CN112312890A - 稳定的杂合fc融合g-csf制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明包含稳定形式的杂合Fc融合的粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)制剂，其包含(i)治疗有效量的杂合Fc融合G‑CSF；(ii)缓冲剂系统；(iii)至少一种稳定剂；和(iv)至少一种表面活性剂；和(v)任选地作为有机溶剂的丙二醇，所述制剂适合于经由皮下(SC)途径施用。

Description

稳定的杂合FC融合G-CSF制剂
技术领域
本发明的制剂涉及稳定的液体制剂组合物，其包含Fc经由肽键融合至粒细胞集落刺激因子(G-CSF)分子，适合于通过皮下(SC)途径施用。
现有技术
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种对于粒细胞(特别是嗜中性粒细胞)的增殖和分化必要的蛋白质。粒细胞吞噬并消灭微生物入侵者和细胞碎片，并因此对感染反应至关重要。然而，它们在血流中的寿命只有6-12小时，并且随着它们发挥功能而被破坏。由于它们的快速周转，粒细胞计数在骨髓损伤(例如由于使用传统癌症治疗(包括化学治疗剂和放疗)的治疗)或免疫性失调(包括AIDS)时迅速而显著下降(US 7208473 B2)。
在过去的几年中，通过增加体内活性和/或减少副作用来提高天然存在的分子或药物的有效性已成为许多科学家的极大兴趣。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)就是其中的实例，其药物特性随时间而改变(N.Nicola,Colony Stimulating Factors,vol.49,MarcelDekker,Inc.,New York,1990)。
首先在大肠杆菌中产生重组的甲硫氨酰基人G-CSF(r-metHuG-CSF)，一种175个残基的蛋白质(C.P.Hill,T.D.Osslund,D.Eisenberg,The structure ofgranulocytecolony-stimulating factor and its relationship to other growthfactors,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,1993,5167-5171)。在蛋白质结构中，有两个二硫键和一个游离的半胱氨酸残基Cys17。已知Cys17在低pH下会质子化，并且质子化形式对于G-CSF的稳定性是重要的(T.Arakawa,S.J.Prestrelski,L.O.Narhi,T.C.Boone,W.C.Kenney,Cysteine 17of recombinant human granulocyte-colony stimulatingfactor is partially solvent-exposed(J.Protein Chem.12,1993,525-531)。r-metHuG-CSF的市场名是
Figure BDA0002757686280000011
(非格司亭(Filgrastim))，并且在癌症疗法诱导的嗜中性粒细胞减少、骨髓移植过程、严重的先天性嗜中性粒细胞减少、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征和AIDS的治疗中被使用(Product Monograph:
Figure BDA0002757686280000012
(filgrastim)-AmgenCanada)。
非格司亭的相对短的半衰期(3.5-3.8hr)用
Figure BDA0002757686280000013
(PEG-非格司亭)来解决，其中G-CSF与聚乙二醇链共价连接，这可以增加体内G-CSF的循环而具有18-80hr的半衰期(Product Monograph:
Figure BDA0002757686280000014
(PEG Filgrastim))。G-CSF的聚乙二醇化对稳定性条件没有影响，其中蛋白质仍需要pH为4.0在2-8℃下长期储存。
增加有效性的另一种方法是使用免疫球蛋白作为融合平台。如美国专利号5,045,312中所述，通过使用碳二亚胺或戊二醛作为交联剂将人生长激素与牛血清白蛋白或小鼠免疫球蛋白缀合。当与未经修饰的生长激素比较时，缀合物具有增强的活性。
已知Fc结构域上的修饰(例如改变糖基化位点)改善治疗效果(R.J.Sola和K.Griebenow,Effects of Glycosylation on the Stability of ProteinPharmaceuticalsmight improve therapeutic role,J Pharm Sci.2009Apr；98(4):1223-1245)。另外，当活性物质与抗体的可结晶片段(Fc)区域融合时，还实现延长的循环或临床活性。Fc结构域的添加通过与Fc受体的相互作用增加融合的伴侣的流体动力学半径，并提供增强的循环，这总体上使其不易被肾脏清除并增加其循环持续时间(D.M.Czajkowsky,J.Hu,Z.Shao,和R.J.Pleass.Fc-fusion proteins:new developments and futureperspectives,EMBO Mol Med.2012Oct；4(10):1015-1028)。
用免疫球蛋白(Ig)作为融合平台对如提及的融合蛋白进行广泛研究。人Ig(hlg)扩大为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，然后可以被进一步分类为如下亚型：人lgG1(hlgG1)、人lgG2(hlgG2)、人lgG3(hlgG3)和人lgG4(hlgG4)(Roitt et al.,Immunology 1989,GowerMedical Publishing,London,U.K.；New York,N.Y.)。Ig是异二聚体蛋白质，其包含通过二硫键连接的四条多肽链，重链(HC)和轻链(LC)。HC和LC二者包含可变区和恒定区。重链的恒定区可以进一步亚分类为三个或四个区域(CH1、CH2、CH3和CH4)。根据同种型，重链恒定区的Fc部分可以包含铰链、CH2、CH3，和/或CH4区。lgG1、lgG2和lgG4具有21天的长血清半衰期，而其他IgG具有约一周的血清半衰期。当融合蛋白通过CH1区N-末端的IgG的Fc部分，Fc区的N-末端或在IgG的CH3区的C-末端处形成时，可以实现增强的稳定性和血清半衰期(H.WSchroeder,L Cavacini,Structure and Function of Immunoglobulins,J AllergyClin.Immunol.Feb 2010；125(202):41-52；Capon et al.,Designing CD4immunoadhesins for AIDS therapy,Nature 1989；337:525-531)。
IgG融合蛋白可以通过与细胞表面受体的胞外结构域或与细胞因子和生长激素融合而形成(Capon et al.,Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy,Nature1989.337:525-531；Mohler等人.,Soluble tumor necrosis factor(TNF)receptors areeffective therapeutic agents in lethal endotoxemia and functionsimultaneously as both TNF carriers and TNF antagonists,J.Immunology1993.151:1548-1561)。
然而，不同于与细胞表面受体的胞外结构域的融合，与非融合的细胞因子或生长因子相比，可溶性蛋白质与IgG的融合导致生物学活性降低。原因是嵌合蛋白以二聚体存在，其中两种活性蛋白非常接近；这导致融合的IgG对它们的靶分子的空间位阻。因此，应克服此问题以制备有效的融合蛋白(Immunoglobulin fusion proteins,US20120276097A1)。
Fc融合技术的其他限制是发生不希望的免疫应答。免疫球蛋白的Fc结构域还具有效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。通常通过Ig的Fc区和效应细胞上的Fc受体(FcR)之间的相互作用或通过补体结合来实现这种效应子功能。因此，应该进行Fc的效应子功能的阻断以减少不希望的应答，例如细胞死亡，细胞因子释放或炎症(Immunoglobulin fusion proteins,US 20120276097 A1)。
总的来说，已知未经任何修饰地使用基于G-CSF的产品如非格司亭
Figure BDA0002757686280000031
由于其半衰期短而受到限制。培非格司亭(Pegfilgrastim)
Figure BDA0002757686280000032
具有相当增加的半衰期，但已知PEG可能具有一些副作用，且聚乙二醇化带来额外的生产步骤。Fc融合策略为增加蛋白质的短半衰期提供了机会，但是Fc融合技术的主要限制之一是存在如所解释的不希望的免疫应答。已经发明杂合Fc(hyFc)平台，其是本发明中被测试以被配制和稳定化的感兴趣的分子，以进一步改善缀合的药物的血浆半衰期且降低细胞毒性和免疫原性(EP20080766022，US 8586038B2)。出于此目的，不具有ADCC和CDC应答的两种不同的免疫球蛋白在遗传上被组合。杂合Fc衍生自人IgG亚类的组合或人IgD和IgG的组合。当杂合Fc与生物活性分子连接时，杂合Fc有效地增加生物活性分子的血清半衰期，以及在当编码Fc多肽融合蛋白的核苷酸表达时提高多肽表达水平。因此，杂合Fc(hyFc)融合的G-CSF还具有更长的血浆半衰期、高效的表达水平、消除的细胞毒性和降低的免疫原性(US8586048B2)。在这方面，hy-Fc融合的G-CSF是独特的且是起源分子，其中Fc部分本身是两种免疫球蛋白分子的融合物，并且该第一融合物进一步与活性分子融合。由于该结构需要注意Fc融合部分和G-CSF部分二者的稳定性，它不同于其他常规的Fc融合药物，并且需要额外不同且独特的溶液用于建立其稳定性。在这方面，对于本发明，完成关于常规Fc融合蛋白的稳定性的文献研究，但是本发明本身是根据这种独特的hy-Fc融合的G-CSF的特定需要而完成的。
文献综述完成后，针对常规的Fc融合的药物存在不同的制剂溶液。重组抗体和Fc缀合的蛋白的多种生物物理和化学特性需要pH(4.0-8.5)、缓冲剂(乙酸盐，柠檬酸盐，磷酸盐)、稳定剂(盐，糖，氨基酸)和/或表面活性剂(聚山梨酯20和聚山梨酯80)的处于液体和冻干形式的制剂，以在存储期间保护它们的完整性和功效(S.M.Chamow,T.Ryll,B.H Lowman,和D.Farson,Eds.,Therapeutic Fc-Fusion Proteins,Wiley-Blackwell:Hoboken,NJ,2014)。
不同于被Fc和Fab结构域的结构域间和结构域内相互作用稳定的完整单克隆抗体(mAb)；由于缺失的结构域间稳定性，Fc缀合物是相对不稳定的(A L Nelson.,Antibodyfragments,MAbs.2010Jan-Feb；2(1):77-83)。此外，最主要的情况是存在Fc融合蛋白的不止一个降解途径。通常，虽然一种使针对一种降解途径的分子稳定化的配制条件可能会刺激另一种降解途径。因此，为Fc融合蛋白药物建立理想的制剂组合物是既相当具有重要性又相当具有挑战性的。
制剂开发需要确定分子的物理和化学降解途径。一旦确定了关键的降解途径，制剂科学家的目的是开发制剂缓冲剂的理想组合物，其包含缓冲剂、稳定剂和/或表面活性剂。
Fc融合蛋白针对化学和物理降解的稳定性通常在狭窄的pH范围内最大化(S.M.Chamow,T.Ryll,B.H Lowman,and D.Farson,Eds.,Therapeutic Fc-FusionProteins,Wiley-Blackwell:Hoboken,NJ,2014)。因此，筛选最佳pH非常重要。除pH值外，稳定剂如糖(蔗糖、海藻糖和/或多元醇)也是Fc-缀合物制剂的重要组分(Gokarn etal.Excipients for Protein Dugs,Excipient Development for Pharmaceutical,Biotechnology,and Drug Delivery,2006)。另外，表面活性剂，例如聚山梨酯，在蛋白质制剂中也起重要作用。它们是与蛋白质结合竞争界面的表面活性剂，因此降低界面张力及其对蛋白质结构的危害(T.A.Khan,H-C.Mahler,R.S.K.Kishore,Eur.J.Pharm.Biopharm；2015Nov 97:60-67)。
已知在基于蛋白质的疗法中的聚集发生在以下的每个阶段：产生、配制、储存、运输并且甚至在施用期间。照此蛋白质聚集对生物制药业来说是相当重大的问题，且尽管近年来取得巨大技术上进步；它仍然持续是发展的主要障碍。因此，预测、最小化、限制和/或逆转蛋白质聚集的能力对于生物治疗药物的可行制造和配制至关重要。不幸地，对聚集的控制是一个相当大的挑战，因为聚集机制遵循许多途径。虽然已经积累很多聚集机制的知识，目前还不可能可靠地预测蛋白质的聚集倾向。然而，目前的聚集模型已经确定控制稳定性的两个因素：一个是胶态稳定性，并且另一个是构象稳定性。
胶态稳定性取决于溶液中蛋白质分子间的排斥的和吸引的分子间相互作用的平衡。构象稳定性被定义为蛋白质分子在折叠态和非折叠态之间自由能中的差异。因此，目前用于预测蛋白质聚集倾向的技术是基于对构象稳定性和胶态稳定性的评估。这些包括基于在电脑中序列/结构的预测和对作为构象稳定性指标的聚集起始(Tm)的测定以及对作为胶态稳定性的量度的渗透第二维里系数(A2)的测定。
为了本发明，针对独特的且起源药物分子hy-Fc融合的G-CSF的特定需求进行了系统性研究。为了提供允许能够保留活性物质的化学和生物物理完整性的具有稳定的液体制剂的长效G-CSF缀合物，发明了包含处于一定pH范围中的缓冲剂、稳定剂、表面活性剂和/或有机部分的制剂。
在本发明中，基于色谱纯度和电泳纯度、A2、和Tonset值评估了杂合Fc融合的G-CSF的稳定制剂，并且选择这些稳定的制剂。用实例证明所选制剂的长期稳定性。
对问题的描述
将如本文所述的制剂类型开发成融合的药物是特别的挑战，其中平台需要与所融合的活性物质之一不同的化学或生物物理稳定性比率。在本发明中，还应注意，hy-Fc融合平台(EP 20080766022，US 8586038B2)是独特的且是起源分子，并且与其他常规Fc平台不同，因此需要不同的溶液用于建立其稳定性。特别地，其他常规Fc平台通常包括IgG2或类似的免疫球蛋白的Fc区，并且药物与该单个免疫球蛋白的Fc区直接融合。然而，hy-Fc平台是IgD和IgG亚类的组合，其中免疫球蛋白Fc部分本身形成融合物，并且药物与该免疫球蛋白部分的融合物构成第二融合物。在这方面，本文解释的所有发明对所描述的hy-Fc-G-CSF药物是完全特异的，并且已经根据对该独特分子的稳定性的特定需求进行了开发(US8586048B2)。
为了在本发明中使用，hy-Fc平台和G-CSF具有人源化生物体的氨基酸序列。没有使用额外的融合反应，因为在IgD和IgG之间以及在G-CSF和免疫球蛋白部分之间的融合物是通过单一遗传密码和单一转录-翻译反应提供的。G-CSF和hy-Fc平台之间的肽键是经由脯氨酸-精氨酸的。hy-Fc融合的G-CSF单体的氨基酸序列如下。信号、G-CSF、N-末端和hv-Fc序列以相应的格式表示。hy-Fc融合的G-CSF的示意性蛋白质结构如图1所示。
Figure BDA0002757686280000051
在本发明中发现，分子的稳定性主要受G-CSF连接位点处在较低pH值(pH<5.0)下的水解以及在高pH值(pH>6.5)下二硫化物改组(shuffling)的影响并且倾向于在G-CSF连接位点处在较低pH值(pH<5.0)下水解以及在高pH值(pH>6.5)下二硫化物改组。G-CSF具有由同源半胱氨酸残基和在位置17处的额外半胱氨酸残基形成的两个二硫键，其不能参与分子内二硫键。这些分子中的二硫键稳定结构，并且使其对相对严酷的处理(一些蛋白酶、高温、变性溶剂、极端pH)具有抗性，这在二硫键还原后确实导致变性(Nicos A.Nicola,Thewaiter and Eliza Hall Institute of Medical Research,"Granulocyte ColonyStimulating Factor",p.77-100)。
额外地，内部研究表明，hy-Fc融合的G-CSF在pH 5.3-6.0之间不可溶或几乎不可溶，并且已知G-CSF本身在pH 4.0左右是稳定且有活性的(T.Arakawa,S.J.Prestrelski,L.O.Narhi,T.C.Boone,W.C.Kenney,Cysteine 17of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor is partially solvent-exposed,J.Protein Chem.12(1993)525-531)。因此，一旦已经确定导致降解的关键途径，目的就是确保活性Fc融合分子的长期稳定性。
发明描述
因此，本发明的焦点是提供液体制剂组合物，其包含经由肽键与杂合Fc(hy-Fc)(单克隆抗体样平台)融合的长效G-CSF分子。针对重组人G-CSF-hyFc发明的制剂应特别具有合适的pH、稳定剂、表面活性剂和/或有机溶剂，以使G-CSF和hy-Fc平台之间以及hy-Fc平台本身之间的连接都具有高稳定性，而不会干扰G-CSF活性和hy-Fc平台的功能。
“稳定的”制剂或药物产品是这样的制剂或药物产品，其中的G-CSF分子在储存时基本上保留其生物物理和化学稳定性及完整性。G-CSF分子制剂的稳定性可以在所选的时间段后在所选的温度下进行测量。
本领域技术人员将意识到，hy-Fc融合的G-CSF分子的稳定性高度依赖于其制剂，并因此对于药物产品的稳定性是基本的以在储存时保护其物理和化学完整性。Fc融合的G-CSF分子的纯度、生物物理特性和功效的变化是稳定性的主要指标，因此应在选定的温度下按一定的时间间隔进行监测。
本发明通过缓冲剂和/或表面活性剂和/或稳定剂和/或有机溶剂的理想组合，使得发明用于hy-Fc融合的G-CSF药物的制剂。
根据本发明的液体制剂包含稳定形式的杂合Fc融合的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)制剂，其包含(i)治疗有效量的杂合Fc融合G-CSF；(ii)缓冲剂系统；(iii)至少一种稳定剂；和(iv)至少一种表面活性剂；和(v)任选地作为有机溶剂的丙二醇，其中制品的pH值在3.8和6.5之间，优选地在4.0和4.6之间。
术语“治疗有效量”是指当向活对象施用时，在活对象上达到期望效果的量。典型地，G-CSF的治疗有效量(Neulasta EMA document)是6mg/单次使用。杂合Fc融合的G-CSF的治疗有效量是50-400mcg/kg，优选150-250mcg/kg，而杂合Fc融合的G-CSF内的G-CSF的治疗有效量是20-160mcg/kg，优选50-100mcg/kg。为提供该治疗效果，在本发明中使用的稳定形式的杂合Fc融合的G-CSF的浓度大约是10mg/mL至80mg/mL，并且优选大约是20mg/mL至40mg/mL。
“稳定剂”促进多肽组分的稳定性，从而维持它们的治疗有效性。糖或糖醇还可以包含在本发明的含稳定化的液体多肽的药物组合物中。可以使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖(包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、右旋糖酐、普鲁兰多糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na)。糖醇被定义为具有—OH基团的C4-C8烃，并且包括例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。以上提及的糖或糖醇可以单独使用或组合使用。只要糖或糖醇在液体制品中可溶并且不会不利地影响使用本发明的方法获得的稳定效果，对所使用的量就没有固定的限制。优选地，基于液体制剂的总体积，糖或糖醇的浓度在约1.0w/v％和约15.0w/v％之间，优选在约2.0w/v％和约10.0w/v％之间，更优选在3.0w/v％和7.0w/v％之间。在本发明中，稳定剂是山梨糖醇，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比在3:2至7:2之间，优选为5:2。
术语“缓冲剂系统”是指这样的一种或多种组分，当添加到水溶液中时能够在添加酸或碱时或在用溶剂稀释时保护溶液免受pH的变化。因此，在液体制剂中缓冲溶液在稳定hy-Fc-G-CSF中起重要作用。可以使用乙酸盐、磷酸盐、甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、三-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)缓冲剂等，在这种情况下，钠、钾或铵离子可以用作平衡离子。以上提及的缓冲剂可以单独使用或组合使用。“酸”是在水溶液中产生氢离子的物质。“药学上可接受的酸”包括在其配制的浓度和方式中无毒的无机酸和有机酸。“碱”是在水溶液中产生羟基离子的物质。“药学上可接受的碱”包括在其配制的浓度和方式中无毒的无机碱和有机碱。在本发明中，选择包含三水乙酸钠和乙酸/氢氧化钠的缓冲剂系统。
“表面活性剂”是包含疏水部分(例如烷基链)和亲水部分(例如羧基基团和羧酸根基团)两者的表面活性分子。可以将表面活性剂添加到本发明的制剂中。适合用于在本发明制剂中的表面活性剂选自由以下组成的组：基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂和基于泊洛沙姆(poloxamer)的非离子型表面活性剂或其组合。本发明的液体制剂可以包含作为非离子型表面活性剂的山梨糖醇，基于液体制剂的总体积，其浓度优选为从0.08％(w/v)至0.15％(w/v)。
“有机溶剂”在本文中是指丙二醇(PG)，一种半极性组分，旨在通过减少蛋白质内/周围的含水量，来减少在低pH下发生的酸介导的水解反应。丙二醇或1,2-二羟基丙烷或1,2-丙二醇是澄清、无色、粘性，特别是无气味的液体，其在20℃下密度为1.038g/cm3，并且分子量为76.095。它可与水、丙酮和氯仿混溶以及混溶于水、丙酮和氯仿。PG专论包括在PhEur，USP和JP中；并且通常被用作在各种药物中的赋形剂；并且还在食品和化妆品中得到批准(Background review for the excipient propylene glycol EMA/CHMP/334655/2013)。本发明的液体制剂可以包含作为有机溶剂的丙二醇，基于液体制剂的总体积，其浓度为20％(v/v)或更低。
用于选择本发明的理想Fc融合的G-CSF制剂的方法：
药物产品的pH可以通过在USP<791>中描述的电位分析确定。
每个样品的浓度可以经由UV测试根据各自在280、320、325、330、335、340、345、350nm下的吸光度测量来确定。从在280nm下的总吸光度中减去(在320、325、330、335、340、345、350nm的)吸光度归结于光散射。可以通过应用具有校正吸光度和消光系数值为1.03ml/cm*g的Lambert-Beer方程来计算测试溶液中的蛋白质浓度。
差示扫描量热法可以是用于确定蛋白质的热力学稳定性的技术。它测量在加热或冷却期间从溶液中的生物分子吸收或释放的热量。天然蛋白质通过在特征温度(Tonset)下解折叠(热变性)对加热应答。Nano DSC，TA仪器(New Castle,美国)可以是确定溶液中蛋白质和其他大分子的变性温度和变性焓的优选方法，其具有多功能性和精确度来进行分子稳定性筛选。为此，将样品在相应的制剂缓冲剂中透析，并稀释至1mg/mL，用于在DSC仪器中进一步使用。扫描速率为1℃/min加热和冷却，其温度范围是20-100℃。
组分梯度多角度静态光散射(GC-MALS)可用于通过处于不同浓度下的它们的光散射行为的变化来确定溶液中蛋白质分子之间的相互作用。用一系列的光散射测量可以计算第二维里系数A2，其是评估分子相互作用的特征参数。Calypso II CG-MALS系统，WyattTechnology Europe(Dernbach,德国)用于向MALS检测器提供分析物的浓度梯度。将样品加样到系统的一个注射器泵上，并且将透析缓冲剂加样到系统的另一个注射器泵上。通过用透析缓冲剂稀释样品，在每次测量中采用从5mg/mL至0.5mg/mL的十个等距浓度步骤。在每个梯度步骤中，将1ml的样品注入MALS检测器中。在180秒的时间段内记录所得的光散射信号。用Calypso软件版本2.1.3可以进行Zimm图分析。
根据欧洲药典，可以使用2100AN浊度计(Hach Lange,Düsseldorf,德国)确定样品的浊度。通过将硫酸肼和六亚甲基四胺混合以制备主要的乳白悬浮液，并然后进一步稀释乳白标准来完成对系统的校准。检测器测量自样品以90°角散射的光以及样品前面的反射光连同直接穿过样品的透射光。测量的结果以NTU给出，它是所测量的90°角散射光与反射值和透射值的组分的总和的比率。
用于校准浊度计的参考溶液的制备。
Figure BDA0002757686280000081
为测试分子的特性和纯度，就分子量和等电点而言监测hy-Fc融合的G-CSF的电泳性质。
可以针对hy-Fc融合的G-CSF进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，以将分子量与内部参考标准品之一进行比较。使用去离子水，将药物产品和内部参考标准品稀释至500μg/mL，并使用
Figure BDA0002757686280000082
LDS样品缓冲剂(4X)和去离子水将其制成3μg/20μL。将其加样到
Figure BDA0002757686280000083
Novex 4-12％Bis-tris凝胶(1.0mm,10个孔)上用于电泳。可以使用等电聚焦凝胶电泳鉴定相对于内部参考标准品的hy-Fc融合的G-CSF的等电点范围。使用去离子水将药物产品和内部参考标准品稀释至1mg/mL，并使用
Figure BDA0002757686280000084
IEF样品缓冲剂2X)制成10μg/20uL。使用
Figure BDA0002757686280000085
pH 3-10IEF凝胶1.0mm，10个孔进行等电点聚焦。
就单体特性和疏水特性而言，hy-Fc融合的G-CSF的纯度可以用液相色谱技术分离和监测。
尺寸排阻色谱(SEC)可以是基于分子大小分离分子的优选方法，因此通过使用2695Alliance HPLC(Waters)可以分离高分子量种类(HMW)和降解的种类。当分子沿着色谱柱的长度而迁移时，通过差示分子排阻或纳入来实现分离。将药物物质稀释至1mg/mL，并使用TSK-GEL G3000SWxL(7.8*300mm)色谱柱和TSK-GEL G3000SWxL(6*40mm)(TOSOHBioscience)保护柱进行分离。流动相包含50mM磷酸盐缓冲剂：在与乙腈以9:1(v/v)的比率混合的1L去离子水中磷酸氢二钠5.34g、磷酸二氢钠3.12g、氯化钠8.76g，其中最终pH为7.0。将0.5mL/min的流速和214nm的检测波长应用30min。计算根据分析结果的主峰占总面积的面积％，其中输出表示单体纯度。
反相高效色谱法(RP-HPLC)可以是经由利用疏水性来分离它们而检查纯度的另一种方法。通过使用2695Alliance HPLC(Waters)，将RP-HPLC用于检查Fc融合的G-CSF变体和截短形式的杂质和保留时间。通过使用Vydac 214TP C4色谱柱(4.6*250mm)(Grace,Vydac)色谱柱和保护柱214MS C4，5μm,7.5×4.6mm(Grace,Vydac)分离在相应的制剂缓冲剂中浓度为1mg/mL的药物。流动相包含去离子水中的0.15％三氟乙酸(TFA)和乙腈中的0.15％TFA，流速为0.5mL/min。将220nm的检测波长应用35分钟，并监测根据分析结果的主峰占总面积的面积％。
通过以下实施例可以获得对本发明的更好理解，示出这些实施例是为了说明而不是构成对本发明的限制。这些实例描述在US 8586048B2中所述的包含全长hyFc融合的G-CSF的液体制剂的开发。
实施例1：选择hyFc-融合的G-CSF制剂的理想pH和缓冲剂组分
在已知有活性的情况下，缓冲试剂对于保持蛋白质的目标pH和稳定性是有必要的。对于本发明的液体制剂，首先通过测量变性起始(Tonset)作为构象稳定性的指标并确定渗透第二维里系数(A2)作为胶态稳定性的量度来筛选缓冲剂。
在本发明中，为使样品复合，通过透析制备制剂。将药物物质填充到预处理的透析管中，并在制剂缓冲剂中孵育2小时。2小时后，更换制剂缓冲剂，并将样品在新鲜缓冲剂中孵育2小时。通过将样品在新鲜的制剂缓冲剂中孵育过夜来完成透析。透析后，从透析管中取出样品，并检查pH值和样品浓度。必要时，用医药级酸或碱调节pH值。必要时，通过稀释或经由超滤的浓缩来调节浓度。
初步的实验室规模测量是借助制剂筛选研究完成的，以在如下各项中监测20mg/mL的hy-Fc融合的G-CSF的由组分梯度多角度静态光散射(CG-MALS)方法测量的胶态稳定性以及由差示扫描量热仪(DSC)测量的热力学性质：在pH 3.8、4.2、4.6和5.2下的10mM乙酸钠；在pH 5.2、6.5和7.0下的10mM组氨酸-盐酸；在pH 6.5和7.5下的10mM磷酸钠；在pH 6.5和7.0下的10mM组氨酸-乙酸盐；在pH 7.5下的10mM Tris-盐酸和在pH 7.5下的10mM Tris-乙酸盐。
表1.在不同pH和缓冲剂组分中对20mg/mL hy-Fc融合的G-CSF的构象稳定性和胶态稳定性的评估
Figure BDA0002757686280000091
Figure BDA0002757686280000101
根据在表1中所示的结果，观察到pH增加使Tonset值增加，并且在所有pH条件下Tonset值高于40℃。在另一方面，在pH 5.2(使用Na/乙酸盐，His/HCl缓冲剂)，pH 6.5(使用NaPO4缓冲剂)下发现A2值为负。负的A2值表示胶态不稳定性。接近hy-Fc-融合的G-CSF的pl值(pH5.3-6.0)，观察到分子之间的排斥相互作用以及甚至吸引相互作用更小。在从6.5至7.0的pH范围内，显示组氨酸-盐酸和组氨酸-乙酸盐缓冲剂系统中比磷酸钠系统中的胶态稳定性更高。因此，在本发明中，基于A2值和Tonset值，显示pH条件为3.8(Na/乙酸盐)、4.2(Na/乙酸盐)、4.6(Na/乙酸盐)、6.5(His/乙酸盐)和7.5(His/乙酸盐)有利于hy-Fc融合的G-CSF的胶态稳定性和热力学稳定性。
实施例2：氯化钠添加对hyFc融合的G-CSF制剂的稳定性的评估
基于实施例1中提供的结果，使用pH 4.2的Na/乙酸盐缓冲的制剂和pH 6.5的His/乙酸盐缓冲的制剂，在进一步研究中对其他制剂赋形剂对所选制剂的Tonset和A2值的影响进行研究。在本研究中，选定硅化容器作为封装系统。在层流下，将预灭菌的1mL油硅化玻璃注射器填充有样品。用加塞机放置塞子。首先，为了评估对稳定性的张力(tonicity)影响，向制剂中添加150mM氯化钠的盐组分。然后如上所述评估胶态稳定性和构象稳定性。
表2.在含有150mM氯化钠的制剂中20mg/mL hyFc融合的G-SF的构象稳定性和胶态稳定性评估
Figure BDA0002757686280000102
然而，添加氯化钠导致高离子强度对热力学稳定性没有明显的影响。根据表2所示的结果，氯化钠的添加导致A2值的降低。这些值表明，由于减少的现有排斥相互作用，并且对构象稳定性没有明显的影响，较高的等渗强度是不利的。因此，本发明的制剂不包含盐组分。
实施例3：山梨糖醇添加对所选hFc融合的G-CSF制剂的稳定性的评估
山梨糖醇在其他候选物中被评估为稳定剂候选物，因为许多其他候选物在长期在低pH值下是不稳定的。将山梨糖醇(5％)添加到制剂中，并然后测量Tonset和A2值。
表3.在含5％山梨糖醇的制剂中对20mg/mL hy-Fc融合的G-CSF的构象稳定性和胶态稳定性的评估
Figure BDA0002757686280000111
根据表3所示的结果，山梨糖醇的存在显示出在pH 4.2下轻微的构象稳定作用，而在pH 6.5下没有作用。因此，在本发明中，需要稳定剂来实现所期望的胶态稳定性和热稳定性。本发明中优选的稳定剂是5％的医药级山梨糖醇。
实施例4：评估表面活性剂对所选制剂的影响
为确定理想的表面活性剂，将0.1％的泊洛沙姆188(P188)或0.02％的聚山梨酯20(PS20)或0.02％的聚山梨酯80(PS80)添加至在pH 4.2下的10mM乙酸钠和在pH 6.5下的组氨酸-乙酸盐的具有5％山梨糖醇的制剂中。将表4中列出的这些液体hFc融合的G-CSF制剂在40℃下进行加速稳定性研究2周，以确定蛋白质在其保质期内的潜在稳定性。这些加速研究通常在高于建议的储存条件的温度下进行，以及然后将数据用于估计假设Arrhenius动力学的情况下对于降解反应的活化能(Cleland等人.,Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 10(4):307-377(1993))。然后将活化能用于计算蛋白质制剂在建议的储存条件下的预期保质期。额外地，在冻融应激下对制剂(表4)的稳定性进行评估。就分子量和等电点而言，针对浊度、单体纯度和疏水纯度以及电泳性(electrophoreticity)监测稳定性。
表4.用于确定20mg/mL含hyFc融合的G-CSF的制剂的理想表面活性剂的制剂矩阵。
Figure BDA0002757686280000112
Figure BDA0002757686280000121
结果表明，所有制剂对冻融应激均稳定(表5-10)。另外，本研究的一个实施方案为在加速稳定性条件下(40℃，2周)，含有泊洛沙姆188(P188)的制剂显示出比含有聚山梨酯20(PS20)和聚山梨酯80(PS80)的制剂和对照制剂具有更高的稳定性(表5-10)。因此，包括在本发明中的泊洛沙姆188或普朗尼克F68(Pluronic F68)作为表面活性剂，以在储存期间和运输条件期间使hyFc融合的G-CSF的聚集风险最小化。
表5.在40℃下2周并且在冻融应激下的F1-F4的浊度结果，n＝4。
Figure BDA0002757686280000122
表6.在40℃下2周并且在冻融应激下的F5-F8的浊度结果，n＝4。
Figure BDA0002757686280000123
Figure BDA0002757686280000131
表7.通过SEC-HPLC确定的在40℃下2周并且在冻融应激下的F1-F4的单体含量百分比，n＝4。
Figure BDA0002757686280000132
表8.通过SEC-HPLC确定的在40℃下2周并且在冻融应激下的F5-F8的单体含量百分比，n＝4。
Figure BDA0002757686280000133
表9.通过RP-FIPLC确定的在40℃下2周并且在冻融应激下的F1-F4的疏水性含量百分比，n＝4。
Figure BDA0002757686280000134
表10.通过RP-FIPLC确定的在40℃下2周并且在冻融应激下的F5-F8的疏水性含量百分比，n＝4。
Figure BDA0002757686280000141
在相同的研究中，在pH 4.2制剂及其亚变体中，主要的降解产物是最有可能由于水解而形成的片段。在pH 6.5下并且发现了由于二硫化物改组的其亚变体共价结合的聚集物(图2和图3)。
实施例5：对所选制剂的优化和长期评估
选择制剂2(表4)作为经筛选的制剂中最稳定的制剂，并编码为制剂2A。在另一方面，许多研究表明，制剂pH的微小变化可能对于制剂的稳定性至关重要。为确定经确定的制剂的pH改变效果和长期稳定性，分别在变化的pH 4.2和4.6下制备表11(制剂2A)和表12(制剂2B)中列出的制剂。在此，通过添加药学上可接受的酸或碱而获得pH的改变。在此，优选的酸是乙酸，并且优选的碱是氢氧化钠。
表11.制剂2A的组成，在pH 4.2下缓冲。
Figure BDA0002757686280000142
*量子饱和度
表12.制剂2B的组成，在pH 4.6下缓冲。
Figure BDA0002757686280000143
Figure BDA0002757686280000151
*量子饱和度
在稳定性研究之前，检测经制备的制剂的热力学稳定性和胶态稳定性(表13)。
表13.制剂2A和2B的胶态特性和热力学特性
Figure BDA0002757686280000152
EMEA的稳定性指南表示，如果在要求储存期超过六个月的情况下，则在提交时至少应提交六个月的稳定性数据。因此，实时实际条件的稳定性测试在2-8℃下进行，加速稳定性测试在25℃下进行6个月。结果在表14-17中给出。
表14.在2-8℃下通过SEC-HPLC确定的制剂2A和2B的单体含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000153
表15.在25℃下通过SEC-HPLC确定制剂2A和2B的单体含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000154
表16在2-8℃下通过RP-HPLC确定制剂2A和2B的疏水性含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000155
Figure BDA0002757686280000161
表17.在25℃下通过RP-HPLC确定制剂2A和2B的疏水性含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000162
显示在实时和实际温度条件下，发现制剂2A和2B在至少6个月是稳定的(表14-17)。因此，在本发明中，揭示出在pH 4.2和4.6下的制剂均在实时-实际稳定性和加速条件下为hy-Fc融合的G-CSF提供长期稳定性。
实施例6：评估有机溶剂对hy-Fc融合的G-CSF制剂的稳定性的影响
本发明的制剂通过使用有机溶剂丙二醇(PG)导致开发经改进的制剂，以克服通过裂解其G-CSF分子进一步分解而降解。
在制剂开发期间，对pH和丙二醇的存在对hy-Fc融合的G-CSF稳定性的影响进行评估(表18)。
表18.评估pH和丙二醇的存在对20mg/mL的Hy-Fc融合的G-CSF稳定性影响的研究矩阵。
Figure BDA0002757686280000163
在pH为4.2和4.6的10mM乙酸钠缓冲剂中研究hy-Fc融合的G-CSF的稳定性，所述缓冲剂包含0.01％普朗尼克F-68、5％山梨糖醇并且具有或不具有10％PG或20％PG。将包含20mg/mL活性成分的样品在25℃和2-8℃下放置6个月。在稳定性研究之前，检查制剂的可注射性以及热力学稳定性和胶态稳定性(表19)。
表19.有机溶剂交换后制剂2A和2B的胶态特性和热力学特性。
Figure BDA0002757686280000171
作为本研究的一个实施方案是，对于所有制剂的推出力均低于10N，并因此对于通过注射施用的药物是可良好接受的。与不具有丙二醇的制剂相比，含丙二醇的制剂显示出略高的推出力。pH对结果没有影响。
根据表19的结果，hy-Fc融合的G-CSF的胶态稳定性在较低pH下更高。10％丙二醇的存在略微增加排斥性蛋白质相互作用，从而增加胶体稳定性，而20％丙二醇则不会。在低pH下，hy-Fc融合的G-CSF的热力学稳定性也略高。
作为另一个实施方案中，相同的研究表明，hy-Fc融合的G-CSF的主要降解途径是化学降解和片段化，因为数据表明单体水平的下降是由于升高的低分子量杂质的增加(表21)。在相同研究中未观察到由于hy-Fc融合的G-CSF的二硫化物改组而聚集。
作为相同研究的最终实施方案，表明丙二醇的添加对化学稳定性具有有益作用，如通过加速稳定性数据所示(表20-23)。然而，20％PG降低热力学稳定性(表19)，并因此其中优选添加10％PG。
表20.在2-8℃下通过SEC-HPLC确定的20mg/mL hy-Fc融合的CSF的单体含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000172
表21.在25℃下通过SEC-HPLC确定的20mg/mL hy-Fc融合的CSF的单体含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000173
Figure BDA0002757686280000181
表22.在2-8℃下通过RP-HPLC确定的20mg/mL hy-Fc融合的CSF的疏水性含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000182
表23.在25℃下通过RP-HPLC确定的20mg/mL hy-Fc融合的CSF的疏水性含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000183
在实时，实际温度和加速条件下，发现在表18中列出的制剂的稳定性持续至少6个月。并且PG的添加对制剂的化学稳定性具有有益作用。因此，PG的存在可能是克服通过G-CSF的裂解而降解的机会，因为可以由FtP-HPLC监测的在25℃下的疏水性纯度变化来解释(表23)。因此，在本发明中，作为有机物的20％或更少的PG的添加揭示在实时、实际温度和加速条件下进一步增强hy-Fc融合的G-CSF的长期稳定性。
实施例7：进一步评估pH对hy-Fc融合的G-CSF制剂的实时稳定性的影响
为全面研究pH对hy-Fc融合的G-CSF的实时稳定性的影响，在pH 4.0和pH 4.4的具有和不具有10％丙二醇PG的制剂(表19)在2-8℃下研究6个月。
在pH为4.0和4.4的10mM乙酸钠缓冲剂中，研究20mg/mL活性成分的Hy-Fc融合的G-CSF，所述缓冲剂包含0.01％普朗尼克F-68、5％山梨糖醇，含或不含10％PG。
表24.制剂2C的组成，在pH 4.0下缓冲。
Figure BDA0002757686280000191
*量子饱和度
表25.制剂2D的组成，在pH 4.4下缓冲。
Figure BDA0002757686280000192
*量子饱和度
表26.评估pH和丙二醇的存在对20mg/mL的Hy-Fc融合的G-CSF稳定性影响的研究矩阵。
Figure BDA0002757686280000193
表27.在2-8℃下通过SEC-HPLC确定的20mg/mL hy-Fc融合的CSF的单体含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000194
Figure BDA0002757686280000201
表28.在2-8℃下通过RP-HPLC确定的20mg/mL hy-Fc融合的CSF的疏水性含量百分比，(n＝2)。
Figure BDA0002757686280000202
作为本发明的实施方案，揭示hy-Fc融合的G-CSF在选定的条件下是稳定的，用SEC-HPLC、RP-HPLC、SDS-PAGE和Gel-IEF分析来证明(表27-28，图4-5)。在本研究中没有观察到聚集物也没有观察到hy-Fc融合的G-CSF的裂解形式。因此，在本发明中，揭示出在pH4.0和4.4下的制剂均在实时，实际温度和加速条件下为hy-Fc融合的G-CSF提供长期稳定性。
表29.hy-Fc融合的G-CSF 20mg/mL溶液的组成
Figure BDA0002757686280000203
*量子饱和度
总而言之，如本文所用，如表29所述的杂合Fc融合G-CSF制剂显示出在3.8-6.5(优选4.0-4.6)之间的pH范围内是稳定的。本文中，在本发明中，制剂包含缓冲剂系统、表面活性剂、稳定剂和/或作为有机溶剂的PG。
在本发明中，缓冲剂系统可以包含三水乙酸钠盐和乙酸/氢氧化钠。
基于液体制剂的总体积，本发明可以包含优选浓度为0.08w/v％至0.15w/v％的作为表面活性剂的山梨糖醇，和优选浓度为3.0w/v％和7.0w/v％的作为稳定剂的山梨糖醇，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比在3:2至7:2之间，优选为5:2。
基于液体制剂的总体积，本发明可以包含20v/v％或更少的PG(Sigma,Switzerland)，优选10v/v％或更少的PG，以便于在酸性pH下减少有助于通过水解方式促进G-CSF的裂解过程的水含量。
附图说明
图1.hy-Fc融合的G-CSF的示意性蛋白质结构
图2.测试二硫化物改组。在还原和非还原条件下对变体#F5和#F6的样品(在40℃下储存2周)进行分析。泳道1：标记物，泳道2：GX-G3 Ref非还原的，泳道3：#F5非还原的，泳道4：#F6非还原的，泳道5：空，泳道6：标记物，泳道7：#F5还原的，泳道8：#F6还原的，泳道9：参考还原的，泳道10：标记物。
图3.在40℃下SDS-PAGE热应激2周；泳道1：参考，泳道2：标记物，泳道3-6：#F3，泳道7-10：#F4。
图4.在2-8℃下在t＝6个月的SDS-PAGE分析：泳道1,9：标记物，泳道2、5、6:参考，泳道3:#F2C，泳道4:#F2C+10％PG，泳道7:#F2D，泳道8:#F2D+10％PG，泳道10:空。
图5.在2-8℃下在t＝6个月的Gel-IEF分析：泳道1,9：标记物，泳道2、5、6:参考，泳道3:#F2C，泳道4:#F2C+10％PG，泳道7:#F2D，泳道8:#F2D+10％PG，泳道10:空。

Claims (29)

1.一种稳定的杂合Fc融合G-CSF制剂，其包含治疗有效量的杂合Fc融合G-CSF，其中所述制剂的pH值在3.8和6.5之间。
2.根据权利要求1所述的制剂，优选地所述制剂的pH值在4.0和4.6之间。
3.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含至少一种稳定剂、缓冲剂系统和至少一种表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述缓冲剂选自由以下组成的组：乙酸盐、磷酸盐、甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、三-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)缓冲剂或其组合。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述缓冲剂系统包含三水乙酸钠和乙酸/氢氧化钠。
6.根据权利要求3所述的制剂，其中所述稳定剂选自由以下组成的组：山梨糖醇、甘露糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇或其组合。
7.根据权利要求6所述的制剂，所述稳定剂是山梨糖醇。
8.根据权利要求7所述的制剂，其中基于所述制剂的总体积，所述山梨糖醇的浓度为从3.0w/v％至7.0w/v％。
9.根据权利要求7所述的制剂，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比在3:2至7:2之间。
10.根据权利要求9所述的制剂，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比优选是5:2。
11.根据权利要求3所述的制剂，其中所述非离子型表面活性剂是基于聚山梨酯或基于泊洛沙姆的非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂选自由以下组成的组：泊洛沙姆188、聚山梨酯20和聚山梨酯80或其组合。
12.根据权利要求11所述的制剂，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆188。
13.根据权利要求12所述的制剂，其中基于液体制剂的总体积，泊洛沙姆188的浓度为从0.08w/v％至0.15w/v％。
14.根据权利要求1所述的制剂，其中杂合Fc融合的G-CSF的浓度在从10mg/mL至80mg/mL的范围内。
15.根据权利要求14所述的制剂，其中杂合Fc融合的G-CSF的浓度优选在从20mg/mL至40mg/mL的范围内。
16.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含作为有机溶剂的丙二醇。
17.根据权利要求16所述的制剂，其中基于液体制剂的总体积，丙二醇的浓度为20v/v％或更低。
18.根据权利要求17所述的制剂，其中基于液体制剂的总体积，优选丙二醇的浓度为10v/v％或更低。
19.一种稳定的杂合Fc融合G-CSF制剂，其包含：(i)治疗有效量的杂合Fc融合G-CSF，(ii)作为缓冲剂系统的三水乙酸钠和乙酸/氢氧化钠，其中所述制剂的pH值在约4.0和4.6之间。
20.根据权利要求19所述的制剂，其中所述制剂还包含作为稳定剂的山梨糖醇和作为表面活性剂的泊洛沙姆188。
21.根据权利要求19-20所述的制剂，其中杂合Fc融合的G-CSF的浓度在从10mg/mL至80mg/mL的范围内。
22.根据权利要求21所述的制剂，其中杂合Fc融合的G-CSF的浓度优选在从20mg/mL至40mg/mL的范围内。
23.根据权利要求20所述的制剂，其中基于所述制剂的总体积，所述山梨糖醇在3.0w/v％和7.0w/v％之间。
24.根据权利要求20所述的制剂，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比在3:2至7:2之间。
25.根据权利要求24所述的制剂，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比优选是5:2。
26.根据权利要求20所述的制剂，其中基于液体制剂的总体积，所述表面活性剂的浓度在从0.08w/v％至0.15w/v％的范围内。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含作为有机溶剂的丙二醇。
28.根据权利要求27所述的制剂，其中基于液体制剂的总体积，丙二醇的浓度为20v/v％或更低。
29.根据权利要求28所述的制剂，其中基于液体制剂的总体积，优选丙二醇的浓度为10v/v％或更低。
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