KR20100015613A - 바이러스 입자 보전 방법 - Google Patents
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Abstract
(j) 폴리에틸렌이민의 농도가 그의 수평균 분자량(Mn)을 기준으로 15 μM 이하이고, 당 농도 또는 1종 이상의 당이 존재하는 경우 총 당농도가 0.1 M 이상인 1종 이상의 당, 폴리에틸렌이민 및 바이러스 입자 수용액을 제공하는 단계; 및 (ii) 상기 수용액을 건조시켜 바이러스 입자를 포함하는 무정형 고체 메트릭스를 형성시키는 단계로 이루어진 바이러스 입자의 보전 방법을 제공한다..
바이러스, 폴리에틸렌이민, 당, 수크로오스
Description
본 발명은 바이러스 입자를 열 변성 및 건조로부터 보전하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 보전된 바이러스 입자를 포함하는 산물에 관한 것이다.
몇몇 생물학적 분자들은 분리, 정제 및 실온 용액에 저장이 가능할 정도로 충분히 안정하다. 그러나 모든 물질이 이러한 안정성이 있지는 않으며, 저온 저장, 안정화제의 첨가, 동결건조, 진공 성형 및 공기건조를 포함한 기술들을 이용하여 자동 저장(shelf preservation)을 보장하려는 시도가 있어왔다. 이러한 기술들의 이용가능성에도 불구하고, 몇몇 생물학적 물질들은 저장 동안 여전히 불만족스러운 안정성 수준을 보이고 있으며, 몇몇 기술들은 추가의 비용과 불편함을 야기시키고 있다. 예를 들어, 냉동 운송 및 저장에는 고비용이 소요된다. 또한 개발도상국가에서는 냉동 운송은 종종 백신과 같은 의약의 수송에 이용할 수 없는 경우도 있다.
특히, 동결건조의 스트레스는 몇몇 생물학적 물질에 큰 손상을 입힐 수 있다. 생물의약의 동결건조는 열민감성 생물질 용액 또는 현탁액의 동결 단계, 이어 서 1차 및 2차 건조 단계를 포함한다. 이 기술은 진공 하 영하의 온도에서 용액의 녹음 없이 수분이 승화되는 것을 바탕으로 한 것이다. 동결건조는 고형 단백질 및 백신 의약을 제조하는데 있어 주요 단계이다. 동겯된 생물질에서 수증기 확산 속도는 매우 느리고, 따라서 이 공정은 시간-소비적이다. 또한 동결 및 건조 단계 모두는 단백질 전개 또는 변성을 일으킬 수 있는 스트레스를 유발한다.
WO-A-2006/0850082에는 당, 충전물질, 예를 들어, 히스톤 단백질, 및 건조- 또는 열-민감상 생물학적 성분을 포함하는 건조 또는 보전 제품이 개시되어 있다. 상기 당은 무정형 고체 메트릭스를 형성한다. 그러나 히스톤은 보전된 생물학적 성분이 인간 또는 동물에 투여되는 경우 면역학적 영향을 나타낼 수도 있다.
발명의 요약
본 발명자들은 1종 이상의 당 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함한 수용액과 혼합된 바이러스 제형이 동결건조와 같은 건조 상태로 보전된다는 사실을 밝혀냈다. 바이러스 제형에 1 종 이상의 당을 첨가함으로써 바이러스 전염성 및(또는) 면역원성이 어느 정도 보전된다. 그러나 1 종 이상의 당과 함께 PEI를 첨가함으로써 바이러스 전염성 및(또는) 면역원성의 보전성이 개선된다. 바이러스 전염성 및(또는) 면역원성에 있어 특히 바람직한 개선점은 비교적 낮은 PEI의 농도와 비교적 높은 1 종 이상의 당 농도에서 나타난다.
따라서 본 발명은 (j) 폴리에틸렌이민의 농도가 그의 수평균 분자량(Mn)을 기준으로 15 μM 이하이고, 당 농도 또는 1종 이상의 당이 존재하는 경우 총 당농 도가 0.1 M 이상인 1종 이상의 당, 폴리에틸렌이민 및 바이러스 입자 수용액을 제공하는 단계; 및 (ii) 상기 수용액을 건조시켜 바이러스 입자를 포함하는 무정형 고체 메트릭스를 형성시키는 단계로 이루어진 바이러스 입자의 보전 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 바이러스 입자의 보전을 위한 부형제로 (a) 수크로오스, 스타키오스 또는 라피노오스 또는 이들의 임의의 조합; 및 (b) Mn을 기준으로 한 5 μM 이하 농도의 폴리에틸렌이민을 포함하는, 바이러스 입자, 1종 이상의 당 및 폴리에틸렌이민을 포함하는 무정형 고체 형태의 보전 제품을 제공한다.
동결건조 후 및 동결건조 동안 바이러스 입자의 보전을 위한 부형제의 용도;
상기 부형제를 포함하는 키트; 상기 보전 제품 및 임의로 보조제를 포함하는 백신; (a) 폴리에틸렌이민의 농도가 그의 수평균 분자량(Mn)을 기준으로 15 μM 이하이고, 당 농도 또는 1종 이상의 당이 존재하는 경우 총 당농도가 0.1 M 이상인 1종 이상의 당, 폴리에틸렌이민 및 바이러스 입자 수용액을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물에 보조제, 완충제, 항생제 및(또는) 첨가제를 임의로 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 용액을 건조하여 상기 바이러스 입자를 포함하는 무정형 고체 메트릭스를 형성시키는 단계를 포함하는 바이러스 입자를 포함한 백신의 제조 방법; 및 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 보전 바이러스 입자를 포함한 건조 분말을 제공한다.
요약
본 발명은 바이러스 입자와 보전용 혼합물의 접촉에 의한 바이러스 입자의 보전에 관한 것이다. 상기 보전 혼합물은 1종 이상의 당과 PEI의 수용액이다. 저농도 PEI 및 상대적으로 고농도인 당이 사용된다. 바이러스 입자가 함유된 상기 수용액은 건조되어 바이러스 입자 포함 무정형 고체 메트릭스가 형성된다.
따라서 본 발명은 건조 단계 동안 바이러스 구조 및 기능이 보전되도록 한다. 그에 따라 건조 후 바이러스 활성이 유지될 수 있다. 보전된 바이러스 입자는 개선된 열 및 건조 저항성을 나타내어 저장 수명이 연장되고, 저장 및 운송의 용이해지며 냉동 유통할 필요성이 없게 된다. 따라서 본 발명은 동결방지제(동결 손상에 대한 보호), 건조방지제(건조에 대한 보호) 및(또는) 열손상방지제(4℃ 이상 또는 이하의 온도에 대한 보호)로서 보호작용을 제공한다.
바이러스 입자
전형적으로 바이러스 전체 또는 바이론(바이러스 최소단위)는 핵산과 그 주위를 둘러싼 보호 단백질 막 또는 캡시드로 이루어진다. 바이러스 핵산은 DNA, RNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, mRNA 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 캡시드는 서브유니트로 구성되어 진다. 많은 바이러스 캡시드가 20면체 또는 나선형 대칭을 갖는 서브유니트로 구성된다. 몇 가지 유형의 바이러스들이 뉴클레오캡시드와 같은 바이러스 구조, 단백질 꼬리와 복합 외벽과 같은 외부 구조물 및 나선형 꼬리에 부착된 20면체 머리와 같은 복합 구조물을 포함한다. 상기 캡시드는 또한 외피로 쌓여질 수 있다. 상기 외피는 지단백 이중층으로 구성되고, 숙주세포의 멤브레인 유래 물질뿐만 아니라 바이러스 기원의 멤브레인 유래 물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 외피는 세포-유래 지질 및 바이러스-유래 단백질을 함유할 수 있다. 바이러스들은 또한 당단백질 스파이크를 함유할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 바이러스 입자는 전체 바이러스, 예를 들어, 생 바이러스, 사멸 바이러스, 생 약독화 바이러스, 불활성화 바이러스, 예를 들어 화학적 불활성화 바이러스 또는 악성 또는 비-악성 바이러스일 수 있다. 생 바이러스는 바이러스 숙주에 의해 감염되고 번식될 수 있다. 사멸 바이러스는 불활성이며, 바이러스 숙주를 감염시키지 않는다. 바이러스 입자는 바이러스-형 입자(VLP) 또는 뉴클레오캡시드일 수도 있다.
바이러스 입자는 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, (+)ssRNA 바이러스, (-)ssRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스 또는 dsDNA-RT 바이러스이거나 또는 이들로부터 유래된 것일 수 있다.
바이러스 입자는 하기 군의 바이러스이거나 또는 그로부터 유래된 것일 수 있으나, 이는 단계 예시일 뿐 이에 제한되는 것은 아니다:
아데노바이러스과(adenoviridae), 예를 들어 인간 Ad5, Ad2, Ad6, Ad24 항원형을 포함한 인간 아데노바이러스 A, B, C, D, E 또는 F;
칼리시바이러스과(caliciviridae), 예를 들어, 노르워크(norwalk) 바이러스;
코로나바이러스과(coronaviridae), 예를 들어, 인간 코로나바이러스 299E 또는 OC43 및 SARS-코로나바이러스;
필로바이러스과(filoviridae), 예를 들어, 에볼라(ebola) 바이러스;
플라비바이러스과(flaviviridae), 예를 들어, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, C형 간염 바이러스;
헤파드나바이러스과(hepadnaviridae), 예를 들어, B형 간염 바이러스;
헤르페스바이러스과(herpesviridae), 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 헤르페스바이러스 1, 3, 4, 5 또는 6;
오르쏘믹소바이러스과(orthomyxoviridae), 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 항원형 HlNl, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9H2, H7N2, H7N3 및 N10N7을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인플루엔자바이러스 A, B, C;
파필로마바이러스과(papillomaviridae), 예를 들어, 인간 파필로마 바이러스;
파라믹소바이러스과(paramyxoviridae), 예를 들어, 인간파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스 및 볼거리 바이러스;
파르보바이러스과(parvoviridae), 예를 들어, 아데노-관련 바이러스;
피코르나바이러스과(picornaviridae), 예를 들어, 인간 폴리오바이러스, 수족구병 바이러스(항원형 O, A, C, SAT-I, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1 포함);
폭스바이러스과(poxviridae), 예를 들어, 우두 바이러스, 천연두 바이러스 및 조류 바이러스(fowlpox);
레오바이러스과(reoviridae), 예를 들어, 블루텅 바이러스(bluetongue virus) 군;
레트로바이러스과(retroviridae), 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 1 및 2를 포함한 렌티바이러스; 및
토가바이러스과(togaviridae), 예를 들어, 루벨라 바이러스.
바람직한 실시형태에 있어서, 바이러스 입자는 아데노바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과, 파르보바이러스과, 피코르나바이러스과 또는 폭스바이러스과 바이러스이거나 그로부터 유래한 것일 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에 있어서, 바이러스 입자는 아데노바이러스, 우두 바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 수족구병 바이러스이거나 그로부터 유해한 것일 수 있다.
바이러스-형 입자(VLP)는 바이러스의 구조 단백질로부터 유래한 바이러스 단백질을 포함하지만, 바이러스 핵산이 결여되어 있다. 이러한 바이러스 구조 단백질은 과발현되는 경우 즉시 입자로 자가-조립된다. VLP는 복제기능이 없다. 몇몇 실시형태에 있어서, VLP는 지질 이중층 내에 삽입된 바이러스 단백질이다. VLP의 예에는 파지-유래 VLP, 인간파필로마바이러스(HPV) L1 주 캡시드 단백질 VLP, 노르워크 바이러스 캡시드 단백질 VLP 및 인플루엔자 바이러스 구조 단백질, 예를 들어 M1 단백질, HA 적혈구응집소 단백질 및 N1 뉴라미니다아제 단백질에서 조립된 VLP를 포함한다.
바이러스 입자는 당업계의 숙련자들에게 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 배양한 숙주 세포를 사용하려고 하는 바이러스 균주로 감염시키고, 감염을 진행시켜 바이러스가 배양 세포에서 복제되도록 하여 제조될 수 있고, 바이러스를 수확하여 정제하기 위한 당업계에 알려진 표준 방법에 의해 제공될 수 있다.
보전 혼합물
본 발명의 보전 혼합물은 1종 이상의 당과 폴리에틸렌이민(PEI)의 수용액을 포함한다. 임의의 적절한 수용액을 사용할 수 있다. 상기 용액은 완충된 것일 수 있다. 상기 용액은 HEPES 용액, 인산염 완충 염수(PBS) 또는 순수일 수 있다.
본 발명에 사용하는데 적절한 당은 환원당, 예를 들어, 글루코오소, 프럭토오스, 글리세르알데하이드, 락토오스, 아라비노오스 및 말토오스; 및 비환원당, 예를 들어, 수크로오스를 포함한다. 상기 당은 단당류, 이당류, 삼당류 또는 다른 다당류일 수 있다. “당”이란 용어는 당 알코올을 포함한다. 단당류, 예를 들어, 갈락토오스, 라피노오스 및 만노오스; 이당류, 예를 들어, 락토오스 및 말토오스; 및 사당류, 예를 들어, 스타키오스를 예시할 수 있다. 트레할로오스, 움벨리페로오스, 베르바스코오스, 이소말토오스, 셀로비오스, 말룰로오스, 투라노오스, 멜레지토오스 및 멜리비오스 또한 본 발명에 사용하는데 적절하다. 적절한 당 알코올은 만니톨이다.
바람직하게는, 1종 이상의 당 수용액은 수크로오스, 라피노오스 또는 스타키오스의 용액이다. 특히 수크로오스는 글루코오스 및 프락토오스의 이당류이고, 라피노오스는 갈락토오스, 프럭토오스 및 글루코오스로 구성된 삼당류이며, 스타키오스는 2 개의 Dα-칼락토오스 단위, 하나의 Dβ-글루코오스 단위 및 하나의 Dβ-프락토오스 단위가 연속하여 연결되어 구성된 사당류이다. 수크로오스와 라피노오스의 조합 또는 수크로오스와 스타키오스의 조합을 이용할 수 있다.
본 발명의 보전 혼합물에 두 가지 이상의 당을 사용하는 경우, 바이러스 감염성 또는 면역원성의 보전이 특히 효과적이다. 따라서 1종 이상의 당 용액은 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상 또는 5종 이상의 당 용액을 포함한다. 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종 등의 당 조합을 예시할 수 있다. 바람직하게는, 2종 이상의 당 용액은 수크로오스 및 라피노오스 또는 수크로오스 및 스타키오스를 포함한다.
PEI는 -(CH2-CH2-NH)-로 표시되는 화학적 단위가 반복되는 것을 특징으로 하는 지방족 폴리아민이다. 본 명세서에 PEI의 예로는 폴리에틸렌이민 단일중합체 또는 공중합체를 포함한다. 폴리에틸렌이민 공중합체는 랜덤 또는 블록 공중합체일 수 있다. 예를 들어, PEI는 폴리에틸렌이민과 다른 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 공중합체로 이루어질 수 있다. 폴리에틸렌이민은 선형이거나 분지형일 수 있다. 또한 PEI의 예로는 폴리에틸렌이민의 유도체 형태를 포함한다. 폴리에틸렌이민은 다양한 위치에서 질소 원자를 함유한다. 질소 원자는 말단 아미노기에, 예를 들어 R-NH2로, 내부 기, 예를 들어, 중합체 구조 내의 알킬 또는 알킬렌기 사이에 놓인 기에, 예를 들어, R-N(H)-R로', 및 중합체 분지의 교차점에, 예를 들어 R-N(-R')-R"로 존재한다(상기에서 R, R' 및 R"는, 예를 들어, 알킬 또는 알킬렌기일 수 있다). 알킬 또는 아릴기가 상기 질소 중심에 수소 원자에 부가하여 또는 그 대신에 연결될 수 있다. 이러한 알킬 및 아릴기는 치환된 또는 비치환된 것일 수 있다. 알킬기는 전형적으로 C1-C4 알킬기, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 아릴기는 전형적으로 페닐이다. PEI는 다양한 다른 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜에 공유결합된 폴리에틸렌이민일 수 있다. PEI의 다른 개질된 유형이 생산된 바 있고, 몇몇이 상업적으로 시판되고 있다. 예를 들어, 분지 PEI 25 kDa, jetPEI(상표명), LMW-PEI 5.4 kDa, 슈도덴드리머 PEI, PEI-SS-PEI, PEI-SS-PEG, PEI-g-PEG, PEG-co-PEI, PEG-g-PEI, PEI-co-L 락트아미드-co-숙신아미드, PEI-co-N-(2-하이드록시에틸-에틸렌이민), PEI-co-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, PEI-g-PCL-블록-PEG, PEI-SS-PHMPA, PEI-g-덱스트란 10,000 및 PEI-g- 트랜스페린-PEG, Pluronic85(상표명)/Pluronicl 23(상표명)-g-PEI가 있다.
PEI는 광범위한, 예를 들어, 300Da 내지 800kDa의 수평균 분자량(Mn)을 갖는다. 바람직하게는, 수평균 분자량은 300 내지 2000Da, 500 내지 1500Da, 1000 내지 1500Da, 10 내지 100kDa, 20 내지 100kDa, 30 내지 100kDa, 40 내지 100kDa, 50 내지 100kDa, 60 내지 100kDa, 50 내지 70kDa 또는 55 내지 65kDa이다. 대략 60kDa 비교적 높은 Mn 또는 1200Da의 비교적 낮은 Mn의 PEI가 적절하다. 바람직하게는, PEI의 중량평균 분자량(Mw)는 500Da 내지 1000kDa이다. 가장 바람직하게는, PEI의 Mw는 500Da 내지 2000Da, 1000Da 내지 1500Da, 또는 1 내지 1000kDa, 100 내지 1000kDa, 250 내지 1000kDa, 500 내지 1000kDa, 600 내지 1000kDa, 750 내지 1000kDa, 600 내지 800kDa, 700 내지 800kDa이다. 대략 750 kDa의 비교적 높은 Mw 또는 1300 Da의 비교적 낮은 Mw의 PEI가 적절하다.
PEI의 중량평균 분자량(Mw) 및 수평균 분자량(Mn)은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려진 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, Mw는 광산란법, SANS(small angle neutron scattering), X-선 산란 또는 침강 속도법으로 측정할 수 있다. Mn은, 예를 들어, 겔투과 크로마토그래피, 점도측정법(Mark-Houwink equation) 및 총괄적 방법, 예를 들어, 증기압 오소메트리 또는 말단기 적정법으로 측정할 수 있다.
다양한 형태의 PEI가 상업적으로 시판되고 있다(예를 들어, Sigma, Aldrich). 예를 들어, 본 발명에서 사용된 Mn 대략 60 kDa 및 Mw 대략 750 kDa의 분지된 비교적 높은 분자량 형태의 PEI가 상업적으로 시판되고 있다(Sigma P3143). 이 PEI는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
본 발명에서 사용한 Mw 1300Da 및 Mn 1200Da의 비교적 저분자량 형태의 PEI 또한 상업적으로 시판되고 있다(예를 들어, Aldrich 482595).
본 발명에서는, 1종 또는 2종 이상의 당과 PEI의 수용액을 포함하는 보전 혼합물이 제공된다. 전형적으로, 바이러스 입자는 보전 혼합물과 배합되어 건조를 위한 수용액으로 제공된다.
건조를 위한 수용액에서 당의 농도는 0.1M 이상이다. 바람직하게는, 건조를 위한 수용액에서 당의 농도 또는 당이 1종 이상인 경우 건조를 위한 수용액에서 당의 총 농도는 포화, 예를 들어, 실온에서 포화까지 적어도 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.75M, 0.9M, 1M 또는 2M, 또는 3M, 2.5M 또는 2M 이하이다. 당 농도 또는 1종 이상의 당의 총 농도는 01.5 내지 2M일 수 있다. 1종 이상의 당이 존재하는 경우, 각 당은 포화, 예를 들어, 실온에서 포화될 때까지 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.75M, 0.9M, 1M 또는 2M에서 3M, 2.5M 또는 2M 까지이다.
건조를 위한 수용액에서 PEI의 농도는 일반적으로 Mn을 기준으로 15μM 이하의 범위이다. PEI 농도는 Mw 기준으로 10μM 이하이다. 이러한 PEI 농도는 특히 바이러스 감염성 또는 면역원성을 보전하는데 효과적이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, PEI는 Mn을 기준으로 5μM 이하, 500nM 이하, 100nM 이하, 40nM 이하, 25nM 이하, 10nM 이하, 5nM 이하, 1nM 이하, 0.5nM 이하, 0.25nM 이하, 0.1nM 이하, 0.075nM 이하, 0.05nM 이하, 0.025nM 이하 또는 0.0025nM 이하로 제공된다. 전형적으로, Mn을 기준으로 PEI의 농도는0.0025nM 이상, 0.025nM 이상, 또는 0.1nM 이상이다. Mn을 기준으로 적절한 PEI 농도 번위는 0.0025nM 내지 5μM, 또는 0.025 내지 200nM이다.
바람직하게는, Mw를 기준으로 PEI 농도는 5μM 이하, 1μM 이하, 0.1μM 이하, 0.01μM 이하, 5nM 이하, 4nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 0.5nM 이하, 0.25nM 이하, 0.1nM 이하, 0.05nM 이하, 0.02nM 이하, 0.002nM 이하, 또는 0.1nM 이하이다. 전형적으로 Mw 기준 PEI의 농도는 0.00001nM 이상, 0.001nM 이상 또는 0.01nM 이상이다. Mw 기준 적절한 PEI 농도 범위는 0.00001 내지 20nM, 0.0001 내지 20nM 또는 0.0001 내지 5nM이다.
전형적으로, 상대적으로 높은 분자량의 PEI가 상대적으로 낮은 분자량의 PEI 보다 낮은 농도에서 효과적이라는 사실이 밝혀졌다. 따라서:
상대적으로 높은 Mw, 예를 들어, 20 내지 1000kDa의 PEI를 사용할 경우, Mw 기준 0.001 내지 5nM 농도의 PEI가 바람직하다. 상대적으로 낮은 Mw, 예를 들어, 300Da 내지 10kDa의 PEI를 사용할 경우, 0.0001 내지 10μM 농도의 PEI가 바람직하다.
상대적으로 높은 Mn, 예를 들어, 20 내지 1000kDa의 PEI를 사용할 경우, Mn 기준 0.001 내지 100nM 농도의 PEI가 바람직하다. 상대적으로 낮은 Mn, 예를 들어, 1Da 내지 10kDa의 PEI를 사용할 경우, 0.0001 내지 10μM 농도의 PEI가 바람직하다.
실시형태에서, 초기에 바이러스 입자와 접촉하는 보전 혼합물은 Mn 기준 2μM 이하 농도의 PEI와 0.1M 이상, 0.2M 이상, 0.3M 이상, 0.4M 이상, 0.5M 이상, 0.75M 이상, 0.9M 이상, 1M 이상, 또는 2M 이상 농도의 1 종 이상의 당 용액을 포함한다.
1종 이상의 당 용액이 2종 이상의 당을 포함하는 경우, PEI의 가장 효과적인 농도는 보전 혼합물에 사용되는 당의 특정 형태에 의존할 것이다. 예를 들어, 2종 이상의 당 중 하나가 수크로오스인 경우, 다른 당은 스타키오스이다. Mn 기준 2μM 이하, 특히 0.025nM 내지 2μM 농도의 PEI가 보전에 효과적이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 입자와 (i) 당 중 하나가 수크로오스이고 다른 것이 스타키오스인 1종 이상의 당 및 (ii) Mn 기준 2μM 이하 농도의 PEI의 수용액을 혼합하는 단계를 포함한다. 2종 이상의 당 수용액이 수크로오스와 라피노오스의 수용액을 포함하는 경우, PEI의 바람직한 농도는 2μM 이하, 또는 0.0025nM 내지 2μM인 것으로 밝혀졌다. 따라서 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 입자와 (i) 수크로오스 및 라피노오스 및 (ii) 0.0025nM 내지 2μM 농도의 PEI의 수용액을 혼합하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상대적으로 높은 분자량, 예를 들어 Mn 기준 10 내지 100kDa PEI를 사용하는 경우, Mn 기준 PEI의 농도는 0.1 내지 100nM이다.
보전 혼합물에 2가지 당의 조합을 사용할 경우, 본 발명자들은 바이러스 입자의 보전에 대한 이들 당의 다양한 분자 농도 비의 효과를 조사하였다. 당 하나와 다른 당의 특정 분자 농도 비가 특히 효과적이었으나, 정확한 비율은 사용된 당의 형태에 의존하였다. 따라서 1종 및 2종 이상의 당이 수크로오스를 포함하는 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 다른 당과 비교하여 수크로오스의 농도는 3:7 내지 9:1의 몰 농도 비, 바람직하게는 4:6 이상, 50:50 이상 6:4 이상, 7:3 이상, 8:2 이상 또는 9:1 이상이다. 수크로오스와 스타키오스의 경우, 3:7 이상, 4:6 이상, 50:50 이상, 6:4 이상, 7:3 이상, 3:1 이상, 8:2 이상 또는 9:1 이상의 수크로오스:스타키오스의 몰 농도 비가 특히 효과적인 보전성을 나타내었다. 바람직하게는, 2종 이상의 당 용액은 50:50 내지 8:2의 몰 농도 비의 수크로오스와 스타키오스 용액을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 보전 혼합물은 (i) 당 중 하나가 수크로오스이고, 다른 당과 수크로오스의 농도 비율이 3:7 내지 9:1의 몰 농도 비율인 2종 이상의 당과 (ii) Mn 기준 100nM 이하 또는 0.025 내지 100nM 농도의 PEI의 수용액을 포함한다.
보전
본 발명의 보전 기술은 바이러스 입자의 건조 및 동결과 열 문제에 대응한 보전에 특히 적절하다. 본 발명의 보전 혼합물과 배합한 바이러스 입자를 건조함으로써 바이러스 입자의 보전이 이루어진다. 건조 시에, 무정형 고체가 형성된다. “무정형”이란 의미는 비구조적이고 일정하거나 반복적인 분자 조직화가 현저하지 않은 것을 의미한다(즉, 비결정성).
전형적으로, 건조는 동결건조, 스냅건조, 진공건조 또는 분무건조로 달성된다. 동결건조가 바람직하다. 물질로부터 수분을 제거하고, 이 물질을 바이알에 밀봉함으로써, 상기 물질을 용이하게 저장, 수송 및 추후 그의 원래 형태로 재구성할 수 있다.
동결건조는 썩기 쉬운 물질을 보전하거나 물질을 수송에 보다 용이하도록 만드는데 이용되는 탈수 공정이다. 동결건조는 고형 단백질 및 백신 의약을 제조하기 위한 주요 단계를 대표한다. 그러나 생물학적 물질은 동결 및 건조 모두의 과정에서 스트레스를 받게 되고, 이는 단백질의 전개 또는 변성을 일으킬 수 있다. 더욱이, 동결된 생물학적 물질로부터 수증기 확산율은 매우 낮기 때문에, 상기 공정은 시간소모적이다. 본 발명의 보전 기술은 생물학적 물질을 건조 및(또는) 동결건조 공정의 열 스트레스로부터 보호할 수 있다.
본 발명의 기술에는 세 가지 주요 단계, 즉 동결, 1차 건조 및 2차 건조를 포함한다. 동결은 전형적으로 동결건조 기계를 이용하여 수행된다. 이 단계에서, 생물학적 물질을 공융점, 즉 물질의 고체상와 액체상이 동시에 존재할 수 있는 최저 온도 이하로 냉각하는 것이 중요하다. 이는 다음 단계에서 용융 보다는 승화가 일어나도록 보장한다. 또한, 무정형 물질은 공융점을 갖지 않지만, 임계점을 갖고 있으며, 1차 및 2차 건조 동안 재용융 또는 붕괴를 방지하기 위해 임계점 이하로 제품을 유지시켜야 한다. 1차 건조 동안, 압력이 저하되고, 수분이 승화되로곡 충분한 열이 물질에 공급된다. 필요한 열의 양은 승화된 분자의 승화 잠열을 이용하여 계산할 수 있다. 물질 중 약 95%의 수분이 이 단계에서 승화된다. 너무 많은 열이 생물학적 물질의 구소를 변성시키거나 변화시킬 수 있으므로 1차 건조는 느리게 수행하여야 한다. 압력을 조절하기 위하여, 부분 진공을 적용하여 승화를 빠르게 한다. 냉각 콘덴서 챔버 및(또는) 콘덴서 플레이트가 수증가를 재고체화시킬 수 있는 표면을 제공한다.
2차 건조 공정에 있어서, 동결 공정 동안 흡수된 물 분자가 승화된다. 온도를 1차 건조 상 보다 높게 상승시켜 물 분자와 동결된 생물학적 물질 사이에 형성되어 있는 임의의 생리화학적 상호작용을 깨뜨린다. 전형적으로는, 압력을 낮추어 승화를 촉진시킨다. 동결건조 공정이 완료된 후, 통상적으로 불활성 가스, 예를 들어, 질소로 진공을 해소한 후, 물질을 밀봉한다. 일 실시형태에 있어서, 건조는 혼합물을 동결, 예를 들어, 스냅 동결에 의해 이루어진다. “스냅 동결”이란 용어는, 예를 들어, 제품을 액체 질소에 침지시켜 이루어지는 것과 같은 실질적인 즉시 동결을 의미한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이는 동결 단계를 의미하고, 1 내지 2초 이하에서 완료된다.
특정 실시형태에 있어서, 건조는 약 1300Pa에서 진공 건조를 이용하여 수행된다. 그러나 진공 건조는 본 발명에 필수적인 것이 아니며, 다른 실시형태에서는, 바이러스 입자와 접촉된 보전 혼합물을 스펀(즉, 회전 건조) 또는 동결건조(하기에서 추가로 기술함)시킨다. 유익하게는, 본 발명의 방법은 바이러스 입자를 포함한 보전 혼합물을 진공 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 편리하게는, 진공은 20,000Pa 이하, 바람직하게는 10,000Pa 이하의 압력을 적용한다. 유익하게는, 진공은 10시간 이상, 바람직하게는 20 시간 이상 적용한다. 당업계의 숙련자들에게 알려진 바와 같이, 진공 적용 시간은 시료의 크기, 사용된 기계장치 및 다른 파라미터에 따를 것이다.
다른 실시형태에 있어서, 건조는 본 발명의 보전 혼합물과 배합된 바이러스 입자를 분무건조하여 수행된다. 이 기술은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있으며, 액체 공급물을 고온 가스, 예를 들어, 공기, 무산소 가스 또는 질소를 통해 건조하는 방법을 포함한다. 상기 액체 공급물은 액적 비말로 분무된다. 상기 액적은 이어 건조 챔버에서 고온 가스와 접촉하여 건조된다. 시료는 보전 혼합물과 혼합되면 다양한 잔여 수분 함량으로 건조되어 냉동 온도 이상, 예를 들어, 약 4℃ 내지 약 45℃의 범위 내에서 또는 냉동 온도 이하, 예를 들어, 약 0 내지 -70℃ 또는 그 이하의 범위에서 장기간 보전할 수 있게 된다.
본 발명의 방법을 이용함으로써, 바이러스 입자와 보전 혼합물의 혼합물은 건조되어 무정형 고체 메트릭스를 형성한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 무정형 고체는 건조 분말 형태로 수득된다. 상기 무정형 고체는 자유 유동 입자의 형태를 취할 수도 있다.
그러나 본 발명 방법의 다른 실시형태에서는, 바이러스 입자를 포함하는 혼합물은 고체 지지체 위에 건조된다. 상기 고체 지지체는 비드, 시험관, 메트릭스, 플라스틱 지지체, 마이크로타이터 접시, 마이크로칩(예를 들어, 실리콘, 실리콘-유리 또는 골드 칩) 또는 멤브레인을 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 보전된 바이러스 입자가 건조 또는 부착된 고체 지지체가 제공된다.
본 발명은 (i) 1종 이상의 당과 (ii) PEI의 수용액을 함유 부형제를 포함하는 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트는 수의학적 또는 약제학적 목적에 적절한 추가의 부형제, 담체 또는 희석제를 포함한다. 투여 지침 또한 제공될 수 있다. 상기 키트는 또한 본 발명의 보전된 바이러스 입자를 환자 또는 목적 세포에 전달하는데 적절한 보조 물질, 예를 들어, 보조제, 고정 또는 유화제, pH 완충제, 겔화 또는 점도 증진 첨가제 또는 착색제를 포함할 수 있다. 바이러스 입자와 관련된 보전은, 건조, 동결, 0℃ 이하, -5℃ 이하, -10℃ 이하, -15℃ 이하, -20℃ 이하 또는 -25℃ 이하의 온도, 동결건조, 실온, -10℃ 이상, -5℃ 이상, 0℃ 이상, 5℃ 이상, 10℃ 이상, 15℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상 또는 30℃ 이상의 온도 조건에 노출되는 경우, 물리적 퇴화 및(또는) 생물학적 활성의 손실, 예를 들어, 바이러스 핵산 또는 단백질 퇴화, 형질도입 효율의 손실, 바이러스 감염성의 손실, 면역원성의 손실, 바이러스 역가의 손실 또는 백신 효능의 손실에 대한 바이러스 입자의 내성에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 보전은 동해방지(cryoprotection )(동결 손상에 대한 보호), lyoprotection(건조에 대한 보호) 및(또는) 열보호(thermoprotection)(4℃ 이상 또는 이하의 온도에 대한 보호)를 포함한다
본 발명에 따른 바이러스 입자의 보전은 바이러스 감염성, 면역원성, 트렌스펙션 속도, 바이러스 역가 및 숙주세포 반응성과 같은 파라미터의 평가에 의해 측정할 수 있다. 이러한 기술은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있다.
바이러스 감염성 및(또는) 면역원성 분석 방법은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있고, 세포 배양액에서 바이러스 생장, 혈액에서 바이러스 특이적 항체 검출, T 및(또는) B 세포 반응의 유도, 방이러스 항원 검출, 바이러스 코딩 DNA 또는 RNA 검출, 또는 현미경을 통한 바이러스 입자 관찰을 포함한다.
또한, 바이러스의 존재는 숙주세포의 형태적 변화를 일으키고, 이를 측정하여 바이러스 활성의 지시자를 제공할 수 있다. 바이러스 감염에 기인한 숙주세포에서의 이와 같은 검출가능한 변화는 세포변성 효과로서 알려져 있다. 세포변성 효과는 세포 원형화, 방향상실, 팽윤 또는 수축, 사멸 및 표면으로부터 이탈로 이루어질 수 있다. 많은 바이러스가 감염된 세포에서 TUNEL(Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling) 분석법과 같은 기술 및 당업계의 숙련자들에게 잘 알려진 다른 기술에 의해 측정가능한 아폽토시스(프로그램화된 세포 사멸)를 유발한다. 또한 바이러스는 숙주세포 유전자 발현의 조절에 영향을 미칠 수 있고, 이들 유전자를 분석하여 바이러스 활성이 존재하는지 여부에 대한 지시자를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 세포 배양액에 시약을 첨가하여 바이러스 발현 산물과의 효소적 또는 화학적 반응을 완성시킨다. 또한 바이어스 게놈은 바이러스 감염성의 검출을 증진시키기 위해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 바이러스 게놈을 유전적으로 변형시켜 상 대조 현미경, 형광 현미경에 의해 또는 방사선이미징에 의해 손쉽게 검출할 수 있는 마커를 발현시킬 수 있다. 상기 마커는 발현된 형광 단백질, 예를 들어, GFP (Green Fluorescent Protein) 또는 비색측정(colourimetric) 또는 방사선표지 반응에 관여할 수 있는 발현된 효소일 수 있다. 또한 상기 마커는 시험 세포의 특정 기능을 방해하거나 저해하는 유전자 산물일 수 있다. 플라크-형성 유니트 분석법을 사용하여 바이러스 감염성을 측정하고, 바이러스 역가를 지시할 수 있다. 이 분석법에서, 적절한 숙주세포를 플레이트 표면 상에서 성장시켜 플라스틱 병 또는 접시를 덮는 세포의 단층을 형성시킬 수 있다. 적절한 숙주세포의 예로는 CHO, BHK, MDCK, 10T1/2, WEHI 세포, COS, BSC 1 , BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HEK293 및 HeLa 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이어서 숙주세포의 단층을 바이러스 입자로 감염시킨다. 액체 배지를 반고체 배지로 교체하여 감염의 결과로서 생성된 임의의 바이러스 입자가 그들의 생성 위치에서 멀리 이동하지 않도록 할 수 있다.
바이러스 입자가 세포를 감염시키고, 복제된 후, 상기 세포를 사멸시킬 때 플라크가 생산된다. 플라크는 세포변성 효과를 나타내는, 예를 들어 현미경에서 다른 세포 보다 둥글고 어둡게 나타나거나, 또는 시각으로 관찰할 때 백색 점으로 나타나는 단층에서 세포의 면적과 관련되며, 플라크 중심은 바이러스-유발 용해로 인해 세포가 결여될 수 있다.
새롭게 복제된 바이러스는 주위 세포를 감염시키고, 이들 또한 사멸시킨다. 이러한 과정은 수회 반복될 수 있다. 이어서 세포는 생존 세포만을 염색하는 메틸렌 블루와 같은 염료로 염색된다. 플라크 중의 사멸 세포는 염색되지 않으며, 착색된 배경 상에서 염색되지 않은 영역으로 나타난다.
각 플라크는 바이러스 하나에 의해 세포 하나가 감염된 후 복제되어 상기 바이러스를 확산시킨 결과이다. 그러나 세포를 사멸시키지 않은 바이러스는 플라크를 생산하지 않을 수 있다. 플라크는 세포변성 효과를 나타내는, 예를 들어 현미경에서 다른 세포 보다 둥글고 어둡게 나타나거나, 또는 시각으로 관찰할 때 백색 점으로 나타나는 단층에서 세포의 면적과 관련되며, 플라크 중심은 바이러스-유발 용해로 인해 세포가 결여될 수 있다.
바이러스 역가의 지시자는 “플라크 형성 유니트(PFU)"를 측정하여 주어진다. PFU는 플라크를 야기시키는 바이러스 또는 바이러스 군과 관련된다. 예를 들어, 바이러스 스톡 용액이 1000 pfu/mL를 갖는다면, 이는 상기 스톡의 매 mL가 플라크를 형성할 수 있는 바이러스 입자 1000개를 갖는다는 것을 의미한다. 바이러스 감염성의 수준은 본 발명에 따라 보전된 생물학적 물질의 시료에서 측정되고 신선하게 배양된 바이러스와 같은 시료 또는 본 발명의 보전 화합물의 첨가 없이 건조 및(또는) 열 변성된 시료와 비교할 수 있다.
전형적으로, 본 발명에 따른 보전 및 생성된 산물을 37℃에서 5일 동안 배양한 후의 바이러스 역가는 상기와 같은 배양 전 또는 실제로 본 발명에 따른 보전 및 상기와 같은 배양 전 바이러스 역가의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이다.
몇 가지 형태의 본 발명에 따른 바이러스 입자, 예를 들어, 바이러스 단백질, VLP 또는 몇 가지 불활성화된 바이러스는 플라크 분석에서 플라크를 형성할 수 있는 능력이 없다.
이 경우, 보전은 다른 방법, 예를 들어, 당업계의 숙련자들에게 잘 알려진 면역원성을 측정하는 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 세포-매개 숙주 면역 반응을 측정하기 위한 in vivo 및 in vitro 분석법이 당업계에 알려져 있고, 본 발명에 사용하기에 적절하다.
예를 들어, 면역 반응에 기반한 항체는 본 발명의 보전된 바이러스 입자를 사용한 면역화 전 및 후에 동물 모델에서 혈청 항체의 양, 항원항체결합력 및 동형 분포를 비교하여 측정할 수 있다.
본 발명의 보전된 바이러스 입자의 용도
백신
본 발명의 보전된 바이러스 입자는 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 전사멸 바이러스, 살아있는 약독화 바이러스, 화학적 불황성화 바이러스, VLP 또는 살아있는 바이러스 벡터와 같은 보전된 바이러스 입자가 백신으로 사용하는데 적절하다. 백신으로서, 본 발명의 보전된 바이러스 입자는 항원으로서 또는 바이러스 감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 증상, 바이러스-유발 독성, 암 및 알러지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 바이러스 감염의 속발증의 치료 또는 예방을 위한 바이러스 단백질과 같은 항원을 코딩하는데 이용될 수 있다. 이러한 항원은 숙주의 면역 시스템을 촉진시켜 체액 및(또는) 세포 항원-특이적 반응을 생성시키는 하나 이상의 에피토프를 함유한다. 본 발명의 보전된 백신을 바이러스에 의한 감염, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV), HIV, HSV2/HSV1, 인플루엔자 바이러스(A, B 및 C 형), 파라 인플루엔자 바이러스, 폴리오 바이러스, RSV 바이러스, 감기바이러스, 로타바이러스, A형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 엔테로바이러스, 아스트로바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 수두(varicella-zoster) 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 아데노바이러스, 루벨라 바이러스, 인간 T-세포 림프종 I형 바이러스(HTLV-I), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스, 폭스바이러스 및 우두 바이러스에 의한 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 상기 백신은 다양한 수의학적 질환, 예를 들어, 수족구병(항원형 O, A, C, SAT-I, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1 포함), 코로나바이러스, 블루텅바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 조류 인플루엔자, 헨드라 및 니파 바이러스, 흑사병바이러스, 개 파르보바이러스 및 소 바이러스 설사 바이러스에 대해 적절한 면역 반응을 제공하는데 이용될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 백신은 서브유니트 콘쥬게이트 또는 다가 백신이다. 예를 들어, 본 발명의 보전된 백신은 두 가지 이상의 상이한 형태의 바이러스, 예를 들어, 홍역, 이하선염 및 루벨라 바이러스에 의한 감염을 치료하는데 이용될 수 있다(예를 들어, MMR 백신).
본 발명의 백신 조성물은 1종 이상의 당과 PEI를 함유한 본 발명의 보전 혼합물과 혼합된 바이러스 입자를 포함한다. 상기 백신 조성물은 면역 시스템의 특이적 세포에 대한 백신 항원의 보전성을 증진시키는 적절한 완충제 및 첨가제, 예를 들어, 항생제, 보조제 또는 다른 분자를 추가로 포함할 수 있다.
백신의 효능을 증가시키고(증기시키거나) 체액 및 세포 면역 반응을 조절하기 위하여 당업계에 잘 알려진 다양한 보조제를 사용할 수 있다. 적절한 보조제는 수중유 유탁액-함유 보조제 또는 유중수 보조제, 예를 들어, 미네랄 오일, 알루미늄 기재 보조제, 스쿠알렌/인산염 기재 보조제, 완전/불완전 프로인트 보조제, 사이토카인 및 백신의 효능을 증진시키기 위해 면역촉진제로서 작용하는 임의의 다른 물질을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 적절한 저장을 제공하고, 제형의 저장 수명을 최대화하기 위하여 동결건조된 형태일 수 있다. 이는 연장된 기간 동안 백신을 비축할 수 있게 하며, 면역원성, 역가 및 효능을 유지하는데 도움을 준다. 본 발명의 보전 혼합물은 특히 동결건조 프로토콜 동안 직면하는 건조 및 열 스트레스에 대하여 바이러스 물질을 보전하는데 적절하다. 따라서 보전 혼합물은 바이러스 또는 바이러스 입자의 배양 후 및 시료를 동결건조 공정 처리하기 전에 첨가하는데 적절하다.
본 발명에 따라 제조된 백신의 보전성을 측정하기 위하여, 당업계의 숙련자들에게 잘 알려진 기술을 이용하여 백신의 효능을 측정할 수 있다. 예를 들어, 세포 또는 체액 면역 반응의 생성을 적절한 동물 모델에서 백신에 대한 항체 또는 면역 세포 반응의 생성을 모니터링하여 시험할 수 있다. 본 발명의 발명에 따라 제조된 백신 시료의 면역 반응을 촉발시키는 능력을 동일한 보전 기술로 처리하지 않은 백신과 비교할 수 있다.
바이러스 벡터
본 발명의 방법에 따라 보전된 바이러스 또는 바이러스 벡터를 이종유래 유전자 또는 행산 서열을 목적 세포에 전사하는데 이용할 수 있다. 적절하게는, 이종유래 서열(즉, 트랜스유전자)는 목적 세포에서 발현될 수 있는 단백질 또는 유전자 산물을 코딩한다. 적절한 트랜스유전자에는 바람직한 수용체 유전자, 치료 유전자 및 면역원성 폴리펩타이드(백신으로서 사용하기 위한) 코딩 유전자를 포함한다. 유전자 치료법, 즉 방어 유전자 발현과 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 시도에는 치료 유전자를 세포에 삽입한 후, 필요로하는 단백질을 발현 및 생성시키는 것이 포함된다. 이러한 시도는 손상된 유전자의 대체 또는 바람직하지않은 유전자 발현의 저해를 가능하게 한다. 특히, 보전된 바이러스 또는 바이러스 벡터를 유전자 치료법에 사용하여 치료 트랜스유전자 또는 면역원성 폴리펩타이드 코딩 유전자를 환자에게 전사할 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 보전된 바이러스 입자는 생 바이러스 벡터이다. “생 바이러스 벡터”는 목적 종에 대하여 비병원성 또는 저병원성이며, 다른 바이러스 또는 미생물, 리포터 유전자 또는 치료 단백질에 대하여 면역 반응 보호를 촉진하는 항원을 코딩하는 1종 이상의 유전자가 삽입된 생 바이러스 벡터를 의미한다. 특히, 핵산이 바이러스 벡터에 도입되어, 여전히 복제가능하기 때문에 삽입된 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키고, 백신의 경우 감염된 숙주 동물에서 면역 반응을 유발시킨다. 일 실시형태에서, 생 바이러스 벡터는 약독화된 생 바이러스 벡터, 즉 야생형 바이러스 보다 덜 전염성(질환 유발)이 되도록 변형된 생 바이러스 벡터이다.
잠재적인 백신으로 재조합 바이러스를 사용하는 기준은 병원성 유기체 유래 특이 유전자를 비병원성 또는 약독화된 바이러스의 게놈에 혼입시키는 것을 포함한다. 이어서 재조합 바이러스가 in vivo 또는 in vitro에서 특이적 진핵세포를 감염시킬 수 있고, 이들이 재조합 단백질을 발현시키도록 한다.
질환 유기체 유래 유전자 코딩 서열을 삽입하여 유도된 생 바이러스 벡터 백신이 생 약독화 백신, 불활성화 백신, 서브유니트 또는 DNA 어프로치에 바람직할 수 있다. 생 바이러스 벡터의 가장 중요한 안전 특성 중 하나는 수용자가 질환 작용제 자체에 노출되지 않고도 병원성 유기체 유래 특이 항원에 대하여 면역화될 수 있다는 사실이다.
목적하는 이종유래 항원을 발현할 수 있어도 숙주에 대하여 약독화되었거나 숙주에서 복제될 수 없는 바이러스 벡터를 선택함으로써 안정성을 추가로 조절할 수 있다.
목적하는 종에서 안전성의 이력을 갖고 있는 백신 균주는 추가의 안정성 특성을 제공한다. 몇몇 시스이 개발된 바 있고, 여기서 벡터는 필수 유전자가 삭제되고, 백신의 제조가 소실 기능이 제공된 세포 시스템에서 수행된다.
다양한 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터를 이종유래 유전자를 목적 세포에 전달하는데 이용할 수 있다. 상기 목적하는 이종유래 유전자는 바이러스 벡터에 삽입될 것이다. 본 발명의 바이러스 벡터는, 예를 들어, 복제 기원이 제공된 바이러스 벡터, 임의로 이종유래 유전자의 발현을 위한 촉진인자 및 임의로 촉진인자의 조절인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시에 유용한 아데노바이러스는 El 및(또는) E3 및(또는) E4 영역이 삭제되거나, 그렇지 않으면 이종유래 DNA를 수용하기 위해 최대화될 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 목적하는 이종유래 유전자에 조작가능하게 연결된 다른 바이러스 핵산 서열과 함께, 구성 촉진인자, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 촉진인자, S V40 대형 T 항원 촉진인자, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 촉진인자, 아데노바이러스 주요 후기 촉진인자(MLP), 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 촉진인자, S V40 초기 촉진인자, 아데노바이러스 촉진인자, 예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 촉진인자(Ad MLP), HSV 촉진인자(예를 들어, HSV IE 촉진인자), HPV 촉진인자, 예를 들어, HPV 상부 조절 영역(URR) 또는 로우스 육종 바이러스 촉진인자를 포함할 수 있다.
또한 조지-특이적 또는 유도 촉진인자를 목적하는 이종유래 유전자의 발현을 조절하는데 이용할 수 있다. 촉진인자는 또한 발현이 설계된 숙주세포와 상용할 수 있도록 선택될 수 있다.
또한 바이러스 벡터는 다른 전사 조절 요소, 예를 들어, 증강인자를 포함할 수 있다. 증강인자는
촉진인자/유전자 서열에 조작가능하게 연결될 경우 상기 유전자 서열의 전사를 증가시키는 시스-작용제(cis-acting agent)로서 대체로 정의된다. 증강인자는 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 촉진인자) 보다 목적 서열로부터 꽤 멀리 떨어진 위치에서 작용할 수 있고, 목적 서열에 대한 각 방위에 위치할 때 작동된다. 증강인자는 폴리오마바이러스, BK 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 아데노바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40), 몰로니 육종 바이럿, 소 유두종 바이러스 및 로우스 육종 바이러스를 포함하는 다수의 바이러스 원으로부터 동정된 바 있다. 적절한 증강제의 예로는 S V40 초기 유전자 증강인자, 로우스 육종 바이러스의 LTR(long terminal repeat) 유래 증강인자/촉진인자, 인간 또는 쥐 CMV 유래 요소, 예를 들어, CMV 인트론 A 서열에 포함된 요소를 포함한다. 목적 이종유래 유전자 함유 바이러스 벡터를 저장 전에 본 발명에 따른 방법으로 보전하고, 동결건조와 같은 추가의 보전 기술로 처리하거나, 환자 또는 숙주세포에 투여할 수 있다.
항바이러스 활성, 면역조절 분자, 예를 들어, 사이토카인(예를 들어. TNF-alpha, 인터페론, 예를 들어, IL-6, 및 IL-2, 인터페론, 콜로니 촉진 인자, 예를 들어, GM-CSF), 보조제 및 공동-촉진 및 부속 분자를 발현시키는 폴리펩타이드 코딩 핵산을 본 발명의 바이러스 벡터에 포함시킬 수 있다. 또한 이러한 폴리펩타이드를, 예를 들어, 본 발명의 보전 혼합물에 개별적으로 제공하거나, 본 발명의 바이러스 벡터와 동시에, 연속으로 또는 개별적으로 투여할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 보전된 바이러스 벡터는 당업계에 잘 알려진 다양한 바이러스 기술, 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 아데노바이러스로 감염시키는 기술을 이용하여, 적절한 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 바람직하게는 목적 유전자를 함유하는 본 발명의 보전된 바이러스 벡터의 투여는 목적 세포의 바이러스 감염에 의해 매개된다.
다수의 바이러스 기재 시스템이 포유류 세포를 핵산전달감염을 위해 개발되어진 바 있다.
예를 들어, 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 선별된 재조합 핵산 분자를 벡터에 삽입하고, 레트로바이러스 입자로서 포장할 수 있다. 이어서, 상기 재조합 바이러스를 분리하고, 대상의 세포로 in vivo 또는 ex vivo로 전달할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 Mo-MLV(Moloney murine leukaemia virus)를 기반으로 한 것일 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 있어서, 1종 이상의 바이러스 유전자 (gag, pol & env)가 일반적으로 목적하는 유전자로 대체된다. 아데노바이러스 하위군 C 항원형 2 및 5가 통상적으로 벡터로서 사용된다. 야생형 아데노바이러스 게놈은 대랙 35kb이며, 30kb까지 외래 DNA로 대체될 수 있다.
조절 기능을 갖는 4가지 초기 전사 유니트(El, E2, E3 & E4) 및 구조 단백질을 코딩하는 후기 트랜스크립트가 존재한다. 아데노바이러스 벡터는 불활성화된 E1 및(또는) E3 유전자를 가질 수 있다. 이어서 조력 바이러스 또는 플라스미드에 의해 자동으로 결손 유전자를 공급하거나 조력 세포 게놈에 통합시킬 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 E2a 온도 민감성 돌연변이 또는 E4 검출을 이용할 수 있다. 최소 아데노바이러스 벡터는 트랜스유전자 주위에 단지 ITR(inverted terminal repeat) 및 팩킹 서열만을 함유할 수 있고, 모든 필요한 바이러스 유전자가 조력 바이러스에 의해 자동으로 제공된다. 따라서 적절한 아데노바이러스 벡터는 Ad5 벡터와 원숭이 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
또한 바이러스 벡터를 우두 바이러스 및 조류 폭스바이러스, 예를 들어, 가금류 폭스 백신을 포함하는 폭스군 바이러스로부터 유도할 수도 있다. 예를 들어, 변형된 우두 바이러스 안카라(MVA)는 정상 인체 조직을 포함한 대부분의 세포 조직에서 복제되지 않는 우두 바이러스의 균주이다. 따라서 재조합 MVA 벡터를 본 발명의 폴리펩타이드를 전달하는데 이용할 수 있다.
바이러스의 부가 형태, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 또한 적절한 벡터 시스템을 개발하는데 이용할 수 있다.
부형제
본 발명에서는, 바이러스 입자를 보전하기 위한 부형제를 제공한다. 상기 부형제는 (a) 수크로오스, 스타키오스, 트레할로스, 당 알코올 또는 라피노오스 또는 이들의 임의의 조합; 및 (b) Mn 기준 5M 이하의 PEI를 포함한다. “부형제”란 본 발명의 바이러스 입자를 위한(예를 들어, 바이러스 입자를 백신으로 사용할 경우) 담체로서 사용되는 불활성 물질을 의미한다. 전형적으로는, 바이러스 입자(예를 들어, 백신으로서 사용하기 위한)를 부형제에 용해하거나 혼합하여, 바이러스 입자의 방부제 역할을 하고(하거나) 체 내로의 투여 및 흡수를 어느 정도 보조한다. 부형제는 본 발명의 보전 혼합물뿐만 아니라, 이러한 성분들이 본 발명의 보전 혼합물의 효과를 유의적으로 감소시키니 않은 한 당업계에 잘 알려진 다른 방부제, 예를 들어, 항산화제, 윤활제 및 결합제를 포함할 수 있다.
고체 지지체에 대한 분석
고체 지지체 상에 저장된 보전된 바이러스 입자는 진단 목적 또는 예방접종 요법을 모니터링하는데 이용할 수 있다. 예를 들어, 체액(혈액, 소변, 타액, 담즙, 위액 등)과 같은 환자 시료를, 환자 시료와 본 발명의 보전 혼합물의 혼합물을 고체 지지체 상에 건조시킴으로써 본 발명에서 기술한 방법에 따라 보전할 수 있다. 이어서 보전된 환자 시료에 대해 항-바이러스 항체(예를 들어, ELISA를 이용)를 이용하여 시료 중의 바이러스 항원/에피토프의 존재 여부를 시험할 수 있다. 또한, 목적하는 바이러스를, 본 발명의 보전 혼합물과 바이러스 입자를 포함하는 혼합물을 고체 지지체 상에 건조함으로써, 본 발명의 방법에 따라 보전할 수도 있다. 환자 시료는 항-바이러스 항체의 존재 하에 환자 시료를 목적하는 바이러스 입자가 부착된 고체 지지체와 접촉시킴으로써 시험할 수 있다. 항원-항체 복합체의 형성이 측정가능한 시그널을 유도해낼 수 있다. 시료 내에 바이러스 입자 항원-항체 복합체의 존재 및(또는) 양을 환자에게서 바이러스 감염의 존재 또는 예방접종 요법의 진행 여부를 알아보는데 이용할 수 있다.
투여
본 발명에 따른 보전된 백신 또는 바이러스 입자를, 동결건조된 산물을 재구성하고 잠시 후, 다양한 공지의 경로 및 기술을 이용하여 in vivo로 대상에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 보전된 백신은 주사가능 용액, 현탁액 또는 유탁액으로 제공될 수 있고, 통상적인 주사바늘 또는 시린지를 이용하거나, 액체 제트 주사 시스템을 이용하여 비경구, 피하, 경구, 외피, 피내, 근육내, 동맥내, 복막내, 정맥내 주사를 통해 투여할 수 있다. 보전된 백신은 피부 또는 비강 조직에 국소적으로, 예를 들어 코, 기관삽관, 장내, 설하, 직장 또는 질로 국소적으로 투여하거나, 호흡기 또는 폐 투여에 적절한 미분된 분무액으로 제공된다.
본 발명 방법의 일 실시형태에 있어서, 혼합물을 액체 주사로 투여하는데 적절한 제형으로 가공하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 혼합물을 섭취를 통해 또는 폐 경로를 통해 투여하는데 적절한 제형으로 가공하는 단계를 추가로 포함한다.
보전된 산물은 적량 제형에 상응하고, 예방적으로 및(또는) 치료적으로 유효한 양으로 대상에게 투여된다. 본 발명의 보전된 산물 또는 백신의 투여는 “예방적” 또는 “치료적” 목적을 위한 것일 수 있다. 본 발명에서 사용된 “치료적” 또는 “치료”란 용어는 감염 또는 재감염의 예방, 증상의 감소 또는 제거, 병원균의 감소 또는 완전 제거를 포함한다. 치료는 예방적으로(감염 전) 또는 치료적으로(감염 후) 효과적일 수 있다.
도 1은 실온에서 24 시간 동안 배양하거나 37℃에서 48 시간 동안 열처리 한 후 동결전조하여 회수한 수족구병 바이러스(FMDV-A)에 대한 PEI, 수크로오스(Sue) 및 라피노오스(Raf)로 이루어진 부형제의 효과를 나타낸 도이다. 상기 결과는 인삼염 완충 염수(PBS)가 동결건조 동안 어떠한 보호 효과도 나타내지 않는다는 사실을 보여준다. 오차 범위는 평균의 표준편차(n=2)로 나타내었다.
도 2는 PEI가 당 수크로오스(Sue) 및 스타키오스(Stac)에 가해진 경우 FMDV-O의 회복을 증진시킨다는 사실을 나타낸 도이다. PEI, Sue 및 Stac 함유 부형제의 사용 결과는 “Poly"로 표시하였다. PEI를 제외하고 Sue 및 Stac 함유 부형제의 사용 결과는 “Sugar"로 표시하였다. 24 시간("24h HT") 및 6 일("6day HT") 열처리한 FMDV-O에서 효과가 나타났다. 오차 범위는 평균의 표준편차(n=2)로 나타내었다.
도 3은 부형제 중 초기 당 농도가 FMDV-O 안정성을 유지하는데 중요하다는 사실을 나타낸 도이다. 수크로오스와 스타키오스 용액 (120 Sue (3M): 80 Stac (0.75M))을 1:10으로 희석하여 당만을 함유한 부형제의 보호효과가 완전히 손실되었다. 오차 범위는 평균의 표준편차(n=2)로 나타내었다.
도 4a는 다양한 PEI 농도의 동결건조된 HT FMDV-O의 회복률에 대한 수크로오스(Sue):스타키오스(Stac) 비의 효과를 나타낸 도이다. 그 결과 Stac의 첨가로 안정성이 증가되었음이 나타났다. 각 PEI 농도에 대한 결과를 대조하였다. 일방 ANOVA에 이은 터키 테스트를 이용한 통계적 분석으로 모든 Sue 함유 혼합물이 140:60의 Suc:Stac 비를 갖는 혼합물에 비해 유의적으로 보다 낮은 회복률을 나타냈음을 보여주었다. 오차 범위는 평균의 표준편차(n=8)로 나타내었다.
도 4b는 WO-A-2006/0850082에 따른 다양한 히스톤(His) 농도의 동결건조된 HT FMDV-O의 회복률에 대한 Sue: Stac 비율의 효과를 나타낸 도이다. 히스톤은 뵈링거 만하임에서 입수힌 히스톤 2A였다. 오차 범위는 평균의 표준편차(n=6)로 나타내었다.
도 5는 아데노바이러스 회복률에 대한 Sue / Stac / PEI 비율의 최적화 효과를 나타낸 도이다. 12시간 동안 동결건조하고, 24시간 열처리한 후 플라크 형성 단위(PFU) 형성을 분석하였다. 그 결과 최고 수준의 Stac를 사용한 경우 바이러스 PFU가 급속히 저하되었음을 나타내었다. Stac를 사용하지 않은 경우, PFU는 극적으로 감소하였다. PBS 만을 이용한 동결건조의 경우 PFU가 발견되지 않았다. 보다 낮은 PEI 희석의 경우, 증진된 바이러스 회복률을 나타내었다.
도 6은 PEI 및 당에서 아데노바이러스 회복률을 나타낸 도이다. PEI 및 당 부형제를 최적화하고 3 가지 대조군, 당, PEI 및 원 역가(동결건조 전)와 비교하였다. PBS 만을 이용한 동결건조의 경우 열보호효과가 나타나지 않았다. 당 만을 사용한 경우 약간의 바이러스 활성이 나타났으나, 보다 큰 바이러스 활성은 부형제에서 당 과 PEI를 함께 사용한 경우 나타났다. 오차 범위는 평균의 표준편차(n=2)로 나타내었다.
도 7은 0.002nM 농도의 PEI와 함께 Sue (1.5M) / Stac (0.125M) 함유 부형제가 최적이며, Sue, Stac 용액 단독에 비해 개선된 아데노바이러스 회복률을 나타냈음을 보여주는 도이다. 단독 부형제로서 PEI는 동결건조 동안 보호효과를 약간 내지 거의 나타내지 않았다.
도 8은 아데노바이러스 회복률에 대한 두 가지 상이한 PEI를 비교하기 위해 설계한 실험 결과를 나타낸 도이다. 고분자량 PEI가 보다 낮은 농도에서 저분자량 PEI 보다 효과적이었다. PBS를 단독으로 사용한 경우 바이러스 회복률을 나타내지 않았다. 또한 최적 PEI/당 농도가 당 단독의 경에 비해 개선된 회복률을 보여주었다.
도 9는 물에 희석한 PEI("PEIW")와 PBS에 희석한 PEI("PEIP")를 비교한 도이다. 그 결과 PEI를 물에 희석한 것에 비해 PBS에 희석한 경우에 보다 큰 아데노바이러스 역가를 보여주었다. PBS 및 증류수 자체만을 부형제로 사용한 경우 매우 낮은 수준의 아데노바이러스 회복률을 보여주었다.
하기의 실시예로 본 발명을 예시한다. 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 10에서 사용된 PEI는 Mw 750000 및 Mn 60000이다(Sigma P3143). 실시예 9에서 사용된 “고분자량” PEI는 Mw 750000 및 Mn 60000이다(Sigma P3143). 실시예 9에서 사용된 “저분자량” PEI는 Mw 1300 및 Mn 1200이다(Aldrich 482595). 실시예에서 사용된 히스톤(histone)은 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)에서 입수한 히스톤 2A이다.
하기의 일반적인 실험 기술을 이용하였다:
동결 건조
바이알을 볼텍싱한 후, -80℃에서 내부에 부분적으로 고무 스토퍼를 구비한 물 30mL 함유 동결 건조기 트레이에서 동결시켰다. 동결된 바이알을 사전 냉각한 동결 건조기(Thermo Fisher)의 동결 건조기 스토퍼 쉘프(Thermo Fisher)로 이송하고, 16시간 동안 건조하였다. 고무 스토퍼를 진공 하에서 바이알로 완전히 낮춘 후, 동결 건조기에서 제거하였다.
FMDV 분석
바이러스와 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 20mM 글루타민, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100μg/ml)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium) 배지에서 배양하였다.
물에 용해된 인둘비오스 25mL(24mg/mL)를 이글스 오버레이 75mL, 트립톤 인삼염 브로쓰 5 mL, FBS 1mL 및 페니실린(100U/mL)과 스트렙토마이신(100μg/mL) 1mL에 가하여 이글스 오버레이 배지를 제조하였다.
BHK-21 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트에서 제조하고, 37℃에서 대략 80-90% 컨플루언스가 될 때까지 밤새 배양하였다. 동결건조된 시료를 DMEM에 재용해 시켰다. 세포 단층을 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하고, 100μL FMDV 시료로 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포 단층을 이글스 오버레이 2mL로 덮고, 이를 실온(RT)에서 고정시킨 후, 37℃에서 추가로 40-48시간 동안 배양하였다. 감염된 세포 단층을 메틸렌 블루(FBS 중 4% 포름알데하이드) 2mL로 실온에서 24시간 동안 염색하고, 염색된 플라크를 기록하였다.
아데노바이러스 분석
96 편평 바닥 세포 배양 접시(Jencons, UK)에 HEK 293 세포를 105 cells/mL(웰 당 100μL)로 접종하고, 37℃에서 5% CO2 환경으로 유지하였다. 90% 컨플루언스에 도달한 후, 아데노바이러스와 부형제를 함유한 바이알을 DMEM(10% FBS) 1mL에 재구성하였다. 이어서 재구성 바이알에서 100mL를 취해 DMEM 900mL에 가함으로써 1:10 희석 단계를 수행하였다. 이어서 생성된 희석 바이러스 100mL를 플레이트 상의 제1 열에 가하고, 플레이트 하방으로 1:2 희석을 수행하였다. 이어서 다음 부형제로 상기 공정을 반복하였다. 추가로 48 시간 후, 형광 현미경을 이용하여 웰 당 GFP 세포의 수를 계수하였다.
통계적 분석
PRISM 그래프패드 소프트웨어 v. 4.00을 이용하여 스튜던트 T-테스트를 수행하여 다양한 부형제 사이의 유의도를 분석하였다. 또한, 각 쌍들의 다중 비교가 필요한 경우, 터키 포스트 비교 테스트를 이용하여 일방 ANOVA를 수행하였다. P 수치 요약은 *p< 0.10; **p<0.05; 및 ***p< 0.005였다.
실시예 1
4.1 x 107 pfu/mL(조직 배양 배지 mL 당)의 역가를 갖는 재조합 아데노바이러스 발현 EGFP(enhanced green fluorescent protein)를 수크로오스(포화 용액, 대략 64% w/v), 스타키오스(포화 용액, 대략 64% w/v) 및 PEI(33μg/mL)를 각각 3:1:1 v/v로 포함한 부형제와 혼합하였다(1:5 v/v). 상기 혼합물을 하기와 같이 동결건조하였다: 시료를 액체 질소에서 동결하고, 실온에서 16 시간 동안 진공 하에서 건조하였다. 이어서, 시료를 사용 전까지 -20℃에서 보관하거나, 즉시 사용하였다. 293 A 세포 중에서 플라크 분석법을 사용하여 아데노바이러스를 분석하였다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
| 처리 | 역가(pfu/mL) |
| 전-건조 | 4.8 x 107 |
| 즉시 후-건조 | 4.3 x 107 |
| 후 건조 및 37℃에서 5일 보관 | 4.1 x 107 |
실시예 2
동결건조(FD) 및 실온에서 24시간 동안 방치(RT) 또는 37℃에서 48시간 동안 열처리(HT)한 경우 FMDV-A의 회복률에 대한 부형제 성분의 효과를 조사하기 위해 본 실시예를 설계하였다. AU 부형제를 유리 바이알에 준비하였다. 모든 바이알을 복수로 준비하였다.
Sue(1g/mL) 수용액 170μL 및 Raf(1g/mL) 수용액 30μL를 가하여, 당 혼합물의 부치가 총 200μL가 되게 하였다. 이어서 PEI(0.03mg/mL) 50 μL를 가하여 부형제를 완성하였다. 최종적으로, FMDV-A 50μL를 가하고, 혼합물을 볼텍싱하였다. 부형제 혼합물 중 각 당 및 PEI의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 성분 | 부형제 중 최종 농도 |
| 수크로오스 | 1.7M |
| 라피노오스 | 0.1M |
| PEI | 6.25nM*/78.13nM1 |
* Mw로 계산한 농도
1 Mn로 계산한 농도
FMDV-A 50μL를 PBS 250μL에 가하여 대조구 혼합물을 제조하였다. 바이알을 동결건조한 후, 실온에서 24시간 동안 또는 37℃에서 48시간 동안 방치하였다. 그 결과, 부형제가 PBS 단독인 경우 매우 적은 바이러스 회복률이 나타났다. Sue, Raf 및 PEI를 함유하는 부형제는 RT 및 HT에서 유사한 FMDV 회복률을 나타냈다. 실제로, 스튜던츠 T-테스트 결과 실온에서 배양한 것(RT)과 37℃에서 48시간 동안 열처리한 것(HT) 사이에 유의적인 차이가 없었다.
실시예 3
열처리된 FMDV-O 바이러스에 대한 PEI의 효과를 조사하기 위하여 본 실시예 를 설계하였다. 120μL Sue(3M), 80μL Stac(0.75M) 및 PEI(10-2mg/mL) 또는 증류수 50μL로 유리 바이알을 복수로 제조하였다. 50μL FMDV-O를 각 부형제 바이알에 가하였다. 부형제 혼합물 중 각 당 및 PEI의 최종 농도(존재하는 경우)를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 성분 | 부형제 중 최종 농도 |
| 수크로오스 | 1.2M |
| 스타키오스 | 0.2M |
| PEI | 2nM*/25nM1 |
* Mw로 계산한 농도
1 Mn로 계산한 농도
50μL 부피의 상기에서 사용된 바이러스를 대조구로서 동결하였다(원 역가). 동결건조 후, 시료를 37℃에서 24시간 또는 6일 동안 배양하였다. 시료를 1mL DMEM(10% PBS)에 재현탁시키고, 플라크 분석법으로 바이러스 회복률을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
단순히 당 부형제 만을 사용한 것과 비교하여 당 부형제 중에 PEI를 포함한 것의 초과 효과를 평가하기 위하여 실시예 3을 설계하였다. 37℃에서 24시간 동한 열처리한 결과, PEI 함유 부형제를 사용한 경우 유의적인 바이러스 회복률 저하가 없는 반면, PEI를 함유하지 않은 당 부형제를 사용한 경우 바이러스 회복률이 유의적으로 감소하였다. 열처리 6일 후, PEI 함유 부형제를 사용한 경우 바이러스의 손실이 발견되었다. 그러나 이러한 손실은 당만을 함유한 부형제를 사용한 경 우 보다 유의적으로 보다 낮았다.
실시예 4
초기 당 농도를 조사하여 FMDV-O의 회복에서 있어 부형제 당 성분을 최적화하였다. 120: 80 Sue (3M) 및 Stac (0.75M) 비율을 갖는 당 용액을 제조하고, 1:10, 1:100, 1:1000 연속 희석을 수행하였다. 200μL의 각 당 농도 또는 PBS의 유리 바이알 세 개를 제조하고, 당 용액 또는 PBS에 FMDV-O 50μL를 가하였다. 각 당의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 성분 | 부형제 중 최종 농도 |
| 수크로오스 | 1.2M |
| 수크로오스 1:10 | 0.12M |
| 수크로오스 1:100 | 0.012M |
| 수크로오스 1:1000 | 0.0012M |
| 스타키오스 | 0.2M |
| 스타키오스 1:10 | 0.02M |
| 스타키오스 1:100 | 0.002M |
| 스타키오스 1:1000 | 0.0002M |
50μL 부피의 바이러스를 대조구로서 동결하였다(원 역가).
시료를 동결건조 한 후, 37℃에서 7일 동안 배양하고, DMEM(10% FBS) 1mL에 재현탁시키고, 플라크 분석법으로 바이러스 회복률을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
본 실시예 4의 목적은 희석 당 농도의 효과를 살펴보는 것이었다. 동결건조 후, 바이러스 회복률은 당 용액을 함유한 부형제에서 원 역가의 대략 1/10 정도 하락하였다. 당 농도를 1:10으로 희석한 경우, 유의적인 회복률을 보이지 않았다.
실시예 5
FMDV-O의 회복을 위한 최적인 수크로오스와 스타키오스 농도 조합의 효과를 조사하기 위해 본 실시예 5를 설계하였다. 80μL Sue(3M)과 120μL Stac(0.75M) 내지 200μL Sue와 0μL Stac의 일련의 당 비율을 준비하였다. 1:100 내지 1:32000의 일련 PEI 희석액 1mg/mL를 준비하였다. 1mg/mL 내지 0.625mg/mL의 일련의 희석으로 His를 준비하였다. 50μL FMDV-O, 200μL의 각 당 비율 및 50μL의 각 PEI 희석액으로 시료의 메트릭스를 준비하였다.
각 당 및 PEI의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 | 부형제 중 최종 농도 |
| 수크로오스 80μL | 0.8M |
| 수크로오스 100μL | 1M |
| 수크로오스 120μL | 1.2M |
| 수크로오스 140μL | 1.4M |
| 수크로오스 160μL | 1.6M |
| 수크로오스 180μL | 1.8M |
| 수크로오스 200μL | 2M |
| 스타키오스 120μL | 0.3M |
| 수크로오스 100μL | 0.25M |
| 수크로오스 80μL | 0.2M |
| 수크로오스 60μL | 0.15M |
| 수크로오스 40μL | 0.1M |
| 수크로오스 20μL | 0.05M |
| PEI 1:100mg/mL - 1:32000mg/mL | 2-0.006nM*/25-0.075nM1 |
| 히스톤 1mg/mL - 0.0625mg/mL | 0.17-0.01mg/mL |
* Mw으로 계산한 농도
1 Mn으로 계산한 농도
시료를 동결건조하고 37℃에서 3일(PEI 시료) 또는 24시간(His 시료) 동안 배양한 후, DMEM (10% FBS) 1mL에 재현탁하고 플라크 분석법으로 FMDV 회복률을 측정하였다. 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.
각 PEI 농도에 대한 결과를 대조하였다. 도 4.1에 나타낸 결과는, 140:60의 비율로 Sue: Stac를 함유한 부형제와 비교하여 수크로오스만을 함유한 부형제의 경우 유의적으로 보다 낮은 회복률을 나타내었음을 보여주었다. 순수한 Sue 부형제 이외에, 다양한 비율의 Sue:Stac 사이에서는 유의적인 차이가 없었다.
도 4.2에 부형제에서 PEI를 His로 대체한 동일한 부형제의 결과를 나타내었다. 상기 결과는 보다 매우 큰 Sue 비율이 바람직하고 Sue 만을 함유한 부형제의 유의적인 유독성은 없는 것으로 최적 Sue:Stac 비율에 대한 효과를 나타내었다.
실시예 6
본 실시예에서는, GFP 태그 아데노바이러스를 사용하여 다양한 당/PEI 농도에 대한 바이러스 회복률을 비교하였다. 최종 부피 200μL로 일련의 다양한 Sue:Stac 비율을 확립하였다. 0.1mg/mL 내지 0.01μg/mL 농도 번위의 PEI 50μL를 각 바이알에 가하였다. 다양한 Sue:Stac:PEI 비에 아데노바이러스를 가한 후, 바이알을 동결하고 동결건조하였다.
각 당 및 PEI의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 | 동결건조 전 최종 농도 |
| 수크로오스 200μL | 2M |
| 수크로오스 160μL | 1.6M |
| 수크로오스 120μL | 1.2M |
| 수크로오스 80μL | 0.8M |
| 수크로오스 40μL | 0.4M |
| 스타키오스 40μL | 0.1M |
| 스타키오스 80μL | 0.2M |
| 스타키오스 120μL | 0.3M |
| 스타키오스 160μL | 0.4M |
| 스타키오스 200μL | 0.5 |
| PEI 1:10mg/mL | 20nM*/250nM1 |
| PEI 1:50mg/mL | 4nM*/5nM1 |
| PEI 1:1000mg/mL | 0.2nM*/2.5nM1 |
| PEI 1:1000150mg/mL | 0.02nM*/0.25nM1 |
* Mw으로 계산한 농도
1 Mn으로 계산한 농도
37℃에서 24시간 동안 열처리 후, 부형제와 바이러스를 DMEM (10% FBS) 1mL에 재구성하였다. 바이러스 역가를, 90% 컨플루언트 단층의 293 세포 함유 96 웰 플레이트에서 2 배 연속 희석을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
초기 최적화로 세 가지 변수, 다양한 농도의 메트릭스를 이용한 Sue 농도, Stac 농도 및 PEI 농도를 조사하였다. 메트릭스의 결과는 당 농도와 PEI 농도 모두가 바이러스 회복률에 뚜렷한 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 높은 농도의 Stac 대 Sue 또는 높은 농도의 PEI 모두가 낮은 수준의 회복률을 보여주었다. 바이러스의 최적 회복률에는 Sue가 필요하였다. Sue를 함유하지 않은 시료는 회복을 보이지 않았다.
실시예 7
본 실시예의 목적은 Sue-Stac 당 부형제에서 PEI 농도를 조사하기 위한 것이다. PEI에 대한 일련의 1:10 희석을 수행하여 최적 PEI 농도를 평가하였다. 당농도 회적화 작업으로부터, 120:80의 Sue-Stac를 선택하였다.
각 당 및 PEI의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 | 동결건조 전 최종 농도 |
| 수크로오스 | 0.8M |
| 스타키오스 | 0.2M |
| PEI 100μg/mL | 20nM*/250nM1 |
| PEI 10μg/mL | 2nM*/25nM1 |
| PEI 1μg/mL | 0.2nM*/2.5nM1 |
| PEI 0.1μg/mL | 0.02nM*/0.25nM1 |
| PEI 0.01μg/mL | 0.002nM*/0.025nM1 |
| PEI 0.001μg/mL | 0.0002nM*/0.0025nM1 |
* Mw으로 계산한 농도
1 Mn으로 계산한 농도
동결건조 후, 시료를 37℃에서 24시간 동안 열처리한 후, 아데노바이러스 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 결과는, 보다 높은 농도의 PEI를 사용할 경우, 낮은 바이러스 회복률을 보였다는 사실을 나타낸다. PEI를 더욱 희석한 경우, 바이러스 회복률이 약 0.01μg/mL의 최적 농도로 개선되었다. 이 농도에서 회복률은 당 부형제 만을 사용한 경우의 바이러스 회복률 보다 유의적으로 높은 것이었다. PBS 함유 부형제는 바이러스 회복을 나타내지 않았다.
실시예 8
동결건조 동안 바이러스 안정성에 대한 다양한 부형제 성분에 대한 보다 큰 이해를 얻기 위해 본 실시예를 설계하였다.
각 당 및 PEI의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 | 동결건조 전 최종 농도 |
| 수크로오스 | 1.5M |
| 스타키오스 | 0.125M |
| PEI(10-2) | 2nM*/25nM1 |
| PEI(10-4) | 0.02nM*/0.25nM1 |
* Mw으로 계산한 농도
1 Mn으로 계산한 농도
부형제와 바이러스를 함유한 바이알을 밤새 동결건조하였다. 동결건조 후, 바이알을 37℃에서 5일 동안 배양한 후, DMEM (10% FBS) 1 mL에 재현탁시켰다. 이어서, 생성된 용액을 1:1000으로 희석하고, 일련의 1:2 희석을 수행한 다음 293 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실시예 9
고농도 PEI와 저농도 PEI의 차이를 연구하기 위한 본 실시예 9를 설계하였다. 고분자량 PEI ("HPEI")는 Mw가 750000인 반면, 저분자량 PEI ("LPEI")는 Mw가 1300이었다.
각 당 및 PEI의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 | 동결건조 전 최종 농도 |
| 수크로오스 | 1.5M |
| 스타키오스 | 0.125M |
| HPEI(10-2) | 2nM*/25nM1 |
| HPEI(10-3) | 0.2nM*/2.5nM1 |
| HPEI(10-4) | 0.02nM*/0.25nM1 |
| HPEI(10-5) | 0.002nM*/0.025nM1 |
| LPEI(10-2) | 1.28nM*/1.38nM1 |
| LPEI(10-3) | 0.128nM*/0.138nM1 |
| LPEI(10-4) | 0.0128nM*/0.0138nM1 |
| LPEI(10-5) | 0.00128nM*/0.00138nM1 |
* Mw으로 계산한 농도
1 Mn으로 계산한 농도
부형제와 아데노바이러스를 함유한 바이알을 밤새 동결건조하였다. 동결건조 후, 바이알을 37℃에서 5일 동안 배양한 후, DMEM (10% FBS) 1 mL에 재현탁시켰다. 이어서, 생성된 용액을 1:1000으로 희석하고, 일련의 1:2 희석을 수행한 다음 293 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
실시예 10
PEI (고분자량 ; Mw 750000)을 PBS ("PEIP") 또는 물("PEIW")에 희석할 경우, 아데노바이러스 회복에 있어서의 차이점을 조사하기 위해, 본 실시예 10을 설계하였다.
각 당 및 PEI의 최종 농도를 하기 표에 나타내었다.
| 부형제 | 동결건조 전 최종 농도 |
| 수크로오스 | 1.5M |
| 스타키오스 | 0.125M |
| PEI(10-2) | 2nM*/25nM1 |
| PEI(10-3) | 0.2nM*/2.5nM1 |
| PEI(10-4) | 0.02nM*/0.25nM1 |
| PEI(10-5) | 0.002nM*/0.025nM1 |
* Mw으로 계산한 농도
1 Mn으로 계산한 농도
부형제와 바이러스를 함유한 바이알을 밤새 동결건조하였다. 동결건조 후, 바이알을 37℃에서 5일 동안 배양한 후, DMEM (10% FBS) 1 mL에 재현탁시켰다. 이어서, 생성된 용액을 1:1000으로 희석하고, 일련의 1:2 희석을 수행한 다음 293 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
Claims (20)
- (j) 폴리에틸렌이민의 농도가 그의 수평균 분자량(Mn)을 기준으로 15 μM 이하이고, 당 농도 또는 1종 이상의 당이 존재하는 경우 총 당농도가 0.1 M 이상인 1종 이상의 당, 폴리에틸렌이민 및 바이러스 입자 수용액을 제공하는 단계; 및(ii) 상기 수용액을 건조시켜 바이러스 입자를 포함하는 무정형 고체 메트릭스를 형성시키는 단계로 이루어진 바이러스 입자의 보전 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민의 수평균 분자량(Mn)이 20 내지 1000 kDa이고, 농도가 Mn을 기준으로 0.001 내지 100 nM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민의 Mn이 1 내지 l0000Da이고, 폴리에틸렌이민의 농도가 Mn 기준 0.0001 내지 10μM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 농도 또는 총 당 농도가 0.5 내지 2M인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당이 수크로오스, 스타키오스, 라피노오스 또는 당 알코올인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2종 이상의 당 용액이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수크로오스 대 다른 당의 농도비가 3:7 내지 9:1이고, 상기 단계 (i)에서 Mn 기준 폴리에틸렌이민의 농도가 0.0025nM 내지 5μM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물이 동결건조된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자가 생 바이러스 또는 사멸 바이러스로 이루어진 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 생 바이러스가 전바이러스 또는 생-약독화 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 바이러스 입자, 1종 이상의 당 및 폴리에틸렌이민미을 포함하며, 무정형 고체 형태인 것을 특징으로 하는 보전된 산물.
- 제11항에 있어서, 상기 산물이 바이러스-유발 독성, 바이러스 감염, 바이러스 감염의 속발, 암 또는 알러지의 예방 또는 치료에 있어 백신으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 보전 산물.
- (a) 수크로오스, 스타키오스 또는 라피노오스 또는 임의의 이들의 조합; 및(b) Mn 기준 5μ 이하 농도의 폴리에틸렌이민을 포함하는 바이러스 입자의 보전용 부형제.
- 동결건조 동안 및 그 이후에 바이러스 입자를 보전하기 위한 제13항에 따른 부형제 의 용도.
- 제13항에 따른 부형제를 포함하는 키트.
- 제11항에서 정의된 보전된 산물과 보조제를 포함하는 백신.
- (a) 1종 이상의 당, 폴리에틸렌이민 및 바이러스 입자의 수용액을 제공하되, 상기 폴리에틸렌이민의 농도는 그의 수평균분자량(Mn)을 기준으로 15μM 이하이고, 당 농도 또는 1종 이상의 당을 사용하는 경우 총 당 농도는 0.1M 이상인 단계;(b) 보조제, 완충제, 항생제 및(또는) 첨가제를 상기 수용액에 첨가하는 단계; 및(c) 상기 수용액을 건조하여 바이러스 입자를 포함한 무정형 고체 메트릭스를 형성시키는 단계로 이루어진 바이러스 입자를 포함한 백신의 제조 방법.
- 상기 백신이 다가 백신인 것을 특징으로 하는 제12항에 따른 산물, 제12항에 있어서, 제16항에 따른 백신 또는 제17항에 따른 방법.
- (i) 1종 이상의 당, 폴리에틸렌이민 및 바이러스 입자의 수용액을 제공하는 단계; 및(ii) 상기 용액을 건조하여 바이러스 입자를 포함한 무정형 고체 메트릭스를 형성시키는 단계로 이루어진 바이러스 입자의 보전 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 얻을 수 있는 보전된 바이러스 입자를 포함하는 건조 분말.
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| CN102725393B (zh) * | 2010-01-28 | 2015-12-02 | 先进生物营养公司 | 包含生物活性材料的干燥玻璃质组合物 |
| US9504750B2 (en) | 2010-01-28 | 2016-11-29 | Advanced Bionutrition Corporation | Stabilizing composition for biological materials |
| GB201002419D0 (en) * | 2010-02-12 | 2010-03-31 | Isis Innovation | Stable live vaccine formulations |
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| EP2552478B1 (en) * | 2010-03-31 | 2016-12-21 | Stabilitech Ltd. | Excipients for stabilising viral particles |
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| GB201406569D0 (en) | 2014-04-11 | 2014-05-28 | Stabilitech Ltd | Vaccine compositions |
| US10555981B2 (en) | 2014-07-16 | 2020-02-11 | Transgene S.A. | Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators |
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| US10752876B2 (en) | 2015-09-02 | 2020-08-25 | Mcmaster University | Enhanced thermal stability for adenoviral vectors through spray drying |
| US20190134190A1 (en) | 2016-05-04 | 2019-05-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
| TW201825674A (zh) | 2016-09-09 | 2018-07-16 | 美商艾斯合顧問有限公司 | 表現雙特異性接合分子的溶瘤病毒 |
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| US11626228B2 (en) * | 2016-12-22 | 2023-04-11 | Rogers Corporation | Multi-layer magneto-dielectric material |
| CN110168092A (zh) | 2016-12-28 | 2019-08-23 | 特朗斯吉有限公司 | 溶瘤病毒和治疗分子 |
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| GB2562241B (en) | 2017-05-08 | 2022-04-06 | Stabilitech Biopharma Ltd | Vaccine compositions |
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| AU2019345595A1 (en) * | 2018-09-28 | 2021-04-15 | Otsuka Pharmaceutical Factory,Inc. | Mammal cell preserving solution containing acarbose or stachyose |
| US20210386807A1 (en) | 2018-10-30 | 2021-12-16 | The University Of Tokyo | Oncolytic virus for cancer therapy |
| MX2021007860A (es) | 2018-12-28 | 2021-10-26 | Transgene | Poxvirux deficiente en m2. |
| WO2020136232A1 (en) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | Transgene Sa | Immunosuppressive m2 protein |
| WO2021211740A1 (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | Spectrum Solutions L.L.C. | Products and methods for detection of viral nucleic acid |
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