CN101636486A - 保存病毒颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

一种保存病毒颗粒的方法，包括(i)提供含有一种或多种糖、聚乙烯亚胺及所述病毒颗粒的水溶液，其中聚乙烯亚胺的浓度以数均分子量(Mn)计为15μm或更低，且糖浓度或含有多种糖时的总糖浓度高于0.1m；和(ii)干燥上述溶液形成含所述病毒颗粒的无定形固体基质。

Description

保存病毒颗粒的方法
技术领域
本发明涉及使病毒颗粒免受热降解和干燥破坏作用的保存方法。本发明还涉及含有保存的病毒颗粒的产品。
背景技术
某些生物分子的足够稳定性，可分离、纯化并随后在室温下于溶液中保存。然而，这对于许多生物制品是不可能的，为确保储存期限，人们尝试了多种技术，包括低温保存、添加稳定剂、冷冻干燥、形成真空及空气干燥等。尽管采用了这些技术，某些生物制品在储存过程中稳定性仍不令人满意；另外，上述技术导致了成本的增加且使用不便。例如，冷藏运输和储存费用昂贵。此外，发展中国家通常无法做到医药产品如疫苗的冷藏运输。
具体来说，冷冻干燥或冷冻真空干燥的应力对某些生物制品非常不利。生物制品的冷冻干燥包括先将温度敏感的生物材料的溶液或悬浮液冷冻，再进行初次及二次干燥。该技术依据的原理为在零度以下的真空中，溶液无需溶解，其中的水分即可升华。对于生产固体蛋白质及疫苗制品来说，冷冻干燥是关键过程。然而水蒸气从冷冻的生物材料中扩散出去的速率非常低，因此这个过程非常耗时。此外，冷冻和干燥两个阶段可使蛋白质去折叠或变性。
WO-A-2006/0850082报道了一种干燥后或保存的产品，该产品包含糖，带电荷物质如组蛋白及对干燥或温度敏感的生物组份。其中，糖形成一种无定形固体基质。
然而，如果将上述保存的生物组份用于人或动物时，组蛋白可能引起免疫反应。
发明内容
本发明的发明人发现，病毒制品与含有一种、两种或多种糖及聚乙烯亚胺(PEI)的水溶液混合后，在冷冻干燥等干燥过程中可受到保护。在病毒制品中加入一种或多种糖可使病毒感染性和/或免疫原性得以部分保留。然而，令人惊讶的是，PEI与一种或多种糖一起加入可使病毒感染性和/或免疫原性的保留程度增加。在PEI浓度相对较低而一种或多种糖的浓度相对较高的情况下，病毒感染性和/或免疫原性的增加程度尤其高。
因此，本发明提供了一种保存病毒颗粒的方法，包括：
(i)提供含有一种或多种糖、聚乙烯亚胺及所述病毒颗粒的水溶液，其中聚乙烯亚胺的浓度以聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为15μM或更低；糖浓度或含有多种糖时的总糖浓度高于0.1M；和
(ii)干燥上述溶液形成含所述病毒颗粒的无定形固体基质。
本发明还提供：
-保存后的产品，其中包含病毒颗粒，一种或多种糖及聚乙烯亚胺；该产品为无定形固体形式；
-用于保存病毒颗粒的辅剂包括：
(a)蔗糖、水苏糖或棉子糖或其任意组合；及
(b)聚乙烯亚胺，其浓度以数均分子量(Mn)计为5μM或更低；
-在冷冻干燥过程中和冷冻干燥之后，保存病毒颗粒的辅剂的用途；
-包含辅剂的试剂盒；
-包含保存产品和可选的佐剂的疫苗；
-一种制备包含病毒颗粒的疫苗的方法，该方法包括：
(a)提供含有一种或多种糖、聚乙烯亚胺及所述病毒颗粒的水溶液，其中聚乙烯亚胺的浓度以聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为15μM或更低；糖浓度或含有多种糖时的总糖浓度高于0.1M，及
(b)可选加入佐剂、缓冲液、抗生素和/或添加剂至混合物中；及
(c)干燥上述溶液形成含所述病毒颗粒的无定形固体基质；及
-可通过本发明所述方法获得的含有保存的病毒颗粒的干燥粉末。
附图说明
图1所示为PEI、蔗糖(Suc)和棉子糖(Raf)组成的辅剂对口蹄疫病毒(FMDV-A)恢复的影响作用，口蹄疫病毒经冷冻干燥后于室温(RT)孵育24h或于37℃热处理48h(HT)。结果还表明磷酸盐缓冲液(PBS)在冷冻干燥过程中未提供保护作用，所示误差线为均值的标准误(n＝2)。
图2所示为PEI加入至蔗糖(Suc)和水苏糖(Stac)溶液中，增强了FMDV-O的恢复。利用含PEI、Suc及Stac的辅剂所得到的结果标为“Poly”，利用含Suc与Stac而不含PEI的辅剂所得到的结果标为“糖”，FMDV-O经过24h(“24小时HT”)及6天(“6天HT”)的热处理，由结果可见不同辅剂的保护作用。所示误差线为均值的标准误(n＝2)。
图3所示为辅剂中的起始糖浓度中对于维持FMDV-O的稳定性十分重要。将蔗糖和水苏糖的溶液(120Suc(3M)∶80Stac(0.75M))按体积比1∶10进行稀释，可使只含糖的辅剂完全丧失保护作用。所示误差线为均值的标准误(n＝3)。
图4.1所示为在PEI浓度可变的条件下，蔗糖(Suc)与水苏糖(Stac)的比例对冷冻干燥后经HT处理的FMDV-O恢复的影响。结果显示加入Stac后使FMDV-O的稳定性增加。每个PEI浓度下的结果均经过校对。用单侧ANOVA进行统计学分析并使用Turkey法进行比较后，结果表明仅含有Suc的混合物其病毒恢复要明显低于Suc与Stac的体积比为140∶60的混合物。所示误差线为均值的标准误(n＝8)。
图4.2所示为根据WO-A-2006/0850082的报道，在组蛋白浓度可变的条件下，Suc与Stac的比例对冷冻干燥后经HT处理的FMDV-O恢复的影响。组蛋白为组蛋白2A，购自Boehringer Mannheim。所示误差线为均值的标准误(n＝6)。
图5所示为Suc、Stac与PEI的比例优化对于腺病毒恢复的影响作用；腺病毒经12小时冷冻干燥及热处理24小时后，对其嗜斑形成单位(PFU)进行评估。结果表明，使用最高比例的Stac时，病毒PFU迅速下降。不使用Stac时，病毒PFU亦显著减少。仅使用PBS进行冷冻干燥时，病毒PFU为零。PEI的稀释度越低，则呈现增加腺病毒恢复的作用。
图6所示为腺病毒在PEI与糖中的恢复水平。辅剂PEI与糖的比例经过优化，并与3种对照：仅含糖的辅剂、PBS与初始滴度的腺病毒(冷冻干燥之前)进行比较。用PBS冷冻干燥对于病毒未显示出热保护作用。而在仅含糖的辅剂中，病毒显示部分活性，但是在含有PEI与糖的辅剂中，可观察到病毒具有更高的活性。所示误差线为均值的标准误(n＝2)。
图7所示为一种优选的辅剂，其中含有1.5M Suc、0.125M Stac与0.02nMPEI；同时证实该辅剂与仅含Suc/Stac的溶液相比更能增强腺病毒的恢复。而PEI作为一种单独辅剂在冷冻干燥过程中的保护作用很低甚至没有保护作用。
图8所示为比较两种不同的PEI对腺病毒恢复影响作用的试验结果；高分子量PEI的有效浓度大大低于低分子量PEI。PBS单独使用未显示病毒恢复水平。PEI与糖在优选浓度下显示出比单纯糖更高的病毒恢复。
图9所示为PEI用水稀释(“PEIW”)与用PBS稀释(“PEIP”)的作用比较。结果显示，与在用水稀释相比，PEI用PBS稀释时所对应的腺病毒滴度更高。当PBS与蒸馏水单独用作辅剂时，所对应的腺病毒恢复水平非常低。
具体实施方式
概述
本发明涉及通过将病毒颗粒与保存混合物接触来保存病毒颗粒的方法。保存混合物为PEI与一种或两种或多种糖的水溶液。使用低浓度的PEI及相对高浓度的糖。包含病毒颗粒的溶液继而干燥形成含有病毒颗粒的无定形固体基质。
如上所述，本发明可使病毒结构与功能在干燥过程中得以保存。病毒在干燥后其活力仍可保留。保存后的病毒颗粒其自身的热耐受性及干燥耐受性增强，使其储藏寿命延长，易于储存和运输，并避免了冷链配送的需要。因此，本发明提供了作为冷冻保护剂(防止冰冻破坏作用)、冻干保护剂(防止干燥破坏作用)和/或温度保护剂(防止温度高于或低于4℃的破坏)的保护作用。
病毒颗粒
一般来说，整个病毒或病毒体由保护性的蛋白外壳或衣壳围绕着核酸组成。病毒核酸可包括DNA、RNA，单链RNA，双链RNA，双链DNA，mRNA或上述任意组合。
衣壳由亚单位组成。许多病毒衣壳由呈二十面体或螺旋对称结构的亚单位组成。某些类型的病毒也包含如核衣壳等病毒结构，如蛋白尾部和复合外壁等超结构，及如与螺旋尾部结合的二十面体头部等复合结构。衣壳可被包膜包围。包膜由脂蛋白双层组成，且可含有来自于宿主细胞的细胞膜以及病毒本身的材料。例如，包膜可含有细胞来源的脂类及病毒来源的蛋白质。病毒也可含有糖蛋白刺突。
在本发明中使用的病毒颗粒可以是整个病毒如活病毒、死病毒、减毒活病毒、灭活病毒如化学灭活病毒或致病病毒或非致病病毒。活病毒具有感染和通过病毒宿主进行复制的能力。死病毒被灭活并没有感染宿主的能力。病毒颗粒也可以是病毒样颗粒(VLP)或核衣壳。
病毒颗粒可以是或可以来源于dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒、(-)ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒或dsDNA-RT病毒。作为示例而非限制，病毒颗粒可以是或可以源自于下列病毒家族中的病毒：
腺病毒，如人腺病毒A、B、C、D、E或F，包括血清型Ad5、Ad2、Ad6、Ad24；
杯状病毒科，如诺沃克病毒；
冠状病毒，如人冠状病毒299E或OC43以及SARS冠状病毒；
丝状病毒，如埃博拉病毒；
黄病毒，如黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒；
嗜肝病毒，如乙型肝炎病毒；
疱疹病毒，如单纯疱疹病毒，人疱疹病毒1、3、4、5或6；
正粘病毒，如流感病毒A、B、C其中包括但不仅限于A型流感病毒的血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9H2、H7N2、H7N3及N10N7；
乳头状瘤病毒，如人乳头状瘤病毒；
副粘液病毒，如人副流感病毒1型、麻疹病毒与流行性腮腺炎病毒；
微小病毒，如腺相关病毒；
微RNA病毒，如人脊髓灰质炎病毒及口蹄疫病毒(其中包括血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及Asia-1)；
痘病毒，如痘苗病毒、天花病毒和禽流感痘病毒(鸡痘)；
呼肠病毒，如蓝舌病毒群；
逆转录病毒，如慢病毒，包括人类免疫缺陷病毒1和2，以及；
披膜病毒，如风疹病毒。
在优选的实施方案中，病毒颗粒可以是或可以来自于腺病毒、正粘病毒、微小病毒、微RNA病毒或痘病毒。在特别优选的实施方案中，病毒颗粒可以是或可以来自于腺病毒、痘苗病毒、流感病毒或口蹄疫病毒。
病毒样颗粒(VLP)包括来自于病毒结构蛋白的病毒蛋白质，但缺乏病毒核酸。这些病毒结构蛋白质在过表达时自发自组装成颗粒。VLP不能复制。在某些实施方案中，VLP为嵌于脂双层中的病毒蛋白质。作为示例，VLP包括源于噬菌体的VLP、人乳头瘤病毒(HPV)L1主要衣壳蛋白VLP、诺沃克病毒衣壳蛋白VLP及由流感病毒结构蛋白(如M1蛋白、HA血凝素蛋白与N1神经氨酸酶蛋白)装配的VLP。
利用标准技术制备病毒颗粒对于本领域技术人员来说是公知的。例如，可利用准备使用的病毒株感染培养的宿主细胞以制备病毒颗粒，病毒感染宿主细胞后在其中复制，采用本领域公知的标准方法将病毒释放并进行收集和纯化。
保存混合物
本发明所述的保存混合物包含一种或多种糖及聚乙烯亚胺(PEI)的水溶液。任何合适的水溶液均可使用。溶液可为缓冲液。溶液可为HEPES溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)或纯水。
本发明中适用的糖包括还原糖，如葡萄糖、果糖、甘油醛、乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖；以及非还原糖，如蔗糖。糖可以是单糖、双糖、三糖或其他寡糖。术语“糖”包括糖醇。
单糖如半乳糖、棉子糖与甘露糖；双糖如乳糖与麦芽糖；以及四糖如水苏糖适用于本发明。海藻糖，伞形糖、毛蕊糖、异麦芽糖、纤维二糖、麦芽酮糖、松二糖、松三糖和蜜二糖也适用于本发明。甘露醇可作为适用的糖醇。
一种或两种或多种糖的优选水溶液为蔗糖、棉子糖或水苏糖溶液。具体来说，蔗糖是由葡萄糖和果糖组成的双糖；棉子糖是由半乳糖、果糖与葡萄糖组成的四糖；水苏糖是由两个Dα-半乳糖单位、一个Dα葡萄糖单位和一个Dβ果糖单位依次连接形成的四糖。蔗糖与棉子糖的组合或蔗糖与水苏糖的组合均可使用。
当本发明所述之保存混合物使用至少两种糖时，病毒的感染力或免疫原性得以有效保留。因此，一种或多种糖的溶液至少包含2种糖、或3种糖、或4种糖或5种糖。对于2种糖、3种糖、4种糖、5种糖、6种糖、7种糖、8种糖、9种及10种糖等，它们的组合也予以考虑。两种或多种糖的优选溶液包含蔗糖和棉子糖或蔗糖和水苏糖。
PEI是一种脂肪族聚胺，其特征在于具有重复的化学单位-(CH2-CH2-NH)-。此处所指的PEI包括聚乙烯亚胺的均聚物或共聚物。聚乙烯亚胺共聚物可以是随机或嵌段共聚物。例如，PEI可以由聚乙烯亚胺和另一种多聚物如聚乙二醇(PEG)的共聚物组成。聚乙烯亚胺可以是线性的或分支的。
此处所指的PEI也包括聚乙烯亚胺的衍生形式。聚乙烯亚胺在多个位置具有氮原子。氮原子位于末端氨基，如R-NH2；以及位于多聚物结构中烷基或烯基之间的内部基团，如R-N(H)-R′；以及位于多聚物分支的交叉点，如R-N(-R′)-R″，其中R、R′、R″可以是烯烃基。氮原子中心除与氢原子连接外，还可与烷基或芳烃基连接。上述烷基或芳烃基可以是取代的或未取代的烷基或芳烃基。烷基通常为C1-C4烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；芳烃基通常为苯基。
PEI可以是与其他多种聚合物，如聚乙二醇，进行共价结合的聚乙烯亚胺。经过其他方法修饰的PEI也已经开发，某些已商品化：如分支状PEI25kDa、
Figure G2008800089268D00081
LMW-PEI 5.4kDa、拟分支状PEI(Pseudodendrimeric PEI)、PEI-SS-PEI、PEI-SS-PEG、PEI-g-PEG、PEG-co-PEI、PEG-g-PEI、PEI-co-L-乳酰胺-co-琥珀酸酰胺、PEI-co-N-(2-羟乙基-乙烯亚胺)、PEI-co-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、PEI-g-PCL-block-PEG、PEI-SS-PHMPA、PEI-g-葡聚糖10000及PEI-g-转铁蛋白-PEG、
Figure G2008800089268D00082
-g-PEI。
所用PEI的数均分子量(Mn)范围较大，约在300Da至800kDa之间。优选的数均分子量在300至2000Da之间、在500至1500Da之间、在1000至1500Da之间、在10至100kDa之间、在20至100kDa之间、在30至100kDa之间、在40至100kDa之间、在50和100kDa之间、在60和100kDa之间、在50至70kDa之间、或在55至65kDa之间。具有相对较高的Mn(约60kDa)或具有相对较低的Mn(约1200Da)的PEI较适用。
优选的PEI重均分子量(Mw)在500至1000kDa之间。最优选的Mw在500至2000Da之间、在1000至1500Da之间、在1至1000kDa之间、在100至1000kDa之间、在250至1000kDa之间、在500至1000kDa之间、在600至1000kDa之间、在750至1000kDa之间、在600至800kDa之间、或在700至800kDa之间。具有相对较高Mw(约750kDa)或具有相对较低Mw(约1300Da)的PEI较适用。
PEI的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定。例如，Mw可通过光散射、小角度中子散射(SANS)、X射线散射或沉降速率法进行测定。Mn可通过凝胶渗透色谱、粘度测定法(Mark-Houwink公式)及依数方法如蒸汽压渗透压测定法或端基滴定法进行测定。
多种形式的PEI已商业化(如Sigma及Aldrich公司)。例如，在本发明中使用的分支状、分子量相对较高的PEI(Mn约60kDa，Mw约750kDa)即为商业化产品(Sigma P3143)。该PEI的分子式如下图所示：
Figure G2008800089268D00091
在本发明中使用的分子量相对较低的PEI(Mw约1300Da，Mn约1200Da)也为商业化产品(Aldrich 482595)。
本发明提供了一种保存混合物，其中包含PEI及一种或两种或多种糖的水溶液。一般来说，病毒颗粒与保存混合物混合形成水溶液并用于干燥。
用于干燥的水溶液中糖的浓度高于0.1M。用于干燥的水溶液中糖的优选浓度，以及在一种以上的糖存在时，用于干燥的水溶液中糖的优选总浓度至少为0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.75M、0.9M、1M、或2M一直到室温饱和、或一直到3M、2.5M或2M。糖浓度或在一种以上的糖存在时的总糖浓度可从0.5至2M。当一种以上的糖存在时，每种糖的浓度可从0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.75M、0.9M、1M或2M一直到室温饱和，或一直到3M、2.5M或2M。
用于干燥的水溶液中PEI的浓度一般来说在不超过15μM(以Mn计)。以Mw计，PEI的浓度不超过10μM。这样的PEI浓度对于保存病毒的感染力或免疫原性十分有效。
在本发明优选的实施方案中，所用的PEI浓度以Mn计低于5μM、低于500nM、低于100nM、低于40nM、低于25nM、低于10nM、低于5nM、低于1nM、低于0.5nM、低于0.25nM、低于0.1nM、低于0.075nM、低于0.05nM、低于0.025nM、或低于0.0025nM。一般来说，PEI的浓度以Mn计为0.0025nM或更高、或0.025nM或更高、或0.1nM或更高。合适的以Mn计的PEI浓度范围在0.0025nM至5μM之间，或在0.025至200nM之间。
优选的以Mw计的PEI浓度低于5μM、低于1μM、低于0.1μM、低于0.01μM、低于5nM、低于4nM、低于2nM、低于1nM、低于0.5nM、低于0.25nM、低于0.1nM、低于0.05nM、低于0.02nM、低于0.002nM、或低于0.1nM。一般来说，PEI浓度以Mw计为0.00001nM或更高、0.001nM或更高、或0.01nM或更高。合适的以Mw计的PEI浓度范围在0.00001至20nM之间，或在0.0001至20nM之间，或在0.0001至5nM之间。
我们发现分子量相对较高的PEI，其有效浓度低于分子量相对较低的PEI。因此：
-当使用Mw相对较高的PEI时，例如Mw在20至1000kDa范围内，优选的PEI浓度以Mw计在0.001至5nM之间。当使用Mw相对较低的PEI时，例如Mw在300Da至10kDa范围内，优选的PEI浓度以Mw计在0.0001至10μM之间。
-当使用Mn相对较高的PEI时，例如Mn在20至1000kDa范围内，优选的PEI浓度以Mn计在0.001至100nM之间。当使用Mn相对较低的PEI时，例如Mn在1Da至10kDa范围内，所用的PEI浓度以Mn计在0.0001至10μM之间。
在一实施方案中，与病毒颗粒首先接触的保存混合物所含PEI的浓度以Mn及低于2μM，同时含有一种或多种糖的溶液，其浓度至少为0.1M、至少为0.2M、至少为0.3M、至少为0.4M、至少为0.5M、至少为0.75M、至少为0.9M、至少为1M或至少为2M。
当含有一种或多种糖的溶液包含两种或多种糖时，最有效的PEI浓度将依赖于保存混合物中糖的特定类型。例如，当两种或多种糖中的一种是蔗糖而另一种是水苏糖时，PEI以Mn计的浓度低于2μM，特别是在0.0025nM和2μM之间的浓度，可起到有效的保存作用。在优选的实施方案中，本发明所述方法包括将病毒颗粒与水溶液混合，该水溶液含有(1)为一种或多种糖的水溶液，多种糖中有一种是蔗糖而另一种是水苏糖；而且(2)含有PEI，其浓度以Mn计低于2μM。
当两种或多种糖的水溶液包含蔗糖和棉子糖时，我们发现优选的PEI浓度低于2μM，或在0.0025nM至2μM之间。因此，在另一实施方案中，本发明所述方法包括将病毒颗粒与水溶液混合，该水溶液(1)包含蔗糖与和棉子糖；而且(2)含有PEI，其浓度在0.0025nM至2μM之间。当使用分子量相对较高的PEI时，例如Mn在10与100kDa之间，优选的PEI浓度以Mn计在0.1至100nM之间。
在保存混合物中使用两种糖的组合时，本发明的发明人研究了上述糖的不同摩尔浓度比对病毒颗粒保存的影响。一种糖与另一种糖的特定摩尔浓度比对保存效果影响明显，但确切比例则依赖于所用糖的种类。因此，在本发明的一个实施方案中，两种或多种糖中的一种为蔗糖，相对于其他糖的摩尔浓度比在3∶7与9∶1之间，优选的比例为至少为4∶6、至少为50∶50、至少为6∶4、至少为7∶3、至少为8∶2、或至少为9∶1。就蔗糖和水苏糖来说，蔗糖与水苏糖的摩尔浓度比至少为3∶7、至少为4∶6、至少为50∶50、至少为6∶4、至少为7∶3、至少为3∶1、至少为8∶2或至少为9∶1。上述比例已证实对病毒保存特别有效。优选两种或多种糖的溶液中蔗糖与水苏糖的优选摩尔浓度比在50∶50与8∶2之间。
在另一实施方案中，本发明所述之保存混合物包含一种水溶液，该水溶液(1)含有两种或多种糖，其中一种为蔗糖，相对于其他糖的摩尔浓度比在3∶7与9∶1之间；而且(2)含有PEI，其浓度以Mn计小于100nM或在0.025至100nM之间。
保存
本发明所述之保存技术对于保护病毒颗粒免受干燥、冷冻及温度的破坏作用特别适用。病毒颗粒与本发明所述之保存混合物混合，通过干燥该混合物，可使病毒颗粒得以保存。在干燥中，可形成无定形固体。此处“无定形”意为非结构的以及未观察到规则或重复组织的分子(即非晶体)。
一般来说，干燥可通过冷冻干燥、瞬时冰冻、真空干燥或喷雾干燥实现。冷冻干燥为优选方法。通过除去材料中的水分并将其密封于容器中，可使材料便于保存和运输，并在将来易于恢复至原始状态。
冷冻干燥是一个脱水的过程，通常用于保存易腐坏的材料，或使材料更易于运输。冷冻干燥对于固体蛋白质和疫苗产品的生产来说是一个关键过程。然而，在冷冻干燥过程中，生物材料容易受到冷冻和干燥的破坏，并可以引起蛋白质去折叠和变性。另外，水蒸气从冷冻生物材料中扩散的速率非常缓慢，因此整个过程十分耗时。本发明所述之保存技术可使生物材料免受冷冻干燥过程中干燥和/或温度应力的破坏作用。
本技术中主要包括三个过程，即冷冻、初次干燥和二次干燥。冷冻过程通常使用冷冻干燥机完成。在该过程中，非常重要的一步是将生物材料冷却至其低共熔点，此点为材料的固相和液相能共存的最低温度。这一步保证了在随后步骤中发生升华而不发生融解。另外，无定形材料没有低共熔点，但是具有一个临界温度点，材料必须保持在低于此点的温度下，以防止在初次和二次干燥过程中发生复溶或崩解。
在初次干燥过程中，压力降低，并给材料提供足够的热量使水升华。所需热量可通过升华分子的升华潜热计算。材料中大约95％的水在此过程中升华。初次干燥过程可缓慢进行，因为过多的热量可降解或改变生物材料的结构。为了控制压力，可使用部分真空来加速升华。冷凝槽和/或冷凝板可提供水蒸气再次凝固的表面。
在二次干燥过程中，冷冻过程中吸收的水分子发生升华。此时温度升高并高于初次干燥过程的温度，以破坏形成于水分子和冷冻生物材料之间的任何理化相互作用。压力通常也降低用来促进升华。冷冻干燥过程完成后，在材料密封前通常使用惰性气体如氮气除去真空。
在一实施方案中，通过冷冻混合物例如通过瞬时冰冻的方法使其干燥。术语“瞬时冰冻”意为冰冻在瞬间完成，例如将产品浸于液氮中。在某些实施方案中，“瞬时冰冻”所指为一冷冻步骤，并在短于1至2秒的时间内完成。
在特定的实施方案中，真空干燥法用来(约1300Pa)进行干燥。然而，真空干燥法对于本发明及其他实施方案并不是必需的。可对病毒颗粒接触的保存混合物进行转干(即旋转干燥法)或冷冻干燥(如下文进一步所述)。本发明所述方法有利之处还在于其包括将含有病毒颗粒的保存混合物置于真空。使用的真空其压力为20000Pa或更低，优选压力为10000Pa或更低。使用真空的时间至少为10小时，优选时间为16小时或更长。作为本领域技术人员的公知内容，真空的使用时间将依赖于样品的大小、所用的机器及其他参数。
在另一实施方案中，病毒颗粒与本发明所述之保存混合物混合，并通过喷雾干燥法将其干燥。该技术对于本领域技术人员是公知的，其涉及一种将液体物料通过热气体，如空气、或不含氧气体或氮气，使该物料获得干燥的方法。液体物料被雾化成小液滴喷射出去，然后在干燥室内通过接触热气体得到干燥。
样品一旦与保存混合物混合，即可干燥成含不同残余水分的样品，并可在高于冷藏温度的条件下进行长期保存，例如在大约4℃至45℃的范围内；也可在低于冷藏温度下保存，例如在0℃至-70℃甚至更低的温度范围内。
使用本发明所述方法，病毒颗粒与保存混合物的混合物干燥形成一种无定形固体基质。在本发明的一个实施方案中，获得的无定形固体为干燥粉末形式。该无定形固体可为流动颗粒形式。
然而，在本发明所述方法的另一实施方案中，包含病毒颗粒的混合物于固体支持物上干燥。该固体支持物包括珠状物、试管、模具、塑料支持物、微量滴定盘、微芯片(例如硅、硅玻璃或金芯片)或膜状物。另一实施方案提供了一种固体支持物。按本发明所述之方法保存的病毒颗粒可干燥并附着于该固体支持物。
本发明提供一种包含辅剂的试剂盒，该辅剂包含(1)一种或多种糖以及(2)PEI的水溶液。优选的试剂盒包含其他适合于兽医用或药用目的的辅剂、载体或稀释剂，同时提供使用说明。试剂盒也可包含辅助物质，如佐剂、凝固剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶化剂或增稠剂或色素，上述辅助物质有利于本发明所保存的病毒颗粒传递至病人体内或靶细胞内部。
关于病毒颗粒的保存可参考病毒颗粒对于物理降解和/或生物学活性丧失的耐受性，生物学活性的丧失包括核酸或蛋白质的降解、转导效率的丧失、病毒感染性的丧失、免疫原性的丧失、病毒滴度的丧失或疫苗活力的丧失等，造成生物学活性丧失的条件包括暴露于干燥、冷冻、温度低于0℃、低于-5℃、低于-10℃、低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃、冷冻干燥、室温、温度高于-10℃、或高于-5℃、高于0℃、高于5℃、高于10℃、高于15℃、高于20℃、高于25℃或高于30℃。按本发明所述，优选的保存方法包含抗冻剂(针对冰冻破坏的保护)、冻干保护剂(针对干燥破坏的保护)和/或温度保护剂(针对温度高于或低于4℃的保护)。
病毒颗粒保护的测定
按本发明所述病毒颗粒的保护作用可通过测定病毒感染力、免疫原性、转染率、病毒滴度及宿主细胞应答等参数进行评估。上述技术为本领域技术人员所公知。
病毒感染力和/或免疫原性的测定方法为本领域专业人员所公知，这些测定方法包含但并不仅限于病毒在培养细胞中生长、血液中病毒特异性抗体的检测、诱导T细胞和/或B细胞产生应答的能力、病毒抗原的检测、病毒编码DNA或RNA的检测，或利用显微镜观察病毒颗粒。
另外，病毒的存在可引起宿主细胞形态学的改变，此种改变可被测定并用来指示病毒活性。宿主细胞由于病毒感染而产生的可被检测的变化作为细胞病变效应为人们所公知。细胞病变效应包括胞体变圆、定向障碍、胞体膨胀或皱缩、细胞死亡并脱落。许多病毒诱导感染细胞产生细胞凋亡(程序性细胞死亡)，细胞凋亡可通过TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术)测定法和其他被本领域专业人员所公知的技术进行测定。
病毒对宿主细胞基因的表达调控也有影响作用，分析这些基因可用于指示病毒活力是否存在。此技术包括向细胞培养基中添加试剂用来完成病毒表达产物的酶学或化学反应。另外，病毒基因组可被修饰以增加病毒感染力的检测。例如，通过遗传修饰病毒基因组可使其表达标记蛋白，标记蛋白可很容易地利用相差显微镜、荧光显微镜或放射显影进行检测。标记蛋白可以是表达的荧光蛋白如GFP(绿色荧光蛋白)或表达的酶，该酶可用于显色或放射标记反应中。标记蛋白也可以是某种基因产物，可中断或抑制所检测细胞的特定功能。
噬斑形成单位可用来测定病毒感染力并可指示病毒滴度。在此种测定中，合适的宿主细胞生长于平坦表面直至形成覆盖塑料培养瓶或培养板的细胞单层。特定宿主细胞的选择依赖于病毒的种类。合适的宿主细胞包括但并不仅限于CHO、BHK、MDCK、10T1I2、WEHI细胞、COS、BSC1、BSC40、BMT 10、VERa、WI38、MRC5、A549，HT1080、293、B-50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos-2、Huh7、HEK293及HeLa细胞。单层宿主细胞被病毒颗粒感染后，用半固体培养基置换液体培养基，这样可使病毒颗粒繁殖。病毒感染的范围在繁殖点附近。当病毒颗粒感染细胞、复制并杀死细胞后则形成嗜斑。在单层细胞中，一个嗜斑指示一处具有细胞病变效应的细胞区域；在显微镜下，此处细胞表现为圆形并比其他细胞暗，或用肉眼观察时呈白色斑点；由于病毒诱导的裂解，嗜斑中心缺少细胞。新复制的病毒感染周围细胞后，周围细胞也被杀死，这个过程可以重复数次。之后将细胞用染料染色，例如使用只能染活细胞的甲基蓝染料；嗜斑中的死细胞不能被染色，因此在有色背景上显示为未染色的区域。
每个嗜斑是病毒感染细胞并伴随病毒自我复制和传播的结果。然而，无法杀死细胞的病毒则不能产生嗜斑。在单层细胞中，一个嗜斑指示一处具有细胞病变效应的细胞区域；在显微镜下，此处细胞表现为圆形并比其他细胞暗，或用肉眼观察时呈白色斑点；由于病毒诱导的裂解，嗜斑中心缺少细胞。病毒滴度的指示可通过测定嗜斑形成单位(PFU)获得。PFU代表产生嗜斑的一个病毒或病毒组。例如，如果一种病毒贮液的滴度为1000pfu/ml，这就表示每ml贮液含有1000个够能形成嗜斑的病毒颗粒。按本发明所述方法保存的生物材料样品，其中病毒感染的水平可以测定，并可与对照样品进行比较，例如新鲜获得的病毒或没有加入本发明所述之保存混合物并易受干燥和/或温度变化影响的样品。
一般来说，按本发明进行保存，之后在37℃孵育5天的所得产品，其病毒滴度至少是孵育前病毒滴度或保存及孵育前病毒滴度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
本发明中某些类型的病毒颗粒，例如病毒蛋白质、VLP、或某些未活化的病毒在嗜斑测定中不具有形成嗜斑的能力。如果是这样，可通过其他方法测定保存作用，例如可采用检测免疫原性的方法，这些方法为本领域专业人员所公知。例如，体内和体外用于检测抗体或细胞介导的宿主免疫反应的测定方法在本领域中是公知的并适用于本发明。如，在动物模型中使用本发明保存的病毒颗粒，通过比较免疫前和免疫后血清抗体的数量、亲和力和表型分布，可检测基于抗体的免疫反应。
本发明保存的病毒颗粒的用途
疫苗
本发明保存的病毒颗粒可作为疫苗使用。例如，诸如完全灭活病毒、减毒活病毒、化学失活病毒、VLP或活病毒载体等保存的病毒颗粒均适合用作疫苗。作为疫苗，本发明保存的病毒颗粒可用作抗原或编码诸如病毒蛋白质等抗原，用于治疗或预防多种疾病，其中包括但并不仅限于病毒感染或病毒感染的后遗症。病毒感染的后遗症又包括但并不仅限于病毒引起的毒性反应、肿瘤及过敏。此类抗原含一个或多个表位，这些表位可刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞抗原特异性免疫应答。
本发明中保存的疫苗可用于治疗由如下病毒引起的感染，包括人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、流感病毒(A、B及C型)、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺瓦克病毒、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、风疹病毒、人类T细胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒和牛痘病毒。疫苗还用于提供合适的免疫应答治疗多种兽病，如手足口病(包括O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及Asia-1等血清型)、冠状病毒、蓝舌病、猫白血病病毒、禽流感、亨德拉和尼帕病毒、瘟病毒、犬细小病毒及牛病毒性腹泻病毒。在一实施方案中，疫苗为亚单位、共价或多价疫苗。例如，本发明中保存的疫苗可用来治疗两种或多种病毒引起的感染，如麻疹、腮腺炎和风疹(MMR疫苗)。
本发明中疫苗的组份包括混有本发明所述之保存混合物的病毒颗粒，其中保存混合物包含一种或多种糖及PEI。疫苗的组份还包含适宜的缓冲液及添加物如抗生素、佐剂或其他能提高针对免疫系统特定细胞的疫苗抗原保存作用的分子。
多种在本技术领域中公知的佐剂可以使用，其目的是为了提高疫苗的效能和/或调节体液和细胞免疫应答。适用的佐剂包括但并不仅限于，水包油含乳液佐剂或油包水佐剂，如矿油、铝佐剂、磷酸鲨稀佐剂、完全/不完全弗氏佐剂、细胞因子以及其他任何可作为免疫刺激剂用来提高疫苗效力的物质。
本发明疫苗的组份可以采用冷冻干燥的形式，其目的是为了便于储存并使产品获得最长的储藏寿命。这将使得疫苗的保存期延长并有助于保持其免疫原性、免疫效能和免疫效力。本发明所述之保护混合物特别适合于保存病毒物质免受冷冻干燥过程中产生的干燥及温度的破坏作用。因此，在病毒或病毒颗粒收集后不久以及在进行冷冻干燥之前，适于在其中加入保护混合物。
为检测按本发明所述方法制备的疫苗的保存效果，可使用本领域技术人员所公知的技术对疫苗的效能进行测定。例如，在合适的动物模型中，通过监测抗体的产生或针对疫苗的免疫细胞应答反应，来测定细胞或体液免疫应答的产生。按本发明所述之方法制备的疫苗样品，其引起免疫应答反应的能力可与没有使用相同保护技术的疫苗进行比较。
病毒载体
按本发明所述之方法保存的病毒或病毒载体可用来向靶细胞转移异源基因或其他核酸序列。在合适的情况下，异源序列(即转基因)编码的蛋白质或基因产物能够在靶细胞中表达。合适的转基因包括必要的报告基因、治疗基因和基因编码免疫原性多肽(用于疫苗)的基因。基因治疗是一种用于治疗或预防基因表达缺陷疾病的方法，该方法涉及将治疗基因插入至细胞内，然后表达和产生所需要的蛋白质。具体来说，保存的病毒或病毒载体可用于基因治疗，并将治疗性转基因或基因编码的免疫原性多肽转移至病人体内。
在一优选的实施方案中，保存的病毒颗粒为活病毒载体。此处“活病毒载体”意为对于目标种属来说无致病性或低致病性的活病毒载体、报告基因或治疗蛋白质，活病毒载体中还插入了一个或多个基因编码的抗原用于刺激产生针对其他病毒或微生物的免疫应答反应。具体来说，核酸引入至病毒载体中，仍能复制并表达出插入的核酸序列所编码的多肽；至于疫苗，则在感染的宿主动物中诱导产生免疫应答反应。在一实施方案中，活病毒载体为减毒的活病毒载体，即其经过修饰，毒性(引发疾病的能力)低于野生型病毒。
使用重组病毒作为潜在疫苗的依据包括将来源于病原体的特定基因整合至非致病的或减毒的病毒基因组中。重组病毒无论在体内还是体外均能感染特定的真核细胞，并使其表达重组蛋白。
通过插入编码来源于病原体序列的基因，所得活病毒载体疫苗可优于活减毒疫苗、未活化疫苗、亚单位或DNA方法。活病毒载体安全性的一个最重要的方面在于，接受者可对来自于病原体的特定抗原产生免疫，而自身并未暴露于致病物。另外，安全性还可通过选择病毒载体来调节，该载体对于宿主细胞来说或是减毒的，或者不能在宿主中复制，但仍具有表达目标异种抗原的能力。在目标物种中具有安全史的疫苗株其安全性更有保证。人们已经开发了数个系统，其中载体的必需基因被删除，而细胞系统可提供其缺失的功能，疫苗的制备也可在细胞系统中完成。
多种载体如逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、腺病毒及腺相关病毒载体可用于将异源基因传递至靶细胞。目标异源基因可插入至病毒载体中。本发明所示之病毒载体包括具有复制起始区的病毒载体，优选的异源基因表达启动子以及优选的启动子的调控因子。例如，在本发明中实施方案中所用的腺病毒在E1和/或E3以及(或)E4区域有缺失，或使缺失达到放大以接受异源DNA。
病毒载体可包含组成型启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40大T抗原启动子、小鼠乳癌病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)、小鼠乳癌病毒LTR启动子、SV40早期启动子、腺病毒启动子如腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、HSV启动子(如HSV IE启动子)、HPV启动子如HPV上游调节区(URR)或Rous肉瘤病毒启动子，组成型启动子与其他病毒核酸序列有效地与目标异源基因连接。组织特异性或可诱导的启动子也可用来控制目标异源基因的表达。也可选择与用于表达的宿主细胞相容的启动子。
病毒载体也可包含其他转录调控元件如增强子。广义的增强子为顺式作用元件，当与启动子/基因序列有效连接时，可提高该基因序列的转录水平。与其他表达控制元件(如启动子)相比，增强子能够在距离目标序列更远的位置行使功能，并可在目标序列的上下游进行调控。增强子已确定存在于多种病毒中，包括多瘤病毒、BK病毒、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、猴病毒40(SV40)、Moloney肉瘤病毒、牛乳头瘤病毒以及Rous肉瘤病毒。适宜的增强子包括SV40早期基因增强子、来源于Rous肉瘤病毒长末端重复序列的(LTR)增强子/启动子以及来源于人或小鼠CMV的调控元件，如CMV内含子A序列所包含的调控元件。
包含目标异源基因的病毒载体可在贮藏之前、或在进行冷冻干燥等保存处理之前、或在给与病人或宿主细胞之前按本发明所述方法进行保存。
本发明所述病毒载体还包括编码具有公知抗病毒活性的多肽的核酸、免疫调节分子诸如细胞因子(TNF-α、干扰素如IL-6及IL-2、干扰素、集落细胞刺激因子如GM-CSF等)、佐剂及共刺激和辅助分子。作为替代方案，上述多肽可在本发明所述之保存混合物中单独提供，或者与本发明所述之病毒载体同时、依次或分开使用。
作为优选方案，可利用多种本领域公知的病毒技术将本发明保存的病毒载体引入至合适的宿主细胞中，例如用重组的病毒载体如逆转录病毒、单纯疱疹病毒及腺病毒感染宿主细胞。作为优选方案，含有目标基因的按本发明保存的病毒载体使用时可通过感染宿主细胞来介导。
人们已经开发了多个基于病毒的系统用于转染哺乳动物细胞。
例如，可利用本领域公知的技术将选择的重组核酸分子插入至载体中并包装成逆转录颗粒。然后，将重组病毒分离并在体内或离体条件下传递至宿主细胞。逆转录载体可来自于Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)。在逆转录载体中，一个或多个病毒基因(gag、pol以及env)通常被目标基因所置换。
多种腺病毒是公知的。腺病毒C亚族血清型2及5为常用载体。野生型腺病毒基因组大约35kb，其中30kb可被外源DNA替换。
腺病毒载体中包含四种具有调控功能的早期转录单位(E1、E2、E3及E4)，以及一种编码结构蛋白的晚期转录产物。腺病毒载体E1和/或E3基因可失活。缺失的基因由辅助病毒及质粒反向提供，或自身整合至辅助病毒的基因组中。腺病毒载体可利用E2a温敏突变体或E4缺失突变体。最小的腺病毒载体仅包含反向末端重复序列(ITR)及转基因序列周围的包装序列，所有必需的病毒基因均由辅助病毒反向提供。合适的腺病毒载体因此包括Ad5载体和猴腺病毒载体。
病毒载体也可来自于痘病毒家族，包括牛痘病毒和禽流感痘病毒如鸡痘疫苗。例如，修饰的Ankara牛痘病毒(MVA)为牛痘病毒的一种，它在多数细胞以及正常人体组织中不能复制。因此，重组MVA载体可用来传递本发明所述的多肽。
其他种类的病毒如腺病毒相关病毒(AAV)及单纯疱疹病毒(HSV)可用来开发成合适的载体系统。
辅剂
在本发明中，也提供了用于保存病毒颗粒的辅剂。辅剂包含(a)蔗糖、水苏糖、海藻糖、糖醇或棉子糖或它们的任意组合，以及(b)以Mn计浓度不超过5M的PEI。此处“辅剂”意为用作本发明所述之病毒颗粒载体的非活性物质(例如当病毒颗粒用作疫苗时)。病毒颗粒(例如用于疫苗)通常溶于或与辅剂混合，该辅剂作为病毒颗粒的保护剂和/或在某种程度上对使用及在人体中的吸收起辅助作用。辅剂不仅包含本发明的保护混合物，也包含其他本领域所公知的保护剂，如抗氧化剂、润滑剂及粘合剂，只要这些成份不会显著降低本发明所述之保存混合物的保护效果。
固体支持物上的测定方法
于固体支持物上保护的病毒颗粒可用于诊断或监测疫苗接种。例如，病人样本如体液(血液，尿液，唾液，痰，胃液等)可按本发明所述方法进行保存，即将包含病人样本及本发明所述之保护混合物的混合物于固体支持物上干燥。
保存的病人样本，然后可使用抗病毒抗体(例如使用ELISA)检测其中病毒抗原/表位的存在。作为替代方案，目标病毒颗粒可按本发明所述方法进行保存，即将包含病毒颗粒及本发明所述之保护混合物的混合物于固体支持物上干燥。将病人样本与固体支持物表面含有的目标病毒颗粒接触，可检测病人样本中抗病毒抗体的存在。抗原抗体复合物的形成产生可测定的信号。样本中病毒颗粒抗原抗体复合物的存在和/或数量可用来指示病毒感染情况或病人的疫苗接种情况。
使用方法
在某些情况下，冻干制品复原后，按本发明保存的疫苗或病毒颗粒可通过多种公知的方法和技术用于受者体内。例如，保存的疫苗可为注射剂、混悬剂或乳剂，并可通过非口服、皮下、口腔、表皮、皮内、肌肉注射、动脉内给药、腹腔给药、使用传统针和注射器的静脉注射、或使用液体快速注射系统等方式给药。保存的疫苗可局部给药至皮肤或粘膜组织，例如鼻腔、气管内部、肠道、舌下，直肠或阴道，或作为微细喷雾剂适用于呼吸道或肺内给药。
在一实施方案中，本发明所述方法还包含将混合物处理为适合于使用的液体注射剂的过程。作为优选方案，该方法还包含将混合物处理为适合于摄取或肺内给药的剂型。
保存的产品用于个体时，给药量与剂型相匹配，并为有效预防量和/或有效治疗量。本发明中保存的产品或疫苗可用于预防或治疗目的。此处使用的术语“治疗的”或“治疗”包括如下含义：预防感染或感染复发，减轻或消除症状，减少或完全消除病原体。治疗过程受到预防(感染之前)或治疗效果的影响(感染之后)。
下列实施例阐述本发明。实施例1、2、3、4、5、6、7、8及10中使用的PEI其Mw为750000，Mn为60000(Sigma P3143)。实施例9中使用的高分子量PEI其Mw为750000，Mn为60000(Sigma P3143)。实施例9中使用的低分子量PEI其Mw为1300，Mn为1200(Aldrich 482595)。实施例中使用的组蛋白为组蛋白2A，购自Boehringer Mannheim。
下列常规试验技术在本发明中使用：
冷冻干燥
样品容器涡旋振荡后，置于冷冻干燥机的托盘中于-80℃冷冻，样品容器中含有30ml的水，并带有部分插入的胶塞。冷冻后的样品瓶转移至预冷式冷冻干燥机(Thermo Fisher)的密封仓中(Thermo Fisher)干燥16小时。在真空状态下，样品瓶从冷冻干燥机取出之前，胶塞完全塞入。
FMDV测定
病毒和细胞在DMEM培养基中培养，培养基中含10％胎牛血清、20mM谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)及链霉素(100μg/ml)。Eagles覆盖培养基(Eagles overlay medium)配制时可将25ml溶于水的Indubiose琼脂糖(24mg/ml)加入至75ml Eagles覆盖培养基中，然后加入5ml磷酸胰蛋白胨肉汤，1ml胎牛血清(FBS)及1ml青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。
BHK-21细胞在6孔组织培养板中接种并于37℃培养过夜直至形成80-90％的覆盖水平。冷冻干燥的样品在DMEM中重新悬浮。细胞单层用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤并与100μl FMDV样品于37℃孵育15分钟。细胞单层用2ml Eagles覆盖培养基覆盖，这可使样品在37℃孵育40-48小时之前放置于室温(RT)。
感染的细胞单层用2ml亚甲蓝(4％PBS甲醛溶液)染色24小时并记录观察到的嗜斑。
腺病毒测定
在96孔平底细胞培养板(Jeacons，UK)以105个/ml的细胞浓度接种HEK293细胞(100μl每孔)并于37℃，5％CO2下保存。在获得90％的覆盖水平后，将含有腺病毒与辅剂的样品复原至1ml含5％FBS的DMEM培养基中。取100ml复原的样品加入至900ml DMEM中，即采用1∶10的稀释过程。然后，将所得100ml稀释后的病毒加入至培养板的第一行，并沿板进行1∶2的稀释。对于另一种辅剂重复此过程。48小时后，利用荧光显微镜对每孔的GFP细胞进行计数。
统计分析
使用PRISM Graphpad软件(版本4.00)并利用学生氏T检验法分析不同辅剂之间的显著性。作为替代方案，需要进行多组成对比较，利用单边ANOVA并用Turkey法进行组间检验。P值表示为*p＜0.10；**p＜0.05；及***p＜0.005。
实施例1
表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒滴度为4.1×107pfu/ml(每ml组织培养基)，将其按1∶5(v/v)的比例与含有蔗糖(饱和溶液，约64％，w/v)、水苏糖(饱和溶液，约64％，w/v)及PEI(33μg/ml)的辅剂混合，辅剂中蔗糖、水苏糖与PEI的比例为3∶1∶1(v/v)。混合物按下列过程进行冷冻干燥：样品于液氮中冷冻，并在室温真空中干燥16小时。在这之后，样品于-20℃储存直至使用或立即使用。
腺病毒在293A细胞中利用嗜斑检测法检测。结果如下表所示。
  处理过程   滴度(pfu/ml)
  干燥前   4.8×107
  干燥后   4.3×107
  干燥后并于37℃放置5天   4.1×107
实施例2
设计本实验用来检测辅剂成份对于经冷冻干燥(FD)并置于室温(RT)24小时或37℃热处理48小时的FMDV-A恢复的影响作用。所有辅剂于玻璃样品容器中制备，所有样品容器均采用双份。
170μl Suc水溶液(1g/ml)与30μl Raf水溶液(1g/ml)混合得到200μl混合糖溶液。然后加入50μl PEI溶液(0.03mg/ml)以完成辅剂的配制。最后，向辅剂中加入50μl FMDV-A然后振荡混合。辅剂混合物中每种糖及PEI的终浓度列于下表：
  辅剂成份   在辅剂中的终浓度
  蔗糖   1.7(M)
  棉子糖   0.1(M)
  PEI   6.25(nM)*/78.13(nM)1
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
将50μl FMDV-A加入至250μl PBS中以制备对照混合物。试样经冷冻干燥后置于室温24小时或37℃48小时。然后进行FMDV检测。结果如图1所示。结果证实，当辅剂为PBS时病毒恢复率很低。当辅剂含有Suc、Raf及PEI时，经RT或HT处理的FMDV显示具有相似的恢复。学生氏T检验表明室温孵育与37℃热处理48小时之间没有显著性差异。
实施例3
设计该试验用来研究PEI对于经热处理的FMDV-O病毒的有利作用。玻璃样品容器中含120μl Suc(3M)，80μl Stac(0.75M)及50μl PEI(10-2mg/ml)或蒸馏水，并采用双份。将50μl FMDV-O加入至各试样容器中。辅剂混合物中每种糖与PEI的终浓度列于下表。
  辅剂成份   在辅剂中的终浓度
  蔗糖   1.2(M)
  水苏糖   0.2(M)
  PEI   2(nM)*/25(nM)1
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
将50μl体积的病毒重新冷冻并作为对照(原始滴度)。冷冻干燥后，样品在37℃孵育24小时或6天，之后重新悬浮于1ml含10％FBS的DMEM中，并用嗜斑检测法测定病毒恢复，结果见图2。
实施方案3用来评估含PEI的糖辅剂相对于单纯糖辅剂的优势。当使用含PEI的辅剂时，样品经37℃热处理24小时后，病毒恢复无显著降低；当使用不含PEI的糖辅剂时，病毒恢复率明显降低。样品经热处理6天后，使用含PEI的辅剂病毒恢复也有损失。然而，该损失显著低于使用只含糖辅剂所造成的损失。
实施例4
本试验对于起始糖浓度进行考查，用于优化FMDV-O恢复中所用的辅剂糖组分。将Suc溶液(3M)与Stac溶液(0.75M)按120∶80的比例制备成糖溶液，然后按1∶10、1∶100、1∶1000进行梯度稀释。准备三份玻璃样品瓶，其中含每种糖浓度的溶液或PBS 200μl，然后将50μl FMDV-O加入至糖溶液或PBS中。
每种糖的终浓度列于下表。
  辅剂组份   辅剂中的终浓度
  蔗糖   1.2(M)
  蔗糖1∶10   0.12(M)
  蔗糖1∶100   0.012(M)
  蔗糖1∶1000   0.0012(M)
  水苏糖   0.2(M)
  水苏糖1∶10   0.02(M)
  水苏糖1∶100   0.002(M)
  水苏糖1∶1000   0.0002(M)
将50μl体积的病毒重新冷冻并作为对照(原始滴度)。冷冻干燥后，样品在37℃孵育7天，之后重新悬浮于1ml含10％FBS的DMEM中，并用嗜斑检测法测定病毒恢复，结果见图3。
实施例4的目的是观察糖浓度稀释的影响作用。在含糖辅剂中，冷冻干燥后，病毒恢复约降至原始滴度的十分之一。当糖浓度稀释至1∶10时，未观察到明显恢复。
实施例5
实施例5用来研究蔗糖和水苏糖浓度的优化组合对于FMDV-O恢复的影响。配制一系列的糖溶液，其中Suc(3M)与Stac(0.75M)的比例从80μl∶120μl至200μl∶0μl。1mg/ml PEI则按1∶100至1∶32000的比例稀释成系列PEI溶液。组蛋白则从1mg/ml稀释至0.625mg/ml，配成系列溶液。用50μl FMDV-O、200μl各种比例的糖溶液以及50μl各种稀释度的PEI溶液制备样品基质。
每种糖和PEI的终浓度列于下表。
  辅剂组分   辅剂中的终浓度
  蔗糖80μl   0.8(M)
  蔗糖100μl   1(M)
  蔗糖120μl   1.2(M)
  蔗糖140μl   1.4(M)
  蔗糖160μl   1.6(M)
  蔗糖180μl   1.S(M)
  蔗糖200μl   2(M)
  水苏糖120μl   0.3(M)
  水苏糖100μl   0.25(M)
  水苏糖80μl   0.2(M)
  水苏糖60μl   0.15(M)
  水苏糖40μl   0.1(M)
  水苏糖20μl   0.05(M)
  PEI 1∶100mg/ml-1∶32000mg/ml   2-0.006(nM)*/25-0.075(nM)1
  组蛋白1mg/ml-0.0625mg/ml   0.17-0.01mg/ml
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
样品冷冻干燥后于37℃孵育3天(PEI样品)或24小时(His样品)，后于1ml含10％FBS的DMEM中重新悬浮，并通过嗜斑试验测定FMDV的恢复。结果如图4.1和4.2所示。
每种PEI浓度的结果已校正。图4.1所示结果表明，当使用仅含蔗糖的辅剂时，病毒恢复率要明显低于含有Suc与Stac的比例为140∶60的辅剂。除仅含Suc的辅剂外，病毒恢复在含不同比例Suc与Stac的辅剂之间没有显著性差异。
图4.2所示为辅剂中PEI被His替代的试验结果。结果显示出对于Suc与Stac比例优化的影响作用，较高的比例Suc为优选方案，仅含Suc的辅剂对病毒恢复无明显不利影响。
实施例6
在本实施例中，带有GFP标签的腺病毒用来比较不同糖/PEI浓度对病毒恢复的作用。配制一系列含不同比例Suc与Stac的溶液，终体积为200μl。将50μl浓度范围在0.1mg/ml至0.01μg/ml的PEI溶液加入至各样品中。再将腺病毒加入至不同比例Suc、Stac与PEI的溶液中，之后冷冻并FD。
每种糖及PEI的终浓度列于下表。
  辅剂组分   辅剂中的终浓度
  蔗糖200μl   2(M)
  蔗糖160μl   1.6(M)
  蔗糖120μl   1.2(M)
  蔗糖80μl   0.8(M)
  蔗糖40μl   0.4(M)
  水苏糖40μl   0.1(M)
  水苏糖80μl   0.2(M)
  水苏糖120μl   0.3(M)
  水苏糖160μl   0.4(M)
  水苏糖200μl   0.5(M)
  PEI 1∶10mg/ml   20(nM)*/250(nM)1
  PEI 1∶50mg/ml   4(nM)*/50(nM)1
  PEI 1∶1000mg/ml   0.2(nM)*/2.5(nM)1
  PEI 1∶10000mg/ml   0.02(nM)*/0.25(nM)1
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
经37℃热处理24小时后，辅剂和病毒在1ml含10％FBS的DMEM中复原。在96孔培养板中，用90％覆盖的293单层细胞，通过2倍系列稀释法检测病毒滴度。结果如图5所示。
初始优化过程利用浓度矩阵考查了三个变量：Suc浓度、Stac浓度及PEI浓度。矩阵结果显示，两种糖及PEI浓度能够显著影响病毒恢复。含高浓度Stac或高浓度PEI的样品均显示较低的恢复。理想的病毒恢复需要Suc存在。不含Suc的样品无恢复。
实施例7
该试验的目的是考查含Suc与Stac的糖辅剂中PEI浓度的影响作用。将PEI溶液按1∶10稀释，配制一系列溶液用于评估最佳PEI浓度。根据糖浓度优化的试验，我们选择了Suc与Stac的比例为120∶80。
每种糖和PEI的终浓度列于下表。
  辅剂组分   辅剂中的终浓度
  蔗糖   0.8(M)
  水苏糖   0.2(M)
  PEI 100μg/ml   20(nM)*/250(nM)1
  PEI 10μg/ml   2(nM)*/25(nM)1
  PEI 1μg/ml   0.2(nM)*/2.5(nM)1
  PEI 0.1μg/ml   0.02(nM)*/0.25(nM)1
  PEI 0.01μg/ml   0.002(nM)*/0.025(nM)1
  PEI 0.001μg/ml   0.0002(nM)*/0.0025(nM)1
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
冷冻干燥后，样品经37℃热处理24小时，然后进行腺病毒检测。结果如图6所示。
结果表明，当使用了较高浓度的PEI，可观察到较低的病毒恢复。当PEI被进一步稀释时，病毒恢复增加，理想的PEI浓度约为0.01μg/ml。该浓度下病毒的恢复显著高于仅使用糖辅剂时的病毒恢复。使用仅含PBS辅剂的样品不显示病毒恢复。
实施例8
本试验可更好的理解在冷冻干燥过程中不同辅剂组分对病毒稳定性的影响。
每种糖及PEI的终浓度列于下表
  辅剂   冷冻干燥前的终浓度
  蔗糖   1.5M
  水苏糖   0.125M
  PEI(10-2)   2nM*/25nM1
  PEI(10-4)   0.02nM*10.25nM1
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
将含有辅剂及病毒的样品冷冻干燥过夜。冷冻干燥后，样品于37℃孵育5天，之后于1ml含10％PBS DMEM中复原。目标溶液然后按1∶1000进行稀释，在进行293检测前再按1∶2进行稀释。结果如图7所示。
实施例9
实施例9用来研究高分子量PEI与低分子量PEI的差异。高分子量PEI(HPEI)Mw为750000，而低分子量PEI(LPEI)Mw为1300。
每种糖及PEI的终浓度列于下表：
  辅剂   冷冻干燥前的终浓度
  蔗糖   1.5M
  水苏糖   0.125M
  HPEI(10-2)   2nM*/25nM1
  HPEI(10-3)   0.2nM*/2.5nM1
  HPEI(10-4)   0.02nM*/0.25nM1
  HPEI(10-5)   0.002nM*/0.025nM1
  LPEI(10-2)   1.28μM*/1.38μM1
  LPEI(10-3)   0.128μM*/0.138μM1
  LPEI(10-4)   0.0128μM*/0.0138μM1
  LPEI(10-5)   0.00128μM*/0.00138μM1
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
将含有辅剂及腺病毒的样品冷冻干燥过夜。冷冻干燥后，样品于37℃孵育5天，之后于1ml含10％PBS DMEM中复原。目标溶液然后按1∶1000进行稀释，在进行293检测前再按1∶2进行稀释。结果如图8所示。
实施例10
实施例10用来研究PEI(高分子量，Mw 750000)在PBS中稀释或在水中稀释对于腺病毒恢复的影响差异。
每种糖及PEI的终浓度列于下表
  辅剂   冷冻干燥前的终浓度
  蔗糖   1.5M
  水苏糖   0.125M
  PEI(10-2)   2nM*/25nM1
  PEI(10-3)   0.2nM*/2.5nM1
  PEI(10-4)   0.02nM*/0.25nM1
  PEI(10-5)   0.002nM*/0.025nM1
*浓度以Mw计
1浓度以Mn计
将含有辅剂及病毒的样品冷冻干燥过夜。冷冻干燥后，样品于37℃孵育5天，之后于1ml含10％PBS DMEM中复原。目标溶液然后按1∶1000进行稀释，在进行293检测前再按1∶2进行稀释。结果如图9所示。

Claims (20)

1、一种保存病毒颗粒的方法，包括：
(i)提供含有一种或多种糖、聚乙烯亚胺及所述病毒颗粒的水溶液，其中聚乙烯亚胺的浓度以聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计不超过15μM，糖浓度或含有多种糖时的总糖浓度高于0.1M；和
(ii)干燥上述溶液形成含所述病毒颗粒的无定形固体基质。
2、如权利要求1所述的方法，其中，聚乙烯亚胺的Mn在20至1000kDa之间，聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.001至100nM之间。
4、如权利要求1中所述的方法，其中，聚乙烯亚胺的Mn在1至10000Da之间，聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.0001至10μM之间。
5、如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述糖浓度或总糖浓度在0.5至2M之间。
5、如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述糖为蔗糖、水苏糖、棉子糖或糖醇。
6、如上述任一项权利要求所述的方法，其中使用两种或多种糖的溶液。
7、如权利要求6所述的方法，其中，蔗糖浓度与其他糖浓度的比例在3∶7与9∶1之间；且步骤(i)中聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.0025nM至5μM之间。
8、前述任一项权利要求所述的方法，其中所得的混合物是冷冻干燥的。
9、前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述病毒颗粒由活病毒或死病毒组成。
10、如权利要求9所述的方法，其中所述活病毒是全病毒或活的减毒病毒。
11、保存的产品，其包含病毒颗粒、一种或多种糖及聚乙烯亚胺，所述保存产品为无定形固体形式。
12、如权利要求11所述的保存产品，用作疫苗，用于预防或治疗病毒引起的毒性反应、病毒感染、病毒感染后遗症、肿瘤或过敏。
13、用于保存病毒颗粒的辅剂，包含：
(a)蔗糖、水苏糖或棉子糖或它们的任意组合，及
(b)聚乙烯亚胺，其浓度以Mn计为5μM或更低。
14、如权利要求13所述的辅剂在冷冻干燥过程中或冷冻干燥后病毒颗粒的保存中的用途。
15、一种包含权利要求13所述的辅剂的试剂盒。
16、一种包含权利要求11定义的保存产品和可选佐剂的疫苗。
17、一种用于制备包含病毒颗粒的疫苗的方法，所述方法包括：
(1)提供含一种或多种糖、聚乙烯亚胺及所述病毒颗粒的水溶液，其中聚乙烯亚胺的浓度以聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为15μM或更低，糖浓度或含有一种以上糖时的总糖浓度高于0.1M；和
(2)加入或不加入佐剂、缓冲液、抗生素和/或添加剂至所得的混合物中；和
(3)干燥所述溶液形成包含所述病毒颗粒的无定形固体基质。
18、如权利要求12所述的产品，如权利要求16所述的疫苗或权利要求17所述的方法，其中所述疫苗为多价疫苗。
19、一种用于保存病毒颗粒的方法，包括：
(1)提供含有一种或多种糖、聚乙烯亚胺及所述病毒颗粒的水溶液；和
(2)干燥所述溶液形成包含所述病毒颗粒的无定形固体基质。
20、一种含保存的病毒颗粒的干燥粉末，按权利要求1至10中任一项所定义的方法获得。
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