KR20210058197A - 이리노테칸을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

이리노테칸을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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KR20210058197A KR1020190145388A KR20190145388A KR20210058197A KR 20210058197 A KR20210058197 A KR 20210058197A KR 1020190145388 A KR1020190145388 A KR 1020190145388A KR 20190145388 A KR20190145388 A KR 20190145388A KR 20210058197 A KR20210058197 A KR 20210058197A
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Abstract

본 발명은 이리노테칸을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 일 구체예에 따르면 이리노테칸은 TopoI 보다 종양 억제 인자 p53의 E3 리가아제인 MDM2와 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)인 Bcl-xL에 직접적으로 결합하고, 세포사멸, 항 세포증식 및 세포주기 정지 효과를 갖는 것을 확인하였으므로, 이리노테칸 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

이리노테칸을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising irinotecan for preventing or treating cancer}
이리노테칸을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
종양 억제 인자인 p53은 세포 스트레스 반응 경로에서 중요한 역할을 한다. p53의 전-세포사멸(pro-apoptotic) 활동은 음성 및 양성 조절자(negative and positive regulator)의 네트워크를 구성하는 수많은 단백질-단백질 상호 작용에 의해 제어된다. MDM2는 p53을 표적으로 삼는 E3 유비퀴틴 리가아제(E3 ubiquitin ligase)로서 p53의 프로테아좀 분해(proteasomal degradation)를 유발하므로, 직접적인 상호작용을 통해 p53을 조절한다. 또한, 잘 알려진 항-세포사멸 단백질(antiapoptotic protein)인 Bcl-xL은 p53의 또 다른 직접 상호 작용 파트너이다. MDM2와 Bcl-xL은 각각 뉴트린-3(Nutlin-3)과 ABT-737과 같은 항암제의 표적으로서 MDM2와 Bcl-xL의 p53 결합 부위는 Bcl-2 상동성(Bcl-2 homology, BH) 모티프로 특징지어졌으며, 이는 약물의 표적 부위이기도 하다. 뉴트린-3는 MDM2의 BH3 모티프에 결합하여 p53과의 상호 작용을 방해하여 p53의 종양 억제 기능을 구조(rescue)하고, p53이 Bcl-xL에 대해 작용할 때 ABT-737은 Bcl-xL의 BH3 모티프에 결합하여 Bcl-xL이 Bax 및 Bim과 같은 필수 전-세포사멸성 단백질과의 추가 상호 작용을 방지한다. MDM2 및 Bcl-xL의 결합 부위의 유사한 구조에도 불구하고, 두 표적에 공통적으로 결합하는 화합물에 대한 연구는 거의 없다.
이리노테칸(irinotecan)은 캄프토테카 아쿠미나타(Camptotheca acuminate) 나무 추출물에서 추출한 알칼로이드(alkaloid)로서, 간 등에서 활성 대사 산물인 SN-38의 형태로 전환되어 DNA 토포아이소머라제I(TopoI)의 억제를 통해 항암 활성을 갖는다고 알려져 있다. SN-38은 이리노테칸보다 100배 내지 1000배의 효능을 갖는다고 알려져 있으나, 중증의 설사 또는 강력한 면역게 억제 등의 위중한 부작용을 유발한다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0137305호
이에, 이리노테칸이, 대사 산물인 SN-38의 TopoI 억제 활성을 통한 항암 활성과 별개로, MDM2 및 Bcl-xL에 직접적으로(예를 들면, 대사 산물을 통하지 않고 본래 화합물 형태로) 결합하여 우수한 항암 활성을 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 이리노테칸(irinotecan) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이리노테칸을 포함하는, p53 분해 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이리노테칸을 포함하는, Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large)과 Bim(BCL2 like 11) 간 결합 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 이리노테칸(irinotecan) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이리노테칸의 화학명은 “[(19S)-10,19-다이 에틸-19-하이드록시-14,18-다이옥소-17-옥사-3,13-다이아자펜타사이클로 [11.8.0.02,11.04,9.015,20] 헨니코사-1(21)4 (9),5,7,10,15(20)-헵탄-7-일]4-피페리딘-1-일피페리딘-1-카르복실레이트”이고, 하기 화학식 1의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure pat00001
일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 천연물에서 추출 및 분리하여 얻거나, 통상적인 유기합성 방법으로 제조할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
이리노테칸은 캄프토테카 아쿠미나타(Camptotheca acuminate) 나무 추출물에서 추출한 알칼로이드(alkaloid)로서 대장암, 폐암 치료 등에 사용된다. 이리노테칸은 생체 내에서 카르복실에스터라제에 의해 활성 대사 산물인 SN-38(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)로 전환되어 토포이소머라제I(TopoisomeraseI, 이하 TopoI) 활성을 저해함으로써 DNA 합성을 막아 세포 분열을 저해하며, 항암 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 이리노테칸 자체는 세포독성이 거의 없으나, SN-38의 축적은 설사 및/또는 백혈구 감소증(leukopenia) 등의 면역계 억제 등의 위중한 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다.
일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 종양 억제 인자 p53(tumour suppressor p53)의 E3 리가아제(E3 ligase)인 MDM2와 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)인 Bcl-xL에 결합하여 그 활성을 억제하여 항암 활성을 가질 수 있다. 또한, 이리노데칸은 카르복실에스터라제에 의한 대사 산물(SN-38) 형태가 아닌 그 자체로 사용되어, SN-38에 의한 부작용 없이 항암 활성을 나타낼 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약학 조성물의 유효성분으로서의 이리노데칸은 그 대사 산물인 SN-38을 포함하지 않는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 이리노테칸을 포함하고, 이리노테칸의 대사 산물인 SN-38은 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자에게 적용(사용)하기 위한 것일 수 있다.
카르복실에스터라제(carboxylesterases)는 에스터 결합을 가수분해 하는 효소의 일종으로서, 카르복실 에스테르(carboxylic ester)와 H2O를 기질로 하여 알코올과 카르복실레이트(carboxylate)를 생성하고, 간의 약물 대사 및 지방 증후군과 연관되어 있다고 알려져 있다.
이리노테칸은 간 및 각 조직에서 카르복실에스테라아제에 의해 활성화 형태인 SN-38로 전환되어 항암 활성을 갖는다고 알려져 있으나, SN-38의 축적은 설사, 면역계 역제 등의 부작용을 유발한다고 알려져 있다. 일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 카르복실에스터라제 활성이 약화 및/또는 불활성화된 환자에 투여되어 SN-38로 전환되지 않아도 직접적으로 MDM-2 및/또는 Bcl-xL에 결합하여 항암 활성을 가질 수 있으므로, 상기 약학 조성물은 부작용 없이 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자의 암 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 카르복실에스터라제는 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예를 들면, CES1(carboxylesterase 1: e.g., 인간 CES1(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001020365.1, NP_001020366.1, NP_001257.4; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001025194.1, NM_001025195.1, NM_001266.4 등), 마우스 CES1(단백질: GenBank Accession No. NP_444430.2; 유전자: GenBank Accession No. NM_053200.2 등)), CES2(carboxylesterase 2; e.g.,인간 CES2(단백질: GenBank Accession Nos. NP_003860.3, NP_932327.2, NP_001352334.1, NP_001352335.1, NP_001352336.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_003869.6, NM_198061.3, NM_001365405.1, NM_001365406.1, NM_001365407.1 등), 마우스 CES2(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001258974.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001272045.2 등)), CES3(carboxylesterase 3: e.g., 인간 CES3(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001172105.1, NP_001172106.1, NP_079198.2; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001185176.1, NM_001185177.1, NM_012122.1, NM_024922.6 등), 마우스 CES3(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001158153.1, NP_941074.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001164681.1, NM_198672.1 등)), CES4A(carboxylesterase 4A; e.g., 인간 CES4A(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001177130.1, NP_001177131.1, NP_001305435.1, NP_001351711.1, NP_776176.5; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001190201.2, NM_001190202.2, NM_001318506.2, NM_001364782.1, NM_173815.7 등), 및 CES5A(carboxylesterase 5A; e.g., 인간 CES5A(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001137157.1, NP_001177087.1, NP_659461.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001143685.1, NM_001190158.1, NM_145024.2 등))으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 명세서에서, 카르복실에스터라제의 "활성이 약화" 또는 "불활성화"되었다는 것은 카르복실에스터라제가 유전자의 핵산 서열 및/또는 단백질의 아미노산 서열의 변이(치환, 결실, 부가 등) 및/또는 2차 또는 3차 구조의 변형 등의 변이에 의하여 효소 활성 정도가 야생형(wildtype)에 비하여 감소되었거나 효소의 활성이 없는 경우를 의미하고, 카르복실에스터라제를 암호화하는 유전자의 전사(transcription) 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 상기 효소의 발현 수준이 저하되거나 전혀 발현되지 않아 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 야생형에 비하여 낮거나 전혀 없는 경우, 또는 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.
일 구체예에 따르면, 상기 환자는 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 암은 MDM2(mouse double minute 2), Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large), 또는 이들 모두가 존재하거나 과발현 또는 과활성화된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 MDM2는 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예를 들면, 인간 MDM2(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001138809.1, NP_001138811.1, NP_001138812.1, NP_001265391.1, NP_002383.2; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001145336.1, NM_001145337.2, NM_001145339.2, NM_001145340.2, NM_001278462.1 등), 또는 마우스 MDM2 (단백질: GenBank Accession No. NP_001275515.1, NP_034916.1; 유전자: GenBank Accession No. NM_001288586.2, NM_010786.4 등))일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 Bcl-xL는 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예를 들면, Bcl-xL는 인간 Bcl-xL(단백질: GenBank Accession Nos. NP_001304848.1, NP_001304849.1, NP_001304850.1, NP_001309168.1, NP_001309169.1 , NP_001309171.1, NP_612815.1; 유전자: GenBank Accession Nos. NM_001317919.1, NM_001317920.1, NM_001317921.1, NM_001322239.1, NM_001322240.1, NM_001322242.1, NM_138578.3 등), 또는 마우스 Bcl-xL(단백질: GenBank Accession No. NP_001276645.1, NP_001276646.1, NP_001341982.1, NP_033873.3; 유전자: GenBank Accession No. NM_001289716.1, NM_001289717.1, NM_001355053.1, NM_009743.5 등))일 수 있다.
본 명세서에서,"과발현"이란 카르복실에스터라제를 암호화하는 유전자의 전사(transcription) 유도 또는 번역(translation) 유도 등으로 야생형(wildtype)에 비해 많은 양이 발현된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "과활성화"란 카르복실에스터라제가 유전자의 핵산 서열 및/또는 단백질의 아미노산 서열의 변이(치환, 결실, 부가 등) 및/또는 2차 또는 3차 구조의 변형 등의 변이에 의하여 효소 활성 정도가 야생형(wildtype)에 비하여 증가된 것을 포함한다.
종양 억제 인자 p53(tumour suppressor p53)은 세포의 증식의 정지 및 사멸을 조절하는 유전자들을 조절하는 인자로서 비정상적인 세포들을 제거하여 정상세포가 암세포가 되는 것을 방지하는 중요한 인자로 알려져 있다. MDM2(mouse double minute 2)는 p53을 유비퀴틴화시켜 분해하는 E3 리가아제(E3 ligase)로서 정상상태에서 p53 단백질은 MDM2에 의해 분해가 유도되어 세포 내에서 그 수준이 낮게 유지된다. 그러나 DNA 등에 손상이 생기면, p53 단백질은 인산화 및 아세틸화되고 MDM2와의 결합이 억제되어 분해되지 않고 세포 내에 축적된다. 한편, MDM2가 축적되면 p53의 분해를 유도하므로, 암 발생의 원인이 된다.
본 일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 직접적으로 TopoI 보다 MDM2에 강하게 결합할 수 있으므로, p53을 안정화시키고 세포사멸을 유도하여 항암 활성을 가질 수 있다.
Bcl-xL은 Bcl-2 패밀리 중 하나로서, Bcl-2 단백질 패밀리는 외부 미토콘드리아 막 투과성 및 시토크롬 c 방출의 조절에 의한 미토콘드리아 세포사멸 경로의 중요한 인자이다. 항-세포사멸 Bcl-2 패밀리 단백질은 세포사멸 유도 BH3 단백질의 분리(sequestration)를 통해 항-세포사멸 기능을 수행한다. Bcl-2 계열 단백질로는 ① 세포생존을 촉진시키는 단백질 (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1), ② Bcl-2와 유사한 구조, 특히 BH1, BH2, BH3 영역의 구조적 유사성이 있고 세포사멸 촉진작용을 하는 단백질(Bax, Bak, Bok), ③ BH3 영역을 제외하고는 Bcl-2 혹은 동일 계열 단백질 상호간에 유사성이 거의 없으며 세포사멸 촉진 작용을 하는 BH3-only 단백질(protein)(Bik, Bad, Bid, Bim, Bmf, Hrk, Noxa, Puma) 등이 있다.
일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 직접적으로 TopoI 보다 Bcl-xL에 강하게 결합할 수 있으므로, Bcl-xL과 필수 전-세포사멸 단백질인 Bim과의 추가 상호 작용을 방지하여 항암 활성을 가질 수 있다.
본 명세서에서, "암"이란, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 종양, 또는 종양을 형성하는 병을 의미하며, 특히 정상적인 세포사멸 활성의 상실, 부족 등에 의해 발병되는 것일 수 있다. 따라서, 세포사멸의 조절을 통해 암을 치료 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 암은 상기 약학 조성물에 의해 증상이 완화, 경감, 개선 또는　치료될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, MDM2 및/또는 Bcl-xL 존재 또는 과발현과 관련된 모든 암을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 암은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 전립선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장골반암, 혈액암, 뇌암, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산 알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및/또는 탈크 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 투여, 비경구 투여 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 각 투여 경로에 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calciumcarbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있다. 비경구 투여는 복강내 투여, 직장내 투여, 피하 투여, 정맥 투여, 근육내 투여 또는 흉부내 투여 등에 의하여 수행될 수 있고, 상기 투여는 주사 등 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 명세서에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 1㎎ 내지 200㎎, 또는 10㎎ 내지 200㎎을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 상기 투여량 및 투여 간격은 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.
다른 양상은, 이리노테칸을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 환자는 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화되었을 수 있다.
일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자에 투여되어 SN-38로 전환되지 않아도 직접적으로 MDM-2 및/또는 Bcl-xL에 결합하여 항암 활성을 가질 수 있으므로, 일 구체예에 따른 예방 또는 치료 방법에 의하여 부작용 없이 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자의 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 암의 예방 또는 치료 방법은 투여하는 단계 이전에, 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자를 선별하는 단계는 환자로부터 채취된 생물학적 시료에서 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것을 확인하여 수행할 수 있다.
상기 카르복실에스터라제 활성의 약화 또는 불활성화 여부를 확인하는 단계는 공지된 방법이면 제한없이 수행될 수 있고, 예를 들면 에스터라제 효소의 기질인 파라-니트로페닐포스파타제(p-nitriphenylphosphate)나 파라-니트로페닐아세테이트(p-nitrophenylacetate)를 사용하여 효소역가 반응값으로 카르복실에스터라제 활성을 분석하거나, 카르복실에스터라제와 결합하는 항체를 반응시켜 결합을 유도하고, 그 결합 정도를 항체에 결합된 효소와 기질 복합 반응에 의한 발색 또는 형광 신호를 통하여 측정(정량)하는 효소면역분석방법 등을 사용하여 효소와 기질 간 반응 정도를 측정할 수 있다. 다른 예에서, 상기 카르복실에스터라제 활성의 약화 또는 불활성화 여부를 확인하는 단계는 카르복실에스터라제의 단백질의 아미노산 서열 또는 유전자의 핵산 서열의 분석을 통하여 돌연변이 여부를 검출하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이 때, 카르복실에스터라제의 단백질의 아미노산 서열 또는 유전자의 핵산 서열에 돌연변이(예를 들면, 점 돌연변이, 삽입, 결실)가 검출되는 경우(즉, 돌연변이가 존재하는 경우), 상기 생물학적 시료에서 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것으로 확인할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것으로 확인되었다면, 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자로 선별할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 암은 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 존재하거나 과발현된 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 암의 예방 또는 치료 방법은 투여하는 단계 이전에, MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 존재하거나 과발현된 암을 갖는 환자를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 존재하거나 과발현된 암을 갖는 환자를 선별하는 단계는 환자로부터 채취된 생물학적 시료에서 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하여 수행될 수 있고, 상기 생물학적 시료는 암 세포일 수 있다.
일 구체예에 따르면, MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하는 단계는 공지된 방법이면 제한없이 수행될 수 있고, 예를 들면 mdm2, bcl-xL, 또는 이들 모두의 mRNA 발현 수준 또는 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 단백질 발현을 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하는 단계는 실시간 PCR, RT-PCR, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해서 측정될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 환자로부터 채취된 생물학적 시료에서 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 검출되거나, 야생형(wildtype)보다 발현이 높은 경우, MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 존재하거나 과발현된 암을 갖는 환자로 선별할 수 있다.
상기 치료방법이 적용되는 대상 개체는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나 이에 한정되지 않는다. 이리노테칸을 포함하는 약학 조성물을 대상 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.
본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상 개체에게 상기 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소 적용)의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 예방 또는 치료 방법은 이리노테칸을 포함하는 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용할 수 있다.
다른 양상은, 생물학적 시료에서 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것을 확인(검출)하는 단계를 포함하는, 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것을 확인하는 단계는 공지된 방법이면 제한없이 수행될 수 있고, 이와 관련해서는 전술한 바와 같다.
본 명세서에서, "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포를 의미하고, 개체(예를 들면, 암 질환이 있는 개체)로부터 분리된 것일 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 및/또는 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 예를 들면, 포유동물, 또는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 확인하는 단계 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등의 전처리 단계를 수행할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법은 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것으로 확인된 생물학적 시료가 유래한 환자를 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자로 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 MDM-2 및/또는 Bcl-xL과 직접 결합하여 항암 활성을 갖고, 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자는 이리노테칸이 SN-38로 전환되지 않거나 그 정도가 약하므로, 부작용이 나타나지 않을 것으로 예상되고 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것으로 확인된 생물학적 시료가 유래한 환자를 이리노테칸 투여에 의해 암치료에 적절한 환자로 선별할 수 있다.
다른 양상은 생물학적 시료에서 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 따르면, MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하는 단계는 공지된 방법이면 제한없이 수행될 수 있고, 이와 관련해서는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 상기 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법은 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하여 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 검출된 생물학적 시료가 유래한 환자를 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자로 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 생물학적 시료에서 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것을 확인하는 단계; 및
생물학적 시료에서 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법은 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것으로 확인되고, MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하여 MDM2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 검출된 생물학적 시료가 유래한 환자를 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자로 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은, 이리노테칸을 포함하는, p53 분해 저해용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 이리노테칸을 p53 분해 저해를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, p53 분해 저해 방법을 제공한다. 투여하는 단계에 관한 것은 전술한 바와 같다.
상기 대상은 MDM2가 존재하거나 과발현된 환자일 수 있다.
상기 대상은 인간을 제외한 포유동몰, 또는 생체로부터 분리된 포유동물 세포일 수 있다.
다른 양상은 인비트로에서 이리노테칸을 포함하는 조성물을 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, p53 분해 저해 방법을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 분리된 세포는 MDM2가 존재하거나 과발현된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 p53 분해 저해 방법은 이리노테칸이 상기 MDM2에 결합하여 p53의 분해를 저해하는 것일 수 있다.
종양 억제 인자 p53은 세포 주기 진행, 아폽토시스, 노화의 중요한 조절자이다. 세포에 다양한 스트레스 요인이 작용하면 타겟 유전자에 p53-매개 전사 활성화 또는 억제가 일어난다. 이러한 작용으로 p53은 DNA 손상이 일어난 세포에서 세포 분열을 조절하고, DNA 손상을 복구하여 세포의 유전적 안정성을 유지한다. 종양 억제 인자로써의 역할 이외에 p53은 세포의 포도당 대사, 오토파지, 항산화 작용 등을 통해 세포의 생존을 촉진하는 역할도 갖는다. p53의 세포내 활성은 정상상태 수준과 전사 후 변형(post-transcriptional modification)에 의해 완벽하게 조절 받는다. 외부 스트레스가 없는 상황에서 p53은 MDM2(murine double minute 2) 단백질의 E3 리가아제 활성에 의해 억제된다. MDM2의 E3 리가아제 활성을 억제시키거나, MDM2와 p53의 상호작용을 방해하면 안정화 상태의 p53 수준이 높아져, 세포의 세포사멸이 촉진된다.
다른 양상은 이리노테칸을 포함하는, Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large)과 Bim(BCL2 like 11) 간 결합 저해용 조성물일 수 있다.
다른 양상은 이리노테칸을 Bcl-xL과 Bim 간 상호작용 저해를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, Bcl-xL 과 Bim 간 상호작용 저해 방법을 제공한다. 투여하는 단계에 관한 것은 전술한 바와 같다.
상기 대상은 Bcl-xL이 존재하거나 과발현된 환자일 수 있다.
상기 대상은 인간을 제외한 포유동몰, 또는 생체로부터 분리된 포유동물 세포일 수 있다.
다른 양상은 인비트로에서 이리노테칸을 포함하는 조성물을 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, Bcl-xL 과 Bim 간 상호작용 저해 방법을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 분리된 세포는 Bcl-xL이 존재하거나 과발현된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 Bcl-xL과 Bim 간 상호작용 저해 방법은 이리노테칸이 상기 Bcl-xL에 결합하여 Bcl-xL과 Bim 간 상호작용을 저해하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 이리노테칸은 TopoI 보다 종양 억제 인자 p53의 E3 리가아제인 MDM2와 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)인 Bcl-xL에 직접적으로 결합하고, 세포사멸, 항 세포증식 및 세포주기 정지 효과를 갖는 것을 확인하였으므로, 이리노테칸 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 각각 뉴트린-3 및 ABT-737의 모델에 적합한 이리노테칸의 파마코포어 모델을 나타낸다. 도 1a 및 도 1b에서 괄호 안의 값은 적합 값(fit value)을 나타내고, 주황색은 방향족 고리를, 청록색은 소수성을, 녹색은 수소결합 수용체를, 적색은 양 이온화 변수를 나타낸다.
도 1c 내지 도 1e는 이리노테칸과 MDM-2, Bcl-xL, 또는 TopoI 사이의 예측 결합 모드를 나타내고 도 1c, 도 1d, 및 도 1e는 각각 MDM2, Bcl-xL, 및 TopoI에서 이리노테칸의 도킹 포즈를 나타낸다. 도 1c 내지 도 1e에서 괄호 안의 값은 에너지 값을 나타내고, 도킹 결과 중 NMR 결과에 매핑된 잔기는 적색으로 나타내었다.
도 2a 및 도 2b는 이리노테칸 존재 또는 부존재 하에서 15N-표지된 MDM2 및 Bcl-xL에 대해 관찰된 2D 1H-15N HSQC 스펙트럼 결과를 나타낸다. 도 2a 및 도 2b에서 청색은 이리노테칸의 부존재하에서의 결과를 나타내고, 적색은 이리노테칸의 존재(MDM2 또는 Bcl-xL : 이리노테칸 = 1:4의 몰비로 존재) 하에서의 결과를 나타내며, 도 2a는 15N-표지된 MDM2에 대한 결과이고, 도 2b는 15N-표지된 Bcl-xL에 대한 결과이다.
도 2c 및 도 2d는 각각 MDM2(도 2c) 및 Bcl-xL(도 2d)에서 이리노테칸 결합에 의해 유도된 화학적 이동 변동을 나타내는 잔기를 나타낸다. 도 2c 및 도 2d에서 그래프의 x축은 단백질(MDM2 또는 Bcl-xL)의 아미노산 잔기 번호를 나타내고, y축은 화학적 이동의 변동 폭을 나타낸다. 도 2c 및 도 2d에서 이리노테칸 결합시 사라진 MDM2와 Bcl-xL의 공명(resonance)은 회색 막대로 표시된다.
도 2e 및 도 2f는 각각 MDM2의 구조(PDB ID: 4HG7, 도 2e) 및 Bcl-xL의 구조(PDB ID: 2YXJ, 도 2f)에 대해 이리노테칸의 결합 위치를 맵핑한 결과를 나타낸다. 도 2e 및 도 2f에서 이리노테칸과의 화학적 결합에 의해 사라진 잔기는 적색으로 표시되고, MDM2(도 2e)에서 CS>0.015ppm 및 Bcl-xL(도 2f)에서 CS>0.03ppm의 화학적 이동 변동을 나타내는 잔기는 노란색으로 표시된다.
도 3a는 HCT116 세포에 이리노테칸을 처리한 후 p53 및 MDM2에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내고, 도 3b는 SW480 세포에 이리노테칸을 처리한 후 p53 및 MDM2에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 3c는 HCT116 세포에 이리노테칸을 처리하고 Bcl-xL에 대해 면역 침전을 수행한 후 Bim 및 Bcl-xL에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 4a는 이리노테칸 처리시 HCT116 세포의 생존력을 측정한 결과를 나타내고, 도 4b는 이리노테칸 처리시 HCT116 세포의 사멸효과를 나타내며, 도 4c는 이리노테칸 처리시 HCT116 세포의 증식 억제 효과를 나타내고, 도 4d는 이리노테칸 처리시 세포 주기 정지 효과를 나타낸다. Bcl-xL 및 MDM2의 특이적 억제제로서 각각 ABT-737 및 뉴트린-3을 대조 화합물로 사용하였다.
도 5a는 이리노테칸 존재 또는 부존재 하에서 15N-표지된 MDM2 및 BclxL에 대해 관찰된 중첩된(overlaid) 2D 1H-15N HSQC 스펙트럼 결과를 나타낸다. 도 5a의 A 및 B에서 청색은 이리노테칸의 부존재 하에서의 결과를 나타내고, 적색은 이리노테칸의 존재 하에서의 결과를 나타내며, 도 5a의 A는 15N-표지된 MDM2에 대한 결과이고, 도 5a의 B는 15N-표지된 Bcl-xL에 대한 결과이다.
도 5b의 A 및 B는 각각 MDM2/뉴트린-3 복합체(complex)의 구조(PDB ID: 4HG7; A) 및 Bcl-xL/ABT-737 복합체의 구조(PDB ID: 2YXJ; B)에 대해 이리노테칸의 결합 위치를 맵핑한 결과를 나타낸다. 도 5b의 A에서 청색 구조체는 뉴트린-3을 나타내고 B에서 적색 구조체는 ABT-737을 나타내며, 도 5b의 A 및 B에서 이리노테칸과의 결합에 의해 사라진 단백질 잔기는 적색으로 표시되고, MDM2(A)에서 CS>0.015ppm 및 Bcl-xL(B)에서 CS>0.03ppm의 화학적 이동 변동을 나타내는 잔기는 노란색으로 표시된다.
이하, 참고예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 참고예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 구조 모델링
Pipeline Pilot[Pipeline Pilot; Accelrys, Inc.: San Diego, CA, 2000]을 사용하여, 뉴트린-3(Nutlin-3) 및 ABT-737과 2D 구조적 유사성을 이리노테칸과 비교하였다. 2D 구조를 모건 알고리즘을 기반으로 한 표준 원형 지문(standard circular fingerprint), ECFP4 등의 분자 표현자(molecular descriptor)로 변환했다. 타니모토 유사도(Tanimoto similarity)를 이용하여 화합물 쌍(compound pairs) 사이의 유사성을 계산하였다.
DS(Discovery Studio 3.1; Accelrys Co.)로부터 생성된 분자의 3D 입체 구조에서 파마코포어 특징(pharmacophore feature)을 구축하는데 뉴트린-3과 ABT-737을 사용하였다. 뉴트린-3 및 ABT-737의 화학적 특성의 3차원 공간 배열 또는 배치(configuration)를 확인했다. 이 프로토콜은 단일 리간드로부터 선택적인 파마코포어 모델을 제조하기 위하여, 수소 결합 수용체/공여체, 소수성 특징, 음이온/양이온 이온화 특징 및 방향족 고리를 고려하였다. 후보 파마코포어 모델의 세트는 특징(feature)으로부터 계산되었다. GFA(Genetic Function Approximation) 모델에 의해 예측된 바와 같이, 프로토콜은 가장 높은 선택도를 갖는 파마코포어를 선택하였다.
DS에서 Libdock 알고리즘을 이용한 도킹 시뮬레이션은 각각 3개의 단백질 MDM2, Bcl-xL 및 TopoI에 대한 화합물로 수행되었다. MDM2와 뉴트린-3의 X-선 결정 구조 복합체는 단백질 데이터 뱅크(PDB ID: 4HG7)로부터 얻었고 Bcl-xL과 ABT-737의 X-선 결정 구조 복합체도 단백질 데이터 뱅크(PDB ID: 2YXJ)로부터 얻었다. 또한, DNA와 인간 TopoI의 X 선 결정 구조 복합체는 단백질 데이터 뱅크(PDB ID: 1A35)로부터 얻었다. 제안된 결합 부위는 리간드 중심에 위치하였으며, 다음의 좌표를 갖는 위치 구(site sphere)가 생성되었다 : MDM2의 경우 직경 9.5Å인 23.835, 7.53, -14.053; Bcl-xL의 경우 직경 9Å인 39.1692, 4.14924, 10.7891이고; TopoI의 경우 직경 13.6Å인 39.1692, 4.14924, 10.7891. 프로토콜은 도킹 허용 오차가 0.25인 100 핫스팟을 포함한다. FAST 입체구조 방법(FAST conformation method)이 CHARMm과 함께 사용되었다. 다른 모든 매개 변수는 기본 설정을 따랐다.
뉴트린(nutlin, 예를 들면 뉴트린-3)이라는 화합물은 MDM2에 강하게 결합하여 MDM2-p53의 상호작용을 억제함으로써 p53을 안정화시켜 세포사멸을 유도하고, ABT-737은 Bcl-2 또는 Bcl-xL의 BH3 모티프에 결합하여 Bax 또는 Bim과 같은 필수 전-세포사멸 단백질과의 추가 상호 작용을 방지하므로, 대조화합물로서 사용되었다.
참고예 2. 단백질 정제
NMR 실험을 위해, 15N-표지된 MDM2 및 Bcl-xL가 15N-NH4Cl을 함유하는 최소 배지에서 발현되었다. 37℃에서 Escherichia coli BL21 CodonPlus RP 세포를 600nm(OD 600)에서 흡광도(optical density) 값이 ~0.9가 되도록 성장시키고, MDM2(잔기 3-109) 구조체의 N 말단 도메인의 발현이 20℃에서 0.4mM IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside)와 함께 16시간 동안 유도되었다. 단백질을 암모늄 설페이트로 침전시키고, 이온 교환 컬럼(HiTrap® SP 및 Q-Sepharose, GE healthcare) 및 겔 여과 컬럼(HiLoad® 16/600 Superdex 75pg, GE healthcare)을 사용하여 추가로 정제하였다. 이전에 보고된 바(M.K. Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 495 (2018) 1067-1073. 및 M.K. Yoon et al., J. Biol. Chem. 293 (2018) 19546-19558.)와 같이, 15N-표지된 절단 Bcl-xL 구조체가 NMR 실험을 위해 발현되고 정제되었다.
참고예 3. NMR 분광법
한국기초과학지원연구원(KBSI)에서 Bruker Avance Ⅱ 800 분광계를 사용하여 모든 NMR 스펙트럼을 수집하였다. 0.4mM의 이리노테칸 존재 또는 부존재 하에서, 0.1mM MDM2 또는 Bcl-xL의 2D 1H-15N HSQC 스펙트럼이 10℃ 및 25℃에서 각각 얻어졌다. NMR 샘플은 90%의 H2O/10% D2O를 포함하고, MDM2의 경우 20mM MES(pH 6.5), 50mM NaCl 및 1mM DTT에서 NMR 샘플을 제조하였고, Bcl-xL의 경우 20mM 인산 나트륨(pH 6.5), 50mM NaCl 및 1mM DTT에서 NMR 샘플을 제조하였다. nmrPipe/nmrDraw 및 SPARKY 소프트웨어를 사용하여 모든 NMR 데이터를 처리 및 분석하였다. MDM2와 Bcl-xL의 2D 1H-15N HSQC 스펙트럼의 확인(assignment)을 위해 BMRB 항목(entry) 18876과 18250을 각각 사용했다.
참고예 4. 세포 배양 및 화합물
HCT116 세포(인간 결장암 세포, p53 야생형), SW480 세포(인간 결장암 세포, p53 돌연변이체)는 ATCC로부터 구입하여 사용하였다.
HCT116 세포를 2mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 소태아 혈청(FBS)이 보충된 McCoy's 5a 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. SW480 세포를 Leibovitz's L-15 Medium 배지에서 37℃, CO2가 존재하지 않는 조건으로 배양하였다.
이리노테칸은 Biopurify Phytochemicals Ltd.에서 구입하였고, ABT-737은 APExBIO에서 구입하였으며 뉴트린-3(Nutlin-3)는 Sigma Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
참고예 5. 웨스턴 블롯 및 면역 침전(immunoprecipitation) 분석
프로테아제-억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충액으로 HCT116 세포 또는 SW480 세포를 용해시켰다. 전체 세포 용해물(Whole-cell lysate)을 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한 후. 4℃, 20,000xg에서 20분 동안 원심분리하고 상등액을 수집하였다.
면역 침전(IP) 분석을 위해, 상기에서 수득된 상등액을 항-Bcl-xL 항체(Cell signaling)와 함께 3시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 추가적으로 단백질 A/G 플러스 아가로오스(Santa Cruz Biotechnology)를 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 아가로오스겔에 포획된 면역 복합체를 RIPA 완충액으로 3회 세척하고, SDS 젤-로딩 완충액으로 용출시켰다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 상기에서 수득된 상등액을 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 분리하고, 분리된 단백질을 PVDF 막에 블로팅하였다. 그 다음 블롯에 항-p53, 항-MDM2(모두 Thermo Fisher Scientific), 항-Bim, 항-Bcl-xL, 또는 항-GAPDH(모두 Cell signaling) 항체를 첨가하고, 37℃에서, 18시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 블롯을 TBST(a mixture of tris-buffered saline (TBS) and Tween 20)로 세척하고 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합(horseradish peroxidase-conjugated) 2차 항체(Thermo Fisher Scientific)와 37℃에서, 1시간 동안 인큐베이션하고 세척한 후, 강화된 화학발광(ECL; Amersham)을 검출하였다. GAPDH는 대조군으로서 사용되었다.
참고예 6. 세포 생존력 분석(viability assay)
Cell Titer-Glo 세포 생존력 분석 키트(Promega)를 사용하여 세포 생존력을 분석하였다. HCT116 세포를 96 웰 플레이트에 104 세포/웰의 밀도로 접종하고, 세포를 화합물(이리노테칸, 뉴트린-3, 또는 ABT-737)로 처리하기 전에 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 다양한 농도(0 내지 50μM)로 이리노테칸, 뉴트린-3, 또는 ABT-737이 처리된 플레이트를 5% CO2, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
그 후, 세포를 실온(RT)에서 30분 동안 배양하고, 분석 시약 100㎕을 각 웰에 첨가한 후 VICTOR X Multilabel Reader(PerkinElmer)를 사용하여 발광(luminescence)을 측정하여 이로부터 세포의 생존력(%)을 계산하였다.
참고예 7. 세포사멸 분석(apoptosis assay)
Caspase-Glo 3/7 분석 키트(Promega)를 사용하여 세포사멸 분석을 수행하였다. HCT-116 세포를 96 웰 플레이트에 104 세포/웰의 밀도로 접종하고, HCT116 세포를 화합물로 처리하기 전에 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상기 참고예 6의 방법으로 계산된 생존력 용량 반응 곡선(viability dose response curve)에서 IC50에 상응하는 농도로 각 화합물(이리노테칸, 뉴트린-3, 또는 ABT-737)을 세포에 처리하여, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 분석 전에, 세포를 실온에서 30분 동안 배양하고, 분석 시약 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. VICTOR X Multilabel Reader(PerkinElmer)를 사용하여 발광(luminescence)을 측정하였다. 각각의 실험은 3회 반복하여 수행되었다.
참고예 8. 세포 증식 분석(cell proliferation assay)
BrdU(5-bromo-2′-deoxyuridine)는 일반적으로 증식하는 세포의 검출에 사용된다. 제조사의 프로토콜에 따라, BrdU 이입(incorporation)을 통해 세포 증식 ELISA 키트(Roche)를 사용하여 상기 참고예 6의 방법으로 계산된 생존력 용량 반응 곡선(viability dose response curve)에서 IC50에 상응하는 농도로 HCT116 세포에 화합물(이리노테칸, 또는 뉴트린-3)을 처리하여 세포 증식을 측정하였다. 기질 용액(substrate solution)으로 BrdU의 세포 이입을 시각화하고, 루미노미터(PerkinElmer Victor X4) 를 사용하여 화학 발광(chemiluminescence)을 측정하였다. 각각의 실험은 3회 반복하여 수행되었다.
참고예 9. 세포 주기 분석(cell cycle analysis)
HCT116 세포를 25cm2 플라스크(106 세포/플라스크)에 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 상기 참고예 6의 방법으로 계산된 생존력 용량 반응 곡선(viability dose response curve)에서 IC50에 상응하는 농도로 각 화합물(이리노테칸, 뉴트린-3, 또는 ABT-737)을 8시간 동안 세포에 처리하였다. 세포를 트립신으로 처리하고, 수집하여, 시험관 내에서 80% 차가운 에탄올 1㎖로 고정시키고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 1,500rpm에서 5분간 원심 분리하고, 세포 펠렛을 300㎍/㎖ RNase(Sigma-Aldrich)를 함유하는 500㎕의 프로피듐 요오드(propidium iodine)(10㎍/㎖)에 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 나일론 메쉬로 여과하였다. 유동 세포 계측기(BD FACS CantoⅡ) 및 BD FACSDiva Clinical 소프트웨어를 이용하여 세포 주기 분포를 계산하였다.
실시예 1. 이리노테칸과 MDM2 또는 Bcl-xL간의 직접 결합 확인
MDM2 및 Bcl-xL을 표적으로 하는 분자를 찾기 위해 뉴트린-3와 ABT-737과 유사한 화합물을 조사했다. 이리노테칸과 ABT-737 및 뉴트린-3의 유사성을 조사하기 위해, 상기 참고예 1의 방법으로 ECFP(extended connectivity fingerprint)에 기초한 구조적 유사성 분석을 수행했다. 타니모토 유사도는 화합물 쌍의 유사성을 측정하기 위해 계산되었고, 타니모토 점수는 각각 ABT-737 및 Nutlin-3에 대해 0.18 및 0.11이었다.
2D 구조의 유사성이 낮기 때문에 구조의 3D 배열을 고려하여 유사성을 분석하기 위해, 상기 참고예 1의 방법으로 파마코포어 모델링 및 도킹 시뮬레이션을 수행했다.
수소 결합 수용체/공여체 특성, 양이온/음이온 이온화 특성, 방향족 고리 특성 및 소수성 특성을 포함하여 뉴트린-3 및 ABT-737의 파마코포어 특성을 생성하였다. 도 1a 및 도 1b는 각각 뉴트린-3 및 ABT-737의 모델에 적합한 이리노테칸의 파마코포어 모델을 나타낸다. 도 1a 및 도 1b에서 괄호 안의 값은 적합 값(fit value)을 나타내고, 주황색은 방향족 고리를, 청록색은 소수성을, 녹색은 수소결합 수용체를, 적색은 양 이온화 변수를 나타낸다. 이리노테칸은 각각 0.55와 0.56의 적합 값(fit value)을 가진 파생 모델에 적합했다. 이로부터 이리노테칸이 기존에 MDM2 및 Bcl-xL과 결합한다고 알려진 두 성분(뉴트린-3 및 ABT-737)의 약리단(파마코포어)과 잘 매핑되는 것을 알 수 있었다.
도 1c 내지 도 1e는 이리노테칸과 MDM-2, Bcl-xL, 또는 TopoI 사이의 예측 결합 모드를 나타내며 도 1c, 도 1d, 또는 도 1e는 각각 MDM2, Bcl-xL, 및 TopoI 에서 이리노테칸의 도킹 포즈를 나타낸다. 도 1c 내지 도 1e에서 괄호 안의 값은 에너지 값을 나타낸다. 이리노테칸의 도킹 시뮬레이션을 통해 얻어진 각각의 에너지 값(-100.37, -170.59 및 -99.53)으로 미루어 보아 이리노테칸은 TopoI 보다 MDM2 및 Bcl-xL에 더 안정적으로 결합하는 것을 알 수 있었다. 도 1c 내지 도 1e에서, 도킹 결과 중 NMR 결과에 매핑된 잔기는 적색으로 나타내었다. 특히, 결합 영역에서 MDM2의 V53, L54, L57, F91, 및 V93과 Bcl-xL의 L130, R139, A142, 및 Y195와 같은 잔기가 NMR 결과에도 존재하는 것이 입증되었다.
MDM2와 Bcl-xL에 대한 이리노테칸의 직접 결합을 조사하기 위해, 상기 참고예 2 및 3의 방법으로 NMR 분광기를 사용하여 2D 1H-15N HSQC 실험을 수행했다. 이리노테칸과의 결합 적정(binding titration) 동안, 15N-표지된 MDM2와 Bcl-xL의 NMR 화학적 이동 변동(chemical shift perturbation)을 관찰하였다.
도 2a, 도 2b, 및 도 5a는 이리노테칸 존재 또는 부존재하에서 관찰된 2D 1H-15N HSQC 스펙트럼 결과를 나타낸다 도 2a, 도 2b, 및 도 5a에서 나타난 바와 같이 중첩된 2D 1H-15N HSQC 스펙트럼에서 MDM2와 Bcl-xL의 몇몇 교차 피크가 사라지고, 이동하였으며 이는 유리(free) 및 이리노테칸 결합 형태 사이에서 빠른 교환이 나타나는 것을 의미하고, 이러한 NMR 화학적 이동 변동은 MDM2 또는 Bcl-xL에 대해 이리노테칸의 직접 결합을 입증했다.
도 2c 및 도 2d는 각각 MDM2(도 2c) 및 Bcl-xL(도 2d)에서 이리노테칸 결합에 의해 유도된 화학적 이동 변동을 나타내는 잔기를 나타낸다. 도 2c 및 도 2d에서 그래프의 x축은 단백질(MDM2 또는 Bcl-xL)의 아미노산 잔기 번호를 나타내고, y축은 화학적 이동의 변동 폭을 나타낸다. 화학적 이동 변동 폭은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다. 도 2c 및 도 2d에서 이리노테칸 결합시 사라진 MDM2와 Bcl-xL의 공명(resonance)은 회색 막대로 표시된다.
(수학식 1)
ΔCS = [(Δ1H)2+0.2(Δ15N)2]0.5
ΔCS = 화학적 이동 변동
Δ1H = 1H 차원(dimension)에서의 화학적 이동 변동
Δ15N = 15N 차원(dimension)에서의 화학적 이동 변동
도 2e 및 도 2f는 각각 MDM2의 구조(PDB ID: 4HG7, 도 2e) 및 Bcl-xL의 구조(PDB ID: 2YXJ, 도 2f)에 대해 이리노테칸의 결합 위치를 맵핑한 결과를 나타낸다. 도 2e 및 도 2f에서 이리노테칸과의 화학적 결합에 의해 사라진 잔기는 적색으로 표시되고, MDM2(도 2e)에서 CS>0.015ppm 및 Bcl-xL(도 2f)에서 CS>0.03ppm의 화학적 이동 변동을 나타내는 잔기는 노란색으로 표시된다. 도 5b의 A 및 B는 각각 MDM2/뉴트린-3 복합체(complex)의 구조(PDB ID: 4HG7; A) 및 Bcl-xL/ABT-737 복합체의 구조(PDB ID: 2YXJ; B)에 대해 이리노테칸의 결합 위치를 맵핑한 결과를 나타낸다. 도 5b의 A에서 청색 구조체는 뉴트린-3을 나타내고, B에서 적색 구조체는 ABT-737을 나타낸다.
MDM2의 경우, 이리노테칸에 결합하여 유도된 NMR 화학적 이동 변동은 p53 펩타이드-결합 소수성 결합 포켓에 국한되고 이는 뉴트린-3과 MDM2 결합시 관찰된 것과 일치한다(도 2e 및 도 5b의 A). Bcl-xL의 경우, BH1, BH2 및 BH3 도메인으로 둘러싸인 BH3 펩타이드 결합 소수성 그루브(groove)에서 이리노테칸 유도 NMR 화학 교란 변동이 발생했으며, 이는 ABT-737과 Bcl-xL 결합시 관찰된 것과 일치한다(도 2f 및 도 5b의 B).
이러한 결과로부터, 이리노테칸은 MDM2 또는 Bcl-xL 단백질의 특이적 소수성 경계면 사이에서 직접적인 상호 작용을 하는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 이리노테칸에 의한 MDM2와 Bcl-xL의 신호 전달 파트너와의 결합 차단 효과
MDM2와 Bcl-xL에 대한 이리노테칸의 기능을 확인하기 위해, 이리노테칸 첨가시 MDM2-p53 및 Bcl-xL-Bim 결합에 대한 효과를 살펴보았다.
MDM2-p53 결합에 대한 이리노테칸 특이적 효과를 확인하기 위해, HCT116 세포에 이리노테칸을 처리하고 참고예 5의 웨스턴 블롯 분석을 통해 p53 발현 및 MDM2의 발현을 측정하여 이를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 뉴트린-3(공지 약물) 및 이리노테칸은 농도 의존적으로 p53과 MDM2의 원형 단백질(intact protein) 수준을 증가시켰다. 이러한 결과는 이리노테칸이 뉴트린-3와 마찬가지로 MDM2-p53 상호 작용의 억제제(inhibitor)인 것을 나타낸다. 이리노테칸이 MDM2-p53 결합 억제제인지 여부를 확인하기 위해 p53 비활성 돌연변이 세포인 SW480 세포에 이리노테칸을 처리하고 참고예 5의 웨스턴 블롯 분석을 통해 p53 발현 및 MDM2의 발현을 측정하여 이를 도 3b에 나타내었다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 돌연변이 p53을 갖는 세포(SW480 세포)는 MDM2 전사를 상향 조절할 수 없기 때문에 높은 수준의 전사 불활성 단백질을 축적하므로 HCT116 세포에서 사용된 것과 동일한 농도로 이리노테칸을 처리한 SW480 세포에서 p53은 지속적으로 발현되고, MDM2 발현은 검출되지 않았다. 이러한 결과는 이리노테칸이 MDM2 발현에 의존하여 야생형 p53 축적을 유도하고 이리노테칸이 MDM2-p53 결합을 특이적으로 조절한다는 것을 보여준다. 따라서 이리노테칸은 MDM2에 결합하여 p53-MDM2 복합체로부터 p53을 분비하여 p53의 전사 활성(transcriptional activity)을 통해 암세포의 증식 억제 및 세포 주기 정지를 유도할 수 있다.
Bcl-xL 관련 세포사멸 신호의 이리노테칸 매개 저해를 조사하기 위해 HCT116 세포에서 상기 참고예 5의 면역 침전 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 Bcl-xL과 Bim의 물리적 상호 작용을 조사했다. HCT116 세포에 이리노테칸을 처리한 후 Bcl-xL 항체를 사용하여 면역 침전을 수행하고, 웨스턴 블롯 분석을 통해 Bim 발현 및 Bcl-xL의 발현을 측정하여 이를 도 3c에 나타내었다. ABT-737(공지 약물)과 같이 이리노테칸 처리시 농도 의존적으로 Bcl-xL과 Bim 상호 작용의 분열(disruption)를 유도했다. 이 결과로부터 이리노테칸이 Bcl-xL의 직접 결합하여 복합체로부터 Bim(전-세포사멸 단백질)을 방출하여 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 이리노테칸의 항암 활성
이리노테칸의 항암 효능을 조사하기 위해 Bcl-xL 및/또는 MDM2 관련 반응, 암세포의 세포 생존력, 세포사멸, 세포 증식 및 세포 주기 정지(cell cycle arrest) 분석을 수행하였다. Bcl-xL 및 MDM2의 특이적 억제제로서 각각 ABT-737 및 뉴트린-3을 대조 화합물로 사용하였다.
실시예 3.1 이리노테칸 처리시 세포의 생존력 측정
상기 참고예 6의 방법과 같이, 이리노테칸 처리시 HCT116 세포의 생존력을 측정하여 이를 도 4a에 나타내었다. Bcl-xL 및 MDM2의 특이적 억제제로서 각각 ABT-737 및 뉴트린-3을 대조 화합물로 사용하였다. 각 화합물의 용량 반응 곡선(dose response curves)을 도시하고, IC50 값을 그래프로부터 계산하였다. 이리노테칸, 뉴트린-3 및 ABT-737의 IC50 값은 각각 10, 18 및 12μM이었다. 이 결과는 이리노테칸이 뉴트린-3 및 ABT-737에 비해 결장암 세포의 생존력을 감소시키는데 효과적임을 보여준다.
실시예 3.2 이리노테칸의 세포사멸 효과 측정
상기 실시예 3.1에서 관찰된 세포 생존력 감소에서 세포사멸 유도의 기여를 조사하기 위해, 상기 참고예 7의 방법으로 각각 IC50에 상응하는 농도의 화합물을 사용하여 HCT116 세포에서 카스파제 3/7 활성을 분석하여 이를 도 4b에 나타내었다. ABT-737은 세포사멸 유도에서 가장 높은 효능을 나타내었고, ABT-737 반응은 주로 Bcl-xL의 직접 저해에 의해 유도될 수 있다. 반면, 뉴트린-3의 약한 세포사멸 효과는 세포사멸 관련 p53 신호 전달을 통한 뉴트린-3의 2차 효과를 나타낼 수 있다. 한편 이리노테칸의 세포사멸 효과는 뉴트린-3 보다 거의 2배 높았지만 ABT-737의 절반 정도였다. 이로부터 이리노테칸이 MDM2 및 Bcl-xL의 활성을 모두 저해할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 3.3 이리노테칸의 세포 증식 억제 효과 측정
상기 실시예 3.1에서 관찰된 생존력 감소에서 세포 증식 억제의 기여를 조사하기 위해, 각각 IC50에 상응하는 농도의 화합물(이리노테칸 또는 뉴트린-3)을 사용하여 HCT116 세포에서 상기 참고예 8의 방법으로 세포 증식 분석을 수행하였다. 이리노테칸 또는 뉴트린-3이 처리된 HCT-116 세포에서 BrdU 이입을 측정하여 도 4c에 나타내었다. 도 4c에 나타난 바와 같이 이리노테칸 또는 뉴트린-3 처리된 세포에서 BrdU 양성 세포의 비율은 대조군 세포보다 거의 10배 정도 낮았다. 이리노테칸은 HCT116 세포에서 뉴트린-3와 유사한 항 증식 효과를 보였다.
실시예 3.4 이리노테칸의 세포 주기 정지(arrest) 효과 측정
이리노테칸의 억제 효과가 세포 주기 정지에 의해 매개되는지 여부를 결정하기 위해, 상기 참고예 9의 방법과 같이 세포 주기 진행에 대한 이리노테칸의 효과를 유동 세포 계측기로 분석하여 그 결과를 도 4d에 나타내었다. 도 4d에 도시된 바와 같이, 화합물(이리노테칸 또는 뉴트린-3)이 처리되지 않은 대조군에서 대부분의 HCT116 세포는 G1기에 존재하였다. 이리노테칸 처리는 HCT116 세포에서 세포 주기의 후기 단계를 유의하게 증가시켰고 정지 시기는 뉴트린-3에 의한 정지시기(G1 또는 G2/M 어레스트) 와 동일하였고, 이는 MDM2에 결합하는 것에 의한 동일 효과이다. 이리노테칸은 알려진 세포 억제제인 뉴트린-3와 같이 세포에서 강한 G1 또는 G2/M 세포 주기 정지를 보였다.

Claims (9)

  1. 이리노테칸(irinotecan) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 환자에 적용하기 위한 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 MDM2(mouse double minute 2), Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large), 또는 이들 모두가 존재하거나 과발현 또는 과활성화된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 생물학적 시료에서 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것을 확인하는 단계를 포함하는, 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 카르복실에스터라제 활성이 약화 또는 불활성화된 것으로 확인된 생물학적 시료가 유래한 환자를 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자로 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 생물학적 시료에서 Mdm2, Bcl-xL, 또는 이들 모두의 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자 선별에 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, Mdm2, Bcl-xL, 또는 이들 모두가 검출된 생물학적 시료가 유래한 환자를 이리노테칸 투여에 의한 암 치료에 적절한 환자로 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 이리노테칸을 포함하는, p53 분해 저해용 조성물.
  9. 이리노테칸을 포함하는, Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large)과 Bim(BCL2 like 11) 간 결합 저해용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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