的菌落，然后，利用典型的质粒小量制备获得得自肺炎克雷伯氏菌和胡萝卜软腐欧文氏杆菌的质粒。
(2)scrKYABR基因序列的鉴别
(2-1)从肺炎克雷伯氏菌得到的scr调节子
含有在(1)中获得的肺炎克雷伯氏菌的scr调节子的质粒被指定为pAscrKP，而克隆到ApaLI和FspI位点的scrKYABR序列(SEQ ID NO.5)通过本领域通常使用的序列测定方法而被测定。图1显示含有从肺炎克雷伯氏菌(ATCC700721)得到的scrKYABR的重组质粒pAscrKP的构建。在SEQ ID NO.5的scrKYABR序列中，从307到1230的位置被测定为scrK基因(SEQ ID NO.6)，从1395到2912的位置被鉴别为scrY基因(SEQ ID NO.7)，从3017到4387的位置被鉴别为scrA基因(SEQ IDNO.8)，从4387到5787的位置被鉴别为scrB基因(SEQ ID NO.9)以及从5817到6821的位置被鉴别为scrR基因(SEQ ID NO.10)。
(2-2)从胡萝卜软腐欧文氏杆菌得到的scr调节子
含有在(1)中获得的胡萝卜软腐欧文氏杆菌的scr调节子的质粒被指定为pAscrEC，而克隆到ApaLI和FspI位点的scrKYABR DNA序列(SEQ ID NO.11)通过本领域通常使用的序列测定方法而被测定。在SEQ ID NO.11的scrKYABR序列中，从412到1347的位置被鉴别为scrK基因(SEQ ID NO.12)，从1538到3073的位置被鉴别为scrY基因(SEQ ID NO.13)，从3153到4523的位置被鉴别为scrA基因(SEQ ID NO.14)，从4523到5932的位置被鉴别为scrB基因(SEQ ID NO.15)以及从5963到6982的位置被鉴别为scrR基因(SEQ ID NO.16)。
实施例2：蔗糖同化的、产生L-氨基酸的微生物的构建
(1)用重组质粒转化
为了检验产生苏氨酸的大肠杆菌是否利用蔗糖生长并有效产生苏氨酸，在用每一个涉及蔗糖同化作用的基因簇——实施例1中获得的含有scr调节子的pAscrKP(SEQ ID NO.17)和pAscrEC(SEQ ID NO.18)转化大肠杆菌时，通过典型的转化方法将每个质粒引入到大肠杆菌ABA5G中。将以pAscrKP或pAscrEC转化的大肠杆菌ABA5G涂铺到含有1％蔗糖的麦康凯琼脂平皿上。在菌落中，选择深紫色的菌落。进行PCR，以确认选择的菌落具有含有与蔗糖同化有关的基因的质粒。
(2)通过以pAscrKP或pAscrEA转化的微生物生产苏氨酸
在LB固体培养基(1g胰蛋白胨，1g NaCl，0.5g/100ml酵母提取物，1.5％琼脂)上培养在(1)中获得的菌落，在33℃培养箱中过夜。在25mL的含有以下表1的组成以及蔗糖作为主要碳源的滴定培养基中接种一环培养的菌株，然后，以200rpm，在33℃培养箱中培养70小时。
[表1]
  组成   浓度(每升)
  蔗糖   70g
  KH2PO4   2g
  (NH4)2SO4   25g
  MgSO4·7H2O   1g
  FeSO4·7H2O   5mg
  MnSO4·4H2O   5mg
  酵母提取物   2g
  碳酸钙   30g
  pH   6.8
使用没有以质粒转化的亲本菌株大肠杆菌ABA5G作为对照组，并将其培养于含有表1的组成——利用葡萄糖替代蔗糖——的培养基中，以比较蔗糖利用率与葡萄糖利用率以及苏氨酸生产力。结果总结在以下表2中。
[表2]
Figure BPA00001444190900091
如表2所示，在70小时的培养期间，含有pAscrEC的大肠杆菌ABA5G/pAscrEC利用了44.3g/L的蔗糖(数据未显示)并产生12.2g/L的L-苏氨酸，而含有pAscrKP的大肠杆菌ABA5G/pAscrKP利用了70g/L的蔗糖——培养基中所含的所有蔗糖，并产生26.5g/L的L-苏氨酸。据发现，含有pAscrEC或pAscrKP的大肠杆菌ABA5G利用了蔗糖，而没有以质粒转化的亲本菌株大肠杆菌ABA5G没有利用蔗糖。此外，发现含有pAscrKP的ABA5G比含有pAscrEC的ABA5G显示更优良的蔗糖利用和苏氨酸生产力。尤其地，含有pAscrKP的ABA5G在含有葡萄糖的滴定培养基中产生了21.2g/L的L-苏氨酸，但在含有蔗糖的滴定培养基中产生了26.5g/L的L-苏氨酸，表明L-苏氨酸生产力增加1.3倍。
因此，含有pAscrKP的重组菌株显示优良的蔗糖利用和L-苏氨酸生产力，而因此被转化的微生物被指定为CA03-0207，于2009年2月23日保藏在国际确认的培养物保藏单位(international depository authority)——韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganism)，其是韩国培养物保藏联盟(KoreanFederation of Culture Collections)的辅助培养物保藏中心(Subsidiary CultureCollection)(位于韩国首尔Seodaemon-gu，Hongje-1-dong，361-221)，并且，该微生物被指定登录号KCCM 10993。
可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围和精神，这对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。因此，应该理解，以上实施方式并非是限制性的，而在各个方面中是说明性的。
本文所述的SEQ ID NOs.1到21序列列于所附序列表中。
发明效果
根据本发明的具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力的微生物被用于利用廉价的蔗糖作为碳源经济地生产L-氨基酸。
序列表
Figure DEST_PATH_ISB00000678253700011
Figure DEST_PATH_ISB00000678253700021
Figure DEST_PATH_ISB00000678253700031
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Figure DEST_PATH_ISB00000678253700251
 

Claims (8)

1.属于埃希氏菌属某种(Escherichia sp.)的微生物，其具有蔗糖可同化性和L-氨基酸产生能力，其通过将从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)得到的基因——编码果糖激酶、蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶和蔗糖转录调节子——引入到具有L-氨基酸产生能力和蔗糖PTS(磷酸烯醇丙酮酸依赖的蔗糖磷酸转移酶系统)活性的属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物中而被获得，其中所述蔗糖PTS由酶I(EI)、组氨酸蛋白和葡萄糖特异性酶IIA(EIIAcrrGlc)组成。
2.根据权利要求1所述的属于埃希氏菌属某种的微生物，其中所述编码果糖激酶、蔗糖孔蛋白、蔗糖PTS通透酶、蔗糖水解酶和蔗糖转录调节子的基因分别是SEQ ID NO.6的scrK、SEQ ID NO.7的scrY、SEQ ID NO.8的scrA、SEQ ID NO.9的scrB和SEQ ID NO.10的scrR。
3.根据权利要求1所述的属于埃希氏菌属某种的微生物，其中所述微生物通过以包含SEQ ID NO.17序列的重组载体转化所述属于埃希氏菌属某种的非蔗糖同化微生物而被获得。
4.根据权利要求1所述的属于埃希氏菌属某种的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌(E.coli)。
5.根据权利要求4所述的属于埃希氏菌属某种的微生物，其中所述大肠杆菌是大肠杆菌CA03-0207(KCCM 10993)。
6.根据权利要求1所述的属于埃希氏菌属某种的微生物，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。
7.产生L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖作为碳源的培养基中培养如权利要求1-6之一所述的属于埃希氏菌属某种的微生物的步骤；以及从所述培养基中回收L-氨基酸的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。
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