KR102589578B1 - 안정한 하이브리드 fc 융합 g-csf 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) 치료적 유효량의 하이브리드 Fc 융합 G-CSF, (ii) 버퍼 시스템, (iii) 적어도 하나의 안정화제 및 (iv) 적어도 하나의 계면활성제, 및 (v) 선택적으로, 피하(SC) 경로를 통한 투여에 적합한 유기 용매로서 프로필렌 글리콜을 포함하는 하이브리드 Fc 융합된 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 제형의 안정한 형태를 포함한다.

Description

안정한 하이브리드 FC 융합 G-CSF 제형
본 제형은 피하(subcutaneous, SC) 경로를 통한 투여에 적합한 과립구 집락 자극 인자(Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF) 분자에 융합된 하이브리드 Fc를 포함하는 안정한 액상 제형 조성물들과 관련이 있다.
과립구 집락 자극 인자(G-CSF)는 과립구들, 특히 호중구들의 증식과 분화에 필수적인 단백질이다. 과립구들은 미생물 친입자들과 세포 파괴물을 에워싸고 삼키며, 따라서 감염 반응에 중요하다. 그러나, 그들은 혈류에서 단지 6-12시간의 수명을 가지며 그들 기능에 따라 파괴된다. 그들의 빠른 전환의 결과, 과립구 수는, 예를 들어, 화학요법제들 및 방사선을 포함하는 전통적인 암 치료들 또는 AIDS를 포함하는 면역학적 장애들로부터의 골수 손상으로 빠르고 현저하게 감소한다 (US 7208473 B2).
지난 몇 년 동안, 생체 내 활성을 높이고 및/또는 부작용들을 줄임으로써 자연적으로 존재하는 분자들 또는 약물들의 효과를 높이는 것이 많은 과학자들의 큰 관심이었다. 과립구 집락-자극 인자(G-CSF)는 약물-특성들이 시간에 따라 바뀐 예이다(N. Nicola, Colony Stimulating Factors, vol. 49, Marcel Dekker, Inc., New York, 1990).
175-잔기 단백질인 재조합, 메티오닐 인간 G-CSF (r-metHuG-CSF)가 대장균에서 처음으로 생산되었다(C.P. Hill, T.D. Osslund, D. Eisenberg, The structure of granulocytecolony-stimulating factor and its relationship to other growth factors, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 1993, 5167-5171). 단백질 구조에는 두 개의 이황화 결합들과 하나의 유리 시스테인 잔기, Cys17이 있다. Cys17은 낮은 pH에서 양성자화 되는 것으로 알려져 있으며 양성자화된 형태는 G-CSF의 안정성에 중요하다(T. Arakawa, S.J. Prestrelski, L.O. Narhi, T.C. Boone, W.C. Kenney, Cysteine 17 of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor is partially solvent-exposed (J. Protein Chem. 12, 1993, 525-531). r-metHuG-CSF의 시장 명칭은 NEUPOGEN® (Filgrastim)이며 암 치료-유도 호중구 감소증, 골수 이식 절차들, 중증 선천성 호중구 감소증, 재상불량성 빈혈, 골수형성이상증후군 및 AIDS의 치료에 사용된다(Product Monograph: Neupogen® (filgrastim) - Amgen Canada).
상대적으로 짧은 반감기(3.5-3.8시간)의 플그라스팀(filgrastim)은 NEULASTA®로 배치되며(PEG-Filgrastim), 여기서 G-CSF는 체내에서 G-CSF의 순환을 18-80시간의 반감기로 증가시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 사슬에 공유결합된다(Product Monograph: Neulasta® (PEGFilgrastim)). G-CSF의 페길레이션(PEGylation)은 안정성 조건들에 영향을 미치지 않으며, 여기서 단백질은 2-8℃에서 장기간 저장을 위해 4.0의 pH가 여전히 필요로 한다.
효과를 증가시키는 다른 방법은 면역글로불린을 융합 플랫폼으로 사용하는 것이다. 미국 특허번호 5,045,312호에서 설명된 바와 같이, 인간 성장 호르몬은 가교제로서 카보디이미드 또는 글루타알데하이드를 사용하여 소혈청 알부민 또는 마우스 면역글로불린에 접합된다. 접합체들은 변형되지 않은 성장 호르몬과 비교할 때 향상된 활성을 갖는다.
글리코실화 부위 변경과 같은 Fc-도메인에 대한 변형들은 치료 효과를 개선하는 것으로 알려져 있다(R. J. Sola and K. Griebenow, Effects of Glycosylation on the Stability of Protein Pharmaceuticals might improve therapeutic role, J Pharm Sci. 2009 Apr; 98(4): 1223-1245). 또한, 활성 물질이 항체의 단편 결정성(Fragment crystallizable, FC) 영역에 융합될 때 확장된 순환 또는 임상 활동도 달성된다. Fc 도메인의 추가는 융합된 파트너의 유체역학적 반경을 증가시키고 Fc 수용체들과의 상호작용에 의해 증가된 순환을 제공하여 신장에 의한 그것의 제거를 총체적으로 강화시키고 그것의 순환기간을 증가시킨다(D. M. Czajkowsky, J. Hu, Z. Shao, and R. J. Pleass. Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives, EMBO Mol Med. 2012 Oct; 4(10): 1015-1028).
언급했듯이, 융합 단백질들은 융합-플랫폼으로서 면역글로불린(Ig)를 사용하여 광범위하게 연구된다. 인간 Ig (hIg)는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 확장되며 이는 인간 IgG1 (hIgG1), 인간 IgG2 (hIgG2), 인간 IgG3 (hIgG3), 및 인간 IgG4 (hIgG4)와 같은 하위 유형들로 더 분류될 수 있다(Roitt et al., Immunology 1989, Gower Medical Publishing, London, U. K.; New York, N.Y.). Ig들은 이황화 결합들을 통해 연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬들, 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)로 구성된 이종이합체(heterodimeric) 단백질들이다. HC 및 LC 모두는 가변 및 불변 영역으로 구성된다. 중쇄의 불변 영역은 3개 또는 4개의 영역(CH1, CH2, CH3 및 CH4)으로 더 세분화 될 수 있다. 이소타입에 따라 중쇄 불변 영역의 Fc 부분은 힌지, CH2, CH3 및/또는 CH4 영역들을 포함할 수 있다. IgG1, IgG2 및 IgG4는 21일의 긴 혈청 반감기를 갖는 반면 다른 IgG들은 약 1주를 갖는다. CH1 영역의 N-말단의 IgG의 Fc 부분, Fc 영역의 N-말단을 통해, 또는 IgG들의 CH3 영역의 C-말단에서 융합 단백질들이 형성되면, 강화된 안정성 및 혈청 반감기가 달성될 수 있다(H. W Schroeder, L. Cavacini, Structure and Function of Immunoglobulins, J Allergy Clin. Immunol. Feb 2010; 125 (202):41-52; Capon et al., Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy, Nature 1989; 337: 525-531).
IgG 융합 단백질들은 세포 표면 수용체들의 세포 외 도메인들 또는 사이토카인들 및 성장 호르몬들에 융합되어 형성될 수 있다(Capon et al., Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy, Nature 1989. 337: 525-531; Mohler et al., Soluble tumor necrosis factor (TNF) receptors are effective therapeutic agents in lethal endotoxemia and function simultaneously as both TNF carriers and TNF antagonists, J. Immunology 1993. 151: 1548-1561).
그러나, 세포 표면 수용체들의 세포 외 도메인들과의 융합과 달리 IgG들에 대한 가용성 단백질들의 융합은 융합되지 않은 사이토카인 또는 성장 인자들에 비해 생물학적 활성을 감소시킨다. 그 이유는 키메릭(chimeric) 단백질들이 2개의 활성 단백질들이 근접한 이합체들로 존재하기 때문이다; 이것은 그들의 표적 분자들에 대한 융합된 IgG들의 입체 장애를 초래한다. 따라서, 효율적인 융합 단백질을 만들기 위해서는 이 문제를 극복해야 한다(Immunoglobulin fusion proteins, US 20120276097 A1).
Fc 융합 기술의 다른 한계는 원하지 않은 면역 반응의 발생이다. 면역글로불린의 Fc 도메인은 또한 항체 의존성 세포 매개 독성 (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)과 같은 효과기 기능들을 갖는다. 이 효과기 기능들은 일반적으로 Ig의 Fc 영역과 및 효과기 세포상의 Fc 수용체 (FcR) 사이의 상호작용을 통해 또는 보체 결합을 통해 달성된다. 따라서, 세포사(cell death), 사이토카인 방출 또는 염증과 같은 원하지 않는 반응을 줄이기 위해 Fc의 효과기 기능들의 차단이 수행되어야 한다 (Immunoglobulin fusion proteins, US 20120276097 A1).
전반적으로, 임의의 변형 없이 필그라스팀(Neupogen®)과 같은 G-CSF 기반 산물의 사용은 그 반감기가 짧기 때문에 제한되는 것으로 알려져 있다. 페그필그라스팀 (NEULASTA®)은 증가된 반감기를 비교적으로 갖지만, PEG는 몇몇의 부작용을 가질 수 있으며 페길려이션은 추가적인 생산 단계를 가져온다는 것이 알려져 있다. Fc 융합 전략들은 단백질들의 짧은 반감기를 증가시킬 수 있는 기회를 제공하지만 Fc 융합 기술의 주요한 한계들 중 하나는 설명된 바와 같이 원하지 않은 면역 반응들의 존재이다. 본 발명에서 제형화 및 안정화되도록 시험된 관심 분자인 하이브리드 Fc (hyFC) 플랫폼은 접합된 약물들의 혈장 반감기를 더 개선하고 세포독성 및 면역원성을 감소키기 위해 발명되었다(EP20080766022, US8586038B2). 이러한 목적을 위해, ADCC 및 CDC 반응을 가지지 않는 2개의 상이한 면역글로불린들이 유전적으로 결합되었다. 하이브리드 Fc는 인간 IgG 서브클래스들의 조합들 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합들로부터 유도된다. 상기 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자에 결합될 때 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 Fc-폴리펩타이드 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드가 발현될 때 폴리펩타이드의 발현 수준을 증가시키는데 효과적이다. 따라서, 하이브리드 FC(hyFc)-융합된 G-CSF는 또한 더 긴 혈장 반감기, 효율적인 발현 수준, 제거된 세포독성 및 감소된 면역원성을 갖는다(US8586048 B2). 이와 관련하여, hy-Fc 융합된 G-CSF는 고유하고 기원적인 분자이며, 상기 Fc 부분 자체는 2개의 면역글로불린의 융합이고 이 제1 융합은 활성 분자에 추가로 융합된다. 이 구조는 Fc 융합 부분과 G-CSF 부분의 안정성에 대한 주의가 필요하기 때문에, 그것은 다른 일반 Fc 융합 약물들과는 다르며 그것의 안정성을 이루기 위한 추가의 상이하고 고유한 용액들을 필요로 한다. 이와 관련하여, 본 발명에 대해, 일반 Fc 융합 단백질들의 안정성에 관한 문헌 연구들이 수행되었지만 본 발명 자체는 이 고유한 hy-Fc 융합된 G-CSF의 특정한 요구들에 따라 수행되었다.
문헌 검토가 끝나면 일반 Fc 융합된 약물들에 대한 상이한 제형 용액들이 있다. 재조합 항체 및 Fc-접합체 단백질들의 다양한 생물물리학적 및 화학적 특성들은 저장 중 그들의 무결성 및 효능을 보호하기 위해 액상의 제형들 및 pH(4.0-8.5), 버퍼들(아세테이트, 시트레이트, 포스페이트), 안정화제들(염들, 당들, 아미노산들), 및/또는 계면활성제들(폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80)의 동결건조된 형태들을 필요로 한다(S. M. Chamow,T. Ryll, B.H Lowman, and D. Farson, Eds., Therapeutic Fc-Fusion Proteins, Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, 2014).
Fc 및 Fab 도메인들의 도메인 간 및 도메인 내 상호작용들에 의해 안정화되는 온전한 단클론 항체(mAb)들과 달리; Fc-접합체들은 도메인 간 안정성이 없기 때문에 상대적으로 불안정하다 (A. L Nelson., Antibody fragments, MAbs. 2010 Jan-Feb; 2(1): 77-83). 더욱이 Fc-융합 단백질에 대해 하나 보다 많은 분해 경로가 존재하는 것이 대부분의 경우이다. 종종, 한 분해 경로에 대해 분자를 안정화시키는 하나의 제형 조건은 다른 분해 경로를 자극할 수 있다. 따라서 그것은 Fc 융합 단백질 약물에 대한 이상적인 제형 조성물을 확립하기 위한 상당한 중요성과 도전을 지닌다.
제형 개발은 분자의 물리적 및 화학적 분해 경로들을 확인하는 것을 필요로 한다. 중요한 분해 경로들이 확인되면, 완충제, 안정화제 및/또는 계면활성제를 포함하는 제형 버퍼의 이상적인 조성물을 개발하는 것이 제형 과학자의 목표이다.
화학적 및 물리적 분해에 대한 Fc-융합 단백질의 안정성은 종종 좁은 pH 범위에서 극대화되며(S. M. Chamow,T. Ryll, B.H Lowman, and D. Farson, Eds., Therapeutic Fc-Fusion Proteins, Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, 2014), 이러한 이유로, 최적 pH를 스크리닝 하는 것이 매우 중요하다. pH외에도 당들(수크로스, 트레할로스, 및/또는 폴리올들)과 같은 안정화제들은 또한 Fc-접합체 제형들의 중요한 구성요소들이다 (Gokarn et al. Excipients for Protein Dugs, Excipient Development for Pharmaceutical, Biotechnology, and Drug Delivery, 2006). 게다가, 폴리소르베이트들과 같은 계면활성제들은 또한 단백질 제형들에서 중요한 역할을 한다. 그것들은 계면에 대한 단백질 결합과 경쟁하는 표면 활성제들이므로 계면 장력 및 단백질 구조들에 대한 그것의 해를 감소시킨다 (T. A.Khan, H-C. Mahler, R. S.K. Kishore, Eur. J. Pharm. Biopharm; 2015 Nov 97: 60-67).
단백질 기반 치료제들에서 응집은 모든 단계(생산, 제형화, 저장, 운송 및 투여 중에도)에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질 응집은 최근 몇 년간 엄청난 기술 발전에도 불구하고 바이오제약 산업에 있어서 중요한 규모의 문제이다; 그것은 여전히 개발에 있어서 주요 장애물이 되고 있다. 따라서, 단백질 응집을 예측, 최소화, 제한 및/또는 역전시키는 능력은 바이오치료의 실행 가능한 제조 및 제형에 중요하다. 유감스럽게도, 응집 메커니즘은 수많은 경로들을 따르기 때문에 응집의 제어는 상당한 도전이다. 응집 메커니즘들에 대한 많은 지식이 축적되었지만 현재 단백질의 응집에 대한 성향을 강력히 예측하는 것은 여전히 불가능하다. 그러나, 현재의 응집 모델들은 안정성을 좌우하는 두 가지 요소들을 확인했다; 하나는 콜로이드성이고 다른 하나는 구조적 안정성이다.
콜로이드 안정성은 용액에서 단백질 분자들 사이의 밀어내고 끌어들이는 분자간 상호작용들의 균형에 의해 결정된다. 구조적 안정성은 단백질 분자의 접힌 및 펼쳐진 상태들 사이의 자유 에너지 차이로 정의된다. 따라서 단백질 응집 성형을 예측하는 현재의 기술들은 구조적 및 콜로이드 안정성의 평가를 기반으로 한다. 그것들은 인실리코(in silico) 서열/구조 기반 예측들 및 구조적 안정성의 지표로서의 응집 개시(Tm)의 측정 및 콜로이드 안정성의 척도로서의 삼투 제2 비리얼 계수(osmotic second virial coefficient, A2)의 측정을 포함한다.
본 발명에 이르러, 고유하고 기원적인 약물 분자 hy-Fc-융합된 G-CSF의 특정 요구들에 대해 체계적인 연구가 수행되었다. 활성 물질의 화학적 및 생물물리학적 완전성을 유지할 수 있는 안정한 액상 제형들로 지속 작용성 G-CSF 접합체의 기능이양을 제공하기 위해, 특정 pH 범위의 버퍼, 안정화제, 계면활성제 및/또는 유기 모이어티를 포함하는 제형이 발명되었다.
본 발명에서, 하이브리드 Fc 융합된 G-CSF의 안정한 제형들은 평가되고, 이러한 안정한 제형들은 크로마토그래피 및 전기영동 순도, A2 및 T개시 값을 기준으로 선택되었다. 선택된 제형들의 장기 안정성은 실시예들로 입증된다.
플랫폼이 융합된 활성 물질 중 하나와 다른 화학적 또는 생물물리학적 안정성 비율을 필요로 하는 융합된 약물로 본원에 기술된 제형의 유형을 개발하는 것은 특별한 도전이다. 본 발명에서, hy-Fc 융합 플랫폼(EP20080766022, US8586038B2)은 고유하고 기원적인 분자이고 다른 일반 Fc 플랫폼들과 다르기 때문에 그것의 안정성을 위한 다른 용액들이 필요하다는 것을 유의해야 한다. 특히, 다른 일반 Fc 플랫폼들은 종종 IgG2 또는 유사한 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하고 약물은 이 단일 면역글로불린의 Fc 영역에 직접 융합된다. 그러나, hy-Fc 플랫폼은 IgD 및 IgG 서브클래스들의 조합이며, 여기서 면역글로불린 Fc 부분 자체가 융합을 형성하고 이 면역글로불린 부분에 대한 약물의 융합은 제2 융합을 구성한다. 이러한 관점에서, 본원에 설명된 모든 발명들은 기술된 hy-Fc-G-CSF 약물에 완전히 특이적이며 이 고유한 분자의 안정성에 대한 특정 요구들에 따라 개발되었다(US8586048 B2).
본 발명에서 사용하기 위해, hy-Fc 플랫폼 및 G-CSF는 인간화 유기체들의 아미노산 서열을 갖는다. IgD와 IgG 사이 및 G-CSF와 면역글로불린 부분 사이의 융합은 단일 유전자 코드와 단일 전사-번역 반응을 통해 제공되므로 추가 융합 반응이 사용되지 않는다. G-CSF와 hy-Fc 플랫폼 사이의 펩타이드 결합은 프롤린-아르기닌을 통해 이루어진다. hy-Fc 융합된 G-CSF 단량체의 아미노산 서열은 하기와 같다. 신호, G-CSF, N-말단 및 hy-Fc 서열들은 해당 형식으로 표시된다. hy-Fc 융합된 G-CSF의 도식적인 단백질 구조는 도 1에 표시된다.
본 발명에서, 상기 분자들의 안정성은 G-CSF 접합 부위에서 낮은 pH 값(pH<5.0) 및 높은 pH 값(pH>6.5)에서의 디설파이드 셔플링에 의해 대부분 영향을 받고 가수분해 되기 쉽다는 것이 발견되었다. G-CSF는 상동의 시스테인 잔기들에 의해 형성된 두 개의 디설파이드 결합 및 분자내 디설파이드 결합들에 참여할 수 없는 17의 위치에서의 여분의 시스테인 잔기를 갖는다. 이 분자들의 디설파이드 결합들은 구조들을 안정화하고 그것들을 상대적으로 가혹한 처리(일부의 프로테아제들, 높은 온도, 변성 용매들, 극한의 pH)에 저항하도록 만들며, 이는 디설파이드 결합들의 감소 후 변성을 유발한다(Nicos A. Nicola, The waiter and Eliza Hall Institute of Medical Research, "Granulocyte Colony Stimulating Factor", p. 77-100).
또한, 사내 연구들은 hy-Fc 융합된 G-CSF는 pH 5.3 - 6.0 사이에서 용해되지 않거나 거의 용해되지 않는 것을 입증하며 그것은 G-CSF 자체는 안정하고 pH 4.0 부근에서 활성인 것으로 알려져 있다(T. Arakawa, S.J. Prestrelski, L.O. Narhi, T.C. Boone, W.C. Kenney, Cysteine 17 of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor is partially solvent-exposed, J. Protein Chem. 12 (1993) 525-531). 따라서 분해로 이어지는 중요 경로가 특정될 때, 활성 Fc-융합 분자의 장기간의 안정성을 보장하는 것이 목적이다.
도 1. hy-Fc 융합된 G-CSF의 도식적인 단백질 구조
도 2. 디설파이드 셔플링에 대한 시험. 변형 #F5 및 #F6의 시료들(2주 동안 40℃에서 저장)이 환원 및 비-환원 조건들에서 분석됐다. 라인 1: 마커, 라인 2: GX-G3 Ref 비-감소, 라인 3: #F5 비-감소, 라인 4: #F6 비-감소, 라인 5: 비어 있음, 라인 6: 마커, 라인 7: #F5 감소, 라인 8: #F6 감소, 라인 9: 참조 감소, 라인 10: 마커.
도 3. 2주 동안 40℃에서 SDS-PAGE 열 스트레스: 라인 1: 참조, 라인 2: 마커, 라인 3-6: #F3, 라인 7-10: #F4.
도 4. 2-8℃, t=6 개월에서 SDS-PAGE 분석: 라인 1, 9: 마커, 라인 2, 5, 6: 참조, 라인 3: #F2C, 라인 4: #F2C+10%PG, 라인 7: #F2D, 라인 8: #F2D+10%PG, 라인 10: 비어 있음.
도 5. 2-8℃, t=6 개월에서 Gel-IEF 분석: 라인1, 9: 마커, 라인2, 5, 6: 참조, 라인3: #F2C, 라인4: #F2C+10%PG, 라인7: #F2D, 라인8: #F2D+10%PG, 라인10: 비어 있음.
따라서 본 발명의 초점은 하이브리드-Fc (hy-Fc), 단클론 항체-유사 플랫폼에 펩타이드 연결을 통해 융합된 지속 작용성 G-CSF 분자들을 포함하는 액상 제형 조성물들을 제공하는 것이다. 재조합 인간 G-CSF-hyFc를 위한 발명된 제형은, 특별히, G-CSF 활성 및 hy-Fc 플랫폼의 기능을 방해하지 않고 G-CSF와 hy-Fc 플랫폼 사이 및 hy-Fc 플랫폼 자체 사이의 연결에 높은 안정성을 제공하는 적절한 pH, 안정화제, 계면활성제 및/또는 유기 용매를 가져야 한다.
"안정한" 제형 또는 약물 제품은 그 안에 있는 G-CSF 분자가 저장 시 그것의 생물물리학적 및 화학적 안정성 및 완전성을 본질적으로 유지하는 것이다. G-CSF 분자 제형들의 안정성은 선택된 기간 후에 선택된 온도에서 측정될 수 있다.
당업자는 hy-Fc 융합된 G-CSF 분자의 안정성이 그것의 제형에 크게 의존하며 따라서 저장 시 물리적 및 화학적 완전성을 보호하기 위해 약물 제품의 안정성에 필수적이라는 것을 인식할 것이다. Fc-융합된 G-CSF 분자의 순도, 생물물리학적 특성들 및 효능의 변화는 안정성의 주요 지표이며, 따라서 정해진 시간 간격으로 선택된 온도에서 모니터링 되어야 한다.
본 발명은 완충제 및/또는 계면활성제 및/또는 안정화제 및/또는 유기 용매의 이상적인 조합에 의해 hy-Fc 융합된 G-CSF 약물을 위한 제형을 발명하는 것을 이끈다.
본 발명에 따른 액상 제형은 안정한 형태의 하이브리드 Fc 융합된 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 제형을 포함하며, 상기 제형은 (i) 치료적 유효량의 하이브리드 Fc 융합 G-CSF, (ii) 소듐 아세테이트 3수화물 및 아세트산/소듐 하이드록사이드 버퍼 시스템, (iii) 안정화제로서 소르비톨 및 (iv) 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 비이온성 계면활성제, 및 (v) 선택적으로 유기 용매로서 프로필렌 글리콜을 포함하고, 여기서 상기 제형의 pH 값은 4.0 내지 4.6이다.
용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 살아있는 대상체에게 투여될 때, 상기 살아있는 대상체에서 원하는 효과를 달성할 수 있는 양을 지칭한다. 통상적으로, G-CSF의 치료적 유효량(Neulasta EMA 문헌)은 단일-사용 당 6 mg이다. 하이브리드 Fc 융합된 G-CSF의 치료적 유효량은 50-400 mcg/kg, 바람직하게는 150-250 mcg/kg인 반면 하이브리드 Fc 융합된 G-CSF 내 G-CSF의 치료적 유효량은 20-160 mcg/kg, 바람직하게는 50-100 mcg/kg이다. 이 치료 효과를 제공하기 위해 본 발명에서 사용된 하이브리드 Fc 융합된 G-CSF의 안정한 형태의 농도는 대략 10 mg/mL 내지 80 mg/mL, 및 바람직하게는 대략 20 mg/mL 내지 40 mg/mL 이다.
"안정화제"는 폴리펩타이드 성분들의 안정성을 촉진하여 그들의 치료적 유효성을 유지한다. 당들 또는 당 알코올들은 또한 본 발명의 안정화 된 액상 폴리펩타이드-함유 약학 조성물들에 포함될 수 있다. 예를 들어, 프럭토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토오스, 락토스, 수크로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 가용성 전분, 하이드록시에틸 전분 및 카복시메틸셀룰로스-Na를 포함하는 단당류, 이당류 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸들과 같은 임의의 당이 사용될 수 있다. 당 알코올은 -OH 그룹을 갖는 C4-C8 탄화수소로 정의되며, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락시티톨(galacititol), 둘시톨(dulcitol), 자일리톨 및 아라비톨을 포함한다. 상기 언급된 당들 또는 당 알코올들은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 당 또는 당 알코올이 액상 제제에 용해되고 본 발명의 방법들을 사용하여 달성되는 안정화 효과들에 악영향을 미치지 않는 한, 사용되는 양에 대한 고정된 제한은 없다. 바람직하게, 상기 당 또는 당 알코올 농도는 액상 제형의 총 부피를 기준으로 약 1.0 w/v % 내지 약 15.0 w/v %, 바람직하게는 약 2.0 w/v % 내지 약 10.0 w/v %, 더 바람직하게는 3.0 w/v % 내지 7.0 w/v %이다. 본 발명에서, 상기 안정화제는 소르비톨이고, 여기서 소르비톨 대 단백질의 중량비는 3:2 내지 7:2, 바람직하게는 5:2 이다.
용어 "버퍼 시스템(buffer system)"은 수용액에 첨가되는 경우 산 또는 알칼리를 첨가할 때 또는 용매로 희석할 때 pH 변화로부터 용액을 보호할 수 있는 하나 이상의 성분을 지칭한다. 따라서, 버퍼 용액은 액상 제형에서 hy-Fc-G-CSF를 안정화시키데 중요한 역할을 한다. 아세테이트, 포스페이트, 글리시네이트, 카보네이트, 시트레이트, 히스티딘, 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄 (Tris) 버퍼들 등이 사용될 수 있으며, 이 경우 소듐, 포타슘 또는 암모늄 이온들이 반대이온으로 작용할 수 있다. 상기 언급된 버퍼들은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. "산"은 수용액에서 수소 이온들을 생성하는 물질이다. "약학적으로 허용되는 산(pharmaceutically acceptable acid)"은 그것들이 제형화되는 농도 및 방식에서 독성이 없는 무기 및 유기산들을 포함한다. "염기"는 수용액에서 수산화이온들을 생성하는 물질이다. "약학적으로 허용되는 염기(Pharmaceutically acceptable base)"는 그것들이 제형화되는 농도 및 방식에서 독성이 없는 무기 및 유기 염기들을 포함한다. 본 발명에서, 소듐 아세테이트 3수화물 및 아세트산/소듐 하이드록사이드를 포함하는 버퍼 시스템이 선택된다.
"계면활성제"는 소수성 부분(예를 들어, 알킬 사슬) 및 친수성 부분(예를 들어, 카르복실 및 카르복실레이트 그룹들)를 함유하는 표면 활성 분자이다. 계면활성제는 본 발명의 제형들에 첨가될 수 있다. 폴리소르베이트-기반 비이온성 계면활성 및 폴록사머-기반 비이온성계면활성 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 계면활성제들이 본 발명의 제형들에 사용되기에 적합하다. 본 발명의 액상 제형은 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 비이온성 계면활성제를 바람직하게는 상기 액상 제형의 총 부피를 기준으로 0.08 % (w/v) 내지 0.15 % (w/v)의 농도로 포함한다.
본원에서 "유기 용매"는 단백질 내/주위의 수성 함량을 감소시킴으로써 낮은 pH에서 발생하는 산 매개 가수분해 반응을 감소시키는 것을 목적으로하는 반-극성(semi-polar) 성분인 프로필렌 글리콜(PG)을 지칭한다. 프로필렌 글리콜 또는 1,2-디하이드록시프로판 또는 1,2-프로판디올은 20℃에서 밀도가 1.038 g/cm3이고 분자량이 76.095인 투명하고 무색이며 점성이 있고 거의 무취인 액체이다. 그것은 물, 아세톤 및 클로로포름과 혼합 가능하다. PG 모노그래프들은 PhEur, USP 및 JP에 포함되고; 일반적으로 다양한 약물들의 부형제로 사용되고; 또한 식품 및 화장품에서 허가된다(Background review for the excipient propylene glycol EMA/CHMP/334655/2013). 본 발명의 액상 제형은 유기 용매로서 프로필렌 글리콜을 상기 액상 제형의 총 부피를 기준으로 20 % (v/v) 이하의 농도로 포함할 수 있다.
발명의 이상적인 Fc 융합된 G-CSF 제형들을 선택하는 방법:
약물 제품의 pH는 USP <791>에 설명된 전위차 분석에 의해 결정될 수 있다.
각 시료의 농도는 각각 280, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350 nm에서의 흡광도 측정으로부터의 UV 테스트를 통해 결정될 수 있다. 280 nm에서의 총 흡광도로부터 광산란으로 인한 흡광도(320, 325, 330, 335, 340, 345, 350 nm에서)를 뺀다. 시험 용액에서의 단백질 농도는 수정된 흡광도와 1.03 ml/cm*g의 흡광 계수 값으로 람베르트-비어(Lambert-Beer) 식을 적용하여 계산될 수 있다.
시차 주사 열량측정법은 단백질들의 열역학적 안정성을 측정하는데 사용되는 기술일 수 있다. 그것은 가열 또는 냉각 동안 용액에서의 생체분자들에서 흡수되거나 방출되는 열의 양을 측정한다. 천연 단백질들은 특성 온도(T개시)에서 펼쳐짐(열 변성)에 의한 가열에 반응한다. 나노 DSC, TA 기구(New Castle, USA)는 분자 안정성 스크리닝을 수행하기 위한 다목성 및 정밀도로 용액에서 단백질들 및 다른 거대분자들의 변성 온도 및 변성 엔탈피를 결정하는데 선호되는 방법일 수 있다. 이를 위해, 시료들은 해당 제형 버퍼에 대해 투석되고 DSC 기구에서 추가로 사용하기 위해 1 mg/mL 로 희석된다. 스캔 속도는 20-100℃의 온도 범위로 1℃/분 가열 및 냉각이다.
조성물-구배-다중-각도 광산란 측정(Composition-Gradient-Multi-Angle Static Light Scattering, GC-MALS)은 상이한 농도들에서 광 산란 거동의 변화들에 의해 용액 내 단백질 분자들 사이의 상호작용을 결정하는데 사용될 수 있다. 일련의 광산란 측정들로 분자 상화작용들을 평가하는 특성 매개변수인 제2 비리얼 계수 A2가 계산될 수 있다. Calypso II CG-MALS 시스템인 Wyatt Technology Europe (Dernbach, 독일)은 MALS 검출기에 분석물의 농도 구배를 제공하는데 사용된다. 시료는 상기 시스템의 하나의 시린지 펌프에 적재되고 투석 버퍼는 상기 시스템의 다른 시린지 펌프에 적재된다. 투석 버퍼로 시료를 희석함으로써 5 mg/mL 내지 0.5 mg/mL의 10 개의 등거리 농도 단계들이 각 측정에 적용된다. 각 기울기 단계에서 1mL의 시료가 MALS 검출기로 주입된다. 결과된 광산란 신호는 180초에 걸쳐 기록된다. Zimm 플롯 분석은 Calypso 소프트웨어 버전 2.1.3으로 수행될 수 있다.
시료들의 탁도는 유럽 약전에 따라 2100 AN 탁도계(Hach Lange, Dusseldorf, 독일)를 사용하여 측정될 수 있다. 시스템의 보정은 하이드라진 설페이트 및 헥사메틸렌테트라민을 혼합하여 1차 유백색 현탁액을 제조한 다음 유백색 표준을 추가로 희석하여 수행된다. 상기 검출기는 시료들로부터 90° 각도에서 산란되는 빛을 상기 시료를 통해 직접 투과된 빛과 함께 상기 시료 앞의 반사광과 함께 측정한다. 측정 결과들은 반사된 값과 투과된 값의 요소들의 합에 대해 측정된 90° 각도 산란광의 비율인 NTU로 제공된다.
탁도계의 보정을 위한 참조 용액의 제조.
분자의 정체 및 순도를 테스트하기 위해 분자량 및 등전점 측면에서 hy-Fc 융합된 G-CSF의 전기영동 특성들이 모니터링된다.
소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE) 분석은 분자량을 사내 참조 표준물질 중 하나와 비교하기 위해 hy-Fc 융합된 G-CSF에 대해 수행될 수 있다. 약물 제품 및 사내 참조 표준물질은 탈이온수를 사용하여 500 μg/mL로 희석되고 NuPAGE® LDS 샘플 버퍼 (4X) 및 탈이온수를 사용하여 3 μg/20 μL로 만들어진다. 전기영동을 위해 NuPAGE® Novex 4 - 12 % 비스-트리스(Bis-tris) 겔 (1.0 mm, 10 웰)에 적재된다. 등전점 겔 전기영동은 사내 참조 표준물질에 대한 hy-Fc 융합된 G-CSF의 등전점 범위를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 약물 제품 및 사내 참조 표준물질은 탈이온수를 사용하여 1mg/mL로 희석되고, Novex® IEF 샘플 버퍼 2X)를 사용하여 10μg/20uL 로 만들어진다. 등전점 전기영동은 Novex® pH 3-10 IEF 겔 1.0 mm, 10 웰을 사용하여 수행된다.
단량체 및 소수성 특성 측면에서 hy-Fc 융합된 G-CSF의 순도는 액체 크로마토그래피 기술들로 분리되고 모니티링 될 수 있다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 분자들의 크기를 기준으로 분자들을 분리하는데 선호되는 방법일 수 있으므로 고분자량종(HMW) 및 2695 Alliance HPLC (Waters)를 사용에 의한 분해된 종이다. 분리는 분자들이 컬럼의 길이에 따라 이동에 따른 차별적 분자 배제 또는 포함에 의해 달성된다. 약물 물질은 1 mg/mL로 희석되고 TSK-GEL G3000SWxL (7.8*300mm) 컬럼 및 TSK-GEL G3000SWxL (6*40mm) (TOSOH Bioscience) 보호 컬럼을 사용하여 분리된다. 이동상은 50 mM의 인산염 버퍼(아세토니트릴과 9:1 (v/v) 비로 혼합된 1L 탈이온수에서의 제2인산나트륨 5.34g, 제1인산나트륨 3.12g, 염화나트륨 8.76g, 최종 pH는 7.0)로 구성된다. 유속 0.5 mL/분 및 214nm의 검출 파장이 30분동안 적용된다. 분석 결과에 따라 전체 면적에 대한 주요 피크의 %면적이 계산되며 여기서 산출량은 단량체의 순도를 나타낸다.
역상-고성능 크로마토그래피(RP-HPLC)는 소수성의 방법에 의해 그들을 분리하는 것을 통하여 순도를 확인하는 다른 방법일 수 있다. RP-HPLC는 2695 Alliance HPLC (Waters)를 사용하여 Fc-융합된 G-CSF 변이체들 및 절단된 형태의 불순물들 및 체류시간을 확인하는데 사용된다. Vydac 214TP C4 컬럼 (4.6 * 250 mm) (Grace, Vydac) 컬럼 및 보호 컬럼 214MS C4, 5 μm, 7.5 × 4.6 mm (Grace, Vydac)을 사용하여 해당 제형 버퍼에서 1mg/mL 농도의 약물을 분리한다. 이동상은 0.5 mL/분의 유속에서 탈이온수에서의 0.15% 트리플루오로아세트산 (TFA) 및 아세토니트릴에서의 0.15% TFA로 구성된다. 220nm의 검출 파장은 35분 동안 적용되고 분석 결과에 따른 총 면적에 대한 주요 피크의 % 면적이 모니터링된다.
본 발명의 더 나은 이해는 하기의 실시예들을 통해 얻을 수 있으며, 이는 예시를 위한 것으로 본 발명의 한계가 되어서는 안된다. 이들 실시예들은 US8586048 B2에서 설명된 전장 hyFC-융합된 G-CSF를 포함하는 액상 제형의 개발을 설명한다.
실시예 1: hyFc-융합된 G-CSF 제형을 위한 이상적인 pH 및 버퍼 성분의 선택
활성인 것으로 알려진 단백질의 목표 pH 및 안정성을 유지하려면 버퍼 시약이 필요하다. 액상 제형의 발명을 위해, 버퍼들은 구조적 안정성의 지표로서 변성 개시 (T개시) 및 콜로이드 안정성의 척도로서 제2 비리얼 계수(A2)의 결정을 측정함으로써 초기에 스크리닝된다.
본 발명에서, 시료들의 조제를 위해 제형들을 투석에 의해 제조하였다. 약물 물질은 사전 조절된 투석 튜브들에 채워지며 제형 버퍼에서 2시간 동안 배양되었다. 2시간 후, 상기 제형 버퍼가 교환되었고 상기 시료들은 새로운 버퍼에서 2시간동안 배양되었다. 새로운 제형 버퍼에서 상기 시료들의 배양하여 밤새 투석을 완료하였다. 투석 후, 상기 시료들은 투석 튜브로부터 제거되었고 상기 시료들의 pH와 농도가 확인되었다. 필요한 경우, pH는 제약 등급의 산 또는 염기로 조정되었다. 필요한 경우, 농도는 희석 또는 초미세여과를 통한 농축으로 조절되었다.
예비 실험 규모 측정들은 조성물-구배 다중-각도 광산란 측정 (CG-MALS) 방법에 의해 측정된 콜로이드 안정성 및 시차주사열량계(DSC)에 의해 측정된 열역학적 특성들을 모니터링 하기 위한 제형 스크리닝 연구를 통해 수행되었으며, 이는 pH 3.8, 4.2, 4.6 및 5.2 의 10 mM 소듐 아세테이트; pH 5.2, 6.5 및 7.0의 10 mM 히스티딘-염산; pH 6.5 및 7.5의 10mM 소듐-포스페이트; pH 6.5 및 7.0의 10 mM 히스티딘-아세테이트; pH 7.5의 10 mM 트리스(Tris)-염산 및 pH 7.5의 10 mM 트리스-아세테이트에서의 20 mg/mL hy-FC 융합된 G-CSF에 대해 수행되었다.
표 1. 상이한 pH 및 버퍼 성분에서의 20 mg/mL hy-Fc 융합된 G-CSF의 구조 및 콜로이드 안정성 평가
표 1에 나타난 결과들에 따르면, pH가 증가하면 T개시 값이 증가하고 모든 pH 조건에서 T개시 값이 40℃보다 높은 것으로 관찰되었다. 반면, A2 값은 pH 5.2 (NA/아세테이트, His/HCl 버퍼 사용), pH 6.5(NaPO4 버퍼 사용)에서 음수로 확인되었다. 음의 A2 값은 콜로이드 불안정성을 나타낸다. hy-Fc-융합된 G-CSF의 pI 값 부근에서(pH 5.3-6.0), 분자들 사이의 덜 밀어내고 심지어 이끄는 상호작용이 관찰되었다. 6.5 내지 7.0의 pH 영역에서, 히스티딘-염산 및 히스티딘-아세테이트 버퍼 시스템들에서 소듐 포스페이트 시스템들 보다 높은 콜로이드 안정성이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에서는, A2 값들 및 T개시 값들을 기준으로, 3.8 (Na/아세테이트), 4.2 (Na/아세테이트), 4.6 (Na/아세테이트), 6.5 (His/아세테이트) 및 7.5 (His/아세테이트)의 pH조건들이 hy-Fc 융합된 G-CSF의 콜로이드 및 열역학적 안정성을 선호하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2: hyFC-융합된 G-CSF 제형의 안정성에 대한 소듐 클로라이드 첨가의 평가
T개시 및 A2 값에 대한 다른 제형 부형제의 효과들은, 실시예 1에서 제공된 결과들에 기초하여, pH 4.2 Na/아세테이트 완충된 제형 및 pH 6.5 His/아세테이트 완충된 제형을 사용한 추가 연구들에서 조사되었다. 이 연구를 위해 실리콘화 용기가 포장 시스템으로 선택되었다. 미리 멸균된 1mL 오일 실리콘화 유리 시린지가 층류 하에서 시료들로 채워졌다. 스토퍼들은 스토퍼 기계에 의해 배치되었다. 첫째로, 안정성에 대한 탄력성 효과를 평가하기 위해, 150 mM 소듐 클로라이드의 염 성분을 제형에 첨가하였다. 그 다음 콜로이드 및 구조적 안정성을 상술한 것과 같이 평가하였다.
표 2. 150 mM 소듐 클로라이드 함유 제형들에서의 20 mg/mL hyFC 융합된 G-SF의 구조 및 콜로이드 안정성 평가
그러나 높은 이온 강도를 초래하는 소듐 클로라이드의 첨가는 열역학적 안정성에 대해 명확한 효과를 갖지 않았다. 표 2에 나타난 결과에 따르면, 소듐 클로라이드의 첨가는 A2 값들의 감소를 야기한다. 이 값들은 기존의 밀어내는 상호작용을 감소시키고 구조적 안정성에 대해 명확한 효과가 없기 때문에 더 높은 등장 강도가 유익하지 않다는 것을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 제형들은 염 성분을 포함하지 않는다.
실시예 3: 선택된 hFC-융합된 G-CSF 제형들의 안정성에 대한 소르비톨 첨가의 평가
많은 다른 후보들이 낮은 pH에서 장시간동안 안정적이지 않기 때문에, 소르비톨이 안정화제 후보로서 특별히 평가되었다. 소르비톨 (5%)가 제형에 첨가되었으며 그 다음 T개시 및 A2 값들이 측정되었다.
표 3. 5% 소르비톨 함유 제형들에서의 20mg/mL hy-Fc 융합된 G-CSF의 구조 및 콜로이드 안정성 평가
표 3에 나타난 결과들에 따르면, 소르비톨의 존재는 pH 4.2에서 약간의 구조 안정화 효과를 보였지만, pH 6.5에서는 효과가 없었다. 따라서, 본 발명에서 안정화제는 원하는 콜로이드 열 안정성을 달성하기 위해 필요하다. 본 발명에서 바람직한 안정화제는 5%의 제약 등급 소르비톨이다.
실시예 4: 선택된 제형들에 대한 계면 활성제 효과의 평가
이상적인 계면활성제를 결정하기 위해, 0.1% 폴록사머 188 (P188) 또는 0.02% 폴리소르베이트 20 (PS20) 또는 0.02% 폴리소르베이트 80 (PS80)이 5% 소르비톨 제형들과 함께 pH 4.2의 10 mM 소듐 아세테이트 및 pH 6.5의 히스티딘-아세테이트에 첨가되었다. 표 4에 나열된 이들 액상 hFc-융합된 G-CSF 제형들은 그것의 보관수명동안 단백질의 잠재적인 안정성을 결정하기 위해 2주 동안 40℃에서 가속 안정성 연구를 받았다. 이러한 가속 연구들은 일반적으로 제안된 저장 조건들보다 높은 온도에서 수행되며 데이터는 아레니우스 동역학(Arrhenius kinetics)을 가정하여 분해 반응들에 대한 활성화 에너지를 추정하는데 사용된다(Cleland et al.,　Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems　10(4): 307-377 (1993)). 그 다음 활성화 에너지는 제안된 저장 조건들에서 단백질 제형의 예상되는 보관수명을 계산하는데 사용된다. 추가로, 제형들(표 4)의 안정성은 동결-해동 스트레스하에 평가되었다. 안정성은 분자량 및 등전점 측면에서 탁도, 단량체 및 소수성 순도, 및 전기영동성에 대해 모니터링 되었다.
표 4. 20 mg/mL hyFC 융합된 G-CSF 함유 제형들을 위한 이상적인 계면활성제를 결정하기 위한 제형 매트릭스.
결과들은 모든 제형들이 동결-해동 스트레스에 대해 안정하다는 것을 보여주었다 (표 5-10). 또한, 가속 안정성 조건(40℃에서 2주 동안) 하에 폴록사머 188 (P188) 함유 제형들은 폴리소르베이트 20 (PS20) 및 폴리소르베이트 80(PS80) 함유 제형들 및 대조군 제형들에 비해 보다 높은 안정성을 보인다는 것이 이 연구의 구현예이다 (표 5-10). 따라서, 폴록사머 188 또는 플루로닉 F68은 저장 동안 및 운송 조건 동안 hyFC-융합된 G-CSF의 응집 위험을 최소화하기 위한 계면활성제로서 본 발명에 포함된다.
표 5. 40℃에서 2주 동안 동결-해동 스트레스 하에서 F1-F4의 탁도 결과들, n=4.
표 6. 2주 동안 40℃하에 및 동결-해동 스트레스 하에서 F5-F8의 탁도 결과들, n=4.
표 7. SEC-HPLC에 의해 결정된 2주 동안 40℃하에 및 동결-해동 스트레스 하에서 F1-F4의 단량체 함량 백분율, n=4.
표 8. SEC-HPLC에 의해 결정된 2주 동안 40℃하에 및 동결-해동 스트레스 하에서 F5-F8의 단량체 함량 백분율, n=4.
표 9. RP-HPLC에 의해 결정된 2주 동안 40℃하에 및 동결-해동 스트레스 하에서 F1-F4의 소수성 함량 백분율, n=4.
표 10. RP-HPLC에 의해 결정된 2주 동안 40℃하에 및 동결-해동 스트레스 하에서 F5-F8의 소수성 함량 백분율, n=4.
동일한 연구에서, pH 4.2 제형들에서 및 그것의 하위 변형들에서, 주요 분해 산물들은 가수분해로 인해 형성될 가능성이 가장 높은 단편들이었다. pH 6.5 및 그것들의 하위 변형들에서 디-설파이드 셔플링으로 인해 공유 결합된 응집체들이 발견되었다(도 2 및 3).
실시예 5: 선택된 제형의 최적화 및 장기간 평가
제형 2(표 4)는 스크리닝된 제형에서 가장 안정한 제형으로 선택되었고 제형 2A로 코드화 되었다. 반면에 많은 연구들은 제형 pH의 작은 변화가 제형 안정성에 중요할 수 있음을 입증하였다. 결정된 제형들의 pH 변화 효과 및 장기 안정성의 결정을 위해, 표 11(제형 2A) 및 표 12(제형 2B)에 나열된 제형들은 각각 pH 4.2 및 4.6으로 변경하여 제조되었다. 여기서 pH 변화는 약학적으로 허용되는 산 또는 염기의 첨가에 의해 얻어졌다. 여기서, 바람직한 산은 아세트산이고 바람직한 염기는 소듐 하이드록사이드이다.
표 11. pH 4.2에서 완충된 제형 2A의 조성
표 12. pH 4.6에서 완충된 제형 2B의 조성
안정성 연구에 앞서, 상기 제조된 제형들의 열역학적 및 콜로이드 안정성을 검사하였다(표 13).
표 13. 제형 2A 및 2B의 콜로이드 및 열역학적 특성들
EMEA의 안정성 지침은 6 개월 초과의 저장 기간이 요구되는 경우 제출 시점에서 최소 6 개월의 안정성 데이터가 제출될 것을 나타낸다. 따라서 2-8℃에서 실시간 실제 조건 안정성 테스트가 수행되고, 25℃에서 6개월 동안 가속 안정성 테스트가 수행되었다. 표 14-17에 결과들을 나타냈다.
표 14. 2-8℃에서 SEC-HPLC에 의해 결정된 제형 2A 및 2B의 단량체 함량 백분율, (n=2).
표 15. 25℃에서 SEC-HPLC에 의해 결정된 제형 2A 및 2B의 단량체 함량 백분율, (n=2).
표 16. 2-8℃에서 RP-HPLC에 의해 결정된 제형 2A 및 2B의 소수성 함량 백분율, (n=2).
표 17. 25℃에서 RP-HPLC에 의해 결정된 제형 2A 및 2B의 소수성 함량 백분율, (n=2).
제형 2A 및 2B는 실시간 및 실제 온도 조건들에서 적어도 6 개월에서 안정한 것으로 확인된 것으로 나타났다(표 14-17). 따라서, 본 발명에서, pH 4.2 및 4.6 제형들은 실시간-실제 안정성 및 가속 조건들 하에서 hy-Fc 융합된 G-CSF에 대해 장기 안정성을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 6: hy-Fc 융합 G-CSF 제형의 안정성에 대한 유기 용매 효과의 평가
본 제형은 유기 용매인 프로필렌 글리콜(PG)을 사용하여 G-CSF 분자 절단의 추가 분해에 의한 악화를 극복하는 개선된 제형을 개발하는 것으로 이어진다.
제형 개발 동안, hy-Fc 융합된 G-CSF에 대한 pH 및 프로필렌 글리콜 존재의 영향이 평가되었다(표 18).
표 18. 20 mg/mL의 Hy-Fc 융합된 G-CSF 안정성에 대한 pH 및 프로필렌 글리콜 존재의 영향을 평가하는 연구 매트릭스
hy-Fc 융합된 G-CSF의 안정성은 0.01% 플루로닉 F-68, 5% 소르비톨을 포함하고 10% PG 또는 20% PG가 있거나 없는 10 mM 소듐-아세테이트 버퍼의 pH 4.2 및 4.6에서 연구되었다. 20 mg/mL의 유효성분을 포함하는 시료들을 25℃ 및 2-8℃에서 6개월 동안 두었다. 안정성 연구에 앞서 제형들의 시린지 기능성과 열역학적 및 콜로이드 안정성이 시험되었다(표 19).
표 19. 유기 용매 교환 후 제형 2A 및 2B의 콜로이드 및 열역학적 특성들
이 연구의 한 구현예는 모든 제형들에 대한 밀어내는 힘이 10 N 미만이어서 주사에 의해 투여되는 약물에 대해 잘 허용된다는 것이다. 프로필렌 글리콜을 함유하는 제형들은 프로필렌 글리콜이 없는 제형들에 비해 약간 더 높은 밀어내는 힘을 나타냈다. pH는 상기 결과에 영향을 미치지 않았다.
표 19의 결과들에 따르면, hy-Fc 융합된 G-CSF의 콜로이드 안정성은 낮은 pH에서 더 높다. 10% 프로필렌 글리콜의 존재는 밀어내는 단백질 상호작용들을 약간 증가시켜 콜로이드 안정성을 증가시킨 반면 20% 프로필렌 글리콜은 그렇지 않았다. hy-Fc 융합된 G-CSF의 열역학적 안정성은 또한 낮은 pH에서 약간 더 높다.
다른 구현예로서, 동일한 연구는 데이터가 단량체 수준의 감소가 상승된 저분자량 불순물들의 증가에 기인함을 보여줌으로써, hy-Fc 융합된 G-CSF의 주요 분해 경로가 화학적 분해 및 단편화인 것을 밝혔다(표 21). hy-Fc 융합된 G-CSF의 디설파이드 셔플링으로 인한 응집은 동일한 연구에서 관찰되지 않았다.
동일한 연구의 최종 구현예로서, 프로필렌 글리콜의 첨가는 가속된 안정성 데이터에 의해 제시된 바와 같은 화학적 안정성에 대해 유익한 효과를 갖는 것을 보여 주었다(표 20-23), 그러나, 20% PG는 열역학적 안정성을 감소(표 19)시키므로 10% PG의 첨가가 바람직하다.
표 20. 2-8℃에서 SEC-HPLC에 의해 결정된 20 mg/mL hy-Fc 융합된 CSF의 단량체 함량 백분율, (n=2).
표 21. 25℃에서 SEC-HPLC에 의해 결정된 20 mg/mL hy-Fc융합된 CSF의 단량체 함량 백분율, (n=2)
표 22. 2-8℃에서 RP-HPLC에 의해 결정된 20 mg/mL hy-Fc 융합된 CSF의 소수성 함량 백분율, (n=2).
표 23. 25℃에서 RP-HPLC에 의해 결정된 20 mg/mL hy-Fc 융합된 CSF의 소수성 함량 백분율, (n=2).
표 18에 나열된 제형들의 안정성은 실시간, 실제 온도 및 가속 조건들 하에서 적어도 6개월 이상 지속되는 것을 확인하였다. 그리고 PG 첨가는 제형들의 화학적 안정성에 유익한 효과를 갖는다. 따라서 PG의 존재는 25℃에서 RP-HPLC에 의해 모니터링 되는 소수성 순도 변화를 해석함으로서 G-CSF의 절단에 의한 분해를 극복할 수 있는 기회일 수 있다 (표 23). 따라서, 본 발명에서, 20% 이하의 PG 첨가는 실시간, 실제 온도 및 가속 조건들 하에서 hy-Fc 융합된 G-CSF의 장기 안정성을 더욱 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: hy-Fc 융합된 G-CSF 제형의 실시간 안정성에 대한 pH 효과의 추가 평가
hy-Fc 융합된 G-CSF의 실시간 안정성에 대한 pH의 효과를 완전히 조사하기 위해, 10% 프로필렌 글리콜 PG 제형들이 있거나 없는 pH 4.0 및 pH 4.4 (표 19)가 2-8℃에서 6개월 동안 연구되었다.
20 mg/mL 유효성분의 hy-Fc 융합된 G-CSF가 pH 4.0 및 4.4의 10 mM 소듐-아세테이트 버퍼에서 연구되었으며, 상기 버퍼는 0.01% 플루로닉 F-68, 5% 소르비톨으로 구성되며 10% PG를 함유하거나 함유하지 않는다.
표 24. pH 4.0에서 완충된 제형 2C의 조성
표 25. pH 4.4에서 완충된 제형 2D의 조성
표 26. 20 mg/mL의 Hy-Fc 융합된 G-CSF 안정성에 대한 pH 및 프로필렌 글리콜 존재의 영향을 평가하는 연구 매트릭스.
표 27. 2-8℃에서 SEC-HPLC에 의해 결정된 20 mg/mL hy-Fc 융합된 CSF의 단량체 함량 백분율, (n=2).
표 28. 2-8℃에서 RP-HPLC에 의해 결정된 20 mg/mL hy-Fc 융합된 CSF의 소수성 함량 백분율, (n=2).
이 연구의 한 구현예로서, SEC-HPLC, RP-HPLC, SDS-PAGE 및 Gel-IEF 분석들(표 27-28, 도 4-5)에 의해 hy-Fc 융합된 G-CSF는 선택된 조건들에서 안정한 것이 밝혀졌다. hy-Fc 융합된 G-CSF의 응집체들 및 절단된 형태들이 이 연구에서 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에서, pH 4.0 및 4.4 제형들은 실시간, 실제 온도 및 가속된 조건들하에서 hy-Fc 융합된 G-CSF에 대한 장기 안정성을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
표 29. hy-Fc 융합된 G-CSF 20 mg/mL 용액의 조성.
결론적으로, 본원에 이용되는 바와 같이, 표 29에 설명된 것과 같은 하이브리드 Fc 융합 G-CSF 제형은 3.8 내지 6.5, 바람직하게는 4.0 내지 4.6의 pH 범위에서 안정한 것으로 나타났다. 여기서, 본 발명에서 상기 제형은 버퍼 시스템, 계면활성제, 안정화제 및/또는 유기 용매로서 PG 로 구성된다.
본 발명에서, 상기 버퍼 시스템은 소듐 아세테이트 3수화물 염 및 아세트산/소듐 하이드록사이드를 포함할 수 있다.
본 발명은 액상 제형의 총 부피를 기준으로 바람직하게 0.08 w/v% 내지 0.15 w/v%의 농도에서 계면활성제로서 소르비톨을 포함할 수 있고, 바람직하게 3.0 w/v% 내지 7.0 w/v%의 농도에서 안정화제로 소르비톨을 포함할 수 있고, 여기서 소르비톨 대 단백질의 중량비는 3:2 내지 7:2, 바람직하게는 5:2이다.
본 발명은 산성 pH에서 가수분해를 통해 G-CSF의 절단 과정을 용이하게 하는데 도움을 주는 수성 함량을 감소시키기 위해 액상 제형의 총 부피를 기준으로 20 v/v% 이하의 PG (Sigma, 스위스), 바람직하게는 10 v/v % 이하의 PG를 포함할 수 있다.
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Claims (29)

  1. 치료적 유효량의 하이브리드 Fc 융합 G-CSF를 포함하는 안정한 하이브리드 Fc 융합 G-CSF 제형으로서, 여기서 상기 제형의 pH 값은 소듐 아세테이트 3수화물 및 아세트산/소듐 하이드록사이드 버퍼 시스템을 갖는 4.0 내지 4.6이고,
    상기 제형은 안정화제로서 소르비톨, 및 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 비이온성 계면활성제를 포함하는, 제형.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소르비톨은 상기 제형의 총 부피를 기준으로 3.0 w/v % 내지 7.0 w/v%의 농도인, 제형.
  3. 제1항에 있어서,
    소르비톨 대 단백질의 중량비는 3:2 내지 7:2인, 제형.
  4. 제3항에 있어서,
    소르비톨 대 단백질의 중량비는 5:2인, 제형.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴록사머 188인, 제형.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폴록사머 188은 액상 제형의 총 부피를 기준으로 0.08 w/v% 내지 0.15 w/v%의 농도인, 제형.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 하이브리드 Fc 융합된 G-CSF는 10 mg/mL 내지 80mg/mL의 농도 범위인, 제형.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 하이브리드 Fc 융합된 G-CSF는 20 mg/mL 내지 40mg/mL의 농도 범위인, 제형.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 유기 용매로서 프로필렌 글리콜을 포함하는, 제형.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 프로필렌 글리콜은 액상 제형의 총 부피를 기준으로 20 v/v% 이하의 농도인 제형.
  11. 제10항에 있어서,
    프로필렌 글리콜은 액상 제형의 총 부피를 기준으로 10 v/v% 이하의 농도인 제형.
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