BRPI0815975B1 - Preparação aquosa, recipiente farmacêutico, processo para preparar uma preparação aquosa, e, uso de uma preparação aquosa - Google Patents

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Abstract

"preparação aquosa, recipiente farmacêutico, processo para preparar uma preparação aquosa, e, uso de uma preparação aquosa" a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica líquida compreendendo um polipeptídeo do fator estimulador de colônias de granulócitos conjugado com um polímero, a composição tendo um valor de ph na faixa de 4,5 a 5,5. a composição ainda compreende um tensoativo e, opcionalmente, um ou mais outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 1 o além disso, a composição da invenção é livre de ácido tartárico ou seus sais e de ácido succínico e seus sais como agentes de tamponamento, e não contêm aminoácidos como estabilizadores. a composição tem uma boa estabilidade em armazenagem e é especialmente útil para a profilaxia e tratamento de distúrbios e indicações médicas em que as preparações do fator estimulador 15 de colônias de granulócitos são consideradas como remédios úteis.

Description

“PREPARAÇÃO AQUOSA, RECIPIENTE FARMACÊUTICO, PROCESSO PARA PREPARAR UMA PREPARAÇÃO AQUOSA, E, USO DE UMA PREPARAÇÃO AQUOSA”
A presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica líquida compreendendo um polipeptídeo do fator estimulador de colônias de granulócitos conjugado com um polímero, a composição tendo um valor de pH na faixa de 4,5 a 5,5. A composição ainda compreende um tensoativo e, opcionalmente, um ou mais outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Além disso, a composição da invenção é livre 10 de ácido tartárico ou seus sais e de ácido succínico e seus sais como agentes de tamponamento, e não contêm aminoácidos como estabilizadores. A composição apresenta uma boa estabilidade em armazenagem e é especialmente útil para a profilaxia e tratamento de distúrbios e indicações médicas em que as preparações do fator estimulador de colônias de 15 granulócitos são consideradas como remédios úteis.
O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é um fator de crescimento hematopoiético que estimula a proliferação e a diferenciação das células precursoras hematopoiéticas e a ativação dos neutrófilos maduros. O G-CSF é capaz de suportar a proliferação de 20 neutrófilos in vitro e in vivo. A forma humana do G-CSF foi clonada por grupos do Japão e dos Estados Unidos em 1986 [ver, por exemplo, Nagata et al. (1986) Nature 319: 415-418]. A glicoproteína humana natural existe em duas formas, uma tendo 174 e a outra tendo 177 aminoácidos. A forma de 174 aminoácidos mais abundante e mais ativa foi usada no desenvolvimento de 25 produtos farmacêuticos por tecnologia recombinante de DNA.
Grandes quantidades de G-CSF recombinante têm sido produzidas em Escherichia coli geneticamente engendrado e têm sido usadas com sucesso em aplicações clínicas para tratar de pacientes de câncer sofrendo de neutropenia induzida pela quimioterapia. O G-CSF produzido por
Escherichia coli é uma cadeia de polipeptídeos de 175 aminoácidos contendo uma metionina extra no término N. Esta proteína tem sido produzida pela expressão de um gene de G-CSF em E. coli e purificação do produto protéico até a homogeneidade. E uma proteína hidrofóbica que tem cinco resíduos de cisteína, quatro deles são envolvidos na ligação dissulfeto. O resíduo de cisteína livre é geralmente implicado na formação de agregados de pesos moleculares mais elevados após a armazenagem em solução. Os agregados das proteínas podem também ser formados das formas oxidadas da proteína que surgem pela oxidação dos resíduos de metionina internos na sequência primária da proteína. Dos quatros resíduos da metionina, um se acha no término N e os outros três são internos. As formas oxidadas da proteína que contém metionina oxidada na posição 122 podem ser separadas das formas contendo metioninas oxidadas nas posições 127 ou 138 e a proteína nativa por procedimentos de separação de HPLC de fase reversa regulares (as posições são calculadas quanto s Metionil-G-CSF consistindo em 175 aminoácidos).
O G-CSF humano recombinante sintetizado em um sistema de expressão de E. coli é denominado filgrastim (nome internacional não registrado, INN). A estrutura do filgrastim difere levemente da glicoproteína natural. A outra forma do G-CSF humano recombinante é denominada lenograstim (INN) e é sintetizada nas células de ovário de hamster chinês (CHO). O filgrastim e o lenograstim são comercializados na Europa sob os nomes comerciais de Neupogen® e Granocyte, respectivamente.
Entretanto, as formas comercialmente disponíveis do G-CSF humano recombinante têm um efeito farmacológico de pouca duração e frequentemente devem ser administradas mais do que uma vez por dia para a duração do estado leucopênico. Uma molécula com meia-vida de circulação mais longa deve reduzir o número de administrações necessárias para aliviar a leucopenia e prevenir as consequentes infecções. Outro problema com os produtos de G-CSF humanos recombinantes correntemente disponíveis é a ocorrência da dor óssea dependente da dose. Tendo em vista que a dor óssea é experimentada pelos pacientes como um efeito colateral significativo do tratamento com G-CSF humano recombinante, deve ser desejável prover um produto de G-CSF humano recombinante que não cause dor óssea, ou por meio de um produto que inerentemente não tenha este efeito ou que seja eficaz em uma dose que seja suficientemente pequena de modo que nenhuma, ou pelo menos, dor óssea seja causada. Assim, existe claramente a necessidade de moléculas de G-CSF recombinante melhoradas e preparações farmacêuticas contendo as moléculas de G-CSF como preparações prontaspara-uso estáveis.
Variantes engendradas por proteínas de G-CSF humano têm sido relatadas, por exemplo, em variantes de G-CSF, descritas nas WO 01/87925, EP 0 456 200 A, U.S. 6.166.183, U.S. 6.004.548, U.S. 5.580.755, U.S. 5.582.823, U.S. 5.675.941, U.S. 5.416.195, U.S. 5.399.345, WO 2005/055946 e WO 2006/074467.
A modificação do G-CSF humano e de outros polipeptídeos de modo a introduzir pelo menos uma cadeia adicional de carboidrato em comparação com o polipeptídeo nativo, também foi relatada (U.S. 5.218.092). Além disso, as modificações poliméricas do G-CSF humano nativo, incluindo a ligação dos grupos de poli(etileno glicol) (PEG), foram relatadas e estudadas (U.S. 5.824.778, US 5.824.784, WO 96/11953, WO 95/21629 e WO 94/20069).
E geralmente aceito que a estabilidade das proteínas pode ser melhorada e a resposta imune contra estas proteínas podem ser reduzidas quando estas proteínas sejam acopladas às moléculas poliméricas. A WO 94/28024 descreve que as proteínas fisiologicamente ativas modificadas com PEG apresentam imunogenicidade e antigenicidade reduzidas e circulam na corrente sanguínea de forma consideravelmente mais extensa do que as proteínas não conjugadas, isto é, têm um índice de depuração reduzido.
A ligação dos polímeros sintéticos à estrutura peptídica em uma tentativa de melhorar as propriedades farmacocinéticas da terapêutica de glicoproteínas é conhecida na técnica. Um polímero exemplar que foi conjugado a peptídeos é o PEG. O uso do PEG para originar a terapêutica peptídica foi demonstrado reduzir a imunogenicidade dos peptídeos. Por exemplo, a patente U.S. número 4.179.337 descreve polipeptídeos não imunogênicos tais como hormônios de enzimas e de peptídeos acoplados ao PEG ou ao poli(propileno glicol) (PPG). Além da imunogenicidade reduzida, o tempo de depuração na circulação é prolongado por causa do tamanho aumentado do conjugado de PEG dos polipeptídeos em questão.
O pegfílgrastim (INN) é um conjugado covalente do G-CSF humano de metionila recombinante (filgrastim) e uma única molécula de monometóxi-PEG de 20 kDa. A molécula de monometóxi-PEG é covalentemente ligada ao resíduo de metionila N-terminal do filgrastim. O pegfílgrastim é comercializado na Europa sob o nome comercial de Neulasta®.
O modo principal de ligação do PEG, e de seus derivados, aos peptídeos, é uma ligação não específica através de um resíduo peptídico de aminoácido (ver, por exemplo, as U.S. 4.088.538, U.S. 4.496.689, U.S. 4.414.147, U.S. 4.055.635 e WO 87/00056). Outro modo de ligar o PEG aos peptídeos é através da oxidação não específica dos resíduos de glicosil sobre um glicopeptídeo (ver, por exemplo, a WO 94/05332).
Nestes métodos não específicos, o PEG é adicionado, de uma maneira não específica, aleatória, aos resíduos reativos em uma estrutura peptídica. A adição aleatória das moléculas do PEG tem seus inconvenientes, incluindo uma falta de homogenicidade do produto final, e a possibilidade de que a atividade biológica ou enzimática do peptídeo venha a ser reduzida. Portanto, durante os anos recentes, esforços têm sido feitos para desenvolver mais métodos específicos do sítio para ligar um polímero sintético ou outro rótulo a um peptídeo, e foi observado que a terapêutica de peptídeos homogêneos especificamente conjugados pode ser produzida in vitro através da ação das enzimas. Estas conjugações com base nas enzimas têm as vantagens da regiosseletividade e estereosseletividade. Duas classes principais de enzimas para uso na síntese de peptídeos conjugados são as glicosiltransferases (por exemplo, as sialiltransferases, as oligossacariltransferases, as N-acetilglicosaminiltransferases) e as glicosidases. Estas enzimas podem ser usadas para ligação específica de açúcares, que podem subsequentemente ser modificados para compreender um componente terapêutico. Altemativamente, as glicosiltransferases, e as glicosidases modificadas, podem ser usadas para transferir diretamente açúcares modificados para a estrutura peptídica (ver, por exemplo, as U.S. 6.399.336 e U.S. 2003/0040037, U.S. 2004/0132640, U.S. 2004/0137557, U.S. 2004/0126838 e U.S. 2004/0142856). Métodos que combinam os elementos sintéticos, tanto químicos quanto enzimáticos, são também conhecidos (ver, por exemplo, a U.S. 2004/137557).
Os vários métodos de conjugar polipeptídeos como G-CSF com componentes poliméricos como o PEG, são bem conhecidos e extensivamente descritos na técnica anterior. A preparação do G-CSF glicoPEGuilado é, por exemplo, descrita no WO 2005/055946. Outro pedido de patente que é dirigido à preparação dos conjugados entre os componentes de G-CSF e de PEG, é o WO 2006/074467. Neste método, os conjugados são ligados através de um grupo de ligação de glicosil intacto interposto entre o polipeptídeo de G-CSF e o grupo de modificação, e a eles covalentemente ligados. Os conjugados são formados de polipeptídeos de G-CSF tanto glicosilados quanto não glicosilados, pela ação da glicosiltransferase. A glicosiltransferase liga um componente de açúcar modificado ou em um resíduo de aminoácido ou de glicosil no polipeptídeo. A descrição do WO 2005/055946 e do WO 2006/074467 é explicitamente referida no contexto da presente invenção.
Além do PEG, igualmente outros componentes poliméricos foram descritos como conjugados úteis com G-CSF e outras proteínas terapêuticas. A WO 02/09766 descreve, entre outros, compostos biocompatíveis de proteínas-polímeros produzidos pela conjugação da proteína biologicamente ativa com um derivado polimérico biocompatível. Os polímeros biocompatíveis usados são polímeros ramificados altamente reativos, e os conjugados resultantes contêm um ligador extenso entre o derivado polimérico e a proteína. Exemplos de polímeros biocompatíveis de acordo com a WO 02/9766 são o PEG, PPG, polioxietileno (POE), politrimetileno glicol, ácido poliláctico e seus derivados, ácido poliacrílico e seus derivados, ácidos poliamino, poliuretano, polifosfazeno, poli(L-lisina), óxido de polialquileno (PAO), polímeros solúveis em água tais como polissacarídeo, dextrano, e polímeros não imunogênicos, tais como o álcool polivinílico e a poliacilamida.
A WO 94/01483 descreve conjugados de polímeros biocompatíveis que são formados pela ligação covalente a um polímero biologicamente inativo ou derivado polimérico, a um polímero hidrofílico sintético farmaceuticamente puro através de tipos específicos de ligações químicas. Como polímeros de ocorrência natural e seus derivados, polissacarídeos tais como o ácido hilurônico, proteoglicanos tais como os sulfatos de condroitina A, B e C, quitina, heparina, sulfato de heparina, dextranos tais como o ciclodextrano, hidroxietil celulose, o éter de celulose e amido, lipídeos tais como triglicerídeos e fosfolipídeos são descritos.
A WO 96/11953 descreve compostos de proteínas quimicamente modificadas de forma N-terminal e métodos para sua produção.
Especificamente, são descritas composições de G-CSF que resultam do acoplamento de um polímero solúvel em água ao término-N do G-CSF.
Exemplos de polímeros solúveis em água listados na WO 96/11953 citam-se os copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-l,3-dioxolano, poli1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (ou homopolímeros ou copolímeros aleatórios), poli(n-vinil pirrolidonapolietileno glicol, homopolímeros de PPG, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno ou polióis polioxietilados.
A WO 97/30148 descreve conjugados de polipeptídeos com alergenicidade reduzida, compreendendo uma molécula polimérica portadora tendo duas ou mais moléculas de polipeptídeo a eles acoplados. Estes conjugados são produzidos pela ativação de uma molécula polimérica portadora, reagindo duas ou mais moléculas de polipeptídeo com a molécula portadora polimérica ativada, e bloqueio de grupos ativos residuais sobre o conjugado. A WO 97/30148 relaciona uma variedade de moléculas portadoras poliméricas, incluindo homopolímeros naturais ou sintéticos tais como polióis, poliaminas, ácidos policarboxílicos e heteropolímeros compreendendo pelo menos dois grupos diferentes de ligação. Exemplos são dados, que compreendem PEGs estrela, PEGs ramificados, álcoois polivinílicos, policarboxilatos, polivinilpirrolidonas e poli-D,L-aminoácidos. Os conjugados da WO 97/30148 também incluem aqueles que compreendam dextranos tais como o carboximetil dextrano, celuloses tais como a hidroxietil celulose ou a hidroxipropil celulose, hidrolisados de quitosano, amidos tais como os amidos hidroxietílicos ou os amidos hidroxipropílicos, glicogênio, agarose, goma guar, inulina, pululano, goma xantana, carragenano, pectina, ácido algínico etc.
A WO 03/074087 diz respeito a um método de acoplar proteínas a um polissacarídeo modificado derivado de amido. A ação de ligação entre a proteína e o amido hidroxialquílico de polissacarídeo, é uma articulação covalente que é formada entre o grupo de aldeído terminal ou um grupo funcional resultante da modificação química do referido grupo de aldeído terminal da molécula de amido hidroxialquílico, e um grupo funcional da proteína. Como grupo reativo da proteína, grupos amino, grupos tio e grupos carbóxi são apresentados.
A WO 2005/014050 descreve as preparações dos conjugados de amido de hidroxialquila (HAS) e uma proteína de G-CSF, em que pelo menos um grupo funcional do polímero ou do seu derivado é reagido com pelo menos um grupo funcional da proteína, por esse meio formando uma articulação covalente. Outros documentos da técnica anterior que se relacionam à HASilação, preferivelmente à HESilação, dos polipeptídeos são as WO 2005/014655, WO 2005/092390, WO 2007/031266, WO 2005/092928 e WO 2005/092391.
Não obstante várias abordagens tenham sido descritas na técnica anterior para modificar polipeptídeos terapêuticos tais como o G-CSF mediante os componentes poliméricos de modo a prolongar seu tempo de depuração e a reduzir a imunogenicidade, pouco trabalho parece ter sido feito no desenvolvimento de formulações vantajosas para tais conjugados de GCSF-polímero.
O produto Neulasta® acima mencionado é uma composição líquida que tem por finalidade a injeção subcutânea. A preparação compreende pegfilgrastim, acetato de sódio, sorbitol, polissorbato 20 e água para injeção, e tem um pH de 4,0 (ver http://www.neulasta.com, e ROTE LISTE 2007). Os produtos Neulasta® e Neupogen®, ambos comercializados pela Amgen, são quase idênticos em relação ao agente tampão, excipientes e valor de pH da solução: o Neupogen® contém filgrastim (ao invés de pegfilgrastim), acetato de sódio, sorbitol, polissorbato 80 e água para injeção, e tem também um pH de 4,0 (ver http://www.neupogen.com, e ROTE LISTE 2007).
A presente invenção é direcionada a composições farmacêuticas líquidas compreendendo um conjugado de polímero-G-CSF, em que as composições tenham sido especificamente desenvolvidas para considerar as características dos conjugados de polímero-G-CSF. Embora várias abordagens tenham sido relatadas na técnica anterior com respeito a formulações contendo o G-CSF não conjugado, pouco é conhecido acerca de preparações úteis dos conjugados de polímero-G-CSF.
Embora algumas composições farmacêuticas desenvolvidas para o G-CSF não conjugado tenham sido apresentadas na literatura de patentes de uma maneira tal que incluam preparações nas quais o G-CSF não conjugado seja substituído por um conjugado de PEG-G-CSF, é óbvio que as 10 composições sejam ajustadas e testadas apenas quanto ao G-CSF não conjugado.
Por exemplo, a WO 2005/042024 descreve composições farmacêuticas estáveis compreendendo G-CSF em que a composição tenha um valor de pH de mais do que 4,0 e ainda compreenda um ácido, porém seja 15 livre de tensoativos. Não obstante a composição farmacêutica descrita na WO 2005/042024 tenha sido claramente desenvolvida para G-CSF não conjugado, é mencionado no relatório descritivo que ela também inclui G-CSF quimicamente modificado com PEG ou coisa parecida, apresentando a mesma, ou melhorada, atividade biológica.
Outro exemplo é a WO 2005/039620, que é também dirigida a uma composição contendo G-CSF aquoso estável. A composição contém ácido succínico ou ácido tartárico ou seus sais como agentes de tamponamento e tem um pH preferido nas faixas de 4,0 e 5,8. De acordo com o relatório descritivo, a proteína de G-CSF pode também ser sinteticamente 25 modificada, por exemplo por glicosilação enzimática ou PEGuilação química.
A EP 1 260 230 Al apresenta formulações de proteínas estáveis contendo triptofano como um estabilizador. A lista de proteínas cobre
G-CSF, e G-CSF quimicamente modificado com PEG ou coisa parecida, também. As formulações de G-CSF são mencionadas de modo a terem preferivelmente um pH de 5 a 7, mais preferível de 6,0 a 6,7.
Outro exemplo é a EP 1 336 410 Al, que descreve formulações farmacêuticas injetáveis contendo uma proteína fisiologicamente ativa como um ingrediente ativo, e pelo menos um açúcar como um agente 5 suavizante e tendo um pH de 6,5 a 7,4. Novamente neste caso, é mencionado que o G-CSF quimicamente modificado com PEG ou coisa parecida é também incluído.
A EP 1 329 224 Al descreve uma formulação em solução de G-CSF que contém pelo menos um aminoácido ou um sal deste, de 10 preferência metionina, como um estabilizador. As formulações de solução de
G-CSF preferivelmente têm um pH de 5 a 7, mais preferível de 5,5 a 6,8. Novamente, o G-CSF quimicamente modificado com PEG ou coisa parecida é referido como estando também incluído.
Entretanto, nenhuma das formulações apresentadas na técnica 15 anterior é uma formulação específica de conjugado de polímero-G-CSF. Ao invés disso, as soluções descritas na literatura de patentes foram apenas desenvolvidas e testadas quanto ao G-CSF não conjugado.
O problema subjacente à presente invenção é prover uma composição de conjugado de G-CSF-polímero que seja adaptada a tais 20 conjugados e que seja estável em temperaturas elevadas, isto é, acima da temperatura de refrigerador que se situa usualmente entre 2 e 8 °C. Além disso, é um objeto da invenção prover uma composição farmacêutica que não necessite de reconstituição em qualquer estágio de sua preparação e que tão pouca irritação quanto possível quando administrada a um paciente.
Estes problemas são solucionados de acordo com a presente invenção mediante o fornecimento de uma composição farmacêutica aquosa que compreenda um conjugado de polímero-G-CSF, a composição tendo um pH na faixa de 4,5 a 5,5. A preparação aquosa de acordo com a invenção compreende um tensoativo e, opcionalmente, um ou mais outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma forma de realização preferida, a composição é livre de aminoácidos ou derivados ou sais destes como estabilizadores, e livre de ácido tartárico ou seus sais, e de ácido succínico ou seus sais, como agentes de tamponamento.
Foi surpreendentemente observado que a formulação de um conjugado de polímero-G-CSF em uma composição tendo um valor de pH na faixa de 4,5 a 5,5, preferivelmente de 5,0, impede a hidrólise ácida da ligação do conjugado. Esta faixa de pH melhora a estabilidade da solução em temperaturas acima da temperatura de refrigerador (2 a 8 °C), em especial na temperatura ambiente (isto é, abaixo de 25 °C) e, ainda, em temperaturas mais elevadas, por exemplo em 40 °C. Isto significa que a composição pode ser armazenada sem esfriamento por um período de tempo prolongado, sem perda significativa da atividade e sem degradação significativa.
Além disso, independente da estabilidade em armazenagem, as composições de acordo com a invenção são vantajosas em relação a uma composição que tenha um pH de 4,0, tendo em vista que uma composição que seja menos ácida causa menos irritação quando administrada a um paciente.
A menos que de outra forma indicado, as seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e o escopo dos vários termos e expressões aqui usados para descrever a presente invenção.
A expressão “conjugado de polímero-G-CSF” refere-se a um conjugado entre um polipeptídeo de G-CSF e um polímero em que o conjugado seja formado por uma articulação covalente entre um grupo funcional do polímero e um grupo funcional do polipeptídeo. Os conjugados podem compreender um ou mais componentes poliméricos.
O termo “G-CSF” (ou polipeptídeo de G-CSF ou proteína de G-CSF ou peptídeo de G-CSF) refere-se a uma proteína que tenha a atividade biológica in vivo de G-CSF humano de ocorrência natural, isto é, uma proteína que seja capaz de estimular a diferenciação e a proliferação das células precursoras hematopoiéticas. O G-CSF pode ser inequivocamente identificado como G-CSF de acordo com o ensaio descrito em Stute, N. et al. “Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colonystimulatingfactor in children” (1992) Blood 79 (11), páginas 2849-2854.
Em uma forma de realização exemplar, o G-CSF tem uma sequência de aminoácidos de acordo com as seguintes SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em que a SEQ ID NO: 1 apresenta a sequência de aminoácidos do tipo selvagem do G-CSF de metionila humano como produzido em E. coli, e a SEQ ID NO: 2 apresenta a sequência de aminoácidos do G-CSF humano como produzido em células de mamíferos, por exemplo em células de CHO. A SEQ ID NO: 1 é a variante de 175 aminoácidos, em que o primeiro aminoácido é metionina e existe um resíduo de treonina na Thr 134. A SEQ ID NO: 2 é uma variante de 174 aminoácidos que tem a mesma sequência da variante de 175 aminoácidos, exceto que a metionina condutora está faltando, de modo que a sequência começa com T e existe um resíduo de treonina na posição 133.
SEQIDNO: 1 MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELV LLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPE LGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQ RRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (175 aminoácidos)
SEQIDNO: 2 TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVL LGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPEL GPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQR RAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP (174 aminoácidos)
O técnico habilitado facilmente observará que a presente invenção não fica limitada às sequências aqui descritas, mas também inclui variantes do G-CSF. Tais variantes são bem conhecidas na técnica. Elas podem conter deleções, substituições ou adições de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos acima descritas, ao mesmo tempo em que mantenham a atividade biológica do G-CSF de ocorrência natural. Como exemplos, porém sem que de forma alguma se entenda estar limitando a presente invenção, as variantes de G-CSF são descritas nas WO 01/87925, EP 0 456 200 A, U.S. 6.166.183, U.S. 6.004.548, U.S. 5.580.755, U.S. 5.582.823, U.S. 5.675.941, U.S. 5.416.195, U.S. 5.399.345, WO 2005/055946 e WO 2006/074467.
O polipeptídeo de G-CSF pode ser glicosilado ou não glicosilado. Em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo de G-CSF é o G-CSF humano recombinante produzido em E. coli, isto é, tendo a sequência de aminoácidos descrita acima na SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante.
O polímero pode ser qualquer polímero que possa ser covalentemente ligado ao polipeptídeo de G-CSF e que resulte em um conjugado de polímero-G-CSF terapeuticamente útil, quando ligado covalentemente a um polipeptídeo de G-CSF. Vários polímeros adequados já foram mencionados acima na parte introdutória, e estes incluem os poli(alquileno glicóis), tais como o PEG e o PPG, amidos hidroxialquílicos, tais como o amido hidroxietílico (HES) e os polímeros descritos nas WO 02/09766, WO 96/11953 e WO 97/30148 com relação aos conjugados de polipeptídeo polimérico. Em uma forma de realização preferida, o polímero é PEG.
Todas as especificações de concentrações em mg/ml usadas no seguinte, com relação ao conjugado, são relacionadas ao componente de GCSF apenas. O componente de PEG, por definição, não é considerado para a concentração de massa.
Enquanto o filgrastim tem um peso molecular de cerca de 18 a kD, o do pegfilgrastim é muito mais elevado por causa do componente
PEG-monometóxi, e tem um peso molecular de cerca de 39 kD. Os conjugados de polímero-G-CSF da presente invenção podem ter um peso molecular na faixa de 20 a 60 kD, preferivelmente na faixa de 35 a 45.
PEGs adequados são apresentados na técnica anterior, por exemplo nas WO 2005/055946, WO 2006/074467 e WO 01/87329. O componente PEG pode ser linear ou ramificado e tendo tamanhos de 5 a 40 kD. Preferivelmente, o componente PEG tem um peso molecular de 15 a 25 kD, o mais preferível de cerca de 20 kD.
Métodos para produzir conjugados de polímero-G-CSF também foram descritos na técnica anterior. Os documentos mencionados acima em relação à preparação dos conjugados entre polipeptídeos e componentes poliméricos são aqui incluídos como referências.
Outros conjugados de polímero-G-CSF que são úteis na presente invenção são descritos em detalhes nas WO 96/11953, EP 822 199 A, WO 01/51510, WO 2006/0128460, EP 921 131 A e EP 744 409. Ficam deste modo explicitamente relatadas as descrições destes documentos, isto é, os conjugados e os métodos de produzi-los, como descritos neste relatório descritivo.
O técnico habilitado observará facilmente que a presente invenção não fica limitada aos conjugados em que um polímero, tal como o PEG ou o HES seja diretamente ligado a um resíduo de aminoácido da proteína, mas também inclui conjugados em que um componente polimérico e o polipeptídeo de G-CSF sejam ligados um ao outro através de um ligador. Por exemplo, os grupos de ligação glicosílicos interpostos entre o polipeptídeo e os componentes de PEG são ligadores úteis dentro dos conjugados da presente invenção. A WO 2006/074467 descreve tais conjugados de polímero-G-CSF em que o polipeptídeo de G-CSF e os componentes poliméricos são ligados através de um ligador glicosílico ou através de um ligador não glicosílico, por exemplo alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída. A descrição da WO
2006/074467 é explicitamente deste modo incluída como uma referência.
O termo “PEG-G-CSF” (G-CSF PEGuilado) refere-se a uma proteína de G-CSF que seja covalentemente ligada a um ou mais 5 componentes de polietileno glicol conforme descrito abaixo. O(s) grupo(s) de PEG e a proteína G-CSF podem ser ou ligados entre si diretamente, ou através de um ligador, por exemplo um ligador glicosílico.
Em uma forma de realização da presente invenção, o conjugado peptídico de polímero-G-CSF é preparado de acordo com o 10 método descrito na WO 2006/074467. Em uma forma de realização preferida, o peptídeo de polímero-G-CSF é um conjugado de PEG-G-CSF tendo um grupo de ligação glicosílica interposto entre o componente de modificação de PEG e o polipeptídeo de G-CSF. Um tal conjugado é referido como G-CSF “glicoPEGuilado”.
Em uma forma de realização exemplar, as moléculas de GCSF “glicopeguiladas” da invenção são produzidas pela formação mediada pela enzima de um conjugado entre um peptídeo de G-CSF glicosilado ou não glicosilado e um componente sacarílico enzimaticamente transferível que inclua um componente de poli(etileno glicol) dentro de sua estrutura. O 20 componente de PEG é ligado ao componente sacarílico diretamente (isto é, através de um grupo único formado pela reação de dois grupos reativos) ou através de um componente ligador, por exemplo alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, etc. O grupo de ligação glicosílica pode constituir-se de porções de ácido siálico que sejam 25 derivadas com o PEG.
Em uma forma de realização preferida da invenção, o ligador glicosílico é ligado à proteína de G-CSF através de O-glicosilação, de preferência através de O-glicosilação em um resíduo de treonina da proteína de G-CSF.
O ligador glicosílico preferivelmente compreende um mono-, di- ou oligossacarídeo, mais preferivelmente o ligador glicosílico compreende ácido siálico e N-acetilgalactosamina.
Em uma forma de realização da presente invenção, o conjugado peptídico de polímero-G-CSF compreende um componente:
Figure BRPI0815975B1_D0001
em que Ri é um componente contendo um resíduo de poli(etileno glicol) de cadeia reta, ou ramificado; e L é um ligador que é um membro selecionado de uma ligação, alquila substituída ou não substituída e heteroalquila substituída ou não substituída; e em que o peptídeo é glicosilado com um resíduo de glicosila e em que o componente é covalentemente ligado ao resíduo de glicosila. O resíduo de glicosila é preferivelmente Nacetilgalactosamina. Em uma forma de realização preferida, o peptídeo de GCSF é glicosilado em um resíduo de treonina, preferivelmente no resíduo de treonina na posição 134 (calculado quanto ao polipeptídeo de metionila-GCSF, isto é, tendo uma metionina N-terminal e 175 aminoácidos no total). Em uma forma de realização preferida, Ri é um resíduo de poli(etileno glicol) de cadeia reta, e L é uma heteroalquila.
O conjugado peptídico de G-CSF acima descrito pode ser produzido de acordo com um método compreendendo (a) colocar em contato um peptídeo de G-CSF de substrato com um doador de ácido siálico de PEG tendo a fórmula:
Figure BRPI0815975B1_D0002
em que Ri e L são como definidos acima, e uma enzima que seja capaz de transferir o componente de ácido siálico de PEG do doador para o resíduo glicosílico do peptídeo de G-CSF de substrato. Em uma forma de 5 realização preferida, a enzima é uma sialiltransferase, por exemplo STóGalNAcI, como descrito na WO 2005/055946.
O conjugado peptídico de G-CSF descrito acima pode ser produzido de acordo com um método que compreenda: (a) o contato de um peptídeo de G-CSF de substrato não glicosilado com um doador glicosílico e 10 uma enzima que seja capaz de transferir o componente glicosílico do doador para o peptídeo de G-CSF de substrato, e (b) o contato do peptídeo de G-CSF glicosilado com um PEG-doador de ácido siálico tendo a fórmula:
Figure BRPI0815975B1_D0003
em que R] e L são como definidos acima, e uma enzima que seja capaz de transferir o componente de ácido siálico de PEG do doador para o resíduo glicosílico do peptídeo de G-CSF de substrato, em que (a) e (b) são reações ou sequenciais ou simultâneas. Em uma forma de realização preferida, o doador glicosílico é UDP-N-acetilgalactosamina. Em uma forma de realização preferida, a enzima em (a) é uma Nacetilgalactosaminiltransferase e a enzima em (b) é uma sialiltransferase, por exemplo GalNAcT2 em (a) e STóGalNAcI em (b).
O G-CSF pode ser produzido por procedimentos sintéticos químicos ou pode ser de qualquer fonte humana ou de outros mamíferos, e pode ser obtido pela purificação de fontes de ocorrência natural como a placenta humana, o sangue humano ou a urina humana. Além disso, um grande número de carcinomas epiteliais, células de leucemia mielóide e várias linhagens de células tumorais, é capaz de expressar este fator.
Preferivelmente, o G-CSF é recombinantemente produzido. Isto inclui a expressão de hospedeiros procarióticos ou eucarióticos de sequências de DNA exógenas obtidas por clonagem genômicas ou de cDNA ou por síntese de DNA. Hospedeiros procarióticos adequados incluem várias bactérias, tais como E. coli, a qual é o hospedeiro preferido. Hospedeiros eucarióticos adequados incluem a levedura, tal como S. cerevisiae, e células de mamíferos tais como as células de ovário de hamster chinês (CHO) e as células de macacos.
A produção recombinante de uma proteína tal como G-CSF é conhecida na técnica. Em geral, isto inclui a transfecção de células hospedeiras com um vetor de expressão apropriado, o cultivo das células hospedeiras sob condições que possibilitem a produção da proteína e a purificação da proteína das células hospedeiras. Para informações detalhadas, ver, por exemplo, Souza, L. M. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science (1986) 232: 61-65; Nagata, S. et al. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony- stimulating factor, Nature (1986) 319: 415-418; Komatsu, Y. et al. 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn. J. Câncer Res. (1987) 78: 1179-1181.
Em uma forma de realização preferida, o G-CSF tem uma sequência de aminoácidos de G-CSF maduro humano (ver, por exemplo, Nagata, S. et al. (1986), vide acima), e pode ainda conter uma metionina em seu término amino, o que então resulta em uma proteína de 175 aminoácidos (ver a SEQ ID NO: 1 acima). Além disso, ao invés da metionina, o G-CSF pode conter um resíduo de serina ou de treonina.
A proteína é então purificada de acordo com um protocolo de processamento convencional de jusante. Métodos de purificação adequados para G-CSF são descritos na técnica anterior, por exemplo nas WO 87/01132, EP 0 719 860 A, EP 1 458 757 A, EP 1 527 188 A, WO 03/051922, WO 01/04154 e WO 2006/097944.
Em uma forma de realização da presente invenção, o conjugado peptídico de polímero-G-CSF é preparado como descrito no Exemplo 1 aqui fornecido. Este conjugado é caracterizado no fato de que o polipeptídeo de G-CSF e o componente de PEG são ligados através de um grupo de N-acetilgalactosaminil (GalNAc) e um grupo de ácido siálico (SA). O conjugado tem a estrutura: G-CSF-GalNAc-SA-PEG, como segue:
Figure BRPI0815975B1_D0004
em que Rj e L são como definidos acima, e AA é um resíduo de aminoácido de G-CSF.
Em uma forma de realização exemplar, RI é um componente de PEG linear ligado através de um grupo de ácido siálico e um grupo de
GalNAc a um polipeptídeo de G-CSF como mostrado abaixo:
Figure BRPI0815975B1_D0005
Figure BRPI0815975B1_D0006
em que L é como definido acima; AA é um resíduo de aminoácido de G-CSF; e f é um número inteiro selecionado dentre 1 a 2500.
Em certas formas de realização, o conjugado de polímero-GCSF tem a seguinte fórmula:
h3c
Figure BRPI0815975B1_D0007
GaINAc—AA I em que AA é treonina 133 (treonina 134 se uma metionina Nterminal estiver presente) de G-CSF; e f é um número inteiro selecionado dentre 1 a 2500.
A preparação farmacêutica da presente invenção é uma composição líquida, por exemplo uma solução aquosa. Para fins de injeção, o uso de água pura como solvente é preferido. Outros solventes que são adequados e convencionais para as preparações farmacêuticas, podem, no entanto, também ser empregados. Em uma forma de realização preferida da invenção, as composições farmacêuticas são soluções isotônicas.
Além disso, não existe nenhuma necessidade de reconstituição em qualquer estágio da preparação da formulação de solução líquida da invenção. A solução é uma formulação pronta-para-uso.
A composição farmacêutica da invenção tem um pH na faixa de 4,5 a 5,5. Em uma forma de realização preferida, o valor do pH situa-se entre 4,7 a 5,3, mais preferível entre 4,8 a 5,2, e o mais preferível entre 4,9 e
5,1Se um ajuste for necessário a fim de se obter a faixa de pH desejada, o valor do pH é ajustado por meio de soluções adequadas; com soluções ácidas, no caso em que uma redução do valor do pH seja indicada, e com soluções alcalinas, no caso em que um aumento do valor do pH seja indicado. Soluções ácidas adequadas são, por exemplo, o ácido clorídrico, o ácido fosfórico, o ácido cítrico e o fosfato hidrogenado de sódio ou de potássio. Soluções alcalinas adequadas são os hidróxidos alcalinos e alcalinoterrosos, os carbonatos alcalinos, os acetatos alcalinos, os citratos alcalinos e os fosfatos hidrogenados dialcalinos, por exemplo o hidróxido de sódio, o acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato de sódio, fosfato hidrogenado dissódico ou dipotássico ou amônia.
Preferivelmente, o pH da solução é ajustado com o uso de hidróxido de sódio. Como consequência, a formulação da invenção pode conter íons de sódio. O sódio se acha usualmente presente em uma concentração de menos do que 10 mmol/litro, tipicamente de menos do que 6 mmol/litro.
A preparação farmacêutica da invenção compreende um ou mais tensoativos. Exemplos típicos de tensoativos incluem: tensoativos não iônicos, por exemplo os ésteres de ácidos graxos de sorbitano, tais como o monocaprilato de sorbitano, o monolaurato de sorbitano, o monopalmitato de sorbitano; os ésteres de ácidos graxos de glicerina, tais como o monocaprilato de glicerina, o monomiristato de glicerina, o monoestearato de glicerina; os ésteres de ácido graxo de poliglicerina tais como o monoestearato de decaglicerila, o diestearato de decaglicerila, o monolinoleato de decaglicerila; os ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano tais como o monolaurato de polioxietileno sorbitano, o monooleato de polioxietileno sorbitano, o monoestearato de polioxietileno sorbitano, o monopalmitato de polioxietileno sorbitano, o trioleato de polioxietileno sorbitano, o triestearato de polioxietileno sorbitano; os ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitol, tal como o tetraestearato de polioxietileno sorbitol, o tetraoleato de polioxietileno sorbitol; os ésteres de ácido graxo de polioxietileno glicerina, tais como o monoestearato de polioxietileno glicerila; os ésteres de ácido graxo de polietileno glicol, tais como o diestearato de polietileno glicol; os éteres de polioxietileno alquila tais como o lauril éter de polioxietileno; os éteres de polioxietileno polioxipropileno alquila tais como o éter de polioxietileno polioxipropileno glicol, o éter de polioxietileno polioxipropileno propila, o éter de polioxietileno polioxipropileno cetila; os éteres de polioxietileno alquil fenila tais como o éter de polioxietileno nonil fenila; os óleos de mamona endurecidos de polioxietileno, tais como o óleo de mamona de polioxietileno, o óleo de mamona endurecido de polioxietileno (óleo de mamona hidrogenado de polioxietileno); derivados de cera de abelha de polioxietileno tais como a cera de abelha dipolioxietileno sorbitol; derivados de polioxietileno lanolina tais como o polioxietileno lanolina; amidas de ácido graxo de polioxietileno tais como a amida de ácido esteárico de polioxietileno tendo um HLB de 6 a 18; tensoativos aniônicos, por exemplo os sulfatos de alquila tendo um grupo alquila Cio-is, tal como o cetilsulfato de sódio, o laurilsulfato de sódio, o oleilsulfato de sódio, os sulfatos de éter de polioxietileno alquila tendo um número de mol de EO médio de 2 a 4 e um grupo de alquila Ci0-i8 tal como o lauril sulfato de polioxietileno de sódio; sais de éster de ácido sulfossuccínico de alquila tendo um grupo alquila C8.i8 tal como o laurilsulfossuccinato de sódio; e tensoativos naturais, por exemplo a lecitina; glicerofosfolipídeos; esfingofosfolipídeos tais como a esfingomielina; ésteres de ácido graxo de sacarose de ácidos graxos C12-18· Um ou mais destes tensoativos podem ser adicionados em combinação às formulações da presente invenção.
Tensoativos preferidos são os ésteres alquílicos de polioxietileno sorbitano, mais preferíveis os Polissorbatos 20, 21, 40, 60, 65,
80, 81, 85, os mais preferíveis sendo os Polissorbatos 20 e 80.
A concentração do detergente na formulação situa-se tipicamente na faixa de 0,0005 % (p/v) a 0,05 % (p/v), preferivelmente de 0,001 % (p/v) a 0,01 % (p/v), mais preferível de 0,002 % (p/v) a 0,006 % (p/v) e, o mais preferível, de 0,003 % (p/v) a 0,004 (p/v), com base no volume total da formulação da solução.
Usualmente, as formulações da invenção contêm o tensoativo Polissorbato 20 ou 80 em uma concentração de 0,003 % (p/v), 0,0033 % (p/v) ou 0,004 % (p/v). O Polissorbato 20 é preferido.
A formulação de acordo com a invenção compreende um agente de tamponamento fisiologicamente aceitável. Tampões adequados são conhecidos na técnica de formulações de soluções, por exemplo tampões de fosfato (preferivelmente o sistema de fosfato monoidrogenado de sódio fosfato diidrogenado de sódio), tampões de citrato, tampões de lactato, tampões de acetato, tampões de carbonato, BisTris, MES e Glicina-HCl. O uso de um tampão de acetato, isto á: ácido acídico ou um sal deste, por exemplo sais de álcalis ou de amônio, é preferido.
O agente de tamponamento se acha comumente presente na formulação em uma concentração de 1 a 100 mmol/litro, preferivelmente 2 a 50 mmol/litro, e o mais preferível 5 a 20 mmol/litro. Em uma forma de realização preferida, o tampão se acha presente em 10 mmol/litro, mais preferivelmente ele é acetato presente em 10 mmol/litro.
A concentração do tampão, por exemplo acetato, é escolhida de uma maneira tal que a ação estabilizadora do pH, bem como a capacidade de tamponamento suficiente, sejam fornecidas. Entretanto, simultaneamente a concentração iônica e, daí, a condutividade da solução, são mantidas tão baixa quanto possível,de modo a evitar a formação de agregados.
Em uma forma de realização da invenção, a condutividade da formulação de solução final é de menos do que 1,0 mS/cm, preferivelmente de menos do que 0,8 mS/cm, e mais preferível de menos do que 0,5 mS/cm.
Além disso, é preferível que a preparação seja livre de ácido tartárico e de ácido succínico, e de sais destes. É igualmente preferível que a solução seja livre de HEPES, TES e tricina.
E também preferível que a formulação da invenção seja livre de íons de sulfato.
Além disso, em uma forma de realização preferida, a formulação é livre de conservantes, em que os conservantes são substâncias convencionalmente usadas como conservantes para aumentar a estabilidade de armazenagem e que, nas concentrações padrão, têm um efeito bactericida. Em particular, a formulação não contém conservantes como cloroetano, álcool benzílico, p-cloro-m-cresol, e éster dialquílico de ácido pirocarbônico, e cloreto de benzalcônio.
Em uma forma de realização da invenção, a formulação ainda compreende um poliol, preferivelmente um álcool de açúcar, o mais preferível manitol ou sorbitol como um agente modificador da tonicidade. O sorbitol é especialmente preferido. A quantidade de açúcar, tal como o sorbitol ou o manitol, é usualmente de até 10,0 % (p/v), com base no volume total da solução. Preferivelmente, a concentração é até 8,0 % (p/v), mais preferível até 6,0 % (p/v) e, o mais preferível, 5,0 % (p/v). Em uma forma de realização preferida, o sorbitol se acha presente em uma quantidade de 5,0 % (p/v).
Além disso, é preferível que a formulação de solução da invenção não contenha um agente estabilizador selecionado de aminoácidos, seus derivados e sais, agentes estabilizadores poliméricos e agentes estabilizadores proteináceos.
O conjugado de polímero-G-CSF contendo as formulações da presente invenção é normalmente administrado através das vias parenterais, tal como por injeção (injeção subcutânea, intravenosa ou intramuscular), ou por administração percutânea, mucosa, nasal ou pulmonar, mas pode também ser administrado oralmente.
O conjugado de polímero-G-CSF se acha usualmente presente na formulação em uma concentração de 1,0 a 30,0 mg/ml, preferivelmente de 5,0 a 20,0 mg/ml, e o mais preferível de 8,0 a 12,0 mg/ml. Em uma forma de realização preferida, o conjugado de polímero-G-CSF é PEG-SA-GalNAc-GCSF presente em uma quantidade de 10,0 mg/ml.
Em uma forma de realização preferida, a formulação compreende o conjugado de polímero-G-CSF como ingrediente ativo, um tensoativo, um agente de tamponamento, um agente modificador da tonicidade, íons de sódio e água, e nenhum outro constituinte. O mais preferível é que a preparação aquosa de acordo com a invenção contenha um G-CSF glicoPEGilado como agente ativo, Polissorbato 20 e/ou Polissorbato 80 como tensoativo, sorbitol e/ou manitol como modificador da tonicidade, acetato como tampão e sódio, e nenhum outro excipiente.
Em outro aspecto da invenção, a preparação aquosa da invenção, como descrito acima, é diluída para se obter uma preparação de diluição aquosa que seja adequada para uso pediátrico. Diluições apropriadas para o tratamento de crianças são obtidas pela diluição da solução acima descrita da invenção a 1:2 até 1:8.
A invenção também diz respeito a um recipiente farmacêutico que contenha a preparação aquosa da invenção ou uma solução de diluição dela obtida mediante diluição. Recipientes farmacêuticos adequados são conhecidos da técnica anterior. O recipiente pode, por exemplo, ser uma seringa, um frasco, garrafa de infusão, ampola ou carpule. Em uma forma de realização preferida, quando o recipiente é uma seringa, esta é equipada com um sistema de proteção da agulha. Tais sistemas de proteção da agulha, os quais são bem conhecidos da técnica anterior, ajudam a reduzir o risco de lesões. Em outra forma de realização, o recipiente é uma carpule dentro de uma caneta de injeção.
A presente invenção também diz respeito a um método de preparar uma preparação aquosa da invenção, em que o conjugado de polímero-G-CSF como o agente ativo é formulado em uma preparação aquosa tendo um pH na faixa de 4,5 a 5,5, e compreendendo um tensoativo e outros excipientes farmacêuticos.
Em outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de uma preparação aquosa da invenção, no tratamento ou prevenção da neutropenia. Além disso, a preparação aquosa da invenção pode ser vantajosamente usada no tratamento e na prevenção de distúrbios neurológicos ou em relação com transplantações da medula óssea. Em geral, as soluções farmacêuticas da invenção são úteis para a mobilização de células tronco.
A formulação farmacêutica líquida de acordo com a invenção foi observada apresentar uma estabilidade em armazenagem muito boa. Dentro do escopo da presente invenção, a expressão “estável em armazenagem” é entendida significar que o teor do conjugado ativo de polímero-G-CSF mantém quantidades até 80 % ou mais da concentração inicial após três meses de armazenagem da formulação em 25 °C. De preferência, após a armazenagem por três meses em 25 °C, o teor remanescente da atividade de G-CSF mantém quantidades de pelo menos 85 %, mais preferível de pelo menos 90 %, e o mais preferível pelo menos 95 % da atividade original.
A atividade do conjugado de polímero-G-CSF pode ser determinada por meio de testes convencionais da atividade, conforme eles são descritos na técnica anterior quanto ao G-CSF; ver, por exemplo, Draft Monographie “Filgrastim Concentrated Solution” PharmEur. Volume 19, N° 1, janeiro de 2007, ou Stute, N. et al. “Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children 7” (1992) Blood 79 (11), páginas 2849-2854.
A medição da atividade do G-CSF in vitro é descrita, por exemplo, por Shirafuji, N. et al. 1989, A nem bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblasts NFS-60 cells as targets and estimation of its leveis in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. (1989) 17, 116-119. Quanto à medição da atividade do G-CSF in vivo, ver, por exemplo, Tanaka, H. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Câncer Research (1991) 51, 3710-3714. Outras publicações em que os testes para a medição da atividade do G-CSF são descritos são a U.S. 6.555.660; Nohynek, G. J. et al. 1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colonystimulating factors in neutropenic and non-neutropenic CD rats, Câncer Chemother. Pharmacol. (1997) 39, 259-266.
A pureza do conjugado de polímero-G-CSF usado na formulação de acordo com a invenção deve ser de pelo menos 95 %, de preferência de pelo menos 97 %, mais preferível de pelo menos 99 %, e o mais preferível mais do que 99 %. O grau de pureza pode ser determinado por meio da análise de HPLC. Materiais e protocolos adequados para conduzir tais análises podem ser obtidos de fornecedores comerciais tais como Vydac ou TOSOH Bioscience (http://www.tosohbiosep.de).
Os componentes para formular as soluções de acordo com a invenção podem ser obtidos de fontes convencionais, por exemplo de companhia tais como a Sigma ou a Merck.
A produção da formulação da invenção pode ser realizada de acordo com métodos convencionais. Os componentes da formulação podem ser dissolvidos em um tampão aquoso. Altemativamente, o conjugado pode já ser obtido em um tampão aquoso como o resultado do processo de purificação.
Finalmente, a formulação líquida acabada é adicionada a um recipiente farmacêutico adequado, em que ela fica armazenada até a administração.
Os seguintes Exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção, sem limitar o seu escopo.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE G-CSF-GalNAc-SA-PEG
O seguinte exemplo ilustra a preparação de G-CSF-GalNAcSA-PEG em (a) um método de duas etapas sequenciais em que cada produto intermediário é purificado antes que ele seja usado na etapa seguinte, e (b) um método de uma etapa com o uso de adição simultânea de enzimas.
а. O Método de Duas Etapas
Preparação de G-CSF-GalNAc (pH 6,2) de G-CSF e UDP-GalNAc com o uso de GalNAc-T2.
G-CSF (960 pg) em 3,2 ml de tampão empacotado foi concentrado foi concentrado por ultrafiltração com o uso de um filtro UF (MWCO 5K) e depois reconstituído com 1 ml de tampão MES 25 mM (pEl б, 2, 0,005 % de NaN3). UDP-GalNAc (6 mg, 9,24 mM), GalNAc-T2 (40 pl, 0,04 U), e MnCl2 100 mM (40 pl, 4 mM) foram então acrescentados e a solução resultante foi incubada na temperatura ambiente.
Após 24 horas, MALDI indicou que a reação estava completa. A mistura de reação foi diretamente submetida a purificação de HPLC com o uso de SEC (Superdex 75 e Superdex 200) e um tampão de eluição compreendendo PBS (solução salina tamponada de fosfato, pH 4,9 e 0,005 % de Tween 80). O máximo de G-CSF-FalNac coletado foi concentrado com o uso do filtro MWCO de 5 KDa Centricon até cerca de 150 pl e o volume foi ajustado a 1 ml com o uso de PBS (solução salina tamponada de fosfato, pH 4,9, e 0,005 % de Tween 80). A concentração final de proteína de 1 mg/ml (A28o), rendimento de 100 %. A amostra foi armazenada a 4 °C.
Preparação de G-CSF-GalNAc-SA-PEG com o uso de G-CSF-GalNAc purificado, CMP-SA-PEG (20 KDa) e ST6GalNAc-TI (pH 6,2) de camundongos.
A solução de G-CSF-GalNAc-SA-PEG contendo 1 mg de proteína foi trocada no tampão por tampão MES 25 mM (pH 6,2, 0,005 % de NaN3), e CMP-SA-PEG (20 KDa) (5 mg, 0,25 pmol) foi adicionado. Após dissolução, MnCl2 (100 μΐ, solução de 100 mM) e ST6GalNAc-I (100 μΐ, enzima de camundongo) foram adicionados e a mistura de reação foi lentamente agitada em 32 °C por três dias. A mistura de reação foi concentrada por ultrafiltração (MWCO 5K) e o tampão foi trocado por NaOAc 25 mM (pH 4,9) uma vez, e depois concentrado até 1 ml do volume total. O produto foi então purificado com o uso de SP-Sepharose (A: NaOAc 25 mM+0,005 % de tween-80, pH 4,5; B: NaOAc 25 mM+0,005 % de Tween-80, pH 4,5+ NaCI 2M) no tempo de retenção de 13 a 18 minutos e SEC (Superdex 75; PBS-pH 7,2, 0,005 % de Tween 80) no tempo de retenção de 8,6 minutos (Superdex 75, 1 ml/minuto de fluxo). As frações desejadas foram coletadas, concentradas a 0,5 ml e armazenadas em 4 °C.
b. O Método de Uma Etapa
Processo de uma etapa com o uso de ST6GalNAc-I (pH 6,0) de camundongo
G-CSF (960 μg de proteína dissolvidos em 3,2 ml do tampão de formulação do produto) foi concentrado por ultrafiltração (MWCO 5K) a 0,5 ml e reconstituído com tampão MES 25 mM (pH 6,0, 0,005 % de NaN3) a um volume total de cerca de 1 ml ou uma concentração de proteína de 1 mg/ml. UDP-GalNAc (6 mg, 9,21 pmol), GalNAc-T2 (80 μΐ, 80 mU), CMPSA-PEG (20 KDa) (6 mg, 0,3 pmol) e a enzima ST6GalNAc-I de camundongo (120 μΐ) e MnCl2(50 μΐ) 100 mM, foram adicionados. A solução foi agitada em 32 °C por 48 horas e purificada com o uso de condições da cromatografia padrão em SP-Sepharose. Um total de 0,5 mg de proteína (A280) foi obtido, ou um rendimento global de cerca de 50 %. A estrutura do produto foi confirmada por análise tanto com MALDI quanto SDS-PAGE.
Processo de uma etapa com o uso de ST6GalNAc-I de galinha (pH 6,0).
14,4 mg de G-CSF foram concentrados a 3 ml de volume final, o tampão foi trocado por tampão MES 25 mM (pH 6,0, 0,05 % de NaN3, 0,004 % de Tween 80) e o volume foi ajustado a 13 ml. O UDP-GalNAc (90 mg, 150 μτηοΐ), GalNAc-T2 (0,59 U), CMP-SA-PEG-20KDa (90 mg), ST6GalNAc-I (0,44 U) de galinha e MnCl2 100 mM (600 μΐ) foram então adicionados. A mistura resultante estabeleceu-se na temperatura ambiente por 60 horas. A mistura de reação foi então concentrada com o uso de um UF (MWCO 5K) e centrifugação. O resíduo (cerca de 2 ml) foi dissolvido em tampão de NaOAc 25 mM (pH 4,5) e concentrado novamente a 5 ml de volume final. Esta amostra foi purificada com o uso de SP-Sepharose por cerca de 10 a 23 minutos, SEC (Superdex 75, 17 minutos, índice de fluxo de 0,5 ml/minuto) e um SEC adicional (Superdex 200, 23 minutos, índice de fluxo de 0,5 ml/minuto),para produzir 3,6 mg (25 % de rendimento global) de G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20 KDa (A280 e método BCA)
EXEMPLO 2
FORMULAÇÃO LÍQUIDA DE CONJUGADO DE POLÍMERO-G-CSF (PEG-SA-GaLNAc-G-CSF)
Uma formulação líquida compreendendo G-CSF glicoPEGilado (o conjugado tendo a estrutura: PEG-SA-GalNAc-G-CSF) foi preparada pela formulação dos seguintes componentes em uma solução aquosa de tampão de acetato.
Ingrediente
G-CSF glicoPEGilado 10 mg/ml
Acetato 10 mM
Sorbitol 5,0 % (p/v)
Polissorbato 20 0,0033 % (p/v)
Sódio 4,38 mM
pH 5,0
O valor do pH da composição foi ajustado pela adição de
NaOH. Todos os ingredientes são de uma qualidade em conformidade com a
Farmacopéia Européia (Ph. Eur.).
Além disso, a mesma composição foi preparada tendo ou pH
4,5 ou pH 5,5, e proporcionalmente menos ou mais sódio, respectivamente.
Uma formulação comparativa foi também preparada, a qual tem um pH de 4,0 (como aquele da preparação de Neulasta®).
EXEMPLO 3
TESTES DE ESTABILIDADE DAS FORMULAÇÕES DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
As composições, pH 4,5, 5,0 e 5,5, foram divididas em alíquotas em 500 μΐ/ffasco e armazenadas em 2 a 8 °C e em 25 °C). Após 1,
2, 3, 4,5, 6, 8, 12 e 15 meses, as amostras foram testadas quanto aos parâmetros de teste dados na tabela abaixo.
As especificações esperadas foram como segue quanto à composição com um pH de 5,0:
Parâmetro de teste Método Especificação
Aparência Inspeção visual Sem cores claras
Teor UV-VIS 10,0 mg/ml ± 5 %
Teor RP-HPLC (30 °C) 10,0 mg/ml ± 5 %
Potência Bioensaio 54 a 156%
Identidade SDS-PAGE Conforme o padrão de referência
Pureza Western Blot Conforme o padrão de referência
Pureza RP-HPLC (60 °C) Oxidação < 2,0 %
Pureza RP-HPLC (30 °C) G-CSF Não peguilado 2,0 %
Pureza SEC Dímeros e agregados < 2,0 %
Desaminação IEF Nenhuma faixa adicional detectável
pH De acordo com a Ph. Eur. 5 e a USP 28 5,0 ± 0,2
Endotoxinas Teste quanto às endotoxinas bacterianas de acordo com a Ph. Eur. 5 < 5 EU/mg
Esterilidade De acordo com a Ph. Eur. 5 Estéril
Partículas subvisíveis Contaminação particulada: partículas subvisíveis de acordo com a Ph. Eur. 5 < 6000 partículas >10 pm por frasco; < 600 partículas > 25 pm por frasco
Todas as amostras testadas em T = 0, 1 mês, 2 meses, 3 meses,
4,5 meses, 6 meses, 8 meses, 12 meses e 15 meses preencheram as especificações esperadas. Isto foi observado quanto a todas às composições testadas contendo o G-CSF glicoPEGilado e tendo um pH de 4,5, 5,0 ou 5,5.
As composições da invenção foram comparadas com duas formulações comparativas: Neulasta® (pH 4,0) e uma composição de G-CSF glicoPEGilado (PEG-SA-GalNAc-G-CSF) tendo um pH de 4,0. Os resultados mostram que, em comparação com a solução comparativa contendo G-CSF glicoPEGilado e tendo um pH de 4,0, as formulações tendo valores de pH mais elevados de 4,5, 5,0 e 5,5 apresentam melhor estabilidade em 10 armazenagem. Os dados coletados permitem a conclusão de que os valores de pH mais elevados impedem a hidrólise ácida da ligação de glicoPEG. Além disso, observou-se que as formulações da presente invenção têm uma estabilidade que é comparável com a estabilidade do conjugado de PEG-GCSF conhecido como Neulasta®.

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Preparação aquosa, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado de polímero-G-CSF como agente ativo tendo a seguinte formula:
    h3c em que AA é treonina 133, ou treonina 134 se uma metionina N terminal estiver presente, de G-CSF, e em que f é um inteiro selecionado de 1 a 2500;
    polissorbato 20 e/ou polissorbato 80 como tensoativo, sorbitol e/ou manitol como modificante de tonicidade, acetato como tampão e sódio, e nenhum outro excipiente, e em que a preparação tem um pH na faixa de 4,5 a 5,5.
  2. 2. Preparação aquosa de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tensoativo se acha presente em uma concentração de 0,0001 % (p/v) a 0,05 % (p/v).
  3. 3. Preparação aquosa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o pH se situa na faixa de 4,7 a 5,3.
  4. 4. Preparação aquosa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o pH se situa na faixa de 4,9 a 5,1.
  5. 5. Preparação aquosa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o conjugado de polímeroG-CSF se acha presente em uma concentração de 1 a 20 mg/ml, preferivelmente de 8 a 12 mg/ml.
  6. 6. Recipiente farmacêutico caracterizado pelo fato de que contém uma preparação aquosa como definida em qualquer uma das
    Petição 870180131014, de 17/09/2018, pág. 14/21 reivindicações 1 a 5.
  7. 7. Recipiente farmacêutico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o recipiente é uma seringa, um frasco, uma garrafa de infusão, ampola, carpule, uma seringa equipada com um sistema de
    5 proteção da agulha, ou uma carpule dentro de uma caneta de injeção.
  8. 8. Processo para preparar uma preparação aquosa como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o conjugado de polímero-G-CSF como o agente ativo é formulado em uma preparação aquosa tendo um pH na faixa de 4,5 a 5,5, e compreendendo
    10 um tensoativo e outros excipientes farmacêuticos.
  9. 9. Processo para preparar uma preparação aquosa de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a preparação aquosa é diluída 1:2 a 1:8.
  10. 10. Uso de uma preparação aquosa como definida em qualquer 15 uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para tratamento ou prevenção da neutropenia, tratamento ou prevenção de distúrbios neurológicos, em conexão com transplante da medula óssea, ou para a mobilização das células tronco.
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