BRPI0721123A2 - Hidrolisatos de proteína do leite com potencial imunogênico reduzido - Google Patents

Description

RELATORIO DESCRITIVO Pedido de Patente de Invenção para: "HIDROLISATOS DE PROTEÍNA DO LEITE COM POTENCIAL IMUNOGÊNICO REDUZIDO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere às composições contendo proteínas hidrolisadas do leite e/ou proteínas do soro, e método para produzi-las. São também divulgados os hidrolisatos proteolíticos de tais proteínas possuindo potencial imunogênico reduzido para uso em aplicações em gue há risco de resposta imunológica indesejável às proteínas.

ANTECEDENTES

O leite é um produto usado amplamente não somente como uma bebida nutritiva em sua forma fluida, mas também como uma base para outros numerosos produtos tais como sorvete, iogurte, manteiga, creme e queijo. Além disso, o leite e seus componentes são usados amplamente como ingredientes nutricionais e funcionais em diversos produtos alimentícios.

O soro é um subproduto da produção de queijo. O soro se tornou um ingrediente ou aditivo alimentício útil para várias finalidades. Um típico processo de produção de queijo pode produzir somente cerca de 4,54 kg de queijo, mas 40,82 kg de soro para cada 45,34 kg de leite processado. 0 soro é rico em lactose, um açúcar naturalmente encontrado no leite, e também contém uma quantidade de proteínas que não coagulam ou precipitam durante o processo de produção de queijo, mas sim permanecem solúveis. Proteínas do soro são conhecidas por serem altamente nutritivas e podem, dessa forma, ser valiosas, mas estão presentes em uma solução aquosa diluída de sais, lactose, proteínas, e alguns lipídios.

Por causa da sua natureza diluída, em alguns locais o soro 5 ainda é frequentemente tratado como um produto de descarte ou rejeito, apesar do custo de descartá-lo. Onde é economicamente praticável, o soro é frequentemente desidratado por aspersão (spray-dried), ou ainda processado para separar as proteínas e/ou a lactose da água, e um do outro.

0 soro, ou diversos dos seus componentes, podem ser

adicionados a uma grande variedade de alimentos processados para prover excelentes propriedades nutricionais e funcionais para o processador e o consumidor.

Proteínas do soro podem compreender cerca de 20% da proteína total do leite. A composição do soro produzido após a coalhagem (curding) na produção de queijo inclui proteínas, junto com a lactose, gordura e cinzas (2-5%). Lactoalbumina e lactoglobulina são duas proteínas do leite predominantes no soro. Foi verificado que cada uma dessas proteínas, bem como outras proteínas encontradas no leite, possui potencial imunogênico, por exemplo, como alérgenos. Pelo fato dessas proteínas serem potenciais imunógenos, ou mesmo alérgenos, certos consumidores podem evitar o uso de produtos alimentícios e/ou cosméticos contendo leite, soro, ou componentes dos mesmos, por exemplo, as proteínas do soro lactoalbumina e lactoglobulina. Em algumas circunstâncias, profissionais sanitários podem orientar certos consumidores a evitar produtos contendo proteínas do soro e leite. Dessa forma, há uma necessidade permanente da redução do potencial imunogênico de proteínas do leite e proteínas do soro.

RESUMO

Em muitos dos seus vários aspectos, composições e métodos são providos para o uso de composições contendo proteínas do soro e/ou proteínas do leite hidrolisadas que são hidrolisadas com uma ou mais enzimas proteolí t icas de modo a reduzir o risco de resposta imunológica, particularmente resposta imunológica adversa, às proteínas, em uma pessoa predisposta a tal resposta.

Em um aspecto, são fornecidos hidrolisatos compreendendo pelo menos uma proteína do leite hidrolisada com pelo menos uma enzima proteolítica que cliva preferencialmente um resíduo de ácido glutâmico ou ácido aspártico. Os hidrolisatos apresentam imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a possuir uma reação imune à proteína. Em determinadas modalidades, a enzima proteolítica é uma endopeptidase. Em uma modalidade, a endopeptidase cliva a porção carboxi-terminal de um resíduo de ácido glutâmico ou um resíduo de ácido aspártico. Em uma modalidade, a endopeptidase é de um StrepLomyees, Staphylococcus ou um Bacillus.

Em uma outra modalidade deste aspecto, a proteína da qual o hidrolisato é produzido é uma proteína do soro, ou compreende pelo menos uma entre uma lactoalbumina ou uma lactoglobulina, tal como uma alfa lactoalbumina ou uma beta lactoglobulina.

0 hidrolisato é preferivelmente enriquecido em peptídios terminantes em resíduos de ácido glutâmico ou ácido aspártico, em comparação com a proteína não-hidrolisada. Em uma modalidade, a endopeptidase é enriquecida em um ou mais dos peptídios AQS APLRVY VE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4). Em outras modalidades, é enriquecida em um ou mais dos peptídios ELEE (SEQ ID NO: 5), VATEE (SEQ ID NO: 6), PFTE (SEQ ID NO: 7), NSAEPE (SEQ ID NO: 8), VFGKE (SEQ ID NO: 9), ASQS APLRVY VE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), IQPTPE (SEQ ID NO: 10), LKPTPE (SEQ ID NO: 11), LKPTPEGD (SEQ ID NO: 12), LKPTPEGDLE (SEQ ID NO: 13), TKIPAVFKID (SEQ ID NO: 14), ou TKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 15), e/ou uma ou mais de DQAME (SEQ ID NO: 16), GIHAQQKE (SEQ ID NO: 17), VLNE (SEQ ID NO: 18), VFGKE (SEQ ID NO: 19), RLHSMKE (SEQ ID NO: 20), DIKQME (SEQ ID NO: 21), KHPIKHQGLPQE (SEQ ID NO: 22), RPKH PIKHQGL PQE (SEQ ID NO: 23), PMIGVNQE (SEQ ID NO: 24), GIHAQQKEPMEGVNQE (SEQ ID NO: 25), RYLGYLE (SEQ ID NO: 26), LAYFYPE (SEQ ID NO: 27), FVAPFPE (SEQ ID NO: 28), KTTMPLW (SEQ ID NO: 29), LFRQ FYQLD (SEQ ID NO: 30), F FVAPFPE (SEQ ID NO: 31), NLLRFFVAPFPE (SEQ ID NO: 32), ou ENLLRFFVAPFPE (SEQ ID NO: 33) . São também fornecidos aqui os hidrolisatos contendo proteína do soro enriquecidos em um ou mais dos peptídios: ELEE (SEQ ID NO: 5), VATEE (SEQ ID NO: 6), PFTE (SEQ ID NO: 7), NSAEPE (SEQ ID NO: 8), VFGKE (SEQ ID NO: 9), ASQSAPLRVYVE 5 (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), IQPTPE (SEQ ID NO: 10), LKPTPE (SEQ ID NO: 11), LKPTPEGD (SEQ ID NO: 12), LKPTPEGDLE (SEQ ID NO: 13), TKIPAVFKID (SEQ ID NO: 14), ou TKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 15). Os hidrolisatos de proteína do 10 soro possuem imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do soro.

Em uma modalidade, o hidrolisato contendo proteína do soro é preferencialmente enriquecido em um ou mais dos peptídios 15 ASQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4). O hidrolisato deste aspecto é produzido através do uso de uma endopeptidase que preferencialmente cliva a porção carboxiterminal de um resíduo de ácido glutâmico ou um resíduo de 20 ácido aspártico. A endopeptidase em uma modalidade não requer um íon metálico para sua atividade.

São também fornecidos aqui ingredientes alimentícios compreendendo um hidrolisato de proteína do soro enriquecido em um ou mais dos peptídios ASQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4). Os ingredientes alimentícios fornecidos possuem imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do soro.

São também fornecidos aqui produtos alimentícios 5 manufaturados compreendendo um hidrolisato de proteína do soro enriquecido em um ou mais dos peptídios ASQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4). Os produtos alimentícios manufaturados possuem imunogenicidade reduzida em um indivíduo 10 predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do soro.

Exemplos de tais produtos alimentícios manufaturados fornecidos de acordo com o descrito aqui incluem comida industrializada para bebês, bebidas isotônicas, produtos contendo queijo, suplementos de proteínas, suplementos nutricionais ou produtos que substituem refeições.

Produtos não-alimentícios que compreendem quaisquer dos hidrolisatos aqui descritos também são fornecidos. Em diversas modalidades, o produto não-alimentício é um cosmético, uma 20 loção, ou um produto de limpeza para uso em pele humana. Em uma modalidade, o produto não-alimentício compreende um hidrolisato de proteína do soro enriquecido em um ou mais dos peptídios ASQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), 25 e possui imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do soro. São também fornecidas composições compreendendo pelo menos dois hidrolisatos conforme descrito aqui, em que cada hidrolisato é produzido com pelo menos uma enzima diferente possuindo uma especificidade diferente, ou cada hidrolisato é 5 produzido com a mesma enzima de uma proteína diferente ou mistura protéica.

0 resumo precedente, bem como a descrição detalhada e exemplos seguintes tem por objetivo ilustrar diversas modalidades.

BREVE DESCIÇAO DOS DESENHOS

As figuras anexas servem para ilustrar ou explicar adicionalmente vários aspectos das composições ou métodos descritos de maneira mais completa aqui e exemplificados abaixo.

Figura 1: análise SDS-PAGE mostrando o curso do tempo da

proteólise de proteínas do soro durante 20 horas de tratamento com S-Glu ou L-Glu. Linhas (da esquerda para a direita) 1, 2, 3: Tratamento com S-Glu por 2, 4 e 20 horas, respectivamente; Linha 4: Controle de soro; Linhas 5, 6, 7: Tratamento com L

Endo por 20, 4 e 2 horas, respectivamente; Linha 8: Controle de soro; Linhas 9, 10: Marcadores de peso molecular (proteínas padrão) .

Figura 2: Análise por espectrômetro de massa representativa de proteína do soro digerida por endopeptidase.

A amostra foi coletada a 20 horas da digestão da amostra com L-Glu. 0 painel A mostra a detecção de várias espécies de peso molecular na amostra. 0 painel B mostra a abundância relativa dos produtos de degradação predominantes.

Figura 3: Análise por espectrômetro de massa representativa de proteína do soro digerida por endopeptidase.

A amostra foi coletada a 20 horas da digestão da amostra com S-Glu. O painel A mostra a detecção de várias espécies de peso molecular na amostra. O painel B mostra a abundância relativa dos produtos de degradação predominantes.

Figura 4: Análise SDS-PAGE de leite desnatado-I, hidrólise 10 por Endo Glu-peptidase: Linhas (da esquerda para a direita): 1, 2, 3: Digestão com S-Endo em t = 2, 4 e 20 horas, respectivamente; Linha 5: Controle de leite desnatado I; Linhas 7, 8, 9: Digestão com L-Endo em t = 2, 4 e 20 horas; Linha 10: marcador de peso molecular.

Figura 5: Análise SDS-PAGE de leite desnatado-II,

hidrólise por Endo Glu-peptidase: Linhas (da esquerda para a direita) : 1, 2, 3: Digestão com S-Endo em t = 2, 4 e 20 horas, respetivamente; Linha 5: Controle de leite desnatado II; Linhas 7, 8, 9: Digestão com L-Endo em t = 2, 4 e 20 horas; Linha 10: marcador de peso molecular.

Figura 6: Análise SDS-PAGE de hidrólise de caserna por Endo Glu: Linhas (da esquerda para a direita) : 1, marcador de peso molecular; Linhas 2, 3, 4: Digestão com S-Endo a 2, 4 e 20 horas respectivamente; Linha 5: marcador; Linhas 6, 7, 8: 25 Digestão com L-Endo a 2, 4 e 20 horas respectivamente; Linha 10: caserna C-5890 Sigma. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

Acrônimos e Abreviações:

cP: centiPoise: unidades de viscosidade dinâmica;

DFP: Diisopropilfluorofosfato;

EDTA: Ácido tetracético etilenodiamina.

Endo-Glu: Endopeptidase que cliva um sítio próximo a um resíduo GLU em um polipeptídeo, clivando preferivelmente a porção carboxi-terminal do resíduo GLU; também algumas vezes referido aqui como EndoGluC, onde a clivagem é definitivamente para a porção carboxi-terminal de um resíduo GLU.

GMP(s): Boas práticas de fabricação (do inglês good manufacturing practíce(s);

HPLC: Cromatografia líquida de alto desempenho;

hr(s): hora(s);

IU: Unidades internacionais;

LC/MS: cromatografia líquida acoplada à espectrometria de ma s s a;

LC-MS/MS: cromatografia líguida acoplada a espectrometria de massa em tandem;

L-Endo: Uma endopeptidase Glu-C de Bacillus líchenformis;

também algumas vezes referida aqui como "L-Glu" ou "L-MPR".

MS: Espectrometria de massa, algumas vezes usada genericamente para compreender as análises acopladas LC/MS e LC-MS/MS;

MW: Peso molecular;

PMSF: fenilmetilsulfonilfluoreto; S-Endo: Uma endopeptidase Glu-C de Bacillus subtilis; também algumas vezes referida aqui como "S-Glu" ou "S-MPR''.

SDS PAGE: Gel de eletroforese de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio;

Succ-AAPEpNA: Succinil-Ala-Ala-Pro-Glu-p-nitroanilida;

t: tempo;

TFA: Ácido trifluoroacético

TP: proteína total - por exemplo: proteína total solúvel em solução sobrenadante;

w/w: peso por peso (ou peso para peso), geralmente

descreve uma base de determinação de uma porcentagem; usada, por exemplo, para expressar concentrações de compostos adicionados;

w/v: peso por volume (ou peso para volume), uma base alternativo para determinar uma porcentagem; usada, por exemplo, para expressar concentrações de compostos adicionados.

Definições

Como usado aqui, o termo "hidrolisato de proteína" se 20 refere ao produto resultante do tratamento da proteína com uma enzima proteolítica. A extensão da clivagem proteolítica da proteína pode variar de mínima (por exemplo, clivagem da ligação de um único peptídeo com uma única proteína) a extensa (por exemplo, clivagem de todas as ligações peptídicas 25 presentes na amostra que apresentem os requerimentos de especificidade da enzima proteolítica sendo usada) dependendo, por exemplo, das condições do tratamento, tais como extensão do tratamento, temperatura, concentração da proteína, e pureza, concentração, e atividade da enzima proteolítica.

Conforme usado aqui, "proteína do leite" compreende qualquer proteína de ocorrência natural na secreção normal da glândula mamária de um mamífero fêmea após o parto, ou produtos derivados destes, tais como frações dos mesmos, ou componentes feitos destes e dos mesmos. 0 leite pode ser de qualquer espécie de mamífero incluindo, mas não limitado a vaca, cabra, ovelha, búfala, iaque, camelo, lhama, alpaca, e humana. São preferidas proteínas do leite destes mamíferos cujo leite é usado comercialmente ou amplamente em várias culturas e países. Deve-se notar que "proteína do leite" conforme usado aqui compreende tanto o singular quanto o plural da palavra "proteína", dessa forma, o termo "proteína do leite" pode se referir a uma única proteína, ou qualquer mistura de uma ou mais proteínas, exceto quando indicado de outra forma.

"Proteína do soro" compreende qualquer proteína encontrada 20 em qualquer quantidade no "soro", o subproduto líquido da produção de queijo que é separado da coalhada. O soro resultante da produção de muitos queijos é particularmente pobre em proteínas micelares do leite, tais como caserna, mas relativamente enriquecido em proteínas solúveis tais como 25 alfa-lactoalbumina e beta-lactoglobulina. Assim como "proteína do leite" descrito acima, o termo "proteína do soro" usado aqui compreende tanto o singular quanto o plural da palavra "proteína", dessa forma, o termo "proteína do leite" pode se referir também a uma única proteína, ou qualquer mistura de uma ou mais proteínas, exceto quando indicado de outra forma.

Será compreendido pelo versado na técnica que proteínas do soro são de fato, uma subclasse das proteínas do leite, e assim o termo "proteína do leite" pode incluir uma ou mais proteínas do soro, exceto quando aqui indicado de outra forma. Compostos do soro podem incluir, por exemplo, soro de leite, 10 creme, e queijo. 0 soro derivado de qualquer tipo de queijo pode ser usado. A proteína do soro pode ser derivada de quaisquer métodos tais como filtração, diálise, evaporação, e osmose reversa de soro de queijo, ou por qualquer outro processo que resulte nas proteínas tipicamente descritas como 15 "proteínas do soro".

Como usado aqui, um indivíduo sensível é um indivíduo predisposto a apresentar uma resposta ou reação imune à proteína em uma forma não hidrolisada. Tal resposta ou reação imune, como um resultado direto ou indireto do consumo de, ou 20 exposição a, por exemplo, uma ou mais proteínas do leite e/ou proteínas do soro, é uma medida da imunogenicidade daquelas proteínas. Tais proteínas demonstrarão pequena à nenhuma imunogenicidade em um indivíduo que não é predisposto a apresentar tal resposta imune à proteína, tal indivíduo é 25 algumas vezes referido aqui como "insensível" ou "não sensível" a uma ou mais proteínas do leite e do soro. Preferivelmente, tal indivíduo não apresentará uma reação imune (resposta imunológica) significante nem à exposição, nem ao consumo da proteína.

Como usado aqui, "imunogenicidade reduzida" se refere a gualquer redução, diminuição, ou melhora de uma resposta imunológica mensurável. Δ medida de tal resposta pode ser avaliada in vitro ou in vivo. Por exemplo, a resposta pode ser medida diretamente ou indiretamente em uma amostra biológica compreendendo tecido, células, ou fluido, ou semelhantes, ou qualquer combinação dos mesmos de um indivíduo, ou pode ser avaliada no indivíduo, tanto direta quanto indiretamente. Enquanto que em várias modalidades fornecidas aqui, qualquer diminuição (ou redução) matemática em tal resposta, se medida in vitro ou in vivo, irá bastar, é preferível que a diminuição seja uma mais substancial. De maneira óbvia, o versado na técnica reconhecerá que dados biológicos tais como uma medida de uma resposta imunológica, são sujeitos a variações potencialmente grandes em um indivíduo, e de indivíduo para indivíduo. Por exemplo, onde a resposta for em um indivíduo "sensível", a resposta imune é preferivelmente reduzida substancialmente (por exemplo, em pelo menos cerca de 50 %, 60 % ou 70%, ou até cerca de 80 % ou mais). Mais preferivelmente, somente diferenças pequenas ou mínimas são vistas em tal indivíduo sensível com os hidrolisatos de proteína descritos aqui, quando comparado com uma medida da resposta imunológica de um indivíduo que não é sensível a uma ou mais proteínas não tratadas do leite ou do soro. Isso é particularmente preferível onde a resposta imunológica é considerada adversa, por exemplo, uma resposta alérgica. Em tais casos, a diminuição na resposta imunológica do indivíduo sensível (ou medida da mesma) pode ser de pelo menos cerca de 85 % a cerca de 90 %, mais preferivelmente de cerca de 90 % a cerca de 95 %, ou até mais. Em alguns casos, uma resposta do indivíduo sensível ao hidrolisatos de proteína descritos aqui não é significativamente diferente, estatisticamente, da resposta de um indivíduo que não é sensível. Ainda em outros casos, a redução na resposta imunológica pode ser muitas vezes superior que aquela vista com a proteína não-hidrolisada em um indivíduo "sensível". Por exemplo, pode haver uma redução de da resposta de cerca de 10 vezes a cerca de 100 vezes ou até 1.000 vezes. Mais preferivelmente há reduções de cerca de 1.000 vezes a 10.000 vezes ou até 100.000 vezes ou reduções maiores em uma medida de uma resposta imunológica de um indivíduo que consome ou é exposto a compostos de hidrolisato de proteína como descrito aqui, quando comparadas àquela resposta do indivíduo às proteínas não modificadas.

Hidrolisatos de proteína

Em um primeiro de seus diversos aspectos, hidrolisatos de proteína são fornecidos compreendendo pelo menos uma proteína do leite hidrolisada com pelo menos uma enzima proteolítica que cliva preferencialmente em um resíduo de ácido glutâmico ou ácido aspártico. Em uma modalidade, o hidrolisato reduziu a imunogenicidade em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune à proteína em uma forma não hidrolisada.

Em certas modalidades, o hidrolisato contendo pelo menos uma proteína do leite é hidrolisado com uma endopeptidase. A especificidade da endopeptidase é preferivelmente limitada. Como um versado na técnica compreenderá, para uso em produtos alimentícios, a proteólise extensiva, não-específica de proteínas pode conduzir a propriedades indesejáveis, tais como sabores estranhos e/ou perda de funcionalidade. A endopeptidase para uso aqui cliva preferencialmente dessa forma em somente uma extensão limitada, por exemplo, por apresentar especificidade para um ou mais aminoácidos particulares, ou tipos particulares de aminoácidos em qualquer ou ambos as porções carboxi-terminal e amino-terminal do sítio de clivagem.

Em determinadas modalidades presentemente preferidas, a endopeptidase apresenta uma especificidade para a porção carboxi-terminal de resíduos de aminoácidos hidrofílicos, particularmente resíduos de ácido glutâmico ou ácido 20 aspártico. Em uma modalidade, a endopeptidase cliva especificamente na porção carboxi-terminal de resíduos de ácido glutâmico e/ou resíduos de ácido aspártico. Em uma outra modalidade, a endopeptidase exclusivamente ou quase exclusivamente na porção carboxi-terminal dos resíduos de 25 ácido glutâmico. Em certas modalidades, a endopeptidase é da família serina protease. É inibida, pelo menos parcialmente, se não completamente, por fenilmetilsulfonilfluoreto ou

diisopropilfluorofosfato. Em certas modalidades, a

endopeptidase é de um Streptomyces, Staphylococcus, ou um Baeillus spp. Alternativamente, a endopeptidase pode ser de qualquer fonte que seja adequada para uso em produção de alimentos e rações. Em uma modalidade, a endopeptidase e de Baeillus subtillis ou de Baeillus liehenformis. Em certas modalidades, a endopeptidase é uma proteína de 23,6 kDa de B. liehenformis, a seqüência de aminoácidos da qual é fornecida na base de dados do Laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) sob o número de acesso EMBL P80057. Alternativamente, a endopeptidase é uma proteína de 23,9 kDa de B. subtilis, a seqüência de aminoácidos da qual é fornecida na base de dados do EMBL sob o número de acesso EMBL P397 90. Ainda em uma outra modalidade, a enzima é qualquer endopeptidase que satisfaça o critério mencionado acima, com a condição que não seja uma endopeptidase revelada na Patente americana N0 US5,866,357.

A fonte de leite para a proteína não é limitada a qualquer espécie de mamífero, e assim é contemplado que leite de espécies incluindo, mas não limitado a vaca, cabra, ovelha, búfalo, cavalo, camelo, iaque, lhama, alpaca, e humanos pode ser usado aqui. Em uma modalidade, as proteínas do leite se originam de uma espécie que é diferente da do indivíduo que é exposto a ou que consome a proteína do leite. Em outra modalidade, um indivíduo é sensível à proteínas de leite de sua própria espécie. Assim, as proteínas do leite podem ser da mesma espécie que o indivíduo. Em tais modalidades, as proteínas modificadas reduzem a imunogenicidade da proteína do leite naquele indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo (algumas vezes referido aqui como uma "pessoa") é humano, e o leite é de uma espécie animal não-humana cujo leite é frequentemente consumido por humanos, por exemplo, vaca, cabra, ovelha, ou búfalo.

Em certas modalidades, pelo menos uma proteína do leite é uma proteína solúvel, não micelar. Dessa forma, a proteína do leite preferivelmente não é uma caseína em tais modalidades. Em uma modalidade, a proteína do leite é uma proteína solúvel, por exemplo, uma ou mais das proteínas tipicamente encontradas no soro resultantes da produção de qualquer queijo produzido da coalhada.

Em uma modalidade particular, a proteína inclui pelo menos uma lactoalbumina ou uma lactoglobulina. Como versado na técnica apreciará, há uma variedade de tais proteínas que vêm sendo identificadas no leite de vários mamíferos. Entre as proteínas do soro predominantes estão a alfa-lactoalbumina e a beta-lactoglobulina, ambas as quais são adequadas para uso neste. Deve-se compreender que uma proteína do soro não será tipicamente isolada de outras proteínas do soro previamente ao uso neste. 0 uso de tais proteínas do leite isoladas ou mesmo purificadas é, contudo também contemplado na presente invenção.

Por causa da imunogenicidade potencial de tais proteínas do leite, conforme discutido acima, é desejável que a endopeptidase clive peptídeos que podem servir como determinantes imunológicos (por exemplo, determinantes antigênicos) que podem estimular, provocar, induzir, ou exacerbar uma resposta imune em um indivíduo. Tais respostas imunes incluem, mas não estão limitadas àquelas primariamente sob controle dos linfócitos T e àquelas mais frequentemente associadas aos linfócitos B do sistema imune. Elas também incluem tais respostas, em que os antibióticos produzidos são de qualquer tipo. O versado na técnica apreciará que entre diversas respostas mensuráveis, anticorpos Ig-E são frequentemente produzidos em resposta a tais proteínas em um indivíduo responsivo.

Para os objetivos da presente invenção uma "redução" da imunogenicidade significa pelo menos uma diminuição matemática na medida da resposta imune, tanto in vivo ou in vitro. Uma diminuição estatisticamente significante é preferida, onde tais análises são possíveis e apropriadas. O versado na técnica em análise estatística apreciará que a determinação de uma diferença estatística pode ser realizada usando, por exemplo, o teste t de Student, ou qualquer outra análise apropriada à natureza e projeção da metodologia aplicada aos dados. Dessa forma, para ajudar a minimizar a imunogenicidade potencial das proteínas do leite, tais como as proteínas do soro, alfa-lactoalbumina e beta-lactoglobulina, a

endopeptidase cliva preferivelmente um ou mais determinantes 5 imunológicos presentes na proteína, por exemplo, a região entre os aminoácidos 55-98 da beta-lactoglobulina. Tal clivagem resulta no hidrolisato se tornando enriquecido em relação à proteína não hidrolisada em um ou mais de determinados peptídeos. Em uma modalidade, o hidrolisato é 10 enriquecido em ou mais dos peptídeos: AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), e KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4).

Em certas modalidades, o hidrolisato é geralmente enriquecido em peptídeos que terminam em um resíduo de ácido 15 glutâmico ou ácido aspártico, quando comparado à proteína nâohidrolisada. Quando a proteína do leite inclui uma proteína do soro, em uma modalidade o hidrolisato é enriquecido em um ou mais dos peptídeos: ELEE (SEQ ID NO: 5), VATEE (SEQ ID NO: 6), PFTE (SEQ ID NO: 7), NSAEPE (SEQ ID NO: 8), VFGKE (SEQ ID NO: 20 9), ASQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), IQPTPE (SEQ ID NO: 10), LKPTPE (SEQ ID NO: 11), LKPTPEGD (SEQ ID NO: 12), LKPTPEGDLE (SEQ ID NO: 13), TKIPAVFKID (SEQ ID NO: 14), e TKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 15).

Alternativamente, em uma modalidade em que a proteína do

leite inclua uma caseína, o hidrolisato pode ser enriquecido em um ou mais dos peptídeos: DQAME (SEQ ID NO: 16), GIHAQQKE (SEQ ID NO: 17), VLNE (SEQ ID NO: 18), VFGKE (SEQ ID NO: 19), RLHSMKE (SEQ ID NO: 20), DIKQME (SEQ ID NO: 21), KHPIKHQGLPQE (SEQ ID NO: 22), RPKHPIKHQGLPQE (SEQ ID NO: 23), PMIGVNQE (SEQ ID NO: 24), GIHAQQKE PMEGVNQE (SEQ ID NO: 25), RYLGYLE (SEQ ID NO: 26), LAYFYPE (SEQ ID NO: 27), FVAPFPE (SEQ ID NO: 28), KTTMPLW (SEQ ID NO: 29), LFRQFYQLD (SEQ ID NO: 30), F FVAPFPE (SEQ ID NO: 31), NLLRFFVAPFPE (SEQ ID NO: 32), e ENLLRFFVAPFPE (SEQ ID NO: 33).

O versado na técnica observará que na presente invenção não há nada que impeça o uso tanto da caserna e proteínas do soro como uma fonte para o hidrolisato, nos casos que o hidrolisato pode ser enriquecido por quaisquer ou todos os peptídeos precedentes (SEQ ID NO: 1-32), ou quaisquer combinações dos mesmos.

Hidrolisatos contendo proteínas do soro

São também providos aqui hidrolisatos contendo proteínas do soro. Os hidrolisatos de proteínas do soro são enriquecidos em um ou mais dos peptídeos: ELEE (SEQ ID NO: 5), VATEE (SEQ ID NO: 6), PFTE (SEQ ID NO: 7), NSAEPE (SEQ ID NO: 8), VFGKE (SEQ ID NO: 9), ASQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKT PAVFKID (SEQ ID NO: 3), KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), IQPTPE (SEQ ID NO: 10), LKPTPE (SEQ ID NO: 11), LKPTPEGD (SEQ ID NO: 12), LKPTPEGDLE (SEQ ID NO: 13), TKIPAVFKID (SEQ ID NO: 14), e TKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 15), e possuem imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais das proteínas do soro. Conforme discutido acima, a reação imune pode compreender quaisquer reações de um indivíduo a uma proteína estranha. A medida de tal reação pode compreender quaisquer das técnicas, in vitro, in vivo, clínicas ou outras, conhecidas dc versado na técnica. Como mencionado acima, uma "redução" significa pelo menos uma diminuição matemática. Uma diminuição estatisticamenLe significante é preferida, onde tal análise é possível e apropriada. Em uma modalidade, o indivíduo é um humano com alergias às proteínas do soro de leite de vaca. 0 hidrolisato fornece pelo menos uma diminuição de 50 % na medida da imunogenicidade quando comparada à proteína do soro não-hidrolisada. Em outras modalidades, há cerca de 70 %, 80 %, ou 90 % ou mais de redução na medida da imunogenicidade. Ainda em outras modalidades, há redução da imunogenicidade de cerca de 10 vezes a 100 vezes, uma redução de 100 vezes a 1.000 vezes, uma redução de 1.000 a 10.000 vezes, ou mais ainda. Em uma modalidade, a composição de proteína hidrolisada resulta em imunogenicidade reduzida no indivíduo sensível de modo que quase não haja diferenças detectáveis entre a resposta imunológica à proteína hidrolisada em um indivíduo sensível e a resposta em um que não seja sensível. Preferivelmente, não há diferenças estatísticas nas respostas imunológicas em um indivíduo sensível e um não-sensível durante a exposição a, ou consumo de hidrolisato contendo proteína do soro. Em certas modalidades, o hidrolisato contendo proteína do soro é enriquecido, em relação a uma amostra de proteína do soro comparável, porém não-tratada, em um ou mais dos peptídeos: AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), e KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4).

0 hidrolisato contendo proteína do soro pode ser produzido através do uso de uma ou mais endopeptidases que clivam preferencialmente na porção carboxi-terminal dos resíduos de ácido glutâmico e/ou ácido aspártico. Em uma modalidade particular, o hidrolisato contendo proteína do soro é produzido através do uso de uma endopeptidase que não use ou exija um íon metálico para sua atividade, e dessa forma não é uma metaloproteinase estrita. 0 versado na técnica apreciará que o uso de quelantes de metais, tal como EDTA, podem auxiliar na determinação da ausência da necessidade de um metal para qualquer enzima, por exemplo, uma protease ou uma peptidase.

Uso de hidrolisatos de proteína:

Em outro aspecto, são providos aditivos alimentícios, suplementos, e ingredientes compreendendo um hidrolisato contendo proteína do soro ou um hidrolisato de proteína do leite, conforme descrito acima.

Hidrolisatos, preferivelmente hidrolisatos do soro, enriquecidos em um ou mais dos peptídeos: AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), e KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4) em relação à proteina nãohidrolisada são preferidos para tais usos.

Os aditivos possuem imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do leite ou do soro.

São também providos aqui, produtos alimentícios manufaturados compreendendo hidrolisato de proteína do leite ou do soro conforme descrito neste. Preferivelmente os hidrolisatos são enriquecidos em um ou mais dos peptídeos: AQS APLRVY VE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), e KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), e possuem imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação .imune a uma ou mais proteínas do leite ou do soro.

Em certas modalidades, o produto alimentício manufaturado é uma comida industrializada para bebês, bebida isotônica, produto contendo queijo, suplemento de proteína, suplemento nutricional ou produto que substitui refeições. Em modalidades preferidas, o hidrolisato é um hidrolisato de proteína do soro e o indivíduo apresenta uma reação alérgica a lactoglobulina e/ou lactoalbumina não-hidrolisada.

Será evidente para o versado na técnica que os compostos providos na presente invenção podem também ser usados em conexão com produção de queijo. O uso dos compostos é particularmente adequado para a produção de vários queijos sólidos e em pasta. Os compostos fornecidos aqui podem ser usados para reduzir a imunogenicidade de tais produtos. 0 queijo pode ser feito inteiramente com leite que é hidrolisado, como provido aqui, ou previamente a coalhagem, composições de um hidrolisato de proteína do leite ou soro podem ser adicionadas ao leite sendo usado para a produção de queijo. Tais usos irão fornecer produtos de queijo com qualidades superiores em termos de conteúdo nutricional e propriedades funcionais.

De maneira similar, as composições de hidrolisatos de leite e soro fornecidas na presente invenção são úteis para a fabricação de outros produtos laticínios incluindo, mas não limitados a produção de iogurte, queijo cottage, ou creme de leite. 0 versado na técnica também apreciará que os hidrolisatos são adaptáveis para desidratação por aspersão, concentração, ou outras etapas adicionais de processamento. Hidrolisatos desidratados por aspersão são particularmente adequados para uso em aplicações em que o sólido de soro pode frequentemente ser usado. Também podem ser usados como uma substituição de sólidos lácteos onde é desejável a obtenção de imunogenicidade reduzida.

Em certas modalidades, as composições de hidrolisatos de leite e soro fornecidas aqui são usadas em outros produtos alimentícios que frequentemente contêm um ou mais produtos ou subprodutos lácteos que não são declarados no rótulo, ou que podem não ter um rótulo, tais como, fornecidos ao consumidor. Em alguns casos, mesmo que os ingredientes sejam listados em um rótulo, os consumidores que não são perfeitamente instruídos em nutrição não compreendem que certos ingredientes listados são de fato ingredientes que contém proteínas do leite ou soro. Tais produtos oferecem um risco real a indivíduos sensíveis, por exemplo, aqueles que podem sofrer reações alérgicas graves, e podem de fato ameaçar a vida destes indivíduos. As composições providas pela presente invenção são prontamente adaptadas para tais usos e podem ser usadas, por exemplo, em bebidas, tais como café, chá ou modificações e derivados dos mesmos, bebidas isotônicas, e similares, bem como pudins, recheios e aperitivos. Muitos outros produtos possuem quantidades pequenas de ingredientes de leite e soro adicionados para prover funcionalidades benéficas conhecidas para processamento ou aceitação do consumidor. Os hidrolisatos descritos aqui podem ser prontamente substituídos pelos ingredientes dos quais eles são derivados. Eles preferivelmente retêm as propriedades funcionais, tais como textura, aroma, gosto, dispersabilidade, solubilidade e similares, dos ingredientes dos quais eles foram derivados. Eles também fornecem sabor melhorado (por exemplo, amargor reduzido) e propriedades preferidas de formação de espuma em relação às alternativas tais como proteínas do soro gue são hidrolisadas de forma mais completa com menos enzimas específicas. Em algumas modalidades, as proteínas hidrolisadas apresentam gelificação, retenção de água e capacidade de ligação com a água melhoradas comparadas às proteínas não-hidrolisadas.

Em outra modalidade as proteínas hidrolisadas do leite e do soro descritas aqui são usadas na fabricação de um produto de aplicação tópica, tal como uma loção, creme, pomada, linimento, solução para limpar a pele ou semelhantes. Consequentemente, tais produtos compreendem as composições de proteínas hidrolisadas descritas nesta são aqui contempladas. Tais produtos são úteis, por exemplo, para finalidades terapêuticas, por exemplo, para prover alívio para pele seca, coceira, desconforto e semelhantes. Estes produtos compreendem preferivelmente, em adição ao componente de proteína hidrolisada um lipídio, cera, óleo, emulsão de água em óleo, emulsão de óleo em água, ou semelhantes como uma base. Tipicamente, eles podem ainda compreender um ou mais compostos de fragrância, bem como outros ingredientes surfactantes ou emulsificantes. São também providos aqui produtos cosméticos e outros acessórios para aparência ou acessórios de beleza compreendendo os hidrolisatos de proteínas do leite e do soro descritos. Em uma modalidade, o produto cosmético é aplicado à face, bochechas, lábios, ou olhos de uma pessoa. Em outra modalidade o produto é usado em qualquer lugar do corpo para ajudar a melhorar a aparência cosmética da pele ou, por exemplo, para diminuir a aparência de sinais de rugas, sardas, cicatrizes, manchas e semelhantes.

Métodos de produção: Os compostos de leite e soro hidrolisados descritos acima podem ser produzidos pela adição de uma ou mais enzimas proteoliticas a um liquido ou semi-sólido contendo proteína do leite ou proteína do soro.

O tratamento enzimático pode ser conduzido pela introdução ou dispersão da protease, ou uma combinação de proteases apropriadas, tais como uma ou mais endoproteases ou endopeptidases em uma composição de leite ou soro, ou em uma composição contendo proteínas do leite e/ou soro como descrito aqui para colocar a enzima em contato com o substrato da proteína. A introdução da enzima na composição da proteína é acompanhada permitindo que ocorra a reação enzimática pela retenção da mistura sob condições então adequadas, por exemplo, para um tempo de retenção apropriado, a uma temperatura apropriada e pH, e na presença de quaisquer cofatores requeridos. O tratamento das composições de proteína do leite ou soro com a(s) enzima (s) descrita (s) acima, pode ser realizado sob condições escolhidas para se adequarem às enzimas selecionadas de acordo com os princípios bem conhecidos na técnica. O versado na técnica compreenderá que quando o produto final desejado for para consumo humano, as condições podem requerer que aquelas práticas de boa fabricação e higiene apropriadas (GMPs) sejam seguidas durante a retenção e tratamento do material contendo proteínas a ser usado. De maneira similar, os produtos cujo objetivo é para uso que não seja consumo, tais como loções ou produtos cosméticos topicamente aplicados podem possuir exigências regulatórias associadas à sua fabricação.

Apesar do gue foi dito acima, o tratamento enzimático pode ser conduzido em qualquer pH adequado, tal como pH de cerca de 2 a 10, pH de 4 a 9 ou pH de 5 a 7. Pode ser preferido usar um pH de cerca de 7 a 8 para algumas das enzimas discutidas aqui. 0 versado na técnica compreenderá que cada enzima terá um desempenho particular em relação a uma faixa de pH, e que pode nem sempre ser necessário ou mesmo desejável usar uma enzima em um pH onde sua atividade seja a mais alta. De maneira similar, o versado na técnica pode prontamente selecionar uma temperatura adequada, ou temperatura para a etapa de tratamento enzimático. Os fatores que afetam a seleção da temperatura incluem, mas não estão limitados à termoestabilidade da enzima ou enzimas a serem usadas, termoestabilidade das proteínas a serem hidrolisadas e as composições compreendendo as referidas proteínas, bem como mudanças na atividade relativa da enzima com a temperatura.

Opcionalmente, após um tempo adequado para o tratamento enzimático, por exemplo, após certa quantidade de proteólises ter ocorrido, por exemplo, uma quantidade desejada predeterminada de proteólises baseadas em considerações tais como propriedades funcionais e imunogênicas, a enzima pode ser ter sua atividade reduzida ou removida. A enzima pode ser parcialmente ou completamente inativada através de processos conhecidos na técnica para remoção e inativação de enzimas usadas em processamento de alimentos ou rações. Em uma modalidade, a enzima é termicamente inativada quando a proteólise é suficientemente extensiva para prover as propriedades imunogênicas reduzidas descritas agui. Em outra modalidade, a extensão da proteólise é monitorada com uma mensuração rápida da mesma, por exemplo, % total de proteína solúvel, viscosidade. A enzima é inativada quando a medida rápida atinge a leitura desejada pré-determinada. Preferivelmente, a atividade da enzima é termicamente inativada, mais preferivelmente a inativação térmica é combinada com uma etapa de processamento tal como um processo requerido de aquecimento, pasteurização ou homogeneização.

Dosagens adequadas de enzimas irão geralmente estar na faixa de cerca de 0,01-1 % (p/p) . Em várias modalidades, as proteínas do leite e do soro estarão presentes a, por exemplo, cerca de 1-60 %, 5-50 %, 20-40 %, 10-45 %, ou cerca de 10-15 % de teor de proteína do soro do leite. Dessa forma, a dosagem da enzima deve incluir quantidades tais como, por exemplo, 0,1-10 %, particularmente 0,2 % (p/p), correspondendo a 2.000 UI por 100 g de proteína do leite ou soro.

Uma UI (unidade internacional) é definida como a quantidade de enzima que produz um micromol de produto de hidrólise de proteína por minuto sob condições padrão. "Condições padrão" para a finalidade de determinação da UI são o uso de 10-15 % de sólidos de proteína do soro em água, ou leite desnatado, pH 7, temperatura de 40 °C. Em uma modalidade, a dosagem da enzima é baseada no teor p/p da proteína da composição sendo tratada, como ilustrado nos exemplos.

Alternativamente, a dosagem da enzima pode ser determinada de outras maneiras, tais como pelo uso de outros ensaios descritos aqui. Todos os tais ensaios podem prover indicadores da extensão (ou grau) da hidrólise da proteína e incluem determinações de % de hidrólise, medidas de viscosidade, eletroforese em gel e espectrometria de massa. Em outras palavras, uma quantidade de enzima requerida para produzir o resultado desejado ou pré-determinado em uma dada quantidade de tempo de incubação também pode ser calculada empiricamente, ou baseada em outros dados. Em uma modalidade, uma quantidade de enzima pode ser selecionada para prover uma queda específica na viscosidade; em outra uma quantidade de enzima para produzir certos fragmentos de digestão como determinado por eletroforese em gel ou análise de espectrometria de massa (MS) .

Em uma modalidade, a dosagem da enzima pode ser retrocalculada pelo grau de hidrólise de uma amostra de proteína. 0 "grau de hidrólise" é uma medida do número de ligações peptídicas clivadas por uma enzima proteolítica. Nesse caso, o grau máximo de hidrólise resultaria da clivagem de substancialmente todos os resíduos de glutamato e possivelmente aspartato nas moléculas de proteínas do soro. 0 grau de hidrólise pode ser determinado por métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, usando um ensaio de TNBS (ácido trinitrobenzeno sulfônico) como descrito em AdlerNissen, J. Agric. Food Chem. 21: 1256 (1979) .

Outros métodos de determinação da dose da enzima ou ensaios de atividade de enzima, tais como através de substratos detectáveis, tais como substratos colorimétricos ou artificiais. Tem sido usado Suc-AAPEpNA (succinil-Ala-Ala-ProGlu-p-nitroanilida). A conversão para concentração de protease EndoGluC ativa pode ser feita pela obtenção de uma medida precisa da razão de atividade especifica e conversão das Unidades de atividade por volume de unidade para a quantidade de enzima usando uma curva padrão ou fator de conversão prédeterminado. Por exemplo, para certos experimentos usados aqui, o fator de conversão para L-MPR foi de 0, 348 U/mg de enzima, e para S-MPR foi 0,549 U/mg. 0 versado na técnica compreenderá como determinar a dosagem ou atividade requerida de acordo com o descrito acima.

0 tratamento enzimático pode ser conduzido em operações em batelada, por exemplo, em um tanque com agitação. 0 tratamento pode também ser contínuo, tal como em uma série de reatores tipo tanque agitados. 0 tratamento pode compreender também o uso de enzimas imobilizadas e várias enzimas modificadas desde que uma especificidade apropriada da hidrólise seja retida pela atividade da enzima imobilizada ou modificada.

Exemplos

Exemplo 1 Digestão de proteínas do leite com endopeptidase de especificidade limitada:

Enzimas: Bacillus licheniformis "Endo-Glu" paptidase ("LGlu") : A enzima ("L-MPR" ou "Endo-GluC") de B. Iicheniformis foi expressa em B. subtilis e purificada de fermentações de 2-

14 L, agrupadas e concentradas. A concentração de enzima purificada (>90 % de pureza) foi de 25,1 mg/mL. Esta proteína de 23,6 kDA possui similaridade de seqüência com a protease V8 de Strptomyces griséus e outras proteases Glu/Asp específicas (por exemplo, com especificidade para Glu-Xaa, ASP-Xaa no sítio de clivagem) . É uma endopeptidase de serina que é parcialmente inibida por EDTA, contudo não é uma metaloprotease. Ela exibe um pH ótimo de cerca de 7,5-8. Maior força iônica reduz a atividade. A seqüência é conhecida e pode ser encontrada em bases de dados públicas. Por exemplo, é provida na UniProtKB/Swiss-Prot Primary Accession Number P 80057, disponível da base da dados do Laboratório Europeu de Biologia Molecular disponível na rede. Veja ”Purification, characterization, cloning, and expression of a glutamic acidspecific protease from Bacillus lichenif ormis ATCC 14580" J. Biol. Chem. 261: 23182-23188 (1992).

Peptidase "Endo-Glu" ("S-Glu") de Bacillus subtilis: A enzima ("S-MPR" ou Endo-GluC" de B. subtilis foi expressa em B. subtilis e purificada de fermentações de 2-14 L, agrupadas e concentradas. A concentração de enzima purificada (>85 % de pureza) foi de 3,5 mg/mL. Uma serina protease de 23,9 kDA, uma proteína possui similaridade de seqüência com aquela de EndoGlu peptidase "L-Glu" de B. licheniformis. A S-Glu protease é relativamente estável em uma larga faixa de pH. Não é tão específica quanto a enzima L-Glu de B. Iicheniformis. A seqüência é conhecida e pode ser encontrada em bases de dados públicas. Por exemplo, é provida na UniProtKB/Swiss-Prot Primary Accession Number P39790, disponível da base da dados do Laboratório Europeu de Biologia Molecular disponível na rede. Veja "Gene encoding a glu-specific extracellular endopeptidase in Bacillus subtilis." J. Bacteriol. 172: 1024- 1029 (1990)., e "Purification and characterization of a glutamic acid-specif ic endopeptidase from Bacillus subtilis ATCC 6051: application to the recovery of bioactive peptides form fusion proteins by sequence-specific digestion." Appl. Microbiol. Biotech. 48: 27-33 (1997).

Métodos

Para avaliar o curso do tempo da digestão proteolítica, 12 % de proteína de soro (13,3 gramas de soro em pó (Lacprodan DI-9224 (Arla Foods)) em 100 ml de água) foi dissolvida em água de grau reagente. Cada quinze (15) gramas desta solução foi colocado em cada um dos quatro tubos de 50 mL e incubados em uma incubadora shaker até alcançar 40 0C (por exemplo, por

minutos) . A enzima purificada como descrita acima foi adicionada em cada um dos três tubos de 50 mL. Foram usados 500 pL de S-MPR a uma concentração de 1,5 mg/mL, ou de L-MPR endoprotease a uma concentração de 4,2 mg/mL. A atividade foi medida usando Suee-AAPEpNA como substrato. As enzimas apresentaram homogeneidade maior que 98 % por SDS-PAGE. 0 quarto tudo foi um tudo controle que não recebeu adição de enzima. Os tubos foram incubados a 40 °C, 175 rpm em um agitador orbital para o tempo indicado. Os tubos foram removidos no final do seu período de incubação (2, 4, e 20 horas, respectivamente) e centrifugados a 3600 rpm (cerca de 2800 G) por dez minutos para separar o precipitado do líquido sobrenadante.

O líquido sobrenadante foi testado para medidas de proteína total (TP) solúvel remanescente no sobrenadante (g/L) , % de sólido seco e viscosidade. Os sobrenadantes foram também analisados eletroforeticamente usando SDS-PAGE, para monitorar a hidrólise. Foram realizadas análises de espectrometria de massa (MS) para confirmar a presença de produtos individuais de clivagem proteolítica.

Análise de espectrometria de massa:

Preparação da amostra: Amostras de proteína hidrolisada foram preparadas conforme descrito. Amostras de

aproximadamente cerca de 20 μΐ, de cada proteína digerida foram analisadas por cromatografia líquida de alto desempenho acoplada ao sistema de espectrometria de massa LCQ Ion Trap (LC/MS).

Análise LC-MS/MS: Todos os dados de MS e MS/MS foram obtidos usando o sistema Surveyor HPLC acoplado ao LCQ Advantage Lon Trap MS (ThermoFinnigan, San Jose, CA) . Uma coluna de fase reversa C18 Vydac (2,1 x 150 mm) foi usada para todas as amostras proteoliticas digeridas usando o gradiente de CLAE (do inglês, HPLC) de 0 % a 70 % de Solvente B por 65 minutos com taxa de fluxo de 200 yL/min. Solvente A: 0,1 % TFA em água e Solvente B: 0,08% TFA em acetonitrila. O processamento dos dados foi realizado usando os programas TurboSEQUEST e Xcalibur (ThermoFinnigan).

Os resultados da análise MS foram então usados com o programa Mascot, o qual permite utilizar fragmentos de peptídeos digeridos como dados únicos a partir dos quais a proteína original e sua seqüência primária podem ser identificadas usando bases de dados públicas tais como a mantida pelo National Center for the Biotechnology Information. Mais informações sobre o Mascot, e seu precursor, Mowse, podem ser encontradas na internet, por exemplo, no sítio (www.matrixscience.com.br) mantido pela Matrix Science Inc., (Boston, MA).

Resultados:

A endopeptidase S-Glu a uma concentração final de enzima proteína de 0,188 % a uma concentração de proteína de substrato do soro de 12 % resultou em uma redução de 5,5 % em proteína total em duas horas. Nas próximas 4 a 20 horas, a TP reduziu ainda, a uma redução máxima de 20 %.

A coalhada precipitada apresentou um volume de retenção de água (isto é, a medida de retenção de água da coalhada) de cerca do mesmo peso de água a coalhar. A viscosidade do sobrenadante melhorou de 3,05 cP a 5,99 cP após 20 horas de incubação com a enzima S-Glu.

Resultados similares foram observados com a enzima L-Glu na mesma concentração final mencionada acima. Em 2 horas, foi observada uma redução de 6, 9 % de TP, melhorando para 10 % na marcação de tempo de 4 horas. A redução atingiu 14 % no final das 20 horas de incubação.

A coalhada precipitada apresentou um volume de retenção de água de cerca de 70 % de peso do peso da proteína.

A viscosidade do sobrenadante permaneceu praticamente a mesma durante o período de incubação de 20 horas com endopeptidase L-Glu.

Os resultados do período de tempo como revelados por SDSPAGE são mostrados na Figura 1 para ambos os tratamentos com as enzimas S-Glu e L-Glu. Os resultados da análise de espectrometria de massa dos produtos de 20 horas de digestão da amostra de soro são mostrados na Figura 2 para L-Glu, e Figura 3 para S-Glu.

As amostras de hidrolisatos de endopeptidases de proteínas do soro foram enriquecidas em peptídeos específicos. A identidade e quantidades relativas dos quais foram verificadas com LC-MS/MS detalhado acima. As Tabelas 1 (a) e (b) e 2 (a) e (b) abaixo mostram os dados obtidos da análise Mascot dos dados dos peptídeos para as amostras de soro digeridas com LGlu e S-Glu, respectivamente, em 20 horas de digestão. Tabela 1 (a), (b): Análise Mascot dos dados de MS para amostra de proteina do soro digerida com L-Glu por 20 horas.

(a): Beta lactoglubulina

>gi1125910 IspIP02754ILACB_BQVIN BSTA-LACTOGLOBULIN PRECURSOR (BETA-LG)Ogi 11070647 IpirI ILGBO beta-lactoglobulin precursor - bovineDgi|669061 <248305) beta-lactoglobulin variant B precursor [Bos caurus] [HASS=19883]

HKCLLLALAL TCGAQALIVT QTHKGLDIQK VAGTtJYSLAH AASDISLLDA QSAPLRVYVK ELKPTPEGDL EILLQKUENG BCAQKKIIAB KTKtPHTOKI DJILNENKVLV LDTDYKKYLL PCHBNSftEPE QSLACQCLVR TPBVDDBALK KFDKALKALP HHIRLSFNPT QLHBQCHI >monoisotopic mas3 = 19852

position sequence (NCBI BLftST link)

125- 130 NSABPB

??? IQPTPB

6Z- 71 LKPTPBGDLB

72- 78 ILLQKHtfB

91- 101 KTKIPAVFKID

91- 10S KTKIPAVFKIDALNH

Protexn Coverage: 38/178 = 21.3% by aaino acid count, 4285/19852 = 21.6% by mass

(b) Kappa Caserna

><3± I 2119400 Ipir I IΙ45Θ75 kappa-casein precursor - bovineOgi 1162811 (H36641) kappa-casein precursor [Bos taurus] IHASS=21225J

HHKSPFLWT ILALTLPFLG AQBQNQBQPI RCBKDBRFFS DKIAKYIPIQ YVLSRYPSYG LNYYQQKPVA LINNQFLPYP YYAKPAAVRS PAQILQWQVL SNTVPAKSCQ AQPTTHAPHP KPHLSFMftIP PKKNQDkTEI PTINTIftSGB PTSTPTIEAV BSTVftTLEAS PBVTBSPPBI NTVQVTSTftV >aonoisotopic mass « 21193

position sequence (NCBI SLftST link)

127- 139 HAIPPKKNQDKT B

162- 168 STVATLB

180- 190 INTVQVTSTAV

140- 158 IPTINTIASGKPTSTPTIB

Protexn Coverage: 50/190 “ 26.3% by amino acid count, 5218/21193 ° 24.6% by mass

Tabela 2 (a), (b): Análise Mascot dos dados de MS para amostra de proteína do soro digerida com S-Glu por 20 horas.

(a): Beta Caserna

►gi 1 2136722 Ipir I 1146963 beta-easain A3 - bovintOgi 1459292 Ibbs 1140624 (367277) b«ta-cat*ls À3 (cattle, BAaaary glend, Paptida, 224 aa] (Bot Caurus] (HASS-2S098]

HKVTILACLV ALALARILKH LNrVPCBIVKS LSSSEKSITFt INiaaBK7QS IHQQQT1DEL QQKIKPiItQT QSLVYP7PCP IPNSLPQHIP PLTQTPWVP PJLQPHVHGV SKVXí AiOlPK GKKftPPPKYP VIPFTISOSL TLTDVBKLHL PLPLWlStfHH QPHQPLPPTV HFPPQSVISI SQSKViPVPQ KAVPYPQftDH PIQÀPLLYQI PVLGPVRCPP PIIV ►nonoiiotopic aass «· 290(4

posltlon laquenc· (NU1I BLHST IinS)

116- 120 AJtAPK

37- 46 SITRIfTKKIH

137- 14« SDSLTLTDVg

58- 72 DKLQDKIHPPAQTQS

21- 29 ífNVPSBJÍVH 147- 156 WLHLPLPLLQ

10

?roteln Corerage: 59/224 ■ Zt.3^ by aaino acid count, 6581/25064 ■ 26.3^ by aass (b): Beta Lactoglubulina

>çiIIZ5910!splP02754ILACB_BOVIN BBTA-LACTOGLOBULIK PRÍOJRSOS (BITA-LG)Ogi 110706471pirI ILCBO beta-lactoglobulin precursor - bovineOgiI 669061 (246305) beta-lacCoglobulin variant- B precursor 18o* taurus] (ΪΙΑ33«19Θ831

HKCLLLALAL TCGAQALIVT QTJKG LDIQK VAGTWTSLAn AASDISLLDA OSMLBVYVi BLKPTPICDl IIlLQKWBJiC ICAQKKIIAI KTKIPftVFKI DftLNHNKVLV LDTDYKKYLL PCHHNSAEPK QSLACQCLVR TPffVDDSALI KFDKALKALP HBIRLSFHPT QLHIQCHI >Bonolsocopic mass ■ 1M52

posicion sequence (NCBI BLlIST link)

125- 130 WSAHPI ??J IQPTPI

SO- 60 ASSAP L,B23í?H

72- 79 ILLQKW8

91- 105 KTKIPAV7XIDALWI

9Z- 105 TKIPAVraiDALHB

ProteiA Coveraga: 39/178 ■ 21.9% by aaino acid count, 4419/19852 ■ 22.3% by Aass

Exemplo 2

Digestão de proteínas do leite usando a endopeptidases, SGlu e L-Glu.

Métodos: Dez (10) gramas de leite desnatado (duas fontes, Berkeley Farms e Sunnyside) foram colocadas em cada um dos oito tubos de 15 mL. Os tubos foram aquecidos a 40 0C por 15 minutos em uma incubadora shaker. A enzima (S-Glu ou L-Glu) foi adicionada (500 pL de uma solução estoque de 3,8 mg/mL) em cada um dos três tubos para cada enzima. Um tubo serviu como controle para cada fonte de leite desnatado e não recebeu qualquer adição de enzima. A incubação continuou para o tempo indicado sob as condições anteriores. Um tudo para cada tratamento com enzima foi removido a 2, 4, 20 horas. Os tubos foram então centrifugados para separar o precipitado e o sobrenadante. Os sobrenadantes foram testados para medidas de proteina total (TP) solúvel remanescente no sobrenadante (g/L) , % de sólido seco e viscosidade. Foi usada análise SDSPAGE para monitorar a clivagem da endopeptidase. Foi feita análise por espectrometria de massa conforme detalhado acima para confirmar a identidade dos produtos de clivagem gerados. A análise Mascot usando os peptídeos gerados foi também realizada usando os dados coletados de espectrometria de ma s s a.

Resultados: Duas amostras de leite desnatado tratado com S-Glu a uma concentração final de 0,19 mg/g de leite desnatado produziram uma coalhada grossa em duas horas de tratamento. Cerca de 43 % - 57 % de proteína total do leite desnatado foi precipitado em duas horas de tratamento ezimático. A precipitação foi quase completa, já que não foi observada nenhuma redução adicional significativa de proteína total no sobrenadante a 4 ou 20 horas para ambas as duas fontes de leite desnatado.

Em contraste com a S-Glu, as amostras tratadas com L-Glu mostraram precipitação melhorada da proteína do leite desnatado ao longo do tempo. Para a amostra I de leite desnatado, o tratamento com L-Glu endopeptidase provocou uma redução de 32 % na concentração de proteína a t= 2h, 42 % a 4h, e 62 % a 20 horas. Na amostra II de leite desnatado tratado com L-Glu a concentração TP foi reduzida em 11,5 % a t= 2h, 41 % a 4h e 51,7 % a 20 horas.

Como pode ser visto dos resultados SDS-PAGE (Figuras 3 e 4, leite desnatado I e II, respectivamente) ambas as endopeptidases L-Glu e S-Glu foram capazes de provocar a precipitação da caserna em 2 horas a partir do leite desnatado e apresentaram hidrólise significantiva de caserna, bem como lactoglobulina e lactoalbumina. As amostras de leite desnatado hidrolisado por endopeptidase foram enriquecidas em peptídeos específicos. A

identidade e quantidades relativas dos quais foram verificadas usando LC-MS/MS detalhado acima. As Tabelas 3 (a),(b) e (c) abaixo mostram os dados obtidos da análise Mascot dos dados dos peptídeos para a amostra I de leite desnatado digerida com L-Glu após 20 horas de digestão.

Tabela 3 (a) , (b) e (c) : Análise Mascot dos dados de MS para amostra I de leite desnatado digerida com L-Glu por 20 horas.

(a): Alfa caserna

>Çfi 1115646 I syt I P02662 | CASl^BOVIH ALPHA-Sl CASBIN PRBCURSOR [HASS=24S29)

HKLLILTCLV AVALARPKHP IKHaCLPQEV LNENLLRFFV APFPEVfGKE KVNBLSKDIG SESTEDQAUE DIKQLiEAESI SSSEBIVPNS VEQKKtQKSD VPSERYLGYL EQLLRLKKYK VPQLEIVPHS ABBRLHSMKE CIHAQQKBPM IGVWQELAYF YPKLEBQEYQ LBAYPSGAUY YVPLCTQYTD APSFSDIPNP ICSHÍJSIKTT UPLW >nonoisotopic nass - 24495

66- 70 D0AHB 94- 99 KKIQKB 93- 99 QKHXQKS 141- 148 CIHAQ0KB 30- 33 VLNB 46- SO VFCKB 134- 140 RLHSHKB 71- 76 aifíSMn 121- 125 VPOLB 149- 156 fHT CiVNOR 141- 156 GIHA00KKPMICVNOB 40- 45 VAPFPB 116- 125 LKKYKVPQLB IOS- 111 BYL ÇYI,* 88- 91 PHSV 157- 163 LAYFYPB 39- 45 FVAPPPB 208- 214 KTTHPLW 164- 172 LPROPYOLD 38- 45 7PVAPPPB 34- 39 HLLRPF 34- 45 NLLftPFVAPFPB 33- 45 BNL LRF PVAPF P B Protein Coverage: 106/214 D 49.5% by amino acid count, 1276*7/24495 n 52.1% by uass (b) Beta caseina

► gi. J 2 L36722 I pir H I469S3 b«ta-casein λ3 - bovineOgi | A59292 Ibbv l 140624 (S67277> beta-casein A3 aoaaary gl&nd, Peptid·, 224 ba! IBos

Cfturu»I |HA3S-2S099)

HKVLIUlCLV ALALARiLKB LNVPGBIV1S LSSS8KSXTB IKKtGCEKFQS EBQQQTIDBL QDKIKPPAQT QSLVYPFPCP IPNSLPQNIP PLTQTPVWP PFLQPRVMGV SlTVKEAPIAPK QKBMPFPKYP VÜPFTKSQSL TLTDVBNLHl PLPLLQ5WHH QPHQPLPPTV HFPPQSVLSl SQSKVLPVPO KAVPfPQRDH PIQAPLLYOK PVLCPVRCP7 PIIV >aonolsotoplc bass ■ 290(4

position sequence (NCBI BLAST link) 47- SZ KgQSBB 133- 136 ΡΓΤΒ 107- IlS VHCVSKVKI 21- 26 LWVPCB 37- <6 SITRIHKKIB 20- 26 ILNVPCB 60- 72 LQDKIHP7AQTQS 63- 73 KIHPJAPTQSL 60- 73 LQDKIHPFADTQSL 124- 132 ΠΡFPKYPVl 123- 132 BHPFPKYPVB 126- 136 FPKYPVKPPTI 124- 136 HPFPKTPVBPFTB 123- 136 BKPFPKYPVRPm Protein Comaga: 60/224 ■ 2(.l% by uino acid count, 6925/25064 ■ 2*7.by Bait

Tabela 3(c): Beta lactoglobulina

»çi 1125910 I sp IP027S4I LACB_BOVIH BBTA-LACTOCLOBUXIN PRBCURSOd (BBTA-LC)Ogi 11070647Ipirl I LCBO beta-iactoglobulin precursor - bovin«OffiI 669061 (Ζ4Θ305) beta-lactoglobulin varianc B precursor IBos caurus] |HAS3s19883)

HKCLLLAtlJU* TCCAQALIVT QTfQCCLDIQK VACTtTYSLAH JkASDISLLDA QSAPLRVYVE ÍLKPTPSCDl SILLQKWfNG ECAQKKIIAÍ KTHPftVFKI DftINEffKVLV IDTDYXKYLL PCHINSMPB QSLACQCLVR TPIVDDBA18 KTDKaiCRLP MHTRLSFNPT QLBÍQCHI ►aonoieotopic nasg » 1)192

position saijuenco [NCBI BLAST Iinb)

125- 130 NSABPR 72- 78 ILLOKUB ISl- 164 KFDKALKALPKHIR 165- 173 LSFNPTQLÍ 91- 105 KTKIPAVFKIDALNB 161- 173 fmm&mpittM 1S9- 173 líPBHWmMIQIcB 158- 173 Protein Coverage: £1/178 α 28.7% by anlno acid count, 5884/198S2 ° 29.6% by aass

De maneira similar, os dados obtidos pela análise Mascot

dos dados do peptídeo para a amostra II de leite desnatado digerida por 20 horas são mostrados abaixo nas Tabelas 4 (a)

para S-Glu, e 4(b) e (c) para L-Glu, respectivamente.

Tabela 4 (a) , (b) e (c) : Análise Mascot dos dados de MS para amostra II de leite desnatado digerida com endopeptidase por

20 horas. (a) : Digestão com S-Glu. Alfa caseína

>giI11564SIspIP02662ICASl^BOVIN ALPHA-Sl CASBIN PRICURSOft (MASS°Z4S29J

HKLLILTCLV AVALARPKHP IKHQGLPQBV LiIENLLRfFV RPFPBVFCKH ICVNlLSKDIC SiSTEDOJUCE DIUJUHftESI SSSSKIVPNS VEQUfIQKBB VTSBKYLCYL EQLLRLKKYK

VPQLKIVPNS ABBRLHSMXE GIKftQQKEPU IGVNQELftYF YTELFRQrYQ LDAYPSCAUY YVPLGTOYtD APSF5DIPNP ICSSUSIKTT KPLV >aonoi#otopic oaxs ■ 24495

posiclon sequence (NCBI BLRST link) 66- 70 DOAHl 66- 71 DQAHED 65- 71 BDflAHKD 30- 33 VLN8 135- 140 LHSHKK 77- 90 ABSISSSBKIVPNS 46- 50 VFCKH 71- 76 DIKQHB 93- 104 QKHIQKKDVPSK 92- 104 KQKHIOKBDVPSK 46- 54 VFCKBKVNB 18- 29 KHPIKHOCLPOl 141- 1S6 CIHAQOKBPHICVNOK 66- 76 DGAHZDIKQHK 158- 163 AYFYPK 106- 111 YLCYLB 157- 163 LAYFYPK 39- 45 FVAPPPB 209- 214 XXBUH 38- 45 FFVAPFPB 35- 45 ME?JVA,Pm 34- 45 NLtRFFVAPFPI 33- 45 BHLtRFFVAPPPH Protein Coveraere: 117/214 B 54.7% by aaino acid count, 13570/24495 ■ 59.4% by uãfs

Tabela 4 (b) : Digestão com L-Glu. Beta Caseína

><ril2136722|pirMI46363 b«ea-ca*«iη A3 - bovineOffif459252tbbs 1140*24 (S57277) beca-casein A3 ícattle, naaeary çLand, Peptide, 224 aaj [Bos tauxusJ IRASS=2S098J

KKVLILACLV ALALARELBS LNVPCBITOS LSSSSHSTTE INHQBKFQS BKQQQTBDBL QDlOCHPFRQT OSLVYPPPCP IPNSLPQNIP PLTQTPVWP PPLQPSVTiCV SKVKBAHAPK QKEUPPPKYP VKPPTESQSL TLTDVBNLHl PLPLLQSWffl QPHQPLPPTV HFPPQSVIiSL SQSKVLPVPQ KAVPYPQRDH PIQA7LLYQK PVLCPVRCPP PIIV >ttonoisotopic natf ■ 25064

position sequence (NCBI BLBST IinlO 17- 20 SLKB 37- 46 SÍTWWWJ* 37- 47 SITftINKKIKK 58- 71 DKLODKIHPFAOTO 139- 146 SLTLIDVB 21- 29 LHVPCSIVK 58- 67 DILQDKIHPF 123- 136 KHPFPKYPVRPRTB 147- 156 NLHLPLPLLO Protein Coverage: 70/224 = 31.3% by aaino acid counc, 8101/25064 = 32.3% by oass

Tabela 4 (c) : Digestão com L-Glu.

>gi 1115054 I sp I P02665 I CAS2_B0VIN ALPKA-S2 CASBIK PRlCURSOIDglj 476486 I pir I IKABOSZ alph£-s2-casein precursor - bovineOgi 1162929 (H16644) alphaff2-like caseia precursor (Bos caurufij ÍHASS=260J9Í

HKJFIFTCLi AVALAKNTHH HVSSSJBSII SQmKQSKH HAINPSKBNL CSTFCKIWR NANFBSYSIC SSSKSSASVA TEZVUTVDO KHYQiOlLNBI NQTYQKÍPQY LQYLYQCPIV LNPWDQVKRN RVPITPTLNR KQiSTSBKNS KKTVDHlSTS VFTKKTQ.TE EBKNMNFLK KISQRYQKFA LPQYIKTVYQ HOKAHKPUIQ PKTKVIPYVR YL >&onoifocopic mass ° 25984

position sequence (NCBI BLAST link)

34- 38 79- 83 58- 65 161- 171 161- 172 84- 99 130- 141

Protein Coverage: 58/222 · 26.1% by aaino acid count, 6711/25984 ■» 25.8% by aass

VATKI

WRNANS K

VgTKKTKLTKR

VPTKKTKLTKBg

VKITVDDKHYOKALNI

NAVPITPTLNRK

Exemplo 3

Digestão de caseína com atividade de endopeptidase Métodos: Dez (10) gramas de caseina em pó (Sigma, # de catálogo C-5890) foram misturados em 50 mL de tampão fosfato 1 M, pH 6,5 e 200 mL de água aquecida. 0 conteúdo foi aquecido até que a caseina fosse dissolvida no tampão. A solução de 5 caseina foi mantida naquela temperatura por cinco minutos. A solução de caseina foi então resfriada para temperatura ambiente, e ajustada para um volume final de 500 mL. Dez (10) mL desta solução de caseina foram colocados em cada um dos oito tubos de 15 mL e aquecidos até 40 0C por 15 minutos em 10 uma incubadora shaker. Cada um dos três recebeu endopeptidase S-Glu ou L-Glu (500 pL de uma solução estoque de 3,8 mg/mL. Um tubo de cada serviu como controle sem adição de enzima. Os tubos de amostra foram removidos a 2, 4, 20 horas, resfriados e centrifugados para separar o precipitado e o sobrenadante. 15 Os sobrenadantes foram testados para medidas de proteina total (TP) solúvel remanescente no sobrenadante (g/L) , % de sólido seco e viscosidade. Os sobrenadantes foram também analisados por eletroforese usando SDS-PAGE para monitorar a hidrólise. Foi feita análise por espectrometria de massa (MS) para 20 confirmar a presença de produtos de clivagem proteolitica individuais. Os resultados da análise MS foram então usados com o programa Mascot, que permite utilizar fragmentos de peptideos digeridos como dados únicos a partir dos quais a proteina original e sua seqüência primária podem ser 25 identificadas usando bases de dados públicas tais como a mantida pelo National Center for the Biotechnology Information. Mais informações sobro o Mascot, e seu precursor, Mowse, podem ser encontradas na internet, por exemplo, no sitio (www.matrixscience.com. br) mantido pela Matrix Science Inc., (Boston, MA).

Resultados: A solução tamponada de caseina (16,85 g/L) tratada com endopeptidase na concentração de 0,19 mg de enzima por grama de solução de caseina, precipitou 58 % da caseina em 2 horas usando S-Glu. Parte da caseina precipitada foi redissolvida, no entanto, devido a hidrólise adicional ao longo do tempo. As concentrações de proteina precipitada foram então 53 % e 49 % a 4 e 20 horas respectivamente. O tratamento com L-Glu gerou um aumento na caseina precipitada ao longo do tempo testado. Em 2 horas, 32,5 % da proteina total (TP) foi removida da solução de caseina. Isso aumentou para 34 % em 4 horas; em 20 horas, a proteina total removida foi de 54,2 %. A Figura 6 mostra os resultados da análise por SDS-PAGE dos fragmentos digeridos de caseina.

Os resultados da análise Mascot dos fragmentos digeridos de caseina são mostrados abaixo, nas Tabelas 5 e 6, para resultados das digestões após 20 horas com as enzimas L-Glu e S-Glu, respectivamente. Tabela 5: Digestão com L-Glu endopeptidase, 20 horas. Alfa

caseina

>gi111E646I Bp|P02662ICAS1_B0VIM ALPHA-Sl CASIIN PRECURSOR |HASS=Z4529]

HKLLILTCLV AVALAEPKHP IKHQGLPQEV LNBNLLRfFV JlPEPEVfGKB KVNBLSKDIG SKSTHDQAiffi DIKQHEABSI SSSHBIVPNS VBQKHIQKXD VPSBEYLGTL BQLLRLKKYK VPQLHIVPNS ASHRlHSiiKE GIXJWQKHPli IGVNQXLAYF YPBLFEQFYQ LDAYPSGAUY YVPIGTQYTD APSFSDIPNP IGSSHSSKTT UPLU >aonoisocopic mass = 24495

position sequence (NCBI ILftST link) 66< 70 DQAHE 141- 148 GIHAQOKB 30- 33 VLNH 46- 50 VPGKB 134- 140 RLftSHKE 71- 76 DIKQHB 18- 29 KHPirçHQr.LPgrç 16- 29 RPKHPIKHOGLPOB 149- 156 PHICVNOH 141- 156 GIHAOOKBPHIGVNOB 105- Iil RYLGYLg 157- 163 LAYFYPB 39- 45 fVAPPPp 208- 214 KTTHPIfU 164- 172 LFROFTfOLD 38- 45 FFVAPFPH 34- 45 NLLRFFVAPFPB 33- 45 ÍNILRPFVAPFPB Frotein Covcrage: 99/214 ■ 46.3^ by a&ino acid count, 11898/24495 ■ 49.6% by su&cs

Tabela 6: Digestão com S-Glu endopeptidase, 20 horas. Alfa

caseina

>gl 1115646 | sp | P02662 | CAS1_B0VIN ALPHA-Sl CASBIM PRECURSOR IHASS«»24S29)

HKLLILTCLV AVALARPKHP IKHQGLPQHV LNBNLLSFfV APFPEVfGBB KVNBLSKDIC SESTEDQAME BIKQKEAHSI SSSHHIVPNS VBQKHIQKED VPSIBYLGYX BQLLRLKKYK VPQLEIVPNS AEBStBSUKE GIHAQQKEPU IGVNQELftYF YPBLFRQFYQ LDAYPSGAWY YVPLCTQYTD APSFSDIPNP IGSBNSBKTT UPLV >aonoisotopic aass n 24499

posicion sequence (NCBI BLSST link) 66- 70 D0AH3 66- 71 DOAMBD 30- 33 VLNB 126- 133 IVPNSABB 46- 50 VPGKB 71- 76 PlKQHS 133- 140 ERLHSHfq 46- 54 VPGKEKVNE 18- 29 KHPIKHQÇLpÇK 141- 156 GIHAOOKBPHIGVNOB 66- 76 DOAHKDIKqHH 158- 163 AYFYPB 134- 163 PLHSHKBGIHAOOKBPHIGVNQBLAYPYPB 106- 111 YLCYLB 106- 112 YLGYLBQ 157- 163 LAYFYPq 39- 45 FVAPFPB 209- 214 irmv 38- 45 FFVAPFPB 35- 45 LLRFFVAP7PH 34- 45 NLLRFpVAPPPH 33- 45 BNL LRP PVAP FPK 28- 56 OBVLNRNLLRFFVAPPPBVFGKBKVNELS Diversas publicações, incluindo patentes, pedidos publicados, artigos técnicos e artigos acadêmicos são citados ao longo da descrição. Cada uma destas publicações citadas está incorporada aqui por referência, em sua totalidade para

todas as finalidades.

Claims (21)

1. Hidrolisato compreendendo pelo menos uma proteína do leite hidrolisada com pelo menos uma enzima proteolítica que cliva preferencialmente um residuo de ácido glutâmico ou ácido aspártico e que cliva um ou mais determinantes imunológicos presentes na proteína, caracterizado pelo fato de o hidrolisato compreender pelo menos uma beta lactoglobulina hidrolisada na região entre os aminoácidos 55-98, o hidrolisato possuindo imunogenícidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune à proteína.

2. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de pelo menos uma enzima proteolítica ser uma endopeptidase.

3. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado pelo fato_de a endopeptidase clivar preferencialmente a porção carboxi-terminal de um resíduo de ácido glutâmico ou resíduo de ácido aspártico.

4. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado_pelo_fato_de a endopept idase ser UniProtKB/Swiss-Prot Primary Accession Number P39790

5. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado_pelo_fato_de a endopept idase ser UniProtKB/Swiss-Prot Primarv Accession Number P80057.

6. Hidrolisato compreendendo pelo menos uma proteína do leite hidrolisada com pelo menos uma enzima proteolítica que cliva preferencialmente um resíduo de ácido glutâmico ou ácido aspártico, caracterizado pelo fato de a enzima proteolítica ser a endopeptidase UniProtKB/Swiss-Prot Primary Accession Number P39790, o hidrolisato possuindo imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune à proteína..

7. Hidrolisato de acordo com quaisquer das Reivindicações4 a 6, caracterizado pelo fato de a endopeptidase ser inibida por fenilmetilsulfonilfluoreto ou diisopropilfluorofosfato.

8. Hidrolisato de acordo com quaisquer das Reivindicações4 a 6, caracterizado pelo fato de a endopeptidase não requerer um íon metálico para sua atividade.

9. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a proteína incluir pelo menos uma lactoalbumina, preferivelmente uma alfa lactoalbumina.

10. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado pelo fato de a proteína ser pelo menos uma lactoalbumina ou uma lactoglobulina, preferivelmente uma alfa lactoalbumina ou uma beta lactoglobulina.

11. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o hidrolisato ser enriquecido em um ou mais dos peptídeos AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4).

12. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser enriquecido em um ou mais dos peptídeos ELEE (SEQ ID NO: 5), VATEE (SEQ ID NO: 6), PFTE (SEQ ID NO: 7), NSAEPE (SEQ ID NO: 8), VFGKE (SEQ ID NO: 9), AS Q S APLRV Y VE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), IQPTPE (SEQ ID NO: 10), LKPTPE (SEQ ID NO: 11), LKPTPEGD (SEQ ID NO: 12), LKPTPEGDLE (SEQ ID NO: 13), TKIPAVFKID (SEQ ID NO:14), ou TKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 15).

13. Hidrolisato de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser enriquecido em um ou mais dos peptídeos DQAME (SEQ ID NO: 16), GIHAQQKE (SEQ ID NO: 17), VLNE (SEQ ID NO: 18), VFGKE (SEQ ID NO: 19), RLHSMKE (SEQ ID NO: 20), DIKQME (SEQ ID NO: 21), KHPIKHQGLPQE (SEQ ID NO: 22), RPKH PIKHQGL PQE (SEQ ID NO: 23), PMIGVNQE (SEQ ID NO: 24), GIHAQQKEPMEGVNQE (SEQ ID NO: 25), RYLGYLE (SEQ ID NO: 26), LAYFYPE (SEQ ID NO: 27), FVAPFPE (SEQ ID NO: 28), KTTMPLW (SEQ ID NO: 29), LFRQFYQLD (SEQ ID NO: 30), F FVAPFPE (SEQ ID NO:31), NLLRFFVAPFPE (SEQ ID NO: 32), ou ENLLRFFVAPFPE (SEQ ID NO: 33) .

14. Hidrolisato contendo proteína do soro caracterizado pelo fato de ser enriquecido em um ou mais dos peptídeos AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4).

15. Ingrediente alimentício caracterizado pelo fato de compreender um hidrolisato de proteína do soro enriquecido em um ou mais dos peptídeos AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: A), possuindo imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do soro.

16. Produto alimentício fabricado caracterizado pelo fato de compreender um hidrolisato de proteína do soro enriquecido em um ou mais dos peptídeos AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), possuindo imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do soro.

17. Produto alimentício fabricado de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser comida industrializada para bebês, bebida isotônica, produto contendo queijo, suplemento de proteína, suplemento nutricional ou produto que substitui refeições.

18. Produto não-alimentício compreendendo o hidrolisato de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o produto não-alimentí cio ser um cosmético, uma loção ou uma solução para limpar a pele para uso em pele humana.

19. Produto não-alimentício compreendendo um hidrolisato que caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma proteína do leite hidrolisada com pelo menos uma enzima proteolítica que cliva preferencialmente um resíduo de ácido glutâmico ou ácido aspártico, o hidrolisato possuindo imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune à proteína.

20. Produto não-alimentício de acordo com a Reivindicação 18 ou Reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender o hidrolisato de proteína do soro enriquecido em um ou mais dos peptídeos AQSAPLRVYVE (SEQ ID NO: 1), ILLQKWE (SEQ ID NO: 2), KTKIPAVFKID (SEQ ID NO: 3), ou KTKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO: 4), possuindo imunogenicidade reduzida em um indivíduo predisposto a apresentar uma reação imune a uma ou mais proteínas do soro.

21. Composição compreendendo pelo menos dois hidrolisatos de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 6, caracterizada pelo fato de cada hidrolisato ser produzido com pelo menos uma enzima diferente possuindo uma especificidade diferente.