BRPI1009855A2 - método para determinação da sensibilidade ao irinotecano e uso do mesmo - Google Patents

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Masahiko Nishiyama
Keiko Hiyama
Keiji Tanimoto
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Saitama Medical University
Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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Abstract

  MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE AO IRINOTECANO E USO DO MESMO. Fornecer um método para determinação da sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, cujo método pode determinar a resposta terapêutica do indivíduo e fornecer um novo meio terâpeutico de câncer empregando o método. O método para determinação de sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou sais inclui medida dos níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene EIFAX, gene C12orf30, gene DDX54, gene PTPN2, gene TBX3 em um espécime, e cálculo da melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progressão (dias) a partir das fórmulas (1) e (3).

Description

f “MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE AO IRINOTECANO E USO DO MESMO” Campo Técnico A presente invenção está relacionada a um método de determinação de sensibili- dade para julgar se câncer tem ou não uma resposta terapêutica ao irinotecano, SN-38, e/ Ou seus sais, e para usos dos mesmos. Antecedente da Técnica Agentes anti-câncer têm vários tipos, tais como, agente alquilantes, um agente de W platina, um antimetabólito, um antibiótico anti-câncer, e uma planta anti-câncerígena alcalói- de. Estes agentes anti-câncer são efetivos para alguns cânceres mais não são efetivos para 7 outros cânceres. Mesmo quando um agente anti-câncer é confirmado como sendo efetivo para certo câncer, o agente anti-câncer é efetivo para alguns indivíduos e não efetivo para outro indivíduos. O parâmetro mostrando se o agente anti-câncer exibe ou não efeito no câncer de um indivíduo especifico é chamado sensibilidade ao agente anti-câncer. Cloridrato de irinotecano (CPT-11) é um agente anti-câncer que tem sido desenvol- vido no Japão e que possui mecanismo de ação baseado na inibição da topoisomerase |. No Japão, CPT-11 indicado para câncer pulmonar de células não pequenas, câncer pulmonar de pequenas células, câncer cervical, e câncer no ovário foi aprovado como uma droga efe- tiva em janeiro de 1994. Ainda, CPT-11 indicado para câncer gástrico, câncer coloretal, cân- cerdemama, carcinoma de células escamosas, e linfoma maligno foi aprovado em Julho de
1995. CPT-11 em terapias de múltiplas drogas tem sido reconhecido ser um da quimiotera- pia padrão, em particular, como a droga de primeira linha ou uma droga de segunda linha para câncer cólon retal em todo o mundo, e a eficácia de CPT-11 tem sido estabelecida. Enquanto isso, desempenho clínico incluindo taxas de sobrevivência atingidas por — quimioterapia de câncer avançado ou metástico com Cloridrato de irinotecano tem sido dras- ticamente melhorado através de uma terapia de combinação empregando uma droga chave tal como CPT-11 ou oxaliplatina, a qual foi desenvolvida no anos 1990, e uma droga flúor- piridina tal como fluoracil (5-FU), a qual! tem sido uma droga principal para a terapia de cân- cer colorretal. Entretanto, a taxa de respota de tal quimioterapia é tão baixa quando cerca de ó 30 50%. Istoé, a quimioterapia não é efetiva para metade dos indivíduos para quem um agente anti-câncer tem sido administrado com altos riscos tais como eventos adversos sérios. As- Í sim, há uma demanda urgente para estabelecimento de um método para predição da sensi- bilidade de um indivíduo a um agente anti-câncer, cujo método permite a determinação de resposta terapêutica de indivíduos individuais (isto é, indicação de um indivíduo que respon- —deouquenão responde). Geralmente, o esquema terapêutico de quimioterapia de câncer requer um longo período de tempo. Depois da repetição de vários cursos de quimioterapia enquanto surgi-
' 2 * mento de eventos adversos é monitorado, realização de efeitos terapêuticos e continuação da terapia são avaliados.
A avaliação requer um longo período de tempo e alto custo médi- co, e os eventos adversos têm sido, na verdade, observados a um certo grau.
Assim, se há meios de prever se indivíduos individuais podem ou não podem receber o efeito de quimio- terapia antes ou em um estágio precoce da terapia, a carga dos indivíduos e o surgimento de efeitos adversos pode ser reduzido ou suavizado, levando a redução do custo medico.
Embora o próprio CPT-11 tenha atividade anti tumor, CPT-11 é ativado por carboxil esterase no corpo, para assim formar 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38), que tem ativi- ' dade anti-tumor de 100 vários milhares de vezes mais forte comparada aquela de CPT-11. A co-presença de CPT-11 e SN-38 no corpo é pensada prover um efeito anti-tumor.
Em he- 7 patócitos, SN-38 é glucuronidado por UDP-glucuronosiltranferase (UGT), para assim formar SN-38 glucuronato conjugado (SN-38G) não tendo citotoxidade.
SN-38G é excretado princi- palmente na bile e então transferido ao trato intestinal, e finalmente excretado nas fezes.
Uma porção de SN-38G excretada no trato intestinal é desconjugada por B-glucuronidasede bactérias entéricas, para assim formar SN-38 ativa novamente.
O assim formado SN-38G é metabolizado e excretado via os passos da reabsorção pela mediação de um transportador presente no epitélio do trato intestinal, circulação enteropática, glucuronidação pelo UGT nas células epteliais intestinais, e semelhantes (Documento Não-Patente 1). No curso deste metabolismo, o SN-38G danifica a mucosa intestinal, para assim possivelmente induzir diar- réia.
Também, alguns estudos revelaram que SN-38 afeta adversamente a medula óssea, onde a divisão de células ativas ocorre, para assim induzir eritrocitopenia, leucocitopenia e trombocitopenia.
Uma causa para efeitos adversos tal como séria diarréia e neutropenia foi confir- mada ser uma mudança na quantidade de exposição de SN-38 no corpo causado por poli- —morfismo genético de UGT1A1. Entretanto, em relação aos efeitos terapêuticos, não houve relato que o efeito terapêutico pode ser previsto baseado na farmacocinética, devido a com- plexidade na farmacocinética in vivo de CPT-11, a qual inclui conversão de CPT-11 (pró- droga) a SN-38 (metabólito ativo) e suas detoxicações; regeneração de SN-38 no curso da circulação enteropática; e metabolismo de CPT-11 e formação de SN-38 a partir de seus é 30 metabólitos.
Enquanto isso, foi relatado que o nível de expressão MRNA de carboxilesterase nas células mononucleares de sangue periférico correlaciona-se com a proporção de AUC ' para SN-38, mas não se correlaciona com o efeito de regressão do tumor (Documento Não Patente 2). Também tem sido relatado os seguintes fatores relacionados a sensibilidade ou re- sistênciaaCPT-11: mutação da topoisomerase |, a qua! é o alvo de SN-38, e seus níveis de expressão; atividade da carboxilesterase, a enzima envolvida na conversão de CPT-11 a SN-38; genes do transportador ABC (proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP)-1,
bi 3 N MRP-2, e proteína resistente ao câncer de mama (BCRP)/ABCG2), a qual afeta as quanti- dades de acúmulo intracelular de CPT-11 e SN-38; e os genes da família BCL2 (Documento de Patente 1). Estudos têm sido conduzidos na correlação de antígenos de proliferação ce- lular Ki-67, gene supressor de tumor TP53 etc com resposta à terapia de CPT-11. Recente- mente, um estudo clínico revelou que o nível de plasma do tecido inibidor de metaloprotei- nase-1 (TIMP-1), o TIMP-1 tendo ação anti-apoptose, é significantemente correlacionado com o prognóstico clínico de um indivíduo de câncer colon-retal metastático tendo passado por terapia de combinação CPT-11 + 5-FU (Documento Não-Patente 3). Como descrito aci- ' ma, muitos estudos tem sido realizados na sensibilidade de CPT-11 predizendo biomarca- —dorese métodos de predição de sensibilidade, devido às suas necessidades. Entretanto, um | " estudo revelou que nenhuma das topoisomerase | (alvo) ou timidilato sintase (possível fator de predição de sensibilidade 5-FU) tem clara correlação com resposta terapêutica em tera- pia de combinação 5-FU + CPT-11 (Documento Não-Patente 4). Portanto, nenhum biomar- cador ou método de predição de sensibilidade o qual definitivamente prevê resposta tera- —pêuticafoiestabelecido. Documento Antecedente da Técnica Documentos de Patente Documento Patente 1: WO 2005/78100 Documentos Não Patentes Documento Não Patente 1: Câncer Res. 1991; 51: 4187-4191 Documento Não Patente 2: Clin. Câncer Res. 2005; 11: 6901-6907 Documento Não Patente 3: Clin. Câncer Res. 2007; 13: 4117-4122 Documento Não Patente 4: Int. J. Câncer 2004; 111: 252-258 Resumo da Invenção
PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO Um objeto da presente invenção é para prover um método para determinação da sensibilidade do indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, cujo método pode determinar a resposta terapeutica do indivíduo. Outro objeto é prover um novo meio terapêutico de câncer empregando o método. ' 30 Meios de Resolver os Problemas Em vista do precedente, os inventores presentes têm investigado detalhadamente, Ê pelo uso de culturas de células de câncer humano, expressão de gene sob adição de SN-38 aos mesmo e sensibilidade a SN-38, onde genes concebivelmente envolvidos na sensibilidade foram específicados. Então, testes clínicos humanos foram realizados sob administração única de CPT-11, para assim investigar um método para determinação da sensibilidade de um indivíduo ao CPT-11 por uso dos genes específicados. Como um resultado, os presentes inventores têm encontrado que os parâmetros de sensibilidade de
' 4 HÁ um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais ; específicamente, a melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progressão (dias), podem ser calculados pela inserção de níveis de expressões dos sete genes em uma fórmula de cálculo específica. Baseados nesta descoberta, os inventores investigaram adicionalmente, e descobriram que, por determinação dos níveis de expressão do gene de uma bioamostra derivada de um indivíduo com câncer e colocando os níveis na fórmula de cálculo, o indivíduo de câncer tendo ou não sensibilidade ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais pode ser determinada ; que, empregando um aumento no valor obtido a partir do '" cálculo da fórmula como um índice, um agente amplificador de sensibilidade pode ser selecionado através de triagem ; e que, empregando o agente amplificador de sensibilidade É em combinação com o irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, os quais são os alvos do aumento de sensibilidade, os efeitos terapêuticos do agente anti-câncer podem der aumentados notavelmente. A presente invenção foi realizada nas bases destas descobertas. Consequentemente, a presente invenção provê um método para determinação da sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, o método compreendendo medida dos níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene EIF1AX, gene C120rf30, gene DDXS4, gene PTPN2, gene TBX3 em um espécime, e cál- culo da melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) a partir das seguintes fórmulas (1) a (3): Melhor taxa de resposta ao tumor (%) = 139,49 — 12,089xA -84,477xB — 12,737xC + 85,900xD — 29,1 19xE — 6,8630xF + 20,303xG - (1); Sobrevivência geral (dias) = 512,78 — 192,11xA — 120,78xB + 134,53xC - 11,883xD + 157,24xE + 31,962xF — 386,55xG + (2) e Sobrevivência livre de progressão (dias) = 68,076 + 78,277xA — 57,358xB - 15,011xC+8,9798xD + 73,077xE — 38,961xF — 43,313xG + (3) (onde A representa um nível de expressão do gene AMD1 ; B representa um nível de expressão do gene CTSC ; C representa um nível de expressão do gene EIFIAX; D representa um nível de expressão do gene C120rf30; E representa um nível de expressão do gene DDXS54; F representa um nível de expressão do gente PTPN2; e G representa um i 30 —nívelde expressão do gene TBX3).
. A presente invenção também fornece um kit para determinação da sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, onde o kit compreende (A) reagentes de ensaio para medir os níveis de expressão de sete genes, e (B) um protocolo para cálculo da melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) das fórmulas (1) a (3). A presente invenção também provê um método para seleção de um agente amplificador de sensibilidade para irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, o método o E A O ET OSS SS SS a RA A DN SRA RR Ne NR!NANRNNi SRU RRRAO , 5 “ compreendendo medição dos níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene EIF1AX, gene C120rf30, gene DDX54, gene PTPN2, e gene TBX3 em um espécime, eem- prega, como um índice, um aumento em qualquer uma das melhores taxas de resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) obtidos a partirdasfórmulas (1) a(3). A presente invenção também fornece um agente amplificador de sensibilidade para irinotecano, SN-38, e/ou seus sais obtidos através do método de triagem.
A presente invenção também provê uma composição para terapia de câncer com- F preendendo o agente amplificador de sensibilidade e irinotecano, SN-38, e/ou seus sais.
Efeitos da invenção í De acordo com o método da presente invenção para determinação da sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, a resposta terapêutica do agente anti-câncer de um indivíduo pode ser determinada antes da administração ou em um estágio inicial depois da administração do agente anti-câncer.
Como resultado, um agente anti- câncertendo um efeito terapêutico mais alto pode ser selecionado, e progressão de câncer e agravação de efeitos adversos, os quais resultam de contínua administração de agente anti-cancerígeno exercendo nenhum efeito terapeutico esperado, pode ser prevenido.
Então, reduções nas aflições do indivíduo e custo médico podem ser esperadas.
Através do emprego de métodos de determinação da sensibilidade, uma droga a qual aumenta a sensibilidade para irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, pode ser selecionada através de triagem.
Pelo emprego do agente amplificador de sensibilidade em combinação com o irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, o efeito terapêutico do câncer pode ser notavelmente aumentado.
Breve descrição dos desenhos Fig. 1 - Um gráfico mostrando uma fórmula para predição do efeito in vitro de SN- 38, estabelecido a partir dos níveis de expressão de cinco genes conhecidos e sete novos genes.
Fig. 2 - Um gráfico mostrando uma fórmula para predição da melhor taxa de resposta do tumor (%) sob administração única de irinotecano, estabelecida a partir do nível ' 30 — deexpressão de cinco genes conhecidos, e mostrando o limite da predição.
Fig. 3 - Um gráfico mostrando uma fórmula para predição da sobrevivência livre de progressão (dias) sob administração única de irinotecano, estabelecido a partir do nível de expressão de cinco genes conhecidos, e mostrando o limite da predição.
Fig. 4 - Um gráfico mostrando uma fórmula para predição da sobrevivência geral —(dias)sob administração única de irinotecano, estabelecido a partir do nível de expressão de cinco genes conhecidos, e mostrando o limite da predição.
Fig. 5 - Um gráfico mostrando uma fórmula para predição da melhor taxa de
TFT E A E a A A REA oo as O E E E O aí AA AA RO a , 6 Áá resposta do tumor (%) sob administração única de irinotecano, estabelecido a partir do nível de expressão de sete novos genes, e mostrando a utilidade da predição.
Fig. 6 - Um gráfico mostrando uma fórmula para predição da sobrevivência livre de progressão (dias) sob administração única de irinotecano, estabelecido a partir dos níveis de expressão de sete novos genes, e mostrando a utilidade da predição.
Fig. 7 - Um gráfico mostrando uma fórmula para predição da sobrevivência geral (dias) sob administração única de irinotecano, estabelecido à partir do nível de expressão de sete novos genes e mostrando à utilidade da predição. 1 Modos de Executar a Invenção O método da presente invenção para determinação da sensibilidade de um z indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais pode ser executado pela medida dos níveis de expressão dos sete genes acima mencionados em um espécime, e cálculo da melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) pela inserção dos níveis de expressão nas fórmulas (1) a (3). Os sete genes empregados na presente invenção foram previamente pensados para se relacionarem a sensibilidade a SN-38 em um sistema empregando células de câncer humanas em culturas.
Entretanto, quando a sensibilidade de indivíduos humanos ao CPT-11 foi estudada em testes clínicos atuais, cada gene não refletiu sensibilidade ao CPT-11. Então, uma análise de regressão múltipla foi realizada entre o nível de expressão de cada gene nos espécimes obtidos no teste clínico e a taxa de melhor resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progressão (dias) do indivíduo relevante (veja Shimokuni T e outros, "Chemosensitivity prediction in esophageal squamous cell carci- noma: novel marker genes and efficacy-prediction formulae using their expression data." Int.
J.
Oncol. 2006. 5.). A análise revelou que os valores obtidos pela inserção dos níveis de expressão dos sete genes acima mencionados nas fórmulas (1) a (3) têm consideravelmen- te alta correlação com a taxa de melhor resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progressão (dias). Portanto, através da medida dos níveis de expres- são dos sete genes acima mencionados no espécime e inserção das medições nas seguin- tes fórmulas (1) a (3), a sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais ' 30 pode ser determinada, onde a melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progressão (dias) podem ser previstos. ' Melhor taxa de resposta ao tumor (%) = 139,49 — 12,089xA -84,477xB — 12,737xC + 85,900xD — 29,1 19xE — 6,8630xF + 20,303xG - (1); Sobrevivência geral (dias) = 512,78 — 192,11xA — 120,78xB + 134,53xC — 11,883xD+157,24xE +31,962xF-386,55xG - (2) e Sobrevivência livre de progressão (dias) = 68,076 + 78,277xA — 57,358xB - 15,011xC + 8,9798xD + 73,077xE — 38,961xF — 43,313xG - (3)
TAIT A A A A A A A A EA EDER RD EA AEE E AEE A E E EDER EE E EAR E A aaa A) AA RA NA NA RR RR Rss ssssseess ? 7 f (em que A representa um nível de expressão do gene AMD1 ; B representa um nível de expressão do gene CTSC ; C representa um nível de expressão do gene EIFIAX ; D representa um nível de expressão do gene C120rf30; E representa um nível de expressão do gene DDX54; F representa um nível de expressão do gene PTPN2; e G representa um
5. nívelde expressão do gene TBX3).
Na presente invenção, gene AMD1 refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeo definida por Acesso GenBank No. NM 001634, ou um homó- logo do gene; Gene CTSC refere-se a um gene expressando mRNA tendo sequências nucleotídi- 10 cas definidas por Nos. de Acesso GenBank NM 148170 e NM 001814, ou um homólogo do gene; Gene EIF1AX refere-se a um gene expressando mRNA tendo sequências nucleo- tídicas definidas por No. de Acesso GenBank NM 001412, ou homólogo do gene; Gene C1201rf30 refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência nu- — cleotídica definida por No. de Acesso GenBank NM 024953, ou homólogo do gene; Gene DDX54 refere-se a um gene expressando mRNA tendo sequência nucleotídi- ca definida por No. de Acessi GenBank NM 024072, ou um homólogo do gene; Gene PTPN?Z refere-se a um gene expressando mRNA tendo sequências nucleoti- dicas definidas por Nos. de Acesso GenBank NM 080422, ou um homólogo do gene; e Gene TBX3 refere-se a um gene expressando mRNA tendo sequências nucleotídi- cas definidas por Nos. de Acesso GenBank NM 005996 e NM 016569, ou um homólogo do gene.
Como aqui utilizado, o termo “gene” refere-se não somente a fita dupla de DNA mas também a fila simples de DNA formando a fita dupla de DNA tal como uma fita de sentido ou umfitade anti-sentido. Nenhuma limitação particular foi imposta no comprimento do DNA . Exemplos do ácido nucléico (polinucleotídeo) incluem RNA e DNA. Exemplos específicos de DNA incluem cDNA, DNA genômico, e DNA sintético, e exemplos específicos de RNA inclu- em mRNA, rRNA e siRNA. O termo “polinucleotídeo” também compreende um oligonucleo- tídeo consistindo de uma pluralidade de nucleotídeos ' 30 Para executar o método da presente invenção para determinar a sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, os níveis de expressão dos sete genes ' acima mencionados em um espécime são medidos, e as medidas são inseridas nas formu- las (1) a (3). Exemplos do espécime incluem bioamostras derivadas a partir de um sujeito tendo câncer (indivíduo de câncer) tal como sangue, soro, plasma, urina, células e tecidos tumorais, ascites, fluídos pleurais, fluídos cerebroespinhais, fezes, e escarro. Entre eles, tecido tumoral é particularmente preferido. O espécime pode ser tratado com um método conhecido apropriado e empregado como um extrato de tecido, uma preparação de tecido
O O A SOOU a A RA QN RRRRSRNRRRUNRUANREENNRNQRRBAUQUNRRORORRNANO RR , 8 7 etc.
Exemplos do câncer para o qual a presente invenção é aplicada incluem câncer de lábio, oral, e cânceres de faringe, tipicamente, câncer de faringe; cânceres digestivos tais como câncer de esôfago, câncer gástrico e câncer colorretal; cânceres de órgãos respirató- rioseintratorácicos tais como câncer de puimão; cânceres de cartilagem articular e dos os- sos; melanoma maligno; carcinoma de células escamosas, e outros cânceres de pele; cân- ceres de tecidos leves e mesoteliais tal como mesoteliona; cânceres de genital feminina tal como câncer de mama, câncer uterino e câncer de ovário, cânceres de genital masculino tal . como câncer de próstata, cânceres de trato urinário tal como câncer de bexiga; cânceres de olhos, cérebro, e de sistema nervoso central tal como tumor no cérebro; câncer de tireóide e 7 outro cânceres endócrinos; cânceres de tecido linfóide, tecido hematopoiético, e outros cân- ceres de tecidos relacionados tal como linfoma de não deHodgkin e leucemia linfóide; e cânceres metatásticos a partir dos cânceres acima mencionados como focos primários. En- tre eles, a presente invenção é preferivelmente aplicada a câncer pulmonar de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer cervical, câncer de ovário, câncer gástrico, câncer colon-retal, carcinoma de célula escamosa, e linfoma maligno, particular- mente preferivelmente a câncer colorretal. Particularmente preferivelmente, a presente in- venção é aplicada ao câncer sem quimioterapia.
O nível de expressão gênica pode ser medido pelo uso de uma sonda ou iniciador que pode detectar os genes da presente invenção ou seus mMRNA, em que o número de có- pia ou nível deexpressão de um gene alvo é determinado através do método de hibridização southern, o método de microarray de DNA, o método PCR em tempo real, o método RT- PCR, ou semelhantes. Também, o polipeptídeo codificado pelo gene pode ser empregado como um alvo de medição. Embora nenhuma limitação particular seja imposta no alvo de medição, enquanto o alvo reflete o nível de expressão do gene, mRNA do gene alvo é prefe- rivelmente empregado como um alvo de medição. Como aqui utilizado, a “medida do nível de expressão do gene” também compreende a confirmação da presença de expressão do gene.
Em seguida, o método PCR será descrito em detalhes. No caso onde mRNA é em- , 30 pregado como alvo de medida, se requerido, o espécime é sujeito a tratamentos prelimina- res conhecidos, tais como filtração, centrifugação, e tratamento cromatográfico. Então, RNA É pode ser extraído a partir do espécime através de um método geralmente empregado tal como o método de ultracentrifugação de cloreto de guanidina-césio, o método de clorofórmio guanidina-fenol acídico (método AGPC), o método de esferas magnéticas, ou o método de colunade sílica. Extração de RNA pode também ser realizada por meios de um Kit comercial (QIAGEN RNeasy KIt, TRIZOL etc.).
O nível de mMRNA pode ser determinado através, por exemplo, de (1) determinação
7 da quantidade de produto de amplificação obtido através do PCR empregando um fragmen- to de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com o mMRNA alvo e um RNA deri- vado a partir de um espécime; (2) determinação da eficiência de hibridização entre um frag- mento de ácido nucléico o qual pode hibridizar especificamente com o mRNA alvo e um —RNA derivado a partir do espécime; ou (3) outros métodos de quantificação conhecidos.
No caso de PCR, o “fragmento de ácido nucléico o qual pode hibridizar específica- mente com o mMRNA alvo” pode ser desenhado pela comparação da sequência de nucleotí- deos do gene alvo com a sequência de nucleotídeo de outro gene selecionando uma se- " quência específica para MRNA do gene alvo. A sequência de nucleotídeo de MRNA do gene alvo pode ser obtida com referência a, por exemplo, um banco de dados (por exemplo., GenBank). Alternativamente, a sequência de nucleotídeo é alinhada por meio de um pro- grama (por exemplo, Clustal X), e uma sequência específica é visualmente selecionada. Nenhuma limitação particular é imposta no comprimento do fragmento de ácido nucléico. Entretanto, um fragmento de ácido nucléico consintindo de 5 a 50 bases é preferido, com um fragmento de ácido nucléico consistindo de 18 a 25 bases contínuas sendo mais preferi- do.
O fragmento de ácido nucléico que pode ser hibridizado com mRNA do gene alvo não está limitado à sequência assim designada, e aqueles versados na técnica podem con- ceber outros equivalentes na base de senso técnico comum. Tais equivalências incluem um fragmento de ácido nucléico tendo uma sequência nucleotídica complementar à sequência então desenhada, e um fragmento de ácido nucléico o qual possui sequência de nucleotídeo homóloga a qualquer uma das sequências acima e a qual pode ser empregada para deter- minação no nível de mMRNA do gene alvo. Exemplos de tais equivalentes incluem (a) um fragmento de ácido nucléico o qual possui sequência de nucleotídeo equivalente a sequên- ciade nucleotídeo, exceto que 1 a 10, preferivelmente 1 ou várias bases são substituídas, adicionadas ou deletadas; (b) um fragmento de ácido nucléico o qual possui uma sequência de nucleotídeo tendo uma identidade de 90% ou mais, preferivelmente 95% ou mais, mais preferivelmente 99% ou mais, para a sequência de nucleotídeo; e (c) um fragmento de ácido nucléico o qual tem uma sequência de nucleotídeo a qual hibridiza, sob condições rigorosas, ' 30 como fragmento de DNA tendo uma sequência de nucleotídeo complementar à sequência de nucleotídeo.
O fragmento de ácido nucléico pode ser um fragmento de ácido nucleico no qual qualquer número, preferivelmente 100 ou menos, mais preferivelmente 20 ou menos, ainda mais preferivelmente 10 ou menos das bases são adicionadas a uma ou duas de suas ter- minações, preferivelmente à terminação 5.
O fragmento de ácido nucléico assim desenhado pode ser, por exemplo, artificial- mente sintetizado, de acordo com a sua sequência de nucleotídeo, por meio de um sinteti-
: 10 Z zador de DNA.
Preferivelmente, a especificidade do fragmento de ácido nucléico é confir- mada depois da síntese.
Quando o MRNA alvo é empregado como um padrão, a especifici- dade pode ser confirmada pela presença de um amplicon específico de PCR, o qual não é obtido no caso de uma certa referência.
No caso do gene AMD1, exemplos de tais fragmentos de ácido nucléicos incluem um fragmento de ácido nucléico tendo uma parte da sequência nucleotídica definida por No.
Acesso GenBank NM 001634 ou tendo uma sequência nucleotídica complementar a se- quência nucleotídica, e um fragmento de ácido nucléico o qual possui uma sequência nucle- ' otídica homóloga a qualquer das sequências acima e a qual é funcionalmente equivalente aofragmento de ácido nucléico acima.
Exemplos do framento de ácido nucléico que possu- : em sequências de nucleotídeo homólogas a qualquer das sequências acima que são funci- onalmente equivalentes ao fragmento de ácido nucléico acima incluem os seguintes frag- mentos de ácido nucléico (a) a (c) os quais podem ser empregados para determinação do nível de mRNA do gene alvo.
O mesmo é aplicado aos casos de genes outros que não o gene AMD.
Exemplos específicos incluem (a) um fragmento de ácido nucléico o qual tem uma sequência de nucleotídeo equivalente a uma parte da sequência de nucleotídeo defini- da pelo No.
Acesso GenBank NM 001634 ou uma sequência de nucleotídeo comprementar a sequência de nucleotídeo, exceto que 1 ou várias bases são deletadas, substituídas ou adicionadas; (b) um fragmento de ácido nucléico o qual possui sequência de nucleotídeo tendo uma identidade de 90% ou maior, preferivelmente 95% ou maior, mais preferivelmente 99% ou maior, a uma parte da sequência de nucleotídeo definida por No. de Acesso Gen- Bank NM 001634 ou uma sequência de nucleotídeo complementar à sequência de nucleo- tídeo; e (c) um fragmento de ácido nucléico o qual possui uma sequência de nucleotídeo que hibridiza, sob condições rigorosas, com o fragmento de DNA tendo uma parte da se- —quência de nucleotídeo definida por No. de Acesso GenBank NM 001634 ou uma sequên- cia de nucleotídeo complementar à sequência de nucleotídeo.
A identidade de uma sequência de nucleotídeo é calculada por meio de um pro- grama de análise de homologia, GENETYXº.
O termo “condições rigorosas” refere-se a dois fragmentos de DNA sendo hibridiza- ' 30 dos com cada um sob condições de hibridização padrões como descrito por Sambrook J. e outros. (Expression of cloned genes in E. coli (Molecular Cloning: A laboratory manual (1989)), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.47-9.62 e 11.45-11.61). O nível de mRNA de um espécime pode ser determinado através de PCR empre- gando os fragmentos de ácido nucléico assim produzidos e RNA derivado do espécime, pre- feriveimente através de RT-PCR em tempo real incluindo um passo de produção de cDNA a partir de MRNA.
RT-PCR pode ser realizado de acordo com uma técnica conhecida tal como RT-PCR de dois passos ou RT-PCR de um passo.
De pontos de vista de simplicidade e
: n bd prevenção de contaminação cruzada, RT-PCR de um passo é preferido. RT-PCR de um passo pode ser realizado por meio de, por exemplo, um kit comercial (por exemplo, QIAGEN One-Step RT-PCR kit). Como a enzima tendo atividade de transcrição reversa a qual pode ser empregada na reação RT, uma variedade de transcriptases reversas tal como transcrip- tase M-MHV reversa podem ser empregadas. A DNA polimerase, a qual é empregada em PCR para amplificação de um fragmento de DNA, preferivelmente tem resistência ao calor (290ºC). Em um modo de tal PCR, reação de desnaturação térmica (fita dupla de DNA para 1 fita simples de DNA) é realizada de 90 a 98ºC, reação de anelamento para hibridização de um iniciador para padrão de cDNA é realizada de 37 a 72ºC, e reação de extensão na qual ' ação da DNA polimerase é realizada a 50 a 75ºC. O conjunto de reações (ciclo) é realizado uma vez para algumas dezenas de vezes. Uma condição de reação preferida inclui desnatu- ração térmica a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 60ºC por 30 segundos, e extensão a 72ºC por 40 segundos. Em PCR, dois iniciadores são preferivelmente utilizados em combi- nação. Neste caso, os dois iniciadores devem ser selecionados para formar uma combina- ção de uma fita de senso e uma fita anti senso. O fragmento de ácido nucléico da presente invenção pode servir como uma sonda, e pode ser usado em combinação com outros inicia- dores universais conhecidoas, oligonucleotídeos etc.
A amostra de espécime contendo mRNA servindo como um padrão para RT-PCR preferiveimente tem uma quantidade total de RNA de 1 pg a 1ug, mais preferivelmente 2 ng a 50 ng.
Quando PCR tem procedimento adequado, a “quantidade amplicon de PCR e o “número de ciclo de PCR” são geralmente correlacionados com a “quantidade padrão de PCR”. Então, o nível de MRNA de um gene alvo; isto é, o nível de expressão do gene alvo, pode ser calculado a partir da quantidade de amplicon produzida em PCR e o número de ciclos de PCR.
Nenhuma limitação particular é imposta no método de determinação da quantidade de amplicon de PCR e o número ciclo de PCR, e qualquer método pode ser empregado. Por exemplo, o número de ciclo de PCR pode ser contado quando o nível de DNA alcançou um i 30 nível pré-determinado. Este procedimento pode ser feito por, por exemplo, determinação do J número de ciclo de PCR quando a intensidade de fluorescência alcançou um nível pré- determinado em um método combinatório incluindo o método PCR no qual um amplicon de PCR é marcado e o método PCR no qual o marcador é monitorado com o tempo. Em um procedimento típico, a marcação é realizada pelo uso de um corante fluorescente, e o mar- —cadoré monitorado pela medida da intensidade de florescência. Em um modo de marcação com corante fluorescente, um corante fluorescente intercalante tal como SYBR (R) Green | pode ser empregado. Desde que o corante intercalante aumente a intensidade de fluores-
: 12 7 cência via intercalação com um ácido nucléico de fita dupla, uma intensidade de fluorescên- cia que reflete corretamente o nível de amplicon de PCR é obtido. Marcação com um coran- te fluorescente também pode ser realizada pelo uso de sonda TagMan, Moleculer Beacon etc., as quais são marcadas com um corante fluorescente. Uma sonda TaqMan ou Molecu- larBaconé uma sonda na qual um corante fluorescente e um extintor são ligados a um oli- gonucleotídeo tendo uma homologia a uma sequência interna de uma região a qua! é ampli- ficada através de PCR. A sonda é adicionalmente empregada em PCR. Desde que a fluo- rescência em resposta ao grau de PCR seja emitida através da interação entre o corante . fluorescente e o extintor ligado a sonda, o produto PCR formado através da amplificação — pode ser monitorado pela medição de intensidade de fluorescência a cada estágio de PCR. '" Como descrito acima, o nível de MRNA do gene alvo de um espécime pode tam- bém ser determinado por, por exemplo, eficiência de hibridização entre o fragmento de ácido nucléico o qual pode hibridizar especificamente com um mRNA e RNA alvo derivado do es- pécime.
O fragmento de ácido nucléico o qual pode hibridizar especificamente com um gene MRNA alvo pode ser um fragmento de ácido nucléico como desenhado e produzido da ma- neira antes mencionada. O fragmento de ácido nucléico é preferivelmente um fragmento de ácido nucléico marcado. Exemplos do agente marcador incluem uma enzima, um íon para- magnético, biotina, um corante fluorescente, um cromófero, um metal pesado, e um rádio isótopo. Um marcador preferencial é uma enzima. Exemplos da enzima incluem peroxidase de rabanete silvestre e fosfatase alcalina. A marcação pode ser realizada através de um método conhecido. Através da determinação do grau de hibridização entre uma amostra contendo RNA derivado de um espécime e o fragmento de ácido nucléico, o gene MRNA alvo do espécime pode ser determinado através de um método de cálculo conhecido. Ne- —nhuma limitação particular é imposta no método de determinação do grau de hibridização, e isso pode ser determinado de acordo com um método conhecido, por exemplo, medindo uma ligação de marcador ao fragmento de ácido nucléico. Isso é, quando um fragmento de ácido nucléico marcado com um corante fluorescente é usado, a intensidade de fluorescên- cia medida, por determinadação do grau de hibridização.
: 30 O nível de expressão de um gene alvo pode também ser determinado pelo uso, como uma sonda, de um fragmento de ácido nucléico o qual pode hibridizar especificamente ' com uma sequência de nucleotídeo do gene alvo ou seu mRNA. No caso do gene AMD1, pode ser usado, como uma sonda, um fragmento de ácido nucléico tendo uma parte da se- quência de nucleotídeo definida por No. de Acesso GenBank NM 001634 (ex, GCATGTGAGTGTTCCGACTTCATCTGTTCC) ou tendo uma sequência de nucleotídeo complementar a sequência de nucleotídeo, ou um fragmento de ácido nucléico o qual possui sequência de nucleotídeo homóloga a qualquer das sequências acima e que é funcional-
' 13 7 mente equivalente ao fragmento de ácido nucléico acima. Estas sondas podem ser imobili- zadas em qualquer fase sólida, para assim, fornecer um DNA chip, um gene chip, um micro- array cDNA, um oligo array DNA etc.
Outras que as sondas mencionadas anteriormente, também podem ser emprega- das, como uma sonda, uma combinação de uma pluralidade de fragmentos de ácido nucléi- co os quais são desenhados para específicamente detectar uma sequência de nucleotídeo do gene alvo ou seu mMRNA do mesmo e que pode especificamente hibridizar com uma plu- ralidade de regiões apropriadamente selecionadas de uma sequência de nucleotídeo do bh gene alvo ou seu mRNA. Nenhuma limitação particular é imposta na fase sólida a qual é empregada para ij imobilização de uma sonda, desde que a fase sólida possa imobilizar o polinucleotídeo. Exemplos das fases sólidas incluem placa de vidro, membrana de nilon, microesferas, um chip de silicone, e uma capilaridade. A fase sólida pode ser marcada. Nenhuma limitação particular é imposta no agente marcador, e um corante fluorescente, um rádio isótopo etc pode ser usado. Na imobilização do polinucleotídeo em uma fase sólida, um polinucleotídeo o qual tenha sido sintetizado antecipadamente pode ser colocado em uma fase sólida, ou um polinucleotídeo alvo pode ser sintetizado em uma fase sólida. Quando um microarray de DNA é selecionado, imobilização pode ser realizada por meio de um observador comercial ou semelhante, através de um método conhecido apropriado (impressão de polinucleotídeo —. através de método de jato de tinta, em síntese in situ, ou fotolitografia) dependendo do tipo de sonda a ser imobilizada.
O nível de expressão de um gene alvo pode ser determinado por hibridização do chip de DNA antes preparado ou semelhante com um DNA marcado ou RNA preparado de um RNA obtido de um espécime (por exemplo, células cultivadas, tecidos, seção de tecido, —oulisatode sangue) ou um DNA ou RNA marcado preparado diretamente a partir do espé- cime; e medição, como um sinal atribuído a sonda rotulada, a quantidade de fitas duplas formadas da sonda e o DNA ou RNA marcado. O sinal pode ser detectado através de um método de rotina, por exemplo, por meio de um contador de radiação, um detector de fluo- rescência etc.
' 30 Alternativamente, o nível de expressão de um gene alvo pode ser determinado através do método de microsferas. Por exemplo, os níveis de expressão de uma pluralidade de genes alvo podem ser simultaneamente determinados através do seguinte procedimento. Especificamente, sondas para mRNA derivado de genes alvo diferentes são imobilizadas em microsferas as quais foram marcadas com diferentes agentes de fluorescência. O MRNA dos genes alvo preparados a partir de um espécime (por exemplo, células cultivadas, teci- do, seção de tecido ou lisado de sangue) são hibridizados com elas, e cada gene alvo é es- pecíficamente detectado através da fluorescência a partir deste ponto. Também, uma sonda
: 14 7 marcada é hibridizada com mRNA de genes alvo os quais hibridizaram com as sondas imo- bilizadas nas microsferas, e o marcador da sonda é detectado, para assim determinar os níveis de MRNA.
Além disso, o número de cópias e o nível de expressão de um gene alvo pode ser determinado pelo uso da sonda antes mencionada através de um método conhecido (por exemplo, o método de hibridização southern, o método de hibridização northern, o método FISH, ou o método CGH). No caso onde um polipeptídeo codificado pelo gene alvo é medi- do, o nível de expressão do gene alvo pode ser determinado através de um método de imu- : nomarcação conhecido (o método ELISA, o método de western blotting, o método EIA, o método RIA, o método IHC, ou semelhantes) empregando um anticorpo específico ao poli- '" peptídeo.
Na determinadção da sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, os níveis de expressão dos genes alvo em uma bioamostra derivada do um indi- víduo com câncer antes e durante a administração de um agente anti-câncer são medidos, e amelhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) do indivíduo com câncer é calculada por qualquer uma das fórmulas (1) a (3). Quando o valor obtido é igual a ou maior que um valor de referência pré-determinado, o câncer tem sensibilidade ao agente anti-câncer, enquanto que quando o valo obtido é mais baixo do que o valor de referência, o câncer não tem qualquer sensibilidade ao agente anti- câncer.
O valor de referência pré-determinado pode ser apropriadamente modificado em acordo com as condições e tipo de câncer do indivíduo de câncer, o tipo de uma droga em- pregada em combinação com o irinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmo etc (ver Exemplos aqui abaixo). No caso de administração única de irinotecano, por exemplo, o valor de refe- rência da melhor taxa de resposta ao tumor (%) é preferivelmente 50%, a sobrevivência ge- —ral(dias) 400 dias, ea sobrevivência livre de progressão (dias) 100 dias.
Quando o valor obtido por qualquer uma das fórmulas (1) a (3) é mais baixo do que o correspondente valor de referência antes da administração de um agente anti-câncer, o câncer pode ser encontrado tendo nenhuma sensibilidade ao irinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmo.
Então, o efeito do agente não é esperado.
Se tal agente anti-câncer ineficiente é ' 30 continuamente administrado a um indivíduo com câncer, a progressão do câncer e o agra- vamento dos efeitos adversos podem ser antecipados.
Então, o método de determinação de ' sensibilidade da presente invenção contribui muito não apenas para determinação de possí- veis respostas terapêuticas provida por um agente anti-câncer mas também para prevenção da agravação de efeitos adversos os quais podem por outro lado ser causados por adminis- tração contínua de um agente anti-câncer ineficiente.
Particularmente, o método de determi- nação de sensibilidade da presente invenção pode ser adequadamente aplicado a um indi- víduo com câncer antes da administração de um agente anti-câncer.
Em adição, o método
: 15 * pode também ser empregado como um método para seleção de um indivíduo que é espera- do ser tratado por um agente anti-câncer.
Através da medida dos níveis de expressão dos genes alvo de uma bioamostra de- rivada de um indivíduo de câncer o qual está corresntemente recebendo um agente anti- câncere monitoramento dos valores obtidos das fórmulas (1) a (3) em cada ciclo de terapia, a sensibilidade do câncer ao agente anti-câncer pode ser avaliada com tempo, qual o mé- todo pode também servir como um método para determinação se a terapia deve ou não ser continuada. Quando o câncer não tem sensibilidade ao agente anti-câncer, um efeito farma- º cêutico do agente não é mais esperado, e apenas efeito adversos do agente anti-câncer são —concebivelmente providos. Então, o método de determinação da sensibilidade da presente 7 invenção pode também ser empregado para prevenção no início do efeito adverso não de- sejado e progressão do câncer e agravação de efeitos adversos os quais podem por outro lado ser causados por continuação de terapia ineficiente.
Em adição, a melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progressão (dias), exemplos do parâmetro o qual pode ser emprega- do para a determinação da sensibilidade incluem parâmetros relacionados a eficácia tais como duração da resposta geral (dias), duração da doença estável (dias), e tempo para fa- lha do tratamento (dias), e parâmetros relacionados aos efeitos adversos tais como concen- tração sanguínea, meia vida de eliminação, biodisponibilidade, área sob curva de tempo de concentração sanguínea (AUC), depuração, volume de distribuição etc. de irinotecano, SN- 38, e os metabólitos do mesmo.
O método da presente invenção pode também ser executado por meio de um kit para execução do método; isto é, um kit de determinação de sensibilidade. O kit de determi- nação de sensibilidade contém (A) reagentes de ensaio para medida dos níveis de expres- — sãodos sete genes, e (B) um protocolo para cálculo da melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias). Uma modalida- de dos reagentes de ensaio para medida dos níveis de expressão dos sete genes (A) con- tém (A1) um protocolo no qual um método para medida dos níveis de expressão dos genes alvo é descrito, (A2) um reagente para medida dos níveis de expressão dos genes alvo, a : 30 —(A3)um DNA chip dentro do qual um fragmento de áciso nucléico que pode especificamente hibridizar com mRNA do genes alvo foram imobilizados. Uma modalidade do protocolo (B) Á contém (B1) um protocolo para cálculo da melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevi- vência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) a partir das fórmulas (1) a (3) e (B2) valores de referência para determinação se um indivíduo tem ou não sensibilidade ao irinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmo. A referência inclui valores de referência da melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevivência geral (dias) e sobrevivência livre de progres- são (dias), fatores que causam variação em valores de referência, e o grau da variação. Es-
IDO AA E ecc A A TDR as A A a AA RANA RR 7 16 ” tes valores de referência podem ser apropriadamente pré-determinados em acordo com as condições e tipo de câncer de indivíduo com câncer, o tipo de uma droga empregada em combinação com irinotecano, SN-38, e/ou um sal do mesmo etc. Com referência aos valores de referência, a determinação acima mencionada pode ser executada.
O kit da presente invenção não está limitado à modalidade acima e compreende um kit incluindo todos ou parte dos membros requeridos para execução de todos ou uma parte dos passos do método. Exemplos de membros requeridos por execução dos passos incluem um tampão.
: Empregando, como um índice, um aumento em qualquer uma das melhores taxas de resposta ao (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) ' obtidos das fórmulas (1) a (3), um agente amplificador de sensibilidade ao irinotecano, SN- 38, e/ou sais do mesmo podem ser selecionados através de triagem. Em outras palavras, a substância a qual aumenta estes valores in vitro ou in vivo aumenta sensibilidade de um indivíduo a um agente anti-câncer. Em um câncer animal, a substância a qual aumenta es- tes valores antes e depois da administração de um agente anti-câncer é definida como uma substância a qual aumenta a sensibilidade ao agente anti-câncer (agente amplificador de sensibilidade do agente anti-câncer). Em várias linhagens de células cancerígenas, a subs- tância que aumenta estes valores in vitro na presença de irinotecao, SN-38, e/ou sais do mesmo é definida como uma substância que aumenta a sensibilidade ao agente anti-câncer (agente amplificador de sensibilidade do agente anti-câncer). Quando um agente amplifica- dor de sensibilidade de agente anti-câncer é usado, um aumento no valor é observado antes da observação de regressão do tumor ou efeito citotóxico. Portanto, se a substância teste pode servir ou não como um agente amplificador de sensibilidade de agente anti-câncer pode ser determinado em um período de tempo mais curto, segundo o qual a carga e custo — envolvidos na triagem podem ser reduzidos, o que é uma ótima vantagem da presente in- venção.
Através do emprego do assim obtido agente amplificador de sensibilidade de agen- te anti-câncer e irinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmo (alvo amplificador de sensibilidade) em combinação, o efeito terapêutico do agente anti-câncer pode ser consideralvelmente . 30 —aumentado.A composição da presente invenção pode ser administrada oralmente ou paren- teralmente, preferivelmente parenteralmente. Sob administração, uma composição contendo ' um agente amplificador de sensibilidade de agente anti-câncer e um agente anti-câncer (agente amplificador de sensibilidade) pode ser misturado com um veículo farmacêutico só- lido ou líquido não tóxico para prover de uma formulação adequada para a via de adminis- tração (oral, intraretal, injeção etc.), para então formar uma preparação farmacêutica geral.
A composição contendo um agente amplificador de sensibilidade agente anti-câncer e um agente anti-câncer (alvo de amplificação de sensibilidade) pode ser uma composição única
: 117 4 contendo ambos ingredientes ou uma composição tipo combinação de duas preparações. Estes ingredientes podem ser administrados através de vias diferentes. Exemplos da forma das preparações incluem formulações sólidas tais como com- primidos, grânulos, pós e cápsulas; preparações líquidas tais como solução, suspensão e emulsão; e formulações liofiizadas. Estas preparações podem ser produzidas através de um método geralmente empregado na técnica. Exemplos de veículos farmacêuticos não tóxicos incluem amido, dextrina, ácidos graxos glicerídeos, polietileno glicol, amido hidroxietila, eti- leno glicol, éster ácido graxo polioxietileno sorbitano, aminoácido, gelatina, albumina, água, f e salina fisiológica. Se requerido, aditivos geralmente empregados na técnica tal como um estabilizador, um umectante, um agente emulsificador, um ligador, um agente de tonicidade, É e um veículo (diluente) podem ser apropriadamente adicionados à composição.
Note que o valor do primeiro termo e o fator de cada nível de expressão de gene em cada uma das fórmulas (1) a (3) foram determinados a partir dos dados dos níveis de expressão dos genes obtidos através de RT-PCR em tempo real. Entretanto, se os níveis de expressão gênica obtidos através de RT-PCR em tempo real tem certa correlação com aqueles obtidos através de um método que não RT-PCR em tempo real, o valor do primeiro termo e o fator de cada nível de expressão gênica em cada uma das fórmulas (1) a (3) pode ser modificado com certos fatores os quais ajustam variações entre RT-PCR em tempo real e outro método que não RT-PCR em tempo real, e as fórmulas assim ajustadas podem ser usadas. Neste caso, os níveis de expressão gênica determinados através de um outro mé- todo que não RT-PCR em tempo real não colocados dentro da fórmula relevante.
Exemplos A presente invenção irá a seguir ser descrita em mais detalhes pelo meio de exem- plos, os quais não devem ser construídos como limitadores da invenção aos mesmos.
Exemplo 1: Identificação dos genes relacionados a sensibilidade a SN-38 pelo uso de linhagens celulares cancerígenas
1. Preparação do RNA total de células de câncer humanas e células não tumorais humanas cultivadas As linhagens celulares empregadas são as seguintes: duas linhagens celulares de leucemia humana (linhagem celular de leucemia mielógena K562 e linhagem celular de re- sistência a múltiplas drogas adquirida da mesma K562/DOX); nove linhagens celulares de : câncer pulmonar (linhagem de célula de câncer pulmão de células pequenas PC-6, linha- gem de células de resistência SN-38 adquiridas da mesma PC-6/SN2-5, linhagem celular CPT-11 adquirida da mesma PC-6/DQ2-2, linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão — PC-9, linhagem celular de resistência CDDP adquirida(cisplatina) da mesma PC-9/CDDP, linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar PC-14, linhagem celular de resistência CDDP adquirida da mesma PC-14/CDDP, linhagem celular de câncer de pulmão de células
E escamosas LC-S, e linhagem celular adenocarcinoma pulmonar AS49); sete linhagens celu- lares de câncer digestivo (quatro linhagens celulares de câncer de cólon: HCC-48, HCC-50, COLOZ201, e COLO320DM, duas linhagens celulares de câncer gástrico: HSC-42 e MKNA45, e uma linhagem celular de câncer esofágeo HEC-46) e uma linhagem celular de câncer epi- dermaldo epitélio oral (KB). RNA total foi extraído a partir de cada linha de célula por meio de RNeasyº Mini kit (produto de Qiagen) de acordo com um protocolo ligado ao mesmo, e estocado a -80ºC. A qualidade do RNA total extraído foi confirmada por meio de 2100 Bioanalyzer (produto de Agilent Technologies) e RNA LabChip (produto de Agilent Technologies). Quando o pico de 18srRNA e pico de 28s rRNA foram nítidos, o produto foi confirmado ser ' de alta qualidade e então sujeito a análise de microarray.
2. Análise de expressão gênica compreensiva por meio de uma microarray e análi- se de expressão gênica quantitativa através de RT-PCR em tempo real As 19 linhagens celulares de tumor humanas cultivadas acima foram analisadas em termos de perfil de expressão gênica por meio de array RIKEN 21K humana (contendo
20.784 clones e controles positivos e negativos) e um microarray de oligonucleotídeo, Co- deLinkº Uniset Human 20K | Bioarray (produtos da GE Healthcare, contendo 19.881 clones e controles positivos e negativos). Para construção de array de 21K humano RIKEN, clones CDNA (estoque de glicerol) comprado de (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) foram usados co- —mo bDNaA alvo. No microarray de cDNA, células COLO201 foram empregadas como amostra de referência, e poli(A) RNA da linhagem celular da amostra foi marcado através de trans- crição reversa por priming aleatório com Cy5-dCTP e Cy3-dCTP . No microarray de oligo- nucleotídeo, todas as amostras foram marcadas com Cy5 e avaliadas através de método de Cor única. Nas análises por meio de array RIKEN 21K humano, um nível de expressão rela- tivo padronizado de cada gene foi obtido por determinação do log(Cy3/Cy5) de cada spot e subtraindo a média dos sinais de log(Cy3/Cy5) de todos os spots a partir do sinal de cada spot. Na análise de microarray de oligonucleotídeos, os dados de intensidade de sinal acima obtido foram normalizado por meio de um programa de análise de expressão de gene mi- croarray, GeneSpring? GX (produto de Aligent). Especificamente, um nível de expressão ' 30 relativo padronizado de cada gene foi obtido por subtração de um sinal de background de um sinal spot (quando o valor obtido foi menor que 0,01; 0,01 foi empregado) e divisão do valor de sinal assim processado pela média de sinais de todos os spots no array. Também, os níveis de expressão gênica foram avaliados quantitativamente por meio de TaqManº Ge- ne Expression Assays (produto da Applied Biosystems) e sistema de detecção de sequência —ABIPrism 7900HT (produto da Applied Biosystems).
3. Avaliação da sensibilidade ao irinotecano e SN-38 A sensibilidade, ao irinotecano e SN-38, das 19 linhagens celulares de tumor hu-
f 19 e mano cultivadas, as quais têm sido sujeitas a análise de expressão gênica abrangente foi determinada através do método MTT (brometo de metiltiazol tetrazólio). Específicamente, 4x10º células/poços de cada linhagem celular e 80 ul/ poço de meio de cultura (meio RPMI1640 com 10% de soro fetal adicionado) foram adicionados a cada poço de uma mi- croplaca 96-poços (Nunclon; Nunc, Roskilde, Denmark), e cultura foi realizada por 24 horas em uma incubadora a 37ºC sob 5% CO,. Depois disso, meio de cultura (meio RPMIH640 com 10% de soro fetal adicionado) foi renovado, e SN-38 ou irinotecano foi adicionado ao mesmo em várias concentrações. Cultura foi ainda realizada por 72 horas em uma incuba- á dora a 37ºC sob 5% CO,. Depois do término desta cultura, o meio da cultura foi removido, e - 10 PBS (tampão fosfato) foi adicionado a 100 ul/poço, seguido por centrifugação a 1.500 rom : por 5 minutos. O sobrenadante foi removido através de sucção. Então, 0,4% MTT de rea- gente (10 ul/poço) e 0,1 M de succinato de sódio (10 ulL/poço) foram adicionados ao poço, e cultura foi realizada por duas horas a 37ºC sob 5% CO,. Subsequentemente, DMSO (150 uL) foi adicionado ao poço, e pipetagem was suficientemente realizada. Por meio de um leitor de microplacas (Maxline Microplate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA), ab- sorbância a 570 a 650 nm foi medida. Uma média de absorbância dos poços de meio cultura foi subtraída da absorção de cada poço de grupo de tratamento de droga, e os valores obti- dos dos poços tiveram a média calculada. Similarmente, a média de absorbância dos poços de meio de cultura foi subtraída a partir da absorção de cada poço de grupo controle (grupo - de tratamento sem droga), e os valores obtidos dos poços tiveram a média calculada. O valor do grupo de tratamento com droga foi dividido por aquele do grupo de controle, e a relação é multiplicada por 100, para assim obter inibição de crescimento percentual (%). Os dados foram assinalados com respeito a concentração em um gráfico semilog, para assim desenhar uma curva de inibição de crescimento, através da qual 50% da concentração inibi- tória de crescimento (ICs55) foi obtido. ICs5 foi empregado como um índice de sensibilidade (Tabela 1) Tabela 1 50% de concentração inibitória de crescimento (IC55) determinada pelo método MTT : o ss ss
FEI
FEST [SF | |possem as ag
4. Identificação de genes relacionado a sensibilidade ao SN-38 Das 19 linhagens celulares menciondadas anteriormente, genes exibindo níveis de expressão correlacionados com sensibilidade a um agente anti-cancerígeno (irinotecano ou SN-38), os quais foram obtidos através de análise de microarray de cDNA e a análise de —microarray de oligonucleotídeo com análise de classificação de correlação, foram extraídas como genes candidatos os quais relatam a sensibilidade ao irinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmos. Específicamente, os níveis de expressão relativos de todos os genes os quais fo- ram sujeitos a ambas as análise de microarray e as concentrações inibidoras de 50% do crescimento (ICs,5) de irinotecano ou SN-38 obtidas através do método MTT foram classífica- das, respectivamente. Um gene tendo uma correlação positiva ou negativa com o níevl de expressão relativo e ICx9 de irinotecano e/ou SN-38 foi extraído como um gene candidato o qual refere-se a sensibilidade ao irinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmo. Em adição, entre genes indicados ter certa correlação entre a classificação no nível de expressão relativo ob- tido por array RIKEN 21K humano (20.784 sondas) e o classificação em valor de ICs,o (P<0.1), genes dos quais as relações de sensibilidade de células de tumor ao irinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmo foi previamente reportada por duas ou mais instituições em 897 ' artigos registrados na National Library of Medicine's Pubmed (1996 a 2005) e aqueles que a . contribuição para a sensibilidade foram funcionalmente confirmadas através de um experi- mento de transferência de genes, um experimento de desmontagem (knock down) etc, fo- ram extraídos como genes candidatos relacionado a sensibilidade conhecidos. Também, independentemente da existência de relatos prévios, genes indicados a ter alta correlação em análise de classificação por correlação entre ambos, dos níveis de expressão relativos obtidos por array RIKEN 21K humano e por CodeLinkº UniSet Human 20K | Bioarray, e am- bos os valores ICs, de irinotecano e SN-38 (P<0.01) foram extraídos como novos genes á candidatos relacionados a sensibilidade.
Em termos de genes candidatos, análises quantita- tivas de expressão de gene das 19 linhagens celulares foram realizadas através de RT- PCR em tempo real empregando TaqManº Gene Expression Assays (produto de Applied Biosystems). Finalmente, genes exibindo reprodutibilidade (P<0,05) em correlação (análise deregressão linear) entre os níveis de expressão e valores de ICs,5 foram identificados como genes relacionados a sensibilidade ao irinotecano e genes relacionados a sensibilidade de SN-38 (12 genes: 5 genes conhecidos e 7 novos genes) (Tabelas 2 e 3). Nenhum dos 7 no- vos genes então identificados foi relatado estar envolvido na sensibilidade de células de tu- . mor ao irinotecano ou SN-38. Tabela 2 f Genes que exibiram níveis de expressão correlacionados a classificação com a sensibilidade ao irinotecano ou SN-38 (P<0.1) em análise de microarray de cCDNA e na qual a correlação foi reproduzida em níveis de expressão determinados através de RT-PCR em . tempo real OO sa aa eae eae e] Análise de mi- | Análise de RT- | Análise de mi- | Análise RT- croarray de | PCR em tempo | croarray de | PCR em tempo cDNA real cDNA real RE a a Fr TC a me ET TEA ER im par em a RR» O am *, 0,05<=P<0,1; ,0,01<=P<0,05; ,P<0,01 Tabela 3 Genes que exibiram níveis de expressão correlacionados à classificação com a sensibilidade ao irinotecano ou SN-38 (P<0,01) em análise de microarray de cDNA e em análise de microarray de oligonucleotídeo. | La a Era aa a ara ia Análise de microarray de | Análise de microarray de e [meses | Poco cos rr o o OD TT ERAS ERA NS Na DRA RR RRRRNRRRRRNESRRRRSSSSSRRSSSNSSNspo 7 22 | *, 0,05<=P<0,1;", 0,01<=P<0,05; ", P<0,01
5. Estabelecimento da fórmula preditiva da eficácia in vitro empregando genes rela- cionados a sensibilidade SN-38 extraídos novos e conhecidos. Embora todos os genes então extraídos exibiram alta correlação entre os níveis de expressão determinados e valores ICs9, o mecanismo de sensibilidade às drogas das célu- las é conhecido ser um sistema complexo envolvendo um número de fatores. Então, fórmu- : las preditivas de eficácia foram preparadas através de múltiplas análises de regressão em- pregando determinados níves de expressão dos genes identificados, e a possibilidade de ' previsão de cada fórmula foi confirmada. Como um resultado, foram estabelecidos como fórmulas preditivas empregando os níveis de expressão de 5 genes conhecidos ([ABCG2], [CYP3A4], [MGMT], [POR], e [TOP2A]): INflCso] = 8,5945 + 0,0627InfABCG2] + 0,0219In[CYP3A4] + 0,0299In[MGMT] — 0,5849In[POR] + 0,8099In[TOP2A] --: (4), e uma formula preditiva empregando os níveis de expressão de 7 novos genes ([AMD1], [CTSC], [EIF1AX], [0120rf30], [DDX54], [PTPN2], e [TBX3]) In [ICso] = 6,2118 + 0,4942In"AMD1] — 0,3801In[CTSC] + 0,3782IN[EIFIAX] — 0,4903InN[C120rf30] + 1,1019In[DDX54] -1,2042In[PTPN2] — 0,1967/IN[TBX3] - (5). As duas fórmulas foram indicadas ter alta possibilidade de predição (R = 0,7677, AICPS (critério de informação Akaike por amostra) = -1,086 em fórmula (4), e R = 0,8442, —AICPS=-1,523em fórmula (5)) (Fig. 1). Exemplo 2: Teste clínico de indivíduos humanos sob administração única de CPT- e)
1. Teste clínico de indivíduos humanos sob administração única de CPT-11 Os estudos mencionados anteriormente têm revelado que a eficácia de SN-38 é possivelmente predita a partir dos genes antes mencionados, novos ou conhecidos identifi- . cados em linhagens celulares de tumores humanos cultivadas, e fórmulas preditoras de efi- cácia empregando níveis de expressão dos genes. Afim de esclarecer a possibilidade de f predição de eficácia empregando os genes em contextos clínicos, estudosclínicos farmaco- lógicos genômicos prospectivos foram realizados. Os casos alvos foram indivíduos de cân- i 30 cer colorretal em estágio IV não operável que não receberam quimioterapia e dos quais o tumor espécime pode ser removido durante uma cirurgia paliativa. O critério de seleção para os indivíduos humanos testes foram como segue: (1) um caso que foi histologicamente di- agnosticado como câncer colorretal; (2) um caso que se tentou a cirurgia de câncer colorre- tal de estágio IV não operável; (3) um caso envolvendo critérios de avaliação de resposta emtumores sólidos (RECIST); e (4) um caso onde funções fisiológicas (medula óssea, fíga-
ooo oa a A a A A O EO E a a a ADD RARA RERRAACRRDAROO AAA : 23 É do, rim, coração etc.) são suficientemente mantidos, em que os resultados do teste de san- gue dentro de uma semana antes do registro preliminar ou queda do registro dentro das seguintes variações de referência: WBC: 4.000/uL a 12.000/ul, NEUT: >2.000/ul, PLT: >100.000/uL, Hb: >9,0 g/dl, GOT-GPT: menos que duas vezes o limite superior do normal nainstituição (no caso de metástase hepática, menos que três vezes), T-Bil: <1,5 mg/dL, Cr: <1,5 mg/dL, CCr: 250 mL/min, BUN: <25 mg/dL, and CRP <1 mg/dL. Os indivíduos humanos testes também incluíram um caso classificado em estado de desempenho (Eastern Coope- rative Oncology Group: ECOG) de O a 2; um caso que não passou por tratamento preliminar É outro que a cirurgia; um caso para o qual, no registro, passaram 21 dias ou mais tempo de- y 10 —poisda cirurgia; um caso que é esperado ter um período de sobrevivência prevista de 3 me- ses ou mais; um caso que não tem co-morbidade ou câncer primário múltiplo ativo severos; um caso de uma idade de 20 ou mais velho e mais novo que 75; um caso do qual uma amostra de tecido para análise de gene foi obtida em cirurgia; e um caso onde o próprio ou a própria indivíduo forneceu consentimento informado de cirurgia incluindo doação de uma bioamostra para estudos. Excluídos foram os seguintes casos: (1) um caso tendo complica- ção severa; (2) um caso tendo uma complicação infecciosa; (3) um caso tendo diarréia (fe- zes aquosas); (4) um caso tendo paralisia intestinal, íleo, ou subíleo (apenas antes do regis- tro); (5) um caso tendo pneumonia intersticial ou fibrose pulmonar; (6) um caso tendo ascite ou fluído pleural em grande volume; (7) um caso tendo icterícia; (8) um caso tendo doença cardíaca como doença cardíaca isquêmica ou arritmia a uma extensão requerendo trata- mento (um caso tendo hipertrofia ventricular esquerda ou leve sobrecarga ventricular es- querda concomitante com hipertensão ou leve bloqueio de ramo direito pode ser registra- do); (9) um caso que experimentou infarto miocárdico dentro de 6 meses; (10) um caso ten- do cirrose como complicação; (11) um caso exibindo hemorragia recente do trato digestivo a ser tratado por trasnfusão sanguínea repetida; (12) um caso tendo distúrbio mental tratado com ou possivelmente a ser tratado com psicotrópico; (13) um caso tendo diabetes de difícil controle como uma complicação; (14) um caso tendo outras complicação pós-operatórias severas; (15) um caso que vivenciou anafilaxia severa a outras drogas; (16) uma indivíduo do sexo feminino grávida ou em lactação ou indivíduo do sexo masculino ou feminino dese- —jandoterum bebê; e (17) um caso que é positivo para vírus de hepatite, vírus HIV ou sífilis.
CPT-11 foi administrado sozinho. Após a passagem de um período de 21 dias ou mais da cirurgia, a administração foi iniciada. A partir do dia 1 (dia de início da administração), CPT- 11 foi administrado uma vez por semana por 3 semanas seguido de um período de descan- so de uma semana (1 curso). A dose de CPT-11 foi de 60 a 100 mg/m?. Quarenta e quatro indivíduos no total participaram no estudo, e a melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobre- vivência livre de progressão (dias) e sobrevivência geral (dias) puderam ser avaliados em todos os participantes. Níveis de expressão quantitativos dos 5 conhecidos e 7 novos genes
A oa aa o o a o o os oa oa o E a a a A MR É Ó NRRR AA : 24 É relacionados a sensibilidade SN-38 ou relacionados a sensibilidade irinotecano acima identi- ficados foram analisados através de RT-PCR em tempo real empregando Ensaios de Ex- pressão Gênica TaqManº. Exceto por um caso em a extração de RNA não foi completada, os níveis de expressão foram quantificados em 43 casos.
2. Estabelecimento de fórmulas preditivas de eficácia e validade das mesmas Fórmulas preditivas de eficácia foram estabelecidas a partir dos níves de expressão de 5 genes conhecidos e 7 genes novos dos 43 casos acima registrados, e a validade das formulas foi avaliada (Figs. 2, 3, 4, 5,6,e 7). Independente da melhor taxa de resposta ao . tumor (%), 36 casos foram empregados no estudo de previsão de eficácia, e os 7 casos re- —manescentes não foram empregados, já que eles foram diagnosticados como doenças pro- 1 gressivas (PD) devido ao aparecimento de uma nova lesão. Os 36 casos foram divididos ao acaso em um grupo de 20 casos para estabelecimento de fórmulas preditivas e o outro gru- po de 16 casos para avaliação das fórmulas preditivas. Similarmente, em relação a sobrevi- vência livre de progressão (dias), 26 casos foram empregados no estudo de predição de eficácia e os casos remanescentes não foram empregados (8 casos: interrupção do trata- mento devido a toxidez, 4 casos: mudança do método terapêutico requerido pelos indiví- duos, 4 casos: realização de cirurgia radical e 1 caso: resposta completa (CR)). Os 26 casos foram divididos em grupos de 16 casos para estabelecimento de formulas preditivas e o ou- tro grupo de 10 casos para avaliação das formulas preditivas. Em relação a sobrevivência geral(dias), 28 casos os quais tinham acabado os períodos de sobrevivência foram empre- gados no estudo de predição de eficácia, e os 15 casos remanescentes vivos não foram empregados. Os 28 casos foram divididos em grupos de 15 casos para estabelecimento de fórmulas preditivas e o outro grupo de 13 casos para avaliação das fórmulas de predição. As fórmulas preditivas foram estabelecidas em uma maneira similar àquela empregada em es- tudosinvitro Como um resultado, foram estabelecidos fórmulas preditivas empregando ní- veis de expressão de 5 genes conhecidos ([ABCG2], [CYP3A4], [MGMT], [POR], e [TOP2A]): A melhor taxa de resposta do tumor (relação a linha base de diâmetro do tumor, %) = 91,287 + 10,472/ABCG2] + 0,65518[CYP3A4] — 3,8065/MGMT] — 2,1487[POR] + : 30 17,354[TOP2A] (6) (R = 0,7393, AICPS = 5,188021), : Sobrevivência livre de progressão (dias) = 69,568 - 51,615/ABCG2] - 3,1043[CYP3A4] + 15,985[MGMT] + 107,90[POR] — 187,63[TOP2A] + (7) (R = 0,8382, AICPS = 8,073506), e Sobrevivênica geral (dias) = 425,67 + 363,52/ABCG2] — 2,8749[CYP3A4] + 2,.765[MGMT] — 481,61[POR] + 321,70[TOP2A] + (8) (R = 0,9267, AICPS = 9,155001), e fórmulas preditivas empregando os níveis de o O o O ASS URSOS SADO OO O NA A RRRSANRNRNUNRNcERRRsÂNORARN OSSOS ' 25 JÁ expressão de 7 genes novos ([AMD1], [CTSC], [EIF1AX], [0120rf30], [DDX54], [PTPN2], e [TBX3]): Melhor taxa de resposta ao tumor (relação linha base de diâmetro do tumor, %) = 139,49 — 12,089/AMD1I] — 84,477[/CTSC] — 12,737[EIFIAX] + 85,900[C120rf30] — 29,119/DDX54]- 6,8630[PTPN2] + 20,303[TBX3] - (1) (R = 0,9420, AICPS = 5,460938), Sobrevivência livre de progressão (dias) = 68,076 + 78,277[/AMD1] — 57,358[CTSC] — 15,011[EIF1AX] + 8,9798[C120rf30] + 73,077[DDX54] — 38,961[PTPN2] — 43,313[TBX3] . - (2) (R = 0,7103, AICPS = 8,411958), e Í Sobrevivência geral (dias) = 512,78 — 192,11[/AMD1] — 120,78[0CTSC] + 134,53[EIF1AX] — 11,883[C120rf30] + 157,24/[DDX54] + 31,962[PTPN2] — 386,55[TBX3] -- (3) (R = 0,8426, AICPS = 10,20386). As fórmulas de predição mencionadas anteriormente foram avaliadas em validade. A avaliação revelou que nenhuma das fórmulas de predição empregando os níveis de ex- pressão de 5 genes conhecidos podem prever qualquer parâmetro de efetividade (eficácia) [Melhor taxa de resposta ao tumor (relação linha base de diâmetro do tumor, %), P = 0,2079, R = -0,3450; sobrevivência livre de progressão (dias) P = 0,4802, R = 0,2712, e sobrevivên- ciageral(dias),P=0,4639, R=-0,2316]. Em contraste, a avaliação revelou que as fórmulas preditas empregando os níveis de expressão de 7 novos genes têm alta possibilidade de predição em qualquer parâmetro de efetividade (eficácia), particularmente a melhor taxa de resposta ao tumor (relação linha base do diâmetro do tumor %) e sobrevivência geral (dias) [Melhor taxa de resposta ao tumor (relação linha base do diâmetro do tumor %) P = 0,007, R=0,6491; sobrevivência livre de progressão (dias), P = 0,1124, R = 0,5333; e sobrevivên- cia geral (dias), P = 0,0114, R = 0,6749].
4. Predição de efetividade (eficácia) por gene único específico As fórmulas preditivas empregando os níveis de expressão de 7 novos genes iden- tificados foram encontradas como sendo úteis. Assim, o emprego ou não de cada um dos e 30 genes identificados sozinhos pode prever a eficácia foi investigada através de análise de regressão linear. Como um resuitado, os respectivos níveis de expressão dos 5 genes co- : nhecidos e 7 novos genes não foram correlacionados com qualquer parâmetro de efetivida- de (eficácia), e a predição pelo uso único do nível de expressão de cada gene poderia ser difícil. Tabela 4 mostra a relação entre o nível de expressão de cada um dos 5 genes co- —nhecidos (ABCG2, CYP3A4, MGMT, POR, e TOP2A) e a melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência livre de progressão (dias), e sobrevivência geral (dias). Tabela 4
. 26 já Melhor taxa de resposta | Sobrevivênia livre de | Sobrevivência geral O jesemeto o nesestatas its | e [Por aos Tora — Joc Tosas Tonsos Tostes | Também, a Tabela 5 mostra a relação entre o nível de expressão de cada um dos 7 S novos genes (AMD1, CTSC, EIF1AX, C120rf30, DDX54, PTPN2, e TBX3) e a melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência livre de progressão (dias), e sobrevivência geral (dias). Tabela 5 Melhor taxa de resposta | Sobrevivênia livre de | Sobrevivência geral o fesemoo O resinas je e | Como descrito aqui acima, somente as fórmulas preditivas (1) a (3) empregando os níveis de expressão dos 7 novos genes então identificados são descobertos serem úiteis para predição da a melhor taxa de resposta do tumor (%), sobrevivência livre de progressão (dias), e sobrevivência geral (dias), os quais são parâmetros para resposta terapêutica (efi- cácia)deirinotecano, SN-38, e/ou sais do mesmo.
õ REIVINDICAÇÕES
1. Método CARACTERIZADO pelo fato de ser para determinar a sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende medir os níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene —EIFIAX, gene C120rf30, gene DDX54, gene PTPN2, e gene TBX3 em um espécime, e cál- culo da melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de progressão (dias) a partir das seguintes fórmulas de (1) a (3): Melhor taxa de resposta ao tumor (%) = 139,49 — 12,089xA -84,477xB — 12,737xC . + 85,900xD — 29,1 19xE — 6,8630xF + 20,303xG + (1); Sobrevivência geral (dias) = 512,78 — 192,11xA — 120,78xB + 134,53xC - h 11,883xD + 157,24xE + 31,962xF — 386,55xG -: (2) e Sobrevivência livre de progressão (dias) = 68,076 + 78,277xA — 57,358xB - 15,011xC + 8,9798xD + 73,077xE — 38,961xF — 43,313xG - (3) (em que A representa um nível de expressão do gene AMD1; B representa um nível de expressão do gene CTSC ; C representa um nível de expressão do gene EIFIAX ; D representa um nível de expressão do gene C120rf30; E representa um nível de expressão do gene DDX54; F representa um nível de expressão do gente PTPN2; e G representa um nível de expressão do gene TBX3).
2. Método de determinação da sensibilidade, de acordo com a reivindicação 1, "CARACTERIZADO pelo fato de que o espécime é uma bioamostra derivada a partir de um indivíduo tendo câncer.
3. Método de determinação da sensibilidade, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o espécime é uma bioamostra derivada a partir de um indivíduo tendo câncer colorretal.
4. Método de determinação da sensibilidade, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que cada um dos níveis de expressão gênica é uma quantidade de mMRNA derivada a partir do gene.
5. Kit para determinação da sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, CARACTERIZADO pelo fato de que o kit compreende (A) reagentes de en- ' 30 — saio para medida dos níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene EIF1AX, gene . C120rf30, gene DDX54, gene PTPN2 e gene TBX3, e (B) um protocolo para cálculo da me- lhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), ou sobrevivência livre de pro- gressão (dias) a partir das seguintes fórmulas de (1) a (3): Melhor taxa de resposta ao tumor (%) = 139,49 — 12,089xA -84,477xB — 12,737xC —+85,900xD-29,119xE- 6,8630xF + 20,303xG - (1); Sobrevivência geral (dias) = 512,78 — 192,11xA — 120,78xB + 134,53xC — 11,883xD + 157,24xE + 31,962xF — 386,55xG - (2) e ç 2 s Sobrevivência livre de progressão (dias) = 68,076 + 78,277xA — 57,358xB — 15,011xC + 8,9798xD + 73,077xE — 38,961xF — 43,313xG - (3) (em que A representa um nível de expressão do gene AMD1 ; B representa um nível de expressão do gene CTSC ; C representa um nível de expressão do gene EIF1IAX ; —Drepresenta um nível de expressão do gene C120rf30; E representa um nível de expressão do gene DDXS54; F representa um nível de expressão do gene PTPN2; e G representa um nível de expressão do gene TBX3).
6. Kit, de acordo com reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que um es- " pécime é uma bioamostra derivada a partir de um indivíduo tendo câncer.
7. Kit, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que : um espécime é uma bioamostra derivada de um indivíduo tendo câncer colorretal.
8. Método para selecionar um agente amplificador de sensibilidade ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende medir os níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene EIFIAX, gene C120rF30, gene —DDXS4, gene PTPN2 e gene TBX3 em um espécime, e empregar, como um índice, um au- mento em qualquer uma da melhor taxa de resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (di- as), ou sobrevivência livre de progressão (dias) obtidas a partir das seguintes fórmulas de (1)a (3): Melhor taxa de resposta ao tumor (%) = 139,49 — 12,089xA -84,477xB — 12,737xC +85,900xD-29,119xE- 6,8630xF + 20,303xG -- (1); Sobrevivência geral (dias) = 512,78 — 192,11xA — 120,78xB + 134,53xC - 11,883xD + 157,24xE + 31,962xF — 386,55xG +: (2) e Sobrevivência livre de progressão (dias) = 68,076 + 78,277xA — 57,358xB — 15,011xC + 8,9798xD + 73,077xE — 38,961xF — 43,313xG - (3) em que A representa um nível de expressão do gene AMD1 ; B representa um nível de expressão do gene CTSC ; C representa um nível de expressão do gene EIFIAX; D representa um nível de expressão do gene C120rf30; E representa um nível de expressão do gene DDXS54; F representa um nível de expressão do gente PTPN2; e G representa um nível de expressão do gene TBX3. ] 30 9. Agente amplificador de sensibilidade ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais R CARATERIZADO pelo fato de ser obtido através de um método de seleção conforme defini- do na reivindicação 8.
10. Composição para terapia de câncer, CARACTERIZADA pelo fato de compre- ender um agente amplificador de sensibilidade conforme descrito na reivindicação 9 e irino- tecano, SN-38, e/ou seus sais.
Fig. 1 Fórmula predita de IC50 Fórmula predita de IC50 em -| empregando 5 genes co- | pregando 7 genes novos INC] = 8.5945+0.0627 n [ABCG2] TIS =6.2118+0.4942IN[AMDT]- +0.0219IN[CYP3A4]+0.0299 In [MGMT] — 0,3801In[CTSC]+0.3782IN[EIFIAN]=
0.5849 In[PORJ+0.8099 In TOP2A] 0.4903INfC720RF30]+1.1019IN[DDX54]- 1,2042IN[PTPN2]-0.1967 nf TBXS] R=0.7677, AICPS =-1.086 R=0.8442, AICPS = -1.523 . Amostras analssdas: 54 [Amostas analisadas: 57 — *º [amostras ocutadas não — a |amostas ocutadas não Pá x fansadass = * fssass « 2 Ss or E. ” E e. e... % 8 É. 8 . Co ao a. 3 ., EO As $ | 3 à é 8 1) + /0e ã e Z . > .e&. & º à $ 7 8 E) o s 7 8 s Valor Predito (InfiCso]) Valor Predito (InllCs])
Fig. 2 Fórmula predita Melhor taxa de resposta 2o tumor (proporção da linha base do diâmetro do tumor, %) = 91,287 +10,472[ABCGZ] +0.65518[ CYP3AS] -3.8065[ MGMT]-2.1487[ POR]+17.354[ TOP2A) g o O Amostras testadas * | |P= 0,2079 ' E 8 | R =-0,3449951 8 8 o º 6 1 Amostras para estabelecimento da 22 ê & pg ómulapredita 9393 3 RR = 05466 ? Dá AIC = 83.00834 8 o Oo AICPC = 5.188021 o Standard : ACTB g Amostras ocultadas não — , q is : 40 60 80 100 120 140 Valor Predito (%)
Fig. 3 Fórmula predita Sobrevivência lira de Progresso 568g—51.615[ABCGZ]-3.1043[ CYPIAJN+
15.985[ MGMT]-+107,90[ PORJ-187.63[ TOP2A] : 8 O Amostras testadas o P= 0,4639 . E ; e | [R = -0,2315751 go. o o | 2 e o Amostras para estabelecimento da 3 8 e o À fórmuiapredita g 8390 5” VV, e 0.7026 3 .. ae = 12110% EF .º | AICPC = 8.073506 oº Standard : ACTB Amostras ocultadas não —, 4 o so 10 150 200 Valor Predito (%)
Fig. 4 Fórmula predita ' Sobrevivência geral (dias) = 425.67 + 363.52[ ABCGZ2)-2.8749[ CYP3A4]+
20.765 MGMT] -A81.61[ POR]-+321.70[ TOP2A] 8 — O Amostras testadas ' | ja = 0.4802 gs R= 0,2712127 o Amostras para estabelecimento se 8 e º 3 8 o À Plimyapedias 92767 * s o o CSN 0.8588 3 8 AC = 109.8600 2 &oº o| laIcPe = 9.155001 s Standard : ACTB Amostras ocultadas não ; 3 o - analisadast———— o 200 “avo sou soo 1000 Valor Predito (%)
DN Fig. 5 Fórmula predita Melhor taxa de resposta ao tumor (proporção da linha base do diâmetro do tumor, %) =139,49-—12.089[/4MD1])- B4,477[CT5C] —12,737[ EIFIAX|+85.900[ C120RF30]-
29.119[DDX54]-6.8630[ PTPN2]+20.303[ TBXS] . 3 " O Amostras testadas P= 0,006515 = R = 0,6490895 gs — o 8 e Amostras para estabelecimento da 3? Oj |R tmuaregibazo É &g oo | RW = 08874 5? “o o | |AIC = 87,37502 2 AICPC= 5.460938 ? o Standard : ACTB Amostras ocultadas não —; 4 o anatisadas: o so 100 150 200 250 Valor Predito (%)
ã Fig. 6 Fórmula predita Sobrevivência lira de progressi 59 076 + 78,277[AMDI]-57,358] CTSCI-
15.011[ EIFIAX]+8.9798[ C120RF30)+73.077 [DDX54]-
38.961[ PTPN2] -43.313[ 78X] â : | | O Amostras testadas | | p= 01124 * 2 | Rn = 05332698 sz 1. = 05332898 E . e ó | [ETTA & L) R ómuapredia 193 E o o R = 05045 3 Fri jare = 1261794 > 2 o º AICPC= 8,411958 81 9 As. Standard : ACTB | o Amostras ocultadas não —, q Í e o O So 1 io 20 20 300 Valor Predito (%)
" Fig. 7 Fórmula predita Sobrevivência geral (dias) =512,78-192.11[AMD1])-120.78[ CTSC]+
134.53[ EIFIAX]-11.883[ C120RF30)4+157.24[ DDX54)+
31.962[ PTPN2]-386.55[ TBX3] 8 O Amostras testadas - P= 0.01137 = o R = 0.6749478 E: < ' PA .º . e € AToSTAS para estabelecimento da Ss s o Yg o À Smuaredido 176 É º 8 Re = 07100 3 So AIC = 1326502 ? glo AICPC= 10.20386 Standard : ACTB Amostras ocultadas não —, x o alisadas o 200 4oo soo soo Valor Predito (%)
RESUMO “MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE AO IRINOTECANO E * — USODOMESMO"
. Prover um método para determinação da sensibilidade de um paciente ao irinote- cano, SN-38,e/ouseus sais, cujo método pode determinar a resposta terapêutica do pacien- te e prover um novo meio terapêutico de câncer empregando o método.
O método para de- terminação da sensibilidade de um paciente ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais inclui me- dida dos níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene EIF1AX, gene C120rf30, gene DDXS4, gene PTPN2 e gene TBX3 em um espécime, e cálculo da melhor taxa de res- posta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progressão (dias) a partir das fórmulas (1) a (3).
'
PÁGINAS MODIFICADAS (SUGERIDAS PELA REQUERENTE)
« Fig. 3 Fórmula predita Sobrevivêr livre de 'ssã oravivência ds) oo = 69,568-51.615[ABCG2]-3.1043[ CYP3A4]+
15.985[ MGMT]+107.90[ POR]-187.63[ TOP2A] 81 O Amostras testadas o P= 0,4639 - R =-0.23157! $ 81 º | = 3 9 O t o À ) Amostras para estabelecimento É . Q MENS q8382 3” VV ,. w = 07026 2 e. AIC = 121.1026 3 .* AICPC = — > 8,073506 oº , Standard : ACTB Amostras ocuitadas não FE . e p— o so 100 180 200 Valor Predito (dias)
Fig. 4 « Fórmula predita Bobrevivência geral (dias)= 425.67 + 363.52[48CG2])-2.8749[ CYP3AS)+
20.765[ MGMT] —481.61[ POR] +321.70[ TOP24] z 7 O Amostras testadas A | | = 0,4802 q ê | |R= 02712127 2 o 8 o Amostras para estabelecimento 3 êâ | 9 /* R efômuiapredia o 9267 o ||& = 0.8588 Í º | ã ? 1 8 AIC = 109,8600 | 3 | & Oo o| laIcPe = 9,155001 Ss Standard : ACTB Amostras ocultadas não; 3 - ip - ligadas —— — ? o 200 400 600 800 1000 . Valor Predito (dias)
Fig. 6 « à Fórmula predita Sobrevivência livre de progressão (dias) = 68.076 + 78.277[AMDI1]-57.358| CTSC)- 15,011[EIFIAX]-+8.9798[ C120RF30)+73.077 [DDX54)-
38.961[ PTPNZ] -43.313[ TBX] 8 JP O Amostras testadas | jP= 01124 2 R = 0,5332898 Z 2898 8 º = ê o [Mefmostas para estabelecimento — | É º | R forma pesa os | E º s | A = 05045 i 4 AIC = 126.1794 | CIT o. [AICPC= =B.411958 .º : E o no Standard : ACTB O q Amostras ocultadas não; q Í ' º O i z o so too 150 200 250 300 e Valor Predito (dias)
< h 7 Fig. 7 Fórmula predita Sobrevivência geral (dias) = 512,78 — 192.11 AMD1]-120.78[ CTSC]+
134.53[ ETFIAX]-11.883[ C120RF30|+157.24[ DDX54)+
31.962[ PTPN2]-386.55[ TEX3] E (O Amostras testadas P= 0.01137 : o << R = 0.6749478 FR o (O) ã E o. o eAmostras para estabelecimento 3 8 220 O À mary da2s 8 o % RE = 07100 . Ê o o AIC = 1326502 : 3 gl o AICPC= 10.20386 : à - ? Standard : ACTB Amostras ocultadas não —;2 e) amatisatas- o 200 4oo soc soo Valor Predito (dias)
T RESUMO “MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE AO IRINOTECANO E USO DO MESMO”
Fornecer um método para determinação da sensibilidade de um indivíduo ao irino- — tecano, SN-38, e/ou seus sais, cujo método pode determinar a resposta terapêutica do indi- víduo e fornecer um novo meio terapêutico de câncer empregando o método.
O método pa- ra determinação da sensibilidade de um indivíduo ao irinotecano, SN-38, e/ou seus sais in- clui medida dos níveis de expressão do gene AMD1, gene CTSC, gene EIF1IAX, gene . C120rf30, gene DDX54, gene PTPN2 e gene TBX3 em um espécime, e cálculo da melhor taxade resposta ao tumor (%), sobrevivência geral (dias), e sobrevivência livre de progres-
. são (dias) a partir das fórmulas (1) a (3).
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