CN105765078A - Vegf抑制剂长期有效性预测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的VEGF抑制剂长期有效性预测方法是预测VEGF抑制剂对受试者的肿瘤的长期有效性的方法，其中，确定在从所述受试者采集的血液样品中是否存在RAS基因来源的核酸或RAS蛋白，确定所述血液样品中的所述RAS基因来源的核酸是野生型还是突变型、或所述血液样品中的所述RAS蛋白是野生型还是突变型，当在所述血液样品中检测到野生型的RAS基因来源的核酸或野生型的RAS蛋白时、且在所述血液样品中检测到突变型的RAS基因来源的核酸或突变型的RAS蛋白时，判定所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性高，当在所述血液样品中检测到所述突变型的RAS基因来源的核酸或所述突变型的RAS蛋白时，判定所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性低。

Description

VEGF抑制剂长期有效性预测方法
技术领域
本发明涉及通过对从受试者低侵袭性采集的生物样品中的RAS蛋白的基因型进行研究，从而预测该受试者的VEGF抑制剂的长期有效性的方法。
本申请以2013年11月15日在日本申请的日本特愿2013-237162号为基础主张优先权，将其内容援引在此。
背景技术
血管内皮细胞生长因子(VEGF)是与脉管形成(胚胎形成期在没有血管的部位生成新的血管)及血管新生(从现有血管伸出分枝形成血管)相关的一组糖蛋白。VEGF有时也被称为血管内皮细胞成长因子、血管内皮生长因子、血管内皮成长因子等。VEGF作为配体主要与位于血管内皮细胞表面的血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)结合，具有刺激细胞分裂、游走、分化、使微小血管的血管通透性亢进的作用，还与单核细胞-巨噬细胞的活化相关。VEGF除了与正常体内的血管新生相关以外，还与肿瘤的血管形成或转移等恶性化的过程相关。
与脉管形成、血管新生、淋巴管新生相关的生长因子有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGF(胎盘生长因子，placentalgrowthfactor)-1、PlGF-2这7个。将它们统称为“VEGF家族”。在单称为VEGF时，有时也指VEGF-A。此外，几个VEGF家族成员由于选择性剪接而存在有几种亚型。例如VEGF-A在人通常存在氨基酸数为121个(VEGF-A121)、165个(VEGF-A165)、189个(VEGF-A189)、206个(VEGF-A206)这4种(非专利文献1)。除此以外，还报道有VEGF-A145、VEGF-A183这样的稀有亚型(非专利文献2)。
VEGF为血管新生的重要的促进因子，VEGF信号传递系统作为控制血管新生的靶分子而受到关注。VEGF在包括癌在内的各种细胞中，主要在低氧条件下由转录因子HIF-1(低氧诱导因子，hypoxiainduciblefactor1)诱导表达。由于mRNA剪接的差异，VEGF以几种大小的均二聚体形式被产生、分泌。之后，不仅主要介由受体型酪氨酸激酶的VEGF2型受体促进血管内皮细胞的游走、扩增，而且使血管通透性提高。
目前为止，有几个研究小组列举了VEGF的有效性预测标记物，但尚未有作为决定性候补的标记物的报告。InceWL等通过临床三期试验报道了，在转移性结肠、直肠癌患者的一线(firstline)治疗中，通过向LV/5-FU+CPT-11合并疗法(IFLregimen)中追加抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab)，OS中央值延长(IFL+bevacizumab组与IFL/安慰剂组的比较试验，参见非专利文献3)。另外，他们为了评价KRAS、b-RAF、p53的变异状況或核内p53过量表达可否作为用于预测贝伐单抗的治疗效果的生物标记物，以本试验的参加者为对象进行了回溯分析。
另外，Johansen等对癌相关基因的变异与VEGF抑制剂的敏感性、长期有效性之间的相关性进行了研究，报告了肿瘤组织中的癌相关基因突变可作为预测VEGF抑制剂在消化癌中的敏感性、长期有效性的标记物发挥功能(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2012-502285号公报
非专利文献
非专利文献1：TischerE，etal.，JournalofBiologicalChemistry，vol.266，1991，p.11947-11954.
非专利文献2：NeufeidG，etal.，FASEBJournal，vol.13，1999，p.9-22.
非专利文献3：InceWL，etal.，JournaloftheNationalCancerInstitute，vol.97(13)，2005，p.981-989.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种无论患者的肿瘤组织中的RAS的状态如何、以该患者的末梢血中的RAS的状态为指标来预测作为血管新生抑制剂发挥功能的VEGF抑制剂对肿瘤(癌)的患者的有效性的方法。
用于解决课题的方法
本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，在癌患者中，给予了VEGF抑制剂时，当肿瘤组织中的RAS的状态为突变型、末梢血中的RAS的状态为野生型时，VEGF抑制剂显著地长期有效，以及尽管在VEGF的肿瘤组织中未检测到RAS的突变型、但在末梢血中检测到了突变型的RAS的患者中，VEGF抑制剂的有效性低，从而完成了本发明。
本发明的一个实施方式的VEGF抑制剂长期有效性预测方法是预测VEGF抑制剂对受试者的肿瘤的长期有效性的方法，其中，确定在从所述受试者采集的血液样品中是否存在RAS基因来源的核酸或RAS蛋白，确定所述血液样品中的所述RAS基因来源的核酸是野生型还是突变型、或所述血液样品中的所述RAS蛋白是野生型还是突变型，当在所述血液样品中检测到野生型的RAS基因来源的核酸或野生型的RAS蛋白时、且在所述血液样品中未检测到突变型的RAS基因来源的核酸或突变型的RAS蛋白时，判定所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性高，当在所述血液样品中检测到所述突变型的RAS基因来源的核酸或所述突变型的RAS蛋白时，判定所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性低。
上述一个实施方式中，所述受试者也可以在过去接受过肿瘤部分的外科切除处置或VEGF抑制剂给予处置。
上述一个实施方式中，所述RAS可以为KRas、HRas或NRAS。
上述一个实施方式中，所述受试者可以接受过除所述VEGF抑制剂以外的药剂的给予处置。
上述一个实施方式中，所述受试者为在接受VEGF抑制剂给药处置后接受了与所述VEGF抑制剂给药处置不同的抗肿瘤疗法的肿瘤患者，所述血液样品可以在所述肿瘤患者再次准备接受所述VEGF抑制剂给药处置之前采集。
上述一个实施方式中，所述抗肿瘤疗法可以为化疗剂的给药治疗。
上述一个实施方式中，所述化疗剂可以为选自氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、博莱霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿霉素、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱及他莫昔芬中的1种或2种以上。
上述一个实施方式中，所述抗肿瘤疗法可以为放射线治疗。
上述一个实施方式中，所述抗肿瘤疗法可以是与已向所述受试者给药的所述VEGF抑制剂不同种类的靶分子药剂的给药治疗。
上述一个实施方式中，所述靶分子药剂可以为选自西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、瑞格非尼、克里唑蒂尼、舒尼替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥珠单抗、拉帕替尼及利妥昔单抗中的1种或2种以上。
上述一个实施方式中，所述抗肿瘤疗法可以为所述靶分子药剂的给药治疗与化疗剂的给药治疗的合并疗法。
上述一个实施方式中，所述肿瘤可以为复发性肿瘤。
上述一个实施方式中，所述肿瘤可以为转移癌。
上述一个实施方式中，所述肿瘤可以为原发癌。
上述一个实施方式中，所述肿瘤可以为选自大肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、食道癌、头颈部癌、子宫癌及子宫颈癌中的1种或2种以上。
上述一个实施方式中，所述肿瘤可以存在于所述受试者的体内的多个部位。
上述一个实施方式中，所述突变型可以为选自所述RAS蛋白的G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、G12S2、G13A、G13S、G13V、G13R、G13C、Q61H、Q61L、Q61R、A146T及A146V中的1个或2个以上。
上述一个实施方式中，通过研究从所述血液样品中的循环DNA中是否检测到所述野生型的RAS基因来源的核酸、以及是否检测到所述突变型的RAS基因来源的核酸，可以确定所述血液样品中是否有所述RAS基因来源的核酸存在，可以确定所述RAS基因来源的核酸是野生型还是突变型。
上述一个实施方式中，所述血液样品可以为末梢血、血清、血浆。
发明效果
根据本发明的上述一个方式，能够从对受试者的侵袭性低的生物样品高精度地预测在受试者中VEGF抑制剂的抗肿瘤作用是否长期有效。
附图说明
图1为表示实施例1中进行的VEGF抑制剂(贝伐单抗)+FOLFOX治疗的方案的图。
图2为实施例1中ID编号4的患者的腹部CT摄影图。
图3为实施例1中ID编号22的患者的胸部CT摄影图。
图4为实施例1中ID编号9的患者的腹部CT摄影图。
图5为实施例1中ID编号9的患者的胸部CT摄影图。
具体实施方式
以往，一直认为血中的RAS基因或其蛋白(RAS蛋白)为从肿瘤组织通过血管浸润等而游离的基因或蛋白，血中的RAS的状态(基因型)与肿瘤组织的RAS的状态一致。但是，与该以往的认知相反，血中的KRAS的状态与肿瘤组织中的KRAS的状态有时并不一致。在此情况下，令人意外的是，VEGF抑制剂对肿瘤组织的长期有效性与肿瘤组织中的KRAS的状态相比更依赖于血中的KRAS的状态。该认知是本发明者们首次发现的。
本发明的VEGF抑制剂长期有效性预测方法(以下有时称为“本发明的长期有效性预测方法”)的特征在于，无论肿瘤组织中的RAS的状态如何，以血中的RAS的状态为指标，对VEGF抑制剂的长期有效性进行预测。对于血中的RAS为野生型且未检测到突变型的受试者，无论肿瘤组织中的RAS是野生型还是突变型，预测VEGF抑制剂给予带来的抗肿瘤作用长期、例如1年6个月以上有效的可能性高。相反，对于从血中检测到突变型的RAS的受试者，预测对VEGF抑制剂的长期有效性低、VEGF抑制剂的抗肿瘤作用仅较短期有效的可能性高。
实际情况如后述实施例1所示，无论原发癌或转移癌中的KRAS基因是否为突变型，血清中的KRAS状态显示为野生型的病例有3例。其中2例，贝伐单抗和FOLFOX化学合并疗法为一年半以上长期有效。该3例中，贝伐单抗、FOLFOX治疗未长期有效的1例，在原发癌切除处置的4个月后复发。该患者中，原发癌切除前检测到血清KRAS的G12A的突变型，在原发癌切除后、血清KRAS变为野生型。但是，其后的定期检查中从血清中再次检测到G12A。
也就是说，当肿瘤组织中可见突变的RAS基因存在时，可以预测检测到从末梢血中的循环DNA(cell-free(cf)DNA)突变而成的RAS基因的受试者对VEGF抑制剂的长期有效性低。相反，当未确认到从末梢血中的循环DNA突变而成的RAS基因的存在时，可以预测该受试者的肿瘤为VEGF抑制剂显示长期有效性的肿瘤。如此，不是以肿瘤组织中的RAS的状态为指标，而是以血中的RAS的状态为指标，能够高精度地预测VEGF抑制剂的长期有效性，这是本发明者们首次获得的认知。
即，本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法的特征在于，其为预测VEGF抑制剂对受试者的肿瘤的长期有效性的方法，其具有下述工序(a)和工序(b)。
(a)其为预测VEGF抑制剂对受试者的肿瘤的长期有效性的方法，其中，确定在从所述受试者采集的血液样品中是否存在RAS基因来源的核酸或RAS蛋白、确定所述血液样品中的所述RAS基因来源的核酸是野生型还是突变型、或者确定所述血液样品中的所述RAS蛋白是野生型还是突变型的工序；和
(b)当所述工序(a)中所述血液样品中检测到野生型的RAS基因来源的核酸或野生型的RAS蛋白时且所述血液样品中未检测到突变型的RAS基因来源的核酸或突变型的RAS蛋白时，判断所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性高，当所述血液样品中检测到所述突变型的RAS基因来源的核酸或所述突变型的RAS蛋白时，判断所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性低。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中检测的RAS可以是HRas、也可以是NRas、也可以是KRAS。本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，优选以KRAS的基因型作为判断的指标。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，所检测的突变型的RAS包含例如插入、重排、缺失及点突变等全部形态的突变。这些突变而成的RAS基因与在一个对立基因(异型结合性)或双方的对立基因(同型接合性)分别可见的野生型RAS不同，为体细胞性或生殖系列中可见的突变型RAS。体细胞突变仅发生在某种组织、例如肿瘤组织，在生殖细胞系列中不遗传。生殖系列突变从任意体组织中可见。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，作为所检测的突变型的RAS，优选RAS基因的外显子2～4上伴随着编码12、13、61及146中的1个或2个以上的氨基酸的突变而成的RAS。具体而言，例如可列举出具有选自RAS蛋白的G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G12S2、G13D、G13A、G13S、G13V、G13R、G13C、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、A146G、A146T及A146V中的1个或2个以上的变异的突变型RAS。各突变型的核酸(基因)突变的方式如表1所示。另外，分别将KRAS的氨基酸序列表示为序列编号1、将KRAS的包含外显子2上的编码12的基因序列表示为序列编号2、将KRAS的包含外显子3上的编码61的基因序列表示为序列编号3、将KRAS的包含外显子4上的编码146的基因序列表示为序列编号4。
表1
氨基酸替换 核酸突变 外显子
G12A 5571G＞C 2
G12C 5570G＞T 2
G12D 5571G＞A 2
G12R 5570G＞C 2
G12S 5570G＞A 2
G12V 5571G＞T 2
G12S2 5570G＞T，5570G＞C 2
G13D 5574G＞A 2
G13A 5574G＞C 2
G13V 5574G＞T 2
G13R 5573G＞C 2
G13S 5573G＞A 2
G13C 5573G＞T 2
Q61H 23579A＞C 3
Q61L 23578A＞T 3
Q61R 23578A＞G 3
Q61K 23577C＞A 3
A146G 25293G＞C 4
A146V 25294C＞T 4
A146T 25293G＞A 4
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，工序(a)中，不研究肿瘤组织中的RAS的状态，而是研究血液样品中的RAS的状态。作为血液样品，可以是末梢血本身，也可以是血清、血浆。血液样品与肿瘤组织相比可更低侵袭性地从受试者采集。因此，对于如复发肿瘤患者那样难以采集肿瘤组织的生物样品的受试者，也能够预测VEGF抑制剂的长期有效性。另外，血液样品还可以从受试者经时地采集，因此本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法也适宜于监测肿瘤是否复发。
其中，关于所述血液样品，无论是原发性肿瘤、转移性肿瘤还是复发性肿瘤，优选在肿瘤的初期阶段从受试者采集的血液样品。具体而言，本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，所使用的血液样品优选为CEA为5ng/mL以下或CA19-9的值为37.0U/mL以下的样品。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，预测长期有效性的VEGF抑制剂在以人为代表的动物中，只要是具有VEGF抑制作用的物质则没有特殊限定，可以是抗VEGF抗体，也可以是TKI。具体而言，作为抗VEGF抗体，可列举出贝伐单抗(制品名：Avastine(注册商标))等。本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，优选对这些VEGF抑制剂中的1种或2种以上的长期有效性进行预测。其中，优选对贝伐单抗的长期有效性进行预测。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，作为预测VEGF抑制剂的长期有效性的对象的肿瘤，只要是VEGF介导性肿瘤(癌)、即在肿瘤形成中VEGF担负某种作用的肿瘤，则没有特殊限定。该肿瘤中包括脑、肝脏、肾脏、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠直肠、前列腺、胰腺、乳房、肺、外阴部、甲状腺、结肠直肠、食道、肝脏的癌、肉瘤、神经胶质肉瘤、头颈部、白血病及淋巴性恶性疾病。更详细而言，还可包括神经母细胞瘤、肠癌(例如直肠癌、大肠癌、家族性大肠息肉癌及遗传性非息肉大肠癌)、食道癌、口唇癌、喉头癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髄样癌、甲状腺动脉乳头癌、肾癌、肾实质癌、卵巢癌、颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、尿管癌、黑色素瘤、脑肿瘤(例如神经胶质肉瘤、星状细胞瘤、脑脊髓膜瘤、髄母细胞瘤及末梢神经外胚层性肿瘤)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性髄性白血病(AML)、慢性髄性白血病(CML)、成人T细胞白血病、肝细胞癌、胆嚢癌、支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髄瘤、基底细胞瘤、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤因氏肉瘤及浆细胞瘤。本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，作为成为预测对象的肿瘤，优选为选自大肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、食道癌、头颈部癌、子宫癌及子宫颈癌中的1种或2种以上。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，成为预测VEGF抑制剂的长期有效性的对象的肿瘤可以是原发癌(原发性肿瘤)、也可以是转移癌(转移性肿瘤)。另外，还可以是复发性肿瘤。此外，肿瘤还可以存在于受试者体内的多个部位。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，优选预测VEGF抑制剂对复发性肿瘤的长期有效性。例如，通过使用从过去接受过肿瘤部分的外科切除处置的受试者、或过去接受过VEGF抑制剂给予处置的受试者采集的血液样品，可以预测VEGF抑制剂对复发性肿瘤或转移癌的长期有效性。其中，在受试者过去接受过VEGF抑制剂给予的情况下，优选使用VEGF抑制剂给药后经过60天后采集的血液样品。VEGF抑制剂治疗中，为了一边对该VEGF抑制剂的长期有效性进行预测一边进行治疗，优选在治疗期间也持续性地实施本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法。通常，出于为了肿瘤标记物检查的采血为每月1次左右与CT检查为每3个月1次左右的平衡，考虑本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法优选每60天左右进行实施。
另外，本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，所使用的血液样品也可以是从过去对VEGF抑制剂显示耐药性的受试者采集的样品。
即使是过去对VEGF抑制剂显示耐药性的受试者，当从血液样品中检测到突变型的RAS基因来源的核酸或其蛋白时，可判断该受试者在其血液样品采集时，VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性高，通过服用VEGF抑制剂，可长期(例如给予开始时点至1年6个月以上的期间)获得肿瘤缩小效果的可能性高。相反，当从血液样品中检测到突变型的RAS基因来源的核酸或其蛋白时，可判断该受试者在其血液样品采集时对VEGF抑制剂的敏感性低、即使服用VEGF抑制剂也无法得到持续性的肿瘤缩小效果的可能性高。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法也优选对从要二次给药VEGF抑制剂的受试者采集的血液样品进行。这里，“要二次给药VEGF抑制剂的受试者”是指在接受了VEGF抑制剂的给药处置后，接受与该VEGF抑制剂给药处置不同的其他抗肿瘤疗法，然后准备接受再次的VEGF抑制剂的给药处置的受试者。虽然有时由于VEGF抑制剂给予而获得耐性，但通过预先研究二次给药前血中的RAS的状态，能够预测二次给药中的VEGF抑制剂的长期有效性。即，当二次给药前从受试者采集的血液样品中未检测到突变型的RAS基因来源的核酸或其蛋白时，可以判断该受试者中VEGF抑制剂长期有效的可能性高，通过二次给药VEGF抑制剂可长期获得肿瘤缩小效果的可能性高。相反，当从血液样品检测到突变型的RAS基因来源的核酸或其蛋白时，可以判断该受试者的VEGF抑制剂的长期有效性低、即使二次给药VEGF抑制剂也无法获得持续性的肿瘤缩小效果的可能性高。
其中，作为在二次给药VEGF抑制剂之前接受的与该VEGF抑制剂给药处置不同的其他抗肿瘤疗法，可以从公知的抗肿瘤疗法中根据受试者的病症等来适当选择使用。作为该其他的抗肿瘤疗法，具体而言，可列举出放射线治疗、化疗剂的给药治疗、与已给药的VEGF抑制剂不同种类的靶分子药剂的给药治疗等。作为该其他的抗肿瘤疗法，可以是1种或2种以上的抗肿瘤疗法的合并疗法。例如，作为本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法，优选靶分子药剂的给药治疗与化疗剂的给药治疗的合并疗法。
所述化疗剂没有限定，可以为具有细胞毒性或细胞分裂抑制性的化合物。具体而言，包括(i)抗代谢剂，例如氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟-2’-脱氧尿苷、吉西他滨、羟基脲或氨甲蝶呤；(ii)DNA断裂剂，例如博来霉素；(iii)DNA交联剂，例如苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺或氮芥；(iv)嵌入剂，例如阿霉素(多柔比星)或米托蒽醌；(v)蛋白合成抑制剂，例如L-门冬酰胺酶、放线菌酮、嘌呤霉素或白喉毒素；(vi)拓扑异构酶I毒，例如喜树碱或托泊替康；(vii)拓扑异构酶II毒，例如依托泊苷(VP-16)或替尼泊苷；(viii)微管相关剂，例如秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇(paclitexel)、长春花碱或长春新碱；(ix)激酶抑制剂，例如黄酮吡醇、星孢菌素、STI571(CPG57148B)或UCN-01(7-羟基星孢菌素)；(x)各种试验用药物，例如thioplatin、PS-341、苯基丁酸、ET-18-OCH3或法尼基转移酶抑制剂(L-739749、L-744832)；多酚类，例如槲皮素、白藜芦醇、白皮杉醇、表没食子儿茶素没食子酸盐、茶黄素类、黄烷醇类、原花青素类、白桦脂酸及其衍生物；(xi)激素，例如糖皮质激素或芬维A胺；(xii)抗激素，例如他莫昔芬、非那雄胺或LHRH拮抗剂。另外，还包括亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、柔红霉素、多西他赛及丝裂霉素C。所述其他的抗肿瘤疗法中，可以仅使用这些化疗剂中的1种，也可以将2种以上并用。
当对从VEGF抑制剂给予处置后进行化疗剂的给药治疗、其后进一步对从预备进行VEGF抑制剂的二次给药的受试者采集的血液样品进行本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法时，作为该化疗剂，优选为选自氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、博来霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春花碱、长春新碱及他莫昔芬中的1种或2种以上。
作为所述靶分子药剂，具体而言，可列举出选自西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、瑞格非尼、克唑替尼、舒尼替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥珠单抗、拉帕替尼及利妥昔单抗中的1种或2种以上。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法还优选对从过去接受过EGFR抑制剂给予处置的受试者采集的血液样品进行。例如有观察到对抗EGFR抗体药的耐受性而进行VEGF抑制剂治疗作为其他疗法的情况。还可以为在接受EGFR抑制剂的给药处置后，接受与该EGFR抑制剂给药处置不同的其他抗肿瘤疗法，其后预备接受VEGF抑制剂治疗的给药处置的受试者。
作为该其他的抗肿瘤疗法，可以根据受试者的病症等来适当选择使用，具体而言，可列举出放射线治疗、化疗剂的给药治疗、与已给药的EGFR抑制剂不同种类的靶分子药剂的给药治疗等。作为化疗剂、靶分子药剂，可列举出上述的化疗剂、靶分子药剂。
所述工序(a)中，血液样品中的RAS的状态可以从蛋白水平确定，也可以从核酸水平(基因组DNA或mRNA)确定。本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法中，由于可高灵敏度地进行检测，因此优选以RAS基因来源的核酸为测定对象。具体而言，优选通过研究从所述血液样品中的循环DNA中是否检测到野生型及突变型的RAS基因来源的核酸来确定该血液样品中有无RAS的存在及是野生型还是突变型。RAS基因来源的核酸可列举出以RAS基因的基因组DNA的全长或其部分、RAS基因的mRNA的全长或其部分、所述mRNA的全长或其部分为模板得到的cDNA、或将它们通过聚合酶链反应(PCR)等来人工地扩增而得到的扩增产物等。
血液样品中的RAS基因来源的核酸的检测或检测到的RAS基因来源的核酸的基因型的确定可通过常规方法进行。本发明中，从预测精度的角度出发，优选在可检测0.1％的突变型的测定条件下进行。
例如，血液样品中的RAS的存在和/或其状态可通过使用数字PCR检测血液样品中所含的RAS基因来源的核酸来确定。特别是通过利用BIORAD公司的DropletDigitPCR(ddPCR)的技术(Hindson，et.al.，AnalyticalChemistry，2011，vol.83(22)，pp.8604-8610)能够高灵敏度地进行检测。DropletDigit的数越多分析精度越高。为了确保检测0.01％的突变的性能，检测一个突变需要10,000DropletDigit。因此，优选规定PCR的MasterMix中的表面活性剂浓度。例如，作为DNA伸长酶等的保存液使用的乙二醇或甘油以终浓度计优选为0.15％以下、或Triton-X以终浓度计优选为0.0003％以下。当上述表面活性剂达到上述终浓度以上时，DropletDigit的乳液数激减，难以高灵敏度地对突变进行检测。
另外，也优选通过对从血液样品得到的核酸及核酸片段进行第1PCR15～50个循环，在使该核酸中所可能含有的突变型RAS的等位基因(allele)拷贝数的绝对量增加后，稀释到106拷贝数左右，然后进行公知的突变检测方法。通过该方法，由于使反应体系中存在的突变型的总数增加，因此即使突变的种类增加，也能够降低突变型的等位基因物理上不存在而无法检测的可能性。此外，还可以将该方法与上述的数字PCR组合。
作为其他的方法，可列举出例如通过以血液样品中的核酸为模板的PCR等，在使包含编码RAS基因中的变异部位的区域的片段扩增后，使该扩增产物与可与KRAS的特定的基因型特异性杂交的探针接触，然后高灵敏度地检测是否形成了缔合体。在进行杂交反应之前，也优选对所述扩增产物的稀释物进行乳液PCR。
所述探针例如可用放射性同位元素(3H、32P、33P等)、荧光剂(罗丹明、荧光素等)或发色剂标记成可检测的。另外，该探针也可以是反义寡核苷酸、例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯类或LNA。其中，该探针的碱基长度可以为约8个核苷酸至约100个核苷酸、或约10个至约75个、或者约15个至约50个、或约20个至约30个。
血液样品中的RAS的存在或其状态可以使用Invader法(MichaelOlivier，MutationResearch573：103-110，2005)进行分析。Invader(注册商标)法是指对通过PCR等制备的双链DNA、或mRNA按照部分形成三重碱基的方式，进行等位基因(Allele)探针与oligo的杂交反应。这里，等位基因探针的5’末端的一部分被设计为具有与所述双链DNA或mRNA非互补的序列(侧翼部)。另一方面，oligo具有完全与所述双链DNA或mRNA互补的序列。2种等位基因探针分别被设计成与野生型、突变型互补的方式，与上述双链DNA或mRNA竞争性杂交。完全互补地进行杂交反应时，侧翼核酸内切酶识别成为三重碱基的部分，将等位基因探针的侧翼部切断。被切断的等位基因探针的侧翼部与该反应体系中存在的自互补型FRETCassette进行杂交反应。此时，出现成为三重碱基的部分，侧翼核酸内切酶将目标突变切断，FRETCassette内的经荧光修饰的DNA片段游离，由于与FRET内的消光物质背离而发出荧光。理论上，被一次切断的等位基因探针的侧翼部能够与另外的FRETCassette再次发生杂交反应，是信号被扩增的能够以非常高的灵敏度检测突变的手法。
可以将该领域中已知的连接酶链反应用于对包含编码RAS基因中的变异部位的区域的片段进行扩增(例如参见Wu，et.al.，Genomics，1989，vol.4，pp.560-569)。另外，还可以使用作为等位基因特异性PCR已知的技术(例如参见RuanoandKidd，NucleicAcidsResearch，1989，vol.17，pp.8392)。根据该技术，使用以在3’末端与特定的RAS突变杂交的引物。当不存在特定的RAS突变时，观察不到扩增产物。另外，还可以使用扩增阻滞突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS)(例如参见欧州专利申请公开第0332435号及Newtonet.al.，NucleicAcidsResearch，1989，vol.17，pp.7)。
对于血液样品中的RAS基因来源的核酸的检测、所检测到的RAS基因来源的核酸的基因型的确定，当检测基因突变时，还可以使用用于检测基因的插入及缺失的其他方法。作为该方法，具体而言，可列举出例如以Sanger’s法为基础的序列分析法，直接确定血液样品中的RAS基因的基因组DNA或mRNA或这些扩增产物等的碱基序列的方法。另外，碱基序列的确定还可以介由PCR来进行。另外，可以将针对基因或周围的标记物基因的限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)探针用于对多态性片段中的等位基因的改变或插入打分。单链DNA构象多态性(SSCP)分析也可用于检测等位基因的碱基变化突变体(Oritaet.al.，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，USA，1989，vol.86，p.2766-2770、及Genomics，1989，vol.5，p.874-879)。
另外，通过将血液样品中的RAS基因来源的核酸的检测、所检测到的RAS基因来源的核酸的基因型的确定中使用的试剂等制成试剂盒，能够更简便地进行本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法。作为该试剂，例如可列举出用于从血液样品中提取核酸的试剂、聚合酶或连接酶等酶、可与RAS的特定的基因型特异性杂交的探针或引物(与RAS基因的突变部位或其相邻部位特异性杂交的寡核苷酸)等。另外，该试剂盒中也可以包含记载了有关血液样品中的RAS基因来源的核酸的检测或其基因型的确定方法的实验方案、关于从得到的RAS的基因型(状态)的结果判定VEGF抑制剂的长期有效性的基准的说明的书面文件等。
本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法还可以为判断是否适用VEGF抑制剂的给予处置时提供重要信息。也就是说，本发明的一个实施方式的长期有效性预测方法能够给临床医生提供有用的信息，基于该方法获得的信息，临床医生们能够确定适当的治疗方法。
实施例
以下，示出实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限于下述实施例。
[实施例1]
对外科切除了原发癌的复发性大肠癌患者23名，研究从原发癌、转移癌及转移癌确认后采集的血液制备的血清中含有的KRAS的伴随着氨基酸替换的非同义突变。
(临床样品)
在原发癌外科切除手术的术前或术后，采血复发性大肠癌患者的末梢血6mL，然后进行离心分离处理(3,000rpm、10分钟)，得到血清成分。此外，对ID编号9的患者，在转移癌外科切除手术的术后也采血末梢血6mL，同样地操作得到血清成分(样品编号16)。另外，将一部分患者的原发癌、转移癌的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片也制成实验样品。其中，本试验得到了日本医科大学附属病院内的伦理审查委员会承认，并得到了全部患者对本研究的知情同意。本试验中的患者信息示于表2。表2中，“转移癌”栏的“-”表示是转移癌确认前的患者。另外，表2中，“靶分子药”栏表示在转移癌外科切除手术后(其中，样品编号8和样品编号15是原发癌外科切除手术前)进行的靶分子药与FOLFOX合并疗法中所给予的靶分子药。即，该栏中，“b-mab”表示贝伐单抗+FOLFOX合并疗法，“C-Mab”表示西妥昔单抗+FOLFOX合并疗法。表2中，“化疗”栏表示转移癌外科切除手术后的靶分子药给予处置时点(其中，样品编号20和21是原发癌外科切除手术后的靶分子药给予处置时点、样品编号16是在血液样品采集时点)的化疗施行状況。更详细而言，“无”为未定给予、今后可能给予的患者，“施行前”表示予定施行，“施行中”表示化疗有效、持续给予的状态，“施行后”表示化疗有效、但在该时点终止了给予，“终止后”表示化疗无效的状态(即，进入姑息治疗的状态)。
对原发癌为KRAS突变型的ID编号1～5、9～11、16、17、19～23的患者进行抗VEGF抑制剂即贝伐单抗与FOLFOX化疗(氟尿嘧啶-亚叶酸-奥沙利铂)。按照贝伐单抗2周间隔给予法进行，以0.5mg/kg/分钟(5mg/kg时为10分钟)的给予速度进行点滴静脉内给予5mg/kg。另外，初次给予时间为90分钟。根据容忍度，给予时间第2次为60分钟、第3次以后为30分钟。FOLFOX化疗如下给予：用2小时点滴静脉内给予400mg/body的亚叶酸(Leukovorin)和145或140mg/body的奥沙利铂，在急速点滴静脉内给予氟尿嘧啶(5-FU)675或650mg/body后，再22小时持续点滴静脉内给予4100mg/body。给予方案如图1所示。
表2
(血清中的CEA及CA-19-9的测定)
通过CLEIA法(化学发光酶免疫测定法)测定血清中的CEA及CA-19-9。将测定结果示于表3。
(从血清的cell-free(cf)DNA的分离精制)
从血清的cfDNA的分离精制使用QIAampCirculatingNucleicAcidKit(QIAGEN公司)进行。本试剂盒中使用的血清样品的量因患者而异，为2mL～4mL。DNA的分离精制工序按照试剂盒中附带的说明书进行。从吸附柱的最终洗脱用TE缓冲液50μL进行。
(从FFPE切片的DNA的分离精制)
从FFPE切片的DNA的分离精制使用QIAampDNAFFPETissueKit(QIAGEN公司)进行。对于1个样品，FFPE切片使用3片切为10μm的切片。DNA的分离精制工序按照试剂盒中附带的说明书进行。从吸附柱的最终洗脱用TE缓冲液100μL进行。
(DNA的定量)
cfDNA及从FFPE切片分离精制的DNA的定量使用Quant-iT(注册商标)PicoGreen(注册商标)dsDNAReagentandKits(invitorogen公司)进行。所测定的样品全部在将所分离的DNA用TE缓冲液稀释20倍后使用。荧光测定装置使用SAFIRA(TECAN公司)。
(定向测序法)
原发癌或转移癌的手术标本以及血清中的KRAS碱基序列分析用定向测序法进行。KRAS的定向序列用的引物序列使用KRAS(正向)：5’-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3’(序列编号5)、KRAS(反向)：5’-GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3’(序列编号6)。各PCR产物的长度为214bp，PCR条件为：在95℃下10分钟的前变性后，将94℃下20秒钟、60℃下20秒钟、72℃下30秒钟作为1个循环进行40个循环，其后在72℃下进行10分钟的延长反应。序列分析使用ABI3730(AppliedBiosystems、FosterCity、CA)，利用BigDyeterminator法进行循环测序。
将结果示于表3。表3的“血清”栏中，基因型的词尾的“(术前)”和“(术后)”分别表示原发癌外科切除手术的术前或术后采集的血清中的基因型。另外，表3的“转移癌”栏中，“-”表示未分析转移癌中的KRAS的基因型。
表3
原发癌的手术标本的KRAS基因突变与cfDNA中的KRAS基因突变的一致率为81.8％。另外，将原发癌与cfDNA中的KRAS基因突变的相关表示于表4。表4中，“pDNA”是指从原发癌提取的DNA。关于Cohen的Kappa系数κ的计算，将P(一致率)、Pe(2个样品之间结果偶然一致时的一致率)代入κ＝(P-Pe)/(1-Pe)，结果κ值为0.58。
表4
需要特别说明的是，原发癌的KRAS状态为突变型、血清中的KRAS状态为野生型的患者ID编号4、9(样品编号15)、22(样品编号24)这3例中，患者ID编号4和22为显著的贝伐单抗+FOLFOX合并疗法长期有效的病例。这2例，在一年半以上维持SD(疾病稳定，stabledisease；肿瘤缩小率小于30％或肿瘤增大率小于20％)的状态。其中，肿瘤缩小率(缩小效果)是用CT图像的肿瘤的直径计算的。肿瘤多点存在时，将它们的直径合并计算。分别将ID编号4的患者的治疗检查记录示于表5、将CT摄影图(2013年1月9日、2013年4月18日及2013年9月6日摄影)示于图2。另外，分别将ID编号22的患者的治疗检查记录示于表6、将CT摄影图(2013年2月1日及2013年5月25日摄影)示于图3。图2中的箭头表示观察到缩小效果的肿瘤部位，图3中的箭头表示消失的肿瘤部位。
表5
表6
另外，从ID编号9的患者的原发癌切除手术前的循环DNA中结果观察到与原发癌同样的KRAS基因突变(G12A)，但从原发癌切除手术后的循环DNA中未检测到G12A。但是，其后，从血清KRAS中检测到G12A，4个月后复发。即，是贝伐单抗的有效性显著变差的结果。分别将ID编号9的患者的治疗检查记录示于表7、将CT摄影图(腹部：2013年3月23日摄影、胸部：2013年6月10日摄影)示于图4及5。图4及5中的箭头表示复发得到确认的肿瘤部位。这些结果启示，通过从血清或血浆中的cfDNA检测KRAS基因突变，能够应用于癌患者的预后或复发诊断。另外，在癌标记物CEA、CA-19-9应答前，通过观察到末梢血中的cfDNA也与早期诊断相关。
表7
另外，从原发癌及转移癌为野生型的ID编号8及ID编号14的患者的cfDNA中检测到G13D。此外，即使给予ID编号8的患者EGFR抑制剂西妥昔单抗，也未见肿瘤缩小效果。该结果显示，肿瘤组织的KRAS的基因突变状态并不一定能够成为EGFR抑制剂的治疗效果预测因子。另一方面，ID编号4及ID编号22的患者从CT摄影结果可知肿瘤缩小20％以上。
另外，实施例1中的复发大肠癌患者的临床分析中，在观察到原发癌突变了的KRAS基因的全部患者中，从复发诊断时采集的血清中也观察到突变了的KRAS基因。根据该结果，在原发癌切除后的复发诊断中，鉴定循环中的突变了的KRAS基因是有用的，通过对接受过针对原发癌的治疗的受试者经时地研究血液中的KRAS的状态，能够早期确认复发肿瘤的存在(根据患者的不同，比CEA或CA19-9等已知生物标记物更为早期地复发肿瘤的存在)。
产业上的可利用性
本发明的长期有效性预测方法使用末梢血样品。因此，能够不需要切除原发癌或进行活组织检查等的活体采集、低侵袭地、高精度地预测VEGF抑制剂的长期有效性。从该低侵袭性和良好的精度的角度出发，认为本发明的长期有效性预测方法在癌检诊等中作为代替便潜血等的检查方法将得到广泛普及。

Claims (19)

1.一种VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其是预测VEGF抑制剂对受试者的肿瘤的长期有效性的方法，其中，
确定在从所述受试者采集的血液样品中是否存在RAS基因来源的核酸或RAS蛋白，
确定所述血液样品中的所述RAS基因来源的核酸是野生型还是突变型、或所述血液样品中的所述RAS蛋白是野生型还是突变型，
当在所述血液样品中检测到野生型的RAS基因来源的核酸或野生型的RAS蛋白时、且在所述血液样品中检测到突变型的RAS基因来源的核酸或突变型的RAS蛋白时，判定所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性高，
当在所述血液样品中检测到所述突变型的RAS基因来源的核酸或所述突变型的RAS蛋白时，判定所述受试者中所述VEGF抑制剂的抗肿瘤作用长期有效的可能性低。
2.根据权利要求1所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述受试者在过去接受过肿瘤部分的外科切除处置或VEGF抑制剂给予处置。
3.根据权利要求1或2所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述RAS为KRas、HRas或NRAS。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述受试者接受过除所述VEGF抑制剂以外的药剂的给予处置。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，
所述受试者为在接受VEGF抑制剂给药处置后接受了与所述VEGF抑制剂给药处置不同的抗肿瘤疗法的肿瘤患者，
所述血液样品在所述肿瘤患者再次准备接受所述VEGF抑制剂给药处置之前采集。
6.根据权利要求5所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述抗肿瘤疗法为化疗剂的给药治疗。
7.根据权利要求6所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述化疗剂为选自氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、博莱霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿霉素、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱及他莫昔芬中的1种或2种以上。
8.根据权利要求5所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述抗肿瘤疗法为放射线治疗。
9.根据权利要求5所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述抗肿瘤疗法是与已向所述受试者给药的所述VEGF抑制剂不同种类的靶分子药剂的给药治疗。
10.根据权利要求9所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述靶分子药剂为选自西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、瑞格非尼、克里唑蒂尼、舒尼替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥珠单抗、拉帕替尼及利妥昔单抗中的1种或2种以上。
11.根据权利要求9或10所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述抗肿瘤疗法为所述靶分子药剂的给药治疗与化疗剂的给药治疗的合并疗法。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述肿瘤为复发性肿瘤。
13.根据权利要求1～11中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述肿瘤为转移癌。
14.根据权利要求1～11中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述肿瘤为原发癌。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述肿瘤为选自大肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、食道癌、头颈部癌、子宫癌及子宫颈癌中的1种或2种以上。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述肿瘤存在于所述受试者的体内的多个部位。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述突变型为选自所述RAS蛋白的G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、G12S2、G13A、G13S、G13V、G13R、G13C、Q61H、Q61L、Q61R、A146T及A146V中的1个或2个以上。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，通过研究从所述血液样品中的循环DNA中是否检测到所述野生型的RAS基因来源的核酸、以及是否检测到所述突变型的RAS基因来源的核酸，确定所述血液样品中是否有所述RAS基因来源的核酸存在，确定所述RAS基因来源的核酸是野生型还是突变型。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的VEGF抑制剂长期有效性预测方法，其中，所述血液样品为末梢血、血清、血浆。
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