BRPI1006250B1

BRPI1006250B1 - dura - máter artificial e método de produção da mesma

Info

Publication number: BRPI1006250B1
Authority: BR
Inventors: Xu Tao; Yuan Yuyu
Original assignee: Medprin Regenerative Medical Tech Co Ltd
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2019-12-10
Also published as: US20140205647A1; MX345864B; US9271822B2; US20120029654A1; EP2340785A1; MX345863B; US8795708B2; RU2491961C2; KR20140090704A; RU2011140225A; KR20110133599A; EP2340785A4; JP5658175B2; BRPI1006250A2; US20140222163A1; WO2010102533A1; EP2340785B1; MX2011009282A; JP2012519559A; US9211180B2

Abstract

dura-mater artificial e método de produção do mesmo são revelados uma dura-máter artificial e um método de produção da mesma. a dura-máter artificial compreende camadas de electrospun preparadas por rotação eletrostática, sendo pelo menos uma delas, uma camada de electrospun hidrofóbica. acima da camada de electrospun hidrofóbica há pelo menos uma camada de electrospun hidrofílica. uma camada de transição pode ser ainda incluída entre as camadas electrospun hidrofóbica e hidrofílica. além disso, citosinas e/ou medicamentos podem ser afixados em ambas camadas hidrofóbica e hidrofílica, por meio de bio-impressão. a dura-máter artificial da invenção apresenta boa biocompatibi1idade, aumenta a regeneração do tecido dural, atinge excelentes efeitos de reparação, evita aderência, permite completa absorção, tem boas propriedades mecânicas, assegura baixas taxas de infecção e pode ser carregada com agentes terapêuticos.

Description

DURA-MÁTER ARTIFICIAL E MÉTODO DE PRODUÇÃO DA MESMA

Campo Técnico [001] A invenção está direcionada aos biofilmes artificiais, em especial às dura-máter artificiais e seus métodos de produção.

Estado da Técnica [002] A deficiência dural é um problema comum durante a neurocirurgia. Lesões crânio-encefálicas abertas (relacionados à indústria, ao tráfego ou a guerras), invasão de tumor, deficiências nas meninges congênitas ou outras doenças do crânio podem levar a deficiências da dura-máter. Tais deficiências da dura-máter precisam ser reparadas a tempo para evitar a perda do líquido cefalorraquidiano, encefalocele, e estresse da pressão barométrica. Senão a vida pode estar em risco.

[003] Atualmente, embora haja muitos substitutos durais, os materiais usados na substituição podem ser geralmente classificados em quatro tipos: fáscia autóloga, aloenxerto, substância natural ou sintética e xenoenxerto. Entretanto, a aplicação clínica desses materiais inevitavelmente leva a problemas tais como altas taxas de infecção. De acordo com as estatísticas, a taxa de infecção para craniotomia é de 4%; a dura-máter feita da pequena mucosa do intestino do porco resulta numa taxa de infecção de 3,4%; e a dura-máter produzida pelo colágeno apresenta uma taxa de infecção de 3,8%. Devido a barreira de sangue cerebral, uma vez que a infecção intracraniana ocorre, a concentração de plasma encefálico de drogas anti-infecção pode dificilmente atingir o nível desejado e o controle da infecção se torna difícil. Além disso, os produtos durais artificiais existentes não têm capacidade de fornecer medicamentos para as meninges. Por isso, o controle de infecção pós-operatório é frequentemente ineficaz.

[004] Além disso, uma das razões comuns para o reparo dural com transplante de dura-máter é o dano às meninges devido à invasão de tumor. Mais da metade dos tumores cerebrais não pode ser completamente removida através de cirurgia tornando, então, a quimioterapia necessária após a cirurgia. Muitas drogas quimioterapêuticas são tóxicas e não podem passar a barreira hemato-encefálica, de forma que uma concentração eficaz das drogas não pode ser atingida resultando em resultados reduzidos da quimioterapia.

[005] Os produtos substitutos durais artificiais atuais geralmente não contêm drogas terapêuticas de interesse. Por exemplo, devido as densas estruturas, a fáscia autóloga não pode ser carregada naturalmente com drogas, e é difícil carregar drogas no aloenxerto ou no xenoenxerto. Entretanto, devido à sua maleabilidade, os substitutos durais com base em material sintético podem ser prontamente carregados com drogas. Por outro lado, devido à limitação dos métodos de carregamento de drogas, também não é fácil carregar a droga na dura-máter artificial, e também permitir liberar a droga no transplante para atingir os objetivos terapêuticos. Até o presente, a forma comum de carregar uma droga anti-infecção no substituto da dura-máter artificial é impregnar o substituto com a droga. Com este método, a maior parte do medicamento permanece sobre a superfície da dura-máter artificial, que é facilmente perdido, ficando difícil atingir uma liberação controlada.

[006] O documento de patente US2008254091, intitulado “Multi-Layered Antiadhesion Barrier” descreve uma barreira antiaderente multicamadas, compreendendo uma camada base estruturada nanofibrosa electrospun a partir de um polímero hidrofóbico, biodegradável, biocompatível e uma camada de polímero formada mediante o revestimento de dita camada de base por um polímero hidrofílico bio-originado e um método para a preparação do mesmo. A barreira antiaderente multicamada da presente invenção pode resolver os problemas dos sistemas de antiadesão convencionais de gel, solução, esponja, película ou material não tecido, tais como adesão a tecidos ou órgãos, flexibilidade, resistência física, facilidade de manuseio (dobragem),etc. Com uma estrutura nanofibrosa, dita barreira bloqueia eficazmente a infiltração ou migração de sangue e células e promove a cicatrização de feridas.

[007] Documento de patente CN101036802 intitulado “Antheraea pernyi silk fibrion biology medicine material and the preparation method” descreve um material biomédico para reparo de tecido 3D adequado para o crescimento adesivo de células cuja matéria prima é a seda natural de tussah. é usada como matéria-prima. Depois que a fibrina da seda da larva antheraea pernyi se dissolve, a estrutura 3D não tecida composta de fibra da seda produzida pela larva da mariposa antheraea pernyi é obtida por fiação eletrostática, em que o diâmetro da fibra é 50nm-20μm, o orifício entre as fibras é 1-500 μm, a espessura de tela não tecida é 50nm-20mm, e o peso molecular da fibrína de seda de antera pernyi é 10X104-20X105D. O material de engenharia biomédica tem características de não-toxicidade, boa biocompatibilidade, boa capacidade de crescimento adesivo da célula, etc. Devido à ampla oferta de materiais e baixo custo, o referido material substitui materiais biomédicos de alto custo tal como o colágeno, sendo usado para material de reparo, como pele artificial, tendão, cartilagem, dura-máter etc., particularmente como indutor de histócitos.

[008] O documento de patente CN1317297 intitulado “Absorbable artificial dura meter of brain and its preparing process” descreve uma dura-máter artificial absorvível que é preparada a partir de glicerina, gelatina e solução mixta de norfloxacina e 3% de quitosana, formando um revestimento de uma rede de polilactato ou não-tecido por espalhamento ou pulverização, cozimento, neutralização, lavagem com água destilada, imersão, corte, secagem e esterilização para obter uma dura-máter artificial de camada dupla. Suas vantagens incluem alta biocompatibilidade, baixa toxicidade, ausência de reação alérgica e absorção lenta.

[009] Concluindo, os substitutos de dura-máter artificiais têm deficiências tais como alta taxa de infecção, baixa bio-compatibilidade, absorbibilidade incompleta, e dificuldade no carregamento de medicamentos e falta de controle da efetiva liberação do medicamento.

Sumário da Invenção [010] Para resolver pelo menos um dos problemas técnicos descritos acima, uma dura-máter artificial é provida de acordo com a presente invenção, que é caracterizada por uma excelente compatibilidade de tecido, anti-aderência ideal, absorção completa, boas propriedades mecânicas, baixa taxa de infecção, e capacidade de carregar substâncias terapêuticas.

[011] Além disso, é provido um método para a produção de dura-máter artificial.

[012] A dura-máter artificial de acordo com a invenção é composta de camadas de electrospun (fibras produzidas por eletrofiação ou rotação eletrostática: em inglês, electrospinning). Ditas camadas de electrospun compõem pelo menos uma camada de electrospun hidrofóbica, que é preparada com um ou mais polímeros hidrofóbicos através de um método de eletrofiação. Dito polímero hidrofóbico é selecionado de um grupo consistindo de poliéster alifático hidrofóbico, poliéteréster, poliortoéster, poliuretano, polianidrido, polifosfazano, e poliaminoácido, e copolímeros e misturas dos mesmos.

[013] Além disso, o poliéster alifático hidrofóbico é pelo menos um selecionado do grupo que consiste de ácido poliláctico, poliglicolido, policaprolactona, e polihidroxibutirato (PHB). Dito poliéteréster é pelo menos um selecionado do grupo que consiste de polidioxanone (PDO), copolímero ácido glicol láctico, e copolímero glicol/terefálico terefalato ácido-polibutilece. Dito polianidrido é pelo menos um selecionado do grupo que consiste de polianidrido polisebacico anidrido diácido (PSPA)-cetano, polianidrido tipo-I, polianidrido tipo II, polianidrido tipo III e polianidrido tipo IV.

[014] A dura-máter artificial, compreendendo camada hidrofóbica, é tão forte quanto a dura-máter humana. Pode selar defeitos do cérebro e evitar a perda do líquido cefalorraquidiano durante a regeneração da própria dura-máter humana. A camada hidrofóbica não é favorável à migração de células e à aderência, pelo qual o objetivo de anti-aderência pode ser alcançado. Na prática, mais do que uma camada hidrofóbica pode ser colocada, para satisfazer diferentes necessidades de força.

[015] Além disso, na dura-máter artificial de acordo com a invenção, pelo menos uma camada de electrospun hidrofóbica pode ser disposta sobre a dita camada hidrofóbica. Dita camada hidrofílica é preparada, através de um método de eletrofiação, com um ou mais tipos de polímeros hidrofílicos selecionados do grupo que consiste de sulfato de condroitina, heparina, agar, glucano, algina, celulose, celulose modificada, alginato sódico, amido, gelatina, fibrinogênio, proteína da seda, polímero de peptídeo elastina mimetizado, colágeno, chitosana, chitosana modificada, poliuretano hidrofílico, polietileno glicol, poli-metil-metacrilato, PMMA, PHBV, PHBHHx, álcool polivinílico, e polilactideo e misturas dos mesmos.

[016] Quando a dura-máter é transplantada no cérebro, a camada hidrofóbica tem um papel anti-aderência e é colocada próxima à superfície do cérebro, enquanto a camada hidrofílica, provendo uma estrutura fina de nanofibra para aderência, migração, proliferação, e diferenciação de células, é colocada longe do cérebro. Como a camada hidrofílica é preparada com materiais hidrofílicos de boa bio-compatibilidade, pode efetivamente suportar a migração e a proliferação de células-tronco e fibroblastos e, consequentemente, promover o crescimento da dura-máter autóloga. Na prática, a camada hidrofílica pode ser mais de uma camada, para satisfazer assim as diferentes necessidades.

[017] De acordo com uma realização da invenção, a dura-máter inventiva pode também ter uma camada de transição entre camadas hidrofóbicas e hidrofílicas. A camada de transição é preparada por um método de eletrofiação com um ou mais polímeros, tendo hidrofilicidade que gradualmente aumenta desde o lado próximo à dita camada de electrospun hidrofóbica até o lado próximo à dita camada de electrospun hidrofílica. A presente camada de transição pode melhorar a hidrofilicidade entre as camadas hidrofóbicas e hidrofílicas.

[018] De acordo com outra realização da invenção, cada camada hidrofóbica, as camadas hidrofílicas, e as camadas de transição podem ser misturadas com uma citocina e/ou medicamento. As misturas de camadas podem permitir a liberação de citocina e/ou medicamento no cérebro em transplante, enquanto a estrutura de polímero que é absorvida. A citocina e/ou o medicamento podem então atingir o objetivo de evitar infecção local, aderência, e/ou agravamento do tumor, ou promover a restauração da dura-máter autóloga.

[019] De acordo com outra realização da invenção, a camada hidrofóbica e a camada hidrofílica podem ser aderidas com a citocina e/ou o medicamento.

[020] A citocina mencionada na invenção é um fator que atua na aderência, migração, proliferação e diferenciação de fibroblasto, que é selecionado do grupo que consiste de interleucina, fator de estímulo da colônia, fator de necrose do tumor, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator básico de fibroblasto, e combinações do mesmo. A citocina pode acelerar o processo de recuperação da dura-máter deficiente.

[021] O medicamento citado na invenção é um ou mais selecionado do grupo que consiste de antibiótico, hemostático, agente anti-aderência, e droga resistente a tumor. Estes medicamentos são colocados na dura-máter artificial de acordo com a necessidade real. Uma vez que a dura-máter artificial é transplantada, os medicamentos são liberados gradualmente para atingir objetivo terapêutico durante a degradação dos polímeros e regeneração da falha da dural. Desta forma, o bloqueio da barreira sanguínea do cérebro para o medicamento é superado.

[022] Além disso, a citocina e/ou medicamento podem ser incluídos em um hidrogel. Com os efeitos de aderência e fixação do hidrogel, o medicamento pode, de acordo com a situação do local, ser igualmente ou especialmente liberado. Dito hidrogel compreende um ou mais selecionados do grupo consistindo de polímero polissacarídeo, polímero polipeptídio, e polímero sintético hidrofílico de alto peso molecular.

[023] De acordo com a realização da invenção, a camada de electrospun hidrofóbica de dura-máter artificial compreende fibras com diâmetro de 50-1000nm. De acordo com uma realização da invenção, a camada de electrospun hidrofóbica compreende poros com tamanho menor que 3μm, enquanto a camada de electrospun hidrofílica compreende uma fibra de diâmetro de 5-20μm, e um tamanho de poro de 20-200μm. O tamanho do poro depende muito do diâmetro da fibra. Quando o diâmetro da fibra diminui, o tamanho do poro também diminui. Assim, o controle do diâmetro da fibra pode realizar o controle do tamanho do poro da camada de electrospun. A média das células humanas é 10-50μm. As meninges consistem principalmente de fibroblastos e fibras de colágenos excretadas do fibroblasto. Muitos dos fibroblastos têm o diâmetro de 20-30μm. O tamanho do poro da camada hidrofóbica é menor do que 3μm, o que pode evitar a entrada da célula e a aderência entre a dura-máter e tecido do cérebro. A camada hidrofílica compreende um tamanho de poro igual ou maior do que a média de diâmetro da célula, que pode promover a entrada e migração da célula.

[024] De acordo com ainda outro aspecto da invenção, um método para preparar a dura-máter artificial é também provido, compreendendo as seguintes etapas: A) Dissolver o polímero hidrofóbico no solvente para obter uma solução eletrofiada hidrofóbica, em que dito polímero hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste de poliéster alifático hidrofóbico, polieteréster, poliortoéster, poliuretano, polianidrido, polifosfazene, ácido poliamino e copolímeros e misturas dos mesmos. B) Produzir, através do eletrofiação, uma camada de electrospun hidrofóbica similar a um filme (ou similar a lã) de dita solução eletrofiada hidrofóbica, preparando desse modo dita dura-máter artificial.

[025] Ainda mais, dito poliéster alifático hidrofóbico é pelo menos um selecionado do grupo que consiste de ácido polilático, poliglicolido, policaprolactona e polihidroxibutirato. Dito polieteréster é pelo menos um selecionado de um grupo que consiste de polidioxanone (PDO), copolímero glicol ácido láctico e glicol/copolímero polibutilece terefalato. Dito polinidrido é pelo menos um selecionado de um grupo que consiste de anidrido polisebácico diácido polianidrido cetano, polianidrido tipo I, polianidrido tipo II, polianidrido tipo III e polianidrido tipo IV.

[026] O método, aplicando o princípio de eletrofiação, forma a dura-máter artificial usando um polímero em especial. A dura-máter pode efetivamente evitar sua aderência ao tecido do cérebro.

[027] Também para evitar a aderência da dura-máter artificial ao tecido do cérebro, o diâmetro de fibras pode ser controlado, e consequentemente o tamanho do poro da estrutura fica sob controle. Desse modo, a migração de células pode ser interrompida. O diâmetro das fibras da camada de electrospun hidrofóbica pode ser controlado em 50-1000nm. De acordo com uma realização da invenção, o tamanho do poro da camada de electrospun hidrofóbica é menor que 3μm.

[028] No método descrito acima, na etapa B) dita eletrofiação é desenvolvida com microbomba de injeção operada na velocidade de 0,1-5,0 milímetros/hora e um gerador de alta tensão operado em uma tensão de 5-40 quilovolts e com uma distância de coleta de 5,0-30,0 centímetros.

[029] Para atingir um melhor efeito de terapia clínica, a invenção pode prover um método, diferente da eletrofiação, para formar uma camada de electrospun hidrofílica sobre dita camada hicrofóbica compreendendo as etapas de: a') Dissolver um polímero hidrofílico no solvente para obter uma solução eletrofiada hidrofílica, em que dito polímero hidrofílico é selecionado do grupo que consiste em sulfato de condroitina, heparina, agar, glucano, algina, celulose modificada, alginato de sódio, amido, celulose, gelatina, fibrinogênio, proteína de seda, polímero peptídeo elastino mimético, colágeno, chitosana, chitosana modificada, poliuretano hidrofílico, polietileno glicol, polimetilmetacrilato, PMMA, PHBV, PHBHHx, polilactidio álcool polivinil. b') colocar dita solução de eletrofiação hidrofílica, por eletrofiação, em dita camada hidrofóbica para formar dita camada de electrospun hidrofílica.

[030] A camada de electrospun hidrofílica é colocada longe da superfície do cérebro, afim de promover a migração das células e a regeneração da dura-máter. Para facilitar a entrada de célula, a camada de electrospun hidrofílica compreende fibras com um diâmetro de 5-200μm e poros de 20-200μm de tamanho.

[031] Na etapa b'), a formação da camada de electrospun hidrofílica, dita eletrofiação é preformada com uma microbomba de injeção operada a uma velocidade de 0,1-20,0 milímetros/hora e um gerador de alta tensão operado a uma tensão de 10-40 quilovolts e com uma distância de coleta de 5,0-30,0 centímetros.

[032] No processo da eletrofiação, geralmente os polímeros hidrofóbicos e hidrofílicos deveriam ser dissolvidos em solventes apropriados respectivamente, para formar soluções eletrofiadas. Frequentemente, ditos solventes são solventes orgânicos voláteis que incluem, mas não se limitam ao ácido metanóico, ácido acético, álcool etílico, acetona, dimetil formamida, dimetil acetamida, dihidrofurano, dimetil sulfóxido, hexafluoro álcool isopropílico, álcool trifluoroetil, diclorometano, triclorometano, álcool metílico, álcool etílico, clorofórmio, dioxeno, trifluoretano, álcool trifluoroetílico e misturas dos mesmos. Os solventes orgânicos voláteis rapidamente volatilizarão durante o processo de formação de camadas electrospun, e as camadas electrospun finais conterão nenhum ou pouco solvente orgânico residual que pode ser removido nas etapas posteriores. Em alguns casos, a água pode ser usada como um solvente e removida por secagem natural ou em forno, após as camadas de electrospun serem formadas.

[033] Além disso, o método de preparar dura-máter artificial provido pela presente invenção compreende ainda, antes de dita camada de electrospun hidrofílica ser preparada, formar uma camada de transição pela eletrofiação entre ditas camadas hidrofílicas e hidrofóbicas, em que dita camada de transição tem hidrofilicidade que gradualmente aumenta desde o lado próximo a à dita camada de electrospun hidrofóbica até o lado próximo a dita camada de electrospun hidrofílica. Os materiais, os solventes e os parâmetros de eletrofiação para preparar a camada de transição podem ser determinados com base na real situação e necessidade. A presente camada de transição pode melhorar a hidrofilicidade entre as camadas hidrofílicas e hidrofóbicas.

[034] Em uma realização da invenção, durante a formação de cada camada de electrospun através de rotação eletrostática, a citocina e/ou medicamento podem ser adicionados às soluções de eletrofiação correspondentes. Com a técnica de mistura, as camadas misturadas dos polímeros e citocina e/ou medicamento satisfazem melhor para aplicação clínica e têm um melhor efeito terapêutico.

[035] O método para preparar a dura-máter artificial ainda compreende, através de bio-impressão, formar uma distribuição de uma citocina e/ou medicamento sobre dita camada de electrospun hidrofóbica e/ou dita camada de electrospun hidrofílica. A bio-impressão é uma tecnologia para imprimir uma citocina e/ou medicamento sobre bio-papéis compreendendo estruturas de ditas camadas electrospun hidrofóbicas e/ou ditas camadas electrospun hidrofílicas.

[036] Para fazer com que dita citocina e/ou medicamento se distribua uniformemente e se fixe sobre as camadas, a citocina e/ou medicamento podem ser incluídos em um hidrogel.

[037] Especificamente , dita bio-impressão compreende as etapas de: a'') combinar uma solução de hidrogel com citocina e/ou medicamento para formar uma solução;e b'') imprimir dita solução sobre ditas camadas electrospun hidrofóbicas e/ou hidrofílicas usando tecnologia de bio-impressão.

[038] Dita solução hidrogel, na invenção, compreende as soluções aquosas de polímero polissacarídeo, polímero polipeptídio sintético e suas misturas. Dito polímero polissacarídeo inclui, mas não se limita a amido, celulose, alginato de sódio, ácido hialurônico e chitosana. Dito polímero polipeptídio inclui, mas não se limita a colágeno, poli-L-lesina e PLGA. Dito polímero hidrofílico sintético inclui, mas não se limita a ácido crílico, ácido polimetacrílico, poliacrilamina e N-isopropil acrilamida.

[039] O hidrogel é líquido sob condições normais. Em temperatura apropriada ou sob condições específicas, ele pode se tornar gel por um período curto através do qual ele tem boa aderência. De acordo com a invenção, alguns hidrogéis precisam de um agente de ligação cruzada na participação da reação. Por isso, o método ainda compreende, antes da bio-impressão,um pré-tratamento de ditas camadas hidrofóbicas e hidrofílicas com uma solução compreendendo um agente de ligação cruzada, com o prétratamento por dita solução compreendendo uma ligação cruzada, um agente de ligação cruzada aderente sobre a camada ou camadas. Depois disso, a citocina e/ou medicamento serão adicionados em uma solução de hidrogel, e a solução misturada é colocada em uma cabeça de impressão. Enquanto imprime, quando a solução de hidrogel com citocina e/ou medicamento atinge as camadas de electrospun, ele solidifica e adere às camadas.

[040] Em uma impressão uniforme e estável a citocina e/ou medicamento podem ser uniformemente liberados. Enquanto em uma impressão personalizada com velocidades variáveis e locais para um caso individual, a citocina e/ou medicamento podem ser liberados em uma área específica. A seleção do agente de ligação cruzada é baseada no tipo de hidrogel. Por exemplo, enquanto o hidrogel é alginato sódio, o agente de ligação cruzada é cloridrato cálcio; enquanto o hidrogel é fibrinogênio, o agente de ligação cruzada é trombina.

[041] Comparada às técnicas antecedentes, a invenção mostra as seguintes vantagens: (1) Suas propriedades mecânicas satisfazem o requisito de resistência à tração e flexibilidade, sendo à prova d'água e anti-aderente. (2) Os materiais compreendendo membranas não venenosas e inofensivas ao ser humano têm boa compatibilidade e permitem completa absorção após o implante, o que evita a ocorrência de tumor ou câncer. (3) A membrana não é preparada com tecidos animais podendo por isso evitar riscos como rejeição imune, espalhamento de vírus e infeccciosidadde da doença. (4) As camadas duplas projetadas podem evitar aderência e promover o crescimento de células autólogas o que permite uma restauração precoce da dura-máter. (5) Pela incorporação da tecnologia de bio-impressão, as substâncias terapêuticas podem ser introduzidas na membrana e podem ser liberadas de forma controlada após o implante. (6) Os materiais são abundantes na fonte, de baixo custo e convenientes para transporte e armazenamento. (7) O método de preparo compreende procedimentos fáceis, de custo baixo e de fácil desenvolvimento industrial. (8) A aplicação clínica é simples, e a aplicação personalizada a pacientes é também disponível.

[042] Outros aspectos e vantagens da invenção serão ainda apresentados nas descrições seguintes, e parte delas se tornará evidente através das seguintes descrições ou poderão ser entendidas mais facilmente através da prática.

Breve Descrição das Figuras [043] Os aspectos adicionais e vantagens acima mencionados ou aspectos adicionais e vantagens da invenção ficarão mais evidentes e mais facilmente entendidos através das seguintes descrições em conjunto com as figuras e realizações, em que: [044] A Figura 1 é uma ilustração do processo de eletrofiação para preparar a dura-máter artificial de acordo com a invenção.

[045] A Figura 2 é a ilustração do processo para preparar a dura-máter artificial de acordo com a invenção, que combina a eletrofiação com a bio-impressão.

[046] A Figura 3 é a ilustração da dura-máter artificial de acordo com a invenção compreendendo dita camada de electrospun hidrofóbica.

[047] A Figura 4 é a ilustração da dura-máter artificial de acordo com a presente invenção compreendendo dita camada de electrospun hidrofóbica e dita camada de electrospun hidrofílica.

[048] A Figura 5 é a ilustração da dura-máter artificial de acordo com a invenção compreendendo camada hidrofóbica, camada hidrofílica e camada de transição.

[049] A Figura 6A é a ilustração de dita dura-máter artificial misturada de acordo com a invenção compreendendo camada de electrospun hidrofóbica e camada de electrospun hidrofílica.

[050] A Figura 6B é a ilustração ampliada da Zona 1 da Figura 6A.

[051] A Figura 7A é a ilustração de dita dura-máter artificial misturada de acordo com a invenção compreendendo camada de electrospun hidrofóbica, camada de electrospun hidrofílica e camada de transição.

[052] A Figura 7B é a ilustração ampliada da Zona II da Figura 7A.

[053] A Figura 8A é a ilustração de dita dura-máter artificial de acordo com a invenção obtida combinando a tecnologia bio-impressão.

[054] A Figura 8B é a ilustração ampliada da Zona III na Figura 8A.

[055] Nas figuras, as referências são: Pulverizador de eletrofiação;

Fibras de eletrofiação;

Fonte de alta tensão;

Dispositivo coletor;

Cabeça de bio-impressora;

Reservatório;

Fio de eletrofiação hidrofóbica;

Medicamento;

Fibras de eletrofiação hidrofílicas;

Citocina e/ou medicamento;

Fibras de eletrofiação de camada de transição;

Camada de electrospun hidrofóbica: Camada de electrospun hidrofílica: Camada de transição.

Melhor Modo de Realizar a Invenção [056] Os exemplos da invenção serão explicados em detalhes.

Ilustrações dos exemplos serão mostrados nas figuras anexas, em que uma mesma referência representa um mesmo ou elementos similares. Os exemplos descritos com referência às figuras são somente ilustrativos, sendo úteis para interpretar a invenção, não representando limitações à invenção.

[057] São agora descritas, juntamente com as Figuras 1 a 8, a dura-máter artificial de acordo com a invenção e o método de fabricação da mesma.

[058] A ilustração do processo da eletrofiação para preparar a dura-máter artificial é mostrada na Figura 1, o pulverizador de eletrofiação 1 contém a solução de polímero, a fonte de energia de alta tensão 3 tem sua extremidade de alta tensão conectada ao pulverizador 1. O dispositivo coletor 4 tem forma cilíndrica e pode ser movido para o lado esquerdo e/ou direito, junto com o eixo do cilindro ou o eixo longo da direção do cilindro. O movimento do dispositivo coletor pode ser ajustado com o programa de computador, de maneira que a camada de electrospun formada terá espessura igual. Na prática, o dispositivo coletor pode ser ajustado na superfície de nível suave e através do movimento entre a esquerda e direita ou antes e depois, e mesmo a recepção pode ser reconhecida. O dispositivo coletor 4 é conectado com a extremidade de baixa tensão e fonte de energia de alta tensão 3, de forma que há uma grande diferença de tensão entre o pulverizador 1 e o dispositivo coletor 4.

[059] Antes da eletrofiação funcionar, a própria solução de polímero para eletrofiação deverá ser preparada.

[060] É uma opção escolher a solução do polímero hidrofóbico para eletrofiação, e tal solução é preparada através da dissolução de um polímero hidrofóbico em um solvente. Dito polímero hidrofóbico inclui mas não se limita ao poliéster alifático hidrofóbico (ácido de cobertura poliláctico, poliglicolidio, policaprolactona, e polixidróxibutirato), polieteréster (como polidioxanone), poliortoéster, poliuretano, polianidrido (como polisebácico anidrido diácido polianidrido-cetona), polifofazene, ácido poliamino e misturas dos mesmos.

[061] Dependendo do projeto, se a camada de electrospun hidrofílica for necessária após a camada de electrospun hidrofóbica ser finalizada, a solução do polímero hidrofílico para eletrofiação deverá ser preparado. O polímero hidrofílico inclui mas não se limita ao sulfato de condroitina, heparina, agar, glucano, algina, celulose modificada, alginato sódio, amido, celulose, gelatina, fibrinogênio, proteína da seda, polímero peptídeo elastina mimetizado, colágeno, chitosana, chitosana modificada, poliuretano hidrofílico, polietileno glicol, polimetilmetacrilato, PMMA, PHBV, PHBHHx, álcool polivinil e polilactídio. Com base nas necessidades reais, os pulverizadores múltiplos 1 podem ser ajustados, nos quais dita solução de polímero hidrofóbico e dita solução de polímero hidrofílico são respectivamente colocadas. Ou, substituir a solução no pulverizador 1 depois que a camada hidrofóbica é feita.

[062] O solvente da solução para eletrofiação pode ser água ou um solvente orgânico volátil que inclui, mas não se limita ao ácido metanóico, ácido acético, álcool etílico, acetona, formamida dimetil, acetamida dimetil, dimetilsulfóxido, álcool isopropílico hexafluor, álcool trifluoretílico, diclorometano, triclorometano, álcool metil, álcool etílico, clorofórmio, dioxano, trifluoroetano, e ácido trifluoracético.

[063] Uma vez que a solução para eletrofiação está pronta, os parâmetros devem ser estabelecidos. Depois disso, a energia é ligada e o dispositivo de eletrofiação é ativado. Assim que as fibras de eletrofiação 2 são rotacionadas no pulverizador 1, o dispositivo coletor 4 se moverá conforme os procedimentos prescritos, de modo a formar uma estrutura da membrana de elestrospun uniforme.

[064] Os parâmetros do processo para formar dita camada de electrospun hidrofóbica são estabelecidos da seguinte forma: uma bomba de microinjeção operada à velocidade de 0,1-5,0 milímetros/hora e um gerador de alta tensão operado a uma tensão de 5-40 quilovolts e com uma distância de coleta de 5,0-30,0 centímetros. Dita camada de electrospun hidrofóbica compreende fibras com diâmetros, que podem ser controlados, oscilando de 50 a 1000 μm, e poros de tamanho menor que 3μm.

[065] Os parâmetros do processo para formar dita camada de electrospun hidrofílica são estabelecidos da seguinte forma: uma bomba de microinjeção operada a uma velocidade de 0,1-20,0 milímetros/hora e um gerador de alta tensão operado em uma tensão de 10-45 quilovolts e com uma distância de coleta de 5,0-30,0 centímetros. Dita camada de electrospun hidrofílica compreende fibras com diâmetro, que pode ser controlado, oscilando de 5 a 200μm e poros de um tamanho de 20-200μm.

[066] Na prática, os procedimentos acima podem ser repetidos, de modo a formar múltiplas camadas hidrofóbicas e/ou múltiplas camadas hidrofílicas, como mostrado na Figura 3 e Figura 4.

[067] A Figura 3 fornece uma dura-máter artificial com três camadas hidrofóbicas que é tão forte quanto a dura-máter humana. Assim que as camadas são formadas por materiais hidrofóbicos, eles não são bons para a migração e ligação das células. Juntamente com o fato de que os materiais são seguros, não venenosos e absorvível para o ser humano, eles atingem o objetivo de anti-aderência.

[068] A Figura 4 fornece uma dura-máter artificial consistindo de duas camadas hidrofóbicas (A) e três camadas hidrofílicas (B). Quando a dura-máter é transplantada ao cérebro, as camadas hidrofóbicas anti-aderentes (A) estão ajustadas próximas à superfície do cérebro, enquanto as camadas hidrofílicas (B) estão ajustadas longe da superfície do cérebro, provendo uma fina estrutura fibrosa para a aderência, migração, proliferação e diferenciação das células. Assim que as camadas hidrofílicas são preparadas com materiais hidrofílicos que oferecem boa biocompatibilidade e têm tamanho de poro maior, o que é bom para a migração de células-tronco e fibroblasto e, consequentemente, favorável ao crescimento de autólogos de dura-máter.

[069] Uma vez que as camadas de electrospun são feitas, elas serão secadas em um forno ou de maneira natural, dependendo da variada solução do componente. Quando o solvente de uma solução de eletrofiação é um solvente orgânico volátil, tais como álcool isopropílico hexafluor, o procedimento para secagem pode ser omitido uma vez que o solvente tenha sido completamente volatizado enquanto as fibras de eletrofiação 2 são rotacionadas para o dispositivo coletor 4 com a diferença de tensão.

[070] Como a camada hidrofóbica é muito diferente da camada hidrofílica em termos de hidrofilicidade, a estabilidade natural não é fácil para ser mantida na aplicação. Para resolver tal problema e aumentar a hidrofilicidade entre as duas, uma camada de transição pode ser aplicada. Dita camada de transição tem uma hidrofilicidade que gradualmente aumenta desde o lado próximo à dita camada de electrospun hidrofóbica até o lado próximo à dita camada de electrospun hidrofílica. Na prática, a solução de eletrofiação de dita camada de transição pode compreender um ou mais polímeros e solvente correspondente que são determinados com base no requisito de hidrofilicidade. Então, a solução é colocada dentro do pulverizador, pelo método acima descrito, para preparar dita camada de transição antes de dita camada hidrofílica. Os parâmetros do processo para formar a camada de transição são estabelecidos da seguinte forma: uma bomba de microinjeção operada a uma velocidade de 0,1 a 5,0 milímetros/hora e um gerador de alta tensão operado a uma tensão de 5-40 quilovolts e com uma distância de coleta de 5,0-30,0 centímetros.

[071] A dura-máter artificial com camada de transição é ilustrada na Figura 5. Na figura, a camada hidrofóbica é de duas camadas e camada hidrofílica é de três camadas. Entre ditas camadas hidrofóbicas (A) e ditas camadas hidrofílicas (B), há uma camada de transição de duas camadas (C). Aquela próxima a ditas camadas hidrofóbicas (A) tem uma hidrofilicidade mais fraca que a outra próxima a ditas camadas hidrofílicas.

[072] Além disso, para realizar a adição da citocina e/ou medicamento na dura-máter artificial, uma eletrofiação misturada pode ser adotada. Especificamente, a citocina e/ou um medicamento podem ser misturados em qualquer uma ou mais camadas de ditas camadas hidrofóbicas, hidrofílicas e de transição. A citocina e/ou medicamento devem ser colocados em uma solução correspondente. Depois disso, a eletrofiação é feita e a citocina e/ou medicamento serão misturados em fibras de eletrofiação 2 assim que as fibras de eletrofiação são formadas. A estrutura da membrana será formada sobre o dispositivo coletor 4.

Do mesmo modo, este procedimento pode ser repetido. A citocina e/ou medicamento adicionados a cada momento podem ser o mesmo ou diferentes. A dura-máter artificial obtida é mostrada na Figura 6. Na Figura 6A, a camada hidrofóbica é de uma estrutura de duas camadas e a camada hidrofílica é uma estrutura de três camadas. Na Figura 6B, uma fibra eletrofiada hidrofóbica 9 é misturada com a citocina 10.

[073] A Figura 7A tem duas camadas de transição C baseadas na Figura 6. Uma delas se aproxima de dita camada hidrofóbica A, tem uma hidrofilicidade mais fraca do que aquela próxima a camada hidrofílica B. Da Figura 7B, a fibra eletrofiada hidrofóbica 7 é misturada com o medicamento 8, e a fibra eletrofiada hidrofílica 9 é misturada com uma citocina 10, as fibras de eletrofiação de duas camadas de transição 11 são respectivamente misturadas com o medicamento 8 e citocina 9.

[074] Além disso, a invenção provê um método que combina eletrofiação e bio-impressão para preparar a dura-máter artificial. Dita bio-impressão é uma tecnologia emergente e tem sido desenvolvida e aplicada em áreas biomédicas nos últimos anos. Esta tecnologia utiliza uma solução de célula especial ou uma solução biológica ativa como a bio-tinta e, como projetada, imprime precisamente sobre um local do substrato específico (denominado de bio-papel) que pode ser degradado no corpo humano. Após a impressão, os bios-papéis serão empilhados em certa sequência. Como a tecnologia de impressão é usada, a bio-tinta consiste de células e/ou citocina que podem ser precisamente colocadas para as áreas projetadas. Os bio-papéis, se empilhados de uma forma em particular, formarão as três estruturas dimensionais.

[075] A implementação específica é determinada na Figura 2. Com base em um determinado dispositivo mostrado na Figura 1, a cabeça da bio-impressora 5 é ajustada, e tal cabeça pode ser ajustada pela modificação da atual impressora comercial a jato de tinta tal como o método, por exemplo, divulgado na patente US7051654. A cabeça contém uma citocina e/ou um medicamento. A maneira e a posição da impressão podem ser ajustadas através de um programa de computador antecipadamente. Os procedimentos de impressão específicos podem basear-se nas tecnologias atuais.

[076] De acordo com uma realização da invenção, a citocina e/ou medicamento podem ser incluídos em hidrogel. Dita solução de hidrogel pode ser uma solução aquosa de polímero polissacarídeo, polímero peptídeo ou polímero hidrofílico. Dito polímero polissacarídeo inclui, mas não se limita ao ácido crílico, ácido polimetacrílico, poliacrilamida e acrilamida N-isopropil. Dito hidrogel é líquido em circunstâncias normais e torna-se gel em certa temperatura ou sob condições específicas. Com a qual, o hidrogel possui boa aderência, que pode fazer uma citocina e/ou medicamento uniforme e definitivamente distribuído sobre a camada de rotação eletrostática.

[077] Os procedimentos da bio-impressão com o hidrogel são os seguintes: colocar citocina e/ou medicamento, preparado e misturado com líquido hidrogel, na cabeça de bio-impressora 5. 2) depois de a camada de electrospun ser formada, imprimir sobre a camada de electrospun com impressora a jato assim como por programa pré-ajustado; baseado em escolha de hidrogel, aplicar condições apropriadas para fazer o hidrogel mais rapidamente formar gel/gelatina que, oferecendo boa aderência, adere a citocina e/ou medicamento incluídos nas camadas do electrospun. 3) Estabelecer distribuição uniforme de bio-tinta e formar uma dura-máter artificial como mostrado na Figura 8A, em que cada camada hidrofóbica é imprimida com uma camada de medicamento e cada camada hidrofílica é imprimida com uma camada de citocina. Como mostrado em grande escala na Figura 8B, o filme preparado com bio-impressão é diferente daquele preparado com mistura. A citocina e/ou medicamento são aplicados sobre as superfícies de camadas que é formada pela fibra eletrofiada hidrofóbica 7 e/ou a fibra eletrofiada hidrofílica 7 e/ou fibra eletrofiada hidrofílica 9. Quando tal dura-máter é transplantada em seres humanos, dita citocina e/ou medicamento pode ser uniformemente liberado. 4) se necessário, estabelecer uma distribuição concentrada sobre certos pontos e fazer dita citocina e/ou dito medicamento impresso em áreas particulares. Quando tal dura-máter é transplantada no corpo humano, dita citocina e/ou medicamento podem ser em grande parte liberada para áreas específicas desejadas.

[078] A solidificação de alguns hidrogéis precisa de agente de ligação cruzada para assistí-los. Neste caso, a bio-impressão na utilização do hidrogel tem os seguintes procedimentos: 1) colocar uma certa quantidade de agente de ligação cruzada no vaso 6. Uma vez que a eletrofiação é acionada, o dispositivo coletor 4,se desloca juntamente com o eixo ou entre a esquerda e direita, entrará em contato com o agente, e as camadas de electrospun formadas serão aderentes aos agentes de ligação cruzada. 2) fazer a bio-impressão como determinado acima. Quando o líquido hidrogel dentro da cabeça 5 fica em contato com o agente de ligação cruzada sobre as camadas de electrospun, o hidrogel transforma-se rapidamente em gel/gelatina e faz com que a citocina e/ou medicamento incluídos se adiram às camadas electrospun. A seleção do agente de ligação cruzada depende do tipo de hidrogel. Por exemplo, quando o hidrogel é um alginato de sódio, o agente de ligação cruzada é um cloridrato de cálcio, quando o hidrogel é um fibrinogênio, o agente é a trombina.

[079] De acordo com uma realização da invenção, dita solução de polímero hidrofóbico pode ser poli (L-lactídeo) hidrofóbico (PLLA) e ε -caprolactona dissolvida em álcool isopropílico hexafluor ou diclorometano, a relação dos ditos dois polímeros podendo ser 50:50, 30:70 ou 70:30. Como o copolímero, o peso do número da média molecular é 150.000-500.000. Quando a mistura é necessária, a solução hidrofóbica pode ser adicionada com 0,01-3% de solução antibiótica e/ou com 0,001-3% de medicamento para hemóstase e anti-aderência.

Junto com a solução de poli (L-Lactídeo) (PLLA) e ε-caprolactona, a solução final será obtida.

[080] De acordo com outra realização da invenção, para a solução do polímero hidrofílico pode ser escolhido poliuretano hidrofílico com gelatina natural, sulfato de condroitina ou polietileno glicol como solventes (s). A relação de massa é 20-80:80-20. A solução do rotação conta com 3-15% em peso total. Na mistura, o polímero de solução hidrofílica pode ser adicionado com uma solução de fator fibroblasto básico, e faz a concentração da citocina de 0,001-0,5%.

[081] Como medicamento adicionado na mistura ou bio-impressão pode ser escolhido, de acordo com a situação real, antibiótico ou droga para hemostase ou anti-aderência. No transplante de dura-máter devido a excisão do tumor, as drogas para quimioterapia de tumor de cérebro podem ser adicionadas.

[082] Um antibiótico inclui, mas não se limita a cefalosporina, ampicilina, espiramicina, sulfonamida e guinolonas. A primeira escolha é ceftriaxona sódio. Como as cirurgias de meninges frequentemente requerem abrir o crânio e no presente momento, a infecção intracranial é frequentemente bacteriana, consistindo principalmente de staphylococcus aureus, streptococcus, pneumococcus, escherichia coli, salmonella e pseudomonas aeruginosa. O vírus mais comum é o staphylococcus aureus. De acordo com relatórios clínicos, o ceftriaxona sódio oferece melhor efeito de terapia.

[083] O medicamento anti-tumor inclui, mas não se limita a nimustine, semustine, lipossomas doxorubicina, vincristina e dactinomicina D. O vincristina é de primeira escolha.

[084] Um medicamento para hemostase ou anti-aderência pode acelerar a cura do ferimento e evitar a ocorrência da aderência. Tais medicamentos incluem, mas não se limitam ao fator da hemostase (que faz com que o material possua a função de hemostase). O inibidor do colágeno sintase (tranilast e alamast, que inibe a renovação do colágeno), a droga de anti-coagulação (como dicoumarolum, sódio heparina e hirudina), a droga antiflamatória (como prometazina, dexametasona, hidrocortiso, hydrocortisonum, prednisolona, ibuprofeno e oxyphenbutazona), o bloqueador de canal de cálcio (como diltiazem clorídrico, nifedipina e cloridrato de verapamil), o inibidor de crescimento da célula (como o fluorouracil), a hidrolase (como hialuronidase, a estreptoquinase, uroquinase, pepsina e tPA) o redutor de oxidação (como o azul de metileno).

[085] De acordo com uma realização da invenção, na mistura, a solução de eletrofiação é adicionada com uma citocina e/ou medicamento nesta fórmula: o fator de crescimento de fibroblasto básico contando com 0,001-0,05% em peso de solução de eletrofiação, a ampinicilina conta com 3% em peso de solução de eltrofiação, o fator de hemóstase conta com 0,001-0,05% em peso de solução de eletrofiação. Na operação da restauração das meninges devido ao tumor de cérebro, a ninustina conta com 0,01-5% em peso que pode ser adicionado.

[086] A dura-máter artificial obtida deve ser lavada, esterilizada, empacotada e armazenada.

Exemplo 1 [087] Poli (L-lactídio) (PLLA) e ε-caprolactona, na relação de massa de 50:50 e com um peso molecular médio de de 260,000 são dissolvidos em um solvente de álcool isopropílico hexafluor para formar uma solução de eletrofiação hidrofóbica. Coloca-se a solução dentro do pulverizador de eletrofiação. A bomba de microinjeção é operada uma velocidade de 5 milímetros/hora; o gerador de alta tensão é operado a uma tensão de 30 quilovolts e a distância de coleta de 20 centímetros. As fibras são recebidas para formar uma estrutura de membrana e têm um diâmetro na média de 300nm. Depois do processo de coleta ser completado, o dispositivo de rotação é fechado.

[088] A dura-máter artificial obtida é lavada por cinco vezes com álcool etílico e água destilada. A dura-máter, então, é empacotada a vácuo depois é liofilizada. Depois da esterilização com 25kGy de cobalto 60, a dura-máter é armazenada no mínimo de 200C.

Exemplo 2 [089] O modo de preparação é o mesmo que no Exemplo 1.

[090] A solução hidrofílica para eletrofiação escolheu poli ácido etanedioico e sulfato de condroitina, em relação de massa de 70:30 e a fração de massa do líquido de rotação de 9%.

[091] O dispositivo de eletrofiação é ativado, e uma camada de electrospun hidrofílica é formada sobre a camada hidrofóbica já formada na realização 1. A distância de coleta é 11 centímetros, a tensão é de 20 quilovolts, e a camada hidrofílica obtida consiste de fibras na média com um diâmetro de 10μη.

[092] A lavagem e o armazenamento são os mesmos da Realização 1.

Exemplo 3 [093] A camada de electrospun hidrofóbica é preparada da mesma maneira que com a Realização 1.

[094] A camada de transição adota uma solução de poliuretano e ácido hialurônico em uma relação de massa de 70:30 e uma fração de massa de 10%. O rotação é ativado com a distância recebida de 11 centímetros e uma tensão de 20 quilovolts. As fibras têm um diâmetro na média de 5μm. Sobre a camada hidrofóbica, é feita a camada de transição.

[095] Portanto, a camada de transição, a camada hidrofílica é rotacionada, da mesma maneira que no Exemplo 4. Depois disso, o rotação é interrompida.

[096] A lavagem e armazenamento são os mesmos que no Exemplo 1.

Exemplo 4 [097] (1) Preparar a camada elctrosporun hidrofóbica: escolher a policaprolactona hidrofóbica e um solvente misturado de clorofórmio ou álcool metilílico em uma relação de 1:1. Acrescentar com ceftriaxona sódio, em uma concentração de 1%. Obter uma solução uniforme.

[098] Adicionar a solução acima dentro do pulverizador para o rotação eletrostática, e realizar a eletrofiação com uma bomba de microinjeção operada a uma velocidade de 0,8 milímetros/hora e um gerador de alta tensão operado a uma tensão de 12 quilovolts e uma distância de coleta de 15 centímetros. Obter as fibras na estrutura da membrana. As fibras da camada de electrospun hidrofóbica têm um diâmetro de 600 nanômetros.

[099] Fechar o dispositivo de rotação.

[0100] (2) preparar a camada de electrospun hidrofílica: Adotar a proteína da seda hidrofílica e gelatina natural em uma relação de 20-80:80-20 e fração de massa de líquido de rotação de 9%.

[0101] Preparar a solução de fator de fibroblasto básico. Misturar a solução com dita solução de eletrofiação uniforme, a concentração final de citocina sendo 0,001%, a distância de coleta de 10 cm e a tensão de 20KV. Iniciar da eletrofiação, e formar a camada hidrofílica sobre a camada hidrofóbica já formada. A média do diâmetro de fibras da camada hidrofílica está no nível de mícron.

[0102] A lavagem e o armazenamento são os mesmos que no Exemplo 1. Exemplo 5 [0103] (1) Preparar a camada de electrospun hidrofóbica: Selecionar a policaprolactona e um solvente misturado de clorofórmio e álcool metílico em relação de 1:1. Misturar com vincristina na concentração de 100ng/ml, e terá uma solução uniforme.

[0104] Adicionar a solução acima dentro do pulverizador para eletrofiação, ajustar a velocidade da bomba de microinjeção para 0,8 ml por hora, a tensão do gerador de alta tensão é de 12KV, e a distância de coleta do dispositivo coletor é de 15cm, e obter as fibras na estrutura da membrana. As fibras da camada de electrospun hidrofóbica têm um diâmetro de 600 nanômetros.

[0105] Fechar o dispositivo de rotação.

[0106] (2) Preparar a camada de transição: escolher poliuretano e ácido hialurônico em relação de massa de 70:30. Ter uma fração de massa de solução do rotação de 10%. Misture com ampicilina na concentração de 3%. A solução uniforme é formada.

[0107] Iniciar o rotação. Rotacionar a camada de transição sobre a camada hidrofóbica já formada.

[0108] A distância de coleta é de 11 centímetros, a tensão é de 20 quilovolts e a média de diâmetro das fibras é de 5μm.

[0109] Fechar o dispositivo de rotação.

[0110] (3) Prepare a camada elestrosporun hidrofílica: Adotar a proteína de seda hidrofílica e gelatina natural na relação de 20-80:80-20 e tem uma fração de massa de solução do rotação de 9%. Misture com solução de ampicilina na concentração final de 3%.

[0111] Ativar o dispositivo de rotação, ajustar a distância de coleta de 10cm, e rotacionar a camada hidrofílica sobre a camada de transição já formada. A média do diâmetro de fibras deve ser no nível de mícron.

[0112] A lavagem e o armazenamento são os mesmos que no Exemplo 1.

Exemplo 6 [0113] (1) Preparar a camada de electrospun hidrofóbica com bio-impressão: [0114] A solução hidrofóbica seleciona a poli (L-Lactídeo) (PLLA) e ε-caprolactona, em uma relação de massa de 50:50, como polímero com um peso molecular médio de de 260000, dissolvido no álcool isopropílico hexafluor.

[0115] O agente de ligação cruzada seleciona 0,1M de solução de cloreto de cálcio.

[0116] O hidrogel contendo uma citocina adota uma solução de alginato do fator de hemostasia. O fator hemostase tem uma concentração de 10ppm em massa na solução de alginato citocina.

[0117] A solução com 0,1M cloreto de cálcio deve ser colocada na placa de petri de célula com um diâmetro de 150mm. A divisão do co-recebedor através do dispositivo de rotação e bio-impressão é colocada na placa de petri. Na formação de uma camada de electrospun, o dispositivo coletor deve estar em contato com a solução na placa de petri. O cabeçote de impressão é fixado abaixo da agulha da eletrofiação a qual está dentro da caixa do dispositivo de rotação, que oferece uma função de impressão de ponto fixo sobre uma área específica com fator de hemostasia. A solução citocina alginato preparada é colocada no cartucho da impressora jato. Nesta realização, o cartucho é HP51626A.

[0118] A solução de eletrofiação hidrofóbica é colocada dentro do pulverizador para rotacionar. Depois disso, ajustar a velocidade da bomba de microinjeção para 5 milímetros/hora, a tensão de gerador de alta tensão é de 30 quilovolts, e a distância de coleta do dispositivo coletor é de 20 centímetros. A fibra é recebida na estrutura da membrana. O rotação dura 20 minutos antes que o dispositivo de rotação feche.

[0119] A solução de hidrogel contendo citocina é impressa sobre dita estrutura nano biônico com impressora a jato. Uma vez que o hidrogel é solidificado, a camada do electrospun hidrofóbico com citocina através da bio-impressão é obtida.

[0120] (2) Preparar a camada de electrospun hidrofílica com bio-impressão: [0121] Uma solução de eletrofiação, uma solução de hidrogel com medicamento e solução de agente de ligação cruzada são preparados.

[0122] Poliglicol e sulfato de condroitina, como materiais hidrofílicos, com razão de massa de 70:30, são escolhidas. A solução de rotação tem a fração de massa de 9%. A solução de agente de ligação cruzada é a solução de cloreto de cálcio de 0,1M.

[0123] A solução de hidrogel contém uma citocina que adota a solução alginato com fator fibroblasto básico. Dita solução de alginato básica tem o fator de fibroblasto básico e na concentração de 100 ppm.

[0124] Os parâmetros são ajustados como segue: ajustar a velocidade da bomba de microinjeção para 0,8 milímetros/hora, a tensão do gerador de alta tensão é de 20 quilovolts e a distância de coleta do dispositivo coletor é de 11 centímetros. Outros procedimentos de preparação são os mesmos que aqueles na primeira etapa acima. Depois de a fibra hidrofílica ser recebida na estrutura da membrana, através da bio-impressão, a solução gel contendo o fator de fibrinogênio básico é impresso em estrutura nano-biônico. Uma vez que o hidrogel é solidificado, a camada de electrospun hidrofílica com citocina através da bio-impressão é obtida.

[0125] A lavagem e o armazenamento são os mesmos que aqueles do Exemplo 1.

Exemplo 7 [0126] A preparação da camada de electrospun hidrofóbica com bio-impressão é a mesma que aquela dita no Exemplo 6.

[0127] Preparar a camada de transição através da bio-impressão.

[0128] A solução líquida de eletrofiação da camada de transição é composta de poliuretano e ácido hialurônico em uma reação de massa de 70:30. A fração de massa de solução do rotação é de 10%. A ampicilina misturada está na concentração de 3%.

[0129] A solução de agente de ligação cruzada é de 0,1M de solução de cloreto de cálcio.

[0130] A solução de hidrogel com citocina é uma solução de alginato de fator de hemostasia e a percentagem do fator de hemostasia é 10ppm.

[0131] Os parâmetros são ajustados como segue: a velocidade da bomba de microinjeção é de 4 milímetros/hora, a tensão do gerador de alta tensão é de 20 quilovolts, e a distância de coleta é de 11 centímetros. Os outros procedimentos são os mesmos que os procedimentos acima. A fibra é recebida na estrutura da membrana. A solução de hidrogel contém a citocina que será impressa sobre a camada de transição. Depois do hidrogel ser solidificado, a camada de electrospun hidrofóbica com citocina através da bio-impressão é obtida.

[0132] A preparação da camada de electrospun hidrofílica com bio-impressão é a mesma que a citada no Exemplo 6.

[0133] A lavagem e armazenamento são os mesmos que aqueles do Exemplo 1.

Experimento do Exemplo 1 [0134] A dura-máter obtida do Exemplo 1 é aplicada em cachorro para experimento animal, enquanto o controle é um produto de reparação das meninges heterogênico clinicamente aplicável. Três cachorros sadios são escolhidos, tanto macho quanto fêmea, com peso entre 10 e 15Kg, sob observação por dois a três meses. Os cachorros escolhidos para o experimento são submetidos a anestesia geral. Seus crânios são abertos tanto do lado esquerdo como do direito. Suas dura-máter são cirurgicamente removidas, e as falhas da dura-máter e lesões do tecido cerebral aparecem. Portanto, as dura-máter obtidas da Realização 1 e o controle, respectivamente, são implantados para reparar as lesões durais dos lados esquerdo e direito do cérebro do cachorro. Após a operação, os cachorros são alimentados normalmente como de costume e observados periodicamente. A espécime é levado da área de implante ao final de cada período de observação. Ao final do período de observação, os crânios dos cachorros são expostos da maneira como dito acima após anestesia geral. Exposto e separado da superfície externa do material de apoio. Para recuperar as amostras, os cachorros são sacrificados pela administração de injeção de ar intravenosa. Os crânios são abertos cirurgicamente. Os implantes e tecidos próximos são retirados. A recuperação das amostras são inspecionadas cuidadosamente com detalhes incluindo a aparência, caracteres, sua relação com os arredores, cisto, calosidade, assim como a aderência entre sua superfície interna e o tecido do cérebro. A espécime é armazenada em uma garrafa , tratada e fixada com solução de Formalina. Etiquetando a garrafa. Uma semana depois, retirando o tecido local; embebido com seção de parafina e mancha histológica com HE.

[0135] Vários dias após o implante, os três cachorros se recuperaram bem, e as incisões são bem curadas sem nenhuma secreção evidente. Os cachorros se alimentam e bebem água normalmente assim como suas atividades externas são normais sem nenhum movimento de mal funcionamento. Três meses após o implante, os três cachorros são sacrificados por injeção de ar intravenosa. Após os sacrifício, tomando o sítio cirúrgico como centro, a espécime é cortada um centímetro fora do local da operação, e inclui o material de apoio, as mediações da dura-máter e parte do tecido do cérebro. Após a espécime ser levada, separa-se o crânio meninges em ordem. Verifica-se que as meninges, onde a dura-máter é transplantada, estão completamente formadas; o material transplantado foi substituído por tecido fibroso, e conectado firmemente com as meninges nativas sem limite. A superfície interna das meninges formadas recentemente no local do transplante das amostras de controle, o material transplantado ainda não foi degradado e existe um pouco de aderência no local do transplante para a superfície interna das meninges.

Experimento do Exemplo 2 [0136] A dura-máter preparada no Exemplo 2 é agora aplicada para o experimento do cachorro. Os cinco cachorros estão no peso de 15-20Kg, 1,5-2 anos de idade, tanto macho quanto fêmea. Eles estão sob anestesia geral através de injeção intramuscular de quetamina. Após anestesia e raspagem, os animais são colocados na mesa de cirurgia na posição de lado. A desinfecção é feita com iodine a 2% e álcool a 75%. As cabeças dos animais são abertas cirurgicamente na direção longitudinal. Um bisturi é usado para separar o periósteo do crânio, e os dois platôs do topo do crânio são expostos. A furadeira de alta velocidade é usada para abrir o crânio. As duas janelas no crânio do vértice são formadas, e duas dura-máter retangulares em tamanho de 3cm x 3cm no topo da cabeça são cortados com tesoura. Finalmente as lesões do topo da dura-máter são feitos para o implante seguinte com dura-máter artificial e controle. Sobre a superfície do cérebro exposta, a eletrocoagulação é aplicada para realizar 6 pontos de ferimentos em tamanho de 1mmx1mm. Então a dura-máter artificial fabricada na Realização 2 é aparada na mesma forma e tamanho que as lesões durais e carregados para o dano. A camada hidrofóbica é direcionada à superfície do cérebro, e as suturas são feitas com linha 4/0 em intervalo de 4mm, para reparar a lesão dural dos cachorros. A agulha arredondada e a linha 4/0 são usados para a sutura do músculo. O material animal comercializado, aplicável clinicamente baseado em produto de reparação dural é aplicado como controle. Após a operação, os cachorros são alimentados normalmente como de costume e observados periodicamente. Os animais se recuperam bem, e as incisões são bem curadas. Nenhuma secreção do fluido cérebro-espinhal ou ocorrência de epilepsia são encontrados. Os cachorros se alimentam e bebem água normalmente assim como suas atividades externas são normais sem nenhum movimento de malformação, e eles sobrevivem a longevidade esperada.

[0137] Dezoito meses depois do implante, os cachorros são sacrificados e a espécime é levada para o local cirúrgico, e isso inclui a dura-máter artificial, a dura-máter das mediações, e a parte das mediações do tecido do cérebro. Depois de observar cuidadosamente a espécime, podemos ver que a conexão entre a dura-máter artificial e a dura-máter nativa é apertada e suave, sem limite claro, bem curada, além disso, com somente a linha a vista. A dura-máter nativa não mostra nenhuma hiperemia, hemorragia ou outra reação de rejeição. Enquanto, os resultados do controle mostra que o material do implante ainda não está degradado, e o local implantado, a superfície interna das meninges adere ao tecido cerebral em alguns graus.

Experimento do Exemplo 3 [0138] A dura-máter artificial obtida do Exemplo 3 está agora sob o experimento com coelho da Nova Zelândia.

[0139] Os animais sob experimento são abertos no crânio, e a lesão da dura-máter e o ferimento do tecido do cérebro são realizados cirurgicamente. Então, a dura-máter artificial é usada para reparar o dano. Depois da operação, os coelhos são alimentados normalmente como de costume e observados periodicamente. Estes animais se recuperam bem. Dezoito meses após o implante, os coelhos são sacrificados e a espécime é levada para local cirúrgico. A espécime inclui a dura-máter artificial, as mediações da dura-máter e a parte de mediações do tecido do cérebro. Quando observa a espécime cuidadosamente, é visto que as células epiteliais cobrem a superfície interna da dura-máter; sob o epitélio, tecido fibroso é formado, células do fibroblasto progenitor se prolifera, e as fibras de colágeno são aumentadas. Todos estes resultados na formação dos novos tecidos vascularizados, em crescimento da dura-máter nativa, degradação do material de implante, dedução da massa total do implante, e geração de ricas redes capilares. Na interface dos tecidos velhos e novos, não são encontrados nenhum neutrófilo, linfócito ou outra reação de célula para inflamação, e nenhuma parede de cisto é formada. A mater aracnóide e o tecido do cérebro são normais.

Experimento do Exemplo 4 [0140] A dura-máter obtida no Exemplo 4 é agora aplicada ao experimento com cachorro, e o método é o mesmo que no Exemplo 2.

[0141] Quinze meses após o implante, os cachorros são classificados e a espécime é levada para o local cirúrgico. A espécime inclui a dura-máter artificial, as mediações da dura-máter, e a parte das mediações de tecido do cérebro. Após observar cuidadosamente a espécime, é visto que a conexão entre a dura-máter artificial e a dura-máter nativa é apertada e suave, sem limite claro, completamente curada, e com somente linha a vista. A dura-máter nativa não mostra hiperemia, hemorragia ou outra reação de rejeição.

Experimento do Exemplo 5 [0142] A dura-máter obtida no Exemplo 5 é agora aplicada a experimento com coelho na Nova Zelândia, e o controle dos materiais animais é comercializado, clinicamente aplicável baseado no produto da dura-máter como o material de apoio.

[0143] O método é o mesmo que para o experimento do Exemplo 3. Quinze meses após o implante, os coelhos são sacrificados e a espécime é levada para o local cirúrgico. Quando observa a espécime cuidadosamente, é visto que as células epiteliais cobrem a superfície interna da dura-máter; sob o epitélio, e tecido fibroso é formado, as células de fibroblasto progenitoras proliferam, e as fibras de colágeno são produzidas, em crescimento da dura-máter nativa, degradação do material de implante, dedução da massa total do implante, e geração de ricas redes capilares. Na interface dos tecidos antigos e novos, sem neutrófilo, linfócito ou outra reação de célula para inflamação são encontrados, e nenhuma parede de cisto é formada. A máter aracnóide e tecido do cérebro são normais. Enquanto os resultados com o controle mostram que o material do implante ainda não está degradado, e no local do implante, a superfície interna das meninges adere ao tecido do cérebro em algum grau.

Experimento do Exemplo 6 [0144] A dura-máter obtida do Exemplo 6 é agora aplicada ao experimento com cachorro, e o método é o mesmo do Experimento do Exemplo 2.

[0145] Doze meses após o implante, os cachorros são sacrificados e a espécime é levada para o local cirúrgico. A espécime inclui a dura-máter artificial, as mediações da dura-máter, e parte nas mediações do tecido cérebro. Quando observa- se a espécime cuidadosamente. É visto que a conexão entre a dura-máter artificial e a dura-máter nativa é apertada e suave, sem limite claro, completamente curada, e somente com linha a vista. A dura-máter nativa não apresenta hiperemia, hemorragia ou outra reação de rejeição.

Experimento do Exemplo 7 [0146] A dura-máter obtida do Exemplo 7 é agora aplicada ao experimento com coelho na Nova Zelândia.

[0147] O método é o mesmo do Experimento do Exemplo 3. Doze meses após o implante, os coelhos são sacrificados e a espécime é levada para local cirúrgico. Quando observa-se a espécime cuidadosamente, é visto que as células epiteliais cobrem a parte interna da dura-máter; sob o epitélio fibroso é formado o tecido, as células fibroblastos progenitoras proliferam, e as fibras de colágeno aumentam. Tosos esses resultados na formação de novos tecidos vascularizados, na dura-máter nativa em crescimento, a degradação do material de implante, dedução da massa total do implante, e a geração da rica rede capilária. Na interface dos tecidos velhos e novos, nenhum neutrófilo, linfócito ou outra reação de célula de inflamação é encontrada, e nenhuma parede de cisto é formada. A máter aracnóide e tecido do cérebro são normais.

[0148] Embora as realizações tenham sido feitas e descritas, os especialistas na área podem, sem se desviar do princípio e da teoria, fazer variações, modificações, substituições e mudanças nestas realizações, como definido no escopo da invenção e nas reivindicações.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Dura-máter artificial preparada com camadas electrospun usando tecnologia de eletrofiação, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma camada electrospun hidrofóbica (A) para justaposição à superfície do encéfalo, dita camada electrospun hidrofóbica tendo fibras com um diâmetro compreendido entre 50 e 1000 nanômetros e poros com um tamanho inferior a 3 micrômetros.

2. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita camada electrospun hidrofóbica é preparada através de um método compreendendo eletrofiação, com um ou mais polímeros hidrofóbicos selecionados do grupo que consiste de poliéster alifático hidrofóbico, polieteréster, poliortoéster, poliuretano, polianidro, polifosfazeno, poliaminoácido e copolímeros e misturas do mesmo.

3. Dura-máter artificial l de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que dito poliéster alifático hidrofóbico é pelo menos um selecionado do grupo que consiste de ácido polilático, poliglicolidio, policaprolactona e poli-hidroxibutirato.

4. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que dito politeréster é pelo menos um selecionado do grupo consistindo de polidioxanona (PDO), copolímero glicol ácido láctico e glicol copolímero polibutilece tereftalato.

5. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que dito polianidrido é pelo menos um selecionado do grupo consistindo de anidrido diácido anidrido policetona polisebácico, polianidrido tipo II, polianidrido tipo III e polianidrido tipo IV.

6. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ainda compreender pelo menos uma camada de electrospun hidrofílica (B) disposta sobre dita camada de electrospun hidrofóbica (A), para posicionamento afastada da superfície do encéfalo.

7. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que dita camada electrospun hidrofílica (B) é preparada através de um método compreendendo eletrofiação, com um ou mais polímeros hidrofílicos selecionados do grupo que consiste de sulfato de condroitina, heparina, ágar, glucana, algina, celulose modificada, alginato sódio, amido, celulose, gelatina, fibrinogênio, proteína de seda, polímero peptídeo mimetizado de elastina , colágeno, quitosana, quitosana modificada, poliuretano hidrofílico, polietileno glicol, polimetilmetacrilato, PHBV, PHBHHx, álcool polivinílico, polilactidio e suas misturas e por compreender fibras com um diâmetro de 5 a 200 micrômetros e poros com um tamanho de 20 a 200 micrômetros.

8. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de compreender uma camada de transição (C) disposta entre ditas camadas hidrofóbica (A) e hidrofílica (B), onde dita camada de transição é preparada por um método de eletrofiação, com um ou mais polímeros, e a hidrofilicidade da referida camada de transição aumenta da referida camada electrospun hidrofóbica em direção a dita camada electrospun hidrofílica.

9. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma citocina (10) e/ou um medicamento (8) adicionado ou aderido à referida camada hidrofóbica electrospun (9).

10. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma citocina (10) e/ou um medicamento (8) adicionado ou aderido à referida camada electrospun hidrofóbica e/ou à dita camada electrospun hidrofílica.

11. Dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma citocina (10) e/ou um medicamento (8) adicionado ou aderido à referida camada electrospun hidrofóbica e/ou dita camada electrospun hidrofílica e/ou dita camada de transição.

12. Dura-máter artificial de acordo com a qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que a citocina é selecionada do grupo consistindo de interleucina, fator estimulador de colônia, fator de necrose tumoral, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator fibroblasto básico e suas combinações, e o referido medicamento é um ou mais selecionado do grupo consistindo de um antibiótico, um hemostático, um agente anti-aderência e uma droga anti-tumor.

13. Método para preparar dura-máter artificial como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) dissolver um polímero hidrofóbico num solvente para obter solução de eletrofiação hidrofóbica, em que dito polímero hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste de poliéster hidrofóbico alifático, polieteréster, poliortoéster, poliuretano, polianidrido, polifosfazeno, poliaminoácido e copolímeros ou suas misturas; b) produzir, através de eletrofiação, uma camada electrospun hidrofóbica, semelhante a uma película, com fibras de um diâmetro de 50 a 1000 nanômetros e poros com um tamanho inferior a 3 micrômetros, a partir da referida solução hidrofóbica para obter a dura-máter artificial.

14. Método para preparar dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) dita eletrofiação é realizada com uma bomba de microinjeção operada a uma velocidade de 0,1 a 5,0 mililitros por hora, e um gerador de alta tensão operado a uma tensão de 5 a 40 kilovolts e com uma distância de coleta de 5,0 a 30,0 centímetros.

15. Método para preparar dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender ainda a formação de uma camada electrospun hidrofílica sobre dita camada electrospun hidrofóbica mediante as etapas de: a') dissolver um polímero hidrofílico num solvente para obter a solução de eletrofiação hidrofílica, sendo dito polímero hidrofílico selecionado do grupo que consiste de: sulfato de condroitina, heparina, agar, glucano, algina, celulose modificada, alginato de sódio, amido, celulose, gelatina, fibrinogênio, proteína de seda, polímero peptídeo elastino mimetizado, colágeno, quitosana, quitosana modificada, poliuretano hidrofílico, polietileno glicol, polimetilmetacrilato, PHBV, PHBHHx, álcool polivinílico e polilactídio e suas misturas; b') depositar dita solução de eletrofiação hidrofílica através de eletrofiação sobre dita camada hidrofóbica para formar a camada electrospun hidrofílica.

16. Método para preparar dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de, em que dita camada electrospun hidrofílica compreende fibras com um diâmetro de 5 a 200 micrómetros e poros com um tamanho de 20 a 200 micrómetros, e em que na etapa (b'), dita eletrofiação é realizada com uma bomba de micro-injeção operada a uma velocidade de 0,1 a 20,0 mililitros por hora e um gerador de alta tensão operado a uma tensão de 10 a 40 kilovolts e com uma distância de coleta de 5,0 a 30,0 centímetros.

17. Método para preparar dura-máter artificial de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a etapa de formar uma camada de transição entre as camadas electrospun hidrofóbica e hidrofílica por eletrofiação de uma solução electrospinning contendo um ou mais polímeros, antes da preparação da camada electrospun hidrofílica e onde a hidrofilicidade de dita camada de transição ser aumentada gradualmente a partir da camada electrospun hidrofóbica para a camada electrospun hidrofílica.

18. Método para preparar dura-máter artificial de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 16, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente, compreendendo ainda uma etapa em que uma citocina (10) e/ou um medicamento (8) são distribuídos na dita camada electrospun hidrofóbica e/ou dita camada electrospun hidrofílica por técnica de bioimpressão, em que a referida técnica de bioimpressão compreende os passos de: a") misturar uma solução de hidrogel com uma citocina e/ou um medicamento para formar uma solução e b") imprimir a referida solução mista sobre as referidas camadas electrospun hidrofóbica e/ou hidrofílica utilizando tecnologia de bioimpressão.