KR20110089705A - 유청단백질의 Protamex 효소 가수분해물 및 그 제조방법 - Google Patents

유청단백질의 Protamex 효소 가수분해물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우유의 유청단백질에 대한 protamex 효소 단백 가수분해물의 ACE 저해효과를 확인하므로서 항고혈압 예방 및 치료 가능성을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

유청단백질의 Protamex 효소 가수분해물 및 그 제조방법{Enzymatic hydrolysate of whey protein and production method of the same}
본 발명은 우유의 유청단백질의 효소 가수분해물과 그 항고혈압 기능성 식품으로서의 용도를 위한 그 제조방법에 관한 것이다.
최근 식습관의 변화함에 따라 식품 첨가물의 사용 및 패스트푸드의 섭취 빈도가 증가하고, 불규칙한 생활 습관과 스트레스로 인하여 암, 심혈관계 질환, 당뇨병 및 각종 성인병 인구가 점차 늘어가고 있다. 이 중 심혈관계 질환은 흔히 현대인들이 고통 받고 있는 질병으로, 선진국뿐만 아니라 개발도상국에서도 발병률이 증가하고 있는 추세이다. 특히 고혈압은 심혈관계 질환의 원인으로 심장수축을 5 mmHg 낮추면, 심혈관계 질환이 16% 감소한다는 보고가 있다(Collons et al., 1997; MacMahon et al., 1990).
ACE(angiotensin-converting enzyme)는 renin-angiotensin aldosteron 계의 angiotensin Ⅰ을 생리적 혈압상승물질인 angiotensin Ⅱ로 전환시키거나 혈관 이완작용이 있는 bradykinin을 분해시키는 효소이며, ACE 저해제는 이 ACE를 특이적으로 저해하는 물질이다. ACE 저해제에 의해 angiotensin Ⅱ의 생성이 감소되면 혈중 catecholamine 값이 감소되고, 혈관이 확장되며 동시에 항이뇨 호르몬인 aldesteron의 분비가 억제된다. 이에 따라 나트륨 이온(Na+) 및 수분의 배설이 촉진되어 몸을 순환하는 혈액량이 감소하고 혈압이 낮아진다(Petrillo and Ondetti, 1983). ACE 저해와 관련된 연구사례는 많이 보고되고 있다(Lourenco da Costa et al., 2007; Yuxing et al., 2009). 특히 가수분해물의 ACE 저해효과에 관한 연구가 많은데, 백합조개(Tasi et al., 2008), 틸라피아 물고기(Raghavan et al., 2009) 가수분해물에서 ACE 저해효과를 확인한 보고가 있다. 이 밖에도 펩타이드인 Leu-Ser-Ala, Val-Ile-Tyr, Leu-Val-Tyr (Asami et al., 2006)가 동물실험에서 ACE 저해효과를 나타낸다는 사례가 있으며, 알파s1 카제인에서 유래한 생리활성 펩타이드인 Leu-Gln-Trp 도 ACE 저해효과를 나타낸다는 연구가 있다 (정 외., 2001).
우유 단백질의 20%를 차지는 유청단백질은 치즈 제조나 casein 생산 시 분리되어 나오는 액상 부산물로, β-lactoglobulin, α-lactalbumin, serum albumin, 면역 글로불린, 락토페린 등이 함유되어 있어 풍부한 아미노산 조성과 높은 생물가를 가지고 있다(Marshall et al., 2004). 따라서, 유청단백질은 그 우수한 영양적 가치와 물리적 특성 때문에 널리 이용되어 왔으며, 최근에는 영양 이 외의 생리활성 성분의 보고로 밝혀지면서 새로운 연구 및 이용 방법의 개발이 각국에서 진행되고 있다(이수원, 2001). 최근까지 연구에 따르면 락토페린의 가수분해물은 암 치료에 효과가 있고(Hatake et al., 2006), 염소의 락토페린은 항균효과를 가지고 있으며(Tomita et al., 1995), 유청단백질 가수분해물은 항염효과를 나타낸다는 보고가 있다(Yamaguchi et al., 2004). 본 발명과 관련하여 유청 가수분해물의 ACE 저해효과에 관한 연구결과도 보고된 바 있다. Friesland Brands 등(2006)은 Bacillus 균주에서 분리한 protease를 사용하여 얻은 유청단백질 가수분해물에서 ACE 저해효과가 있음을 확인했고, 유청단백질을 효소로 가수분해하여, ACE 저해효과를 가진 펩타이드를 생산하는 방법을 보고하였으며, Janssen et al. (2006)은 trypsin과 chymotrypsin을 사용하여 얻은 5개 또는 6개의 펩타이드가 고혈압을 조절하는 기능이 있음을 보고하였다.
본 발명은 영양적으로 우수하고 상기 생리활성 특성을 가진 유청단백질 농축물을 trypsin보다 가격 면에서 매우 저렴한 산업적 효소인 protamex를 사용하여 가수분해하였고, 이 유청단백질 가수분해물의 ACE 저해효과를 확인하였다. 또한, 이러한 유청단백질 가수분해물의 보다 생산방법은 경제적이고, 안전한 항고혈압 물질의 생산 가능성을 보여준다.
정봉현, 김유경 특허 제10-0318553호 (2001), 안지오텐신-1-전환효소 억제 활성을 갖는 신규한 생리활성 펩타이드.
이수원, 유청 중의 생리활성물질, 식품세계 2001년 7월호. Hatake K., et. al., US20060204501 (2006), Drug for cancer theraphy. Yamaguchi M., et. al., JP16196707 (2004), Peptide having inhibitory activity against production of inflamatory cytokine
본 발명은 우유 유청단백질의 protamex 효소 가수분해물의 항고혈압 기능성 식품으로서의 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 상기 목적은 유청단백질의 효소 가수분해물을 얻는 단계와; ACE 억제 활성을 측정하는 단계와; 측정 결과를 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명 유청단백질의 protamex 효소 가수분해물은 ACE 저해율이 유청단백질 농축물(9.91%)에 비하여 현저히 높으며 가수분해 시간이 5시간 일 때 55.5%로 가장 높은 효과가 있음이 확인되었다.
도1은 유청단백질 가수분해물의 ACE 저해효과를 보인 그래프이다.
도2는 protamex를 사용한 유청단백질 가수분해물의 가수분해 시간별 ACE 저해 효과를 보인 그래프이다.
실험재료
유청단백질 농축물(WPC80)은 시중에 판매되는 삼익유가공㈜ 제품을 사용하였고, 가수분해를 위해서 alcalase(Novozyme Co.), flavourzyme(Novozyme Co.), neutrase(Novozyme Co.), protamex(Novozyme Co.), trypsin(Sigma Chemical Co.)을 사용하였다. ACE 저해효과를 확인하기 위해 사용된 rabbit lung acetone powder와 hippuryl-L-histidyl-L-leucine은 Sigma Chemical Co. 제품을 사용하였으며, sodium tetraborate decahydrate는 Junsei Chemical Co. 제품을 사용하였다.
가수분해물의 제조
가수분해는 Sinha et al. (2007)와 Kim et al. (2007)의 연구를 참고하여 실시하였다. 유청단백질 농축물은 alcalase, flavourzyme, neutrase, protamex, trypsin을 사용하여 가수분해 하였다. 효소 분해는 기질 (유청단백질 농축물: WPC)과 효소의 비를 바람직하기는 20~30:1, 가장 바람직하게는 25:1로 하고 pH 6.5로 조정하여 45℃, 6시간 반응시킨 후, 반응 정지를 위해 100℃에서 15분 동안 가열하였다. 이들을 각각 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리 하고, 상등액을 동결건조하여 실험에 사용하였다.
ACE 억제 활성 측정
ACE 억제 활성 측정은 Je et al. (2009)의 실험방법을 변형하여 사용하였다. Rabbit lung powder를 0.3 M NaCl이 함유된 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)에 0.1 g/mL 의 농도로 현탁하고, 4℃에서 24 시간 동안 효소를 추출하였다. 이것을 3,000 rpm에서 40분간 원심분리하여 그 상등액을 ACE 조효소로 사용하였다. 기질은 hippuryl-L-histidyl-L-leucine을 0.3 M NaCl이 함유된 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)에 녹여 5 mM로 만들어 사용하였다. 대조구는 시료대신 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)를 사용하였다.
0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3) 100 ㎕, 시료 50 ㎕, ACE 조효소 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 5분간 예비반응 시킨 후, hippuryl-L-histidyl-L-leucine 기질 50 ㎕를 가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 1 N HCl 250 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, ethyl acetate 1.5 mL를 가하여 15초 간 교반한 후, 3,000 rpm에서 20분간 원심분리시켜 상등액 1 mL를 취하였다. 이 상등액을 100℃에서 가열하여 완전건조 시킨 뒤 증류수 3 mL를 가하여 용해시킨 후, 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해율을 구하였으며, 저해율 계산식은 다음과 같다.
Figure pat00001

유청단백질 농축물을 효소 별로 가수분해하여 얻은 펩타이드의 ACE 저해효과를 확인하였다(도 1). ACE 저해효과는 trypsin, protamex, neutrase, alcalase, flavozyme의 순서로 높게 나타났다. trypsin과 protamex의 ACE 저해율은 각각 56.7%, 55.5%로 비슷했으며, 통계적으로 유의성은 없었다. 이 수치는 유청단백질 농축물의 ACE 저해율 (9.91%)에 비해 월등히 높은 수치이다. Alcalase, neutrase, flavozyme은 각각 47.15%, 48.11%, 46.23%의 ACE 저해율을 보였으며, 이 수치는 유청단백질 농축물에 비해 높은 수치이나 trypsin, protamex보다는 낮은 수치였다.
Novozyme에서 생산되는 산업용 효소의 판매 가격을 [표 1]에 나타내었다. trypsin과 protamex를 사용하여 얻은 유청 가수분해물의 ACE 저해효과는, 각각 56.7%, 55.5%로 큰 차이를 나타내지 않았다. 하지만 1 kg 당 효소의 가격은 protamex (60,000원)가 trypsin (1,000,000원)에 비해 16배 이상 저렴하므로 protamex가 산업적으로 유용한 효소로 판단되었다.
Figure pat00002

반응시간에 따른 ACE 저해효과 검증
기질 (유청단백질 가수분해물: WPH)과 효소 (protamex)의 비율을 25:1로 하여 가수분해를 실시하였다. Protamex를 이용한 유청단백질 농축물의 가수분해는 pH 7, 50℃에서 실시하였으며, 0-8시간까지 1시간 단위로 샘플링을 실시하였고, 샘플링 한 시료는 water bath에서 100℃, 15분간 가열하여 가수분해를 중지시킨 후, ACE 저해효과를 측정하였다.
가수분해를 실시하였을 때 ACE 저해효과가 높으면서, 가격이 저럼한 protamex를 사용하여, 가수분해 시간에 따른 ACE 저해효과를 확인하였다. Protamex를 첨가한 후 ACE 저해효과가 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. ACE 저해효과는 가수분해 시간이 5시간 일 때 55.5%로 가장 높게 나타났으며, 그 이후에는 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2).
본 발명 유청단백질의 protamex 효소 단백 가수분해물은 ACE 저해효과가 뛰어나고 항고혈압 기능성의 용도가 있으므로 보건 및 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 유청단백질을 효소분해하여 유청단백 가수분해물의 제조방법에 있어서, 유청단백질 농축물(WPC)과 단백질 분해효소 protamex를 20~30:1로 하고 pH 6.5로 조정하여 45℃에서 6시간 반응시킨 후, 100℃에서 15분간 가열한 다음, 3,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후, 상등액을 동결 건조함을 특징으로 하는 유청단백질의 가수분해방법.
  2. 제1항의 방법으로 제조된 항고혈압 기능성 유청단백질의 protamex 효소 단백 가수분해물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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