BRPI0719509A2 - Métodos, kits e composições para geração de novos folículos pilosos e crescimento de cabelos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS, KITS E COMPOSIÇÕES PARA GERAÇÃO DE NOVOS FOLÍCULOS Pl- LOSOS E CRESCIMENTO DE CABELOS".

Antecedentes da Invenção A presente invenção refere-se a métodos, kits e composições

para geração de novos folículos pilosos e crescimento do cabelo em um in- divíduo.

A neogênese folicular é definida como a geração de novos folí- culos pilosos (HF) após o nascimento. Os seres humanos nascem com um 10 complemento total de HF, que pode mudar em termos de tamanho e carac- terísticas de crescimento como em calvície precoce ou pode essencialmente se degenerar e desaparecer como nos últimos estágios de calvície ou em alopecias cicatriciais permanentes (cicatricial). Portanto, a geração de novos HF é desejada no tratamento de calvície comum bem como condições co- 15 muns com menos perda de cabelo, tais como, lúpus eritematoso discoide, hipotricose congênita, líquen planopilar, e outras alopecias cicatriciais. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção apresenta métodos, kits e composições para gera- ção de novos folículos pilosos e crescimentos do cabelo em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção apresenta uma composição que in-

cluir de 0,001% a 0,1% (p/v) de um inibidor de EGFR de molécula pequena formulado para administração tópica, onde o inibidor de EGFR é um hetero- ciclo contendo nitrogênio não-naturalmente ocorrente de menos de cerca de

2.000 dáltons, ou um metabólito desse.

Em outro aspecto, a invenção descreve um kit que inclui (i) uma

composição que inclui de 0,000001% a 10% (p/v) de um inibidor de EGFR de molécula pequena formulado para administração tópica, onde o inibidor de EGFR é um heterociclo contendo nitrogênio não-naturalmente ocorrente de menos de cerca de 2.000 dáltons, ou um metabólito desse, e (ii) instru- 30 ções para aplicar essa composição à pele de um indivíduo com necessidade de gerar um folículo piloso ou estimular o crescimento do cabelo.

A invenção descreve ainda um kit que inclui (i) uma composição da invenção e (ii) instruções para aplicar a composição à pele de um indiví- duo.

A invenção também descreve um kit que inclui (i) uma composi- ção da invenção; e (ii) instruções para aplicar a composição à pele de um 5 indivíduo com necessidade de gerar um folículo piloso ou estimular o cres- cimento do cabelo.

A invenção descreve um kit que inclui (i) uma composição da invenção; e (ii) instruções para administração da composição à pele de um indivíduo, onde a pele foi submetida à re-epitelialização menos de duas se- manas antes da primeira administração da composição.

A invenção descreve um kit que inclui (i) uma composição que compreende um anticorpo de EGFR; e (ii) instruções para administrar o anti- corpo a um indivíduo com necessidade de gerar um folículo piloso ou esti- mular o crescimento do cabelo. Em uma modalidade, o anticorpo é selecio- 15 nado a partir de zalutumumab, cetuximab, IMC 11F8, matuzumab, SC 100, ALT 110, PX 1032, BMS599626, MDX 214 e PX 1041.

A invenção descreve ainda um kit que inclui uma composição formulada para administração tópica que inclui (i) um inibidor de EGFR de molécula pequena selecionado a partir de leflunomida, gefitinib, erlotinib, 20 lapatinib, canertinib, vandetanib, CL-387785, PKI166, pelitinib, HKI-272, e HKI-357; e (ii) um agente biologicamente ativo adicional selecionado a partir de um anti-histamínico, um anti-inflamatório, um retinoide, um antiandrogêni- co, um imunossupressor, um abridor de canal, um antibiótico, e um antimi- crobiano. Em uma modalidade, o inibidor de EGFR de molécula pequena é 25 gefitinib ou erlotinib e o agente biologicamente ativo adicional é um abridor de canal selecionado entre minoxidil, diazóxido e fenitoína.

Qualquer um dos kits acima pode incluir opcionalmente instru- ções para aplicar a composição à cabeça de um indivíduo (por exemplo, ao escalpo, bochecha, queixo, face inferior ou sobrancelha), aplicar a composi- 30 ção à pele de um indivíduo uma ou duas vezes ao dia, aplicar a composição à pele de um indivíduo durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou ainda 10 dias consecutivos, administrar a composição durante a noite, ou administrar a composição durante o dia.

A invenção descreve um método para gerar um folículo piloso ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele de um indivíduo ao (i) rom- per a pele do indivíduo (por exemplo, resultando na indução de re- 5 epitelialização da pele do indivíduo) e (ii) colocar as células da pele em con- tato com um inibidor de EGFR de molécula pequena, ou um metabólito des- se, em uma quantidade suficiente para gerar folículos pilosos ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele. Em algumas modalidades, a etapa (a) é realizada em menos de duas semanas, 10 dias, 8 dias, 5 dias, ou ainda 3 10 dias antes da etapa (b). Em outras modalidades, a etapa (a) é realizada si- multaneamente com, ou mais de um dia, dois dias, 3 dias ou uma semana após a etapa (b).

A invenção descreve ainda um método para gerar um folículo piloso ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele da cabeça de um 15 indivíduo ao (i) colocar as células da pele em contato com um inibidor de EGFR de molécula pequena, ou um metabólito desse, em uma quantidade suficiente para gerar folículos pilosos ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele, onde o inibidor de EGFR é um heterociclo contendo nitrogênio não-naturalmente ocorrente de menos de cerca de 2.000 dáltons ou um me- 20 tabólito desse e com a condição de que a pele não seja a pálpebra.

A invenção também descreve um método para gerar um folículo piloso ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele de um indivíduo ao (i) induzir a re-epitelialização da pele do indivíduo; e (ii) colocar as células da pele em contato com um anticorpo EGFR em uma quantidade suficiente pa- ra gerar folículos pilosos ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele.

A invenção descreve um método para gerar um folículo piloso ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele de um indivíduo ao (i) induzir a re-epitelialização da pele do indivíduo; e (ii) administrar ao indivíduo um inibidor de EGFR selecionado a partir de um inibidor de EGFR de molécula 30 pequena, ou um metabólito desse, e um anticorpo EGFR, onde o inibidor de EGFR é formulado para liberação sustentada e administrado em uma quan- tidade suficiente para gerar folículos pilosos ou estimular o crescimento do cabelo sobre a pele. Em uma modalidade, as etapas (i) e (ii) são realizadas simultaneamente.

A invenção descreve ainda um método para produzir cabelo pigmentado em um indivíduo ao (i) gerar um folículo piloso no indivíduo de 5 acordo com o método da invenção; e (ii) suprimir a expressão de uma prote- ína Wnt no folículo piloso. Em algumas modalidades a etapa para suprimir a expressão de uma proteína Wnt inclui induzir uma expressão de uma proteí- na Dkkl.

Qualquer um dos métodos acima inclui opcionalmente a etapa de colocar a pele do indivíduo em contato com uma composição da inven- ção.

Em uma modalidade particular, os métodos da invenção incluem realizar a etapa de contato durante o dia ou realizar a etapa de contato du- rante a noite.

Em qualquer um dos métodos anteriores o inibidor de EGFR po-

de ser administrado de maneira sistêmica ou tópica.

Em qualquer um dos métodos anteriores a pele reepitelializada desprovida de um estrato córneo inclui queratinócitos recentemente forma- dos, ou inclui folículos pilosos embrionários que exibem um ou mais marca- dores característicos selecionados entre BerEP4, citqueratina 15, citquerati- na 17, β-catenina, sonic hedgehog e fosfatase alcalina.

Em uma modalidade dos métodos acima, o método inclui gerar um folículo piloso ou estimular o crescimento do cabelo sobre a cabeça, es- calpo, bochecha, queixo ou sobrancelha de um indivíduo.

Para qualquer um dos métodos acima, os indivíduos podem a-

presentar queda de cabelo do escalpo, face ou sobrancelha. O indivíduo po- de sofrer de uma doença associada com calvície, tal como, alopecia andro- genética, lúpus eritematoso discoide, hipotricose congênita, líquen planopi- lar, ou alopecia cicatricial. Os métodos da invenção também podem produzir 30 crescimento do cabelo mais rápido e cabelo mais grosso (em comparação com um indivíduo não se submeteu ao tratamento). Em outro aspecto, a composição de qualquer método anterior da invenção pode ser administrada ao indivíduo uma ou duas vezes ao dia (por exemplo, durante pelo menos 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais dias consecutivos).

Em uma modalidade particular dos métodos, kits e composições da invenção, o inibidor de EGFR de molécula pequena formulado para ad- 5 ministração tópica inclui 0,000001% a 10%, 0,00001% a 10%, 0,00001% a 1%, 0,0001% a 1%, 0,0001% a 0,5%, 0,001% a 0,5%, 0,01% a 0,5%, 0,1% a 0,5%, ou ainda 0,001% a 0,1% (p/v) de um inibidor de EGFR de molécula pequena.

Em outra modalidade particular dos métodos, kits e composições da invenção, as formulações tópicas incluem um excipiente farmaceutica- mente aceitável de um antioxidante (por exemplo, tióis, sulfoximinas, quelan- tes de metal, ácidos graxos, vitaminas (inclusive vitamina E), fenóis, estilbe- nos, ácido úrico, manose, selênio e propil gaiato), um excipiente emulsifican- te (por exemplo, ácidos graxos polietoxilados, diésteres de ácido graxo PEG, misturas de monoéster e diéster de ácido graxo PEG, ésteres de ácidos gra- xos com glicerol polietileno glicol, produtos de transesterificação de álcool- óleo, ácidos graxos poliglicerinados, ésteres de ácidos graxos propileno gli- col, misturas de ésteres glicerol-ésteres propileno glicol, mono- e diglicerí- deos, esterol e derivados de esterol, ésteres de ácido graxo com sorbitano polietileno glicol, alquil ésteres polietileno glicol, ésteres de açúcar, alquil fenóis polietileno glicol, copolímeros de bloco polioxietileno-polioxipropileno, ésteres de ácidos graxos com sorbitano, ésteres de ácidos graxos com álco-

ol inferior, tensoativos iônicos, ésteres de tocoferol e ésteres de esterol), um agente gelificante, um hidrocoloide, um agente de reticulação e um plastifi- 25 cante. Em uma modalidade, a formulação tópica pode incluir de 0,5 a 50%, 0,5 a 25%, 0,5 a 15%, 0,5 a 10%, 0,5 a 5% ou 0,5 a 3% (p/p) de um ou mais excipientes emuIsificantes, de 0,5 a 50%, 0,5 a 25%, 0,5 a 15%, 0,5 a 10%, 0,5 a 5%, ou 0,5 a 3% (p/p) de um ou mais agentes gelificantes, de 0,001% a 3%, 0,01% a 1%, 0,05% a 0,5% (p/p) de um ou mais antioxidantes, de 30 0,001% a 3%, 0,01% a 1%, 0,05% a 0,5% (p/p) de um ou mais agentes de reticulação, de 0,001% a 3%, 0,01% a 1%, 0,05% a 0,5% (p/p) de um ou mais plastificantes, e de 0,5 a 50%, 0,5 a 25%, 0,5 a 15%, 0,5 a 10%, 0,5 a 5%, ou 0,5 a 3% (p/p) de um ou mais hidrocoloides.

Ainda em outra modalidade particular dos métodos, kits e com- posições da invenção, o inibidor de EGFR (por exemplo, um inibidor de EG- FR de molécula pequena ou anticorpo EGFR) é combinado (por exemplo, administrado, formulado ou contido em um kit) com um agente biologicamen- te ativo adicional selecionado a partir de um anti-histamínico (por exemplo, mepiramina, difenidramina e antazolina), um anti-inflamatório (por exemplo, corticosteroides, NTEs, e inibidores COX-2), um retinoide (por exemplo, áci- do 13-cis-retinoico, adapaleno, ácido retinoico todo-trans e etretinato), um antiandrogênico (por exemplo, finasterida, flutamida, diazóxido, 11 alfa- hidroxiprogesterona, cetoconazol, RU58841, dutasterida, fluridil e QLT- 7704), um imunossupressor (por exemplo, ciclosporina, tacrolimo, rapamici- na, everolimo e pimecrolimo), um abridor de canal (por exemplo, minoxidil, diazóxido e fenitoína), um antibiótico e um antimicrobiano (por exemplo, benzoato de benzila, cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, álcool benzíli- co, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, metacresol canforado, fenol canforado, hexilresorcinol, cloreto de metilbenzetônio, ce- trimida, clorexidina, clorobutanol, clorocresol, cresol, glicerina, imiduréia, fe- nol, fenoxietanol, feniletilálcool, acetato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, sorbato de potássio, benzoato de sódio, proprionato de sódio, ácido sórbico e tiomersal).

Em uma modalidade particular dos métodos, kits e composições da invenção, o inibidor de EGFR é administrado, formulado ou é parte de um kit com um antiandrogênico (por exemplo, finasterida) e um abridor de canal (por exemplo, minoxidil).

Ainda em outra modalidade dos métodos, kits e composições da invenção, a formulação tópica é um creme, loção, bastão, pomada, gel, s- pray, espuma, adesivo, aerossol, curativo de ferimentos ou pastilha.

Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, kits e com- posições anteriores, o inibidor de EGFR de molécula pequena é selecionado a partir de leflunomida, o metabólito Ieflunomida A771726, gefitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, vandetanib, CL-387785, PKI166, pelitinib, HKI-272 e ΗΚΙ-357.

Em outra modalidade de qualquer um dos métodos, kits e com- posições anteriores, o anticorpo EGFR é selecionado a partir de zalutumu- mab, cetuximab, IMC 11F8, matuzumab, SC 100, ALT 110, PX 1032, 5 BMS599626, MDX 214 e PX 1041.

Os termos "administração" e "administrar" se referem a um mé- todo para administrar uma dosagem de uma composição farmacêutica a um paciente, onde o método é, por exemplo, tópico, oral, intravenoso, transdér- mico, subcutâneo, intraperitoneal ou intramuscular. O método preferido de 10 administração pode variar dependendo de vários fatores, por exemplo, os componentes da composição farmacêutica, local onde se deseja o cresci- mento do cabelo e geração de folículo piloso. Nos métodos, kits e composi- ções da invenção, a administração é, desejavelmente, tópica.

Por "uma quantidade suficiente" entende-se a quantidade de um 15 inibidor de EGFR (por exemplo, um inibidor de EGFR de molécula pequena ou um anticorpo EGFR) requerida para aumentar a taxa de nova geração de folículos pilosos e/ou novo crescimento do cabelo sobre o escalpo ou so- brancelha de um indivíduo em comparação com a taxa de nova geração de folículos pilosos ou crescimento do cabelo observada na ausência de trata- 20 mento. A quantidade eficaz de inibidor de EGFR usada para praticar a pre- sente invenção varia dependendo do inibidor que é usado, a forma de admi- nistração, a idade, peso corporal e saúde geral do indivíduo. Essencialmen- te, o médico irá decidir a quantidade e regime de dosagem apropriados. Tal quantidade é referida como "uma quantidade suficiente".

Como usado aqui, "reepitelização" se refere ao processo que

ocorre durante a formação de uma nova epiderme. O tecido que é submetido a esse processo pode ser caracterizado pela ausência de morfogênese de folículo piloso, células em um estado tipo embrionário, ou pela ausência de um estrato córneo.

Por "distúrbio" entende-se um grau suficiente de perturbação em

folículos pilosos existentes e na epiderme circundante e/ou derme para indu- zir um estado "tipo embrionário". Esse estado tipo embrionário inclui a ativa- ção, migração e diferenciação de células-tronco epiteliais da região com pro- tuberância do folículo piloso ou da epiderme interfolicular. A intensidade do distúrbio da pele pode incluir em quantidades crescentes: remoção parcial do estrato córneo, remoção completa do estrato córneo, remoção parcial da 5 epiderme, remoção completa da epiderme, distúrbio parcial da derme e re- moção completa da derme. O distúrbio da pele também pode incluir distúrbio médio a leve da epiderme e/ou derme sem qualquer perturbação do estrato córneo e/ou epiderme externa. Níveis diferentes de distúrbio da pele podem ser observados por métodos químicos, energéticos, mecânicos, baseados 10 em som, ultrassom e/ou eletromagnéticos.

Por "liberação controlada" entende-se a liberação espacial e temporal regulada de um composto terapêutico de uma formulação. O termo "liberação controlada" se destina a incluir liberação retardada, liberação sus- tentada e liberação da formulação em pulsos ou padrões senoidais. Em for- 15 mulações de liberação controlada, V3x pode ou não mudar. A liberação con- trolada do composto pode ser ativada por um estímulo exógeno ou endóge- no.

Por "liberação retardada" entende-se que o componente tera- peuticamente ativo não é imediatamente liberado da formulação (por exem- pio, partícula transportadora).

Por "liberação sustentada" entende-se uma forma de liberação controlada por meio da qual o composto terapeuticamente ativo é liberado durante um período prolongado de tempo.

Como usado aqui, "formulada para administração tópica" se re- 25 fere a uma composição da invenção que contém um composto terapêutico e formulada com um excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição dispersível. As composições formuladas para administração tópica (por exemplo, como um creme, gel, loção, pomada, partícula de mi- crodermoabrasão, e qualquer outra formulação tópica descrita aqui) são a- 30 quelas fabricadas ou vendidas de acordo com os regulamentos governamen- tais referentes a um regime terapêutico que inclui instruções para a adminis- tração tópica da composição. Por "inibidor de EGFR de molécula pequena" entende-se uma molécula que inibe a função de uma ou mais tirosina quinases da família EGFR. As tirosina quinases da família EGFR incluem EGFR1 HER-2 e HER-

4 (vide, Raymond et al., Drugs 60(Suppl.l):15 (2000); and Harari et al., On- cogene 19:6102 (2000)). Os inibidores de EGFR de molécula pequena inclu- em, por exemplo, gefitinib (Baselga et al., Drugs 60(Suppl. 1):33 (2000)), erlotinib (Pollack et al., J. Farm. Exp. Ter. 291 :739 (1999)), Iapatinib (Lackey et al., 92nd AACR Meeting, New Orleans, abstract 4582 (2001)), canertinib (Bridges et al., Curr. Med. Chem. 6:825 (1999)), vandetanib (Wedge et al., Cancer Res. 62:4645 (2002)), CL-387785 (Discafani et al., Biochem. Phar- macol. 57:917 (1999)), PKI166 (Takada et al., DrugMetab. Dispos. 32: 1272 (2004)), pelitinib (Torrance et al., Nature Medicine 6: 1024 (2000)), HKI-272, HKI-357 (para HKI-272 e HKI-357 vide, por exemplo, Greenbergeret al., 111 NCI-EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Terapi, Amster- dam, abstract 388 (2000); Rabindran et al., Cancer Res. 64:3958 (2004); Holbro et al., Ann. Rev. Pharm. Tox. 44:195 (2004); Tsou et al., J. Med. Chem. 48:1107 (2005); e Tejpar et al., J. Clin. Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. 22:3579 (2004)), e Ieflunomida (Kochhar et al., FEBS Lett. 334:161 (1993)). As estruturas de cada um desses compostos são fornecidas abaixo na Tabelai. Fármaco Estrutura Erlotinib Lapatinib Canertinib Vandetanib \ Q s, If CL-387785 XÒ PKI166 -<xxf° M N Pelitinib JX r^rXCr J- Fármaco Estrutura HKI-272 1 · «X+sKjS J HKI-357 r. 'r^Oocír J Os inibidores de EGFR de molécula pequena que podem ser

usados nos métodos e composições da invenção incluem anilinoquinazoli- nas, tais como, gefitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, vandetanib e CL- 387785 e as outras anilinoquinazolinas descritas na Publicação No.

5 WO/2005/018677 e patente Nos. U.S. 5.747.498 e 5.457.105; quinolina-3- carbonitrilas, tais como, pelitinib, HKI-272 e HKI-357, e as quinolina-3- carbonitrilas descritas na patente Nos. U.S. 6.288.082 e 6.002.008; pirrolopi- rimidinas, tais como, PK1166 e as pirrolopirimidinas descritas na Patente No. U.S. 6.713.474 e Publicação de Patente Nos. U.S. 20060211678, 10 20060035912, 20050239806, 20050187389, 20050165029, 20050153989, 20050037999, 20030187001 e 20010027197; piridopirimidinas, tais como aquelas descritas na Patente Nos. U.S. 5.654.307 e 6.713.484; pirazolopiri- midinas, tais como aquelas descritas na Patente Nos. U.S. 6.921.763 e 6.660.744 e Publicação de Patente Nos. U.S. 20060167020, 20060094706, 15 20050267133, 20050119282, 20040006083 e 20020156081; isoxazóis, tais como, leflunomida; imidazoloquinazolinas, pirroloquinazolinas e pirazoloqui- nazolinas. De preferência, o inibidor de EGFR de molécula pequena contém um sistema de anel heterobicíclico ou heterotricíclico. Cada publicação de patente listada acima está aqui incorporada a título de referência. Por "Α77 7628" entende-se o metabólito ativo de Ieflunomida que possui a estrutura abaixo.

Como usado aqui, "promover diferenciação" se refere à prática de aumentar a porcentagem de células que irão se diferenciar, como indica- 5 do ou de aumentar o número de células por área de unidade de pele que irão se diferenciar.

Por "célula epidérmica não comprometida" entende-se uma célu- la-tronco epidérmica, uma célula que apresenta com protuberância, uma cé- lula derivada de protuberância, ou qualquer outro tipo de célula conhecida que pode ser induzida para se diferenciar em uma célula de HF.

Por "célula de HF" entende-se uma célula-tronco de HF, uma célula da papila dérmica, uma célula do bulbo, uma célula matriz, uma célula da haste do pêlo, uma célula da bainha radicular interna, uma célula radicu- Iar externa, célula-tronco de melanócito ou um melanócito.

Por "EDIHN" entende-se neogênese de HF induzida por distúr-

bio da camada epitelial, tal como, por abrasão ou ferida, entre outros. Utili- zando-se os métodos da invenção, durante a re-epitelialização que acompa- nha o distúrbio da camada epitelial, a pele entra em contato com um inibidor de EGFR de molécula pequena para promover uma diferenciação de uma célula epidérmica não comprometida em uma célula de HF.

Por "corticosteroide" entende-se qualquer composto naturalmen- te ocorrente ou sintético caracterizado por um sistema de anel ciclopentano- peridrofenantreno hidrogenado e que possui atividade imunossupressora e/ou anti-inflamatória. Os corticosteroides naturalmente ocorrentes são ge- 25 ralmente produzidos pelo córtex adrenal. Os corticosteroides sintéticos po- dem ser halogenados. Exemplos de corticosteroides são fornecidos no pre- sente documento. Outras características e vantagens da invenção tornar-se-ão ób- vias a partir da seguinte Descrição Detalhada, desenhos e reivindicações. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. A abrasão epidérmica resulta na formação do novo fo- lículo piloso (HF). HF em estágios progressivos de desenvolvimento é mos- trado nos painéis à esquerda, centro e à direita. A seta no painel esquerdo indica o germe capilar. As células escuras se referem à progênie de células- tronco de HF na com protuberância.

Figura 2. A marcação com BrdU de HF acompanha a abrasão epidérmica. O HF em estágios progressivos de desenvolvimento é mostrado nos painéis à esquerda, no centro e à direita.

Figura 3. O local da ferida não contém HF imediatamente após a re-epitelialização. Vista superior (painel esquerdo) e corte de tecido (painel direito) do local 10 dias após a indução da ferida.

Figura 4. Aparência de germes capilares 12 dias após a indução

da ferida. A seta indica germe capilar.

Figura 5. Germes capilares induzidos por neogênese de HF in- duzida por Distúrbio Epidérmico (EDIHN) expressam K17. Dois germes capi- lares diferentes são mostrados nos painéis esquerdo e direito.

Figura 6. germes capilares induzidos por EDIHN contem células

da papila dérmica (DP), como evidenciado por coloração com fosfatase alca- lina (AP). As setas indicam células DP. Painel esquerdo: germes capilares. Painel direito: HF em um estágio desenvolvido adicional.

Figura 7. Comparação histológica entre HF induzido por EDIHN e HF embrionário. Painéis superiores à esquerda, segundo da esquerda, terceiro da esquerda e painéis à direita: Estágios progressivos de desenvol- vimento de HF induzido por EDIHN. Painéis inferiores à esquerda, centro e à direita: Estágios progressivos de um desenvolvimento de HF embrionário.

Figura 8. Indução de diversos marcadores de desenvolvimento de HF embrionário, Esquerdo (painel esquerdo), vias de sinalização/int (Wnt) 10b (painel central) e drenagem sônica (Shh; painel direito), por EDIHN. As estruturas de HF são indicadas por pontas de seta. Figura 9. Atividade proliferativa durante EDIHN, como evidencia- do por marcação por pulso BrdU. Estágios progressivos de desenvolvimento de HF são mostrados nos painéis à esquerda, no centro e à direita.

Figura 10. Indução de marcadores de HF S100A3 (painel es- querdo; corte de tecido paralelo ao eixo geométrico de HF) e S100A6 (painel direito; vista em corte transversal do folículo) por EDIHN.

Figura 11. Novo crescimento do cabelo em 25 dias (painel es- querdo) e 45 dias (painel direito) após a indução da ferida.

Figura 12. Esquema de ensaio EDIHN de lâmina microscópica (whole-mount).

Figura 13. Repopulação de células-tronco na protuberância de HF induzida por EDIHN, como evidenciado pela retenção de marcador BrdU após um período. Painel esquerdo: ampliação inferior: 50 X. Painel direito: ampliação superior: 400 X.

Figura 14 A. Células-tronco em HF induzido por EDIHN expres-

sam K 15. Painel superior esquerdo: vista superior do local da ferida. Painel inferior à esquerda: membrana da epiderme; segundo painel inferior da es- querda: igual ao painel [inferior à esquerda], porém visualizado sob Iuz bran- ca; painel direito: cortes de tecido.

Figura 14B. Neogênese de HF procede para o próximo ciclo ca-

pilar.

Figura 15. Esquema de criação de novo HF por EDIHN.

Figura 16. Nenhum HF novo evidente 11 dias após a indução da ferida em camundongos de 21 dias de idade. Painel superior: exame ma- croscópico; painel esquerdo inferior: coloração com AP da derme; painel di- reito inferior: coloração com K 17 da epiderme.

Figura 17. 14 dias após a indução da ferida, novos HF começa- ram a se formar como evidenciado pela coloração com AP da derme (painel esquerdo) e coloração com K 17 da epiderme (painel direito). Painéis princi- pais: ampliação de 10 X. Insertos: ampliação de 80 X.

Figura 18. 17 dias após a indução da ferida, os novos HF estão mais desenvolvidos. Painel esquerdo: coloração com AP da derme; painel direito: coloração com K17 da epiderme. Painéis principais: ampliação de 10 X. Insertos: ampliação de 80 X.

Figura 19. As feridas fecharam como em camundongos subme- tidos à depilação, então ferida (3 camundongos à esquerda em cada painel) 5 vs. ferida, separadamente (4 camundongos à direita em cada painel). Painel esquerdo: imediatamente após o ferimento. Painel direito: 10 dias após o ferimento.

Figura 20. Indução de anágeno por depilação antes do ferimento da aumenta a eficiência de EDIHN. Figura 20A. Painel superior: painel inferi- or esquerdo, coloração com AP da derme; painel inferior direito: coloração com K17 da epiderme. Figura 20B. Representação gráfica do aumento de EDIHN por depilação.

Figura 21A. EDIHN em pele humana enxertada no camundongo imunodeficiente (scid), sete dias após a indução de uma ferida excisional. As setas indicam novos HF. Figura 21B. A abrasão dérmica de enxertos de pele humana resulta em EDIHN. A pele de adulto humana (W) foi enxertada nos camundongos, raspada e examinada sete dias depois, por coloração de S100A6 (primeira, segunda e quarta fileiras) ou S100A4 (terceira fileira). Germes capilares (HG) e papila dérmica (DP) são indicados. A pele fetal humana (F) com desenvolvimento normal de folículos pilosos é mostrada para comparação. A pele de camundongo 17d foi incluída após o ferimento como um controle (painel superior esquerdo). Figura 22. Transcrições supra- reguladas pelo menos 2 vezes em células de HF ativadas, como avaliado por análise dChip. Figura 22A. Valores médios e erros padrão das transcri- ções supra-reguladas em amostras não-ativadas ("linha-bs") e ativadas ("expt") e modulações e diferenças entre valores não-ativados e ativados são mostradas. Figura 22B. Dados brutos de transcrições supra-reguladas em células não-ativadas e ativadas. "Ctrl" indica células não-ativadas e "Hi- gh-dep" indica células ativadas. Figura 22C. Informações adicionais sobre transcrições supra-reguladas.

Figura 23. Neogênese de folículo piloso pigmentado observada na pele de camundongos que expressam Dkkl após EDIFIN. Figura 23A. ampliação de 3,2x. Figura 23B. ampliação de 8x.

Figura 24. Camundongos de controle estavam carentes de HF

pigmentado.

Figura 25. EGF inibe sua formação de HF por EDIHN. Figura 5 25A. Coloração com K17 da pele ferida do camundongo representativo tra- tado com EGF. A ampliação é de 4x. Figura 25B. Vista com alta ampliação (10x) da pele mostrada em (A). Figura 25C. Coloração com K17 da pele feri- da do camundongo de controle representativo que não recebeu EGF após o ferimento. A ampliação é de 4x. Figura 25D. Vista com maior ampliação 10 (10X) da pele mostrada em (D).

Figura 26. A administração de um inibidor de receptor EGF (AG1478) resulta na geração de mais e maiores HF comparada com contro- les. Figura 26A. Superior: pele de 2 camundongos de controle. A linha trace- jada externa indica a extensão da área ferida após a contração e cicatriza- 15 ção; a linha tracejada interna indica a área de neogênese. Inferior: pele de 2 camundongos tratados, onde a área ferida e a área de neogênese coincidem amplamente, com a exceção de uma pequena área no lado esquerdo da área cercada em cada painel. Figura 26B. Grandes folículos pilosos desen- volvidos na área ferida nos camundongos injetados com AG1478. Painel 20 esquerdo: epiderme corada com K 17, com três folículos pilosos grandes próximos uns aos outros. Painel direito: derme corada com AP com áreas de grande coalescência DP. Barras de escala: 200 μητι.

Figura 27 A. Formação de folículo piloso aumentada em camun- dongos K14- Wnt7a. Painel esquerdo: Camundongos transgênicos Wnt7a. 25 Painel direito: camundongos de controle (de ocorrência natural). Figura 27B. Quantificação de experimento com camundongos de 4 semanas de idade. Figura 27C. Quantificação de experimento com camundongos de 3 semanas de idade.

DESCRICÃO DETALHADA A invenção descreve métodos, kits e composições para a gera-

ção de novos folículos pilosos e crescimento do cabelo em um indivíduo. Os métodos da invenção podem incluir re-epitelialização do tecido cutâneo an- tes da administração de um inibidor de EGFR de molécula pequena. Deta- lhes adicionais dos métodos, kits e composições da invenção são fornecidos abaixo.

Formulações Tópicas 5 Nos métodos da invenção, o inibidor de EGFR de molécula pe-

quena pode ser distribuído na pele em uma formulação tópica. As formula- ções tópicas incluem, sem caráter limitativo, cremes, loções, géis, bastões, pomadas, sprays, espumas, adesivos, aerossóis, curativos de ferimentos ou pastilhas. As formulações podem ser administradas, por exemplo, utilizando 10 um aplicador de spray com medidor de dose, uma microagulha, iontoforese, aumento de penetração de ultrassom, eletroporação, nano/microinjeção, es- ponja, ou aplicando e espalhando a formulação com as mãos.

Quaisquer veículos farmacologicamente convencionais e cosme- ticamente aceitáveis podem ser usados. Por exemplo, os inibidores de EG- 15 FR de molécula pequena podem ser administrados em formulações Iipos- somais que permitem que os compostos biologicamente ativos entrem na pele. Tais formulações Iipossomais são descritas na Patente Nos. U.S. 5.169.637; 5.000.958; 5.049.388; 4.975.282; 5.194.266; 5.023.087; 5.688.525; 5.874.104; 5.409.704; 5.552.155; 5.356.633; 5.032.582; 20 4.994.213; e Publicação PCT No. WO 96/40061. Exemplos de outros veícu- los adequados são descritos na Patente No. U.S. 4.877.805 e Publicação EP No. 0586106A1. Os veículos adequados da invenção também podem incluir óleo mineral, petrolato, polideceno, ácido esteárico, miristato de isopropila, estearato de polioxil 40, álcool estearílico ou óleo vegetal.

As formulações podem incluir vários corantes, fragrâncias, es-

pessantes (por exemplo, goma xantana), conservantes, umectantes, emoli- entes (por exemplo, óleos de hidrocarboneto, ceras ou silicones), demulcen- tes, excipientes emulsificantes, dispersantes, intensificadores de penetração, agentes plastificantes, conservantes, estabilizantes, demulsificantes, agen- 30 tes umectantes, emulsificantes, hidratantes, adstringentes, desodorantes convencionais, e similares podem ser adicionados para proporcionar benefí- cios adicionais e aprimorar a sensação e/ou aparência da preparação tópica. As formulações tópicas da invenção terão tipicamente um f entre 5,5 e 8,5 e incluem de cerca de 0,000001% a 10% (p/v), de forma desejável, 0,001% a 0,1% (p/v), inibidor de EGFR de molécula pequena.

Antioxidantes

5 As formulações de inibidor de EGFR de molécula pequena da

invenção podem conter um ou mais antioxidantes. Os antioxidantes úteis incluem, sem caráter limitativo, tióis (por exemplo, aurotioglicose, ácido di- hidrolipoico, propiltiouracil, tioredoxina, glutationa, cisteína, cistina, cistami- na, ácido tiodipropiônico), sulfoximinas (por exemplo, butionina-sulfoximinas, homo-cisteína-sulfoximina, butionina-sulfonas e penta, hexa e heptationina- sulfoximina), quelantes de metal (por exemplo, ácidos graxos α-hidroxi, áci- do palmítico, ácido fítico, lactoferrina, ácido cítrico, ácido láctico e ácido má- lico, ácido húmico, ácido biliar, extratos biliares, bilirrubina, biliverdina, ED- TA, EGTA, e DTPA), vitaminas (por exemplo, vitamina E, vitamina C, palmi- tato de ascorbila, fosfato de ascorbila Mg e acetato de ascorbila), fenóis (por exemplo, butil-hidroxitolueno, butil-hidroxianísol, ubiquinol, ácido nordi- hidroguaiarético, tri-hidroxibutirofenona), benzoatos (por exemplo, benzoato de coniferil), ácido úrico, manose, propil gaiato, selênio (por exemplo, selê- nio-metionina), estilbenos (por exemplo, óxido de estilbeno e óxido trans- estilbeno), e combinações desses.

Os antioxidantes que podem ser incorporados nas formulações da invenção incluem antioxidantes naturais preparados a partir de extratos vegetais, tais como, extratos de aloe vera; abacate; camomila; equinácea; ginko biloba; ginseng; chá verde; urze; jojoba; lavanda; capim-limão; alca- 25 çuz; malva; aveias; hortelã; erva-de-são-joão; salgueiro; gualtéria; extrato de inhame selvagem; extratos marinhos; e misturas desses.

A quantidade total de antioxidante incluída nas formulações po- dem ser de 0,001% a 3% em peso, de preferência, 0,01% a 1% em peso, em particular 0,05% a 0,5% em peso, com base no peso total da formulação. Excipientes Emulsificantes

As formulações de inibidor de EGFR de molécula pequena da invenção podem incluir um ou mais excipientes emulsificantes. Os excipien- tes emulsificantes que podem ser usados nas formulações da invenção in- cluem, sem caráter limitativo, compostos que pertencem às seguintes clas- ses: ácidos graxos polietoxilados, diésteres de ácido graxo PEG, misturas de monoéster e diéster de ácido graxo PEG, ésteres de ácidos graxos com gli- 5 cerol polietileno glicol, produtos de transesterificação de álcool-óleo, ácidos graxos poliglicerinados, ésteres de ácidos graxos propileno glicol, misturas de ésteres glicerol-ésteres propileno glicol, mono- e diglicerídeos, esterol e derivados de esterol, ésteres de ácido graxo com sorbitano polietileno glicol, alquil ésteres polietileno glicol, ésteres de açúcar, alquil fenóis polietileno 10 glicol, copolímeros de bloco polioxietileno-polioxipropileno, ésteres de ácidos graxos com sorbitano, ésteres de ácidos graxos com álcool inferior, tensoati- vos iônicos, ésteres de tocoferol e ésteres de esterol. Exemplos comercial- mente disponíveis de cada classe de excipiente são fornecidos abaixo.

Os ácidos graxos polietoxilados podem ser usados como excipi- entes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. E- xemplos de tensoativos de monoéster de ácido graxo polietoxilados comer- cialmente disponíveis incluem: monolaurato PEG 4-100 (Crodet L series, Croda), mono-oleato PEG 4-100 (Crodet O series, Croda), monoestearato PEG 4-100 (Crodet S series, Croda, and Mirj Series, Atlas/ICI), diestearato PEG 400 (Citrol 4DS series, Croda), monolaurato PEG 100, 200 ou 300 (Ci- trol ML series, Croda), mono-oleato PEG 100, 200 ou 300 (Citrol MO series, Croda), dioleato PEG 400 (Citrol 4DO series, Croda), monoestearato PEG 400-1000 (Citrol MS series, Croda), estearato PEG-I (Nikkol MIS-IEX, Nikko, e Coster K1, Condea), estearato PEG-2 (Nikkol MIS-2, Nikko), oleato PEG-2 (Nikkol MIO-2, Nikko), Iaurato PEG-4 (Mapeg® 200 ML, PPG), oleato PEG-4 (Mapeg® 200 MO, PPG), estearato PEG-4 (Kessco® PEG 200 MS, Stepan), estearato PEG-5 (Nikkol TMGS-5, Nikko), oleato PEG-5 (Nikkol TMGO-5, Nikko), oleato PEG-6 (Algon OL 60, Auschem SpA), oleato PEG-7 (Algon OL 70, Auschem SpA), Iaurato PEG-6 (Kessco® PEG300 ML, Stepan), Iaurato PEG-7 (Lauridac 7, Condea), estearato PEG-6 (Kessco® PEG300 MS, Ste- pan), Iaurato PEG-8 (Mapeg® 400 ML, PPG), oleato PEG-8 (Mapeg® 400 MO, PPG), estearato PEG-8 (Mapeg® 400 MS, PPG), oleato PEG-9 (Emul- gante Α9, Condea), estearato PEG-9 (Cremofor S9, BASF), Iaurato PEG-10 (Nikkol MIL- 10, Nikko), oleato PEG-10 (Nikkol MIO-10, Nikko), estearato PEG-12 (Nikkol MIS-10, Nikko), Iaurato PEG-12 (Kessco® PEG 600 ML, Stepan), oleato PEG-12 (Kessco® PEG 600 MO, Stepan), ricinoleato PEG- 5 12 (CAS # 9004-97-1), estearato PEG-12 (Mapeg® 600 MS, PPG), estearato PEG-15 (Nikkol TMGS- 15, Nikko), oleato PEG-15 (Nikkol TMGO- 15, Nik- ko), Iaurato PEG-20 (Kessco® PEG 1000 ML, Stepan), oleato PEG-20 (Kessco®) PEG 1000 MO, Stepan), estearato PEG-20 (Mapeg® 1000 MS, PPG), PEG-25 estearato (Nikkol MIS-25, Nikko), Iaurato PEG-32 (Kessco® 10 PEG 1540 ML, Stepan), oleato PEG-32 (Kessco® PEG 1540 MO, Stepan), estearato PEG-32 (Kessco® PEG 1540 MS, Stepan), estearato PEG-30 (Mirj 51), Iaurato PEG-40 (Crodet L40, Croda), oleato PEG-40 (Crodet 040, Cro- da), estearato PEG-40 (Emerest® 2715, Henkel), estearato PEG-45 (Nikkol MIS-45, Nikko), estearato PEG-50 (Mirj 53), estearato PEG-55 (Nikkol MIS- 15 55, Nikko), oleato PEG-100 (Crodet 0-100, Croda), estearato PEG-100 (Ari- acel 165, ICI), oleato PEG-200 (Albunol 200 MO, Taiwan Surf.), oleato PEG- 400 (LACTOMUL, Henkel), e oleato PEG-600 (Albunol 600 MO, Taiwan Surf.). As formulações da invenção podem incluir um ou mais ácidos graxos polietoxilados acima.

Os diésteres de ácidos graxos polietileno glicol podem ser usa-

dos como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exemplos de diésteres de ácido graxo polietileno glicol comercial- mente disponíveis incluem: dilaurato PEG-4 (Mapeg® 200 DL, PPG), diolea- to PEG-4 (Mapeg® 200 DO, PPG), diestearato PEG-4 (Kessco® 200 DS, 25 Stepan), dilaurato PEG-6 (Kessco® PEG 300 DL, Stepan), dioleato PEG-6 (Kessco® PEG 300 DO, Stepan), diestearato PEG-6 (Kessco® PEG 300 DS, Stepan), dilaurato PEG-8 (Mapeg® 400 DL, PPG), dioleato PEG-8 (Mapeg® 400 DO, PPG), diestearato PEG-8 (Mapeg® 400 DS, PPG), dipalmitato PEG-10 (Polialdo 2PKFG), dilaurato PEG-12 (Kessco® PEG 600 DL, Ste- 30 pan), diestearato PEG-12 (Kessco® PEG 600 DS, Stepan), dioleato PEG-12 (Mapeg® 600 DO, PPG), dilaurato PEG-20 (Kessco® PEG 1000 DL, Ste- pan), dioleato PEG-20 (Kessco® PEG 1000 DO, Stepan), diestearato PEG- 20 (Kessco® PEG 1000 DS, Stepan), dilaurato PEG-32 (Kessco® PEG 1540 DL, Stepan), dioleato PEG-32 (Kessco® PEG 1540 DO, Stepan), diestearato PEG-32 (Kessco® PEG 1540 DS, Stepan), dioleato PEG-400 (Citrol 4DO series, Croda) e diestearato PEG-400 Citrol 4DS series, Croda). As formula- 5 ções da invenção podem incluir um ou mais dos diésteres de ácidos graxos polietileno glicol acima.

As misturas de mono- e diéster de ácido graxo PEG podem ser usadas como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de mo- lécula pequena. Exemplos de misturas de mono- e diéster de ácido graxo 10 PEG comercialmente disponíveis incluem: PEG 4-150 mono, dilaurato (Kessco® PEG 200-6000 mono, Dilaurate, Stepan), mono, dioleato PEG 4- 150, (Kessco® PEG 200-6000 mono, Dioleate, Stepan) e mono-, diestearato PEG 4-150 (Kessco® 200-6000 mono, Diestearate, Stepan). As formulações da invenção podem incluir uma ou mais misturas de mono- e diéster de áci- 15 do graxo PEG acima.

Os ésteres de ácidos graxos com glicerol polietileno glicol po- dem ser usados como excipientes para a formulação dos inibidores de EG- FR de molécula pequena. Exemplos de ésteres de ácidos graxos com glice- rol polietileno glicol comercialmente disponíveis incluem: PEG-20 Iaurato de 20 glicerila (Tagat® L, Goldschmidt), Iaurato de glicerila PEG-30 (Tagat® L2, Goldschmidt), Iaurato de gliceril PEG-15 (Glicerox L series, Croda), Iaurato de glicerila PEG-40 (Glicerox L series, Croda), estearato de glicerila PEG-20 (Capmul® EMG, ABITEC), e Aldo® MS-20 KFG, Lonza), oleato de glicerila PEG-20 (Tagat(R) O, Goldschmidt) e oleato de glicerila PEG-30 (Tagat® 02, 25 Goldschmidt). As formulações da invenção podem incluem um ou mais dos ésteres de ácidos graxos com glicerol polietileno glicol acima.

Os produtos de transesterificação de álcool-óleo podem ser usa- dos como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exemplos de produtos de transesterificação de álcool-óleo comer- 30 cialmente disponíveis incluem: óleo de rícino PEG-3 (Nikkol CO-3, Nikko), óleo de rícino PEG-5, 9 e 16 (ACCONON CA series, ABITEC), óleo de rícino PEG-20, (Emalex C-20, Nihon Emulsion), óleo de rícino PEG-23 (Emulgante EL23), óleo de rícino PEG-30 (Incrocas 30, Croda), óleo de rícino PEG-35 (lncrocas-35, Croda), óleo de rícino PEG-38 (Emulgante EL 65, Condea), óleo de rícino PEG-40 (Emalex C-40, Nihon Emulsion), óleo de rícino PEG- 50 (Emalex C-50, Nihon Emulsion), óleo de rícino PEG-56 (Eumulgin® PRT 5 56, Pulcra SA), óleo de rícino PEG-60 (Nikkol CO-6OTX, Nikko), óleo de ríci- no PEG-100, óleo de rícino PEG-200 (Eumulgin® PRT 200, Pulcra SA), óleo de rícino hidrogenado PEG-5 (Nikkol HCO-5, Nikko), óleo de rícino hidroge- nado PEG-7 (Cremofor W07, B ASF), óleo de rícino hidrogenado PEG-10 (Nikkol HCO- 10, Nikko), óleo de rícino hidrogenado PEG-20 (Nikkol HCO- 10 20, Nikko), óleo de rícino hidrogenado PEG-25 (Simulsol® 1292, Seppic), óleo de rícino hidrogenado PEG-30 (Nikkol HCO- 30, Nikko), óleo de rícino hidrogenado PEG-40 (Cremofor RH 40, BASF), óleo de rícino hidrogenado PEG-45 (Cerex ELS 450, Auschem Spa), óleo de rícino hidrogenado PEG- 50 (Emalex HC-50, Nihon Emulsion), óleo de rícino hidrogenado PEG-60 15 (Nikkol HCO-60, Nikko), óleo de rícino hidrogenado PEG-80 (Nikkol HCO-80, Nikko), óleo de rícino hidrogenado PEG-100 (Nikkol HCO-100, Nikko), óleo de milho PEG-6 (Labrafil® M 2125 CS, Gattefosse), óleo de amêndoa PEG-6 (Labrafil® M 1966 CS, Gattefosse), óleo de semente de damasco PEG-6 (Labrafil® M 1944 CS, Gattefosse), óleo de oliva PEG-6 (Labrafil® M 1980 20 CS, Gattefosse), óleo de amendoim PEG-6 (Labrafil® M 1969 CS, Gattefos- se), óleo de semente de babaçu hidrogenado PEG-6 (Labrafil® M 2130 BS, Gattefosse), óleo de semente de babaçu PEG-6 (Labrafil® M 2130 CS, Gat- tefosse), PEG-6 trioleína (Labrafil® M 2735 CS, Gattefosse), óleo de milho PEG-8 (Labrafil® WL 2609 BS, Gattefosse), glicerídeos de milho PEG-20 25 (Crovol M40, Croda), glicerídeos de amêndoa PEG-20 (Crovol A40, Croda), trioleato PEG-25 (TAGAT® TO, Goldschmidt), óleo de semente de babaçu PEG-40 (Crovol PK-70), glicerídeos de milho PEG-60 (Crovol M70, Croda), glicerídeos de amêndoa PEG-60 (Crovol A70, Croda), triglicerídeo capríli- co/cáprico PEG-4 (Labrafac® Hidro, Gattefosse), glicerídeos capríli- 30 cos/cápricos PEG-8 (Labrasol, Gattefosse), glicerídeos caprílicos/cápricos PEG-6 (SOFTIGEN® 767, Huls), glicerídeo Iauroil macrogol-32 (GELUCIRE 44/14, Gattefosse), glicerídeo estearoil macrogol (GELUCIRE 50/13, Gatte- fosse), mono-, di-, tri-, tetraésteres de óleos vegetais e sorbitol (SorbitoGIice- ride, Gattefosse), tetraisoestearato de pentaeritritil (Crodamol PTIS, Croda), diestearato de pentaeritritil (Albunol DS1 Taiwan Surf), tetraoleato de pentae- ritritil (Liponate PO-4, Lipo Chem.), tetraestearato de pentaeritritil (Liponate 5 PS-4, Lipo Chem.), tetracaprato tetracaprilato pentaeritritil (Liponate PE-810, Lipo Chem.) e tetraoctanoato de pentaeritritil (Nikkol Pentarate 408, Nikko). Também incluídas como óleos nessa categoria de tensoativos estão vitami- nas solúveis em óleo, tais como, vitaminas A, D, E, K, etc. Assim, os deriva- dos dessas vitaminas, tais como, succinato de tocoferil PEG-1000 (TPGS, 10 disponível junto à Eastman), também são tensoativos adequados. As formu- lações da invenção podem incluir um ou mais dos produtos de transesterifi- cação de álcool-óleo acima.

Os ácidos graxos poliglicerinados podem ser usados como exci- pientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. E- xemplos de ácidos graxos poliglicerinados comercialmente disponíveis inclu- em: estearato de poligliceril-2 (Nikkol DGMS, Nikko), oleato de poligliceril-2 (Nikkol DGMO, Nikko), isoestearato de poligliceril-2 (Nikkol DGMIS, Nikko), oleato de poligliceril-3 (Caprol® 3GO, ABITEC), oleato de poligliceril-4 (Nik- kol Tetraglin 1-0, Nikko), estearato de poligliceril-4 (Nikkol Tetraglin 1-S, Nikko), oleoato de poligliceril-6 (Drewpol 6-1-0, Stepan), Iaurato de poliglice- ril-10 (Nikkol Decaglin 1-L, Nikko), oleato de poligliceril-10 (Nikkol Decaglin 1-0, Nikko), estearato de poligliceril-10 (Nikkol Decaglin 1-S, Nikko), ricino- Ieato de poligliceril-6 (Nikkol Hexaglin PR-15, Nikko), Iinoleato de poligliceril- (Nikkol Decaglin 1-LN, Nikko), pentaoleato de poligliceril-6 (Nikkol Hexa- glin 5-0, Nikko), dioleato de poligliceril-3 (Cremofor G032, BASF), diesteara- to de poligliceril-3 (Cremofor GS32, BASF), pentaoleato de poligliceril-4 (Nik- kol Tetraglin 5-0, Nikko), dioleato de poligliceril-6 (Caprol® 6G20, ABITEC), dioleato de poligliceril-2 (Nikkol DGDO1 Nikko), trioleato de poligliceril-10 (Nikkol Decaglin 3-0, Nikko), pentaoleato de poligliceril-10 (Nikkol Decaglin 5-0, Nikko), septaoleato de poligliceril-10 (Nikkol Decaglin 7-0, Nikko), tetra- oleato de poligliceril-10 (Caprol® 10G40, ABITEC), decaisoestearato de po- ligliceril-10 (Nikkol Decaglin 10-IS, Nikko), decaoleato de poligliceril-101 (Drewpol 10-10-0, Stepan), mono-, dioleato de poligliceril-10 (Caprol® PGE 860, ABITEC) e poliricinoleato de poligliceril (Polimuls, Henkel). As formula- ções da invenção podem incluir um ou mais dos ácidos graxos poliglicerina- dos acima.

5 Os ésteres de ácidos graxos propileno glicol podem ser usados

como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pe- quena. Exemplos de ésteres de ácidos graxos propileno glicol comercial- mente disponíveis incluem: monocaprilato propileno glicol (Capriol 90, Gatte- fosse), monolaurato propileno glicol (Lauroglicol 90, Gattefosse), oleato pro- pileno glicol (Lutrol OP2000, BASF), miristato propileno glicol (Mirpil), mono- estearato propileno glicol (LIPO PGMS, Lipo Chem.), hidroxiestearato propi- leno glicol, ricinoleato propileno glicol (PROPIMULS, Henkel), isoestearato propileno glicol, mono-oleato propileno glicol (Miverol P-06, Eastman), dica- prato dicaprilato propileno glicol (Captex® 200, ABITEC), dioctanoato propi- Ieno glicol (Captex® 800, ABITEC), caprato caprilato propileno glicol (LA- BRAFAC PG1Gattefosse), dilaurato propileno glicol, diestearato propileno glicol (Kessco® PGDS, Stepan), dicaprilato propileno glicol (Nikkol Sefsol 228, Nikko) e dicaprato propileno glicol (Nikkol PDD, Nikko). As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos ésteres de ácido graxo propileno glicol acima.

As misturas de ésteres propileno glicol e ésteres glicerol podem ser usadas como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Uma mistura preferida é composta dos ésteres de ácido oléico de propileno glicol e glicerol (Arlacel 186). Exemplos desses tensoati- 25 vos incluem: oléicos (ATMOS 300, ARLACEL 186, ICI), esteáricos (ATMOS 150). As formulações da invenção podem incluir uma ou mais das misturas de ésteres propileno glicol e ésteres glicerol acima.

Os mono- e diglicerídeos podem ser usados como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exemplos de mono- e diglicerídeos comercialmente disponíveis incluem: monopalmito- leína (C 16:1) (Larodan), monoelaidina (C 18: 1) (Larodan), monocaproina (C6) (Larodan), monocaprilina (Larodan), monocaprina (Larodan), monolau- rina (Larodan), monomiristato de glicerila (C 14) (Nikkol MGM, Nikko), mono- oleato de glicerila (C18:1) (PECEOL, Gattefosse), mono-oleato de glicerila (Miverol, Eastman), mono-oleato/linoleato de glicerol (OLICINE, Gattefosse), monolinoleato de glicerol (Maisine, Gattefosse), ricinoleato de glicerila (Softi- 5 gen® 701, Huls), monolaurato de glicerila (ALDO® MLD, Lonza), monopal- mitato de glicerol (Emalex GMS-P, Nihon), monoestearato de glicerol (Cap- mul® GMS, ABITEC), mono- e dioleato de glicerila (Capmul® GMO-K, ABI- TEC), glicerila palmítica/esteárica (CUTINA MD-A,ESTAGEL-G 18), acetato de glicerila (Lamegin® EE, Grunau GmbH), Iaurato de glicerila (Imwitor® 10 312, Huls), citrato/lactato/oleato/linoleato de glicerila (Imwitor® 375, Huls), caprilato de glicerila (Imwitor® 308, Huls), caprilato/caprato de glicerila (Capmul® MCM, ABITEC), mono- e diglicerídeos de ácido caprílico (Imwi- tor® 988, Huls), glicerídeos caprílicos/cápricos Imwitor® 742, Huls), mono- glicerídeos mono- e diacetilados (Mivacet® 9-45, Eastman), monoestearato 15 de glicerila (Aldo® MS, Arlacel 129, ICI), ésteres de ácido láctico de mono- e diglicerídeos (LAMEGIN GLP, Henkel), dicaproína (C6) (Larodan), dicaprina (C10) (Larodan), dioctanoina (C8) (Larodan), dimiristina (C 14) (Larodan), dipalmitina (C 16) (Larodan), distearina (Larodan), dilaurato de glicerila (C 12) (Capmul® GDL, ABITEC), dioleato de glicerila (Capmul® GDO, ABI- 20 TEC), ésteres de glicerol de ácidos graxos (GELUCIRE 39/01, Gattefosse), dipalmitoleina (C16:l) (Larodan), 1,2 e 1,3-dioleína (G18:l) (Larodan), dielai- dina (C18:l) (Larodan) e dilinoleína (C18:2) (Larodan). As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos mono- e diglicerídeos acima.

Esterol e derivados de esterol podem ser usados como excipien- 25 tes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exem- plos de esterol e derivados de esterol comercialmente disponíveis incluem: colesterol, sitosterol, lanosterol, éter PEG-24 colesterol (Solulan C-24, Amer- chol), colestanol PEG-30 (Fitosterol GENEROL series, Henkel), fitosterol PEG-25 (Nikkol BPSH- 25, Nikko), esterol de soja PEG-5 (Nikkol BPS-5, 30 Nikko), esterol de soja PEG-10 (Nikkol BPS-IO, Nikko), esterol de soja PEG- 20 (Nikkol BPS-20, Nikko) e esterol de soja PEG-30 (Nikkol BPS-30, Nikko). As formulações da invenção podem incluir um ou mais entre esterol e os derivados de esterol acima.

Os ésteres de ácido graxo com sorbitano polietileno glicol podem ser usados como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exemplos de ésteres de ácido graxo com sorbitano polie- 5 tileno glicol comercialmente disponíveis incluem: Iaurato de sorbitano PEG- 10 (Liposorb L-10, Lipo Chem.), monolaurato de sorbitano PEG-20 (T ween® 20, Atlas/ICI), monolaurato de sorbitano PEG-4 (Tween® 21, Atlas/ICI), mo- nolaurato de sorbitano PEG-80 (Hodag PSML-80, Calgene), monolaurato de sorbitano PEG-6 (Nikkol GL-I, Nikko), monopalmitato de sorbitano PEG-20 10 (Tween® 40, Atlas/ICI), PEG-20 monoestearato de sorbitano (Tween® 60, Atlas/ICI), monoestearato de sorbitano PEG-4 (Tween® 61, Atlas/ICI), mo- noestearato de sorbitano PEG-8 (DACOL MSS, Condea), monoestearato de sorbitano PEG-6 (Nikkol TS 106, Nikko), triestearato de sorbitano PEG-20 (Tween® 65, Atlas/ICI), tetraestearato de sorbitano PEG-6 (Nikkol GS-6, 15 Nikko), tetraestearato de sorbitano PEG-60 (Nikkol GS-460, Nikko), mono- oleato de sorbitano PEG-5 (Tween® 81, Atlas/ICI), mono-oleato de sorbitano PEG-6 (Nikkol TO- 106, Nikko), mono-oleato de sorbitano PEG-20 (Tween® 80, Atlas/ICI), oleato de sorbitano PEG-40 (Emalex ET 8040, Ninon Emulsi- on), trioleato de sorbitano PEG-20 (Tween® 85, Atlas/ICI), tetraoleato de 20 sorbitano PEG-6 (Nikkol GO-4, Nikko), tetraoleato de sorbitano PEG-30 (Nikkol G0-430, Nikko), tetraoleato de sorbitano PEG-40 (Nikkol G0-440, Nikko), monoisoestearato de sorbitano PEG-20 (Tween® 120, Atlas/ICI), he- xaoleato de sorbitol PEG (Atlas G- 1086, ICI), polissorbato 80 (Tween® 80, Pharma), polissorbato 85 (Tween® 85, Farma), polissorbato 20 (Tween® 20, 25 Farma), polissorbato 40 (Tween® 40, Farma), polissorbato 60 (Tween® 60, Farma) e hexaestearato de sorbitol PEG-6 (Nikkol GS-6, Nikko). As formula- ções da invenção podem incluir um ou mais dos ésteres de ácido graxo com sorbitano polietileno glicol acima.

Os alquil éteres polietileno glicol podem ser usados como excipi- entes para formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exem- plos de alquil éteres polietileno glicol comercialmente disponíveis incluem: éter oleíla PEG-2, olet-2 (Brij 92/93, Atlas/ICI), éter de oleíla PEG-3, olet-3 (Volpo 3, Croda), éter de oleíla PEG-5, olet-5 (Volpo 5, Croda), éter de oleíla PEG-10, olet-10 (Volpo 10, Croda), éter de oleíla PEG-20, olet-20 (Volpo 20, Croda), Iauril éter PEG-4, lauret-4 (Brij 30, Atlas/ICI), Iauril éter PEG-9, Iauril éter PEG-23, lauret-23 (Brij 35, Atlas/ICI), cetil éter PEG-2 (Brij 52, ICI), cetil 5 éter PEG-10 (Brij 56, ICI), cetil éter PEG-20 (BriJ 58, ICI), estearil éter PEG- 2 (Brij 72, ICI), estearil éter PEG-10 (Brij 76, ICI), estearil éter PEG-20 (Brij 78, ICI) e estearil éter PEG-100 (Brij 700, ICI). As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos alquil ésteres polietileno glicol acima.

Os ésteres de açúcar podem ser usados como excipientes para 10 a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exemplos de ésteres de açúcar comercialmente disponíveis incluem: diestearato de saca- rose (SUCRO ESTER 7, Gattefosse), diestearato/monoestearato de sacaro- se (SUCRO ESTER 11, Gattefosse), dipalmitato de sacarose, monoesteara- to de sacarose (Crodesta F- 160, Croda), monopalmitato de sacarose (SU- 15 CRO ESTER 15, Gattefosse) e monolaurato de sacarose (monolaurato de sacarose 1695, Mitsubisbi-Kasei). As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos ésteres de açúcar acima.

Os alquil fenóis polietileno glicol podem ser usados como excipi- entes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. E- 20 xemplos de alquil fenóis polietileno glicol comercialmente disponíveis inclu- em: séries de nonilfenol PEG-10-100 (Triton X series, Rohm & Haas) e sé- ries de éter octilfenol PEG-15-100 (Triton N-series, Rohm & Haas). As formu- lações da invenção podem incluir um ou mais dos alquil fenóis polietileno glicol acima.

Os copolímeros de bloco polioxietileno-polioxipropileno podem

ser usados como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Esses tensoativos estão disponíveis sob vários nomes comerciais, inclusive uma ou mais séries de Sinperonic PE (ICI), séries de Pluronic® (BASF), Lutrol (BASF), Supronic, Monolan, Pluracare e Plurodac. 30 O termo genérico desses polímeros é "poloxâmero" (CAS 9003-11-6). Esses polímeros possuem a fórmula I:

HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH (I) onde "a" e "b" indicam o número de unidades de polioxietileno e polioxipropi- leno, respectivamente. As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos copolímeros de bloco de polioxietileno-polioxipropileno acima.

Polioxietilenos, tais como, PEG 300, PEG 400 e PEG 600 po- 5 dem ser usados como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena.

Os ésteres de ácidos graxos de sorbitano podem ser usados como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pe- quena. Exemplos de ésteres de ácido graxo de sorbitano comercialmente 10 disponíveis incluem: monolaurato de sorbitano (Span-20, Atlas/ICI), mono- palmitato de sorbitano (Span-40, Atlas/ICI), mono-oleato de sorbitano (Span- 80, Atlas/ICI), monoestearato de sorbitano (Span-60, Atlas/ICI), trioleato de sorbitano (Span-85, Atlas/ICI), sesquioleato de sorbitano (Arlacel-C, ICI), triestearato de sorbitano (Span-65, Atlas/ICI), monoisoestearato de sorbitano 15 (Crill 6, Croda) e sesquiestearato de sorbitano (Nikkol SS- 15, Nikko). As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos ésteres de ácido graxo de sorbitano acima.

Os ésteres de álcoois inferiores (C2 a C4) e ácidos graxos (C8 a G18) são tensoativos adequados para uso na invenção. Exemplos desses 20 tensoativos incluem: oleato de etila (Crodamol EO, Croda), miristato de iso- propila (Crodamol 15 IPM, Croda), palmitato de isopropila (Crodamol IPP1 Croda), Iinoleato de etila (Nikkol VF-E, Nikko) e Iinoleato de isopropila (Nikkol VF-IP, Nikko). As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos ésteres de ácido graxo de álcool inferior acima.

Os tensoativos iônicos podem ser usados como excipientes para

a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Exemplos de tensoativos iônicos úteis incluem: caproato de sódio, caprilato de sódio, ca- prato de sódio, Iaurato de sódio, miristato de sódio, miristolato de sódio, palmitato de sódio, palmitoleato de sódio, oleato de sódio, ricinoleato de só- 30 dio, Iinoleato de sódio, Iinolenato de sódio, estearato de sódio, Iauril sulfato de sódio (dodecil), tetradecil sulfato de sódio, Iauril sarcosinato de sódio, di- octil sulfosuccinato de sódio, colato de sódio, taurocolato de sódio, glicocola- to de sódio, deoxicolato de sódio, taurodeoxicolato de sódio, glicodeoxicolato de sódio, ursodeoxicolato de sódio, quenodeoxicolato de sódio, tauroqueno- deoxicolato de sódio, glico quenodeoxicolato de sódio, colilssarcosinato de sódio, N-metil taurocolato de sódio, fosfatídeos de gema de ovo, Iecitina de soja hidrogenada, Ieeitina dimiristoil, leeitina, Ieeitina hidroxilada, Iisofosfati- dilcolina, cardiolipina, esfingomielina, fosfatidilcolina, fosfatidil etanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidil glicerol, fosfatidil serina, dietanolamina, fosfolipí- deos, fosfato de oleil éter polioxietileno, produtos de esterificação de álcoois graxos ou etoxilados de álcool graxo, com ácido fosfórico ou anidrido, éter carboxilatos (por oxidação de grupo OH terminal de etoxilados de álcool gra- xo), monoglicerídeos succinilados, estearil fumarato de sódio, succinato de hidrogênio propileno glicol estearoil, ésteres de ácido tartárico mo- no/diacetilados de mono- e diglicerídeos, ésteres de ácido cítrico de mono, diglicerídeos, ésteres gliceril-lacto de ácidos graxos, acil lactilatos, ésteres lactílicos de ácidos graxos, estearol,-2-lactilato, estearoil Iactilato de sódio, sais de alginato, alginato propileno glicol, alquil sulfatos etoxilados, alquil benzeno sulfonas, sulfonatos de α-olefina, isetionatos de acila, tauratos de acila, alquil gliceril éter sulfonatos, octil sulfosuccinato de sódio, undecilena- mideo-MEA-sulfosuccinato de sódio, brometo de hexadecil triamônio, brome- to de decil trimetil amônio, brometo de cetil trimetil amônio, cloreto de dodecil amônio, sais de alquil benzildimetilamônio, sais de diisobutil fenoxietoxidime- til benzilamônio, sais de alquilpiridínio, betaínas (trialquilglicina), Iauril betaí- na (N-IauriI1N,N-dimetilglicina) e aminas etoxiladas (amina de coco polioxieti- leno-15). Para simplicidade, contraíons típicos são proporcionados acima. Será avaliado por um elemento versado na técnica, entretanto, que qualquer contraíon bioaceitável pode ser usado. Por exemplo, embora os ácidos gra- xos sejam mostrados como sais sódicos, outros contraíons de cátion tam- bém podem ser usados, tais como, por exemplo, cátions de metal álcali ou amônio. As formulações da invenção podem incluir um ou mais dos tensoati- vos iônicos acima.

Os ésteres de tocoferol e ésteres de esterol, como descrito na Patente Nos. U.S. 6.632.443 e 6.191.172, cada uma esta aqui incorporada a título de referência, podem ser usados como excipientes para a formulação de inibidores de EGFR de molécula pequena. Esses ésteres de tocoferol e ésteres desses são descritos pela fórmula II:

{X-OOC-[(CH2)n-COO]m}p-Y (II)

5 onde X é selecionado entre a-tocoferol, β-tocoferol, γ-tocoferol, δ-tocoferol, colesterol, 7-de-hidrocolesterol, campesterol, sitosterol, ergosterol e estig- masterol; p é 1 ou 2; m é 0 ou 1; n é um número inteiro de 0 a 18; e I é uma porção hidrofílica selecionada entre poliálcoois, poliéteres e derivados des- ses.

Os excipientes emulsificantes presentes nas formulações da in-

venção estão presentes em tais quantidades que o veículo forme uma dis- persão uniforme de inibidor de EGFR de molécula pequena. As quantidades relativas de tensoativos requeridas são facilmente determinadas ao observar as propriedades da dispersão de inibidor de EGFR de molécula pequena 15 resultante, como determinado utilizando técnicas padrão para medir as solu- bilidades. A clareza óptica da dispersão aquosa pode ser medida utilizando técnicas quantitativas padrão para avaliação de turbidez. Por exemplo, uma formulação da invenção pode incluir de 0,001% a 10% em peso, de prefe- rência, 0,01% a 5% em peso, de excipiente emulsificante.

Agentes Gelificantes

As formulações de inibidor de EGFR de molécula da invenção podem conter um ou mais agentes gelificantes. Os agentes gelificantes úteis incluem, sem caráter limitativo, hidroxietilcelulose (comercialmente disponí- vel como hidroxietilcelulose NATROSOL® produzida por Aqualon), hidroxi- 25 propil celulose (comercialmente disponível como hidroxipropilcelulose KLU- CEL® produzida por Aqualon), polímeros de ácido acrílico reticulados (tal como polímero de ácido acrílico reticulado comercialmente disponível CAR- BOPOL®, produzido por Goodrich), polímero cruzado de decadieno MVE/MA (tal como, polímero cruzado de decadieno MVE/MA comercialmen- 30 te disponível STABILEZE®, produzido por ISP), copolímero PVM/MA (tal como, o copolímero PVM/MA comercialmente disponível GANTREZ®, pro- duzido por ISP), acrilatos/acrilonitrogênios de amônio (comercialmente dis- ponível como acrilatos/acrilonitrogênios de amônio HIPAN®), carboximetilce- lulose, polivinilpirrolidona, carbômero (carboxipolimetileno, CAS 541823-57- 9; cujos graus diferentes com vários pesos moleculares são comercialmente disponíveis), álcool cetostearil, dióxido de silício coloidal, gelatina, goma 5 guar, carboximetil celulose de sódio ou cálcio, hidroxietil ou hidroxipropil ce- lulose, hidroxipropilmetilcelulose, metil ou etil celulose, maltodextrina, álcool polivinilico, propileno carbonato, povidona, propileno glicol alginato, alginato de sódio de ácido algínico, glicolato de amido de sódio, amido e sacarose. Tipicamente, o agente gelificante, quando usado, está presente em uma 10 quantidade entre cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso da composição. Mais particularmente para p polímero de ácido acrílico reticulado CARBO- POL® a faixa de porcentagem de peso composicional preferida está entre cerca de 2% a cerca de 6%, enquanto para hidroxietilcelulose NATROSOL® ou hidroxipropilcelulose KLUCEL® a faixa preferida está entre cerca de 0,5% 15 a cerca de 4%. Desejavelmente, a faixa de porcentagem de peso composi- cional para polímero cruzado de decadieno PVM/MA STABILEZE® e acrila- tos/acrilonitrogenios de amônio HIPAN® está entre cerca de 1% a cerca de 4%. A faixa de porcentagem de peso composicional para polivinilpirrolidona está entre cerca de 0,5% e cerca de 10%.

Hidrocoloides

As formulações de inibidor de EGFR de molécula pequena da invenção podem conter um ou mais hidrocoloides. Os hidrocoloides úteis incluem, sem caráter limitativo, Carbopol, inclusive Carbopol 940, carrageni- na, ágar, goma xantana, poliglicomanano de goma de alfarrobeira e gelatina. Agentes de Reticulacão

As formulações de inibidor de EGFR de molécula da invenção podem conter um ou mais agentes de reticulação para formar uma ligação química entre as moléculas do polímero e o gel, formando um corpo sólido. Exemplos de agentes de reticulação de goma de alfarrobeira, goma guar ou 30 goma guar quimicamente modificada são galactose, titanato orgânico ou á- cido bórico. Quando o hidrocoloide for um poliglucomanano (por exemplo, Konjak®), bórax pode ser usado como um agente de reticulação. Quando goma xantana for usada, um reticulante adequado para goma xantana é manose. Se a goma de alfarrobeira for usada como o hidrocoloide principal, Iactose ou outro oligossacarídeo adequado pode ser usado.

Plastificantes

As formulações de inibidor de EGFR de molécula pequena da

invenção podem conter um ou mais plastificantes. Os plastificantes úteis in- cluem, sem caráter limitativo, alquil glicóis, polialquileno glicóis (por exemplo, polietileno glicol e/ou polipropileno glicol), benzoato de benzila, clorobutanol, óleo mineral, (mistura de CTFA de óleos minerais, por exemplo, Amerchol L- 10 101, Protalan M-16, Protalan M-26), petrolato (CTFA, mistura de petrolato, por exemplo, Amerchol CAB, Forlan 200), álcoois de lanolina, sorbitol, triace- tina, sebacato de dibutila, de dietila, glicerina, petrolactama e citrato de trieti- la.

Outros Ingredientes Biologicamente Ativos As formulações da invenção podem ser usadas em combinação

com qualquer ingrediente ativo adicional descrito aqui. Desejavelmente, o inibidor de EGFR de molécula pequena e o ingrediente ativo adicional são formulados juntamente. A quantidade de um ingrediente ativo adicional inclu- ída irá depender do efeito desejado e do ingrediente ativo que é selecionado. 20 Em geral, a quantidade de um ingrediente ativo adicional varia de cerca de 0,0001% a cerca de 20%, de preferência, de cerca de 0,01% a cerca de 10%, ou ainda cerca de 0,1% a cerca de 5% em peso.

Outros agentes biologicamente ativos que podem ser usados nos métodos, kits e composições da invenção incluem agentes anti- 25 histamínicos, anti-inflamatórios, retinoides, agentes antiandrogênicos, imu- nossupressores, abridores de canal, antimicrobianos, ervas (por exemplo, saw palmetto), extratos (por exemplo, extrato de Souhakuhi), vitaminas (por exemplo, biotina), co-fatores, psoraleno, antralina e antibióticos. Anti-histamínicos

Em algumas modalidades, um anti-histamínico pode ser usado

nas composições, métodos e kits da invenção. Os anti-histamínicos úteis incluem, sem caráter limitativo, Etanolaminas (por exemplo, bromodifenidra- mina, carbinoxamina, clemastina, dimenidrinato, difenidramina, difenilpiralina e doxilamina); Enediaminas de etila (por exemplo, feniramina, pirilamina, tripelenamina e triprolidina); Fenotiazinas (por exemplo, dietazina, etopropa- zina, metdilazina, prometazina, tietilperazina e trimeprazina); Alquilaminas 5 (por exemplo, acrivastina, bromfeniramina, clorfeniramina, desbromfenirami- na, dexclorfeniramina, pirrobutamina e triprolidina); Piperazinas (por exem- plo, buclizina, cetirizina, clorciclizina, ciclizina, meclizina, hidroxizina); Piperi- dinas (por exemplo, astemizol, azatadina, ciproeptadina, desloratadina, fexo- fenadina, loratadina, cetotifeno, olopatadina, fenindamina e terfenadina); e 10 anti-histamínico atípicos (por exemplo, azelastina, levocabastina, metapirile- no e feniltoxamina). Tanto anti-histamínico não-sedativos como sedativos podem ser empregados. Os anti-histamínicos não-sedativos incluem lorata- dina e desloratadina. Os anti-histamínicos sedativos incluem azatadina, bromodifenidramina; clorfeniramina; clemizol; ciproeptadina; dimenidrinato; 15 difenidramina; doxilamina; meclizina; prometazina; pirilamina; tietilperazina; e tripelenamina.

Outros anti-histamínicos adequados para uso nas composições, métodos e kits da invenção são acrivastina; histana; antazolina; astemizol; azelastina; bamipina; bepotastina; bietanautina; bromfeniramina; carbinoxa- 20 mina; cetirizina; cetoxima; clorociclizina; cloropiramina; cloroteno; clorfeno- xamina; cinarizina; clemastina; clobenzepam; clobenztropina; clocinizina; ciclizina; deptropina; dexclorfeniramina; maleato de dexclorfeniramina; dife- nilpiralina; doxepina; ebastina; embramina; emedastina; epinastina; cloridrato de etimemazina; fexofenadina; histapirrodina; hidroxizina; isoprometazina; 25 isotipendil; levocabastina; mebidrolina; mequitazina; metafurileno; metapiri- leno; metron; mizolastina; olapatadina; orfenadrina; fenindamina; feniramina; feniltoloxamina; p-metildifenidramina; pirrobutamina; setastina; talastina; ter- fenadina; tenildiamina; tiazinâmio; cloridrato de tonzilamina; tolpropamina; triprolidina; e tritoqualina.

Análogos de anti-histamínicos podem ser usados nas composi-

ções, métodos e kits da invenção. Os análogos de anti-histamínicos incluem 10-piperazinilpropilfenotiazina; di-cloridrato de 4-(3-(2-clorofenotiazin-10- il)propil-1 -piperazinaetanol; 1-(10-(3-(4-metil-1-piperazinil)propil)-10H-

fenotiazin-2-il)-(9CI)1-propanona; 3-metoxiciproeptadina; cloridrato de 4-(3- (2-Cloro-1 OH-fenotiazin-10-il)propil)piperazina-1 -etanol; 10,11 -di-hidro-5-(3- (4-etoxicarbonil-4-fenilpiperidino)propilideno)-5H-dibenzo(a,d)cicloepteno;

5 aceprometazina; acetofenazina; alimemazina (por exemplo, cloridrato de alimemazina); aminopromazina; benzimidazol; butaperazina; carfenazina; clorfenetazina; clormidazol; cinprazol; desmetilastemizol; desmetilciproepta- dina; dietazina (por exemplo, cloridrato de dietazina); etopropazina (por e- xemplo, cloridrato de etopropazina); cloridrato de 2-(p-bromofenil-(p’- 10 tolil)metoxi)-N,N-dimetil-etilamina; metilbrometo de N,N-dimetil-2- (difenilmetoxi)-etilamina; EX-10-542A; fenetazina; fuprazol; metil 10-(3-(4- metil-1 -piperazinil)propil)fenotiazin-2-il cetona; lerisetron; medrilamina; meso- ridazina; metilpromazina; N-desmetilprometazina; nilprazol; nortioridazina; perfenazina (por exemplo, enantato de perfenazina); 10-(3- 15 dimetilaminopropil)-2-metiltio-fenotiazina; cloridrato de 4-(dibenzo(b,e)tiepin- 6(11H)-ilideno)-1-metil-piperidina; proclorperazina; promazina; propiomazina (por exemplo, cloridrato de propiomazina); rotoxamina; rupatadina; Sch 37370; Sch 434; tecastemizol; tiazinâmio; tiopropazato; tioridazina (por e- xemplo, cloridrato de tioridazina); e 3-(10, 11-di-hidro-5H- 20 dibenzo(a,d)cicloepten-5-ilideno)-tropano.

Outros compostos que são adequados para uso nas composi- ções, métodos e kits da invenção são AD-0261; AHR-5333; alinastina; ar- promidina; ATI-19000; bermastina; bilastina; Bron-12; carebastina; clorfena- mina; clofurenadina; corsym; DF-1105501; DF-11062; DF-1111301; EL-301; 25 elbanizina; F-7946T; F-9505; HE-90481; HE-90512; hivenil; HSR-609; icoti- dina; KAA-276; KI-234; lamiacaste; LAS-36509; LAS-36674; levocetirizina; levoprotilina; metoclopramida; NIP-531; noberastina; oxatomida; PR-881- 884A; quisultazina; rocastina; selenotifeno; SK&F-94461; SODAS-HC; tago- rizina; TAK-427; temelastina; UCB-34742; UCB-35440; VUF-K-8707; Wi- 30 49051; e ZCR-2060.

Ainda outros compostos que podem ser usados nas composi- ções, métodos e kits da invenção são descritos na Patente Nos. U.S. 3.956.296; 4.254.129; 4.254.130; 4.282.233 4.283.408; 4.362.736; 4.394.508; 4.285.957; 4.285.958; 4.440.933 4.510.309; 4.550.116; 4.692.456; 4.742.175; 4.833.138; 4.908.372 5.204.249; 5.375.693; 5.578.610; 5.581.011; 5.589.487; 5.663.412; 5.994.549; 6 201.124; e 5 6.458.958.

Agentes antimicrobianos

Em algumas modalidades, um agente antimicrobiano pode ser usado nas composições, métodos e kits da invenção. Os agentes antimicro- bianos úteis incluem, sem caráter limitativo, benzoato de benzila, cloreto de 10 benzalcônio, ácido benzoico, álcool benzílico, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, metacresol canforado, fenol canforado, hexil- resorcinol, cloreto de metilbenzetônio, cetrimida, clorexidina, clorobutanol, clorocresol, cresol, glicerina, imidureia, fenol, fenoxietanol, feniletilálcool, a- cetato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, sorbato de 15 potássio, benzoato de sódio, proprionato de sódio, ácido sórbico e tiomersal.

O antimicrobiano pode ser de cerca de 0,05% a 0,5% em peso da composição total, exceto para fenol canforado e metacresol canforado. Para fenol canforado, as porcentagens de peso preferidas são cerca de 8% a 12% de cânfora e cerca de 3% a 7% de fenol. Para metacresol canforado, 20 as porcentagens de peso preferidas são cerca de 3% a 12% de cânfora e cerca de 1% a 4% de metacresol.

Agentes antiinflamatórios

Em algumas modalidades, um agente anti-inflamatório pode ser usado nas composições, métodos e kits da invenção. Os agentes anti- 25 inflamatórios úteis incluem, sem caráter limitativo, Fármacos Anti- inflamatórios Não-Esteroides (NSAIDs) (por exemplo, naproxen sódico, di- clofenaco sódico, diclofenaco de potássio, aspirina, sulindac, diflunisal, piro- xicam, indometacina, ibuprofeno, nabumetona, trissalicilato de colina e mag- nésio, salicilato de sódio, ácido salicilsalicílico (salsalato), fenoprofeno, flur- 30 biprofeno, cetoprofeno, meclofenamato de sódio, meloxicam, oxaprozina, sulindac e tolmetina), inibidores de COX-2 (por exemplo, rofecoxib, celeco- xib, valdecoxib e lumiracoxib), e corticosteroides (por exemplo, dipropionato de alclometasona, amcinonida, dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, propionato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexa- metasona, diacetato de diflorasona, acetonida de flucinolona, fiumetasona, fluocinonida, flurandrenolida, halcinonida, propionato de halobetasol, butirato 5 de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, prednisolona, ou acetonida de triancinolona). Imunossupressores

Em algumas modalidades, um imunossupressor não-esteroide pode ser usado nas composições, métodos e kits da invenção. Os imunos- supressores adequados incluem ciclosporina, tacrolimo, rapamicina, evero- Iimo e pimecrolimo.

Ciclosporinas

As ciclosporinas são metabólitos fungosos que compreendem uma classe de oligopeptideos cíclicos que atua como imunossupressores. A 15 ciclosporina A é um polipeptídeo cíclico hidrofóbico de onze aminoácidos. Esse se liga e forma um complexo com a ciclofilina de receptor intracelular. O complexo de ciclosporina/ciclofilina se liga e inibe a calcineurina, uma pro- teína serina-treonina-específica fosfatase dependente de calmodulina Ca2+. A calcineurina media eventos de transdução de sinal requeridos para a ati- 20 vação de célula T (analisada em Schreiber et al., Cell 70:365-368, 1991). As ciclosporinas e seus análogos funcionais e estruturais suprimem a resposta imune dependente de célula T ao inibir a transdução de sinal ativada por antígeno. Essa inibição diminui a expressão de citocinas pró-inflamatórias, tal como, IL-2.

Muitas ciclosporinas diferentes (por exemplo, ciclosporina A, B,

C, D, E, F, G, H e I) são produzidas por fungos. A ciclosporina A está comer- cialmente disponível sob o nome comercial NEORAL junto à Novartis. Os análogos estruturais e funcionais de ciclosporina A incluem ciclosporinas que possuem um ou mais aminoácidos fluorados (descritos, por exemplo, na Pa- 30 tente No. U.S. 5.227.467); as ciclosporinas que possuem aminoácidos modi- ficados (descritas, por exemplo, na Patente Nos. U.S. 5.122.511 e 4.798.823); e ciclosporinas deuteradas, tal como, ISAtx247 (descritas na Pu- blicação de Pedido de Patente No. U.S. 2002/0132763 Al). Os análogos de ciclosporina adicionais são descritos na Patente Nos. U.S. 6.136.357, 4.384.996, 5.284.826, e 5.709.797. Os análogos de ciclosporina incluem, porém sem caráter limitativo, D-Sar (α-SMe)3 VaI2-DH-Cs (209-825), Allo-Tr- 5 2-Cs, Norvalina-2-Cs, D-Ala(3-acetilamino)-8-Cs, Tr-2-Cs, e D-MeSer-3-Cs, D-Ser(0-CH2CH2-0H)-8-Cs, e D-Ser-8-Cs, que estão descritos em Cruz et al., Antimicrob. Agents Chemoter. 44: 143 (2000).

Tacrolimo

Tacrolimo e análogos de tacrolimo são descritos por Tanaka et al. (J. Am. Chem. Soc, 109:5031 (1987)) e na Patente Nos. U.S. 4.894.366, 4.929.611, e 4.956.352. Os compostos relacionados com FK506, inclusive FR-900520, FR-900523 e FR-900525, são descritos na Patente No. U.S. 5.254.562; O-aril, O-alquil, O-alquenil, e O-alquinilmacrolidas são descritos na Patente Nos. U.S. 5.250.678, 532.248, 5.693.648; macrólidos amino Ο- Ι 5 aril são descritos na Patente No. U.S. 5.262.533; macrólidos de alquilideno são descritos na Patente No. U.S. 5.284.840; macrólidos de N-heteroaril, N- alquileteroaril, N-alquenileteroaril e N-alquinileteroaril são descritos na Pa- tente No. U.S. 5.208.241; os aminomacrólidos e derivados desses são des- critos na Patente No. U.S. 5.208.228; os fluoromacrólidos são descritos na Patente No. U.S. 5.189.042; amino O-alquil, O-alquenil e O- alquinilmacrólidos são descritos na Patente No. U.S. 5.162.334; e os halo- macrólidos são descritos na Patente No. U.S. 5.143.918.

O tacrolimo é extensivamente metabolizado pelo sistema de oxi- dase de função mista, em particular, pelo sistema de citocromo P-450. O 25 mecanismo principal de metabolismo é a desmetilação e hidroxilação. Embo- ra seja provável que diversos metabólitos de tacrolimo exibam atividade bio- lógica imunossupressora, o metabólito 13-demetil é relatado para possuir a mesma atividade que o tacrolimo.

Pimecrolimo

Pimecrolimo é o derivado de 33-epi-cloro de macrolactama as-

comicina. Os análogos estruturais e funcionais de pimecrolimo são descritos na Patente No. U.S. 6.384.073. Rapamicina

Os análogos estruturais e funcionais de rapamicina incluem deri- vados de rapamicina mono- e diacilada (Patente No. U.S. 4.316.885); pró- fármacos de rapamicina solúveis em água (Patente No. U.S. 4.650.803); és- 5 teres de ácido carboxílico (Publicação PCT No. WO 92/05179); carbamatos (Patente No. U.S. 5.118.678); ésteres de amida (Patente No. U.S. 5.118.678); ésteres de biotina (Patente No. U.S. 5.504.091); ésteres fluora- dos (Patente No. U.S. 5.100.883); acetais (Patente No. U.S. 5.151.413); éte- res de silil (Patente No. U.S. 5.120.842); derivados bicíclicos (Patente No.

U.S. 5.120.725); dímeros de rapamicina (Patente No. U.S. 5.120.727); deri- vados de O-aril, O-alquil, O-alquienil e O-alquinil (Patente No. U.S. 5.258.389); e rapamicina deuterada (Patente No. U.S. 6.503.921). Os análo- gos de rapamicina adicionais são descritos na Patente Nos. U.S. 5.202.332 e 5.169.851.

Retinoides

Em algumas modalidades, um retinoide pode ser usado nas composições, métodos e kits da invenção. Os retinoides úteis incluem, sem caráter limitativo, ácido 13-cis-retinoico, adapaleno, ácido retinoico todo- trans, e etretinato.

Abridores de canal

Em algumas modalidades, um abridor de canal pode ser usado nas composições, métodos e kits da invenção. Os abridores de canal úteis incluem, sem caráter limitativo, minoxidil, diazóxido e fenitoína. Antiandrogênicos

Em algumas modalidades, um antiandrogênico pode ser usado

nas composições, métodos e kits da invenção. Os antiandrogênicos úteis incluem, sem caráter limitativo, finasterida, flutamida, diazóxido, 11alfa- hidroxiprogesterona, cetoconazol, RU58841, dutasterida, fluridil, QLT-7704 e oligonucleotideos antiandrogênicos.

Antibióticos

Em algumas modalidades, um antibiótico pode ser usado nas composições, métodos e kits da invenção. Os antibióticos úteis incluem, sem caráter limitativo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, me- zlocilina, piperacilina, azlocilina, temocilina, cepalotina, cefapirina, cefradina, cefaloridina, cefazolina, cefamandol, cefuroxima, cefalexina, cefprozil, cefa- 5 clor, loracarbef, cefoxitina, cefmatozol, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima, cefixima, cefpodoxima, ceftibuteno, cefdinir, cef- piroma, cefepima, BAL5788, BAL9141, imipenema, ertapenema, meropene- ma, astreonama, clavulanato, sulbactama, tazobactama, estreptomicina, ne- omicina, canamicina, paromicina, gentamicina, tobramicina, amicacina, ne- 10 tilmicina, espectinomicina, sisomicina, dibecalina, isepamicina, tetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, minociclina, oxitetraciclina, metaciclina, doxi- ciclina, eritromicina, azitromicina, claritromicina, telitromicina, ABT- 773, Iin- comicina, clindamicina, vancomicina, oritavancina, dalbavancina, teicoplani- na, quinupristina e dalfopristina, sulfanilamida, ácido para-aminobenzoico, 15 sulfadiazina, sulfisoxazol, sulfametoxazol, sulfatalidina, linezolida, ácido nali- díxico, ácido oxolínico, norfloxacina, perfloxacina, enoxacina, ofloxacina, ci- profloxacina, temafloxacina, Iomefloxacina, fleroxacina, grepafloxacina, es- parfloxacina, trovafloxacina, clinafloxacina, gatifloxacina, moxifloxacina, ge- mifloxacina, sitafloxacina, metronidazol, daptomicina, garenoxacina, ramo- 20 planina, faropenem, polimixina, tigeciclina, AZD2563 e trimetoprima. Re-epitelializacão

Em um aspecto dessa invenção, as composições da invenção são administradas à pele de um indivíduo (exemplos do local da pele são a cabeça, por exemplo, o escalpo, a sobrancelha ou uma região cicatrizada) 25 enquanto a pele está em um estado de re-epitelialização. A re-epitelialização é o processo que ocorre durante a formação de uma nova epiderme e pode ser caracterizado para os propósitos dessa invenção pela ausência de mor- fogênese de folículo piloso (por exemplo, se estiver dentro do tecido algu- mas células estão no estágio pré-placoide da formação de folículo piloso), 30 um estado tipo embrionário, onde o folículo se regenera, ou pela ausência de um estrato córneo.

Estado de Re-epitelialização A re-epitelialização pode ser detectada pela inspeção da nova epiderme onde a cobertura da área ferida por queratinócitos indica re- epitelialização. A presença de um queratinócito pode ser observada a olho nu como uma superfície branca, Iustrosa e brilhosa que cobre gradualmente 5 a ferida aberta. Utilizando um microscópio confocal, os queratinócitos podem ser visualizados como uma lâmina de células "cobblestone". A re- epitelialização também pode ser detectada através da medida de perda de água transepidérmica (TEWL). A TEWL diminui quando a barreira epitelial é restaurada. A microscopia de varredura a laser confocal e/ou tomografia de 10 coerência óptica também pode ser usada para detectar o estado de re- epitelialização, onde a presença de queratinócitos indica re-epitelialização.

A presença de um estrato córneo pode ser determinada através de inspeção visual, observação direta de vasos sanguíneos papilares utili- zando um microscópio capilar ou através de uma reação redox colorimétrica 15 de um composto que reage na presença de células vivas. Por exemplo, 0,01% de amarelo de nitrazina aplicado á pele irá permanecer amarelo se o estrato córneo estiver presente e ficará marrom esverdeado se não estiver. Em outro exemplo, 0,01% de roxo de bromcresol aplicado à pele irá perma- necer amarelo se o estrato córneo estiver presente e ficará roxo se o estrato 20 córneo não estiver presente.

A área de re-epitelialização pode ter, por exemplo, entre 0 a 2 milímetros (mm) de largura (por exemplo, 1 mm, 2 mm, 3 mm, ou mais), 0 a 2 centímetros (cm) de largura (por exemplo, 1 cm, 1,5 cm e 2,0 cm) ou mais. Opcionalmente, a área de re-epitelialização pode ser interfolicular.

Em alguns aspectos da invenção, é desejável administrar os

compostos da invenção em uma fase particular de re-epitelialização. Os es- tágios onde os compostos da invenção podem ser, de preferência, adminis- trados e/ou ativados incluem períodos:

• após o término do processo de re-epitelialização (por exemplo, 3 a 12 dias ou 9 a 11 dias após romper a pele),

• após ou durante o estabelecimento de uma população de célu- las-tronco que irá se desenvolver em um folículo piloso regenerado ((Ito et al, Nature 447, 316-320, maio de 2007),

• antes da expressão de marcadores de diferenciação de folículo piloso KRT 17 e Lefl durante vários dias após o fechamento da ferida (Ito et al, Nature 447, 316-320, maio de 2007),

· após ou durante a expressão de uma ou mais proteínas inclu-

sive KRT 17, Lef-1, fosfatase alcalina, Wnt10b, e Shh (Ito et al, Nature 447, 316-320, maio de 2007),

• caracterizado pela ausência de expressão de K10 (que é ex- presso em epiderme normal) e/ou indução de expressão de K16 e K17 (que

não são expressos em epiderme normal) (Patel et al, Journal of Investigative Dermatology, 126, 2006),

• caracterizado pela elevação de um ou mais fatores de transcri- ção inclusive AP-I e NF-κΒ, citocinas primarias IL-1 β e TNF-α, e metalopro- teases de matriz (Karimipour et al, Journal of the American Academy of

Dermatology, 52, Issue 2, 2005),

• caracterizado por alterações histológicas (Freedman et al, Dermatologic Surgery, 27 Issue 12, December 2001), inclusive, por exemplo:

• espessamento da epiderme e derme,

• achatamento de cristas,

· ectasia vascular,

• inflamação perivascular,

• hialinização da derme papilar com colágeno e fibras elásticas recentemente depositadas,

• mudança em orientação, densidade ou acondicionamento de

colágeno e outras estruturas,

• caracterizado por desprendimento da casca da ferida. Depen- dendo da intensidade do processo de abrasão, pode ser desejado que os compostos da invenção sejam administrado ou ativados antes ou após o desprendimento da casca da ferida. Alternativamente, os folículos pilosos

podem começar a se formar antes de a casca cair, no caso, por exemplo, de dermoabrasão.

Alternativamente, os compostos da invenção podem ser admi- nistrados antes do rompimento epidérmico. Em tais modalidades, o compos- to pode ser formulado para liberação controlada de modo que o composto terapeuticamente ativo seja liberado durante a re-epitelialização ou durante uma fase particular de re-epitelialização (por exemplo, como descrito acima.

5 O composto também pode ser formulado de modo que esse seja ativado por um estímulo endógeno ou exógeno (por exemplo, como descrito abaixo). Indução de re-epitelializacão

O estado de re-epitelialização pode ser induzido. Métodos para induzir esse estado incluem o rompimento da pele do indivíduo no local onde 10 os compostos da invenção serão administrados. O rompimento pode ser rea- lizado através de abrasão (por exemplo, fricção ou desgaste da pele), ou através de qualquer método que resulta em perturbação da intactilidade da epiderme ou camada epidérmica inclusive queimadura (por exemplo, indu- zindo uma queimadura de sol) ou perfurando a epiderme ou camada epi- 15 dérmica: O rompimento pode resultar tanto em remoção parcial como com- pleta da camada epidérmica no local almejado.

O rompimento da camada epitelial pode ser realizado, por e- xemplo, por meios mecânicos, químicos, eletromagnéticos, elétricos ou magnéticos. Os meios mecânicos podem ser realizados através do uso de, 20 por exemplo, lixa, uma roda de feltro, ultrassom, mistura acelerada de forma supersônica de solução salina e oxigênio, "remoção de fita" ou descolamen- tos.

Os meios químicos de rompimento da epiderme podem ser rea- lizados, por exemplo, utilizando fenol, ácido tricloracético ou ácido ascórbico. Os meios eletromagnéticos de rompimento da epiderme podem

ser realizados, por exemplo, pelo uso de um laser capaz de induzir lesão transepitelial (por exemplo, um laser Fraxel, um laser de CO2, ou um "laser excimer"). O rompimento também pode ser realizado através, por exemplo, do uso de radiação visível, infravermelha, ultravioleta, rádio ou raio X.

Os meios elétricos ou magnéticos de rompimento da epiderme

podem ser realizados, por exemplo, através da aplicação de uma corrente elétrica ou através de eletroporação. Os meios elétricos ou magnéticos tam- bém podem incluir a indução de um campo elétrico ou magnético. Por e- xemplo, uma corrente elétrica pode ser induzida na pele pela aplicação de um campo magnético alternado. Uma fonte de energia de radiofreqüência pode ser acoplada a um elemento de condução, e as correntes que são in- 5 duzidas irão aquecer a pele, resultando em uma alteração ou rompimento da pele. Nessa modalidade, nenhuma transferência de energia externa é ne- cessária para causar um rompimento.

Qualquer meio anteriormente mencionado de rompimento pode ser usado para induzir, por exemplo, uma queimadura, excisão ou micro- dermoabrasão.

Opcionalmente, a pele, após o rompimento epidérmico, não en- tra em contato com nenhuma substância durante um período de tempo (por exemplo, pomada, a bandagem ou um dispositivo) que é normalmente ad- ministrada a uma abrasão ou ferida para evitar infecção. Aqui a pele não 15 entra em contato com nenhuma substância até, por exemplo, o rompimento epidérmico curar (por exemplo, qualquer tempo entre 2 dias e 3 semanas). Alternativamente, a pele pode entrar em contato com um cilindro ou banda- gem (por exemplo, resultando em fluxo sanguíneo aumentado na pele rom- pida ou perda de água transdérmica reduzida ou transferência de massa 20 reduzida de gases na pele e da pele (por exemplo, oxigênio, dióxido de car- bono, vapor de água), transferência de calor reduzida da pele (por exemplo, resultando em uma temperatura aumentada da superfície cutânea) ou pres- são aumentada sobre a pele.

Antes do rompimento, a pele pode ser depilada ou epilada. A depilação ou epilação pode ser realizada através, por exemplo, de aplicação de cera, puxão, um material abrasivo, um laser, eletrolose, um dispositivo mecânico ou ácido tioglicólico.

O rompimento da epiderme pode ser induzido entre 3 a 12 dias (por exemplo, 4a 12, 5a 12, 4a11,6a11,6a10, 6a 9, 7a 8, 5 a 11, 5 a 10 ou 7 a 10 dias) antes da adição das composições da invenção.

Qualquer um dos métodos descritos acima pode ser usado para remover uma quantidade precisa de tecido epidérmico. Por exemplo, os mé- todos de abrasão descritos aqui podem ser usados para realizar:

• A remoção do estrato córneo através da remoção dos primei- ros 10 a 30 μηη de células cutâneas mortas.

• A remoção do estrato córneo e parte ou toda a epiderme ao remover os primeiros 30 a 100 μηι da pele. Esse não é profundo o bastante

para remover a glândula sebácea, protuberância, ou papila capilar de estru- turas de folículo existentes.

• A remoção do estrato córneo, a camada de epiderme, e parte da derme caem para aproximadamente 500 μίτι. Esse processo remove a

maior parte das glândulas sebáceas, que estão em uma profundidade abaixo de 500 μηη.

• A remoção do estrato córneo, a epiderme total, e parte da derme caem para aproximadamente 800 μηι. Esse processo remove a maior parte das glândulas sebáceas, e as regiões de protuberância, que estão em

uma profundidade abaixo de 800 μίτι. (Dunkin et al., Plastic Reconstructive Surgery, 119 (6), maio de 2007).

• A remoção do estrato córneo, a camada de epiderme, e parte da derme caem para aproximadamente 2000 a 4000 μηι. Esse processo re- move as glândulas sebáceas, as regiões de protuberância, e a maior parte

das papilas capilares, que estão em uma profundidade abaixo de 2000 μιτι.

• A remoção do estrato córneo, a camada de epiderme, e a ca- mada de derme resulta na remoção de até 5 a 7 mm de pele. Esse processo remove todas as estruturas dos folículos, inclusive a glândula sebácea, pro- tuberância e papila.

Os seguintes exemplos são apresentados para proporcionar aos

versados na técnica uma revelação e descrição completa de como os méto- dos e compostos reivindicados aqui são realizados, feitos e avaliados e são destinados para serem puramente exemplificativos da invenção e não pre- tendem limitar o escopo de daquilo que os inventores consideram como sua

invenção.

Exemplo 1: Depilação e abrasão epidérmica causam novamente a formação de folículos pilosos. Depilação e abrasão epidérmica. Os camundongos foram anes- tesiados com uma injeção de pentobarbital sódico antes de o pêlo na parte posterior ser cortado e depilado com Nair (Carter-Wallace, New York, NY), então a epiderme foi removida utilizando uma roda de feltro rotativa como 5 descrito por Argyris T, J. Invest. Dermathol. 75: 360 (1980). Após esfregar com 70% de etanol e secar sob uma lâmpada incandescente, as camadas basais e suprabasais em uma área de 1,5 cm2/cm da epiderme interfolicular foram removidas por abrasão cuidadosa com uma roda de feltro montada sobre um Dremel Moto-tool (Racinae, Wl). Após a abrasão, a pele estava 10 brilhante e lisa, e não havia sangue. Um dia depois, a área friccionada foi coberta por uma crosta de fibrina, que caiu após 3 a 7 dias, expondo a epi- derme recentemente regenerada. Um grupo de camundongos de controle foi sacrificado imediatamente após a abrasão para confirmar microscopicamen- te a remoção completa da epiderme interfolicular.

Imunoistoquímica. As amostras de pele foram fixadas em 10%

de formalina tamponada com PBS. Partes de parafina de seis mícrons de espessura foram cortadas e coloridas, quando aplicável, com anticorpos.

Marcação de BrdU. O protocolo descrito por Bickenbach e cole- gas (Bickenbach et al, Cell Tiss Kinet 19: 325-333, 1986; Bickenbach et al, 20 Exp Cell Res 244, 184-195, 1998) foi usado. Os camundongos foram injeta- dos com 50 miligramas por quilograma (mg/kg) de peso corporal de 5- bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) a cada 12 horas para um total de quatro inje- ções.

Resultados: uma área das costas de camundongos de 50 dias 25 de idade foi submetida à depilação e remoção da epiderme utilizando uma roda de feltro giratória. Quinze dias depois, placoides de HF, germes capila- res e outros sinais de neogênese de folículo estavam presentes (Figura 1; a seta indica um germe capilar). A morfologia dos folículos era similar ao de- senvolvimento do folículo embrionário. Para caracterizar adicionalmente a 30 proliferação nos novos folículos, a pele foi marcada com BrdU 60 minutos antes do sacrifício. Como mostrado na Figura 2, o padrão de proliferação era similar aos folículos em desenvolvimento no embrião. Essas descobertas demonstram que (a) o rompimento da epi- derme causa a geração de novos HF, e que essa geração de novos FIF po- de ocorrer (b) em indivíduos adultos e (c) durante o telogênio (os camun- dongos de 50 dias de idade estão no segundo estágio telógeno do ciclo capi- 5 lar).

Exemplo 2: Indução de uma grande ferida excisional. porém não uma pe- quena ferida perfurante. causa novamente a formação do folículo piloso.

Indução de ferida perfurante e excisional. As costas de camun- dongos de 21 dias de idade foram depiladas como descrito no Exemplo 1 e 10 esterilizadas com álcool, seguido por 1% de solução de iodo. As feridas per- furantes, 4 mm de diâmetro, foram induzidas utilizando uma pinça de biopsia dérmica, descendendo até, porém não através, fáscia muscular. As feridas excisionais eram de espessura completa e possuíam 1 cm de diâmetro; a pele e o panículo carnoso foram cortados utilizando tesouras cirúrgicas finas. 15 Resultados: para testar se a ferida poderia induzir a formação de

HF, as feridas perfurantes ou feridas excisionais foram induzidas em camun- dongos. Ambos os tipos de feridas apresentaram contração e re- epitelialização após a indução de ferida; entretanto, diferente dos camun- dongos que receberam feridas perfurantes, os camundongos que receberam 20 feridas excisionais também apresentaram a formação de cicatriz dentro de 10 dias de indução de ferida (Figura 3, painel esquerdo). Nenhum folículo estava evidente nesse ponto de tempo (Figura 3, painel direito). 12 dias após a indução de ferida, germes capilares, com morfologia similar a germes capi- lares fetais, foram observados no local da ferida, após a marcação de pulso 25 de BrdU (Figura 4). Diversos marcadores foram usados para verificar que as estruturas observadas eram HF. As estruturas apresentaram coloração com antiqueratina 17 (K 17), um marcador de HF (Figura 5), e coloração com fos- fatase antialcalina no ponto de tempo de 12 dias verificou que as estruturas possuíam fibroblastos contendo papila dérmica, como esperado para HF 30 (Figura 6; HF em estágios anteriores e posteriores são mostrados nos pai- néis esquerdo e direito, respectivamente).

Os HF gerados por indução de ferida foram adicionalmente ca- racterizados por comparação morfológica com HF embrionários, após a colo- ração com BrdU; uma clara correspondência em morfologia foi observada em vários estágios (Figura 7). Ademais, diversos marcadores de desenvol- vimento de HF embrionários, ou seja, Lef1, /int (Wnt) 10b, e drenagem sôni- 5 ca (Shh), também foram induzidos na neogênese de HF induzida por rompi- mento dérmico (EDIHN) (Figura 8). A coloração com BrdU adicional (Figura 9) e coloração de marcadores de HF S100A3 e S100A6 (Figura 10; painel esquerdo: corte tecidual paralelo ao eixo geométrico de HF; painel direito: vista em corte transversal de folículo) forneceu uma verificação adicional que 10 o desenvolvimento dos folículos EDIHN foi estritamente comparado com o desenvolvimento de HF embrionários.

Essas descobertas fornecem uma prova adicional que o rompi- mento da epiderme causa a geração de novos HF, e que essa geração de novos HF pode ocorrer (b) em indivíduos adultos e (c) durante o telogênio (os camundongos de 21 dias de idade estão no primeiro estágio telógeno do ciclo capilar).

Exemplo 3: Folículos pilosos induzidos por EDIHN geram pelos.

Nos 25 e 45 dias após a indução de feridas, os locais da ferida continham novos pelos (Figura 11, painéis esquerdo e direito, respectiva- mente). Novos pelos pareciam ser desprovidos de pigmentação, exceto quando a via wnt foi inibida, utilizando Dkk-1 (Dickkopf-1) durante os primei- ros nove dias após o ferimento (vide Exemplo 10).

Essas descobertas indicam que os HF induzidos por EDIHN fun- cionam normalmente; ou seja, são capazes de gerar pelos.

Exemplo 4: Os folículos pilosos EDIHN mantêm a capacidade de entrar no crescimento cíclico do cabelo.

Marcação de BrdU. BrdU (Sigma) em 50 mg/kg de peso corporal de foi injetado duas vezes por dia durante 3 dias começando 20 dias após o ferimento. BrdU foi detectado 40 dias após o ferimento (17 dias).

Lâmina microscópica e imunofluorescência. As lâminas micros-

cópicas de HF foram obtidas por incubação de pele nova com EDTA (20mM em PBS) a 37°C durante a noite, então separa-se a epiderme e derme. A epiderme foi então fixada em 10% de formalina durante 10 min, temperatura ambiente (TA). A derme foi fixada em acetona durante a noite, TA. Após en- xágüe com PBS, as membranas foram coloridas com anticorpos para imu- noistoquímica (esquematicamente mostradas na Figura 12) e foram repre- sentadas utilizando um microscópio confocal Leica.

Resultados: para determinar se os HF induzidos por EDIHN con- tinham níveis normais de células-tronco de HF, a pele do camundongo foi examinada para a presença de células de retenção por marcador 21 dias após a indução de ferida. A retenção de BrdU durante um longo período, sob essas condições, uma das marcas de células-tronco de HF. Números nor- mais e a disposição de células de retenção por marcador (na protuberância do HF) foram observados (Figura 13). Para verificar que as células de reten- ção por marcador eram células-tronco de HF, camundongos K15-eGFP fo- ram utilizados. Nesses camundongos, eGFP (proteína verde fluorescente aumentada) é expressa a partir do promotor K15; assim, a expressão de eGFP identifica as células-tronco de HF. Como mostrado na Figura 14 A, as células de expressão de eGFP foram observadas nos corte teciduais (lado direito) de folículos pilosos recentemente formados 35 dias após a indução de ferida. As células que expressam eGFP também foram observadas nas membranas da epiderme (painel esquerdo inferior) indicando a conversão de células epidérmicas em células com características de células-tronco de folí- culo piloso. O painel ([inferior, segundo da esquerda] é igual ao painel [infe- rior, esquerdo], porém visualizado sob Iuz branca). Essa descoberta mostra que as células de retenção por marcador apresentaram propriedades de cé- lulas-tronco de HF.

Para determinar se o ciclo de HF induzido por EDIHN estava normal, montagens foram preparadas a partir de camundongos adicionais em 35, 38 e 45 dias após o ferimento. Como mostrado na Figura 14B, os HF induzidos por EDIHN entraram na fase de descanso, telogênio, e então en- traram novamente em um novo estágio de anagênio.

Em suma, as descobertas desse Exemplo mostram que HF in- duzidos por EDIHN contem células-tronco de HF, conforme os HF gerados de forma embrionária. A presença das células-tronco de HF mostra que HF induzidos por EDIHN mantem a capacidade de entrar no crescimento cíclico do cabelo da mesma maneira que o HF gerado de forma embrionária. As descobertas também mostram que a ferida induz as células epidérmicas a 5 assumirem um estado de célula-tronco de folículo piloso (que expressa K15- eGFP). Esse modelo é mostrado esquematicamente na Figura 15. As des- cobertas de Exemplos 2, 3 e 4 mostram que HF induzidos por EDIHN são completamente funcionais e, assim, capazes de restaurar o crescimento do cabelo em um indivíduo.

Exemplo 5: EDIHN induz novos folículos pilosos em camundongos no está- gio de teloqênio do ciclo capilar.

Para determinar se EDIHN induziu novos folículos pilosos em camundongos feridos no estágio telógeno do ciclo capilar, os camundongos de 21 dias de idade foram submetidos a EDIHN utilizando uma ferida excisi- 15 onal de 1 cm, como descrito no Exemplo 2. A pele foi então examinada por análise de membrana para indicações de novos HF. Como mostrado na Fi- gura 16, após 11 dias, novos HF não estavam evidentes por exame macros- cópico (painel superior), coloração por AP da derme (painel inferior esquer- do), ou coloração por K17 da epiderme (painel inferior direito). Após 14 dias, 20 como mostrado na Figura 17, as células da papila dérmica foram detectadas na derme (painel esquerdo) e células-tronco de HF na epiderme (painel direi- to), demonstrando que novos folículos estavam sendo formados. Após 17 dias, os novos folículos estavam mais desenvolvidos, como mostrado pelo exame da derme e epiderme (Figura 18, painéis esquerdo e direito, respecti- 25 vãmente). Esse método induziu a formação de uma média de 49 novos folí- culos na ferida, um número que foi constante durante três experimentos se- parados, como mostrado na Tabela 2.

Para determinar se EDIHN induziu novos folículos pilosos em camundongos feridos no estágio telógeno do ciclo capilar, os camundongos de 21 dias de idade foram submetidos a EDIHN utilizando uma ferida excisi- onal de 1 cm, como descrito no Exemplo 2. A pele foi então examinada por análise de membrana para indicações de novos HF. Como mostrado na Fi- gura 16, após 11 dias, novos HF não estavam evidentes por exame macros- cópico (painel superior), A coloração com AP da derme (painel inferior es- querdo), ou coloração com K17 da epiderme (painel inferior direito). Após 14 dias, como mostrado na Figura 17, as células da papila dérmica foram detec- 5 tadas na derme (painel esquerdo) e as células-tronco de HF na epiderme (painel direito), demonstrando que novos folículos estavam sendo formados. Após 17 dias, os novos folículos estavam mais desenvolvidos, como mostra- do por exame da derme e epiderme (Figura 18, painéis esquerdo e direito, respectivamente). Esse método induziu a formação de uma média de 49 no- 10 vos folículos na ferida, um número que foi constante durante três experimen- tos separados, como mostrado na Tabela 2. Tabela 2. Resultados de três experimentos separados realizados em camundongos de 21 dias de idade. Amostra Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 1 24 70 55 2 29 52 25 3 27 85 53 4 102 25 80 5 53 27 23 Média dos experimen¬ Desvio padrão dos tos experimentos Média 47 51,8 47,2 48,67 2,71 Desvio Padrão 32,8 26,3 23,7 As descobertas desse Exemplo demonstram que EDIHN é ca- paz de induzir a formação de novos HF em camundongos no estágio telóge- no do ciclo capilar, apesar do fato que esses camundongos não contem HF no estágio anágeno durante a ferida.

Exemplo 6: Em camundongos adultos, a indução de anaqênio aumenta a eficácia de EDIHN.

O experimento descrito no Exemplo 5 foi repetido com camun- dongos de idades diferentes, e, portanto, em estágios diferentes do ciclo ca- pilar. Para garantir que ocorreu a cicatrização da ferida, feridas maiores fo- 10 ram induzidas nos camundongos mais velhos. Como mostrado na Tabela 3, os camundongos adultos em telogênio, tais como, camundongos de 8 se- manas de idade, apresentaram eficiências inferiores de formação de HF por EDIHN.

Tabela 3. Eficiência de formação de HF por EDIHN em camundongos adul- tos em vários estágios do ciclo capilar.

Idade Tamanho Dias após a Camundongos que Ciclo capilar da ferida ferida apresentam EDIHN 3 semanas 1 cm 20 25/25 (100%) Telogênio 4 semanas 1 cm 20 5/5 (100%) Anagênio precose semanas 1 cm 20 1/2 (50%) Anagênio 8 semanas 1,5 cm 30 16/35 (46%) Telogênio 14 semanas 1,5 cm 30 1/2 (50%) N/A* semanas 1,5 cm 30 2/2 (100%) N/A* * O segundo telogênio dura aproximadamente 40 dias em camundongos. Assim, os camundongos de 14 semanas de idade e 20 semanas de idade continham uma mistura de HF telógeno e anágeno.

Para determinar se a indução experimental de anagênio aumen- 20 tou a eficiência de EDIHN, os camundongos de 8 semanas de idade foram depilados vários dias antes da indução da ferida. Como mostrado na Figura 19, as feridas fecharam similarmente sejam ou não precedidas por depila- ção. Como mostrado na Figura 20A-B, os camundongos depilados apresen- taram EDIHN aumentado relativo aos camundongos não-depilados mostra- dos no Exemplo anterior por um fator de 11 vezes.

As descobertas desse Exemplo demonstram que a indução de anagênio aumenta EDIHN. Ademais, essas descobertas mostram que E- DIHN é capaz de não só formar novos HF, como também de ativar o anagê- nio em HF preexistentes no estágio telógeno.

Exemplo 7: EDIHN induz novos folículos pilosos em pele humana.

Enxerto: O escalpo de adulto humano descartado da área pré- auricular obtida a partir de cirurgia plástica foi enxertado em camundongos imunodeficientes (scid). O enxerto foi enfaixado e permitido para cicatrizar, então foi usado no estudo de cicatrização de feridas 3 meses após o enxer- to.

Resultados: para determinar se a pele humana respondeu ao EDIHN como a pele do camundongo, a pele humana foi enxertada em ca- mundongos SCID (imunodeficientes) e submetida à depilação por puxão e 15 indução de ferida três dias depois. Sete dias após a indução de ferida, a formação de novos HF foi observada na pele humana (Figura 21A; a seta indica novos HF) por coloração com hematoxilina e eosina de cortes tecidu- ais parafinizados.

Em experimentos adicionais, a pele humana adulta foi enxertada em camundongos, abradada e examinada 7 dias após a abrasão. Novos HF foram gerados na pele humana, esses simularam a formação de folículo pi- loso normal durante o desenvolvimento fetal, como evidenciado por colora- ção com S100A6 ou S100A4 (Figura 21B).

Os resultados desse Exemplo mostram que EDIHN pode ser usado para gerar o crescimento do cabelo em pele humana como para pele de camundongo.

Exemplo 8: Vias moleculares ativadas durante a ativação de células-tronco de HF.

Isolamento e ativação de células-tronco de HF. Os camundon- gos K15-eGFP foram depilados para induzir a formação de novos HF. As células-tronco de folículos pilosos ativadas foram isoladas de camundongos K15-eGFP utilizando separação celular ativada por fluorescência (FACS) dois dias após a depilação e 5 mg (microgramas) totais de RNA da popula- ção celular foram isolados, reversamente transcritos e hibridizados em uma matriz Affimetrix (Santa Clara, Califórnia) chip MG_U74v2. As imagens feitas a varredura foram analisadas utilizando Affimetrix Microarray Suite 5.0 e 5 software GeneSpring (Silicon Genetics) para detectar diferenças de modula- ção entre células-tronco de HF ativadas (HFSCs) e HFSCs não-ativadas (te- logênio). Os valores foram normalizados antes de computar diferenças de modulação entre amostras não-ativadas "linha-bs" e ativadas ("expt").

Resultados: para identificar as vias moleculares superreguladas durante a ativação de célula-tronco de HF, as células-tronco de HF ativadas foram isoladas, e os padrões de expressão genética das células foram anali- sados para detectar as transcrições superreguladas. As transcrições (Acces- sion Nos. AW047343, AF053235, M26005, AA681998, AF057156, AI845584, AA614971, AV374591, U04443, I07836, M21285, V00756, 114296, X16490, AW120868, C78850, D67076, M61007, C85523, AW122030, U57524, U05809, AW212475, V00835, AV374868, M21285, U74683, X61800, U20735, U19118, AW049031, M93275, AB000713, U20735, U83148, L10244, U88328, X82786, AW122523, AI642048, L07264, M15668, AI047508, AJ001418, AI838080, AF072127, X80417, AI847051, U09504, U22033, AF033034, AA960603, U47737, L00039, D21099, AF026481, J04596, X81580, AI314958, AF058798, AW046627, AI848050, AF065441, AF022992, AF064088, AI787713, AI853531, X14678, AI854358, X67668, K02236, X51829, AW048937, AV139913, M32490, AI121305, U35374, X15643, AI849109, U70132, M13805, AV138783, K02927, X07699, X57800, M35247, AI553024, X16995, AF038562, Il 1666, U40930, D26090, AI787627, M33988, AI845182, AA619207, AW125783, J04103, D90146, AI563854, AF017128, X67644, AA980204, AI843232, U59807, Al 152659, AI850090, AF064635, AI843106, AF033186, Z50159, X78683, X68193, A- A062013, AI465965, U50413, AW120502, X62940, U60020, L32752, AI840013, AB020424, AI848453, AU040563, X89749, AW125390, X05862, AW046181, U10118, AW212775, AI846302, M22998, X64837, AI843119, AI837786, U41465, U70494, D17666, X14897, AJ006289, X12944, AW061302, U67328, ΑΙ604314, ΑΙ845121, AW047756, ΑΙ838021, AW122893, Μ59821, Μ13805, ΑΙ845886, Χ53157, U191 18, AF062071, U10404, U07634, Χ04663, Χ61232, Χ14309, U42386, U51126, AF093853, Ζ19521, U04354, Μ35244, AW121930, ΑΙ852632, U70475, U09659, 5 AW124785, AF071315, D49733, Χ80899, D83203, Ζ20410, ΑΙ839906, ΑΙ843448, AW125336, AW123802, ΑΙ835771, Χ53584, Μ32599, AF035644, Ι00629, AW125380, U68564, AW125346, Χ61232, D20333, ΑΒ025218, U84411, Μ62362, ΑΑ032310, Μ94087, ΑΙ847609, ΑΙ853294, Μ33934, Χ16202, ΑΙ661431, ΑΙ839109, ΑΙ849135, Μ32459, ΑΙ841389, Χ03039, 10 AW049795, D87691, All 17211, Ι00520, ΑΑ638002, Ζ22661, Χ99644, ΑΙ843895, Μ38724, AW122989, ΑΙ844810, ΑΑ940430, Μ38381, AF014371, Ζ30939, U28208 e AV218217) foram superreguladas pelo menos 2 vezes nas células-tronco de HF ativadas relativas às células antes da ativação. Em alguns casos, a seqüência é uma seqüência genômica que contem a se- 15 quência da transcrição. Os dados que pertencem à superregulação das transcrições e informações adicionais sobre essas são fornecidos na Figura 22.

Assim, as transcrições identificadas nesse Exemplo, as proteí- nas que essas codificam, e as vias onde as proteínas participam, contribuem 20 significativamente para a indução de células epidérmicas para diferenciação em células-tronco de HF. A ativação das transcrições, proteínas e vias mos- tradas na Tabela 4 é então um método para aumentar EDIHN. Ademais, a inibição das transcrições, proteínas e vias mostrada na Tabela 4 é assim um método para prevenir EDIHN e eliminar folículos pilosos. Ademais, a inibição 25 das transcrições, proteínas e vias mostrada na Tabela 5 é um método para aumentar EDIHN. Ademais, a ativação das transcrições, proteínas e vias mostradas na Tabela 5 é assim um método para aumentar EDIHN.

Exemplo 9: Vias moleculares ativadas durante a indução de células epidér- micas para diferenciação em células-tronco de HF.

O padrão de expressão genética de células-tronco de HF foi

analisado como descrito no Exemplo 8 e comparado com queratinócitos ba- sais não-protuberantes. 157 genes foram expressos de maneira diferencial nas células-tronco de HF, como examinado por análise de microarranjo e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Um grupo de genes selecionados com expressão aumentada em células-tronco de HF é mostra- do na Tabela 4. Um grupo de genes selecionados com expressão reduzida

em células-tronco de HF é mostrado na Tabela 5.

Tabela 4. Genes superregulados em células-tronco de HF. Os números en- tre parênteses são o aumento em vezes como determinado por PCR em tempo real quantitativa.

Nome de Gene/Nome GenBk Aumento de Proteína Acesso # em vezes Cd34/Cd 34 antígeno Al847784, proteínas de super¬ 43 (189) AI173145 fície celular S100a4/S100A4 (mts) Z15986 Relacionado com 35 (144) cálcio Proteína Id2 helix- AF077861 Fatores de transcri¬ 11 (25) loop-helix ção e genes relacio¬ nados Id4 AJ001972 Fatores de transcri¬ 4(12) ção e genes relacio¬ nados Peg3/Proteína de zin¬ AF038939 Fatores de transcri¬ 12 co de gene expresso ção e genes relacio¬ de forma padrão 3 nados Fz2/Frisada 2 AW123618 Fatores de Cresci¬ 9(17) mento, receptores e genes relacionados Dkk3/Dickkopf 3 AJ243964 Fatores de Cresci¬ 6 (22) mento, receptores e genes relacionados Sfrpl/ Proteína rela¬ U88566 Fatores de Cresci¬ 6 cionada frisada secre- mento, receptores e tada 1 genes relacionados Dab2/Homólogo desa¬ U18869 Fatores de Cresci¬ 15 tivado 2 mento, receptores e genes relacionados Nome de Gene/Nome GenBk Aumento de Proteína Acesso # em vezes Cktsfl b1/Gremlina, AF045801 Fatores de Cresci¬ 12 (12) superfamília de nó de mento, receptores e citeína 1, BMP anta¬ genes relacionados gonista 1 Fgfrl/ Fator de cres¬ U22324 Fatores de Cresci¬ 10 cimento de fibroblasto mento, receptores e receptor 1 genes relacionados Fgf 1/ Fator de cresci¬ M30641 Fatores de Cresci¬ 10 mento de fibroblasto 1 mento, receptores e genes relacionados Gpr49/Receptor aco¬ AF110818 Fatores de Cresci¬ 64 (377) plado por proteína G mento, receptores e 49 FEX genes relacionados Igfbp5/ Proteína de L12447 Fatores de Cresci¬ 37 ligação de fator de mento, receptores e crescimento tipo insu¬ genes relacionados lina 5 Myoc/Proteína gluco- AF041335 Fatores de Cresci¬ 111 corticoide induzida por mento, receptores e rede trabecular genes relacionados Itm2a/E25 putativa L38971 Fatores de Cresci¬ 30 proteína de membra¬ mento, receptores e na integral genes relacionados Eps8/ Substrato de L21671 Fatores de Cresci¬ 15 via de receptor de mento, receptores e fator de crescimento genes relacionados epidérmico 8 Fyn/Fyn proto- M27266 Fatores de Cresci¬ 10 oncogênio mento, receptores e genes relacionados Co 16a 1 /Procol-Iagen, X66405 Estruturalmente re¬ 36 tipo VI, alfa 1 lacionado Tnc/Tenascin C AV230686 Estruturalmente re¬ 17 X56304 lacionado Krt2-6a/ Complexo de K02108 Estruturalmente re¬ 10 queratina, básico, ge¬ lacionado ne 6a (queratina 6a) Nome de Gene/Nome de Proteína GenBk Acesso # Aumento em vezes Canal de potássio, subfamília K, elemen- to 2 AI849601 Relacionado com canal 14 Skd3/ Supressor de K + defeito de transpor- te 3 AI837887 Relacionado com canal 4 Clic4/ Canal intracelu- lar de cloreto 4 (mito- condrial) AI845237 Relacionado com canal 3 Col 18a 1 /Endostatina (alfa 1 colágeno (XVII- I)) L22545 Relacionado com canal 5

Tabela 5. Genes infra-regulados em células-tronco de HF

Nome de Gene/Nome de Proteína GenBk Acesso # Aumento em vezes GNA-14 Subunidade alfa de proteína G de camundongo (GNA- 14) M80631 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 32 Ly6/Complexo de an- tígeno linfócito 6 X04653 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 12 Bmp4/Proteína mor- fogenética óssea 4 L47480 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 11 IL 1r2/ Receptor de interleucina, tipo Il AV223216 X59769 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 11 Sítio de integração 3a MMTV relacionado com Wnt3a/vias de sinalização X56842 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 4 Il12rb2/ Receptor de interleucina 12, beta 2 U64199 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 3 Nome de Gene/Nome de Proteína GenBk Acesso # Aumento em vezes Sítio de integração 10a MMTV relaciona- do com Wntl Oa/vias de sinalização U61969 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 3 lfngr2/Precursor de receptor interferon- gama M28233 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 3 Fgfbpl/Proteína de ligação de fator de crescimento de fibro- blasto 1 AF065441 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 3 Klf5/ Fator tipo Krup- pel 5 AA611766 Fatores de cresci- mento, receptores e genes a jusante 5 Gata3/GATA Proteína de ligação 3 X55123 Fatores de transcri- ção e genes relacio- nados 4 Simulado por ácido retinoico, proteína básica 14, proteína basic-helix-loop-helix Y07836 Fatores de transcri- ção e genes relacio- nados 3 Mki67/ Antígeno iden- tificado por anticorpo monoclonal Ki67 X82786 Ciclo celular relacio- nado 4 Cks2/CDC28 subuni- dade reguladora de proteína quinase, su- bunidade reguladora 2 AA681998 Ciclo celular relacio- nado 4 Ccng2/Ciclina G2 U95826 Ciclo celular relacio- nado 3 Prcl/ Regulador de proteína de segmento de DNA citocinese Chr 7 AA856349 Ciclo celular relacio- nado 3

Assim, as transcrições identificadas nesse Exemplo, as proteí-

nas que essas codificam e as vias onde as proteínas participam, contribuem significativamente para a indução de células epidérmicas para diferenciação em células-tronco de HF. A ativação das transcrições, proteínas e vias mos- tradas na Tabela 4 é então um método para aumentar EDIHN. Ademais, a inibição das transcrições, proteínas e vias mostrada na Tabela 4 é assim um método para prevenir EDIHN e eliminar folículos pilosos. Ademais, a inibição das transcrições, proteínas e vias mostrada na Tabela 5 é um método para aumentar EDIHN. Ademais, a ativação das transcrições, proteínas e vias mostradas na Tabela 5 é assim um método para aumentar EDIHN. Exemplo 10: Expressão de inibidores de WNT-1 durante os primeiros nove dias após o ferimento causa a pigmentação de novos HF.

Nesse Exemplo, os camundongos duplamente transgênicos que expressam tanto tetO-Dkkl como K5-rtTA foram utilizados. Quando esses camundongos são alimentados com reação formulada com 1 g/kg de doxici- clina (BioServ, Laurel1 MD), esses expressam Dkkl, sob o controle do promo- tor K5, na epiderme basal. Os camundongos de controle também receberam doxiciclina, porém esses eram K5-rtTA negativos e assim não expressaram Dkk1.

Resultados: uma ferida de 1 cm2 foi induzida nas costas dos camundongos duplamente transgênicos de 21 dias ou 50 dias de idade. Os camundongos foram alimentados com ração contendo doxiciclina imediata- mente após o ferimento para induzir a expressão de Dkkl, e então a doxici- clina foi descontinuada após o término da re-epitelialização 9 dias após o ferimento. A expressão de Dkkl inibe a atividade de Wnt, que por sua vez, induz a pigmentação do folículo. 22 dias após o ferimento, os HF pigmenta- dos foram observados na pele cortada após preparar a camada epidérmica (Figura 23 A-B). Os camundongos de controle eram desprovidos de HF pig- mentados (Figura 24).

Em outros experimentos, a expressão continuada de Dkkl após o período de 9 dias inibiu a formação de novos HF.

As descobertas desse Exemplo mostram que o HF pigmentado pode ser produzido ao suprimir a expressão de Wnt 1 ou ao induzir a ex- pressão de Dkkl durante o período de re-epitelialização, então induz-se a expressão de Wnt1. Ademais, as descobertas desse Exemplo mostram que os fatores que inibem a formação de folículo piloso neonatal (por exemplo, Dkkl) também inibem EDIHN, desse modo sustenta-se ainda a noção que os folículos pilosos formados por EDIHN são similares aos folículos pilosos normais.

Exemplo 11: Inibição de EDIHN por injeção de fator de crescimento epidér- mico.

Os camundongos de 21 dias de idade foram feridos como des- crito nos Exemplos anteriores. Começando a partir do 11° dia após o feri- mento, um ponto de tempo correspondente ao ponto no qual a ferida foi re- centemente reepitelializada, 10 ml_ de 1 mg/ml de EGF foram injetados no leito da ferida. EGF foi injetado uma vez ao dia após esse ponto durante um total de 5 dias. Três dias depois, a pele foi coletada e as análises EDIHN de membrana foram realizadas. EGF impediu a formação de HF como avaliado por morfologia macroscópica. Ademais, as membranas de pele de controle e tratadas foram analisadas com imunocoloração de anticorpo anti-K17. Todos os camundongos injetados com EGF (n=4) não apresentaram nova forma- ção de HF (Figuras 25 A-B), enquanto os camundongos de controle (n=2) apresentou muitos HF novos, como esperado. (Figuras 25 C-D). Em um experimento adicional, EGF recombinante (1 micrograma

(mcg)/microlitro (mel)) foi injetado 11, 13 e 15 dias após o ferimento. A pele foi coletada 18 dias após o ferimento e colorida com K17 e fosfatase alcali- na. Novamente, a administração de EGF inibiu EDIHN.

As descobertas desse Exemplo mostram que EGF inibe a for- mação de HF. Assim, a inibição de EGF, EGFR ou uma das vias onde esses participam aumenta a formação de HF induzida por EDIHN. Exemplo 12: Aumento de EDIHN por inibição de receptor EGF.

Para determinar o efeito de administração de inibidores de re- ceptor EGF sobre DIHN, o inibidor AG1478 (150 μΜ em volume de 10 μΙ_) foi administrado como uma única injeção 11 dias após o ferimento incisional (1 cm2) no meio da ferida próxima à superfície da pele. A administração do ini- bidor de receptor EGF resultou na geração de mais e maiores folículos pilo- sos comparados com os camundongos de controle que foram apenas feridos (Figura 26A). Como mostrado na Figura 26B, grandes folículos pilosos se desenvolveram na área ferida nos camundongos injetados com AG1478. Painel esquerdo: epiderme colorida com K 17, com três folículos pilosos grandes próximos um do outro. Painel direito: derme colorida com AP com grandes áreas de papila dérmica coalescente.

As descobertas desse Exemplo confirmam os resultados do E- xemplo anterior, e mostram que mais e maiores HF podem ser gerados quando EDIHN compreende, ou é seguido por, administração de inibidores de EGFR, ou com compostos com um mecanismo de ação similar; por e- xemplo, proteína Hedgehog e antagonistas de androgênio. Exemplo 13: Aumento de EDIHN pela expressão de um ativador de B- catenina.

Para determinar o efeito de administração de ativadores de β- catenina sobre EDIHN, os camundongos transgênicos K14-Wnt7, que su- perexpressam o ativador de via β-catenina, Wnt7, na epiderme, foram sub- metidos a EDIHN, então a formação de HF foi medida 19 dias após o feri- mento. Em cada um dos 2 experimentos separados, com camundongos de 4 semanas de idade e 3 semanas de idade, os camundongos transgênicos desenvolveram significativamente números maiores de HF comparados com camundongos de controle, não-transgênicos (Figura 27 A-C).

Assim, a administração de ativadores β-catenina resulta em um aumento em EDIHN. As descobertas dos Exemplos 11 a 13 mostram que novos HF podem ser gerados ao (a) romper a epiderme; e (b) administrar um fator que promove a diferenciação de uma célula epidérmica não- comprometida em uma célula de HF. Exemplo 14: Aumento de EDIHN por administração de FGF.

Para determinar o efeito de fator de crescimento de fibroblasto (FGF) sobre EDIHN, FGF recombinante é administrado 11 dias após o feri- mento incisional, como descrito no Exemplo 11. A administração de FGF aumenta a formação de HF, mostrando que novos HF podem ser gerados ao (a) romper a epiderme; e (b) administrar FGF, um FGF de codificação de nucleotídeo, ou um fator que aumenta a sinalização por FGF. Exemplo 15: Aumento de EDIHN por administração de EDAR.

Para determinar o efeito de fator de crescimento de fibroblasto (FGF) sobre EDIHN1 os camundongos transgênicos K14-Eda-A1, que super- expressam (ectodisplasina-A1) Eda-Al na epiderme, são submetidos a E- DIHN1 então a formação de HF é avaliada 19 dias após o ferimento, como descrito no Exemplo 13. Os camundongos transgênicos desenvolvem signi- ficativamente números maiores de HF comparados com camundongos de controle, não-transgênicos, mostrando que novos HF podem ser gerados ao (a) romper a epiderme; e (b) administrar um fator que aumenta a sinalização por ectodisplasina.

Exemplo 16: Aumento de EDIHN por administração de minoxidil.

Para determinar o efeito de minoxidil sobre EDIHN, FGF recom- binante é administrado 11 dias após a ferida incisional, como descrito no Exemplo 11. A administração de minoxidil aumenta a formação de HF1 mos- trando que os novos HF podem ser gerados ao (a) romper a epiderme; e (b) administrar um minoxidil.

Exemplo 17: Remoção de HF por abrasão e administração de EGF.

As regiões de suporte capilar da epiderme de camundongos são abradadas, como descrito no Exemplo 1, então administra-se EGF recombi- nante, como descrito no Exemplo 1. Esse método impede o recrescimento de pelo nas áreas abradadas, mostrando que o pelo pode ser removido ao (a) romper a camada epidérmica; e (b) administrar EGF, um EGF de codifi- cação de nucleotídeo, ou um fator que aumenta a sinalização por EGF. Outras Modalidades

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente menciona- dos nesse relatório descritivo estão aqui incorporados a título de referência com a mesma abrangência como se cada publicação ou pedido de patente estivesse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

Embora a invenção seja descrita em conjunto com as modalida- des especificas dessa, será entendido que essa é capaz de modificações adicionais e esse pedido pretende abranger quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente descrição que estão dentro da prática co- nhecida ou comum da técnica à qual a invenção pertence e pode ser aplica- da aos recursos essenciais apresentados e resulta no escopo das reivindi- cações.

Claims (80)

1. Composição que compreende de 0,001% a 0,1% (p/v) de um inibidor de EGFR de molécula pequena formulado para administração tópica, em que o dito inibidor de EGFR é um heterociclo contendo nitrogênio não- naturalmente ocorrente de menos de cerca de 2.000 dáltons, ou um metabó- Iito desse.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, que compre- ende adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável seleciona- do entre um antioxidante, um agente emulsificante, um agente gelificante, um hidrocoloide, um agente de reticulação e um plastificante.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um antioxidante selecionado do grupo que consiste em tióis, sulfoximinas, quelantes de metal, ácidos graxos, vitaminas, fenóis, estilbenos, ácido úrico, manose, selênio e propil gaiato.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que o dito antioxidante é vitamina E.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um excipiente emulsificante sele- cionado a partir do grupo que consiste em ácidos graxos polietoxilados, diés- teres de ácido graxo PEG, monoéster de ácido graxo PEG e misturas de éster e diéster, ésteres de ácidos graxos com glicerol polietileno glicol, pro- dutos de transesterificação de álcool-óleo, ácidos graxos poliglicerinados, ésteres de ácidos graxos com propileno glicol, misturas de ésteres com gli— cerol-ésteres propileno glicol, mono- e digliceríideos, esterol e derivados de esterol, ésteres de ácidos graxos de sorbitano polietileno glicol, alquil éteres de polietileno glicol, ésteres de açúcar, alquil fenóis de polietileno glicol, co- polímeros de bloco polioxietileno-polioxipropileno, ésteres de ácidos graxos de sorbitano, ésteres de ácidos graxos de álcool inferiores, tensoativos tôni- cos, ésteres de tocoferol e ésteres de esterol.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um agente gelificante.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um hidrocoloide.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um agente de reticulação.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um plastificante.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, que compre- ende adicionalmente um agente biologicamente ativo adicional selecionado entre um anti-histamínico, um anti-inflamatório, um retinoide, um antiandro- gênico, um imunossupressor, um abridor de canal, um antibiótico, e um an- timicrobiano.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, onde o dito agente biologicamente ativo adicional é um anti-histamínico selecionado a partir do grupo que consiste em mepiramina, difenidramina e antazolina.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito agente biologicamente ativo adicional é um anti-inflamatório selecionado a partir do grupo que consiste em corticosteroides, NSAIDs e inibidores COX-2.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito agente biologicamente ativo adicional é um retinoide selecionado a partir do grupo que consiste em ácido 13-cis-retinoico, adapaleno, ácido retinoico todo-trans e etretinato.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito agente biologicamente ativo adicional é um antiandrogênico selecionado a partir do grupo que consiste em finasterida, flutamida, diazóxido, 11 alfa- hidroxiprogesterona, cetoconazol, RU58841, dutasterida, fluridil e QLT-7704.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito agente biologicamente ativo adicional é um imunossupressor seleciona- do a partir do grupo que consiste em ciclosporina, tacrolimo; rapamicina, e- verolimo e pimecrolimo.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito agente biologicamente ativo adicional é um abridor de canal selecionado a partir do grupo que consiste em minoxidil, diazóxido e fenitoína.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito agente biologicamente ativo adicional é um antimicrobiano selecionado a partir do grupo que consiste em benzoato de benzila, cloreto de benzalcô- nio, ácido benzoico, álcool benzílico, butilparabeno, etilparabeno, metilpara- beno, propilparabeno, metacresol canforado, fenol canforado, hexilresorci- nol, cloreto de metilbenzetônio, cetrimida, clorexidina, clorobutanol, clorocre- sol, cresol, glicerina, imiduréia, fenol, fenoxietanol, feniletilálcool, acetato fe- nilmercúrico, borato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, sorbato de potás- sio, benzoato de sódio, proprionato de sódio, ácido sórbico e tiomersal.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 1, que compre- ende adicionalmente um antiandrogênico e um abridor de canal.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, em que o dito antiandrogênico é finasterida e o dito abridor de canal é minoxidil.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita composição é formulada como um creme, loção, bastão, pomada, gel, spray, espuma, adesivo, aerossol, curativo de ferimentos ou pastilha.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é selecionado entre leflunomida, ge- fitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, vandetanib, CL-387785, PK1166, peliti- nib, HKI-272 e HKI-357.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é gefitinib.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 21, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é erlotinib.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 21, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é leflunomida.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é o metabólito leflunomida e A771726.

26. Kit que compreende (i) uma composição compreendendo de 0,000001% a 10% (p/v) de um inibidor de EGFR de molécula pequena for- mulado para administração tópica, em que o dito inibidor de EGFR é um he- terociclo contendo nitrogênio não-naturalmente ocorrente de menos de cerca de 2.000 dáltons, ou um metabólito desse; e (ii) instruções para aplicar a dita composição à pele de um indivíduo com necessidade de gerar folículos pilo- sos ou estimular o crescimento de cabelos.

27. Kit que compreende (i) uma composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25; e (ii) instruções para aplicar a dita composição à pele de um indivíduo.

28. Kit, de acordo com a reivindicação 27, que compreende adi- cionalmente instruções para aplicar a dita composição à cabeça de um indi- víduo.

29. Kit que compreende (i) uma composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25; e (ii) instruções para aplicar a dita composição à pele de um indivíduo com necessidade de gerar folículos pilo- sos ou estimular o crescimento de cabelos

30. Kit, de acordo com a reivindicação 29, que compreende adi- cionalmente instruções para aplicar a dita composição à pele de um indiví- duo uma ou duas vezes ao dia.

31. Kit, de acordo com a reivindicação 30, que compreende adi- cionalmente instruções para aplicar a dita composição à pele de um indiví- duo durante pelo menos 2 dias consecutivos.

32. Kit, de acordo com a reivindicação 31, que compreende adi- cionalmente instruções para aplicar a dita composição à pele de um indiví- duo durante pelo menos 5 dias consecutivos.

33. Kit que compreende (i) uma composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25; e (ii) instruções para administração da dita composição à pele de um indivíduo, em que a dita pele foi submetida à re-epitelialização menos de duas semanas antes da primeira administra- ção da dita composição.

34. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, 29, ou 33, em que a dita composição compreende de 0,001% a 0,1% (p/v) de um inibidor de EGFR de molécula pequena.

35. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, .29, ou 33, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é selecio- nado entre leflunomida, gefitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, vandetanib, CL-387785, PKI 166, pelitinib, HKI-272 e HKI-357.

36. Kit, de acordo com a reivindicação 35, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é gefitinib.

37. Kit, de acordo com a reivindicação 35, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é erlotinib.

38. Kit, de acordo com a reivindicação 35, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é leflunomida.

39. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27,29, ou 33, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é o metabó- Iito leflunomida A771726.

40. Kit que compreende uma composição formulada para admi- nistração tópica que compreende (i) um inibidor de EGFR de molécula pe- quena selecionado entre leflunomida, gefitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, vandetanib, CL-387785, PKI166, pelitinib, HKI-272 e HKI-357; e (ii) um agen- te biologicamente ativo adicional selecionado entre um anti-histamínico, um anti-inflamatório, um retinoide, um antiandrogênico, um imunossupressor, um abridor de canal, um antibiótico e um antimicrobiano.

41. Kit, de acordo com a reivindicação 40, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é gefitinib ou erlotinib e o dito agente biolo- gicamente ativo adicional é um abridor de canal selecionado entre minoxidil, diazóxido e fenitoína.

42. Kit, de acordo com a reivindicação 40, em que a dita compo- sição é formulada como um creme, loção, bastão, pomada, gel, spray, es- puma, adesivo, aerossol, curativos de ferimentos ou pastilha.

43. Kit que compreende (i) uma composição compreendendo um anticorpo EGFR; e (ii) instruções para administrar o dito anticorpo a um indi- víduo com necessidade de gerar folículos pilosos ou estimular o crescimento de cabelos.

44. Kit, de acordo com a reivindicação 43, em que o dito anticor- po EGFR é selecionado entre zalutumumab, cetuximab, IMC 11F8, matuzu- mab, SC 100, ALT 110, PX 1032, BMS599626, MDX 214 e PX 1041.

45. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, 29, 33 ou 43, que compreende adicionalmente instruções para administrar a dita composição à noite.

46. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, 29, 33 ou 43, que compreende adicionalmente instruções para administrar a dita composição durante o dia.

47. Método para gerar um folículo piloso ou estimular o cresci- mento de cabelos, sendo que o dito método compreende as etapas de: (a) induzir a re-epitelialização da pele do dito indivíduo; e (b) colocar as células da dita pele em contato com um inibidor de EGFR de molécula pequena, ou um metabólito desse, em uma quantidade suficiente para gerar folículos pi- Iosos ou estimular o crescimento de cabelos sobre a dita pele.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que a etapa (a) é realizada menos de duas semanas antes da etapa (b).

49. Método para gerar um folículo piloso ou estimular o cresci- mento de cabelos sobre a pele da cabeça de um indivíduo, sendo que o dito método compreende a etapa de colocar as células da dita pele em contato com um inibidor de EGFR de molécula pequena em uma quantidade sufici- ente para gerar folículos pilosos ou estimular o crescimento de cabelos so- bre a dita pele, onde o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é um he- terociclo contendo nitrogênio não-naturalmente ocorrente de menos de cerca de 2.000 dáltons, ou um metabólito desse, e com a condição de que a dita pele não seja a pálpebra.

50. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 49, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é sistemicamente administrado.

51. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 49, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é topicamente administrado.

52. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 49, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é selecionado entre leflunomida, gefitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, vandetanib, CL-387785, PKI166, peli- tinib, HKI-272 e HKI-357.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é gefitinib.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é erlotinib.

55. Método, de acordo com a reivindicação 52, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é leflunomida.

56. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 49, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é o metabólito leflunomida A771726.

57. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 49, sendo que o dito método compreende administrar ao dito indivíduo uma composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

58. Método para gerar um folículo piloso ou estimular o cresci- mento de cabelos sobre a pele do indivíduo, sendo que o dito método com- preende as etapas de: (a) induzir a re-epitelialização da pele do dito indiví- duo; e (b) colocar as células da dita pele em contato com um anticorpo EG- FR em uma quantidade suficiente para gerar folículos pilosos ou estimular o crescimento de cabelos sobre a dita pele.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, em que o dito anticorpo EGFR é selecionado entre zalutumumab, cetuximab, IMC 11F8, matuzumab, SC 100, ALT 110, PX 1032, BMS599626, MDX 214 e PX 1041.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47,49, ou 58, em que a dita pele é a pele do escalpo ou sobrancelha do indiví- duo.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47,49 ou 58, em que o dito indivíduo sofre de calvície no escalpo.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47,49 ou 58, em que o dito contato é realizado durante a noite.

63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que o dito contato é realizado durante o dia.

64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47,49 ou 58, em que o dito indivíduo sofre de alopecia androgenética.

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que o dito indivíduo sofre de lúpus eritematoso discoide.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que o dito indivíduo sofre de hipotricose congênita.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que o dito indivíduo sofre de líquen planopilar.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que o dito indivíduo sofre de alopecia cicatricial.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que o dito produz crescimento piloso mais rápido.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que o dito produz cabelos mais grossos.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, que compreende adicionalmente a etapa de administrar ao dito indivíduo um agente biologicamente ativo adicional selecionado entre um anti-histamínico, um anti-inflamatório, um retinoide, um antiandrogênico, um imunossupressor, um abridor de canal, um antibiótico e um antimicrobiano.

72. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 49, em que o dito inibidor de EGFR de molécula pequena é administrado ao dito indivíduo uma vez ou duas vezes ao dia.

73. Método, de acordo com a reivindicação 56, em que o dito anticorpo EGFR é administrado ao dito indivíduo uma vez ou duas vezes ao dia.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que a dita pele é desprovida de um estrato córneo.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que a dita pele compreende ceratinócitos recentemente forma- dos.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 49 ou 58, em que a dita pele compreende folículos pilosos embrionários que exibem um ou mais marcadores característicos selecionados entre BerEP4, citoqueratina 15, citoqueratina 17, β-catenina, ouriço sônico e fosfatase alca- lina.

77. Método para gerar um folículo piloso ou estimular o cresci- mento de cabelos sobre a pele de um indivíduo, sendo que o dito método compreende as etapas de: (a) induzir a re-epitelialização da pele do dito indivíduo; e (b) administrar ao dito indivíduo um inibidor de EGFR seleciona- do a partir de um inibidor de EGFR de molécula pequena, ou um metabólito desse, e um anticorpo EGFR, onde o dito inibidor de EGFR é formulado para liberação sustentada e administrado em uma quantidade suficiente para ge- rar folículos pilosos ou estimular o crescimento de cabelos sobre a dita pele.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, em que as eta- pas (a) e (b) são realizadas simultaneamente.

79. Método para produzir cabelo pigmentado em um indivíduo, sendo que o dito método compreende (i) gerar um folículo piloso no dito indi- víduo como definido em método, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 47 a 78; e (ii) suprimir a expressão de uma proteína Wnt no dito folí- culo piloso.

80. Método, de acordo com a reivindicação 79, em que a etapa de suprimir a expressão de uma proteína Wnt compreende induzir a expres- são de uma proteína Dkkl.