BRPI0808960A2 - Método para preservar partículas virais, excipiente para a preservação de partículas virais, uso de um excipiente, kit, método para preparar uma vacina, e, pó seco. - Google Patents

Description

“MÉTODO PARA PRESERVAR PARTÍCULAS VIRAIS, EXCIPIENTE PARA A PRESERVAÇÃO DE PARTÍCULAS VIRAIS, USO DE UM EXCIPIENTE, KIT, MÉTODO PARA PREPARAR UMA VACINA, E, PÓ SECO”

Campo da invenção

A invenção diz respeito a métodos de preservar partículas virais da degradação térmica e dessecação. A invenção também diz respeito a produtos compreendendo partículas virais preservadas.

Fundamentos da invenção

Algumas moléculas biológicas são suficientemente estáveis que elas podem ser isoladas, purificadas e depois armazenadas em solução na temperatura ambiente. Entretanto, isto não é possível para muitos materiais e técnicas envolvendo o armazenamento em temperatura baixa, adição de estabilizadores, secagem por congelamento, formação de vácuo e secagem ao ar foram experimentadas para garantir a auto-preservação. Não obstante da disponibilidade destas técnicas, alguns materiais biológicos ainda mostram níveis insatisfatórios de estabilidade durante o armazenamento e algumas técnicas levam a custo aumentado e inconveniência. Por exemplo, o transporte e armazenamento refrigerados são caros. Além disso, o transporte refrigerado frequentemente não está disponível para o transporte de medicamentos tais como vacinas em países no Terceiro Mundo.

Em particular, os estresses de secagem por congelamento ou liofilização podem ser muito prejudiciais a alguns materiais biológicos. A secagem por congelamento de produtos biofarmacêuticos envolve o congelamento de soluções ou suspensões de biomateriais termossensíveis, seguido por secagem primária e secundária. A técnica é fundamentada na sublimação da água na temperatura subzero sob vácuo sem a fusão da solução. A secagem por congelamento representa uma etapa chave para fabricar produtos farmacêuticos de proteína sólida e vacina. A taxa de difusão de vapor d’água do biomaterial congelado é muito baixa e portanto o processo é demorado. Adicionalmente, tanto os estágios de congelamento quanto de secagem introduzem estresses que são capazes de desdobrar ou desnaturar proteínas.

A WO-A-2006/0850082 relata um produto dessecado ou

preservado compreendendo um açúcar, um material carregado tal como uma proteína de histona e um componente biológico de dessecação ou termossensível. O açúcar forma uma matriz sólida amorfa. Entretanto, o histona pode ter conseqüências imunológicas se o componente biológico preservado for administrado a um ser humano ou animal.

Sumário da invenção

O presente inventor verificou que preparações virais misturadas com uma solução aquosa contendo um, dois ou mais açúcares e uma polietilenoimina (PEI) são preservadas na secagem tal como na secagem 15 por congelamento. A adição de um ou mais açúcares a uma preparação viral leva a alguma preservação de infectividade e/ou imunogenicidade virais. Entretanto, a adição de PEI juntamente com um ou mais açúcares surpreendentemente leva a preservação melhorada de infectividade e/ou imunogenicidade virais. Uma melhora particularmente preferida na 20 infectividade e/ou imunogenicidade é observada em concentrações relativamente baixas de PEI e concentrações relativamente altas de um ou mais açúcares.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um método para preservar partículas virais compreendendo:

(i) fornecer uma solução aquosa de um ou mais açúcares, uma

polietilenoimina e as ditas partículas virais em que a concentração de polietilenoimina é 15 μΜ ou menos com base na massa molar média numérica (Mn) da polietilenoimina e a concentração de açúcar ou, se mais do que um açúcar estiver presente, a concentração de açúcar total é maior do que 0,1M; e

(ii) secar a solução para formar uma matriz sólida amorfa compreendendo as ditas partículas virais.

A invenção fornece ainda:

- um produto preservado compreendendo partículas virais, um

ou mais açúcares e polietilenoimina, produto este que está na forma de um sólido amorfo;

- um excipiente para a preservação de partículas virais compreendendo:

(a) sacarose, estaquiose ou rafinose ou qualquer combinação

destes; e

(b) polietilenoimina em uma concentração com base em Mn de 5 μΜ ou menos;

- uso do excipiente para a preservação de partículas virais durante e depois da secagem por congelamento.

- um kit compreendendo o excipiente;

- uma vacina compreendendo o produto preservado e opcionalmente um adjuvante; um método para preparar uma vacina compreendendo partículas virais, o método compreendendo:

(a) fornecer uma solução aquosa de um ou mais açúcares, uma

polietilenoimina e as ditas partículas virais em que a concentração de polietilenoimina é 15 μΜ ou menos com base na massa molar média numérica (Mn) da polietilenoimina e na concentração de açúcar ou, se mais do que um açúcar estiver presente, a concentração de açúcar total é maior do que 0,1 M; e

(b) opcionalmente adicionar um adjuvante, tampão, antibiótico e/ou aditivo à mistura; e

(c) secar a solução para formar uma matriz sólida amorfa compreendendo as ditas partículas virais; e - um pó seco compreendendo partículas virais preservadas, obtenível pelo método da invenção.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o efeito de um excipiente composto de PEI, 5 sacarose (Suc) e rafinose (Raf) sobre a recuperação do Vírus da Febre Aftosa (FMDV-A) a seguir da secagem por congelamento e incubação durante 24 horas na temperatura ambiente (RT) ou tratamento térmico durante 48 a 37° C (HT). Os resultados também mostram que a solução salina tamponada com fosfato (PBS) não oferece nenhuma proteção durante a secagem por 10 congelamento (FD). Barras de erro mostradas são o erro padrão da média (n = 2)·

A Figura 2 mostra que PEI realça a recuperação de FMDV-O quando adicionado aos açúcares sacarose (Suc) e estaquiose (Stac). Os resultados obtidos pelo uso de um excipiente contendo PEI, Suc e Stac são 15 denotados por “Poli”. Os resultados obtidos pelo uso de um excipiente contendo Suc e Stac sem PEI são denotados por “Açúcar”. O efeito é observado com FMDV-O tratado com calor tanto durante 24 horas (“24h HT”) quanto 6 dias (“ódias HT”). Barras de erro mostradas são o erro padrão da média (n = 2).

A Figura 3 mostra que a concentração inicial de açúcar no

excipiente é importante em manter a estabilidade de FMDV-O. A diluição de uma solução de sacarose e estaquiose (120 Suc (3M):80 Stac (0,75M)) 1:10 em volume produz uma perda completa nos efeitos protetores de um excipiente apenas de açúcar. Barras de erro mostradas são o erro padrão da média (n = 3).

A Figura 4.1 mostra o efeito da razão de sacarose (Suc): estaquiose (Stac) sobre a recuperação de FMDV-O seco por congelamento HT com concentrações de PEI variadas. Os resultados mostram que a adição de Stac aumenta a estabilidade. Os resultados para cada concentração de PEI foram conferidos. A análise estatística usando um ANOVA de uma via seguido por um Teste de Turkey mostrou que uma mistura contendo toda a Suc obteve recuperação significativamente mais baixa do que uma contendo uma razão de SucrStac de 140:60 em volume.

Barras de erro mostram o erro padrão da média (n = 8).

A Figura 4.2 mostra o efeito da razão de Suc:Stac sobre a recuperação de FMDV-O seco por congelamento HT com concentrações variadas de histona (His) de acordo com WO-A2006/0850082. A histona foi histona 2A obtida da Boehringer Mannheim. Barras de erro mostradas são o erro padrão da média (n = 6).

A Figura 5 mostra o efeito da otimização das proporções de Suc/Stac/PEI sobre a recuperação de adenovírus. A formação de unidade de formação de placa (PFU) foi avaliada a seguir da secagem por congelamento durante 12 horas e tratamento térmico durante 24 horas. Os resultados 15 demonstram quando, usando os níveis mais altos de Stac, a PFU viral caiu rapidamente. Sem nenhuma Stac presente, PFU foi dramaticamente reduzida. Quando seca por congelamento com apenas PBS, não existiu nenhuma PFU. Diluições mais baixas de PEI também pareceram realçar a recuperação do vírus.

A Figura 6 mostra a recuperação de adenovírus em PEI e

açúcar. O excipiente com PEI e açúcar foram otimizados e comparados a 3 controles; açúcares apenas, PBS e o título original (antes da secagem por congelamento). A secagem por congelamento com PBS simplesmente não mostrou nenhuma termoproteção. Açúcares apenas mostraram alguma 25 atividade viral, entretanto, maior atividade foi observada usando PEI juntamente com o açúcar no excipiente. Barras de erro mostradas são o erro padrão da média (n = 2).

A Figura 7 mostra que um excipiente contendo Suc (1,5M)/Stac (0,125M) com PEI em uma concentração de 0,02 nM parece ótima e demonstra recuperação melhorada de adenovírus em apenas uma solução de Suc Stac sozinha. PEI como o único excipiente mostrou pouca a nenhuma proteção durante a secagem por congelamento.

A Figura 8 mostra os resultados de um experimento designado 5 para comparar dois PETS diferentes sobre a recuperação adenoviral. A PEI de peso molecular alto foi eficaz em uma concentração muito mais baixa do que a PEI de peso molecular baixo. PBS sozinha não mostrou nenhuma recuperação viral. Novamente concentrações de PEI/açúcar ideais mostram recuperação melhorada sobre os açúcares sozinhos.

A Figura 9 mostra uma comparação entre a diluição de PEI em

água (“PEIW”) e a diluição de PEI em PBS (“PEIP”). Os resultados mostraram títulos de adenovírus mais altos quando PEI é diluída em PBS em oposição á água. Quando usados como excipientes por si só tanto PBS quanto água destilada mostraram um nível muito baixo de recuperação de adenovírus.

Descrição detalhada da invenção Sumário

A presente invenção diz respeito à preservação de partículas virais contatando-se as partículas virais com uma mistura de preservação. A 20 mistura de preservação é uma solução aquosa de PEI e um, dois ou mais açúcares. Concentrações baixas de PEI e concentrações relativamente altas de açúcar são usadas. A solução em que as partículas virais estão presentes depois é seca para formar uma matriz sólida amorfa compreendendo as partículas virais.

A invenção permite assim que a estrutura e função virais sejam

preservadas durante a etapa de secagem. A atividade viral a seguir da secagem assim pode ser mantida. As partículas virais preservadas demonstram resistência térmica e à dessecação melhorada permitindo extensão da vida de prateleira, facilidade de armazenamento e transporte e tomando desnecessária uma cadeia fria para a distribuição. A invenção pode fornecer assim proteção como um crioprotetor (proteção contra dano no congelamento), lioprotetor (proteção contra dessecação) e/ou um termoprotetor (proteção contra temperaturas mais altas ou mais baixas do que 4o C).

Partículas virais

Tipicamente, um vírus integral ou vírion consiste de ácido nucleico circundado por um revestimento protetor de proteína ou capsídeo. Ácido nucleico viral pode compreender DNA, RNA, RNA de filamento único, RNA de filamento duplo, DNA de filamento duplo, mRNA ou qualquer combinação destes.

O capsídeo é composto de subunidades. Muitos capsídeos virais são compostos de subunidades que podem ter simetria icosaédrica ou helicoidal. Alguns tipos de vírus também incluem estruturas virais tais como 15 um nucleocapsídeo, estruturas extras tais como caudas de proteína e paredes externas complexas, e estruturas complexas tais como uma cabeça icosaédrica ligada a uma cauda helicoidal. O capsídeo também pode ser circundado por um envelope. O envelope é composto de bicamada de lipoproteína e pode conter material da membrana de uma célula hospedeira assim como aquela de 20 origem viral. Por exemplo, o envelope pode conter lipídeos derivados de célula e proteínas derivadas de célula. Vírus também podem conter picos de glicoproteína.

As partículas virais usadas na presente invenção podem ser vírus integrais tais como vírus vivos, vírus mortos, vírus vivos atenuados, 25 vírus inativos tais como vírus quimicamente inativos ou vírus virulentos ou não virulentos. Um vírus vivo é capaz de infectar e ser reproduzido pelo hospedeiro viral. Um vírus morto é inativo e é incapaz de infectar o hospedeiro viral. As partículas podem ser partículas semelhantes a vírus (VLPs) ou nucleocapsídeos. A partícula viral pode ser ou pode ser derivado de um vírus de dsDNA, um vírus de ssDNA, um vírus de dsRNA, um vírus de (+)ssRNA, um vírus de (-)ssRNA, um vírus de ssRNA-RT ou um vírus de dsDNA-RT. Como um exemplo mas não intencionado a ser limitante, a partícula viral pode ser ou pode ser derivada de um vírus das famílias seguintes:

- adenovírus tais como adenovírus humano A, B, C, D, E ou F incluindo sorotipos de Ad5, Ad2, Ad6, Ad24 humanos;

- calicivírus tais como o norovírus;

- coronavírus tais como coronavírus humano 299E ou OC43 e SARS-coronavírus;

- filovírus tais como vírus ebola;

- flavivírus tais como vírus da febre amarela, vírus da Febre do Nilo Ocidental, vírus da dengue, vírus da hepatite C;

- hepadnavírus tais como vírus da hepatite B;

- vírus da herpes tais como vírus da herpes simples, vírus da herpes humana 1, 3, 4, 5 ou 6;

- ortomixovírus tais como vírus da gripe A, B, C incluindo mas não limitado aos sorotipos do vírus da gripe A HlNl5 H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9H2, H7N2, H7N3 e N10N7;

- vírus do papiloma tais como vírus do papiloma humano;

- paramixovírus tais como vírus parainfluenza humano 1, vírus do sarampo e vírus da caxumba;

- parvovírus tais como vírus adeno-associado;

- picomavírus tais como poliovírus humano, vírus da febre aftosa (incluindo os sorotipos O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 e Asia-1);

- poxvírus tais como vírus da vacínia, vírus da varíola e poxvírus aviário (epitelioma contagioso);

- reovírus tais como grupo do vírus da língua azul;

- retrovírus tais como lentivírus incluindo vírus da imunodeficiência humana 1 e 2; e

- togavírus tais como vírus da rubéola.

Em uma forma de realização preferida, a partícula viral pode ser ou pode ser derivada de um adenovírus, ortomixovírus, parvovírus, picomavírus ou poxvírus. Em uma forma de realização particularmente preferida, a partícula viral pode ser ou pode ser derivada de um adenovírus, vírus da vacínia, vírus da gripe, ou vírus da febre aftosa.

Partículas semelhantes a vírus (VLPs) incluem proteínas virais derivadas das proteínas estruturais de um vírus, mas que carecem de ácido 10 nucleico viral. Quando superexpressadas, estas proteínas estruturais virais espontaneamente auto-agrupam em partículas. VLPs são incompetentes de replicação. Em algumas formas de realização, as VLPs são proteínas virais embutidas dentro de uma bicamada de lipídeo. Exemplos de VLPs incluem VLPs derivadas de fago, VLPs de proteína de capsídeo principal do vírus do 15 papiloma humano (HPV) LI, VLPs de proteína de capsídeo de Norovírus e VLPs montadas a partir de proteínas estruturais do vírus da gripe tais como proteína Ml, proteína de HA hemaglutinina e proteína de Nl neuraminidase.

Partículas virais podem ser preparadas usando técnicas padrão bem conhecidas àqueles habilitados no ramo. Por exemplo, um vírus pode ser 20 preparado infectando-se células hospedeiras cultivadas com a cepa do vírus que deve ser usada, permitindo infecção para progredir tal que o vírus duplica nas células cultivadas e pode ser liberado por métodos padrão conhecidos na técnica para colher e purificar vírus.

Mistura de preservação A mistura de preservação da presente invenção compreende

uma solução aquosa de um ou mais açúcares e uma polietilenoimina (PEI). Qualquer solução aquosa adequada pode ser usada. A solução pode ser tamponada. A solução pode ser uma solução de HEPES, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou água pura. Açúcares adequados para o uso na presente invenção incluem açúcares redutores tais como glicose, frutose, gliceraldeídos, lactose, arabinose e maltose; e açúcares não redutores tais como sacarose. O açúcar pode ser um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, ou outros oligossacarídeos. O termo “açúcar” inclui álcoois de açúcar.

Monossacarídeos tais como galactose, rafmose e manose; dissacarídeos tais como lactose e maltose; e tetrassacarídeos tais como estaquiose são considerados. Trealose, umbeliferose, verbascose, isomaltose, celobiose, maltulose, turanose, melezitose e melibiose também são adequados para o uso na presente invenção. Um álcool de açúcar adequado é manitol.

Preferivelmente, a solução aquosa de um, dois ou mais açúcares é uma solução de sacarose, rafmose ou estaquiose. Em particular, sacarose é um dissacarídeo de glicose e frutose; rafmose é um trissacarídeo composto de galactose, frutose e glicose; e estaquiose é um tetrassacarídeo que consiste de duas unidades de Da-galactose, uma unidade de Da-glicose e uma unidade de Dp-frutose seqüencialmente ligada. Uma combinação de sacarose e rafmose, ou de sacarose e estaquiose pode ser utilizada.

A preservação da infectividade ou imunogenicidade virais é particularmente eficaz quando pelo menos dois açúcares são usados na mistura de preservação da presente invenção. Portanto, a solução de um ou mais açúcares compreende uma solução de pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou pelo menos 5 açúcares. Combinações de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc açúcares são consideradas. Preferivelmente, a solução de dois ou mais açúcares compreende sacarose e rafinose, ou sacarose e estaquiose.

PEI é uma poliamina alifática caracterizada pelas unidades químicas de repetição denotadas como -(CH2-CH2-NH)-. Referência a PEI aqui inclui um homopolímero ou copolímero de polietilenoimina. O copolímero de polietilenoimina pode ser um copolímero aleatório ou de bloco. Por exemplo, PEI pode consistir de um copolímero de polietilenoimina e um outro polímero tal como polietileno glicol (PEG). A polietilenoimina pode ser linear ou ramificada.

Referência a PEI também inclui formas derivadas de uma polietilenoimina. Uma polietilenoimina contém átomos de nitrogênio em várias posições. Átomos de nitrogênio estão presentes em grupos de terminal amino, por exemplo, R-NH2, e em grupos internos tais como grupos que interrompem um grupo alquila ou alquileno dentro da estrutura polimérica, por exemplo, R-N(H)-R’, e na interseção de uma ramificação do polímero, por exemplo, R-N(-R’)-R” em que R, R’ e R” podem ser grupos alquileno por exemplo. Grupos alquila ou arila podem ser ligados aos centros de nitrogênio além de ou ao invés de átomos de hidrogênio. Tais grupos alquila e arila podem ser substituídos ou não substituídos. Um grupo alquila seria tipicamente um grupo alquila C1-C4, por exemplo, metila, etila, propila, isopropila, butila, sec-butila ou terc-butila. O grupo arila é tipicamente fenila. A PEI pode ser uma polietilenoimina que foi covalentemente

ligada a uma variedade de outros polímeros tais como polietileno glicol. Outras versões modificadas de PEI foram geradas e algumas estão disponíveis comercialmente: PEI ramificada 25 kDa, jetPEI®, LMW-PEI 5,4 kDa, PEI Pseudodendrimérica, PEI-SS-PEI, PEI-SS-PEG, PEI-g-PEG, PEG-co-PEI, 20 PEG-g-PEI, PEI-co-L lactamida-co-succinamida, PEI-co-N-(2-hidroxietiletileno imina), PEI-co-N-(2-hidroxipropil) metacrilamida, PEI-g-PCL-blocoPEG, PEI-SS-PHMPA, PEI-g-dextrano 10 000 e PEI-g-transferrina-PEG, Pluronic85®/Pluronic 123®-g-PEI.

PEI está disponível em uma ampla faixa de massas molares 25 médias numéricas (Mn) por exemplo entre 300 Da e 800 kDa. Preferivelmente, a massa molar média numérica está entre 300 e 2000 Da, entre 500 e 1500 Da, entre 1000 e 1500 Da, entre IOe 100 kDa, entre 20 e 100 kDa, entre 30 e 100 kDa, entre 40 e 100 kDa, entre 50 e 100 kDa, entre 60 e 100 kDa, entre 50 e 70 kDa ou entre 55 e 65 kDa. Uma PEI de Mn relativamente alta de aproximadamente 60 kDa ou uma Mn relativamente baixa de 1200 Da é adequada.

Preferivelmente, a massa molar média ponderada (Mw) de PEI está entre 500 Da e 1000 kDa. O mais preferivelmente, a Mw de PEI está entre 5 500 Da e 2000 Da, entre 1000 Da e 1500 Da, ou entre 1 e 1000 kDa, entre 100 e 1000 kDa, entre 250 e 1000 kDa, entre 500 e 1000 kDa, entre 600 e 1000 kDa, entre 750 e 1000 kDa, entre 600 e 800 kDa, entre 700 e 800 kDa. Uma Mw relativamente alta de aproximadamente 750 kDa ou uma Mw relativamente baixa de aproximadamente 1300 Da é adequada.

A massa molar média ponderada (Mw) e massa molar média

numérica (Mn) de PEI podem ser determinadas por métodos bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. Por exemplo, Mw pode ser determinada por dispersão da luz, dispersão de nêutron de ângulo pequeno (SANS), dispersão de raio X ou velocidade de sedimentação. Mn pode ser determinada por 15 exemplo por cromatografia de permeação em gel, viscosimetria (equação de Mark-Houwink) e métodos coligativos tais como osometria de pressão de vapor ou titulação de grupo final.

Várias formas de PEI estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Sigma, Aldrich). Por exemplo, uma forma ramificada, de peso 20 molecular relativamente alto de PEI usada aqui com uma Mn de aproximadamente 60 kDa e uma Mw de aproximadamente 750 kDa está disponível comercialmente (Sigma P3143). Esta PEI pode ser representada pela fórmula seguinte: Uma forma de peso molecular relativamente baixo de PEI usada aqui também está disponível comercialmente (por exemplo, Aldrich 482595) que tem uma Mw de 1300 Da e Mn de 1200 Da.

Na presente invenção, uma mistura de preservação compreendendo uma solução aquosa de PEI e um, dois ou mais açúcares é fornecida. Tipicamente, as partículas virais são misturadas com a mistura de preservação para fornecer a solução aquosa para secagem.

A concentração de açúcar na solução aquosa para secagem é maior do que 0,1 M. Preferivelmente, a concentração do açúcar na solução aquosa para secagem ou, se mais do que um açúcar estiver presente, a concentração total de açúcar na solução aquosa para secagem, é pelo menos 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,75 M, 0,9 M, I M ou 2 M até a saturação por exemplo, saturação na temperatura ambiente ou até 3 M, 2,5 M ou 2 M. A concentração de açúcar ou a concentração total se mais do que um açúcar estiver presente pode ser de 0,5 a 2 M. Quando mais do que um açúcar está presente, cada açúcar pode estar presente em uma concentração de 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,75 M, 0,9 M, I M ou 2 M até a saturação por exemplo, saturação na temperatura ambiente ou até 3 M, 2,5 M ou 2 M.

A concentração de PEI na solução aquosa para secagem está geralmente na faixa de 15 μΜ ou menos com base em Mn. A concentração de PEI pode ser 10 μΜ ou menos com base em Mw. Tais concentrações de PEI são particularmente eficazes em preservar a infectividade ou imunogenicidade virai s. Em uma forma de realização preferida da invenção, a PEI é fornecida em uma concentração com base em Mn de menos do que 5 μΜ, menos do que 500 nM, menos do que 100 nM, menos do que 40 nM, menos do que 25 nM, menos do que 10 nM, menos do que 5 nM, menos do que 1 nM, menos do que 0,5 nM, menos do que 0,25 nM, menos do que 0,1 nM, menos do que 0,075 nM, menos do que 0,05 nM, menos do que 0,025 Nm ou menos do que 0,0025 nM. Tipicamente a concentração de PEI com base em Mn é 0,0025 nM ou mais, 0,025 nM ou mais, ou 0,1 nM ou mais. Uma concentração de PEI adequada varia com base em Mn está entre 0,0025 nM e μΜ, ou entre 0,025 e 200 nM.

Preferivelmente, a concentração de PEI com base em Mw é menos do que 5 μΜ, menos do que 1 μΜ, menos do que 0,1 μΜ, menos do que 0,01 μΜ, menos do que 5 nM, menos do que 4 nM, menos do que 2 nM, menos do que 1 nM, menos do que 0,5 nM, menos do que 0,25 nM, menos do que 0,1 nM, menos do que 0,05 nM, menos do que 0,02 nM, menos do que 0,002 nM ou menos do que 0,1 nM. Tipicamente a concentração de PEI com base em Mw, é 0,00001 nM ou mais, 0,001 nM ou mais ou 0,01 nM ou mais. Uma concentração de PEI adequada varia com base em Mw está entre 0,00001 e 20 nM, entre 0,0001 e 20 nM ou entre 0,0001 e 5 nM.

Tipicamente, é verificado que PEI de peso molecular relativamente alto é eficaz em concentrações mais baixas do que PEI de peso molecular relativamente baixo. Assim:

- Onde uma PEI de Mw relativamente alta é usada, por exemplo na faixa de 20 a 1000 kDa, uma concentração de PEI entre 0,001 e 5 nM com base em Mw é preferida. Onde uma PEI de Mw relativamente baixa é usada, por exemplo na faixa de 300 Da a 10 kDa, uma concentração de PEI entre 0,0001 e 10 μΜ é preferida.

- Onde uma PEI de Mn relativamente alta é usada, por exemplo na faixa de 20 a 1000 kDa, a concentração de PEI com base em Mn está preferivelmente entre 0,001 e 100 nM. Onde uma Mn relativamente baixa, é usada, por exemplo na faixa de I Da a 10 kDa, uma concentração de PEI entre 0,0001 e 10 μΜ é usada.

5 Em uma forma de realização, a mistura de preservação

inicialmente contatada com as partículas virais compreende PEI em uma concentração com base em Mn de menos do que 2 μΜ e uma solução de um ou mais açúcares em uma concentração de pelo menos 0,1 M, pelo menos 0,2 M, pelo menos 0,3 M, pelo menos 0,4 M, pelo menos 0,5 M, pelo menos 0,75 M, pelo menos 0,9 M, pelo menos 1 M, ou pelo menos 2 M.

Quando a solução de um ou mais açúcares compreende dois ou mais açúcares, a concentração mais eficaz de PEI será dependente do tipo particular de açúcar usado na mistura de preservação. Por exemplo, quando um dos dois ou mais açúcares é sacarose e o outro é estaquiose, PEI em uma 15 concentração com base em Mn de menos do que 2 μΜ, em particular em uma concentração entre 0,025 nM e 2 μΜ, é eficaz na preservação. Em uma forma de realização preferida, o método da invenção envolve misturar as partículas virais com uma solução aquosa de (i) um ou mais açúcares em que um destes açúcares é sacarose e o outro é estaquiose e (ii) PEI em uma concentração 20 com base em Mn de menos do que 2 μΜ.

Quando a solução aquosa de dois ou mais açúcares compreende uma solução aquosa de sacarose e rafmose a concentração preferida de PEI é verificada ser menor do que 2 μΜ, ou na faixa entre 0,0025 nM e 2 μΜ. Portanto em uma outra forma de realização, o método da 25 invenção envolve misturar as partículas virais com uma solução aquosa de (i) sacarose e rafmose e (ii) PEI em uma concentração entre 0,0025 nM e 2 μΜ. Preferivelmente, quando uma PEI de peso molecular relativamente alto é usada, por exemplo entre 10 e 100 kDa com base em Mn, a concentração de PEI com base em Mn está entre 0,1 e 100 nM. Embora usando uma combinação de dois açúcares na mistura de preservação, os presentes inventores investigaram o efeito de diferentes razões de concentração molar destes açúcares sobre a preservação da partícula viral. Razões de concentração molar específicas de um açúcar para um outro 5 foram particularmente eficazes mas a razão exata dependeu dos tipos de açúcar usados. Portanto em uma forma de realização da invenção em que um dos dois ou mais açúcares compreende sacarose, a concentração de sacarose em relação ao outro açúcar está em uma razão de concentrações molares entre 3:7 e 9:1, preferivelmente em uma razão de pelo menos 4:6, pelo menos 10 50:50, pelo menos 6:4, pelo menos 7:3, pelo menos 8:2 ou pelo menos 9:1. No caso de sacarose e estaquiose, uma razão de concentrações molares de sacarose:estaquiose de pelo menos 3:7, pelo menos 4:6, pelo menos 50:50, pelo menos 6:4, pelo menos 7:3, pelo menos 3:1, pelo menos 8:2 ou pelo menos 9:1 demonstrou preservação particularmente eficaz. Preferivelmente, a 15 solução de dois ou mais açúcares compreende uma solução de sacarose e estaquiose em uma razão de concentrações molares entre 50:50 e 8:2.

Em uma outra forma de realização, a mistura de preservação da presente invenção compreende uma solução aquosa de (i) dois ou mais açúcares em que um dos açúcares é sacarose e a concentração de sacarose em 20 relação ao outro açúcar está em uma razão de concentrações molares entre 3:7 e 9:1 e (ii) PEI em uma concentração de menos do que 100 nM ou em uma concentração com base em Mn entre 0,025 e 100 nM.

Preservação

As técnicas de preservação da presente invenção são 25 particularmente adequadas para a preservação contra dessecação e congelamento de partículas virais e inoculação térmica. A preservação de partículas virais é obtida por secagem de partículas virais misturadas com a mistura de preservação da presente invenção. Na secagem, um sólido amorfo é formado. Por “amorfo” é significado não estruturado e não tendo nenhuma organização regular ou repetida observável de moléculas (isto é, não cristalinas).

Tipicamente, a secagem é obtida por secagem por congelamento, congelamento instantâneo, secagem a vácuo ou secagem por 5 pulverização. A secagem por congelamento é preferida. Removendo-se a água do material e vedando-se o material em um frasco, o material pode ser facilmente armazenado, transportado e mais tarde reconstituído até sua forma original.

A secagem por congelamento é um processo de desidratação 10 tipicamente usado para preservar o material perecível ou tomar o material mais conveniente para o transporte. A secagem por congelamento representa uma etapa chave para fabricar produtos farmacêuticos de proteína sólida e vacina. Entretanto, materiais biológicos estão sujeitos tanto a estresses de congelamento quanto secagem durante o procedimento, que são capazes de 15 desdobrar ou desnaturar proteínas. Além disso, a taxa de difusão de vapor d’água a partir do material biológico congelado é muito baixa e portanto o processo é demorado. A técnica de preservação da presente invenção permite que os materiais biológicos sejam protegidos contra a dessecação e/ou estresses térmicos do procedimento de secagem por congelamento.

Existem três estágios principais para esta técnica isto é,

congelamento, secagem primária e secagem secundária. O congelamento é tipicamente realizado usando uma máquina de secagem por congelamento. Nesta etapa, é importante resfriar o material biológico abaixo de seu ponto eutético, a temperatura mais baixa na qual a fase sólida e líquida do material 25 pode coexistir. Isto garante que a sublimação ao invés da fusão ocorrerá nas etapas seguintes. Alternativamente, materiais amorfos não têm um ponto eutético, mas têm um ponto crítico, abaixo do qual o produto deve ser mantido para impedir fusão posterior ou colapso durante a secagem primária e secundária. Durante a secagem primária a pressão é diminuída e fornecida com bastante calor ao material para que a água sublime. A quantidade de calor necessária pode ser calculada usando o calor latente de moléculas de sublimação da sublimação. Cerca de 95 % da água no material são 5 sublimados neste estágio. A secagem primária pode ser lenta visto que muito calor pode degradar ou alterar a estrutura do material biológico. De modo a controlar a pressão, um vácuo parcial é aplicado que acelera a sublimação. Uma câmara de condensador a frio e/ou placas condensadoras fornecem uma superfície para que o vapor d’água re-solidifique.

No processo de secagem secundária, moléculas de água

adsorvidas durante o processo de congelamento são sublimadas. A temperatura é elevada mais alto do que na fase de secagem primária para quebrar quaisquer interações físico-químicas que se formaram entre as moléculas de água e o material biológico congelado. Tipicamente, a pressão 15 também é diminuída para encorajar a sublimação. Depois da conclusão do processo de secagem por congelamento, o vácuo é usualmente quebrado com um gás inerte, tal como nitrogênio, antes que o material seja vedado.

Em uma forma de realização, a secagem é obtido congelandose a mistura, tal como por congelamento instantâneo. O termo “congelamento 20 instantâneo” significa um congelamento virtualmente instantâneo como é obtido, por exemplo, imergindo-se um produto em nitrogênio líquido. Em algumas formas de realização ela refere-se a uma etapa de congelamento, que consome menos do que 1 a 2 segundos para completar.

Em certas formas de realização, a secagem é realizada usando 25 dessecação a vácuo em tomo de 1300 Pa. Entretanto a dessecação a vácuo não é essencial para a invenção e em outras formas de realização, a mistura de preservação contatada com a partícula viral é girada (isto é, dessecação rotativa) ou seca por congelamento (como mais descrito abaixo). Vantajosamente, o método da invenção compreende ainda submeter a mistura de preservação contendo a partícula viral a um vácuo. Convenientemente, o vácuo é aplicado em uma pressão de 20.000 Pa ou menos, preferivelmente 10.000 Pa ou menos. Vantajosamente, o vácuo é aplicado durante um período de pelo menos 10 horas, preferivelmente 16 horas ou mais. Como conhecido àqueles habilitados na técnica, o período de aplicação de vácuo dependerá do tamanho da amostra, do mecanismo usado e outros parâmetros.

Em uma outra forma de realização, a secagem é obtida por secagem por pulverização das partículas virais misturadas com a mistura de preservação da invenção. Esta técnica é bem conhecida àqueles habilitados no ramo e envolve um método de secagem de uma alimentação líquida através de um gás quente por exemplo, ar, gás isento de oxigênio ou nitrogênio. A alimentação líquida é atomizada em uma pulverização de gotículas. As gotículas depois são secas por contato com o gás quente em uma câmara de secagem.

Uma vez misturadas com a mistura de preservação, as amostras podem ser secas a vários teores de umidade residual para oferecer preservação a longo prazo em temperaturas maiores do que as temperaturas de refrigeração por exemplo, dentro da faixa de cerca de 4o C a cerca de 45° C, ou mais baixas do que as temperaturas de refrigeração por exemplo, dentro da faixa de cerca de 0 a -70° C ou abaixo.

Usando o método da invenção, a mistura de partículas virais e mistura de preservação é seca para formar uma matriz sólida amorfa. Em uma forma de realização da invenção, o sólido amorfo é obtido em uma forma de pó seco. O sólido amorfo pode tomar a forma de partículas de fluxo livre.

Entretanto, em uma outra forma de realização do método da invenção, a mistura compreendendo partículas virais é seca sobre um suporte sólido. O suporte sólido pode compreender um pérola, tubo de teste, matriz, suporte plástico, placa microtituladora, microchip (por exemplo, chip de silício, vidro de silício ou outro), ou membrana. Em uma outra forma de realização, é fornecido um suporte sólido sobre o qual uma partícula viral preservada de acordo com os métodos da presente invenção é seca ou ligada.

A presente invenção fornece um kit compreendendo um excipiente compreendendo uma solução aquosa de (i) um ou mais açúcares e 5 (ii) PEI. Preferivelmente o kit compreende outros excipientes, carregadores ou diluentes adequados para propósitos veterinários ou farmacêuticos. Instruções para a administração também podem ser fornecidas. O kit também pode compreender substâncias auxiliares, tais como adjuvantes, agentes de sedimentação ou emulsificação, agentes tamponantes de pH, aditivos de 10 gelação ou realçadores de viscosidade ou corantes, adequados para a liberação das partículas virais preservadas da invenção em um paciente ou célula alvo.

Preservação em relação a partículas virais refere-se à resistência da partícula viral à degradação física e/ou perda de atividade biológica tal como degradação de ácido nucleico ou proteína, perda de eficiência de transdução, perda de infectividade viral, perda de imunogenicidade, perda de título viral ou perda de potência da vacina, sob exposição a condições de dessecação, congelamento, temperaturas abaixo de 0o C, abaixo de -5o C, abaixo de -10° C, abaixo de -15° C, abaixo de -20° C ou abaixo de -25° C, secagem por congelamento, temperatura ambiente, temperaturas acima de -10° C, acima de -5o C, acima de 0o C, acima de 5o C, acima de 10° C, acima de 15° C, acima de 20° C, acima de 25° C ou acima de 30° C. Preferivelmente, a preservação de acordo com a presente invenção compreende crioproteção (proteção contra dano no congelamento), lioproteção (proteção contra dessecação) e/ou termoproteção (proteção contra temperaturas mais altas ou mais baixas do que 4o C).

Medição da preservação da partícula viral

A preservação de partículas virais de acordo com a presente invenção pode ser medida pela avaliação de parâmetros tais como infectividade viral, imunogenicidade, taxas de transfecção, título viral e resposta da célula hospedeira. Tais técnicas são bem conhecidas àqueles habilitados no ramo.

Métodos de avaliar quanto à infectividade e/ou imunogenicidade virais são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica e 5 incluem mas não são limitados a crescimento de um vírus em uma cultura celular, detecção de anticorpo específico do vírus no sangue, capacidade para evocar respostas de célula T e/ou B, detecção de antígenos virais, detecção de DNA ou RNA codificados por vírus, ou observação de partículas virais usando um microscópio.

Além disso, a presença de um vírus dá origem a mudanças

morfológicas na célula hospedeira, que podem ser medidas para fornecer uma indicação de atividade viral. Mudanças detectáveis tais como estas na célula hospedeira devido à infecção viral são conhecidas como efeito citopático. Efeitos citopáticos podem consistir de arredondamento, desorientação, 15 intumescência ou encolhimento, morte e separação celulares da superfície. Muitos vírus induzem apoptose (morte celular programada) em células infectadas, mensurável por técnicas tais como o ensaio de TUNEL (rotulagem de extremidades entalhadas de uridina desoxinucleotidil transferase dUTP terminal) e outras técnicas bem conhecidas àqueles habilitados no ramo.

Vírus também podem afetar a regulação da expressão dos

genes da célula hospedeira e estes genes podem ser analisados para fornecer uma indicação de se a atividade viral está presente ou não. Tais técnicas podem envolver a adição de reagentes à cultura celular para completar uma reação enzimática ou química com um produto de expressão viral. Além 25 disso, o genoma viral pode ser modificado de modo a realçar a detecção de infectividade viral. Por exemplo, o genoma viral pode ser geneticamente modificado para expressar um marcador que pode ser facilmente detectado por microscopia de contraste de fase, microscopia de fluorescência ou por radioformação de imagem. O marcador pode ser uma proteína fluorescente expressada tal como GFP (Proteína Verde Fluorescente) ou uma enzima expressada que pode estar envolvida em uma reação colorimétrica ou de radiorrotulagem. O marcador também pode ser um produto genético que interrompe ou inibe uma função particular das células que são testadas.

5 Um ensaio para unidades de formação de placa pode ser usado

para medir a infectividade viral e para indicar o título viral. Neste ensaio, células hospedeiras adequadas são cultivadas em uma superfície plana até que elas formem uma monocamada de células que cobre um frasco plástico ou prato. A seleção de uma célula hospedeira particular dependerá do tipo de 10 vírus. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem mas não são limitado a células CHO, BHK, MDCK, IOT1/2, WEHI, células COS, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HEK293 e HeLa. A monocamada de células hospedeiras depois é infectada com as partículas virais. O meio líquido é 15 substituído com uma unidade semi-sólida de modo que quaisquer partículas virais produzidas, como o resultado de uma infecção não podem mover-se longe do sítio de sua produção. Uma placa é produzida quando uma partícula viral infecta uma célula, duplica, e depois mata esta célula. Uma placa referese a uma área de células na monocamada que exibe um efeito citopático, por 20 exemplo, parecendo redonda e mais escura do que outras células no microscópio, ou como manchas brancas quando visualizadas ao olho nu; o centro da placa pode carecer de células devido à Iise induzida por vírus. O vírus recentemente duplicado infecta células adjacentes e eles também são mortos. Este processo pode ser repetido várias vezes. As células depois são 25 manchadas com um corante tal como azul de metileno, que mancha apenas células vivas. As células mortas na placa não mancham e aparecem como áreas não manchadas em um fundo colorido.

Cada placa é o resultado da infecção de uma célula por um vírus seguido por replicação e difusão deste vírus. Entretanto, vírus que não matam células podem não produzir placas. Uma placa refere-se a uma área de células em uma monocamada que exibe um efeito citopático, por exemplo, parecendo redonda e mais escura do que outras células no microscópio, ou como manchas brancas quando visualizadas ao olho nu; o centro da placa 5 pode carecer de células devido à Iise induzida por vírus. Uma indicação de título viral é fornecida medindo-se “unidades de formação de placa” (PFU). PFU refere-se a um vírus ou grupo de vírus, que induzem uma placa. Por exemplo: se uma solução de estoque viral tem 1000 pfu/ml, significa que cada ml deste estoque tem 1000 partículas virais que podem formar placas. Níveis 10 de infectividade viral podem ser medidos em uma amostra de material biológico preservado de acordo com a presente invenção e comparado a amostras de controle tais como vírus recentemente colhido ou amostras submetidas à dessecação e/ou variação térmica sem adição da mistura de preservação da presente invenção.

Tipicamente, o título viral a seguir da preservação de acordo

com a presente invenção e incubação do produto resultante a 37° C durante 5 dias é pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % do título do vírus antes de tal incubação ou, de fato, antes da preservação de acordo com a presente invenção e tal incubação.

Alguns tipos de partículas virais da invenção, tais como proteínas virais, VLPs, ou alguns vírus inativados não têm a capacidade para formar placas no ensaio de placa. Neste caso, a preservação pode ser medida por outros métodos tais como métodos para determinar a imunogenicidade 25 que são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. Por exemplo, ensaios in vivo e in vitro para medir respostas imunes de hospedeiro mediadas por célula ou anticorpo são conhecidos na técnica e adequados para o uso na presente invenção. Por exemplo, uma resposta imune com base em anticorpo pode ser medida comparando-se a quantidade, avidez e distribuição de isótipo de anticorpos no soro em um modelo animal, antes e depois da imunização usando a partícula viral preservada da invenção.

Usos das partículas virais preservadas da invenção

Vacinas

5 As partículas virais preservadas da presente invenção podem

encontrar uso como uma vacina. Por exemplo, partículas virais preservadas tais como vírus integral morto, vírus vivo atenuado, vírus quimicamente inativado, VLPs ou vetores virais vivos são adequados para o uso como uma vacina. Como uma vacina as partículas virais preservadas da invenção podem 10 ser usadas como antígenos ou para codificar antígenos tais como proteínas virais para o tratamento ou prevenção de várias condições incluindo mas não limitadas a infecção viral, seqüelas de infecção viral incluindo mas não limitadas a toxicidade induzida por vírus, câncer e alergias. Tais antígenos contêm um ou mais epítopos que estimularão um sistema imune do 15 hospedeiro para gerar uma resposta humoral e/ou celular específica de antígeno.

A vacina preservada da invenção pode ser usada para tratar a infecção por vírus tais como vírus do papiloma humano (HPV), HIV, HSV2/HSV1, vírus da gripe (tipos A, B e C), vírus para influenza, vírus da 20 poliomielite, vírus RSV, rinovírus, rotavírus, vírus da hepatite A, norovírus, enterovírus, astrovírus, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus varicelazoster, citomegalovírus, vírus epstein-barr, adenovírus, vírus da rubéola, vírus de linfoma de célula T humana tipo I (HTLV-I), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite D, poxvírus e vírus da vacínia. A 25 vacina pode ser usada ainda para fornecer uma resposta imune adequada contra numerosas doenças veterinárias, tais como febre aftosa (incluindo sorotipos O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 e Asia-1), coronavírus, língua azul, vírus da leucemia felina, influenza aviária, vírus hendra e nipah, pestivírus, parvovírus canino e vírus da diarréia viral bovina. Em uma forma de realização, a vacina é uma vacina subunitária, conjugada ou multivalente. Por exemplo, a vacina preservada da invenção pode ser usada para tratar a infecção por dois ou mais tipos diferentes de vírus tais como sarampo, caxumba e rubéola (por exemplo, vacina contra MMR).

5 As composições de vacina da presente invenção compreendem

partículas virais misturadas com a mistura de preservação da invenção contendo um ou mais açúcares e PEI. A composição de vacina pode compreender ainda tampões e aditivos apropriados tais como antibióticos, adjuvantes ou outras moléculas que realçam a apresentação de antígenos de vacina a células específicas do sistema imune.

Uma variedade de adjuvantes bem conhecidos na técnica pode ser usada de modo a aumentar a potência da vacina e/ou modular respostas imunes humorais e celulares. Adjuvantes adequados incluem, mas não são limitados a, adjuvantes contendo emulsão óleo-em-água ou adjuvantes de 15 água-em-óleo, tais como óleo mineral, adjuvantes com base em alumínio, adjuvantes com base em esqualeno/fosfato, Adjuvante de Freund Completo/Incompleto, citocinas e quaisquer outras substâncias que agem como agentes imunoestimulantes para realçar a efetividade da vacina.

A composição de vacina da presente invenção pode estar em 20 uma forma seca por congelamento (Iiofilizada) de modo a levar em consideração o armazenamento apropriado e maximizar a vida de prateleira da preparação. Isto levará em consideração o empilhamento de estoque da vacina durante períodos prolongados de tempo e ajudará a manter a imunogenicidade, potência e eficácia. A mistura de preservação da presente 25 invenção é particularmente adequada para preservar substâncias virais contra dessecação e estresses térmicos encontrados durante protocolos de secagem por congelamento/liofilização. Portanto, a mistura de preservação é adequada para adicionar ao vírus ou partícula viral logo depois da colheita e antes da sujeição da amostra ao procedimento de secagem por congelamento. Para medir a preservação de uma vacina preparada de acordo com a presente invenção, a potência da vacina pode ser medida usando técnicas bem conhecidas àqueles habilitados no ramo. Por exemplo, a geração de uma resposta imune celular ou humoral pode ser testada em um modelo 5 animal apropriado monitorando-se a geração de anticorpos ou respostas celulares imunes à vacina. A capacidade de amostras de vacina preparadas de acordo com o método da presente invenção de desencadear uma resposta imune pode ser comparada com vacinas não submetidas à mesma técnica de preservação.

Vetores virais

Um vírus ou vetor viral preservado de acordo com o método da presente invenção pode ser usado para transferir um gene heterólogo ou outra seqüência de ácido nucleico a células alvo. Adequadamente, a seqüência heteróloga (isto é, transgene) codifica uma proteína ou produto genético que é 15 capaz de ser expressado na célula alvo. Transgenes adequados incluem genes repórteres desejáveis, genes terapêuticos e genes que codificam polipeptídeos imunogênicos (para o uso como vacinas). A terapia genética, um método para o tratamento ou prevenção de doenças associadas com expressão de gene imperfeita, envolve a inserção de um gene terapêutico nas células, seguido 20 pela expressão e produção das proteínas requeridas. Este método permite a substituição de genes danificados ou a inibição da expressão de genes indesejados. Em particular, o vírus ou vetor viral preservado pode ser usado na terapia genética para transferir um transgene terapêutico ou gene que codifica polipeptídeos imunogênicos a um paciente.

Em uma forma de realização preferida, a partícula viral

preservada é um vetor viral vivo. Por “vetor viral vivo” é significado um vetor viral vivo que é não patogênico ou de baixa patogenicidade para as espécies alvo e em que foi inserido um ou mais genes que codificam antígenos que estimulam uma resposta imune protetora contra outros vírus ou microorganismos, um gene repórter ou uma proteína terapêutica. Em particular, o ácido nucleico é introduzido no vetor viral em um tal modo que ele é ainda capaz de duplicar expressando deste modo um polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico inserida e no caso de uma vacina, 5 evocando uma resposta imune no animal hospedeiro infectado. Em uma forma de realização, o vetor viral vivo é um vetor viral vivo atenuado isto é, é modificado para ser menos virulento (causador de doença) do que o vírus do tipo selvagem.

A base do uso de vírus recombinantes como vacinas potenciais envolve a incorporação de genes específicos de um organismo patogênico no genoma de um vírus não patogênico ou atenuado. O vírus recombinante depois pode infectar células eucarióticas específicas in vivo ou in vitro, e fazer com que elas expressem a proteína recombinante.

Vacinas com vetor viral vivo derivadas pela inserção de genes que codificam seqüências de organismos de doença podem ser preferidas sobre vacinas atenuadas vivas, vacinas inativadas, acessos de subunidade ou DNA. Uma das características de segurança mais importantes de vetores virais vivos é que os receptores podem ser imunizados contra antígenos específicos a partir de organismos patogênicos sem exposição ao agente de doença propriamente dito. A segurança é regulada ainda pela seleção de um vetor viral que é atenuado para o hospedeiro ou incapaz de duplicar no hospedeiro embora ainda capaz de expressar o antígeno heterólogo de interesse. Uma cepa de vacina que tem uma história de segurança na espécie alvo oferece uma característica de segurança adicional. Vários sistemas foram desenvolvidos em que o vetor é suprimido de genes essenciais e a preparação da vacina é realizada em sistemas celulares que fornecem a função perdida.

Uma variedade de vetores tais como vetores retrovirais, lentivirais, do vírus da herpes, do poxvírus, adenovirais e virais adenoassociados pode ser usada para a liberação de genes heterólogos às células alvo. O gene heterólogo de interesse pode ser inserido no vetor viral. Os vetores virais da invenção podem compreender por exemplo um vetor viral fornecido com uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão do gene heterólogo e opcionalmente um regulador do promotor.

5 Por exemplo, adenovírus úteis na prática da presente invenção podem ter supressões na região El e/ou E3 e /ou E4, ou de outro modo podem ser maximizados para receber DNA heterólogo.

O vetor viral pode compreender um promotor constitutivo tal como um promotor de citomegalovírus (CMV), promotor de antígeno T grande de SV40, promotor LTR de vírus do tumor mamário de camundongo, promotor tardio principal de adenovírus (MLP), o promotor LTR de vírus do tumor mamário de camundongo, o promotor inicial de SV40, promotores de adenovírus tais como o promotor tardio principal de adenovírus (Ad MLP), promotores de HSV (tais como os promotores de HSV IE), promotores de HPV tais como a região reguladora a montante de HPV (URR) ou promotor do vírus do sarcoma de rous juntamente com outras seqüências de ácido nucleico viral operavelmente ligadas ao gene heterólogo de interesse. Promotores induzíveis ou específicos de tecido também podem ser usados para controlar a expressão do gene heterólogo de interesse. Promotores também podem ser selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para a qual a expressão é designada.

O vetor viral também pode compreender outras elementos moduladores transcrícionais tais como realçadores. Realçadores são amplamente definidos como um agente cis-atuante, que quando 25 operavelmente ligado a um promotor/seqüência genética, aumentará a transcrição desta seqüência genética. Realçadores podem funcionar a partir de posições que estão muito mais longes de uma seqüência de interesse do que outros elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores) e podem operar quando posicionados em qualquer orientação em relação à seqüência de interesse. Realçadores foram identificados a partir de várias fontes virais, incluindo vírus do polioma, vírus BK, citomegalovírus (CMV), adenovírus, vírus símio 40 (SV40), vírus do sarcoma de Moloney, vírus do papiloma bovino e vírus do sarcoma de Rous. Exemplos de realçadores 5 adequados incluem o realçador de gene inicial SV40, o realçador/promotor derivado da repetição de terminal longo (LTR) do vírus do sarcoma de Rous, e elementos derivados de CMV humano ou de murino, por exemplo, elementos incluídos na seqüência A de íntron de CMV.

O vetor viral contendo um gene heterólogo de interesse depois pode ser preservado de acordo com o método da invenção antes do armazenamento, submetendo a outras técnicas de preservação tais como liofilização, ou administração a um paciente ou célula hospedeira.

Ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos conhecidos exibir atividade antiviral, moléculas imunomoduladoras tais como citocinas 15 (por exemplo, TNF-alfa, interferons tais como IL-6, e IL-2, interferons, fatores estimulantes de colônia tais como GM-CSF), adjuvantes e moléculas co-estimuladoras e acessórias podem ser incluídos no vetor viral da invenção. Alternativamente, tais polipeptídeos podem ser fornecidos separadamente, por exemplo na mistura de preservação da invenção ou podem ser administrados 20 simultânea, seqüencial ou separadamente com vetores virais da invenção.

Preferivelmente, o vetor viral preservado da invenção pode ser introduzido em células hospedeiras adequadas usando uma variedade de técnicas virais que são conhecidas no ramo, tais como por exemplo infecção com vetores virais recombinantes tais como retrovírus, vírus da herpes 25 simples e adenovírus. Preferivelmente, a administração do vetor viral preservado da invenção contendo um gene de interesse é mediada por infecção viral de uma célula alvo.

Vários sistemas com base em vírus foram desenvolvidos para transfectar células mamíferas. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante selecionada pode ser inserida em um vetor e empacotada como partículas retrovirais usando técnicas conhecidas no ramo. O vírus recombinante depois pode ser isolado e liberado a células do paciente in vivo ou ex vivo. Vetores 5 retrovirais podem ser fundamentados no vírus da leucemia em murino de Moloney (Mo-MLV). Em um vetor retroviral, um ou mais dos genes virais (gag, pol & env) são geralmente substituídos com o gene de interesse.

Vários vetores adenovirais são conhecidos. Os sorotipos 2 e 5 do subgrupo C de adenovírus são comumente usados como vetores. O genoma de adenovírus do tipo selvagem é aproximadamente 35 kb dos quais até 30 kb podem ser substituídos com DNA estranho.

Existem quatro unidades transcricionais iniciais (El, E2, E3 & E4), que têm funções reguladoras, e um transcrito tardio, que codifica proteínas estruturais. Vetores adenovirais podem ter o gene inativado por El 15 e/ou E3. O(s) gene(s) perdido(s) depois pode ser fornecido em trans por um vírus auxiliar, plasmídeo ou integrado em um genoma de célula auxiliar. Vetores adenovirais podem usar um mutante sensível à temperatura E2a ou uma supressão em E4. Vetores adenovirais mínimos podem conter apenas as repetições de terminal invertido (ITRs) & uma seqüência de empacotamento 20 em tomo do transgene, todos os genes virais necessários sendo fornecidos em trans por um vírus auxiliar. Vetores adenovirais adequados incluem assim vetores Ad5 e vetores adenovirais símios.

Vetores virais também podem ser derivados da família da varíola de vírus, incluindo vírus da vacínia e poxvírus aviário tais como 25 vacinas contra epitelioma contagioso. Por exemplo, vírus da vacínia modificado Ankara (MVA) é uma cepa do vírus da vacínia que não duplica na maioria dos tipos de célula, incluindo tecidos humanos normais. Um vetor de MVA recombinante portanto pode ser usado para liberar o polipeptídeo da invenção. Tipos de adição de vírus tal como vírus adeno-associado (AAV) e vírus da herpes simples (HSV) também podem ser usados para desenvolver sistemas de vetor adequados.

Excipiente

5 Na presente invenção, um excipiente para a preservação de

partículas virais também é fornecido. O excipiente compreende (a) sacarose, estaquiose, trealose, um álcool de açúcar ou rafmose ou qualquer combinação destes; e (b) PEI em uma concentração com base em Mn de 5 M ou menos. Por “excipiente” é significado uma substância inativa usada como um 10 carregador para as partículas virais da invenção (por exemplo quando as partículas virais são usadas como uma vacina). Tipicamente, as partículas virais (por exemplo, para o uso como uma vacina) são dissolvidas em ou misturadas com o excipiente, que age como um preservante da partícula viral e/ou em alguns contextos ajuda na administração e absorção no corpo. Assim 15 como a mistura de preservação da presente invenção, um excipiente também pode compreender outros preservantes tais como antioxidantes, lubrificantes e aglutinantes bem conhecidos na técnica, contanto que estes ingredientes não reduzam significativamente a efetividade da mistura de preservação da presente invenção.

Ensaio em um suporte sólido

Partículas virais preservadas armazenadas em um suporte sólido podem ser usadas para propósitos de diagnóstico ou para monitorar um regime de vacinação. Por exemplo, uma amostra de paciente tal como fluido corporal (sangue, urina, saliva, muco, sucos gástricos etc) pode ser preservada 25 de acordo com os métodos descritos aqui secando-se uma mistura compreendendo a amostra do paciente e mistura de preservação da presente invenção sobre um suporte sólido.

Amostras preservadas do paciente depois podem ser testadas quanto à presença de antígenos virais/epítopos na amostra usando anticorpos anti-virais (por exemplo usando ELISA). Alternativamente, partículas virais de interesse podem ser preservadas de acordo com os métodos descritos aqui secando-se uma mistura compreendendo as partículas virais e mistura de preservação da presente invenção sobre um suporte sólido. Amostras do 5 paciente podem ser testadas quanto à presença de anticorpos anti-virais contatando-se a amostra do paciente com um suporte sólido sobre o qual as partículas virais de interesse são ligadas. A formação de complexos de antígeno-anticorpo pode evocar um sinal mensurável. A presença e/ou quantidade de complexos de antígeno-anticorpo de partícula viral em uma 10 amostra podem ser usadas para indicar a presença de uma infecção viral ou progresso de um regime de vacinação em um paciente.

Administração

Vacinas ou partículas virais preservadas de acordo com a presente invenção podem ser administradas, em alguns exemplos depois da reconstituição de um produto seco por congelamento, a um paciente in vivo usando uma variedade de caminhos e técnicas conhecidos. Por exemplo, as vacinas preservadas podem ser fornecidas como uma solução, suspensão ou emulsão injetáveis e administradas por intermédio de injeção parenteral, subcutânea, oral, epidérmica, intradérmica, intramuscular, interarterial, intraperitoneal, intravenosa usando uma agulha e seringa convencionais, ou usando um sistema de injeção de jato líquido. Vacinas preservadas podem ser administradas topicamente à pele ou tecido mucoso, tal como nasal, intratraqueal, intestinal, sublingual, retal ou vaginalmente, ou fornecidas como uma pulverização finamente dividida adequada para a administração respiratória ou pulmonar.

Em uma forma de realização, o método da invenção compreende ainda a etapa de processar a mistura em uma formulação adequada para a administração como uma injeção líquida. Preferivelmente, o método compreende ainda a etapa de processar a mistura em uma formulação adequada para a administração por intermédio de ingestão ou por intermédio da via pulmonar.

O produto preservado é administrado a um paciente em uma quantidade que é compatível com a formulação de dosagem e que será 5 profilática e/ou terapeuticamente eficaz. A administração do produto ou vacina preservados da invenção pode ser para propósito “profilático” ou “terapêutico”. Como usado aqui, o termo “terapêutico” ou “tratamento” inclui qualquer um do que segue: a prevenção da infecção ou reinfecção; a redução ou eliminação dos sintomas; e a redução ou eliminação completa de um 10 patógeno. O tratamento pode ser efetuado profilaticamente (antes da infecção) ou terapeuticamente (a seguir da infecção).

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção. A PEI usada nos Exemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 10 teve uma Mw de 750000 e uma Mn de 60000 (Sigma P3143). A PEI de “peso molecular alto” usada no Exemplo 9 15 teve uma Mw de 750000 e uma Mn de 60000 (Sigma P3143). A PEI de “peso molecular baixo” do Exemplo 9 teve uma Mw de 1300 e uma Mn de 1200 (Aldrich 482595). A histona usada nos Exemplos foi histona 2A obtida da Boehringer Mannheim.

As seguintes técnicas experimentais gerais foram utilizadas:

Secagem por congelamento

Depois do turbilhão, os frascos foram congelados a -80° C em bandejas do secador por congelamento contendo 30 ml de água com tampas de borracha parcialmente dentro. Os frascos congelados foram transferidos à prateleira de bloqueio do secador por congelamento (Thermo Fisher) do 25 secador por congelamento pré-esfriado (Thermo Fisher) e secos durante 16 horas. Tampas de borracha foram diminuídas totalmente nos frascos sob um vácuo antes da remoção a partir do secador por congelamento.

£nsaio de FMDV

Vírus e células foram cultivados em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com 10 % de soro bovino fetal, 20 mM de glutamina, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml). O meio de sobreposição de Eagle foi preparado adicionando-se 25 ml de indubiose dissolvido em água (24 mg/ml) a 75 ml de sobreposição de Eagle, 5 5 ml de caldo de fosfato de triptona, 1 ml de soro bovino fetal (FBS) e 1 ml de penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 m/ml).

Células BHK-21 foram preparadas em placas de cultura de tecido de 6 reservatórios e cultivadas durante a noite a 37° C até aproximadamente 80 a 90 % de confluência. As amostras secas por 10 congelamento foram re-colocadas em suspensão em DMEM. Monocamadas de células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas com 100 μΐ de amostra de FMDV a 37° C durante 15 minutos. Monocamadas de célula foram sobrepostas com 2 ml de sobreposição de Eagle que foi deixada fixar na temperatura ambiente (RT) antes de incubar a 15 37° C durante um adicional de 40 a 48 horas.

Monocamadas de célula infectada foram manchadas com 2 ml de azul de metileno (4 % de formaldeído em PBS) durante 24 horas na temperatura ambiente e placas visualizadas registradas.

Ensaio de adenovírus 96 placas de cultura celular de fundo plano (Jencons, UK)

foram semeadas com células HEK 293 em IO5 células por ml (100 μΐ por reservatório) e mantidas a 37° C com 5 % de CO2. Depois de obter 90 % de confluência frascos contendo o adenovírus mais excipiente foram reconstituídos em 1 ml de DMEM mais 5 % de FBS. Uma etapa de diluição 25 1:10 depois foi tomada tomando-se 100 ml do frasco reconstituído e adicionando-se a 900 ml de DMEM. 100 ml do vírus diluído resultante depois foram adicionados à primeira série sobre a placa e uma diluição 1:2 realizado abaixo da placa. O processo depois foi repetido com o excipiente seguinte. Depois de um adicional de 48 horas, as células de GFP numérico por reservatório foram contadas usando microscopia fluorescente.

Análise estatística

Um teste T de student foi realizado para analisar a significância entre diferentes excipientes usando o software PRISM Graphpad versão 4.00.

Alternativamente, onde comparações múltiplas de pares foram necessárias, um ANOVA de uma via foi realizado com como teste de pós-comparação de Turkey. Os resumos do valor de P são *p <0,10; **p < 0,05; e ***p < 0,005.

Exemplo 1

Um adenovírus recombinante que expressa proteína 10 fluorescente verde realçada (EGFP) com um título de 4,1 x IO7 pfu/ml (meio de cultura de tecido por ml) foi misturado (1:5 v/v) com um excipiente compreendendo sacarose (uma solução saturada, aproximadamente 64 % p/v), estaquiose (uma solução saturada, aproximadamente 64 % p/v) e PEI (33 μ§/ηι1) em uma razão de 3:1:1 v/v respectivamente. A mistura foi seca por 15 congelamento como segue: amostras foram congeladas em nitrogênio líquido, e secas sob vácuo na temperatura ambiente durante 16 horas. Depois deste tempo as amostras foram armazenadas até o uso a -20° C ou usadas imediatamente. Adenovírus foi avaliado usando um ensaio de placa em células 293A. Os resultados são mostrados na seguinte Tabela.

Tratamento Título (pfu/ml) Pré-secagem 4,8 x IO7 Imediatamente após a secagem 4,3 x IO7 Após a secagem e 5 dias a 37° C 4,1 x IO7 Exemplo 2

Este experimento foi designado para examinar o efeito de componentes de excipiente sobre a recuperação de FMDV-A quando secos por congelamento (FD) e deixados durante 24 horas na temperatura ambiente (RT) ou tratados com calor durante 48 horas a 37° C (HT). Todos os 25 excipientes foram preparados em frascos de vidro. Todos os frascos foram configurados em duplicata.

170 μΐ de uma solução aquosa de Suc (1 g/ml) e 30 μΐ de uma solução aquosa de Raf (1 g/ml) foram adicionados entre si, fornecendo um volume total de 200 μΐ para a mistura de açúcar. 50 μΐ de PEI (0,03 mg/ml) depois foi adicionado para completar o excipiente. Finalmente, 50 μΐ de FMDV-A foram adicionados e a mistura turbilhonada. A concentração final de todo o açúcar e de PEI na mistura do excipiente é mostrada na Tabela abaixo:

Componente do Excipiente Concentração Final no Excipiente Sacarose 1,7 (M) Rafinose 0,1 (M) PEI 6,25 (nM)778,13 (nM)1 * concentração calculada de Mw 'concentração calculada de Mn

Uma mistura de controle foi preparada por adição de 50 μΐ de FMDV-A a 250 μΐ de PB S. Os frascos foram secos por congelamento e depois deixados na temperatura ambiente durante 24 horas ou 37° C durante 48 horas. Um ensaio de FMDV depois foi realizado. Os resultados são 10 mostrados na Figura I. Os resultados demonstraram que existe muito pouca recuperação viral quando o excipiente foi PBS apenas. O excipiente contendo Suc, Raf e PEI demonstrou recuperação de FMDV similar na temperatura ambiente ou HT. Um teste T de student de fato não mostrou nenhuma diferença significante entre a incubação na temperatura ambiente (RT) e o 15 tratamento térmico durante 48 horas a 37° C (HT).

Exemplo 3

Este experimento foi designado para investigar o benefício de PEI sobre o vírus FMDV-O tratado com calor. Frascos de vidro foram preparados em duplicata com 120 μΐ de Suc (3 M), 80 μΐ de Stac (0,75 M) e 500 de PEI (IO'2 mg/ml) ou água destilada. 50 μΐ de FMDV-O foram adicionados a cada frasco do excipiente. A concentração final de cada açúcar e de PEI, quando

presente, na mistura do excipiente é mostrada na Tabela abaixo:

Componente do Excipiente Concentração final no Excipiente Sacarose 1,2 (M) Estaquiose 0,2 (M) PEI 2 (nM)725 (nM)1 * concentração calculada de Mw 'concentração calculada de Mn Volumes de 50 μΐ do vírus usados também foram recongelados como controles (título original). Depois da secagem por congelamento, as amostras foram incubadas a 37° C durante 24 horas ou 6 dias. As amostras foram recolocadas em suspensão em 1 ml de DMEM (mais 10 % de FBS) e a recuperação viral 5 determinada no ensaio de placa. Os resultados são mostrados na Figura 2.

O exemplo 3 foi designado para avaliar o benefício extra de incluir PEI no excipiente de açúcar sobre simplesmente ter o excipiente de açúcar sozinho. A seguir do tratamento térmico a 37° C durante 24 horas, não houve nenhuma queda notável na recuperação viral quando o excipiente contendo PEI 10 foi usado considerando que a recuperação do vírus foi significativamente reduzida quando o excipiente de açúcar foi utilizado sem PEI. Depois de 6 dias de tratamento por calor, houve uma perda de vírus quando o excipiente contendo PEI foi usado. Entretanto, novamente, esta perda foi significativamente mais baixa do que a perda quando o excipiente contendo açúcar foi utilizado sozinho.

Exemplo 4

As concentrações de açúcar iniciais foram examinadas para otimizar o componente de açúcar do excipiente na recuperação de FMDV-O. Uma solução de açúcar com uma razão de 120:80 de Sue (3 M) e Stac (0,75 M) foi preparada (“açúcares”) e diluições seriais de 1:10, 1:100, 1:1000 realizadas. 20 Frascos de vidro triplos com 200 μΐ de cada concentração de açúcar ou PBS foram preparados e 50 μΐ de FMDV-O adicionados à solução de açúcar ou PBS.

A concentração final de cada açúcar é mostrada na Tabela abaixo:

ComponentedaExcipiente Concentração Final do Excipiente Sacarose 1,2 (M) Sacarose 1:10 0,12 (M) Sacarose 1:100 0,012 (M) Sacarose 1:1000 0,0012 (M) Estaquiose 0,2 (M) Estaquiose 1:10 0,02 (M) Estaquiose 1:100 0,002 (M) Estaquiose 1:1000 0,0002 (M) Volumes de 50 μΐ do vírus também foram recongelados como controles (título original). As amostras foram secas por congelamento, depois incubadas a 37° C durante 7 dias antes da ressuspensão em 1 ml de DMEM (mais 10 % de FBS) e recuperação viral determinada no ensaio de placa. Os resultados são mostrados na Figura 3.

O objetivo do Exemplo 4 foi ver o efeito de diluir a 5 concentração de açúcar. A seguir da secagem por congelamento, a recuperação viral cai para aproximadamente um décimo do título original em um excipiente contendo a solução de açúcar. Quando a concentração de açúcar é diluída 1:10, nenhuma recuperação significante foi observada. Exemplo 5

O exemplo 5 foi designado para investigar o efeito de

combinações ideais de concentrações de sacarose e estaquiose para a recuperação de FMDV-O. Uma série de razões de açúcar de 80 μΐ de Suc (3 M) e 120 μΐ de Stac (0,75 M) para 200 μΐ de Suc e 0 μΐ de Stac foram preparadas. PEI foi preparada com uma série de diluições de 1 mg/ml de 15 1:100 a 1:32000. His foi preparada com uma série de diluições de 1 mg/ml a 0,625 mg/ml. Uma matriz de amostras foi preparada com 50 μ 1 de FMDV-O, 200 μΐ de cada razão de açúcar e 50 μΐ de cada diluição de PEI.

A concentração final de cada açúcar e de PEI é mostrada na

Tabela abaixo:

Componente do Excipiente Concentração Final do Excipiente Sacarose 80 μΐ 0,8 (M) Sacarose 100 μΐ I(M) Sacarose 120 μΐ 1,2 (M) Sacarose 140 μΐ 1,4 (M) Sacarose 160 μΐ 1,6 (M) Sacarose ISO μ7 1,8 (M) Sacarose 200 μΐ 2 (M) Estaquiose 120 μΐ 0,3 (M) Estaquiose 100 μΐ 0,25 (M) Estaquiose 80 μΐ 0,2 (M) Estaquiose 60 μΐ 0,15 (M) Estaquiose 40 μΐ 0,1 (M) Estaquiose 20 μΐ 0,05 (M) PEI 1:100 mg/ml - 1:32000 mg/ml 2 - 0,066 (nM)’/25 - 0,075 (nM)1 Histona 1 mg/ml - 0,0625 mg/ml

0,17 - 0,01 mg/ml

*concentração calculada de Mw 'concentração calculada de Mn As amostras foram secas por congelamento e incubadas a 37° C durante 3 dias (amostras de PEI) ou 24 horas (amostras de His) antes de recolocar em suspensão em 1 ml de DMEM (mais 10 % de FBS) e determinar a recuperação de FMDV no ensaio de placa. Os resultados são mostrados nas 5 Figuras 4.1 e 4.2.

Os resultados para cada concentração de PEI foram conferidos. Os resultados mostrados na Figura 4.1 demonstraram que uma recuperação significativamente mais baixa foi observada quando do uso de um excipiente apenas de sacarose comparado a um excipiente contendo uma razão de 140:60 10 de Suc: Stac. Além de um excipiente de Suc puro não houve nenhuma diferença significante entre as razões diferentes de Suc:Stac.

A Figura 4.2 mostra os resultados do mesmo experimento em que His é substituída com PEI no excipiente. Os resultados demonstraram um efeito sobre as razões ideais de Suc:Stac com razões muito mais altas de Suc sendo preferíveis e nenhum deletério notável de um excipiente apenas de Suc. Exemplo 6

Neste Exemplo, adenovírus com um rótulo de GFP foi usado para comparar a recuperação viral com concentrações de açúcar/PEI diferentes. Uma série de razões de Suc:Stac diferentes foram configuradas 20 com um volume final de 200 μΐ. 50 μΐ de PEI em uma faixa de concentrações de 0,1 mg por ml a 0,01 μg por ml também foram adicionadas a cada frasco. Depois da adição de adenovírus às razões de Suc:Stac:PEI diferentes, os frascos foram resfriados e FD.

A concentração final de cada açúcar e de PEI é mostrada na

Tabela abaixo:

Componente do Excipiente Concentração Final do Excipiente Sacarose 200 μΐ 2(M) Sacarose 160 μ 1 1,6 (M) Sacarose 120 μ 1 1,2 (M) Sacarose 80 μ 1 0,8 (M) Sacarose 40 μΐ 0,4 (M) Estaquiose 40 μ 1 0,1 (M) Estaquiose 80 μΐ 0,2(M) Estaquiose 120 μ 1 0,3 (M) Estaquiose 160 μ 1 0,4 (M) Estaquiose 200 μΐ 0,5 (M) PEI 1:10 mg/ml 20 (nM)7250 (nM)1 PEI 1:50 mg/ml 4 (nM)’/ 50 (nM)1 PEI 1:1000 mg/ml 0,2 (M)V 2,5 (nM)1 PEI 1:10000 mg/ml 0,02 (nM)70,25 (nM)1 * concentração calculada de Mw 'concentração calculada de Mn

A seguir de 24 horas de tratamento térmico a 37° C, o excipiente e o vírus foram reconstituídos em 1 ml de DMEM (mais 10 % de FBS). O título viral foi avaliado usando diluições seriais de 2 vezes em placas de 96 reservatórios contendo uma monocamada de confluência a 90 % de 293 células. Os resultados são mostrados na Figura 5.

A otimização inicial examinou três variáveis: concentração de Suc, concentração de Stac e concentração de PEI usando uma matriz de concentrações diferentes. Os resultados da matriz demonstraram que tanto a concentração de açúcar quanto a concentração de PEI podem efetuar

pronunciadamente a recuperação viral. Concentrações altas de Stac para Suc ou concentrações altas de PEI ambas mostraram níveis baixos de recuperação. A recuperação ideal do vírus necessitou que Suc estivesse presente. As amostras não contendo nenhuma Suc não mostraram nenhuma recuperação. Exemplo 7

O objetivo deste experimento foi examinar a concentração de

PEI em um excipiente de açúcar Suc:Stac. Uma série de diluições de 1:10 de PEI foram configuradas para avaliar concentrações de PEI ideais. A partir do trabalho em otimizar as concentrações de açúcar, uma razão de 120:80 Suc:Stac foi escolhida.

A concentração final de cada açúcar e de PEI é mostrada na

Tabela abaixo:

Componente do Excipiente Concentração Final do Excipiente Sacarose 0,8 (M) Estaquiose 0,2 (M) PEI 100 μg/ml 20 (nM)’/250 (nM)1 PEI 10 μ g/ml 2 (nM)725 (nM)1 PEI 1 μg/ml 0,2 (nM)72,5 (nM)1 PEI 0,1 μ g/ml 0,02 (ηΜ)7θ,25 (nM)1 PEI 0,0^g/ml 0,002 (nM)70,025 (nM)1 PEI 0,001 μ g/ml 0,0002 (nM)70,0025 (nM)1 * concentração calculada de Mw 'concentração calculada de Mn

A seguir da secagem por congelamento, as amostras foram tratadas com calor a 37° C durante 24 horas depois que o ensaio do adenovírus foi realizado. Os resultados são mostrados na Figura 6.

Os resultados demonstraram que quando PEI é usada nas 5 concentrações mais altas, baixa recuperação viral é observada. Conforme PEI é mais diluída, a recuperação viral melhora com uma concentração ideal em tomo de 0,01 μΐ/ml. A recuperação nesta concentração foi significativamente mais alta do que a recuperação viral usando excipientes de açúcar apenas. O excipiente contendo PBS não mostrou nenhuma recuperação viral.

Exemplo 8

Este experimento foi designado para obter um maior entendimento dos componentes de excipiente diferentes sobre a estabilidade do vírus durante a secagem por congelamento.

A concentração final de cada açúcar e de PEI é mostrada na

Tabela abaixo:

Excipiente Concentração final antes da secagem por congelamento Sacarose 1,5 M Estaquiose 0,125 M PEI (10-2) 2 nM*/25 nM1 PEI (10-4) 0,02 nM*/0,25 nM1 *concentração calculada de Mw 'concentração calculada de Mn

Frascos contendo excipiente mais vírus foram secos por congelamento durante a noite. A seguir da secagem por congelamento, os frascos foram incubados a 37° C durante 5 dias antes de recolocar em suspensão em 1 ml de DMEM (10 % de FBS). A solução resultante depois foi 20 diluída 1:1000 antes de realizar uma série de diluições 1:2 antes de proceder ao ensaio 293. Os resultados são mostrados na Figura 7. Exemplo 9

O Exemplo 9 foi designado para estudar as diferenças entre PEI de peso molecular alto e baixo. A PEI de peso molecular alto (“HPEI”) tem uma Mw de 750000 considerando que a PEI de peso molecular baixo (“LPEI”) tem uma Mw de 1300.

A concentração final de cada açúcar e de PEI é mostrada na

Tabela abaixo:

Excipiente Concentração final antes da secagem por congelamento Sacarose 1,5 M Estaquiose 0,125 M HPEI (10-2) 2 nM*/25 nM1 HPEI (10-3) 0,2 nM*/2,5 nM1 HPEI (10-4) 0,02 nM*/0,25 nM1 HPEI (10-5) 0,002 nM*/0,025 nM1 LPEI (10-2) 1,28 μΜ*/1,38 μΜ1 LPEI (10-3) 0,128 μΜ*/0,138 μΜ1 LPEI (10-4) 0,0128 μΜ*/0,0138 μΜ1 LPEI (10-5) 0,00128 μΜ*/0,00138 μΜ1 * concentração calculada em Mw 'concentração calculada em Mn

Frascos contendo excipiente mais adenovírus foram secos por

congelamento durante a noite. A seguir da secagem por congelamento, os frascos foram incubados a 37° C durante 5 dias antes de recolocar em suspensão em 1 ml de DMEM (10 % de FBS). A solução resultante depois foi diluída 1:1000 antes de realizar uma série de diluições 1:2 antes de proceder ao ensaio 293. Os resultados são mostrados na Figura 8.

Exemplo 10

O Exemplo 10 foi designado para examinar as diferenças na recuperação de adenovírus quando PEI (peso molecular alto; Mw 750000) foi diluída em PBS (“PEIP”) ou água (“PEIW”).

A concentração final de cada açúcar e de PEI é mostrada na

Tabela abaixo:

Excipiente Concentração final antes da secagem por congelamento Sacarose 1,5 M Estaquiose 0,125 M PEI (10-2) 2 nM*/25 nM1 PEI (10-3) 0,2 nM*/2,5 nM1 PEI (10-4) 0,02 nM*/0,25 nM1 PEI (10-5) 0,002 nM*/0,025 nM1 ^concentração calculada de Mw 1 concentração calculada de Mn

Frascos contendo excipiente mais vírus foram secos por congelamento durante a noite. A seguir da secagem por congelamento, os frascos foram incubados a 37° C durante 5 dias antes de recolocar em suspensão em 1 ml de DMEM (10 % de FBS). A solução resultante depois foi 5 diluída 1:1000 antes de realizar uma série de diluições 1:2 antes de proceder ao ensaio 293. Os resultados são mostrados na Figura 9.

Claims (19)

1. Método para preservar partículas virais, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) fornecer uma solução aquosa de um ou mais açúcares, uma polietilenoimina e as ditas partículas virais em que a concentração de polietilenoimina é menor do que 500 nM com base na massa molar média numérica (Mn) da polietilenoimina e na concentração de açúcar ou, se mais do que um açúcar estiver presente, a concentração de açúcar total é maior do que0,1 M; e (ii) secar a solução para formar uma matriz sólida amorfa compreendendo as ditas partículas virais.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de polietilenoimina está entre 0,0025 e 200nM, com base na massa molar média numérica (Mn) da polietilenoimina.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de polietilenoimina está entre 0,025 e 200nM, com base na massa molar média numérica (Mn) da polietilenoimina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de polietilenoimina é menor do que IOOnM, com base na massa molar média numérica (Mn) da polietilenoimina.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Mn da polietilenoimina está entre 20 e 1000 kDa e a concentração da polietilenoimina está entre 0,001 e 100 nM com base na Mn.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Mn da polietilenoimina está entre 300 e 20000 Da..

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a concentração de açúcar, ou concentração de açúcar total, está entre 0,5 e 2 M.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o açúcar é sacarose, estaquiose, rafinose ou um álcool de açúcar.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma solução de dois ou mais açúcares é usada.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a concentração de sacarose em relação ao outro açúcar está em uma razão de entre 3:7 e 9:1; e a concentração de polietilenoimina com base em Mn na etapa (i) está entre 0,0025 nM e 100 nM.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a mistura é seca por congelamento.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as partículas virais são compostas de um vírus vivo ou vírus morto.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vírus vivo é vírus integral ou vírus vivo atenuado.

14. Excipiente para a preservação de partículas virais, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarose, estaquiose ou rafinose ou qualquer combinação destes; e (b) polietilenoimina em uma concentração com base em Mn menor do que 500nM.

15. Uso de um excipiente como definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser para a preservação de uma partícula viral durante e depois da secagem por congelamento.

16. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o excipiente como definido na reivindicação 14.

17. Método para preparar uma vacina compreendendo partículas virais, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma solução aquosa de um ou mais açúcares, uma polietilenoimina e as ditas partículas virais em que a concentração de polietilenoimina é menor do que 500nM com base na massa molar média numérica (Mn) da polietilenoimina e na concentração de açúcar ou, se mais do que um açúcar estiver presente, a concentração de açúcar total é maior do que0,1 M; e (b) adicionar opcionalmente um adjuvante, tampão, antibiótico e/ou aditivo à mistura; e (c) secar a solução para formar uma matriz sólida amorfa compreendendo as ditas partículas virais.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a vacina é uma vacina multivalente.

19. Pó seco, caracterizado pelo fato de que compreende partículas virais preservadas, capaz de ser obtido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13.