BRPI1013259B1 - Moduladores lxr - Google Patents

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BRPI1013259B1
BRPI1013259B1 BRPI1013259-7A BRPI1013259A BRPI1013259B1 BR PI1013259 B1 BRPI1013259 B1 BR PI1013259B1 BR PI1013259 A BRPI1013259 A BR PI1013259A BR PI1013259 B1 BRPI1013259 B1 BR PI1013259B1
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acid
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Kick Ellen K.
Zhang Haiying
Bollu Venkataiah
Martin Richard
Mohan Raju
Stevens William C., Jr
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Exelixis Patent Company Llc
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Abstract

compostos, sal farmaceuticamente aceitáveis, isômeros, ou pró drogras destes, da invenção são revelados, que são revelados, que são úteis como moduladores da atividade de receptores x do fígado (lxr). composições farmacêuticas contendo os compostos e métodos de uso dos compostos são também revelados.

Description

EXPERIENCE IA DA INVENÇÃO Campo da Invenção
Esta invenção relata para compostos que modulam a atividade de receptores X do figado (LXRs). A invenção também provém composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção e métodos de utilizar estas composições para modular a atividade de receptor X do figado. Em particular, isômeros de imidazole e derivativos são providos para modular a atividade de LXRs.
Receptores Nucleares
Os receptores nucleares são uma superfamilia de proteínas reguladoras que são estruturalmente e funcionalmente relatadas e são receptores, por exemplo, esteróides, retinóides, vitaminas D e hormônios da tiróide (ver, exemplo, "Evans (1988) Science 240:889-895") . Estas proteínas ligam para elementos de ação cis nos promotores de seus genes alvo e modula expressão de gene na resposta para ligandos dos receptores.
Os receptores nucleares podem ser classificados baseados em suas propriedades de ligações de DNA (ver, exemplo, ''Evans, supra and Glass (1994) Endocr. Rev. 15:391-407"). Por exemplo, uma classe de receptores nucleares inclui os receptores glucocorticóide, estrógeno, andrógeno, progestina e mineralocorticóide que ligam como homodimeros para elementos de resposta de hormonal (HREs) organizado como repetidores invertidos (ver, exemplo, "Glass, supra") . Uma segunda classe de receptores, incluindo estas atividades por ácido retinóico, hormônio da tiróide, vitaminaa D3, ácidos graxos/peroxisome proliferativos (isto é, atividade de receptor peroxisome proliferative ou PPARs) e- eedisone, ligado para Es como heterodimeros com um padrão comum, receptores retinóide X (isto é, RXRs, também conhecido como os receptores de ácido retinóico 9-cis; ver, exemplo, ("Levin et al. (1992) Nature 355:359-361 e Heyman et al. (1992) célula 68:397-406").
Os RXRs são sem iguais os receptores nucleáres em que eles ligam DNA como um homodimero e são requeridos como um padrão heterodimérico para um número de receptores nucleares adicionais para ligar DNA (ver, exemplo, "Mangelsdorf et al. (1995) Cell 83:841-850")Os últimos receptores determinam a classe II de subfamilia de receptor nuclear, incluindo muito dos quais são estabelecidos ou implicados como importante regulador de expressão de gene. Existem três genes RXR (ver, exemplo, "Mangelsdorf et al. (1992) Genes Dev. 6:329-344"), codificando para RXRcc, β, e y, ’ todos dos quais são capazes para heterodimerizar com qualquer dos receptores classe II, embora eles apareçam para ser preferencial para distinguir subtipos RXR para padrão de receptores em vivo (ver, exemplo, "Chiba et al. (1997) Mol. Células. Biol. 1 7:3013-3020"). No figadoadulto, RXRa é o mais abundante dos três RXRs (ver, exemplo, "Mangelsdorf et al. (1992) Genes Dev. 6:329-344"), sugerindo que pode ser um papel proeminente em funções hepáticas que envolve regulação por receptores nucleares classe II. Ver também, "Wan et al. (2000) Mol. Células. Biol. 20:4436-4444".
LXRg e LXRB
Os LXRa é encontrado predominantemente no figado, com niveis mais baixo encontrado nos rins, intestino, baço e tecido adrenal (ver, exemplo, "Willy, et al. (1995) Gene Dev. 9 (9) : 1033-1045") . Os LXRp são ubiquos em mamiferos e foi encontrado em aproximadamente todos os tecidos examinados. Os LXRs são ativados por certas ocorrências naturais, derivativos oxidados de colesterol (ver, exemplo, "Lehmann, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (6) :3137-3140") . Os LXRa são ativados por oxicolesterol e metabolismo promotor de colesterol ("Peet et al. (1998) célula 93:693-704"). Assim, LXRs aparece para fazer um papel em, exemplo, metabolismo de colesterol (ver, exemplo, "Janowski, et al. (1996) Nature 383:728-731").
O receptor nuclear LXR faz um papel critico em controle coordenado de ácido biliar, metabolismo de colesterol, e triglicerideo para manter homeostáse de lipideo. Os LXRs e ácido biliar/genes regulador de oxisterol são alvos potenciais para desenvolvimento de drogas terapêuticas para baixar soro colesterol e tratamento cardiovascular e doenças do figado. Compostos com atividade para LXR podem ter profundo efeito sobre homeostáse de lipideo, e pode mais efetivamente controlar doença ou desordens em que LXR está implicado. Isto é realizado através de regulação de múltiplos genes envolvidos em homeostasis de colesterol incluindo Cyp7al, um membro da familia de enzimas citocromo p450 e a taxa que limita passos em sintese de ácido biliar, como também ABC transportadores de membrana ABCA1, ABCG1, ABCG5, e ABCG8. ABCA1 é critico no efluxo de colesterol e de fosfolipideos para lipoproteinas pobre lipideo tal como ApoA-I assim contribuindo para um aumento nos niveis de plasma HDL. Em adição, ABCG5 e ABCG8 aparece para mediar e reduzir absorção intestinal de colesterol e facilitar efluxo de colesterol de células do figado dentro da bile. Infelizmente, em adição para o efeito um anti-aterogênico de agonista LXR, estudos em cultura de célula e sistema de modelo animal demonstraram que agonista LXR aumenta niveis triglicerideos do plasma e lipogênesis hepática e promove o aumento de produção de partículas de lipoproteina VLDL. "Schultz et al., Genes & Development 14:2831-2838 (2000); Repa et al. Genes & Development 14:28119-2830 (2000)". Estratégia para minimizar o indesejado efeito de lipideo inclui identificar composto seletivo de LXRβ que são também parcialmente agonistas. Agonistas parciais podem mostrar ativação especifica de tecido ou repressão de receptores nucleares, como foi demonstrado para o anti-estrogênio tamoxifen, que funciona como um'antagonista de sinalização de estrógeno em tecido do seio e um agonista no útero. 5 Caracterização de LXR isoforma especifica de ratos nulos indica que LXRa é o predominante mediador de atividade de LXR no figado. Em macrófagos, contudo, LXRβ sozinho é suficiente para mediar os efeitos de ligandos de LXR ligandos sobre expressão alvo de gene. Por esta razão 10 compostos com limitada atividade de LXRa deveria ter atividade de anti-aterogênico enquanto limita feitos hepáticos indesejáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Assim, nós reconhecemos que existe uma necessidade para um 15 composto, composições e métodos de modulação da atividade dos receptores nucleares LXR de modo que separa os efeitos desejáveis em metabolismo de colesterol e aterogênesis de aumentado nivel de triglicerideo de plasma em lipogênesis hepática. Embora agonistas de LXR completo causem ambos os 20 efeitos desejáveis e indesejáveis, a presente invenção descreve compostos que têm uma separação benéfica entre os dois, e assim possui um melhor indice terapêutico entre aumentado transporte reverso de colesterol e efeitos detrimental sobre triglicérideos de plasma e Colesterol 25 LDL.
Em um aspecto, a presente invenção inclui composto ou um isômero individual ou mistura de isômeros, um isótopo ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, que são útil como moduladores da atividade de receptores X do figado (LXRs).
Compostos para uso em composições e métodos para modular a atividade de receptores nucleares são providos. Em particular, compostos da invenção que são úteis para modular os receptores X do figado, LXRα e LXRβ, e em particular, LXRβ.
Em um aspecto, os compostos providos neste documento são agonistas de LXR. Em outro aspecto, os compostos providos 5 neste documento são antagonistas de LXR. Agonistas que exibem baixa eficácia são, em certos aspectos,antagonistas.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos de tratamento, inibição, ou melhoramento de sintomas de uma 10 doença ou desordem que é modulada ou outra maneira afetada por atividade LXR ou na qual atividade LXR é envolvida, compreendendo administrar para um sujeito em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto da presente invenção ou um isômero individual ou 15 mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos de modular metabolismo de colesterol para um sujeito em necessidade disto, compreendendo administrar uma efetiva 20 quantidade de metabolismo de colesterol modular de um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos 25 de prevenir ou tratamento para ateroscleroses em um sujeito em necessidade disto, compreendendo administrar uma quantidade efetiva para reduzir nivel de colesterol de composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável 30 destes.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos de modular Atividade LXR para um sujeito em necessidade disto, compreendendo contactar o receptor nuclear com um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos de tratamento, inibição ou melhoramento de um ou mais 5 sintomas de hipocolesterolemia em um sujeito em necessidade disto, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos de aumentar efluxo de colesterol de células de um sujeito em necessidade disto, compreendendo administrar uma quantidade efetiva para aumentar o efluxo de colesterol de um composto da presente invenção ou um isômero individual 15 ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos de aumentar a expressão de ATP-Ligação Cassette Al (ABCA1) e ATP-Ligação Cassette G1 (ABCG1) nas células de um sujeito 20 em necessidade disto, compreendendo administrar uma quantidade efetiva para aumentar expressão de ABCA1 e ABCG1 de um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um salfarmaceuticamente aceitável destes.
Outro aspecto desta invenção está direcionado para métodos de tratamento, inibição, ou melhoramento de um ou mais sintomas de uma doença ou desordem que é afetada por niveis de colesterol ou ácido biliar, compreendendo administrar para um sujeito em necessidade disto uma quantidade 30 terapeuticamente efetiva de um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro aspecto desta invenção é direcionado para composições farmacêuticas compreendendo um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e pelo menos um transportador oú excipiente farmaceuticamente aceitável.
Outro apecto desta invensão está direcionado para regular o 5 transporte reverso de colesterol e caminhos sinalizando inflamatórios que são implicados em patologia de doença de humanos incluindo ateroscleroses e doenças associadas tal como infarto do miocárdio e isquemia em um sujeito em necessidade disto, compreendendo administrar uma quantidade 10 efetiva reguladora de transportador de colesterol reverso e caminhos sinalizando inflamatórioss de um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro apecto desta invensão está direcionado para 15 tratamento da sindrome metabólica que compreende uma constelação de desordens do metabolismo do corpo incluindo obesidade, hipertensão, resistência a insulina, e diabetes incluindo tratamento de doenças resultante de metabolismo compromissado e imunidade incluindo ateroscleroses e 20 diabetes tanto quanto desordens autoimune e doenças em um sujeito em necessidade disto, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto da presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Outro apecto desta invensão está direcionado para tratamento da aterosclerose, resistência a insulina, osteoartrite, infarto, hiperglicemia, dislipidioemia, psoriáse, idade e pele enrugada dependente de exposição de UV, diabetes, câncer, doença de Alzheimer, inflamação, 30 desordens imunológica, desordens de lipideo, obesidade, degeneração macular, condições caracterizada por uma alteração da função de barreira da epiderme, condições de diferenciação de distúrbio ou excesso de proliferação da epiderme ou membrana mucosa, ou desordens cardiovasculares em um sujeito em necessidade disto, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto dá presente invenção ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invencao compreene um compost Da formula I,
Figure img0001
ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, caracterizado por: R1 é cloro, flúor , metil ou trifluormetil; R2 é H ou metil; R3 é H ou metil; R4 é H, cloro, flúor , ou metil; e n é 1, ou 2.
Em algumas concretizações, o composto de fórmula 1 é um no qual R2 e R3 são metil.
Em algumas concretizações, o composto da fórmula I é um no qual R1 é cloro ou flúor. Em algumas destas concretizações, R2 e R3 são metil.
Em algumas concretizações, o composto da fórmula I é um no qual R4 é flúor. Em algumas destas concretizações, R1 é cloro ou flúor e R2 e R3 são metil z qual R e R são H. Em algumas destas concretizações, R e cloro’ ou flúor.
Em algumas concretizações, o composto da fórmula I é um no qual R2 é metil e R3 é H. Em algumas destas concretizações, n é 2, R1 é cloro, e R4 é flúor .
Em outro aspecto, a invenção compreende um composto da fórmula da estrutura 1 de acordo com qualquer das antecedentes concretizações juntos com um ou mais transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
Em outro aspecto, a invenção compreende um método de tratamento da doença ou desordem compreendendo administrar para um sujeito em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente efetiva de (a) um composto da fórmula da estrutura I de acordo para qualquer das antecedentes concretizações ou (b) uma composição farmacêutica compreendendo um composto da fórmula da estrutura I de acordo para qualquer das antecedentes concretizações juntas com um ou mais transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por: a doença ou desordem ser ateroscleroses, hipercolesterolemia, hiperlipoproteinemia, hipertrigliceridemia, lipodistrofia, hiperglicemia, diabetes mellitus, dislipidemia, ateroscleroses, doença de gallstone, acne vulgaris, condições acneiforme na pele, diabetes, doença de Parkinson, câncer, Doença de Alzheimer, inflamação, desordens imunológicas, desordens lipidicas, obesidade, condições caracterizada por uma barreira de função epidermal, condições de distúrbio diferenciação ou excesso proliferação da epiderme ou membrana, mucosa ou desordens cardiovasculares.
Em algumas concretizações, a doença ou desordem para tratamento é hipercolesterolemia, hiperlipoproteinemia, hipertriglicerideomia, lipodistrofia, hiperglicemia, ateroscleroses, diabetes mellitus, ou dislipidioemia.
Em outra concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável 5 destes, selecionado de:
Figure img0002
Figure img0003
Figure img0004
Em outra concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, selecionado de:
Figure img0005
Figure img0006
Em outro concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, selecionado from:
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Figure img0008
Em outro concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, selecionado from:
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Em outra concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, que é 2-(1-(3-cloro-3'-fluor-4(hidroximetil)-5’- (metilsulfonil)bifenil-4-il)-2-(2-(2, 6-diclorofenil)propan- 2-il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol.
Em outra concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, que é 2-(2-(2-(2-cloro-3-fluorfenil)propan-2-il)-1- (3'-fluor-4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4- il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol.
Em outra concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, que é 2-(2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1-(3'- fluor-4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4-il)-1H- imidazol-4-il)propan-2-ol.
Em outra concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, que é 2-(2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1- (3,3'-difluor-4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil- 4-il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol..
Em outra concretização, a presente invenção compreende um composto, isótopo, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, que é 2-{2-[1-(2,6-diclorofenil)etil]-1-[3,3'- difluor-4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4-il]- lH-imidazol-4-il}propan-2-ol.
Os compostos descritos neste documento, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem conter de um ou mais centros assimétricos e pode assim dar origem para isômeros, tais como enantiômeros, diastereômeros, e outras formas estereoisomérica. Tais formas podem ser definidas, em termos de absoluta stereochemistry, como (/?) - ou (5)~, ou como (D)- ou (L)- para aminoácido. A presente invenção está significada para incluir todos tais possiveis individuais estereoisômero e misturas destes, incluindo seus racêmicos e enantiomérico oticamente puro ou formas diastereomérico. Os compostos são normalmente preparados como racemates e pode convenientemente ser usado como tais, ou oticamente ativa ( + ) e (-) , (R) - e (S)-, ou (D)- e (L) - isômeros ou 5 correspondentes diasterômeros podem ser preparados usando sintomas quiral ou reagentes quiral, ou eles podem ser, tais como cromatografia quiral ou HPLC fase reversa. Quando os compostos descritos neste documento contêm ligação dupla de olefinico ou outros centros de assimetria geométrica, e 10 a menos que especificado de outra maneira, é entendido que os compostos incluem ambos E e Z isômeros geométricos.
A invenção também inclui compostos nomeados isotopicamente da invenção, caracterizado por: de um ou mais átomos ser substituído por um átomo tendo o mesmo número atômico, mas 15 uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa usualmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos adequados para inclusão nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogénios, tais como H ou D e H ou T, carbonos tais como C, C, e C, 20 clorinas, tais como 36C1, fluorinas tais como 18F, iodinas, tais como 123I e 125I, nitrogênio, tais como 13N e 15N, oxigênio, tais como O, O, e O, fosforos, tais como P, e enxofre, tais como 35S. Certos compostos nomeados isotopicamente da invenção, para exemplo, destas 25 incorporações um isótopo radioativa, é útil em drogas e/ou estudos de distribuição de substratos de tecido. Os isótopos radioativos tritio, 3H, e carbono-14, 14C, são particularmente úteis para este propósito em vista de sua fácil incorporação e meio fácil de detecção. Substituição 30 com isótopos pesados tais como deuterium, 2H ou D, podem oferecer certas vantagens terapêutica resultante de maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento in vivo vida média ou redução da dosagem requerida, e consequentemente pode ser preferida em algumas circunstâncias. Substituição com positron emitindo isótopos tais como 11C, 18F, 150, e 13N, pode ser útil em estudos de Topografia de Emissão de Positron (PET) para examinar ocupação de receptor de substrato.
Compostos nomeados isotopicamente da invenção podem geralmente ser preparados por técnicas convencionais conhecidas por gualquer experiente no assunto ou por processos análogos para estes descritos neste documento, usando um apropriado reagente nomeado isotopicamente no 10 lugar dos reagentes nomeados isotopicamente de outra maneira empregado.
Definições
Os seguintes termos e expressões usados neste documento têm os significados indicados.
"Receptor nuclear" refere-se para um receptor que ativa ou reprime transcrição de um ou mais genes nos núcleos (mas pode também ter ação na segunda mensagem de sinalização) , tipicamente em conjunção com outros fatores de transcrição. 0 receptor nuclear é ativado por ligando de cognato natural 20 para o receptor. Receptores nucleares são usualmente encontrados no citoplasma ou núcleo, em lugar de ser membrana de ligação. Um receptor nuclear é um membro de uma superfamilia de proteinas reguladoras que são receptores para várias moléculas pequenas endógenas, 25 exemplo, esteróides, retinóides, vitamina D e hormônios da tiróide. Estas proteinas ligam para elementos de ação cis nos promotores de seus genes alvo e modula expressão de gene em resposta para um ligando. Receptores nucleares podem ser classificados baseados em suas propriedades de 30 ligação de DNA. Por exemplo, os receptores glucocorticóide, estrogênio, androgênio, progestina e mineralocorticóide ligam como homodimeros para elementos de resposta de hormônio (HREs) organizado como repetidor invertido. Outro exemplo são receptores, incluindo estes ativados por ácido graxos/peroxisome proliferatores e ecdisone, que Irgam para hora Es como heterodimeros com um padrão comum, o receptor de retinóide X (RXR). Entre os últimos receptores é LXR. "Receptor X do figado" ou "LXR" refere-se para um receptor nuclear implicado em biosintese de colesterol. Como usado neste documento, o termo LXR refere-se para ambos LXRa e LXRβ, duas formas de proteina encontrada em mamiferos. Receptor X do figado-oc ou LXRa refere-se para o receptor descrito na Patente U.S. Nos. 5,571,696, 5,696,233 e5,710,004, e "Willy et al. (1995) Gene Dev. 9(9):1033- 1045". Receptor X do figado-β ou LXRβ refere-se para o receptor descrito no "Peet et al. (1998) Curr. Opin. Genet. Dev. 8 (5) : 571-575; Song et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 761:38-49; Alberti et al. (2000) Gene 243(1-2):93-103"; e referência citada neste documento; e na Patente U.S. Nos. 5,571,696, 5,696,233 e 5,710,004.
"Aceitável farmaceuticamente" refere-se para estes compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que estão, dentro do escopo do julgamento médico, satisfatório para contacto com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outros problemas ou complicações proporcional com um razoável beneficio razão de risco ou que foi de outra maneira aprovado pelo "United States Food and Droga Administração" como sendo aceitável para uso em humanos ou animais domésticos.
"Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se para ambos os sais adicionados ácido e base.
"Sal farmaceuticamente aceitável de adição de ácido" referem-se para estes sais que retém a eficácia biológica e propriedades de bases livres, que não são biologicamente ou de outra maneira indesejadas, e que são formadas com ácidos inorgânicos tais como ácido hidroclórico, ácido hidrobrômico, ácido enxôfrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e seus semelhantes, e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido trifluoracético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido 5 maléico, ácido malônico, ácido sucinico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanosulfônico, ácido etanesulfônico, ácido p-toluenosulfônico, ácido salicíilico, e semelhantes.
"Sal adicionado à base" refere-se para estes sais que retém a eficácia biológica e propriedades de ácidos livres, que não são biologicamente ou de outra maneira indesejado. Estes sais são preparados com a adição de uma base inorgânica ou uma base orgânica para o ácido livre. Sais 15 derivado de bases inorgânicas incluindo, mas não são limitados para, os sais de sódio, potássio, lítio, amónia, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio sais e semelhantes. Preferidos sais inorgânicos são amónia, sódio, potássio, cálcio, e magnésio. Sais derivados de 20 bases orgânicas incluem, mas não são limitados para, sais de aminas primária, secundária, e terciária, substituídas aminas incluindo ocorrência de aminas substituídas naturalmente, aminas cicias e resinas de troca de íon base, tais como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeina, procaina, hidrabamina, colina, betaina, etilenediamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, poliamina resinas e semelhantes. Particularmente preferidas bases orgânicas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina e cafeina.
"Quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se para a quantidade de um composto que, quando administrado para um sujeito, é suficiente para efeito do tratamento para uma doença ou desordem descrita neste documento. A quantidade 5 de um composto que constitui uma "quantidade terapeuticamente efetiva" variará dependendo do composto, da desordem e sua severidade, e a idade do sujeito para ser tratado, mas pode ser determinada rotineiramente por um experiente no assunto.
"Modular" ou "modula" refere-se para o tratamento, prevenção, supressão, melhoramento ou indução de uma função, condição ou desordem. Por exemplo, é acreditado que os compostos da presente invenção podem modular ateroscleroses por estimular a remoção de colesterol de 15 lesões aterosclerótica em um humano.
"Tratar" ou "tratamento" como usado neste documento cobre o tratamento de uma doença ou desordem descrita neste documento, em um sujeito, preferencialmente um humano, e inclui: inibindo uma doença ou desordem, isto é, prendendo seu desenvolvimento; aliviando uma doença ou desordem, isto é, causando regressão da desordem.
"Sujeito" refere-se para um de sangue quente, tal como um 25 mamifero, preferencialmente um humano, ou uma criança humana, que está afligida com, ou tem o potencial para ser afligido com uma ou mais das doenças e desordens descritas neste documento.
"Aterosclerose" refere-se para um processo por meio da qual 30 formam placas ateroscleróticas dentro da parede interna da artéria que conduz para doenças ateroscleróticas cardiovasculares. Doenças aterosclerotica cardiovasculares podem ser reconhecidas e entendidas por médicos que praticam nos campos pertinentes de medicina, e inclui sem limitação, restenosis, doenças coronárias do coração (também conhecida como doença da artéria coronária ou doença de isquemia do coração), doença' cerebrovascular incluindo isquemia do coração, demência de multi infarto, e 5 doença de vasos peripéricos, incluindo claudicação intermitente, e disfunção erétil.
"Dislipidemia" refere-se para niveis anormais de lipoproteinas no plasma do sangue incluindo ambos os niveis baixos e/ou elevado de lipoproteinas (exemplo, elevado 10 niveis de Baixa Densidade Lipoproteina (LDL), Muito Baixa Densidade Lipoproteina (VLDL) e niveis baixo de Alta Densidade Lipoproteina (HDL).
"EC50" refere-se para uma dosagem, concentração ou quantidade de um composto particular de teste que conclui 15 uma resposta dependente da dosagem a 50% da expressão máxima de uma resposta particular que é induzida, provocada ou potencializada por particular teste composto.
"Colesterol" refere-se para um álcool esteróide que é um componente essencial de membranas da célula e bainha de 20 mielina e, como usado neste documento, incorpora seus usos comuns. Colesterol também serve como um precursor para hormônios de esferóides e ácidos biliares.
"Triglicerideo(s)" ou "TGs" refere-se para três moléculas de ácidos graxos esterifiçados para uma molécula de 25 gl icerol e serve para armazenar ácidos graxos que são usados por células dos músculos para produção de energia ou são retirados e armazenados em tecido adiposo.
"IC50" refere-se para uma quantidade, concentração ou dosagem de um composto particular de teste que alcança 50% 30 de inibição de uma resposta máxima, tal como modulação de receptor nuclear, incluindo as atividades de LXRα ou LXRβ, em um ensaio que mede tal resposta.
"LXR" ou "LXRs" refere-se para ambos LXRα e LXRβ.
"LXRα" (LXR alfa) refere-se para todas as formas mamíferas de tai receptor incluindo, por exemplo, alternativas isoformas juntas e isoformas ocorrendo naturalmente. Representativas espécies de LXRα incluem, sem limitação o 5 rato (Genbank Acesso NM_031627), o rato ("Genbank Acesso BC012646"), e humano ("GenBank Acesso No. U22662") formas do receptor.
"LXRβ" (LXR beta) refere-se para todas as formas de mamíferos de tal receptor incluindo, por exemplo, alternativas isoformas juntas e isoformas ocorrendo naturalmente. Espécie representativa de LXRβ inclui, sem limitação o rato ("GenBank Acesso NM_031626"), rato ("Genbank Acesso NM_009473") , e humano ("GenBank Acesso No. U07132") formas do receptor.
"Obeso" e "obesidade" refere-se para um índice de Massa Corporal (IMC) maior que 27,8 kg/m2 para homem e 27,3 kg/m2 para mulher (BMI igual a peso (kg)/(altura)2 (m2) .
Utility
Os compostos da invenção exibem valiosas propriedades 20 farmacológicas e são particularmente úteis como agonistas LXR, antagonistas, agonistas inverso, agonistas parciais e antagonistas, ou são seletivo para LXRa ou para LXRβ. Os compostos da invenção são úteis para o tratamento de doenças ou desordens descritas neste documento, tais como 25 estas associadas com, ou tendo sintomas surgidos de complicações de, transporte de colesterol alterado, transporte de colesterol reverso, metabolismo de ácido graxo, absorção de colesterol, re-absorção colesterol, secreção de colesterol, excreção de colesterol, ou 30 metabolismo de colesterol.
Estas doenças incluem, por exemplo, ateroscleroses, doenças aterosclerótica cardiovascular, (ver, exemplo, Publicação de Aplicação de Patente Internacional Nos. WO 00/57915 e WO 00/37077), dislipidioemia, hiperglicemia, resistência a insulina, diabetes, obesidade, sindrome X (Publicação de Aplicação de Patente U.S. N°' 20030073614, (Publicação de Aplicação de Patente Internacional N°‘ WO 01/82917), excesso de depósito de lipidio em tecidos periféricos, tais como peles ("xanthomas") (ver exemplo, Patente U.S. Nos. 6,184,215 e 6,187,814), infarto, doença oclusiva periférica, perda de memória {"Brain Research (1997), Vol. 752, pp. 189-196"), nervo ótico e patologias retinal (isto é, degeneração macular, retinites pigmentosa), reparo de perigo traumático para o sistema nervoso central ou periférico {"Trends em Neurosciences (1994), Vol. 17, pp. 525-530"), prevenção de processo degenerativo devido à idade (’’ Journal de Pathology (1997), Vol. 151, pp. 1371- 1377") , ou Doença de Alzheimer (ver, exemplo, Publicação de Aplicação de Patente Internacional N0’ WO 00/17334; "Trends em Neurosciences (1994), Vol. 17, pp. 525-530"), prevenção de neuropatias degenerativas, ocorrendo em doenças tais como neuropatias diabéticas (ver, exemplo, Publicação de Aplicação de Patente Internacional N°’ WO 01/82917), escleroses múltiplas {"Annals de Clinicai Biochem. (1996), Vol. 33, No. 2, pp. 148-150"), e doenças autoimunes {" J. Lipídio Res. (1998), Vol. 39, pp. 1740-1743").
Também provido, são métodos de aumentar a expressão de "ATP-Ligação Cassette" (ABCA1), (ver, exemplo, Publicação de Aplicação de Patente Internacional N°’ WO 00/78972) assim aumentar transporte de colesterol reverso em células mamiferas usando os compostos e composições das reivindicações.
De acordo com outro aspecto, a invenção também inclui métodos para remover colesterol depositado em tecido tal como placas ateroscleróticas ou xantomas em um sujeito com ateroscleroses ou doença aterosclerótica cardiovascular manifestada por sinais clinicos de tais doenças, caracterizado por: os métodos para compreender administrar para o sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto ou composição da presente invenção. Adicionalmente, a presente invenção também apresenta um método para prevenir ou reduzir o risco de uma primeira ou 5 subsequentes ocorrências de uma doença aterosclerótica cardiovascular evento incluindo doença de isquemia do coração, infarto de isquemia, demência de multi enfarto, e claudicação intermitente, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente efetiva de um composto ou 10 composição da presente invenção para um sujeito em risco para tais eventos.
Os compostos da presente invenção podem também ser usados em métodos para diminuir hiperglicemia e resistência a insulina, isto é, em métodos para tratamento de diabetes 15 (Publicação de Aplicação de Patente Internacional N°‘ WO 01/82917), e em métodos de tratamento, prevenção, ou melhoramento de desordens relatadas para, ou surgimento de complcações de diabetes, hiperglicemia ou resistência a insulina, incluindo o grupo de estados de doença, condições 20 ou desordens que compõem "Syndrome X" (ver Aplicação de Patente U.S. 20030073614) compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto ou composição da presente invenção para um sujeito em necessidade de tal tratamento. Adicionalmente, a presente 25 invenção também apresenta um método para prevenir ou reduzir o risco de desenvolver hiperglicemia, resistência a insulina, diabetes ou sindrome X em um sujeito, compreendendo a administração de uma quantidade profilática efetiva de um composto ou composição da presente invenção 30 para um sujeito em risco para tal evento.
Diabetes mellitus, comumente chamada diabetes, refere-se para uma doença derivada de processo de múltiplos fatores de causa e caracterizado por elevados niveis de glicose no plasma, referido como hiperglicemia. Ver, exemplo,
"LeRoith, D. et al., (eds.), DIABETES MELLITUS (Lippincott- Raven Publishers, Philadelphia, Pa. U.S.A. 1996"). Incontrolada hiperglicemia é associada com aumentada e prematura mortalidade devido a um aumentado risco para 5 doenças macrovascular, incluindo nefropatia, neuropatia, retinopatia, hipertensão, doença cerebrovascular e doenças coronárias do coração. Por esta razão, controlar a glicose homeostasis é uma criticamente importante abordagem para o tratamento de diabetes.
Existem duas maiores formas de diabetes: diabetes tipo 1 (formalmente referida para diabetes dependente de insulina ou IDEM); e diabetes tipo 2 (formalmente referida para diabetes não dependente de insulina ou NIDDM).Diabetes Tipo 2 é a doença caracterizada por resistência a insulina, 15 acompanhada por relativa, em lugar de absoluta, deficiência de insulina. Diabetes Tipo 2 pode variar de predominante resistência a insulina com relativa deficiência de insulina para predominante deficiência de insulina com algumas resistência a insulina. Resistência a insulina é a 20 habilidade diminuida de insulina para exercer suas ações biológicas através de um largo intervalo de concentrações. Em indivíduos resistência a insulina, corpo segrega anormalmente alta quantidade de insulina para compensar a sua deficiência. Quando inadequada quantidade de insulina 25 está presente para compensar uma resistência a insulina e controle adequado de glicose, um estado de tolerância de glicose prejudicado se desenvolve. Em um número significativo de individuos, adicional declínio da secreção de insulina e os niveis de glicose do plasma sobem, resultando em um estado clinico de diabetes. Diabete Tipo 2 pode ser devido a uma profunda resistência para insulina, estimulando efeitos regulatórios sobre o metabolismo e glicose e lipídio nos principais tecidos sensíveis a insulina: músculo, figado e tecido adiposo. Esta resistência para responsabilidade de insulina resulta em ativação de insuficiente insulina de captação de glicose, oxidação e armàzenagem em músculo e inadequada repressão de insulina de lipolisis em tecido adiposo e de produção de glicose e secreção no figado. Na diabete Tipo 2, niveis de ácido graxo livre são frequentemente elevados em obeso e alguns sujeitos não obeso e lipidio oxidação é aumentada. Prematuro desenvolvimento de ateroscleroses e uma razão de aumento de cardiovascular e doenças periférico vascular são critérios característicos de sujeitos com diabetes. Hiperlipidemia é um importante fator precipitante para estas doenças. Hiperlipidemia é uma desordem geralmente caracterizada por um anormal aumento no soro de lipidio, por exemplo, colesterol e triglicerideo, na corrente sanguínea e é um importante fator de risco em desenvolvimento de ateroscleroses e doenças do coração. Para uma revisão de desordens de metabolismo de lipidio, ver, exemplo, "Wilson, J. et al., (ed.), Disorders of Lipid Metabolism, Chapter 23, Textbook of Endocrinology, 9th Edition, (W. B. Sanders Company, Philadelphia, Pa. U.S.A. 1998") .. Hiperlipidemia é usualmente classificada como hiperlipidemia primária ou secundária. Primária hiperlipidemia é geralmente causada por deficiência genética, enquanto hiperlipidemia secundária é geralmente causada por outros fatores, tais como vários estados de doenças, drogas, e fatores dietéticos. Alternativamente, hiperlipidemia pode resultar de ambas uma combinação de causas primária e secundária de hiperlipidemia. Niveis elevados de colesterol são associados com um número de estados de doenças, incluindo doença artéria coronariana, angina pectoris, doença da artéria carótida, infarto, arteriosclerosis cerebral, e xantoma.
Dislipidemia, ou niveis anormais de lipoproteinas no plasma do sangue, é uma ocorrência frequente entre os diabéticos, e foi mostrado para ser uma das principais colaboradoras para o aumento da incidência de eventos coronarianos e morte entre sujeitos diabéticos (ver, exemplo, "Joslin, E. Ann. Chim. Med. (1927), Vol. 5, pp. 1061-1079"). Estudos epidemiológicos desde então confirmaram a associação e tem mostrado a vários aumentos em mortes coronarianas entre os sujeitos diabéticos quando comparado com sujeitos não diabéticos (ver, exemplo, "Garcia, M. J. et al. , Diabetes (1974), Vol. 23, pp. 105-11 (1974); and Laakso, M. and Lehto, S., Diabetes Reviews (1997), Vol. 5, No. 4, pp. 294- 315"). Várias anormalidades de lipoproteina foram descritas entre sujeitos diabéticos ("Howard B., et al., Arteriosclerosis (1978), Vol. 30, pp. 153-162").
Adicionalmente provido por esta invenção são métodos de uso dos compostos da invenção para tratar obesidade, tanto como as complcações de obesidade. Obesidade é ligada para uma variedade de desordens médicas, incluindo diabetes e hiperlipidemia. Obesidade é também um conhecido fator de risco para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (Ver, exemplo, "Barrett-Conner, E., Epidemol. Rev. (1989), Vol. 11, pp. 172-181; e Knowler, et al., Am. J Clin. Nutr. (1991), Vol. 53, pp. 1543-1551").
Administração e Formulação
Um composto da invenção pode ser administrado a sujeito em necessidade disto por qualquer rota aceitável de administração. Rotas aceitáveis de administração incluem, mas não são limitados para, bucal, cutâneas, endocervical, endosinusial, endotraqueal, enteral, epidural, intersticial, intra-abdominal, intra-arterial, intrabronquial, intrabursal, intracerebral, intracisternal, intracoronariana, intradermal, intraductal, intraduodenal, intradural, intraepidermal, intraesofageal, intragástrica, intragengival, intraileal, intralinfática, intramedular, intrameningeal, intramuscular, intra-ovariana, intraperitoneal, intraprostática, intrapulmonar, intra- sinalo, intraespinhal, intrasinovial, intratesticular, intrátecal, intratubular, intratumor, intra-uterino, intravascular, intravenosa, nasal, nasogástrica, oral, parenteral, percutânea, peridural, retal, respiratória (inalação), subcutâneos, sublingual, submucosas, topical, transdermal, transmucosal, transtraqueal, ureteral, uretral e vaginal.
Um composto da invenção pode ser administrado em qualquer forma de dosagem aceitável sólida, semi-sólida, liquida ou gasosa. Formas aceitáveis de dosagem incluem, mas não são limitadas para, airosos, cápsulas, cremes, emulsões, gases, gel, grãos, unguento, loções, bálsamo, pastas, pó, soluções, suspensões, xaropes e tabletes. Sistemas aceitáveis de entrega incluem, mas não são limitados para, dispositivos biodegradáveis implantes (exemplo, poli(DL- lactide), lactide/glicolido copolimeros e lactide/caprolactone copolimeros), cápsulas, duchas, enemas, inalador, intra-uterino, nebulizantes, adesivo, bombas e supositórios.
Uma forma de dosagem da invenção pode incluir somente um composto da invenção ou o composto da invenção pode ser formulados junto com convencionais excipientes, transportadores e adjuvantes farmacêuticos e/ou outros medicamentos ou agentes farmacêuticos. Excipientes aceitáveis incluem, mas não são limitados para, (a) antiaderentes, tais como croscarmelose sódio, crosprovidona, amido de sódio glicosado, celulose micro cristalino, amido e talco; (b) pastas, tais como celulose, gelatina, celulose de hidroxipropil, lactose, maltitol, polietileno glicol, polivinil pirrolidona, sorbitol, amido, açúcar, sacarose e xilitol; (c) coberturas, tais como celulose, verniz, zein e agentes entéricos; (d) desintegrantes, tais como celulose, crosslinked polyvinil pyrrolidone, sódio carboximetil celulose, metilcelulose, celulose microcristalin, sódio amido glicolato e amido; (e) agentes de preenchimento, tais como cálcio carbonoato, celulose, fosfato de cálcio dibásico, glicose, lactose, manitol, sorbitol e sacarose; (f) agentes de sabor; (g) agentes de coloração; (h) glidantes, tais como cálcio estearato, dióxido de silicone coloidal, gliceril behenato, gliceril monoestearato, gloceril palmitoestearato,óleo vegetal hidrogenado, estearato de magnésio, magnésio trisilicato, óleo mineral, polietileno glicol, dióxido de silicone, amido, estearato, ácido esteárico, talco, sódio de estearil fumarato, sódio benzoato e zinco; (i) lubrificantes, tais como cálcio estearato, óleo vegetal hidrogenado, magnésio estearato,óleo mineral, polietileno glicol, sódio estearil fumarato, estearin, ácido esteárico e talco; e (j) preservativos, tais como clorobutanol, ácido citrico, cisteina, metionina, metil paraben, fenol, propil paraben, retinol palmitato, selênio, sódio citrato, ácido sorbico, vitamina A, vitamina C e vitamina E. Cápsulas podem conter qualquer dos excipientes acima, e podem adicionalmente conter um transportador semi-sólido ou liquido, tais como um polietileno glicol ou óleos de base vegetal. Transportadores farmacêuticos incluem polimeros solúveis, micro partículas feitas de insolúvel ou biodegradável natural e polimeros sintéticos, micro cápsulas ou micro esferas, lipoproteinas, liposomas e miceles.
Uma composição farmacêutica pode ser na forma de um liquido, exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão, suspensão, ou outras formas semelhantes ou pode ser apresentada como um produto seco para reconstituição com água ou outros adequados veiculos antes do uso. Preparações liquidas podem conter convencionais aditivos, tais como (a) diluentes líquidos, tais como água, salina, solução Ringer, óleo fixador tais como diglicerideos sintético ou mono, ou polietileno glicóis, glicerina, glicol propileno ou outros solventes; (b) surfactantes, agentes de suspensão ou agentes emulsificantes, tais como sorbitan polioxietileno ésteres de ácido graxo, glicerideos poliglicolizado saturados, monoglicerideos, ésteres de ácido graxo, blocos de copolimeros de óxido de etileno e óxido de propileno, estearatos polioxil, óleo castor etoxilatado, e ácidos hidroxiesteárico etoxilatado; (c) tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; (d) agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminatetraacético; (e) agentes antibacterianos, tais como álcool benzil ou paraben metil; (f) antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; (g) agente isotônico, cloreto de sódio ou dextrose; tanto quanto para um adoçante e agentes de sabores, tinturas e preservativos.
Uma composição farmacêutica da invenção conterá uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto da invenção, como um individual estereoisômero ou mistura de estereoisômero, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, com restante da composição farmacêutica compreendendo de um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Geralmente, para administração oral, um composto da invenção, como um individual estereoisômero ou mistura de estereoisômeros, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes compreenderá de 1% a 99% por peso de uma composição aceitável farmaceuticamente, com o remanescente da composição compreendendo de um ou mais excipientes aceitáveis farmaceuticamente. Tipicamente, um composto da invenção, como um individual estereoisômero ou mistura de estereoisômero, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes compreenderá de 5% a 75% por peso de uma composição aceitável farmaceuticamente, com a remanescente da composição compreendendo de um ou mais excipientes parenteral, um composto da invenção, como urn individual estereoisômero ou mistura de estereoisômeros, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes compreenderá de 0,01% a 1% por peso de uma composição aceitável farmaceuticamente. Métodos para preparar as formas de dosagem da invenção são conhecidos, ou será aparente, para experientes no assunto; para exemplo, ver "Remington's Farmacêutica Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990").
Uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto da invenção variará dependendo de diversos fatores incluindo a atividade, estabilidade metabólica, razão de excreção e duração da ação do composto, a idade, peso, saúde geral, sexo, dieta e espécies do sujeito, o modo e tempo de administração do composto, a presença de adjuvantes ou adicionais ingredientes ativos terapeuticamente em uma composição, e a severidade da doença para qual o efeito terapêutica é procurado.
Os compostos da invenção podem ser administrados para humano sujeitos a niveis de dosagem no intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 10.000 mg por dia. Um humano adulto normal tendo um peso corporal de cerca de 70 kilogramaas pode ser administrado uma dosagem no intervalo de cerca de 0,15 μg a cerca de 150 mg por kilograma de peso corporal por dia. Tipicamente, um humano adulto normal será administrado de cerca de 0,1 mg a cerca de 25 mg, ou 0,5 mg a cerca de 10 mg por kilograma de peso corporal por dia.
Os compostos da invenção podem ser administrados em uma ou mais formas de dose unitária. A dose unitária pode ser administrada de uma a quatro vezes ao dia, ou duas vezes ao dia, ou uma vez ao dia. Em um método alternativo do descrito uma efetiva dose, uma dose unitária oral é uma que é necessária para alcançar um nivel de soro no sangue de cerca de 0,05 a 20 μg/ml ou cerca de 1 a 20 μg/ml em um sujeito. A dose ótima de um composto da invenção para um particular sujeito pode ser determinada por um experiente no assunto.
Compostos da invenção, ou um isômero individual ou mistura de isômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, pode também ser administrado simultaneamente com, antes de, ou depois de administrar um ou mais dos agentes terapêuticos descritos acima. Tais combinações de terapias incluem administração de dosagem única da formulação farmacêutica que contenha um composto da invenção e um ou mais adicionais agentes ativos, como também administração do composto da invenção e cada agente ativo em suas próprias dosagens da formulação farmacêutica separada. Por exemplo, um composto da invenção e um inibidor da redutase HMG-CoA podem ser administrados para o sujeito juntos em uma composição de dosagem oral simples, tais como um tablete ou cápsula, ou cada agente administrado em separado em formulação de dosagem oral. Quando a formulação de dosagem separada é usada, os compostos da invenção e um ou mais adicionais agentes ativos podem ser administrados essencialmente ao mesmo tempo, isto é, concorrentemente, ou a separados estágios de tempo, isto é, sequencialmente; combinação de terapia é entendida para incluir todas destes regimes.
Em uma concretização, os compostos da invenção são usados em combinação com um ou mais dos agentes terapêuticos seguintes em tratamento de ateroscleroses: agentes antihiperlipidêmicos, agentes de aumento de HDL no plasma, agentes antihipercolesterolemia, inibidores de biosintese de colesterol (tal como inibidores de redutase de HMG CoA, tais como lovastatin, simvastatin, pravastatin, fluvastatin, atorvastatin e rivastatin) , acil-coenzima A:colesterol acitransferase (ACAT) inibidores, probucol, raloxifene, ácido nicotinico, niacinamida, inibidores de absorção de colesterol, ácido biliar sequestrantes (tais como resinas de troca de anion, ou aminas quaternárias {exemplo, coleagitaramina ou colestipol)), receptor de indução de lipoproteina de baixa densidade, clofibrate, fenofibrate, benzofibrate, cipofibrate, gemfibrizol, vitamina B&, vitamina Bi2, vitaminas anti-oxidante, bloqueadores β, agentes anti-diabetes, antagonistas angiotensin II, inibidores angiotensin conversor de enzima, inibidores de agregação de platelet, receptor antagonistas de fibrinogen, aspirina ou derivados de ácido fibrico .
Em outra concretização, os compostos da invenção são usados em combinação com um ou mais dos agentes terapêuticos seguintes no tratamento de inibidor de biosintese de colesterol, particularmente um inibidor redutase de HMG- CoA. O termo inibidor redutase HMG-CoA é entendido para incluir todos os sais farmaceuticamente aceitáveis, formas de compostos de éster, ácido livre e lactona que tem atividade inibidora redutase HMG-CoA e, por esta razão, o uso de tais formas de sais, ésteres, ácidos livres e lactona é incluida dentro do escopo desta invenção. Compostos que têm atividade inibidora de redutase para HMG- CoA podem ser facilmente identificados usando ensaios bem conhecidos no assunto. Por exemplo, adequados ensaios são descritos ou revelados na Patente U. S. No. 4,231,938 e WO 84/02131. Exemplos de adequados inibidores redutase HMG-CoA incluem, mas não são limitados para, lovastatin (MEVACOR®; ver, Patente U.S. No. 4,231,938); simvastatin (ZOCOR®; ver, Patente U.S. No. 4,444,784); pravastatin sódio (PRAVACHOL®; ver, Patente U.S. No. 4,346,227); fluvastatin sódio (LESCOL®; ver, Patente U.S. No. 5,354,772); atorvastatin cálcio (LIPITOR®; ver, Patente U.S. No. 5,273,995) e rivastatin (também conhecida como cerivastatin; ver, Patente U.S. No. 5,177,080). A fórmula da estrutura destes adicionais inibidores redutase HMG-CoA que podem ser usados em combinação com os compostos da invenção são descritos na página 87 de "M. Yalpani, "Cholesterol Lowering Drugs," Chemistry & Industry, pp. 85-89 (5 February 1996) . . Em concretizações agora preferidas, o inibidor redutase HMG- CoA é selecionado de lovastatin e simvastatin.
Em uma adicionalmente concretização, os compostos da invenção são usados em combinação com um ou mais dos agentes terapêuticos seguintes em tratamento com um ou mais adicionais agentes ativos de diabete dependendo do alvo desejado da terapia (ver, exemplo, "Turner, N. et al., Prog. Drug Res. (1998), Vol. 51, pp. 33-94; Haffner, S., Diabetes Care (1998), Vol. 21, pp. 160-178; and DeFronzo, R. et al. (eds.), Diabetes Reviews (1997), Vol. 5, No. 4)". Em vários estudos foram investigados os beneficios da combinação de terapias com agentes orais(ver, exemplo, "Mahler, R., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1999), Vol. 84, pp. 1165-71; United Kingdom Prospective Diabetes Study Group: UKPDS 28, Diabetes Care (1998), Vol. 21, pp. 87-92; Bardin, C. W. (ed.), Current Therapy em Endocrinology And Metabolism, 6th Edition (Mosby--Year Book, Inc., St. Louis, Mo. 1997); Chiasson, J. et al., Ann. Intern. Med. (1994), Vol. 121, pp. 928-935; Coniff, R. et al., Clin. Ther. (1997), Vol. 19, pp. 16-26; Coniff, R. et al., Am. J. Med. (1995), Vol. 98, pp. 443-451; Iwamoto, Y. et al., Diabet. Med. (1996), Vol. 13, pp. 365-370; Kwiterovich, P., Am. J. Cardiol (1998), Vol. 82 (12A), pp. 3U-17U)".. Estes estudos indicam que modulação de diabetes e hiperiipidemia pode ser também aumentada pela adição de um segundo agente para o regime terapêutico.
Em uma adicional concretização, os compostos da invenção são usados em combinação com um ou mais dos agentes terapêuticos seguintes no tratamento de diabetes: sulfonilureas (tais como cloropropamida, tolbutamida, acetohexamida, tolazamida, glyburide, gliclazide, glinase, glimepiride, e glipizide) , biguanides (tais como metformain) , tiazolidinediones (tais como ciglitazona, pioglitazona, troglitazona, e rosiglitazona) , e relatadas insulina sensibiizadora, tais como ativatores seletivos e 5 não seletivos de PPARα, PPARβ e PPARy; de hidroepiandrosterona (também referido como DHEA ou seus conjugados sulfato éster, DHEA-SO4); antiglucocorticóides; TNFαD inibidores; α-glucosidase inibidores (tais como acarbose, miglitol, e voglibose), pramlintide (um análogo 10 sintético do hormônio humano amilin), outras insulinas secretogogues (tais como repaglinide, gliquidaone, e nateglinide), insulina, tanto quanto para um agenteterapêutico discutido acima para tratamento de ateroscleroses.
Ainda em outra concretização, os compostos da invenção são usados em combinação com um ou mais dos agentes terapêuticos seguintes no tratamento de obesidade ou desordens relacionada com obesidade. Tais agentes incluem, mas não são limitados para, agentes fenilpropanolamina, 20 fentermine, dietilpropion, mazindol, fenfluramina, dexfenfluramina, fentiramina, βa adrenoceptor agonista;sibutramina, inibidores gastrointestinal lipase (tais como orlistat), e leptins. Outros agentes usados no tratamento de obesidade ou desordens relacionadas com obesidade incluem receptor modulador neuropeptidio Y, enterostatin, colecitokinin, bombesin, amilin, histamina H3, dopamina D2, hormônio estimulante melanocite, fator de liberação corticotrofin, galanin e ácido butirico gamma amino (GABA) .
Sintése
Os compostos da presente invenção podem ser preparados em vários métodos bem conhecidos para experientes no assunto, incluindo, mas não limitados para estes descritos acima, ou através de modificações destes métodos por aplicação de técnicas padrão conhecidas para experientes no assunto de sintése orgânica. Os compostos foram nomeados usando"ChemDraw Ultra 9.0 ou 10.0 (CambridgeSoft)". Os reagentes e materiais de partida são comercialmente disponivel, ou prontamente sintetizados por técnicas bem conhecidas por um experiente no assunto. É entendido que nas descrições seguintes, combinações de substituintes e/ou variações das fórmulas descritas são permissiveis só se tais contribuições resultar em compostos estáveis. A menos que de outra maneira indicado, todos os compostos associados com NMR e/ou dados de espectros de massa foram preparados e o NMR e espectros de massa medidos.
Figure img0010
NaJÍCOj, THF, 70-80 °C; ii. AcOH, tolueno ou TFA, EtOH, 80 °C; (c) R3MgBr, THF ou THF/ CH2C12,, 0°C - temperatura ambiente; (d) K2C03, PdCl2 (dppf) , DME/H20, 80°C.
Em geral, compostos da fórmula (0036) são preparados por primeiro reagir anilina da fórmula (0032) com 2-(fenil)-2- metilpropanenitrila (0031) na presença de trimetilaluminio para dar compostos da fórmula (0033) depois de procedimentos de padrão isolação (Esquema 1) . Em um  subsequente passo, exposição de amidina (0033) para um halo éster, tais como etil a-bromopiruvato, sob condições básicas a temperatura elevada seguido por condições de desidratação, tais como ácido trifluoracético em etanol 5 provendo 177-imidazole da fórmula (0034) depois de procedimentos padrão de isolação. Compostos da fórmula (0034) são então sujeitos para transformação de funcionalidade, tais como de éster para carbinol. Em uma reação de ligação medida por paládio, por exemplo, reações 10 de Suzuki, compostos da fórmula (0035) são então reagidos com (2-fluor-6-(sulfonil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2- dioxaborolan-2-il)fenil)metanol (0017)(ver Esquema 2 abaixo) para fornecer compostos da fórmula (0036) depois de procedimento padrão de isolação.
Figure img0011
a) i. 1,0 M LHMDS em THF; ii. R4SNa, refluxo; b) BH3-THF, 0°C-refluxo; c) mCPBA, CH2C12; d) PdCl2(dppf), bis (pinacolato) diboron, KOAc, DMSO, 80°C. Esquema 2: passo 2a Preparação de ácido 4-bromo-2-fluor-6-(metilthio)benzoic
Figure img0012
Para um frasco de fundo redondo de 500 mL ligado com condensador foi acrescentado ácido 4-bromo-2,6- difluorbenzóico(16, 0 g, 67,5 mmol) e anidro THF (110 mL). O frasco de reação foi resfriado em um banho de gelo antes de adição em conta gotas de 1,0 M litio bis- (trimetilsilil) amida (74 mL, 1,1 equiv) . A suspensão da reação foi agitada à temperatura ambiente por 20 min antes de adição de sódio tiometóxido (5,21 g, 74,2 mmol). A solução da reação foi permitida para agitar em refluxo por 3 horas. A reação foi determinada para ser completada depois de extinta uma aliquota da reação em diluido aquoso HC1 e executar GCMS: encontrada m/z = 265. 267 ions originais. A mistura da reação resfriada foi extinta com H2O e diluida com EtOAc (200 mL) . A mistura da reação foi transferida para um funil separador, e 1,0 N aquoso. HC1 foi acrescentado para dar uma solução de pH = 2-3. A camada de etil acetato foi separada, lavada com salmoura, secadas sobre Na2SO4, e concentrada a vácuo para fornecer 14,6 g (rendimento 81 %) do intermediário ácido 6-fluor-4- bromo-2-metilsulfanil-benzóico como um sólido branco ondulado. XH NMR (400 MHz, CDC13) δ 7,18 (s, 1H) , 7,12 (dd, J = 8 Hz, 1H) , 2,49 (s, 3H); GCMS m/z = 265, 267 [M] + .
Alternativamente, o intermediário ácido 6-fluor-4-bromo-2- metilsulfanil-benzóico foi preparado como segue:
Para um frasco 20L foi carregado dimetil formamida (14,5 L, 10.0 vol), seguido por sódio hidróxido (293,7 g, 1,2 eq) e a massa da reação resfriada para -15 a -10 °C. ácido 4-bromo-2,6-difluorbenzóico (1450 g, 1,0 equiv) foi acrescentado por um periodo de 10-15 minutos a -15 para -10 °C e agitado por um adicional periodo de 10-15 minutos. Sódio tiometóxido (514,6 g, 1,2 equiv) foi acrescentado por 5 um periodo de 5-10 minutos para um -10 a -5 °C. Após completar a adição, a temperatura da reação foi aumentada para 25-28 °C por um periodo de 45 a 60 minutos e mantida nesta temperatura l,5-2h. A temperatura da reação foi então aumentada para 60-65 °C por um periodo de 30-60 minutos e 10 mantida a 60-65 °C por 5h até a reação ser julgada completada. A mistura da reação foi então resfriada para 20-25 °C e extinta com uma solução resfriada (5-10 °C) de 2N HCI (5, 045 L de 12N HCI em 30,3 L água) . Seguido a extinção, etil acetato (14,5 L, 10 vol) foi acrescentado e 15 a mistura agitada por 10-15 minutos. As fases foram separadas e a camada aquosa foi extraida com etil acetato (7,25 L, 5 vol) . As duas fases foram separadas e a camada orgânica combinada foi lavada com uma solução de salmoura (725 g de NaCl em 3,625 L de água) . As fases foram 20 separadas e a camada orgânica foi lavada com água (5,0 vol,7,25 L) . As fases foram separadas e a camada orgânica foi secada sobre o sódio sulfato (1450 g) . A camada orgânica foi filtrada para remover o sulfato de sódio, que foi então lavada com etil acetato (2,9 L, 2 vol) . A camada orgânica 25 foi concentrada sob pressão reduzida a 45-50 °C/ 30-40 mm Hg para aproximadamente 1 a 1.2 volumes e éter de petróleo (7,25 L, 5 vol) foi acrescentado a 40-45 °C por um periodo de 15-20 minuto. A solução foi resfriada para 20-25 °C por um periodo de 20-25 minutos. 0 sólido foi filtrado e 30 lavado com éter de petróleo (2,9 L, 2,.O vol) e o produto secado sob vácuo 25-28 °C, 0,4 a 0,7 mbar para fornecer 1410 g (87%, Área 99.40%) do intermediário ácido 6-fluor-4- bromo-2-metilsulfanil-benzóico. Passo 2bPreparação de (4-bromo-2-fluor-6-(iαetiltio)fenil)methanol
Figure img0013
Dentro de um frasco de fundo redondo ligado com condensador purgado com 500 mL de N2 foi acrescentado ácido 6-fluor-4- bromo-2-metilsulfanil-benzóico (14,6 g, 55,0 mmol) e anidro THF (70 mL) . A solução da reação foi permitida resfriar para 0°C antes da adição em conta gotas de uma solução de 1,0 M BH3-THF (83 mL, 1,5 equiv) em THF. A solução da reação foi agitada à temperatura ambiente então colocada em refluxo por adicionais 2horas. A solução da reação foi resfriada antes de extinta com uma solução de 1:1 H2O/THF. A solução da reação foi transferida para um funil separador com EtOAc (100 mL) e uma solução aquosa de K2CO3 foi acrescentada. A fase de etil acetato foi separada, lavada com salmoura, secadas sobre Na2SO4, e concentrada a vácuo. 0 produto bruto foi cromatografado através de uma coluna de 110g SiO2 usando um solvente e gradiente de 100 % Hx para 55% EtOAc. 0 produto em titulo purificado foi obtido como um sólido ondulado branco (13,7 g, rendimento de 99 %). 2H NMR (400 MHz, CDC13) δ 7,13 (s, 1H) , 7,06 (dd, = 8 Hz, J2 = 2 Hz, 1H) , 4,77 (s, 2H) , 2,51 (s, 3H) , 2,20-2,05 (br s, 1H); GCMS m/z = 251, 253 [M]+.
Alternativamente, o intermediário (4-bromo-2-fluor-6- (metilthio)fenil)metanol foi preparado como segue:
Para um frasco de 20L foi carregado ácido 4-bromo-2-fluor- 6- (metilthio)benzóico (1400 g, 1,0 eq) seguido por THF (14 L, 10 vol) sob nitrogênio. Para esta solução foi acrescentado complexo de borane-dimetil sulfide (802,41 g, 1000 mL) a 25-28°C por um periodo de 30-45 minutos. A aumentada para 60-65 °C por um periodo de 30-45 minutos e a temperatura mantida ate HPLC mostrar menos que 1% de ácido 4-bromo-2-fluor-6- (metilthio)benzóico (aproximadamente 3-4 h) . Quando a reação foi completada a mistura foi resfriada para 10-15°C por um periodo de 30-40 minutos. A reação foi então extinta com metanol (2,1 L, 1,5 vol) por um periodo de 1 a 1^ h a 10-15°C. A massa da reação foi então concentrada sob vácuo a 40-50°C/ 0,4 a 0,7 mbar de 1 a 1,5 volumes. A mistura resultante foi dissolvida em DCM (8,4 L, 6 vol). A camada orgânica foi lavada com uma solução de cloreto de amónia (560 g NH4C1 em 2,8 L água, 2 vol). As fases foram separadas e a camada orgânica foi lavada com 10% NaHCOs solução (2,8 L, 2 vol), solução saturada de salmoura (2,1 L, 1,5 vol) e água (4,2 L, 3 vol) . A camada orgânica foi separada e secada sobre sulfato de sódio (700 g). O sulfato de sódio foi removido por filtração e lavado com DCM (2,8 L, 2 vol) . A camada orgânica foi concentrada sob vácuo a 40-45°C/ 0,4 a 0,7 mbar de 1 a 1,2 vol para fornecer o produto que foi secado sob vácuo a 45-50°C/ 0,4 a 0.7 mbar. O produto em titulo foi obtido com rendimento de 90% (1200 g) com Área de 90,07%. Passo 2c Preparação de (4-bromo-2-fluor-6-(metanosulfonil)fenil)-metanol
Figure img0014
Para um frasco de 500 mL foi acrescentado (4-bromo-2-fluor- 6-(metilthio)fenil)metanol (13,7g, 54,6mmol) e diclorometano (125 mL) anidro. A solução foi resfriada para 0-3°C em um banho de gelo antes da adição da porção de ácido 3-cloroperbenzóico (77% max., Aldrich) (18,8 equiv). A solução da reação foi então permitida para aquecer para temperatura ambiente onde permaneceu por 18 h. A reação foi então concentrada a vácuo para remover diclorometano e o residuo foi lavado dentro de um funil separador com etil acetato e 1M de NaOH aquoso. A camada de etil acetato foi separada, lavada com 1M de NaOH aquoso, secada sobre Na2SO4, e concentrada a vácuo. O residuo foi purificado por cromatografia de luz (Biotage, 65 x 200 mm SiO2 coluna, eluição por gradiente de 100% hexanas para 90% de etil acetato). Apropriadas frações foram combinadas e concentradas a vácuo para fornecer o composto em titulo como um sólido sem cor, semi cristalino, rendimento: 8,lg (52%). XH NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,98 (dd, J = 8 Hz, 1H) , 7,91 (s, 1H), 5,45 (t, J = 8 Hz , 1H) , 4,88 (dd, Ji = 8 Hz , J2 = 2 Hz, 2H) , 3,42 (s, 3H) ; 19F NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ-111.8 ppm; GCMS m/z = 283, 285 [M] + .Passo 2d Preparação de (2-fluor-6-(metilsulfonil)-4-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)methanol
Figure img0015
Para um frasco de fundo redondo de 100 mL, purgado com N2 seco, foi pesado e conduzido (4-bromo-2-fluor-6- (metanosulfonil)fenil)-metanol (1,98 g, 6,99 mmol), bis(pinacolato)diboron (2,13 g 1,2 equiv), dicloro[1,1'- bis(difenilfosfino) ferrocene]paládio (II) diclorometano (560 mg, 10 mol%), potássio carbonato (2,06 g, 3 equiv), e DMSO (25 mL) . A suspensão resultante foi permitida para agitar a 90 °C por 3 h. Uma aliquota da solução da reação foi encontrada para não conter mais bromida de partida como determinada por análise de LCMS. A suspensão da reação resfriada foi diluida com etil acetato (50 mL) e água (50 mL) e filtrada através de filtro "Celite Buchner Funnel". O filtrado resultante foi transferido para um funil separador, e a fase orgânica foi separada. A fase aquosa foi extraida com etil acetato, e as fases de combinado de etil acetato foram lavadas com salmoura, secadas sobre Na2SO4, e concentradas a vácuo. O residue foi purificado por silica gel na cromatografia de luz (Biotage SP-1, 40g SiO2 coluna, eluição por gradiente de 100% hexanos para 60% etil acetato) para fornecer um óleo claro e viscoso. O produto foi isolado como um pó amorfo branco para dissolver em diclorometano e a reprecipitação resultou em adição de hexanos. O composto em titulo foi isolado como um pó banco sólido, rendimento: 1,9 g (rendimento 82%). XH NMR (400 MHz, CDC13) δ 8,28 (s, 1H), 7,79 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,03 (d, J = 8 Hz, 2H) , 3,23 (s, 3H) 3,05 (t, J= 8 Hz, 1H) , 1,35 (s, 6H) ; 19F NMR (400 MHz, CDCI3) δ -116.3 ppm.
Alternativamente, o intermediário (2-fluor-6-(metilsulfonil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-l, 3,2-dioxaborolan-2- il)fenil)metanol foi preparado como segue:
Para um reator de sobrecarga de 500 mL equipado com um agitador de barra, sonda de temperatura, condensador de refluxo e uma entrada de nitrogênio foi carregado com metil tetrahidroran (MeTHF) (75 mL, 5 volumes) seguido por potássio acetato (5,2 g, 52,98 mmoles, 1 equiv.) e (oxidi- 2,1-fenilene)bis(difenilfosfine) (322 mg; 597,3 μmoles,0,01125 equiv.) e bis(pinacolato)diboron (17.51 g, 68.95 mmoles, 1.3 equiv.) . O frasco de reação foi evacuado para menos que 150 Torr, e então preenchido outra vez com nitrogênio. Este procedimento de desgaseificação foi repetido 3 vezes. Pd(0Ac)2 (94,2 mg; 419,6 μmoles, 0,0075 equiv.) foi carregado para o reator e o frasco da reação foi evacuado para menos que 150 Torr, e então preenchido outra vez com nitrogênio e a sequencia repetida 3 vezes. A massa resultante foi permitida para envelhecer a 20-25°C por 15 minutos. Depois de completado os 15 minutos de envelhecimento, a mistura foi aquecida para uma temperatura interna de 80°C. Como a mistura no reator foi aquecida para temperatura, em um frasco separado foi carregado (4-bromo- 2-fluor-6-(metanosulfonil)fenil)-metanol (15,03 g, 53,09 mmoles, 1 equiv.) seguido por MeTHF (75 ml, 5 volumes). A solução resultante foi degasificada por subsuperfície de nitrogênio borbulhante por pelo menos 15 minutos antes do uso. Uma vez que a misturade catalisador alcançou refluxo, a solução degasificada de 4-bromo-2-fluor-6- (metanosulfonil)fenil)-metanol em MeTHF foi acrescentada para a reação em uma porção simples e permitida reagir. A reação tipicamente levou aproxidamente 20 horas para completar depois da adição de substrato. Após completar tipicamente menos que 0,75 RAP de material de partida da reação foi resfriado para 20-25°C. Uma vez na temperatura ambiente a reação foi diluida com MeTHF (75 ml, 5 volumes) e lavada com uma solução de 5% de peso de NaCl (7,5 volumes, 110 ml) por pelo menos 15 minutoa. As fases foram separadas e o produto superior rico em fluxo de MeTHF foi filtrado através de Celite para remover residues de paládio insolúvel. O bolo do Celite foi lavado com MeTHF (75 ml, 5 volumes). A reação foi tratada com silica de funcionalidade (30 equiv) para remover paládio e cor. A massa foi agitada por pelo menos 60 minutos e então filtrada para remover a silica. A silica usada foi lavada com MeTHF (5 volumes, 75 ml) . O combinado da fase orgânica foi lavado com água (5 volumes, 75 ml) . A orgânica foi destilada para 5 volumes (75 ml) sob vácuo (60-70 Torr, temperatura de banho de 30 °C) . Quando o marco de 75 ml foi reagido a destilaçãofoi parada e heptano (75 ml, 5 volumes) foi acrescentado em conta gota para a solução da reação. Depois de aproximadamente 35 ml de heptanos ser acrescentado o produto começou a cristalizar da solução. Após completar a adição o produto foi isolado por filtração e a massa molhada lavada com solução de MeTHF-heptanos (1:9) (2 x 75 ml) e secada a 50°C. 0 produto em titulo foi obtido um sólido branco, 13,64 g, (rendimento de 78%) com Área de 99,58%.
Exemplo 1 2- (1- (3-cloro-3 ' -f luor-4 ' - (hidroximetil) -5 ' - (metilsulfonil) bifenil-4-il) -2- (2- (2-fluor fenil) propan-2-il) -lH-imidazol-4-il)propan-2-ol
Figure img0016
Exemplo la Preparação de 2-(2-fluorfenil)-2-metilpropanenitrila
Figure img0017
Para um frasco de fundo redondo de 3 gargalos de 500 mL com um funil adicional ligado que foi purgado com N2 secado, foi acrescentado 2-fluorfenilacetonitrila (11,0 g, 81,4 mmol) e anidro THF (70 mL) . A solução da reação foi resfriada para -10°C antes da adição em conta gotas de uma solução 1,0 M de potássio tert-butóxido (195 mL, 2,4 molar equiv) em THF. A solução da reação foi agitada a -10°C por 20 minutos antes da adição de iodometano (15,2 mL, 244 mmol). A solução da reação foi permitida para agitar aquecendo para temperatura ambiente por 4 horas. A solução da reação foi extinta por adição de NH4C1 aquoso e diluida com EtOAc (200 mL) . A fase orgânica foi dividida, lavada com NH4CI aquoso, secada sobre Na2SO4, filtrada, concentrada a vácuo e cromatografada através de uma coluna de 240 g SiO2 sobre o Biotage SP-1, usando um gradientee de solvente de 100% Hx para 50 % EtOAc para fornecer 10,1 g (rendimento de 76 %) do produto em titulo. GCMS m/z = 163 [M] + .
Exemplo lb Preparação o f N-(4-bromofeníl)-2-(2-fluorfenil)-2- metilpropanimidamida
Figure img0018
Para um forno secado, frasco de fundo redondo de 250 mL purgado de N2 ligado com funil adicinal foi acrescentado 4- bromoanilina (7,31 g, 42,5 mmol) e anidro tolueno (40 mL) . Para a solução da reação a 0°C foi acrescentado uma solução de 2,0 M de Me3Al (32 mL, 1,5 molar equiv) . A solução da reação foi agitada a 0°C por 30 min, então uma solução de 2-(2-fluorfenil)-2-metilpropanenitrila (7,62 g, 46,7 mmol) em tolueno (25 mL) foi acrescentada para o frasco da reação. A solução da reação foi permitida para ser agitada a 90°C por 5 horas. A solução resfriada da reação foi extinta com uma solução aquosa de sódio potássio tartrato. Depois de 20 minutos parada, a fase orgânica foi particionada e lavada com solução de sódio potássio tartrato. A solução orgânica foi extraida com 1N aquoso HCI (100 mL x 3) . A combinação aquosa da solução de HCI foi neutralizada por adição de IN aquoso NaOH e extraida com diclorometano (200 mL x 2) . A solução de produto de diclorometano foi secada sobre Na2SO4, filtrada, e concentrada a vácuo para fornecer o composto em titulo (5,5 g, rendimento de 39%). GCMS m/z = 334, 336 [M] + .
Exemplo lc Preparação de etil l-(4-bromofenil)-2-(2-(2- fluorfenil) propan-2-il)-1H-imidazole-4-carboxila to
Figure img0019
Para um frasco de fundo redondo de 250 mL, purgado com N2 secado e ligado com funil adicional, fundo redondo de 250 mL ligado com condensador foi acrescentado N-(4-bromofenil)-2-(2- fluorfenil)-2-metilpropanimidamida (5,0 g, 15 mmol), anidro THF (80 mL) , NaHCO3 (2,52 g, 30 mmol), e 90% etil bromopiruvato (1,90 mL, 15,1 mmol). A mistura da reação foi agitada a 70°C por 2 horas antes da análise por LCMS. A mistura da reação resfriada foi decantada e concentrada a vácuo. O residuo foi colocado em tolueno (65 mL) e ácido acético (1,8 mL) . A solução foi agitada a refluxo por 1 hora. A solução resfriada foi lavada com H20 (150 mL x 3), secada sobre Na2SO4, filtrada, concentrada a vácuo, e cromatografada através de uma coluna de SÍO2, usando um gradiente 100% Hx a 70% EtOAc para fornecer o composto do titulo purificado (4,3 g, rendimento de 67%). LCMS (ES): m/z = 431,3, 433,3 [M+H] + .
Exemplo Id Preparação de 2- (1- (4-bromofenil) -2- (2- (2-fluorfenil)propan-2-il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol
Figure img0020
Para um frasco de fundo redondo de 250 mL, purgado com N2 secado e ligado com funil adicional, foi acrescentado uma solução 3,0M MeMgBr (12 mL, 3,7 equiv) em Et2O. 0 frasco foi resfriado para 0°C antes da adição em conta gotas de etil 1-(4-bromofenil)-2-(2-(2-fluorfenil)propan-2-il)-1H- imidazole-4-carboxilato (4,22 g, 9,78 mmol) em uma solução de anidro diclorometano (80 mL) . A solução da reação foi permitida para ser agitada, aquecida para temperatura ambiente por 1 hora. A solução da reação foi extinta por adição de NH4C1 aquoso. A mistura foi derramada para um funil separador e a camada de diclorometano foi particionada, secada sobre Na2SO4, filtrada, concentrada e cromatografada através de uma coluna a 40 g SiO2 usando um gradiente de 100% Hx para 70% EtOAc para rendimento do composto em titulo (3,19 g, rendimento de 78%) . LCMS (ES) : m/z = 417.3, 419.3 [M+H]+.
Exemplo 1 Preparação de 2-(l-(3’-fluor-4'-(hidroximetil)-5'- (metilsulfonil)bifenil-4-il) -2- (2 - (2-fluorfenil)propan-2- il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol
Figure img0021
Para um frasco de fundo redondo de 50 mL foi acrescentado 2-(1-(4-bromofenil)-2-(2-(2-fluorfenil)propan-2-il)-1H- imidazol-4-il)propan-2-ol (380 mg, 911 δmol), DME (25 mL) e H20 (6 mL) . A solução foi borgulhada com N2 por 10 min antes da adição de (2-fluor-6-(metilsulfonil)-4-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)metanol (360 mg, 1,09 mmol), carbonato de potássio (380 mg, 2,73 mmol), e dicloro[1,1'-bis (difenilfosfino)ferrocene]paládio (II) aduzido diclorometano (74 mg, 91 δmol). A mistura da reação foi permitida para agitar a 80 °C por 2h. A solução resfriada da reação foi diluida com EtOAc (30 mL) e filtrada através de filtro Celite "Buchner funnel". O filtrado foi lavado com NH4CI aguoso (150 mL x 2) . A fase orgânica foi secada sobre Na2SO4, filtrada, e concentrada a vácuo. O residuo foi purificado por cromatografia de luz de silica gel (Biotage SP-1, 25 g SiO2 coluna, eluição para gradiente de 5% EtOAc para 100% EtOAc) para fornecer o composto do titulo(100 mg, rendimento de 20 %). 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,02 (d, J = 2 Hz, 1H) , 7,51 (dd, = 2 Hz, J2 = 10 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 9 2H) , 7,08-7,16 (mult, 1H), 6,85-6,92 (mult, 3H), 6,77-6,84 (mult, 2H), 6,65 (s, 1H) , 5,09 (d, J = 6 Hz, 2H) , 3,35 (s, 1H) , 3,30 (2, 3H) , 3,02 (t, J = 6 Hz, 1H) , 1,72 (s, 6H) , 1,62 (s, 6H) ; 19F NMR (400 MHz, CDCI3) δ -112,1, -113,5 ppm; LCMS (ES) m/z =541,3 [M+H]+, 563,2 [M+Na]+.
Exemplos 2-8
Todos os compostos seguintes foram feitos de maneira similar para os descritos no Exemplo 1 usando apropriadas anilinas e 2-(fenil)-2-metilpropanenitrilas. Se não comercialmente disponíveis, nitrilas foram feitas usando técnicas padrão que são prontamente aparentes para um experiente no assunto.
Figure img0022
Figure img0023
Figure img0024
Composto 2 possui as seguintes NMR caracteristicas: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,02 (s, 1H) , 7,56 - 7,49 (m, 1H) , 7,35 (d, J = 2,0, 1H), 7,12 - 6,96 (m, 3H) , 6,68 (d, J = 8,2, 1H) , 6, 66 - 6,60 (m, 1H) , 6,56 (s, 1H) , 5,08 (d, J= 5,4, 2H) , 3,36 (s, 1H) , 3,29 (s, 3H) , 2,92 (t, J = 7,0, 1H) , 2,07 (s, 3H), 1,97 (d, J= 2,4, 3H), 1,72 (d, J= 7,4, 3H), 1,59 (s, 6H) .
Composto 3 possui as seguintes NMR caracteristicas: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,00 (m, 1H) , 7,57 (d, J = 2,1, 1H) , 7,55 - 7,49 (m, 1H) , 7,13 (s, 1H) , 7,11 (s, 1H) , 7,07 (dd, J = 8,3, 2,1, 1H), 7,01 - 6,95 (m, 1H) , 6,81 (d, J = 8,3, 1H) , 6,59 (s, 1H) , 5,09 (d, J = 5,4, 2H) , 3,30 (s, 3H) , 3,26 (m, 1H), 2,89 (t, J = 7,0, 1H) , 2,06 (s, 3H) , 1,92 (s, 3H), 1,61 (s, 3H), 1,59 (s, 3H).
Composto 4 possui as seguintes NMR caracteristicas: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7,97 (s, 1H) , 7,47 (dd, J = 10,0, 1,8,1H) , 7,31 - 7,20 (m, 2H) , 7,00 (d, J = 8,3, 2H) , 6,92 - 6,71 (m, 3H) , 6,65 (s, 1H) , 5,08 (dd, J = 7,0, 1,6, 2H) , 3,29 (s, 3H), 3,27 (s, 1H), 2,90 (t, J= 7,0, 1H), 1,82 (s, 6H) , 1, 60 (s, 6H) .
Composto 5 possui as seguintes NMR caracteristicas: 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,89-7,90 (mult, 1H), 7,82-7,85 (mult, 1H) , 7,52 (d, J = 8,6 Hz,2H), 7,16 (d, J = 8,6 Hz 2H) , 7,07-7,09 (mult, 2H), 6, 94-6, 98 (mult, 1H), 6,80 (s, 1H) , 5,55 (t, J= 5,2 Hz, 1H) , 4,93-4,95 (mult, 2H) , 4,65 (s, 1H), 3,45 (s, 3H), 1,96 (s, 6H), 1,45 (s, 6H).
Composto 6 possui as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7,97 (s, 1H) , 7,46 (dd, J = 9,9, 1,8, 1H), 7,23 - 7,18 (m, 1H) , 7,12 (dd, J = 10,3, 1,9, 1H) , 6,97 (ddd, J = 23,4, 9,0, 4,0, 2H) , 6, 88 - 6, 79 (m, 2H) , 6,61 (s, 1H) , 5,08 (d, J= 5,4, 2H) , 3,30 (s, 3H) , 3,27 - 3,23 (m, 1H) , 2,92 (t, J= 6,9, 1H) , 1,61 (s, 12H) .
Composto 7 possui as seguintes NMR características: 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,95-7,90 (m, 2H), 7,62 (dd, 1H, J= 11, 1,5 Hz), 7,33 (dd, 1H, J= 9,5, 1,5 Hz), 7,13-7,08 (m, 3H), 6,85 (s, 1H), 6,80-6,70 (m, 1H) , 5,57 (t, 1H, J = 5,3 Hz), 4,95 (d, 2H, J= 4,3 Hz), 4,71 (s, 1H) , 3,47 (s, 3H), 1,85 (s, 6H), 1,46 (s, 6H).
Composto 8 possui as seguintes NMR características: 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,96-7,90 (m, 2H) , 7,49 (dd, 1H, J = 11, 1,5 Hz), 7,34 (dd, 1H, J = 9,5, 1,5 Hz), 7,20-7,10 (m, 1H), 7,05-6,94 (m, 2H), 6,90-6,75 (m, 3H), 5,57 (t, 1H, <7 = 5,3 Hz), 4,94 (d, 2H, J= 4,3 Hz), 4,70 (s, 1H), 3,47 (s, 3H) , 1,68 (s, 6H), 1,47 (s, 6H) .
Exemplo 9 2- (2- (2- (2, 6-diclorofenil)propan-2-il) -1- (3,3 ' -di fluor-4 ' - (hidroximetil)-5’ -(metilsulfonil)bifenil-4-il)-IH-imidazol-
Figure img0025
Exemplo 9a Preparação de 2-(2,6-diclorofenil)-2- metilpropanenitrila
Figure img0026
Para uma solução de 1 M de potássio tert-butóxido (403 mL, 403 mmol) a -66 °C (acetona / gelo seco) foi lentamente acrescentado 2-(2,6-diclorofenil)acetonitrila (25,0 g, 134 mmol) em anidro THF (150 mL). A mistura foi agitada a -66°C por 20 minutos. Então, iodometano (33,6 mL, 538 mmol) foi acrescentado a conta gota por um periodo 25 minutos a - 66 °C. Neste estágio, foi exotérmica e uma grande quantidade de luz amarela precipitada foi observada. A suspensão foi agitada a -60 °C por 30 minutos. A mistura da reação foi extinta com 200 mL água gelada, e extraida com éter (3 x 150 mL) . As orgânicas foram combinadas, lavada com 150 mL de salmoura, secada sobre Na2SC>4, e concentrada com um evaporador rotativo. O produto bruto (30 g, óleo amarelo) foi purificado por cromatografia de coluna (ISCO, 330 g silica, 20% EtOAc em hexanos) para fornecer 2-(2,6- diclorofenil)-2-metilpropanenitrila (28,2 g, 132 mmol, rendimento de 98%) como um óleo de luz amarelada. 1H-NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7,35 (d, 2H, J= 8,03 Hz ), 7,16 (t, 1H, J= 8,0 Hz), 2,09 (s, 6H) ; 13C-NMR (CDC13, 126 MHz) δ 134,6, 133,8, 131,4, 129,0, 124,1, 38,6, 29,2; MS m/e 214,10 (M+H+) ; HPLC (XBridge 5μ C18 4,6x50 mm, 4 mL/min, Solvente A: 10 % MeOH/água com 0,2% H3PO4, Solvente B: 90% MeOH/água com 0,2% H3PO4, gradientee com 0-100 % B por um periodo de 4 minutos): 3,16 minutos.
Exemplo 9b Preparação o f N-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2, 6- diclorofenil)-2-metilpropanimidamida
Figure img0027
2-(2,6-Diclorofenil)-2-metilpropanenitrila (20 g, 93 mmol) e 4-bromo-2-fluoranilina (28,4g, 149 mmol) foram dissolvidos em anidro o-xileno (200 mL) e aquecido para 100°C sob N2. Trimetilaluminio (2 M) em tolueno (140 mL, 280 mmol) foi acrescentado a conta gota (aproximadamente 0,9 mL por minuto)por mais de 2,5 horas enquanto um mistura da reação foi agitada a 100°C. Depois da adição, a mistura da reação foi agitada a 100°C por 30 minutos, e então resfriada para -5°C. A mistura da reação foi muito cuidadosamente extinta com potássio de sódio tartrate (20g em 100 mL água) (Cuidado: formação de gás e calor) . A mistura da reação foi filtrada através de Celite 545. O filtrado foi lavada com IN HC1 (4 X 70 mL) . A aquosa foi neutralizada com 2N NaOH e extraida com EtOAc (4 X 100 mL). As orgânicas foram combinadas, lavada com salmoura, secada com Na2SO4, e concentrada com um evaporador rotativo para fornecer 24 g de produto bruto. O produto bruto foi recristalizado com 72 mL de MTBE e 240 mL de hexano para dar N-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2, 6-diclorofenil)-2-metilpropanimidamida (17,5 g, 43,3 mmol, 46,4% rendimento) como um sólido branco (pureza: 99%) . 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7,42 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,30 (m, 2H), 7,16 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 6,93 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 2,11 (s, 6H) ; 13C- NMR (DMSO-dg, 100 MHz) δ 166, 5, 156,1, 153,7, 140,6, 138,5, 135,9, 131,4, 128,6, 128,0, 125,7, 119,5, 112,9, 50,0, 29,2; MS m/e 403,09 (M+H+) ; HPLC (XBridge 5μ C18 4,6x50 mm, 4 mL/min, Solvente A: 10 % MeOH/água com 0,2 % H3PO4, Solvente B: 90 % MeOH/água com 0,2 % H3PO4, gradiente com 0-100% B no periodo de 4 minutos): 2,32 minutos.
Exemplo 9c Preparação de etil 1-(4-bromo-2-fluorfenil) -2- (2- (2,6-diclorofenil)propan-2-il)-4-hidroxi-4,5-dihidro-lH-
Figure img0028
Para uma mistura de N-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2,6- diclorofenil)-2-metilpropanimidamida (48.0 g, 119 mmol), K2CO3 (41.0 g, 297 mmol) em tolueno (180 mL) e THF (180 mL)a 55 °C foi acrescentado lentamente uma solução de etil 3- bromo-2-oxopropanoato (23,3 mL, 166 mmol) em 24 mL de THF por 50 minutos. A mistura da reação foi colocada a 55 °C por 1,5 horas. Uma mistura branca foi observada. A mistura da reação foi resfriada para 5°C. HCI (0,5N, 450 mL) foi acrescentado a conta gota (ponto final pH = 9~10) . Depois da adição, a suspensão foi resfriada para 0°C. O sólido foi coletado por filtração, lavado com água (2 x 50 mL) , e então secada em um vácuo de forno a 60°C no periodo da noite. Etil 1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-4-hidroxi-4,5-dihidro-lH- imidazole-4-carboxilato (59 g, 114 mmol, rendimento de 96%) foi obtido como um sólido branco. 1H-NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7,11 (m, 3H) , 6,96 (m, 2H) , 6,72 (t, 1H, J = 8,28 Hz), 4,35 (m, 2H) , 4,25 (d, 1H, J= 10,5 Hz), 3,80 (d, 1H, J = 10,8 Hz), 1,98 (s, 3H) , 1,93 (s, 3H) , 1,38 (t, 3H, J= 7,03 Hz); 13C-NMR (CDCI3, 126 MHZ) δ 173, 0, 171,5, 159,8, 157,8, 137,3, 135,7, 132,1, 131,1, 128,1, 127,4, 125,6, 122,2, 120, 1, 93, 5, 62, 5, 45, 5, 30,2, 14,0; MS m/e 517,05 (M+H+) ; HPLC (XBridge 5μ C18 4,6x50 mm, 4 mL/min, Solvente A: 10 % MeOH/água com 0,2% H3PO4, Solvente B: 90 % MeOH/água com 0,2% H3PO4, gradiente com 0-100% B por periodo de 4 minutos): 2,74 minutos.
Exemplo 9d Preparação de etil 1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2-(2, 6- diclorofenil)propan-2-il)-1H-imidazole-4-carboxila to
Figure img0029
Para uma mistura de etil 1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2- (2,6-diclorofenil)propan-2-i1)-4-hidroxi-4,5-dihidro-lH- imidazole-4-carboxilato (38 g, 73 mmol) em EtOH (200 mL) foi acrescentado TEA (25,0g, 220 mmol) . A mistura foi subsequentemente aquecida para 95°C. Análise de HPLC depois de 2,5 horas mostrou menos que 1% de álcool intermediário remanescente. A mistura foi diluida com 300 mL de CH2CI2 e resfriada para aproximadamente 5°C com um banho de gelo. A mistura foi neutralizada com IN NaOH (120 mL) e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraida com CH2CI2 (2 x 100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram concentradas em um evaporador rotativo para dar material bruto. Recristalização em EtOH (5 mL / 1 g) proveu 32 g de etil 1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-lH-imidazole-4-carboxilato como um sólido sem branco (rendimento de 86%). 1H-NMR (DMSO-dg, 400 MHz) δ 7,92 (s, 1H) , 7,16 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,22 (m, = 8,0 Hz), 1,94 (s, 6H), 1,27 (t, 3H, J = 8,0 Hz); MS m/e 502,68 (M+H+) ; HPLC (XBridge 5μ C18 4,6x50 mm, 4 mL/min, Solvente A: 10 % MeOH/água com 0,2% H3PO4, Solvente B: 90% MeOH/água com 0,2 % H3PO4, gradiente com 0-100% B mais de 4 minutos): 3,87 minutos.
Exemplo 9e Preparação de 2- (1-(4-bromo-2-fluorfenil) -2- (2- (2,6- diclorofenil)propan-2-il) -IH-imidazol-4-il)propan-2-ol
Figure img0030
Para uma mistura de metilmagnésio bromoda (60,0 mL, 180 mmol, 3M em éter) em 120 mL de THF resfriada com um banho de gelo/sal (-15 a -17°C) foi acrescentado lentamente uma solução de etil 1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2-(2,6- diclorofenil)propan-2-il)-lH-imidazole-4-carboxilato (30 g, 60 mmol) em 65 mL de CH2CI2 e 87 mL de THF mais de 45 minutos. A temperatura interna foi cuidadosamente colocada abaixo de 0°C. Um adicional 2 X 20 mL de CH2CI2 foi usado para levar adiante o material residual. A temperatura da mistura da reação foi mantida abaixo de 0°C a 1 hora com agitarring. Então a mistura da reação foi diluida com 100 mL de CH2CI2, e NH4C1 saturado foi acrescentado lentamente. A mistura resultante foi extraida com CH2CI2 (2 X 80 mL) . Orgânicas foram combinadas, lavada com salmoura, secada com Na2SO4, e concentrada em um evaporador rotativo para fornecer 2-(1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2 - (2,6- diclorofenil)propan-2-il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol (28.5 g, 58.6 mmol, rendimento de 98%) como um sólido branco. XH-NMR (CDC13, 400 MHz) δ 7.13 (dd, 1H, J = 9,03, 2,01 Hz), 7,09 (s, 1H), 7,07 (s, 1H) , 6,93 (m, 2H) , 6,75 (t, 1H, J= 8,16 Hz ), 6,55 (s, 1H),'3,18 (s, 1H), 2,00 (s, 6H) , 1,58 (s, 6H) ; 13C-NMR (CDC13, 126 MHz) δ 158,1, 156, 1, 154,5, 147,8, 139,3, 135,7, 131,3, 130,3, 127,8, 126,9, 122,7, 119,8, 115,1, 68,7, 44,8, 31,1, 29,9; MS m/e 485,05 (M+H+) ; HPLC (XBridge 5μ C18 4, 6x50 mm, 4 mL/min, Solvente A: 10 % MeOH/água com 0,2 % H3PO4, Solvente B: 90 % MeOH/água com 0,2 % H3PO4, gradiente com 0-100 % Bpor mais de 4 minutos): 2,78 minutos.
Exemplo 9 Preparação de 2-(2-(2-(2, 6-diclorofenil)propan-2-il)-1- (3,3 '-difluor-4 ’ - (hidroximetil) -5 ' - (metilsulf onil) bif enil- 4-il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol
Figure img0031
Para um frasco de fundo redondo com 3 gargalos de 1 L sob nitrogênio foi acrescentado 2-(1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2- (2 - (2,6-diclorofenil)propan-2-il)-lH-imidazol-4-il)propan- 2-ol (12,0g, 24,7 mmol), [2-fluor-6-metanosulfonil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenil]- metanol (9,78 g, 29,6 mmol), K2CO3 (10,2 g, 74 mmol), DME (120 mL) e água (12 mL). A mistura foi aquecida para 60°C, e então 1,1'-bis(difenilfosfino)ferrocene paládio (II) complexo clorido (4,06 g, 4,94 mmol) foi acrescentado sob nitrogênio. A mistura da reação foi aquecida 80°C por 30 minutos. A resultante mistura de cor escura foi resfriada com um banho de gelo, e particionada em 200 mL de CH2ci2 e 200 mL de água. As camadas orgânicas foram combinadas e secas com Na2SO4. Depois da concentração, o produto bruto foi purificado por cromatografia de luz (ISCO, 330g silica, 0% para 100% EtOAc em hexanos) para fornecer 12,79 g de produto bruto (rendimento de 85%) como um sólida amarelo luminoso.
Recristalização foi conduzida por dissolver 9,5 g de produto bruto em acetona (80 mL) a 65°C. A solução resultante foi resfriada lentamente para 25°C por mais de 5 horas, e então resfriada para 0°C por adicionais 30 minutos. Cristais começaram a se formar a 45°C. O sólido foi coletado por filtração e enxaguado com acetona fria. Depois de secada em um forno a 4 5 °C sob vácuo por 14 horas, 4,9 g de produto puro foi obtido. Para recuperar adicional produto cristalino, o liquido original foi concentrado para aproximadamente 10 mL e passado através de um bloco de silica. EtOAc (100 mL) foi usado para eludir o composto. O filtrado foi concentrado sob vácuo para dar um sólido bruto. 0 sólido bruto foi recristalizado em acetona seguindo o procedimento a cima para fornecer um adicional 2,5 g de produto. 0 combinado recuperado para dois cultivos depois de recristalização deu um rendimento de 78%. 1H-NMR (DMSO-dí, 400 MHz) δ 7,94 (m, 2H) , 7,63 (dd, 1H, J = 11,29, 1,51 Hz), 7,34 (d, 1H, J = 9,54 Hz), 7,14 (m, 3H), 7,05 (m, 1H), 6,83 (s, 1H), 5,58 (t, 2H, J= 5,27 Hz), 4,96 (d, 2H, J= 4,27 Hz), 4,70(s, 1H), 3,46 (s, 3H), 1,96 (s, 6H) , 1,45 (s, 6H) ; MS m/e 609,16 (M+H+) ; HPLC (XBridge 5μ C18 4, 6x50 mm, 4 mL/min, Solvente A: 10 % MeOH/água com 0,2 % H3PO4, Solvente B: 90 % MeOH/água com 0,2 % H3PO4, gradiente com 0-100 % B a cima de 4 minutos) : 2,56 minutos.
Alternativamente, Exemplo 9 foi preparado como segue:
Para um frasco de fundo redondo de 3 gargalos 1 L sob nitrogênio foi acrescentado metiltetrahidrofuran ("MeTHF", 6,9 kg), 2-(1-('4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2-(2, 6-diclorofenil)propan-2-il)-lH-imidazol-4-il)propan-2-ol (1,994 kg, 4,1 moles) e (2-fluor-6-(metilsulfonil)-4- (4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)metanol (1,38 kg, 4,19 moles). A mistura foi agitada a 23 °C por 15 min até gue os sólidos se dissolveram. Na conclusão do periodo, (oxidi-2,1-fenilene)bis(difenilphosphine) (0,022 kg, 0,041 moles) e Pd(OAc)2 (0,01 kg, 0,045 moles) foram acrescentados como uma mistura via uma linha de sub surperficie. Até completar a adição, a mistura foienxaguada com adicional MeTHF (1,65 kg). A mistura resultante foi evacuada para menos que 80 Torr e preenchida outra vez com nitrogênio. Este processo foi repetido mais duas vezes. Depois de completada a sequência de gaseificação, a mistura da reação foi agitada por pelo menos 15 min e uma cor dourada clara foi observada. Em um vaso de reação separado, uma solução de hidróxido de potássio (0,352 kg) em água (10,00 kg) foi preparada e desgaseifiçada para evitar a solução com gás de nitrogênio por pelo menos 15 minuto antes do uso. A solução KOH (10,35 kg) foi transferida para dentro do reator por vácuo. A temperatura da reação exibiu uma conhecida exotermia de 20°C para 29°C. Até completar a adição, a mistura bifásica resultante foi desgaseifiçada por uma série de variações de pressão. A mistura foi aquecida para entre 45-50°C onde foi agitada por pelo menos 2 h. Depois deste tempo, a mistura da reação foi analisada por HPLC, que indicou que a reação foi completada. A mistura da reação foi resfriada para 23°C e agitada foi parada. A mistura foi permitida para separar por 30 minutos e a baixa velocidade o espalhamento KOH foi removido. O produto orgânico rico foi passado através de uma coluna de tiourea funcionalizada silica gel (0,782 kg)  (Siliciclo) aproximadamenbte 0,1 kg por minuto para remover o paládio. O produto da fase orgânica rica foi lavada com uma solução de 5% NaHCOβ (5 vol) e a fases separadas. A fase orgânica foi lavada com água (5 vol) e as fases orgânicas e aquosas separadas.
O produto da fase orgânica rica foi polido filtrado em um vaso de reação limpo e então concentrada para aproximadamente 8 volumes (aproximadamente 16 L) sob vácuo (80 Torr, Tjacket = 60°C) . Uma vez no volume prescrito, a mistura da reação foi permitida para resfriar para 25°C. Uma vez na temperatura prescrita a mistura da reação foi vertida com 2-(2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1-(3,3’- difluor-4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4-il)- lH-imidazol-4-il)propan-2-ol (0,5%, 0,008 kg). A massa resultante foi agitada a 25°C por cerca de 18 h. Na conclusão deste periodo, a mistura da reação foi concentrada para aproximadamente 8 L sob vácuo (150 Torr, Tjacket = 60 °C) . Uma vez no volume prescrito, a mistura da reação foi aquecida para 50°C e isopropil acetato (IPAc, 13,90 kg) foi acrescentado para o reator durante um periodo 90 min. Quando coletada a adição, a mistura da reação foi resfriada para 25°C durante um periodo de 3h. Uma vez na temperatura prescrita a mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente por cerca de 16 h. Na conclusão deste periodo, a mistura da reação foi filtrada, tornada licor, e lavada com adicional IPAc (10,4 kg) . A massa filtrada foi secada via sucção sobre o filtro sob uma corrente de nitrogênio secado para rendimento de um sólido branco. O sólido branco foi transferido para um secador e secado a 50°C sob vácuo completo para fornecer 2,03 kg de produto (rendimento de 81%, 99,40 AP, 98% do peso).
Exemplo 10 2- (2- (2- (2, 6-diclorofenil)propan-2-il) -1- (3,3 ' -di fluor-4 ' - (hidroximetil) -5 ’- (metilsulfonil)bifenil-4-il) -IH-imidazol- 4-il) [ (13CD3) 2]propan-2-ol
Figure img0032
Preparação de 2-(1~ (4-bromo-2-f luorfenil) -2- (2- (2, 6- diclorofenil)propan-2-il) -lH-imidazol-4-il [ (13CD3) 2] propan- 2-01
Figure img0033
Magnésio secado no forno (86 mg, 3,52 mmol) e anidro dietil éter (3,20 mL) foram transferidos para um forno secado 25 mL 14/20 frasco de fundo redondo sob argon. [13CD3]-lodometano (467 mg, 3,20 mmol) foi acrescentado à temperatura ambiente e agitada a 33 °C por 1 hora. Sinais visiveis indicaram que o reagente Grignard formado (suspensão limpa trocou para mistura obscura com espumante e exoterma). A solução foi resfriada para temperatura ambiente e transferida via cânula para uma solução fria (banho de gelo/água) de etil 1-(4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2- (2,6-diclorofenil)propan-2-il)-lH-imidazole-4-carboxilato (400 mg, 0,800 mmol) em anidro diclorometano (2,60 mL) sob argon. O frasco no qual o reagente Grignard foi preparado foi enxaguado com éter anidro(2 x 400 μL) e transferido via cânula para o etil éster contido no frasco. A mistura da reação foi permitida para lentamente aquecer para temperatura ambiente e agitada por 1 hora. Análise HPLC indicou menos que 0,3% do material de partida estando presente. A reação foi resfriada para 0°C, diluida com diclorometano anidro (800 μL) e extinta por adição lenta e cuidadosa de cloreto de amónia aquosa saturada (8 mL) . As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi extraida com diclorometano (3x4 mL) . O combinado orgânico extraido foi concentrado a vácuo para obter 443,5 mg de produto bruto como um sólido branco. O produto bruto descrito acima foi combinado com 244,3 mg (sólido branco) obtido de uma reação similar. O produto combinado foi purificado por cromatografia de luz sílica gel ("Isco RediSep cartridge", 12 g) e eludida com 10 para 20% EtOAc em hexano. Frações de 30 mL foram coletadas. As frações foram verificadas por TLC (Sílica, 50% EtOAc, 50% hexano, Rf = 0,41) e HPLC. 0 produto puro contendo frações foram combinados e concentrados em vácuo para rendimento de 531,2 mg de produto como um sólido branco (rendimento de 90%) : XH-NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm: 6, 47-7,58 (m, 7H) , 2,01 (br s, 6H). HPLC: (YMC ODS-AQUOSO, 3 μm, 150 x 4,6 mm, Fase móvel A = 0,05% TFA em H2O, Fase móvel B = 0,05% TFA em ACN, 0 min 50% B, 9 min 95% B, 15 min 95% B, 15,5 min 50%B. Razão de fluxo = 1 ml /min) Tr= 9,23 min (a 220 nm, Pureza Química = 98,8%), LCMS (+ ion) m/z = 487(0%), 493(59%), 495(100%), 497(47%), 498(8%).
Preparação de 2- (2-(2-(2, 6-diclorofenil)propan-2-il) -1-(3,3' -dif luor-4 ’ - (hidroximetil) -5 ' - (metilsulfonil) bif enil- 4-il) -lH-imidazol-4-il) [ (13CD3) 2]propan-2-ol
Figure img0034
Para um 25 mL 14/20 frasco de fundo redondo sob argon foi acrescentado 2- (1- (4-bromo-2-fluorfenil)-2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il) -lH-imidazol-4-il) [ (±3CD3) 2]propan- 2-ol (0.283 g, 0.572 mmol), (2-fluor-6-(metilsulfonil)-4- (4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)metanol (0.227 g, 0.686 mmol), 1,1'-Bis(difenilfosfino)-ferrocene- paládio(II)dicloreto diclorometano complexo (0,094 g, 0,114 mmol), carbonato de potássio (0,237 g, 1,716 mmol), DME (4,30 ml) e água (0,215 ml) gue foi previamente misturado com argon. A mistura foi aquecida para 80°C por 1 hora. Análises de HPLC e LCMS indicaram que material de partida foi consumido. A mistura da reação foi resfriada com um banho de gelo-água, particionado entre diclorometano (10 mL) e água (10 mL) . A camada aquosa foi extraida com diclorometano (3 x 10 mL) . 0 combinado orgânico extraido foi concentrado a vácuo para dar 643, 6 mg como um sólidp semi sólido escuro.
Previamente, uma reação similar para a preparação de 2-(2- (2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1-(3,3'-difluor-4'- (hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4-il)-IH-imidazol- 4-il) [ (13CD3) 2] propan-2-ol foi completada e forneceu 462,3mg de um sólido escuro. O produto bruto de ambos os experimentos foram combinados e purificadoa por cromatografia de luz silica gel ("Isco RediSep cartridge", 80 g) depois de dissolvida em diclorometano e pré absorvido por silica gel. A coluna de luz foi eludida com 25 - 50% EtOAc em hexano. Frações de 30 mL foram coletadas.
Frações foram verificadas por TLC (Sílica, 50% EtOAc, 50% hexano, Rf = 0,09) e HPLC antes de combinar o produto puro contendo frações e concentrado em vácuo para dar 468,3 mg de 2-(2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1-(3,3'-difluor- 4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4-il)-1H- imidazol-4-il) [ (13CD3) 2] propan-2-ol como um sólido amarelo. Este material foi adicionalmente purificado por recristalização em acetona (4 mL) a 65°C, resfriado lentamente para 25°C por 5 horas (cristais de partida para formar a 40°C) então resfriada para 0°C por 30 minutos adicionais. O sólido foi coletado por filtração, enxaguado com acetona fria e secada a vácuo para dar 66,2 mg de título composto como um sólido branco.
O licor inicial desta primeira recristalização foi concentrado e o resíduo foi recristalizado de uma quantidade mínima de acetona (1 mL) usando o mesmo procedimento como esboçado acima para obter uma segunda colheita de 276,4 mg de produto cristalino como um sólido sem cor.
O licor inicial desta segunda cristalização foi concentrado e purificado por preparativo HPLC, Tr = 15,0 min (Prep HPLC condições: "Synergi Hidro-RP column", 4 μ, 80Â, 21,2 x 250 mm, Fase Móvel A = H2O, Fase Móvel B = ACN, 0 min 30% B, 25 min 100% B. Razão de fluxo = 16,0 ml /min. UV a 220 nm.) Os 3 isolados purificados foram combinados para dar 401,1 mg de 2-(2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1-(3, 3'- difluor-4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4-il)- lH-imidazol-4-il) [ (13CD3) 2] propan-2-ol como um sólido amarelo claro (rendimento de 64%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO- d6}} δ ppm: 7,86-7,96(m, 2H) , 7,62 (dd, J=ll,33 Hz, 2,01 Hz, 1H), 7,33(dd, J=8,31 Hz, 1,76 Hz, 1H) , 7,09-7,19(m, 3H) , 6, 99-7,09(m, 1H) , 6,81(s, 1H) , 5,53-5, 62(m, 1H) , 4,89- 4,99(m, 2H), 4,67(t, J=3,15 Hz, 1H) , 3,45 (s, 3H) , 2,08 (residual acetona, 8 mol%) , l,95(s, 6H) . 13C-NMR (400 MHz, D6-DMSO) 29,61(t, J=109,88 Hz) HPLC: (YMC ODS-AQUOSO, 3 μm, 150 x 4,6 mm, Fase Móvel A =0,05% TFA em H2O, Fase Móvel B = 0,05% TFA em ACN, 0 min 5 50% B, 9 min 95% B, 15 min 95% B, 15,5 min 50% B. Razão de fluxo = 1 ml /min) Tr= 9,66 min (a 220 nm, Chemical pureza= 99,8%). LCMS (+ ion) m/z = 609(0%), 617(100%), 618(31%), 619(74%), 620(22%), 621(16%), 622(4,3%), 623(1,3%).
Exemplos 11-20
Os compostos seguintes foram feitos de maneira similar para aquela descrita no Exemplo 1, por substituição de vários reagentes de fenil acetonitrila no lugar de 2-(fenil)-2- metilpropanenitrilas como o material de partida:
Figure img0035
Figure img0036
Figure img0037
Exemplo 21 Exemplo para Composto 21
Figure img0038
Dentro de um frasco de 1 L foi pesado 25,0 g (134 mmol) de 2,6-diclorofenilacetonitrila e 250 mL de anidro THE. A solução resultante foi resfriada para -70°C e 134 mL de 1,0 M potássio tert-butóxido (1,0 M) em THF foi acrescentado seguido por 8,4 mL de iodometano (1,0 eq) . A reação foi agitada -70°C por 1 h então foi permitida para aquecer para temperatura ambiente por mais de 3 h. A reação foi concentrada a vácuo para remover THF então foi lavada dentro de um funil separador com etil acetato e 1 M HC1. 0 etil acetato foi separado, lavado com bisulfate, salmoura, foi secado sobre (Na2SO4) , e concentrado a vácuo. 0 residue foi purificado por cromatografia de luz silica gel (Biotage, 300 g SiO2, gradiente elução de 100% hexanos para 10% etil acetato por mais de 1 h) . Frações apropriadas foram combinadas e concentradas a vácuo, para fornecer o produto desejado como um óleo sem cor, aproximadamente 99% puro por GC, rendimento: 12,2 g (45%). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7,3β(d, J = 8 Hz, 2H) , 7,22(t, J = 8 Hz, 1H) , 4,84(q, J = 7 Hz, 1H), l,07(d, J = 7 Hz, 3H).
O Composto 21 foi feito de maneira similar à descrita no Exemplo 1, usando apropriada anilina e 2- (fenil)propanenitrila como material de partida.
Figure img0039
Figure img0040
Composto 11 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,10 (d, J = 1,2, 1H) , 7,59 (dd, J = 9,9, 1,8, 1H), 7,47 - 7,37 (m, 2H), 7,24 (dd, J= 5,3, 3,2, 2H) , 7,13 (dd, J = 8,3, 2,1, 1H) , 7,05 (d, J = 8,4, 1H) , 6,89 (s, 1H) , 5,10 (d, J= 4,4, 2H), 4,09 (s, 2H), 3,30 (s, 3H), 3,25 (d, J= 17,4, 1H), 2,86 (s, 1H), 1,63 (s, 6H).
Composto 12 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8,06 (d, J = 8,7, 2H) , 7, 99 - 7,86 (m,1H), 7,70 (d, J= 8,3, 1H) , 7,58 (m, 3H), 7,40 (t, J = 7,6, 1H), 7,21 (d, J= 7,7, 1H), 7,13 (s, 1H), 5,57 (t, J= 5,3, 1H) , 4,95 (d, J = 4,7, 2H) , 4,81 (s, 1H) , 4,13 (s, 2H) , 3,45 (s, 3H), 1,46 (s, 6H).
Composto 13 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,10 (s, 1H) , 7,71 (d, J = 2,0, 1H) , 7,60 (dd, J = 9,9, 1,8, 1H) , 7,49 (dd, J = 8,2, 2,1, 1H) , 7,22 (d, J = 8,2, 1H) , 7,12 (dd, J = 8,6, 6,1, 1H) , 6,96 (dd, J= 8,5, 2,6, 1H) , 6, 89 - 6, 78 (m, 2H) , 5,10 (s, 2H) , 4,05 (s, 2H) , 3,31 (s, 3H) , 3,00 (s, 1H) , 2,77 (s, 1H) , 1,63 (2, J = 5,5, 6H).
Composto 14 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7,85 (t, J = 4,5, 2H) , 7,70 (dd, J = 11,4, 1,8, 1H) , 7,50 (dd, J = 8,3, 1,7, 1H) , 7,35 (t, J = 8,2, 1H), 7,09 (dd, J= 8,8, 2,6, 1H), 7,03 - 6,80 (m, 3H), 5,35 (t, J= 5,3, 1H), 4,73 (d, J= 4,1, 2H), 4,56 (s, 1H), 3,80 (s, 2H), 3,38 (t, J= 6,4, 1H), 3,23 (s, 3H), 1,21 (s, 6H) .
Composto 15 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,11 (d, J = 1,2, 1H) , 7,72 - 7,53 (m, 3H), 7,28 (dd, J= 18,0, 4,9, 5H) , 7,15 (dd, J= 8,3, 2,1, 1H), 7,05 (d, J = 8,4, 1H) , 6,96 (s, 1H) , 5,09 (s, 2H) , 4,12 (s, 2H) , 3,30(s, 3H) , 3,28 (s, 1H) , 2,93 (s, 1H) , 1,64
Composto 16 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ 8,09 (s, 1H) , 7,60 (dd, J = 9,9, 1,8, 1H) , 7,39 (m, 2H) , 7,23 (t, J = 8, 1H) , 7,18 - 7,06 (m, 2H), 7,00 (m, 1H), 6,89 - 6,81 (m, 2H) , 5,10 (dd, J= 7,0, 1,6, 2H), 4,06 (s, 2H), 3,30 (s, 3H) , 2,92 (t, J = 7,0, 1H), 2,70 (s, 1H), 1,64 (s, 6H).
Composto 17 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,10 (s, 1H) , 7, 64 - 7,55 (m, 3H) , 7,25 (m, 2H) , 7,16 - 7,00 (m, 3H) , 6,92 (s, 1H) , 6,81 (d, J = 7,5, 1H) , 5,08 (dd, J = 7,1, 1,7, 2H) , 4,02 (s, 2H) , 3,28 (s, 3H) , 2,90 (t, J = 7,1, 1H) , 2,76 (s, 1H), 2,16 (d, J = 8,6, 3H), 1,64 (s, 6H).
Composto 18 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,12 (s, 1H) , 7,70 - 7,59 (m, 3H), 7,45 (d, J = 8,4, 2H), 7,24 (d, J = 8,0, 2H) , 7,16 - 7,07 (m, 1H) , 6,85 (s, 1H) , 5,10 (d, J = 5,6, 2H) , 4,31 (s, 2H) , 3,30 (s, 3H), 3,07 (s, 1H) , 2,94 (t, J= 7,0, 1H) , 1,55 (s, 6H) .
Composto 19 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,11 (d, J = 1,1, 1H) , 7,62 (ddd, J = 12,0, 8,4, 1,8, 3H), 7,28-7,26 (m, 3H), 6,97 (s, 1H), 6,93 - 6,76 (m, 2H) , 5,09 (s, 2H) , 4,14 (s, 2H) , 3,29 (br s, 4H) , 2, 91 (s, 1H) , 1, 65 (s, 6H) .
Composto 20 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,08 (d, J = 1,1, 1H) , 7,57 (dd, J = 9,9, 1,8, 1H), 7,38 (ddd, J= 10,3, 9,2, 2,0, 2H), 7,23 - 7,17 (m, 2H) , 7,18 - 7,01 (m, 3H) , 6,89 (d, J = 0,7, 1H) , 5,09 (s, 2H), 4,14 (s, 2H) , 3,37 (s, 1H) , 3,30 (s, 3H) , 2,92 (s, 1H) , 1,64 (s, 6H) .
Composto 21 tem as seguintes NMR características: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7,97 (s, 1H) , 7,47 (dd, J = 9,8, 1,6, 1H) , 7,18 (d, J= 10,6, 1H) , 7,12 - 7,04 (m, 2H) , 6,96 (d, J = 7,9, 2H) , 6,90 - 6,81 (m, 1H) , 6,79 (s, 1H) , 5,13 (s, 2H), 4,94 (q, J = 7,0, 1H) , 3,82 (s, 1H) , 3,39 (d, J = 24,5, 1H) , 3,36 (s, 3H) , 1,81 (d, J = 7,1, 3H) , 1,63 (s, 6H) .
Procedimentos padrões fisiológicos, farmacológicos e bioquímicos são disponíveis para testar os compostos para identificar estes que possuem atividades biológicas que modulam a atividade dos LXRs (LXRα e LXRβ) . Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios bioquímicos, tais como ensaios de ligação, ensaios de polarização fluoresecente, ensaios de recrutamento coativador baseado em FRET ver, geral, "Glickman et al., J. Biomolecular Screening (2002), Vol. 7, No. 1, pp. 3-10"), tanto quanto ensaios baseados em célula que incluem o ensaio de co-transfecção, o uso de quimera LBD-Gal 4 e ensaios de interação proteina-proteina, (ver, "Lehmann, et al., J. Biol Chem. (1997), Vol. 272, No. 6, pp. 3137-3140").
Os Compostos da presente invenção mostram inesperada vantagem sobre compostos previamente descritos no assunto, tais como estes descritos em Publicação PCT N° WO 2007/002563. Os presentes compostos foram mostrados no ensaio(s), tais como estes descritos acima, para ter uma característica agonista parcial LXR com potência inteira aumentada em sangue humano e baixa eficácia LXRot. Adicionalmente, os compostos da presente invenção também exibem estabilidade metabólica em ensaio microsmal em figado humano. Tais compostos podem ser mais úteis no tratamento, inibição ou melhoramento de uma ou mais das doenças ou desordens que são discutidas neste documento.
Exemplo A Ensaio de Proximidade de Cintilação (SPA)
O ensaio SPA mede o sinal radioativo gerado por ligação de 3H-24,25-epoxicolesterol para LXRα-RXRα ou LXRp-RXRa heterodimeros. A base do ensaio é o uso de gota de SPA contendo uma cintilante, tais que quando a ligação para o receptor traz o ligando nomeado dentro da proximidade com a gota, a energia do nomeado estimula o cintilante para emitir luz. A luz é medida usando um micro prato de leitura de cintilação padrão. A habilidade de um ligando para ligar com um receptor pode ser medida por avaliar o grau para o qual o composto pode competir fora um ligando radionomeado com afinidade conhecida para o receptor.
Materiais Requeridos: 1. Nome: 3H-24,25-epoxi-colesterol ("NEN Life Science Produtos / Perkin Elemer)") 2. LXRa lisado: Baculovirus expressada LXRa/RXR heterodimer ambos com uma etiqueta 6-HIS produziram como um lisado bruto. 3. LXRβ lisado: Baculovirus expressada LXRβ/RXR heterodimer ambos com uma etiqueta 6-HIS produziram como um lisado bruto. 4. SPA gotas: Ysi cobre His-tag SPA gotas (Amersham) 5. Prato: superfície de não ligação prato bom 384 (Corning). 6. Proteina lisado tampão de diluição: (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazole). 7.2x SPA Tampão: (40 mM K2HPO4/KH2PO4 pH7,3, 100 mM NaCl, 0.,05% Polisorbato 20, 20% Glicerol, 4 mM EDTA). 8. 2x SPA Tampão w/o EDTA: (40 mM K2HPO4/KH2PO4 pH7,3, lOOmM NaCl, 0,05% Polisorbato 20, 20% Glicerol). Soluções de Estoque 0,5 M K2HPO4/KH2PO4 pH 7,3 0,5 M EDTA pH 8,0 5 M NaCl 10% Polisorbato-20 Glicerol
Preparação de Proteina Lisado
Expressão de Baculovirus plasmides para humano RXR a (acesso No NM_002957), LXRa (acesso No U22662), e LXRβ (acesso No U07132) foram feito por clonar o apropriado comprimento inteiro de cDNAs dentro do vetor pBacPakhrs2 (Clontech, CA) seguindo procedimentos padrões. Insersão do cDNAs dentro do vetor pBAcPakhis2 criado de poliligação em um quadro de fusão para o cDNA para uma etiqueta N-terminal poli-His tag recente em pBacPakhisl. Clonagem correta foi confirmada por restrição de mapeamento e /ou sequência. Células lisadas foram preparadas por infectar saudáveis células de inseto Sf9 a uma densidade de aproximadamente l,25xl06/ml a 27 °C, em um volume total de 500 mL por IL medido no frasco, foi feito cultura sob condições padrões. Para preparar o LXRa lisado, células de inseto foram co- transfectadas com a expressão cassete de LXRα a uma multiplicidade de infecção de 2,0 e com a expressão cassete RXR a uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 1,0. Para preparar o lisado LXRβ, células de inseto foram co-transfectadas com a expressão cassete LXRβ a uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 2,0 e com a expressão cassete RXR a uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 1,0. Em ambos os casos as células foram incubadas por 48 horas a 27 °C com agitação constante antes de armazenar.
Depois da incubação, células foram armazenadas por centrifugação e tornada pelota. Pelotas de células foram resuspensas em dois volumes de água-gelo preparada tampão de extração (20mM Tris pH 8,0, lOmM Imidazole, 400mM NaCl, um tablete inibidor de protease livre EDTA contido ("Roche Catalog No: 1836170") por 10 ml de tampão de extração).
Células foram homogeneizadas lentamente sobre gelo usando um homogenizador Dounce para alcançar 80-90% de célula lisis. O homogeinado foi centrifugado em um rotor pré resfriador (Ti50 ou Ti70, ou equivalente) a 45.000 rpm por 30 minutos a 4 °C. Alíquotas de supernadante foram congeladas sobre gelo secado e armazenadas congeladas a -80°C até a quantificação e controle de qualidade.
Alíquotas dos lisados foram testadas no ensaio SPA para assegurar consistência de lote para lote, e análise via SDS-PAGE depois de purificação, usando Resina de Ni-NTA (Qiagen) e ajustada para concentração de proteína e nível de expressão antes de uso em ensaio de blindagem.
Preparação de Reagentes de Blindagem
Solução [3H] 24,25 Epoxicolesterol (EC): para um simples 384-prato bom (ou 400 bons) , 21 μL de [3H] EC (atividade específica 76,5 Ci/mmol, concentração 3,2 mCi/mL) foi acrescentado para tampão 4,4 mL de 2x SPA para prover para uma concentração final de 200 nM. Para cada adicional 384- prato bom, um adicional de 19,1 μL de [3H] EC foi acrescentado para 4,0 mL de adicional tampão 2x SPA. A concentração final de [3H] EC no bom foi 50 nM.
Lisado de LXRa (preparado como acima) foi duluído com tampão de proteína lisada diluída. 1400 μL de diluída LXRa lisado foi preparado por 384-prato bom, (ou 200 bons) e 1120 μL de lisado LXRa diluído foi preparado para cada adicional 384-prato bom.
Lisado de LXRβ (preparado como acima) foi duluído com tampão de proteína lisada diluída. 1400 μL de lisado LXRβ duluído foram preparados por 384-prato bom, (ou 200 wellbons) e 1120 μL de lisado LXRβ diluída foram preparados para cada adicional 384-prato bom.
Solução de gota de SPA: para um 384-prato bom (ou 400 bons), 3,75 mL de 2x SPA Tampão w/o EDTA, 2,25 mL de H2O, e 1,5 mL de etiqueta Ysi His gotas de SPA (vortex bem antes de remover) foram misturados juntos. Para cada adicional 384-prato bom, um adicional 3,5 mL de tampão 2x SPA w/o EDTA, 2,1 mL de H2O, e 1,4 mL de etiqueta Ysi His gotas de SPA foram misturadas juntas.
Procedimento:
Diluições apropriadas de cada composto foram preparadas em um 96-prato bom e pipetado dentro de apropriados 384 prato bom a 3,5 μl por bom. 9,1 μL de [3H] EC foram acrescentados para cada bom da coluna 2-23 do multiprato bom. 5 μl de diluida lisado de LXRa foi acrescentado para cada bom da coluna 2-23 em filas impar do multiprato bom. 5 μL de diluida lisado de LXRβ foi acrescentado para cada bom da coluna 2-23 em filas par do multiprato bom. 17,5 μL de solução de gotas de SPA foram acrescentados para cada bom da coluna 2-23 do multiprato bom.
Os pratos foram cobertos com aferidos limpos e colocados em uma incubadora a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos.
Depois da incubação os pratos foram analisados usando um leitor de prato luminescente. ("MicroBeta, Wallac") usando o programa "n ABASE 3H_384DPM". 0 cenário para "n ABASE 3H_384DPM" foi: Modo de Contagem: DPM; Tipo de Amostra: SPA; Modo ParaLux: experiência baixa;
Tempo de Contagem: 30 segundos.
Os ensaios para LXRα e LXRβ foram realizados de maneira idêntica. O determinado Ki representa a média de pelo menos duas respostas de experimento de doses independentes. A afinidade de ligação para cada composto pode ser determinada por uma análise de regressão não linear usando a fórmula de competição local para determinar 0IC50 onde: Y =Fundo + (Topo - Fundo)/(l + 10x’logIC5°) . O Ki foi calculado usando a equação de Cheng e Prusoff onde: Ki = IC5o/(l + [Concentração de Ligando]/Kd de Ligando).
Para este ensaio, tipicamente a Concentração de Ligando = 50 nM e o Kd de EC para o receptor é 200 nM como determinado por ligação de saturação.
Os compostos da invenção demonstraram a habilidade para ligar para LXRα e/ou LXRβ, quando testado em seus ensaios.
Exemplo B Ensaio de Co-Transfecção
Para medir a habilidade de compostos para ativar ou inibir atividade transcricional de LXR em um ensaio baseado em célula, de co-transfecção foi usado. Para isto foi mostrado funções LXR como um heterodimer com RXR. Para o ensaio de co-transfecção, expressões plasmide para LXRα e LXRβ são introduzidas separadamente via transiente de transfecção dentro de células mamiferas ao longo de um repórter luciferase plasmide que contém uma cópia de uma sequência de DNA que é ligada por heterodimeros LXR-RXR ("LXRE; Willy, P. et. al. 1995") . LXRs heterodimerizado com o endógeno RXR. O tratamento de células transfectadas com um LXR agonista aumenta a atividade transcricional de LXR, que é medida por um aumento em atividade luciferase. Similarmente, atividade de antagonista LXR pode ser medida por determinar a habilidade de um composto para competitivamente inibir a atividade de um agonista LXR.
Materiais Requeridos
Células de Rins de Macaco africano verde CV-1 Expressão de Co-transfecção plasmide, compreendendo comprimento inteiro LXRα (pCMX-h LXRa Dou LXRp (pCMX-hLXRp) , reporter plasmide (LXRExl-Tk-Luciferase), e controle (pCMX- expressão vetor Galactosidase) ("Willey et al. Genes & Development 9 1033-1045 (1995)").
Reagents de transfecção tais como FuGENEδ (Roche).
Ix Tampão sw célula lisis: 22,4 mM Tricina pH 8,0 0,56 mM EGTA pH 8,0 5,6 mM MgSO4 0,6% Triton X-100 5,6% glicerol lOx solução de substrato de luciferase: 10 mM HEPES pH 6,5 2,75 mM D-Luciferin 0,75 mM Coenzima-A 3,7 mM ATP 96 mM DTT
Preparação de Reagentes de Blindagem
Células CV-1 foram preparadas 24 horas antes do experimento por chapear eles dentro de frascos T-175 pratos de 500 cm2 em ordem para alcançar confluência 70-80% no dia da transfecção. O número de células para ser transfectada foi determinado pelo número de pratos para serem blindados. Cada bom de um 384 prato bom requer aproximadamente 8000 células. Reagente de transfecção de DNA foi preparado por misturar o requerido plasmide DNAs com um reagente de lipidio catiônico transfectado FuGENEβ (Roche) para seguir as instruções providas com os reagentes. Quantidade ótima de DNA foi determinada empiricamente por linha de célula e tamanho do vaso para ser transfectado. Para cada frasco de T175 cm2 um total de 20 μg de DNA, 60 μl de Eugene 6 e 1 ml de "Optimem" foi misturado e acrescentado. As Células foram então incubadas pelo menos 5 horas a 37 °C para preparar células de blindagem. Reagente de ensaio de Luciferase foi preparado por combinar antes do uso: 1 parte de 10x solução de substrato de Luciferase 9 partes de IX tampão de célula lisis.
Procedimento
Ensaio de pratos foram preparados por dispensar 5 μL de composto para bom de um 384 prato bom para alcançar concentração final do composto de 10 μM e não mais que 0,5% DMSO. Média foi removida das células de blindagem, as células tripisinizadas, ' armazenadas as células por centrifugação, contadas, e colocadas no prato a uma densidade de aproximadamente 8000 células por bom no ensaio de 384 prato bom preparado acima em um volume de cerca de 45 μL. Pratos de ensaio contendo ambos compostos e células de blindagem(50 μL no volume total) foram incubadas por 20 horas a 37°C.
Depois da incubação com compostos, média foi removida das células e reagente de ensaio de luciferase (30 μL/boa) acrescentado. Depois de aproximadamente 2 minutos à temperatura ambiente, os pratos de ensaio foram lidas sobre um medidor de luminosidade ("PE Biosystems Northstar reader with on-board injectors, or equivalent").
O ensaio de co-transfecção de LXR/LXRE pode ser usado para estabilizar os valores de EC50/IC50 para potência e percentual de atividade ou inibição para eficácia. A eficácia define a atividade de um composto relativo para um alto controle ((N-(3-((4-fluorfenil)-(naftalena-2- sulfonil)amino)propil)-2,2-dimetilpropionamida)) ou um baixo controle (DMSO/veiculo). As curvas de resposta de dose são geradas de uma curva de ponto 10 com concentrações diferem por unidade de LOG. Cada ponto representa a média de 4 bons de dados de um 384 prato bom.
Os dados deste ensaio são providos pelas seguintes equações, das quais o valor de EC50 pode ser resolvido: Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1 + 10 ((logEC50-x) *Hillslope)) .
O EC50/IC50 é, por esta razão, definido como a concentração na qual um agonista ou antagonista elucida uma resposta que é metade do caminho entre os valores de Topo (máximo) e o fundo (linha de base) . Os valores de ECJO/ICSO representados são as médias de pelo menos 2 e normalmente 3 experimentos independentes. A determinação da eficácia relativa ou % de controle para um agonista é por comparação para a resposta máxima alcançada por ( (N-(3-((4-fluorfenil)-(naftalena-2- sulfonil)-amino)propil)-2,2-dimetilpropionamida) que é medida individualmente em cada experimento de resposta de dose.
Para o ensaio de antagonista, um agonista LXR pode ser acrescentado para cada bom de um 384 prato bom para elucidar uma resposta. O percentual de inibição para cada antagonista é por esta razão uma medida da inibição da atividade do agonista. Neste exemplo, inibição 100% indicará que a atividade de uma concentração especifica de agonista LXR foi reduzida para niveis da linha de base, definida como a atividade do ensaio na presença somente de DMSO.
Compostos da presente invenção foram testados no ensaio de LXRa descrito imediatamente acima e foram mostrados para ter eficácia de menos que ou igual a 25% o composto de controle.
Compostos da presente invenção foram testados no ensaio de LXRβ descritos imediatamente acima e foram mostrados para ter eficácia de maior que ou igual para 30% do composto de controle.
Exemplo C Ensaio Total do Sangue Humano
Sangue Humano Total foi coletado em EDTA contendo tubos e aliquotas de 0,5 mL foram imediatamente misturados em um 96 bloco bom com a diluição serial apropriada de composto de teste, em 0,5% DMSO. Os compostos foram incubados com sangue a 37°C com constante balanço por 4 horas. Depois da incubação, células foram lisadas em solução ácido nucléico lisis purificação ABI ("Applied Biosystems catalog # 4305895") e congelado a -80°C. Célula lisis seguintes, total RNA foi purificado usando um ABI 6100 RNA pré posto de acordo com o protocolo provido para a fabricação. Os cDNAs foram sintetizados, e mRNAs foram quantificados usando Quantitativo SYBR-Green PCR (Q-PCR) sobre um Sistema de Detenção ABI Prism 7900HT e reagentes de "Quanta Bioscience Inc (Quanta Bioscience catalog # 95047 e
Figure img0041
A quantidade de cada mRNA foi determinada pelo método ΔΔCT ("(Michael W. Pfaffl. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 9 e 45") e normalizado para uma quantidade de dois controles mRNAs, isto é, proteina ribosomal L-30 (L-30) e beta-2-microglobulin (B2M). A indução de ABCA1 e ABCG1 para composto de teste foi grafado como uma percentagem do composto referência, ácido acético 2-(4-(5-(5-ciano-l-(2,4-difluorbenzil)-6-oxo-4- (trifluormetil)-1,6-dihidropiridin-2-il)tiiofen-2-il)-3-metilfenil) , e potência (EC50) e atividade (% MAX) foram calculados por uma apropriada curva de resposta senoidal como uma função da transformada de log da concentração do composto usando software XLFit de acordo para a equação y = A + ( (B-A) / (1+ ( (C/x) AD) ) ) . 0 completo LXRα e LXRβ pan agonista ácido acético 2-(4-(5-(5-ciano-l-(2,4- difluorbenzil)-6-oxo-4-(trifluormetil)-1,6-dihidropiridin- 2-il)tiofen-2-il)-3-metilfenil) , (EC50 1-2 μM) foi usado como um composto referência e sua atividade máxima foi definida como 100%.
Compostos da presente invenção foram testados no ensaio descrito imediatamente acima e foram mostrados para ter uma 5 potência geralmente menor que 1.000 nM, preferencialmente, menor que 100 nM, mais preferencialmente menor que 20 nM.
Exemplo D Processamento Alto (HT) de Estabilidade Metabólica em Microssomas Humano
O ensaio de estabilidade metabólica avalia estabilidade metabólica de CYP-mediado in vitro usando microssomas de figado humano depois de dez minutos de incubação.
O composto de teste é hospedado como uma solução de ação de 3,5 mM em 100 por cento de DMSO. O composto é diluido para 15 criar uma solução de acetonitrila (ACN) 50 μM contendo 1,4% de DMSO, que é então usado como uma 100x ação para incubar com microssomas de figado humano. Cada composto é testado em duplicata. O composto, NADPH e soluções de microssoma de fígado são combinadas para incubação em três passos:. 152 μl de suspensão de micro soma de frgado, protein concentração de 1,1 mg/ml em 100 mM NaPi, pH 7,4, tampão de 5 mM MgCla, é pré-aquecido a 37°C. 2. 1,7 μl de 50 μM de composto (98,6% ACN, 1,4% DMSO) é acrescentado para o mesmo tubo e pré-incubado a 37°C por 25 5 minutos. 3. A reação é iniciada por adição de 17 μl de pré-aquecida solução de 10 mM NADPH em 100 mM NaPi, pH 7,4.
Componentes de reação são bem misturados, e 75 μl são imediatamente transferidos dentro de 150 μl solução de 30 extinção /parada (ponto de tempo zero, To) • Reações são incubadas a 37°C por 10 minutos e então uma adiciona alíquota de 75 μl é transferida dentro da solução de extinção 150 μl. Acetonitrila contendo 100 μM DMN (um padrão UV para injeção de controle de qualidade), é usado como solução de extinção para terminar reações metabólicas. Misturas de extinção são centrifugadas a 1500 rpm (aproximadamente 500 X g) em uma centrifuga Allegra X-12, rotor SX4750 ("Beckman Coulter Inc., Fullerton,CA") por quinze minutos para pelota de microssomas denaturado. Um volume de 90 μl de extrato de supernadante, contendo a mistura de composto original e seus metabólicos, é então transferida para um separado 96-prato bom para análise UV- LC/MS-MS para determinar o percentual de composto original que é remanescente na mistura.
Amostra Simples de UV-LC/MS-MS - Pré Análise de Integridade Estrutural.
A Estabilidade metabólica de pré-análise de integridade estrutural é usada para acessar a pureza de compostos que estão sendo ensaiados. Os compostos são recebidos em 96- prato bom como uma solução de 57 μl de 3,5 mM DMSO. As soluções de ação de composto 3,5 mM DMSO são diluidas 18- vezes com uma solução contendo volumes iguais de acetonitrila, isopropanol, e MÍIHQ-H2O. As soluções resultantes (200 μM) são analisadas para integridade estrutural por LC-UV/MS sobre um espectrômetro "LCQ Deca XP mais ion trap mass", usando uma "Waters XBridge C18, 5 μm, 2 x 50 mm coluna" com uma "Waters Sentry 2.1 mm guard column", e a condições LC descrita na tabela abaixo, com uma injeção de 5 μl e uma razão de fluxo de 1 ml/min. Os dados requeridos refletem pureza por UV absorvida a 220 nm. Só resultados para estes compostos com pureza maior que 50% são reportados.
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• *Fase Móvel para pré análise de integridade estrutural: (A) 98% água, 2% acetonitrila com 10 mM acetato de amónia; (B) 10% água, 90% acetonitrila com 10 mM acetato de amónia
Análise da Amostra - Amostra Incubadas
Otimização da condição de MS/MS é conduzida sobre um espectrômetro "Thermo TSQ Quantum triple-quadropole mass" equipado com uma fonte "Heated-electrospray (H-ESI)" por infusão automática para obter as transições de SRM e seus correspondentes valores de energia de colisão. As soluções de composto a uma concentração de 20 μM em 1:1 metanol:água são infuso a uma razão de fluxo de 90 μL/min, então combinada com a fase móvel a uma razão de fluxo de 50 μL/min antes de ser introduzido dentro da fonte. Todos os compostos são primeiro otimizados usando fase móvel A e B (50% A e 50% B) , e se necessário, usando fase móvel C e D (também com uma composição 50:50) . Os parâmetros otimizados, incluindo polaridade, transição SRm e energia de colisão, são armazenadas em uma base de dados Microsoft Access.
As condições do espectrômetro de massa obtido da infusão automatizada são usadas para análise da amostra de incubação do ensaio de estabilidade metabólica. O volume de injeção é 5 μl e a razão de fluxo é 0,8 ml/min. 0 gradiente usado é mostrado na tabela abaixo. Todas as amostras são injetadas com o gradiente usando primeiro fase móvel A e B. Se necessário (por exemplo, por razões de cromatografia), amostras são re-injetadas com o mesmo gradiente, mas usando fase móvel C e D. todas os parâmetros de análise LC-MS/MS são capturados eletronicamente no arquivo de dados cru.
Figure img0044
expressão de ABCA1 de gene relativo para um composto de referência, e o ensaio de estabilidade metabólica de microssoma. Valores de EC50 são dados no intervalo onde A é <100 nM, B é 101 nM para <1.000nM e C é >1,000 nM. Tabela 1
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Os dados representativos acima ilustram uma inesperada característica parcial desejável de agonista LXR, aumentada potência em sangue humano total, baixa eficácia LXRa e estabilidade metabólica em um ensaio microssomal de figado humano dos compostos da presente invenção em comparação para compostos previamente descritos no assunto, tais como estes revelados em Publicação PCT. No. WO 2007/002563.
Exemplo E Potência In Vivo e Indução Máxima ABCG1 em Macacos "Cinomolgos"
Os compostos da presente invenção foram testados para suas habilidades para induzir o mRNA para o gene alvo LXR ABCG1 em células de sangue quando administrado oralmente para macacos cinomolgos.
Os compostos de teste foram formulados em 0,5% carboximetil celulose (CMC, Sigma) e 2% Polisorbato 80 (Sigma) por trituração. Cada grupo de tratamento contém três macacos masculinos, cada um pesando 3,0-6,0 kg no inicio do estudo. Os compostos de teste foram formulados fresco cada manhã em veiculo, e animais que foram que tinham jejuado na noite anterior foram dosados entre 7 e 7:30 da manhã por gavage de pó. Para célula de sangue da linha de base mRNA foi determinado, 1 ml de sangue venoso, foi coletado em um tubo EDTA de cobertura secada e 1 volume de Fosfato Dulbecco Salino tamprado sem cálcio ou magnésio e 2 volumes de solução de ácido nucléico purificação Lisis ("Applied Biosystems, Inc.") foram acrescentados. Amostras foram congeladas a -80°C antes da isolação e análise de RNA. Compostos de teste foram dosados seguindo a amostra da coleção de linha base. Depois de 5 horas de dosagem, sangue venoso foi coletado e processado como acima para determinações de RNA. Um adicional 0,5 ml de sangue foi também coletado e analisado para concentrações do plasma do composto.
Isolação de RNA, Amostras congeladas foram permitida para descongelar à temperatura ambiente, e então colocada sobre gelo. O RNA Total foi isolado sobre o ABI 6100 usando um pré carregado protocolo de acordo para as instruções de fabricação ("ABI Manual #4332809 Rev. B").
Sintése de cDNA e Reações deQ-PCR Reações. Kit de sintese de "qScript cDNA from Quanta Biosciences, Inc". Foram usados para gerar o primeiro fio cDNA de cada amostra total de RNA. Reações de 20 μl foram conduzidas em "96-well Eppendorf AG twin-tec PCR plates on a MJ Research, Inc. model PTC-200 DNA Engine". Aproximadamente 500 ng de RNA total foram usados para cada reação. Reações foram compostas como segue: Reação de mistura 5X rq-Script4 μl mais 3-5 μl nuclease livre de água mais 1 μl q-Script transcriptase reverso mais RNA de entrada 10-12 μl. Depois de misturadas, as reações foram centrifugadas a 3750 rpm por 2 minutos, à temperatura ambiente e conduzida no protocolo "q-Script" 25°C por 5 minutos, seguido por 42°C por 30 minutos, e então 85°C por 5 minutos) em um "MJ Research thermocycler". Cada reação foi diluida com 30 μl de nuclease livre de água e usada imediatamente para SYBR- a -20°C. Reações de SYBR-Verde Q- PCR foram realizadas como segue. Misturas da reação para o gene alvo LXR, ABCG1, e a normalização padrão interna de gene de proteina ribosomal L30 foram preparados usando validado primeiro conjunto direto/reverso [ABCG1 (X-Mmul- ABCG1-F1 e X-Mmul-ABCGl-Rl) ; ribosomal proteina L30 (SYBR- hL30-Fl e SYBR-hL30-Rl) ] . Informações sobre sequências destes primeiros conjuntos foram obtidas do "Primer Bank" Web Site (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html) para L30 (Primer Bank # 4506631al) , e da Exelixis, Inc. (South San Francisco, California, USA) para ABCG1 (Mmul_ABCGl.TaquosoMan Fl/Rl). Sequências Primer Mmul_ABCGl.TaquosoMan.Fl 5' -ACGCAGACAGCACTGGTGAA-3' Mmul_ABCGl.TaquosoMan.R1 5' -CTTCCCTCCACCTGGAACCT-3’ hL30-Fl 5'-GCTGGAGTCGATCAACTCTAGG-3' hL30-R2 5'-CCAATTTCGCTTTGCCTTGTC-3'
Reações SYBR-Green foram agrupadas como segue.Por reação, 10 μl 2X "PowerSYBR® Green Supermix" ("Applied Biosystems Catalog # 4367 659") mais 2 μl de 10 μM de Mistura Primer Direta/Reversa de Especifico Gene (final concentração de primers é 500 nM cada) mais 4 μl água foram misturadas juntas com 4 μl de diluida reação RT. Misturas da reação foram centrifugadas a 3750 rpm por 2 minutos à temperatura ambiente e realizadas sobre um "Applied Biosystems model 7900HT SDS-Taqman System".
Cálculo de quantidades relativas de mRNA, e composto potencies in vivo e atividades máximas. A quantidade relativa de ABCG1 mRNA foi calculado usando o segundo método derivativo comparativo Ct (2 ct). A quantificação foi obtida depois de normalização para proteina ribosomal L30 mRNA. Cada amostra foi testada em duplicidade e a média Ct foi usada para cálculos.
Cálculos de potência in vivo de compostos em "macacos cinomolgos". A concentração de composto de teste em plasma de cada animal individual em 5 horas depois da dose foi plotada versos a dobra de indução versos a linha de base de 5 ABCG1 mRNA em células de sangue para cada animal a 5 horas depois da dose para todas os grupos. Dados de todos os grupos de dosagem foram incluidos no mesmo desenho para cada composto. A potência in vivo (EC50) e a indução máxima de ABCG1 mRNA para cada composto foi determinada por 10 ajustamento de curva não linear usando uma equação de resposta de dosagem senoidal ("Graphpad Prism 4.03 software").
Quantificação de concentrações de plasma do composto por LC/MS/MS. A seguir os detalhes da cromatografia liquida com 15 espectrômetro de massa em tandem (LC/MS/MS) baseado em métodos bioanalitico usado para teste para quantificar compostos em plasma de "macacos cinomolgos".
A análise de LC/MS/MS do composto de teste foi conduzida contra uma curva padrão no intervalo de 1 para 5000 nM. AS 20 curvas padrão foram ajustadas com uma regressão linear de peso reciproco quadrado (1/x2). Padrões foram analisados em réplicas únicas. Amostra de controle de qualidade foram preparadas em matriz biológica em branco a 3 concentrações dentro do intervalo da curva padrão e foram analisadas como 25 répl icas dentro de cada conjunto analisado. Asconcentrações determinadas de mais que 75% do QCs foram dentro de 20% de seus valores nominais.
A preparação da amostra foi conduzida sobre manipuladores liquidos automatizados "Janus 8-tip and Janus Mini 96-tip". 30 Alíquotas (50 μL) da matriz biológica (plasma) de estudos in vivo e amostras padrões QC foram tratadas com 1 M cabonoato de amónia em água pH 9,2 não ajustado (50 μL) contendo 200 nM de dois padrões internos (IS), seguido por 300 μL metil t-butil éter (MTBE) e particionada por extração liquida-liquida (LLE) usando quarenta repetições de verter de enche-expele por aproximadamente 3 minutos. As camadas aquosas e orgânicas foram então centrifugadas por 2-min a 3900 rpm. A camada orgânica de cima extraiu solvente MTBE (250 μL) que foi removido para outro limpo 96-prato bom e colocado em um evaporador de nitrogênio por 15 min a 40°C para secar. Aliquotas (100 μL) foram usadas para reconstituir o extrato secado com Fase Móvel consistindo de 1:1 acetonitrila/água. Uma aliquota de 10 μL foi injetada primeiro sobre o tubo de fluxo de cromatografia liquida (HTLC) de extração de coluna de alto desempenho, então eludido sobre uma segunda cromatografia liquida de coluna (HPLC) de alto desempenho para base de análise de LC/MS/MS.
O sistema LC usado para todas as análises foi um "Aria TX- 2" ("Thermo Scientific, Waltham, MA, USA") sistema HPLC consistindo de 8 bomba "Shimadzu LC10AD" com 2 Sistemas Controladores "SCL-10AVP" ("Columbia, MD, USA") e um "dual arm CTC Analytics HTS PAL autosampler (Switzerland)" equipado com um refrescador que mantém as amostras a 10°C durante a análise. 0 HPLC extração de coluna on-line foi um "Cyclone-P mixed polymer" (0,5 x 50 mm, 50 μM particulas, "Thermo Scientific, Waltham, MA, USA") colocado à temperatura ambiente. O HPLC coluna de análise C18 usado foi um "XBridge C18 (2,1 mm x 50 mm, 5 μM particle, Waters Corporation, Milford, MA, USA)" colocado à temperatura ambiente. A Fase Móvel, que consistia de 0,1% ácido fórmico em água (A) e 0,1% ácido fórmico em acetonitrila (B) , foi entregue a uma razão de fluxo de 1,5 mL/min para o HTLC extração de coluna on-line e a 0,5 mL/min para o HPLC C18 análise de coluna. Esta razão de fluxos troca durante o passo de transferir entre 0,5 para 1,0 min. Os tempos de retenção para o composto de teste e padrão interno foram registrados. 0 tempo total de análise foi 5,0 min. Os gradientes são sumarizados nas tabelas seguintes.
Figure img0050
O espectrômetro de massa usado para todas as análises foi um "Finnigan Quantum Ultra tandem mass spectrometer (Thermo 5 Scientific, Waltham, MA, USA)" equipado com uma interface aquecida eletro spray operando em ambos os modos de ionização positiva e negativa. Nitrogênio de ultra alta pureza (Ultra-High-Purity - UHP) foi usado como um gás de envoltura e auxiliar a razão de fluxos de 55 psi para o gás de envoltura e 25 unidades para auxiliar. A temperatura de desovação foi 350°C e a temperatura da fonte foi 350°C. A deteção de cada analito foi alcançada através de monitoramento de reação selecionada (Selected Reaction Monitoring -SRM). Modo de ionização positiva foi usado para quantificar o composto de teste e o padrão interno. Argon UHP a uma pressão de l,.5xl0“3 torr foi mantida na célula de colisão de quadripole 2. O monitoramento de transições para um composto da presente invenção e seu padrão interno foram registrados.
A potência in vivo em macaco cinomólogo de compostos de teste, e a indução máxima ABCG1 derivada dos desenhos de concentração de plasma do composto em 5 horas após dosagem verso dobra de indução mRNA em 5 horas após dosagem são mostradas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2
Figure img0051
Exemplos 4 e 9 da presente invenção são cerca de quatro a sessenta vezes mais potente que um composto conhecido no assunto depois de dosado em macacos cinomólogos. Similarmente, Exemplos 4 e 9 indução ABCG1 mRNA em sangue para uma máxima de cerca de seis e nove vezes comparado para cerca de doze vezes para um composto conhecido no 5 assunto assim demonstrando parcial Atividade LXR no sangue de macacos cinomólogos.
É entendido gue os exemplos e concretizações descritas neste documento são somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou trocas a luz destas serão 10 sugeridas por pessoas experientes no assunto e são para ser incorporadas dentro do espirito e competência desta aplicação e escopo das reivindicações anexadas. Todas as Publicações, Patentes, e Aplicações de Patentes citadas neste documento são neste documento incorporadas por 15 referência para todos os propósitos.

Claims (10)

1. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, caracterizado por: ser selecionado dentre:
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Figure img0053
2. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 1, caracterizado por: ser selecionado dentre:
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Figure img0055
3. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 1, caracterizado por: ser selecionado de:
Figure img0056
Figure img0057
4. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 1, caracterizado por: ser selecionado de:
Figure img0058
Figure img0059
5. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 4, caracterizado por ser 2-(1-(3-cloro-3'-fluor-4'-(hidroximetil)-5'-(metilsulfonil)bifenil-4-il)-2-(2-(2,6- diclorofenil)propan-2-il)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol.
6. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 4, caracterizado por ser 2-(2-(2-(2-cloro-3-fluorfenil)propan-2-il)-1-(3'-fluor-4'-(hidroximetil)-5'- (metilsulfonil)bifenil-4-il)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol.
7. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 4, caracterizado por ser 2-(2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1 -(3'-fluor-4'-(hidroximetil)-5'- (metilsulfonil)bifenil-4-il)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol.
8. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 4, caracterizado por ser 2-(2-(2-(2,6-diclorofenil)propan-2-il)-1 -(3,3'-difluor-4'-(hidroximetil)-5'- (metilsulfonil)bifenil-4-il)-1H-imidazol-4-il)propan-2-ol.
9. Composto, composto marcado isotopicamente, ou sal farmaceuticamente aceitável destes, da reivindicação 4, caracterizado por ser 2-{2-[1-(2,6-diclorofenil)etil]-1-[3,3'-difluor-4'-(hidroximetil)-5'- (metilsulfonil)bifenil-4-il]-1H-imidazol-4-il}propan-2-ol.
10. Composição caracterizada por:compreender um composto das reivindicações 1 a 9, um composto marcado isotopicamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
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