BRPI0708079A2

BRPI0708079A2 - purificação de antìgenos bacterianos

Info

Publication number: BRPI0708079A2
Application number: BRPI0708079-4A
Authority: BR
Inventors: Antonello Covacci; Markus Hileringmann; Llaria Ferlenghi
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2006-02-17
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2011-05-17
Also published as: JP2009538116A; US20100074923A1; US20110275132A1; CN101484464A; MX2008010604A; CA2642721A1; WO2007116322A2; US20080031877A1; AU2007237133A1; EP1994047A2; WO2007116322A3

Abstract

PURIFICAçãO DE ANTìGENOS BACTERIANOS. São apresentados métodos de isolamento de fímbrias e de estruturas semelhantes a fímbria a partir de bactérias gram-positivas, incluindo Streptococcus pneumoniae, e composições que incluem essas fímbrias isoladas. Essas composições são úteis como composições imunogênicas para a produção de anticorpos e imunoestimulação. Também são apresentados métodos de inibição de Streptococcus pneumoniae e métodos de identificação de inibidores de Streptococcus pneurnoniae.

Description

PURIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS BACTERIANOSReferência Cruzada Com Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido U.S.Provisório N0 de Série 60/774.450, depositado em 17 defevereiro de 2006, cujo conteúdo é aqui incorporado porreferência em sua totalidade.

Campo Da Invenção

A presente invenção está relacionada às fimbriasobtidas de bactérias gram-positivas, incluindoStreptococcus pneumoniae, métodos de produção e isolamentodas fimbrias, e ao uso das fimbrias para a indução de umaresposta imunológica contra bactérias gram-positivas. A-presente invenção também fornece, inter alia, métodos dedetecção de infecção bacteriana gram-positiva, métodos detratamento de infecção bacteriana gram-positiva, e métodosde identificação de inibidores de fímbrias bacterianasgram-positivas que se ligam a um substrato. Também sãofornecidos anticorpos que se ligam às fímbrias.

Fundamentos Da Invenção

A bactéria gram-positiva Streptoeoecus pneumoniae(também conhecida como pneumococo) é uma causa importantede morbidade e mortalidade em todo o mundo, e representa umdos quatro principais responsáveis por mortes em doençasinfecciosas, junto com HIV, malária e tuberculose (1-5). Éuma causa importante de infecções do trato respiratóriocomo, por exemplo, otite média, sinusite e pneumoniaadquirida na comunidade, mas também é um patógenoimportante em doenças invasivas como, por exemplo,septicemia e meningite. Embora o pneumococo seja umpatógeno devastador, ele também coloniza de formainofensiva em um grau elevado crianças saudáveis quefreqüentam creches (6, 7). Um fator de virulênciaimportante na doença pneumocócica é a cápsulapolissacarídica, pela qual os pneumococos são agrupados empelo menos noventa sorotipos diferentes (8). Outros fatoresgenéticos, por exemplo, CbpA (proteína A de ligação decolina) e pneumolisina, foram descritos como sendoimportantes para a virulência (9-11).

A infecção por S. pneumoniae leva a uma doençainvasiva desencadeada pela colonização inicial danasofaringe, mas os mecanismos de adesão não são bemcompreendidos. A adesão in vitro de pneumococosencapsulados é bem menor do que dos derivados nãoencapsulados não virulentos (4) , embora a expressão dacápsula seja essencial para a colonização bem sucedida dasvias aéreas superiores. Essas observações sugerem que, invivo, os pneumococos são adesivos, apesar da produção deuma cápsula espessa (5).

Em outras bactérias gram-positivas, por exemplo,Corynebacterium diphtheriae (12, 13), Actinomyces spp. (14)e, recentemente, estreptococos do grupo A (GAS) eestreptococos do grupo B (GBS) (15, 16), estruturas desuperfície semelhantes a fímbrias por microscopiaeletrônica foram identificadas e caracterizadasgeneticamente, bem como bioquimicamente (12, 13, 15, 16) .Em Actinomyces spp., genes de fímbrias do tipo 1 medeiam aadesão às superfícies dentárias e mucosas (17). No entanto,há necessidade de dados funcionais sobre o papel e a funçãofisiológicos na doença infecciosa de fímbrias emStreptococcus spp. patogênico.Fímbrias gram-positivas são polímeros prolongadosformados por uma reação de transpeptidase que envolveproteínas de subunidades de entrecruzamento covalente quecontêm padrões de aminoácidos específicos, que são montadospor sortases específicas. Sortases também são responsáveispor adesão covalente das fímbrias à parede celular depeptidoglicano.

Sumário Da Invenção

A presente especificação descreve, inter alia, oisolamento e a caracterização de fímbrias da bactéria gram-positiva Streptococcus pneumoniae. As fímbrias temparticipação na patogênese de S. pneumoniae e de outrasbactérias gram-positivas, e são úteis, inter alia, emmétodos de tratamento e imunização contra infecçõesbacterianas gram-positivas.

Em alguns aspectos, a especificação fornece fímbriasbacterianas gram-positivas isoladas, por exemplo, fímbriasde Streptococcus pneumoniae, fímbrias de estreptococos dogrupo A (GAS) ou fímbrias de estreptococos do grupo B(GBS). Em algumas modalidades, as fímbrias compreendem pelomenos uma de uma proteína RrgA de S. pneumoniae, umaproteína RrgB de S. pneumoniae e uma proteína RrgC de 3.pneumoniae, por exemplo, um polipeptídeo que possui aseqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 2, ID. DE SEQ.N0 : 4 OU ID. DE SEQ. N°: 6, ou uma forma processada desta.Em algumas modalidades, as fímbrias isoladas possuem umpeso molecular de cerca de 1 x IO5 a 1 x IO7 Da ou, emalgumas modalidades, de 2 χ IO6 a 3 χ IO6 Da. Em algumasmodalidades, as fímbrias isoladas possuem um comprimento defilamento de cerca de 0,1 a 2 μπι (por exemplo, cerca de0,1, 0,2, 0,5, 1, 1,5 ou 2 μπι) . Em algumas modalidades, asfímbrias isoladas possuem um diâmetro de cerca de 10 nm(por exemplo, cerca de 8, 9, 10, 11 ou 12 nm) . Em algumasmodalidades, as fÍmbrias isoladas compreendem trêsprotofilamentos.

Em algumas modalidades, as fímbrias são separadas dascélulas por digestão enzimática (por exemplo, com uma oumais enzimas líticas como, por exemplo, peptidoglicanohidrolases (por exemplo, mutanolisina, lisostafina elisozima)). Em algumas modalidades, as fímbrias sãoseparadas das células por cisalhamento mecânico (porexemplo, por ultrassonificação). Em algumas modalidades, asfímbrias são separadas das células por diminuição ouinibição da atividade de SrtA. Em algumas modalidades, asfímbrias são separadas das células por tratamento dascélulas com um composto que interfere com a integridade daparede celular (por exemplo; um antibiótico). Em algumasmodalidades, as fímbrias são substancialmente livres decélulas bacterianas. Em algumas modalidades, as fímbriassão substancialmente livres de peptidoglicanos. Em algumasmodalidades, a especificação apresenta métodos de produçãodas fímbrias bacterianas gram-positivas isoladas (porexemplo, fímbrias de S. pneumoniae), em que os métodosincluem a exposição de uma célula bacteriana que produzfímbrias bacterianas gram-positivas (por exemplo, fímbriasde S. pneumoniae) à digestão enzimática ou ao cisalhamentomecânico, e o isolamento das fímbrias da célula.

Em alguns aspectos, a especificação apresentacomposições imunogênicas que compreendem uma ou mais dasfímbrias bacterianas gram-positivas isoladas (por exemplo,fímbrias de S. pneumoniae).

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde isolamento de fímbrias bacterianas gram-positivas (porexemplo, fímbrias de S. pneumoniae, GAS ou GBS), em que osmétodos compreendem a separação de fímbrias de célulasbacterianas que produzem fímbrias bacterianas gram-positivas (por exemplo, células bacterianas gram-positivasou células bacterianas transformadas para a produção defímbrias gram-positivas), e o isolamento das fímbrias dascélulas. Em algumas modalidades, as fímbrias são separadasdas células por digestão enzimática (por exemplo, com umaou mais enzimas líticas como, por exemplo, peptidoglicanohidrolases (por exemplo, mutanolisina, lisostafina elisozima)). Em algumas modalidades, as fímbrias sãoseparadas das células por cisalhamento mecânico (porexemplo, por ultrassonificação). Em algumas modalidades, asfímbrias são separadas das células por diminuição ouinibição da atividade de SrtA. Em algumas modalidades, asfímbrias são separadas das células por tratamento dascélulas com um composto que interfere com integridade daparede celular (por exemplo, um antibiótico). Em algumasmodalidades, o isolamento compreende uso de umacentrifugação por gradiente de densidade. Em algumasmodalidades, o isolamento compreende a redução dapolidispersibilidade, por exemplo, a separação doscomponentes por tamanho, por exemplo, com o uso decromatografia por filtração em gel. Em algumas modalidades,o isolamento inclui uma ou mais etapas de cromatografia,por exemplo, cromatografia por filtração em gel,cromatografia por troca iônica, cromatografia de fasereversa ou cromatografia por afinidade. Em algumasmodalidades, o método ainda compreende uma ou mais etapasde concentração.

Em alguns aspectos, a especificação apresentaanticorpos que se ligam especificamente a uma fímbriabacteriana gram-positiva isolada (por exemplo, uma fímbriade S. pneumoniae). Em algumas modalidades, os anticorpossão anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais,anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, anticorposhumanizados, anticorpos de cadeia simples ou fragmentosFab. Em algumas modalidades, os anticorpos são marcados,por exemplo, com uma enzima, um radioisótopo, uma toxina,um agente de contraste (por exemplo, uma partícula de ouro)ou um fluoróforo. Em algumas modalidades, os anticorpos seligam preferencialmente a uma fímbria de S. pneumoniae ou aum fragmento desta, comparada com a ligação dos anticorposàs proteínas individuais que constituem a fímbria. Emalgumas modalidades, os anticorpos se ligampreferencialmente a um complexo de fímbrias, comparada coma ligação do anticorpo a uma proteína da fímbria que nãoestá em complexo selecionada do grupo que consiste em RrgA,RrgB e RrgC. Em algumas modalidades, os anticorpos não seligam especificamente à RrgA, RrgB ou RrgC que não estão emcomplexo.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde indução de uma resposta imunológica contra uma bactériagram-positiva (por exemplo, S. pneumoniae), em que osmétodos incluem a administração de uma quantidade eficaz defímbrias bacterianas gram-positivas, por exemplo, fímbriasde S. pneumoniae (por exemplo, fímbrias isoladas de S.pneumoniae), a um indivíduo, por exemplo, um ser humano ouum animal não humano.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde detecção de uma infecção bacteriana gram-positiva (porexemplo, uma infecção por S. pneumoniae) em um indivíduo,por exemplo, um ser humano, em que os métodos incluem oteste de uma amostra do indivíduo, por exemplo, soro ouescarro, para evidenciar a presença de fímbrias bacterianasgram-positivas (por exemplo, fímbrias de S. pneumoniae). Emalgumas modalidades, a evidência da presença de fímbriasbacterianas gram-positivas (por exemplo, fímbrias de S.pneumoniae) é fornecida pela presença de um anticorpo parafímbrias bacterianas gram-positivas (por exemplo, fímbriasde S. pneumoniae) . Em algumas modalidades, o anticorpo seliga preferencialmente a um complexo de fímbrias, comparadacom a ligação do anticorpo a uma proteína da fímbria quenão está em complexo (por exemplo, RrgA, RrgB e RrgC) . Emalgumas modalidades, o anticorpo não se ligaespecificamente a uma proteína da fímbria que não está emcomplexo (por exemplo, RrgA, RrgB ou RrgC).

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde detecção de uma infecção bacteriana gram-positiva, porexemplo, de uma infecção por S. pneumoniae, em umindivíduo, em que os métodos incluem o contato de umaamostra com um agente (por exemplo, um anticorpo) que seliga especificamente a uma fímbria bacteriana gram-positiva, por exemplo, uma fímbria de S. pneumoniae, e adetecção da ligação do agente a um componente da amostra.

Em algumas modalidades, o anticorpo se ligapreferencialmente a um complexo de fímbrias, comparada coma ligação do anticorpo a uma proteína da fímbria que nãoestá em complexo (por exemplo, RrgA, RrgB e RrgC) . Emalgumas modalidades, o anticorpo não se ligaespecificamente a uma proteína da fímbria que não está emcomplexo (por exemplo, RrgA, RrgB ou RrgC).

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde tratamento de um indivíduo (por exemplo, um indivíduohumano) que possui ou com suspeita de ter uma infecção porbactérias gram-positivas (por exemplo, S. pneumoniae) , emque os métodos incluem a administração ao indivíduo de umaquantidade eficaz de um agente que se liga especificamentea fímbrias gram-positivas. Em algumas modalidades, o agenteé um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal, umanticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpohumano, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeiasimples ou um fragmento Fab) . Em algumas modalidades, oagente (por exemplo, um anticorpo) bloqueia a adesão ou aligação de bactérias gram-positivas às células como, porexemplo, células hospedeiras. As células podem ser célulasepiteliais, por exemplo, células dos epitélios do pulmão ouda nasofaringe. Em algumas modalidades, o anticorpo se ligapreferencialmente a uma fímbria de S. pneumoniae ou a umfragmento desta, comparado com as proteínas individuais queconstituem a fímbria. Em algumas modalidades, o agente (porexemplo, um anticorpo) se liga especificamente a uma oumais proteínas de fímbrias de S. pneumoniae, por exemplo,RrgA7 RrgB ou RrgC (por exemplo, um ou mais polipeptídeosque possuem a seqüência de aminoácidos dos IDS. DE SEQ.Nos: 2, 4 ou 6, ou formas processadas de qualquer umdestes). Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, umanticorpo) se liga especificamente a um polipeptídeo quepossui os resíduos de aminoácidos 316-419 do ID. DE SEQ.N°: 4. Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, umanticorpo) bloqueia pelo menos 50% da adesão de S.pneumoniae às células epiteliais pulmonares A54 9, comparadocom um controle, medida em um ensaio de adesão.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodospara a determinação de um esquema de tratamento para umindivíduo (por exemplo, um indivíduo humano) que possui oucom suspeita de ter uma infecção bacteriana gram-positiva(por exemplo, por S. pneumoniae), em que os métodos incluemo teste de uma amostra do indivíduo quanto à presença de umanticorpo para fímbrias gram-positivas, e a escolha de umesquema de tratamento com base na presença ou ausência doanticorpo. O método pode ainda incluir o tratamento doindivíduo com um agente antibiótico, caso a presença doanticorpo não seja detectada. 0 método também pode incluiro tratamento do indivíduo com um agente antiinflamatório,caso a presença do anticorpo seja detectada.

A especificação também apresenta fímbrias gram-positivas isoladas que incluem polipeptídeos que incluemuma seqüência de aminoácidos de uma proteína de uma fímbriagram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) com até 50(por exemplo, até 40, 30, 20, 10 ou 5) substituições,inserções ou deleções de aminoácidos. Em algumasmodalidades, as substituições de aminoácidos sãosubstituições conservativas de aminoácidos. Em algumasmodalidades, a proteína da fímbria gram-positiva é RrgA(por exemplo, ID. DE SEQ. N° : 2), RrgB (por exemplo, ID. DESEQ. N°: 4) ou RrgC (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 6). Emalgumas modalidades, os polipeptídeos incluem as seqüênciasde aminoácidos de dois ou mais dos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4ou 6, ou fragmentos imunogênicos de qualquer um destes. Emalgumas modalidades, os polipeptídeos incluem as seqüênciasde aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, e 6, oufragmentos imunogênicos de todos esses. A especificaçãotambém apresenta fragmentos imunogênicos de fímbrias gram-positivas isoladas, por exemplo, aqueles que contêmproteínas da fímbria de S. pneumoniae como, por exemplo,RrgA, RrgB e RrgC (por exemplo, fragmentos imunogênicos dosIDS. DE SEQ. Nos: 2, 4 e 6). Também são apresentados naespecificação métodos de indução de uma respostaimunológica contra uma bactéria gram-positiva (por exemplo,S. pneumoniae), em que os métodos incluem a administraçãode uma quantidade eficaz de uma fímbria gram-positivaisolada a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano. Aespecificação também apresenta métodos de produção defímbrias gram-positivas isoladas por transformação de umacélula hospedeira com um ou mais ácidos nucléicossuficientes para produzir as fímbrias, e o isolamento dasfímbrias da célula hospedeira.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde expressão de um anticorpo antifímbria gram-positiva (porexemplo, de S. pneumoniae) em uma célula, em que os métodosincluem a expressão de um ácido nucléico que codifica oanticorpo antifímbria gram-positiva na célula.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde purificação de bactérias gram-positivas (por exemplo, S.pneumoniae) de uma amostra que inclui as bactérias gram-positivas, em que os métodos incluem o fornecimento de umamatriz de afinidade que inclui um anticorpo que se ligaespecificamente a uma fímbria gram-positiva ligada a umsuporte sólido; o contato da amostra com a matriz deafinidade para formar um complexo matriz deafinidade/bactéria gram-positiva; a separação do complexomatriz de afinidade/bactéria gram-positiva do restante daamostra; e liberação da bactéria gram-positiva da matriz deafinidade.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde liberação de um agente citotóxico ou um agentediagnóstico a uma bactéria gram-positiva (por exemplo, S.pneumoniae), em que os métodos incluem o fornecimento doagente citotóxico ou do agente diagnóstico conjugado a umanticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente auma fimbria gram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) ;e a exposição da bactéria ao conjugado de anticorpo-agenteou fragmento-agente.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde identificação de moduladores de S. pneumoniae, em que osmétodos incluem o contato de uma célula suscetível àinfecção por S. pneumoniae, por exemplo, uma célula HEP2,uma célula CHO, uma célula HeLa ou uma célula dos epitéliospulmonares A549, com um composto candidato e S. pneumoniae,e a determinação de se uma atividade de S. pneumoniae, porexemplo, adesão a uma célula (por exemplo, uma célulaepitelial pulmonar A549) , é inibida, em que a inibição daatividade de S. pneumoniae é indicativa de um inibidor deS. pneumoniae.

Em alguns aspectos,, a especificação apresenta métodosde identificação de moduladores da ligação de fímbriasgram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) , em que osmétodos incluem o contato de uma célula animal suscetível àligação de fímbrias gram-positivas com um compostocandidato e uma célula bacteriana que possui fímbrias gram-positivas, e a determinação de se a ligação da célulabacteriana à célula animal é inibida, em que a inibição daatividade de ligação é indicativa de um inibidor de ligaçãode fímbrias gram-positivas.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde identificação de moduladores da ligação de fímbriasgram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) , em que osmétodos incluem o contato de uma célula suscetível àligação de fímbrias gram-positivas com um compostocandidato e fímbrias gram-positivas, e a determinação de sea ligação das fímbrias à célula é inibida, em que ainibição da atividade de ligação é indicativa de uminibidor de ligação de fímbrias gram-positivas.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde identificação de moduladores da ligação de fímbriasgram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae), o referidométodo compreendendo o contato de uma célula suscetível àligação de fímbrias gram-positivas com um compostocandidato e uma proteína da fímbria gram-positiva oufragmento de ligação celular desta, e a determinação de sea ligação da proteína da fímbria ou de fragmento desta àcélula é inibida, em que a inibição da atividade de ligaçãoé indicativa de um inibidor de ligação de fímbrias gram-positivas.

Em alguns aspectos, a especificação apresenta métodosde identificação de moduladores da ligação de fímbriasgram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) , o referidométodo compreendendo o contato de uma proteína suscetível àligação da fímbria gram-positiva, por exemplo, uma proteínada matriz extracelular, ou fragmento de ligação à fímbriagram-positiva desta, com um composto candidato e umafímbria gram-positiva, proteína da fímbria gram-positiva,ou um fragmento desta, e a determinação de se a ligaçãoentre as duas proteínas ou fragmentos destas é inibida, emque a inibição da atividade de ligação é indicativa de uminibidor de ligação de fímbrias gram-positivas.

A especificação também apresenta composiçõesfarmacêuticas, imunogênicas e de vacina que incluemfímbrias bacterianas gram-positivas isoladas (por exemplo,fímbrias de S. pneumoniae). A especificação tambémapresenta o uso de fímbrias gram-positivas (por exemplo, deS. pneumoniae) (ou qualquer um dos polipeptídeos ou ácidosnucléicos descritos acima) para a preparação de umacomposição imunogênica ou uma composição de vacina para otratamento ou a profilaxia de infecção bacteriana gram-positiva. A especificação também apresenta fímbrias gram-positivas (por exemplo, de 3. pneumoniae) (ou qualquer umdos polipeptídeos ou ácidos nucléicos descritos acima) parauso em medicina. A especificação também apresenta fímbriasgram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) (ou qualquerum dos polipeptídeos ou ácidos nucléicos descritos acima)para uso no tratamento ou na prevenção de infecçãobacteriana gram-positiva.

A especificação também apresenta composiçõesfarmacêuticas que incluem agentes (por exemplo, anticorpos)que se ligam especificamente às fímbrias de S. pneumoniae.A especificação também apresenta o uso de agentes (porexemplo, anticorpos) que se ligam especificamente àsfímbrias de S. pneumoniae para a preparação de ummedicamento para o tratamento ou a profilaxia de infecçãopor S. pneumoniae. A especificação também apresenta taisagentes para uso em medicina. A especificação tambémapresenta tais agentes para uso no tratamento ou naprevenção de infecção bacteriana gram-positiva.

A especificação também apresenta métodos de isolamentode fimbrias de Streptococcus pneumoniae, em que os métodosincluem a separação de fimbrias de células de 5. pneumoniaeque produzem fímbrias de S. pneumoniae, por exemplo, TIGR4de S. pneumoniae, e o isolamento de fímbrias de S.pneumoniae. Em algumas modalidades, as fímbrias sãoseparadas de células de S. pneumoniae por digestãoenzimática (por exemplo, com uma ou mais enzimas líticascomo, por exemplo, peptidoglicano hidrolases (por exemplo,mutanolisina, lisostafina e lisozima)). Em algumasmodalidades, as fímbrias são separadas de células de S.pneumoniae por cisalhamento mecânico (por exemplo, porultrassonificação). Em algumas modalidades, as fímbrias sãoseparadas de células de S. pneumoniae por diminuição ouinibição da atividade de SrtA. Em algumas modalidades, asfímbrias são separadas de células de S. pneumoniae portratamento das células com um composto que interfere comintegridade da parede celular (por exemplo, umantibiótico). Em algumas modalidades, os métodos incluem adegradação de ácidos nucléicos com uma nuclease. Em algumasmodalidades, os métodos incluem a redução dapolidispersibilidade, por exemplo, por separação def ímbrias de S. pneumoniae por tamanho com o uso decromatografia por filtração em gel. Em algumas modalidades,os métodos incluem uma ou mais etapas de cromatografia, porexemplo, cromatografia por filtração em gel, cromatografiapor troca iônica, cromatografia de fase reversa oucromatografia por afinidade. Em algumas modalidades, ascélulas de S. pneumoniae que produzem fímbrias de S.pneumoniae expressam mais fímbrias do que TIGR4 de S.pneumoniae.

A menos que definido de forma diferente, todos ostermos técnicos e científicos aqui utilizados possuem osmesmos significados comumente entendidos por aqueleshabilitados na técnica à qual esta invenção pertence.Embora métodos e materiais similares ou equivalentesàqueles aqui descritos possam ser usados na prática outeste da presente invenção, métodos e materiais adequadosserão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos depatentes, patentes e outras referências aqui mencionadassão incorporadas por referência em sua totalidade. Em casode conflito, o presente pedido, incluindo definições, serádeterminante. Além disso, os materiais, métodos e exemplossão somente ilustrativos e não têm a intenção de limitar ainvenção.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção sãoapresentados nos desenhos que acompanham a invenção e nadescrição abaixo. Outras características, objetivos evantagens da invenção ficarão evidentes a partir dadescrição e dos desenhos, e a partir de modalidadesadicionais abaixo.

Breve Descrição Dos DesenhosFig. 1. (A) Coloração negativa de S. pneumoniae cepaT4 que mostra fímbrias abundantes na superfície bacteriana.(B) Coloração negativa de cepa mutante Τ4Δ (rrgA-srtD) quemostra ausência de fímbrias. (C) Coloração negativa domutante Τ4Δ (mgrA) que mostra fímbrias abundantes. (D)Coloração negativa do mutante Τ4Δ (rrgA-srtD, nzgrA) quemostra ausência de fímbrias na superfície bacteriana. (E)Marcação por imuno-ouro de T4 pela utilização de anti-RrgA.(F) Marcação por imuno-ouro de T4 com anti-RrgB (5 nm) eanti-RrgC (10 nm). Demonstrou-se que anti-RrgB decora todasas fímbrias (barra, 200 nm). (G) Grande aumento de fímbriasT4 com marcação dupla com anti-RrgB (5 nm) e anti-RrgC (10nm). Ela mostra marcação específica de uma fímbria poranti-RrgC, como indicado pelas setas (barra, 100 nm) . (H)Marcação por imuno-ouro do mutante por eliminação de S.pneumoniae Τ4Δ (rrgA-srtD) sem fímbrias visíveis nasuperfície detectáveis por anti-RrgB e anti-RrgC (barra,200 nm).

Fig. 2. Organização do genoma da ilhota rlrA na cepaT4 sorotipo 4 (TIGR4), e comparação com a cepa delaboratório R6 de seqüências disponíveis. A cepa 19F,ST16219F, compartilha uma organização similar com umaidentidade de seqüência global de 98%, enquanto a cepa nãoencapsulada R6 e sua progenitora D3 9 são cepas ilhota defímbrias-negativas. Seqüências de inserção (JS1167)flanqueiam o lócus em cepas positivas [uma das transposasesé frame-shifted (fs)], enquanto um elemento RUP (unidade derepetição em pneumococo) é identificado na cepa ilhota def ímbr ias - negat iva. O tamanho do lócus, além de seu teorrelativo de G+C, é mostrado. A posição do reguladornegativo mgrA é indicada. É incluída para comparação aorganização do genoma das ilhotas que codificam estruturasde fímbrias em Streptococcus agalactiae e Corynebacteriumdiphtheriae.

Fig. 3. (A) Western blot com o uso de um gel degradiente de poliacrilamida 4-12% com o anti-soro de RrgBdetecta uma escala de polímeros de alto peso molecular(HMW) em cepas que expressam f ímbrias (T4, Τ4Δ (mgrA),ST16219F e ST16219FA {mgrA)), enquanto as cepas mutantesdesprovidas de fímbrias (Τ4Δ (rrgA-srtD), Τ4Δ (rrgA-srtD,mgrA) e ST16219FA (rrgA-srtD)) não possuem polímeros HMW. 0mutante mgrA mostra uma intensidade aumentada, quandocomparado com o respectivo tipo selvagem. (B) Western blotcom o anti-soro de RrgB com o uso de um gel de gradiente 4-12% para D3 9 desprovida da ilhota, o mutante D3 9 com ailhota rlrA introduzida (D39V (rrgA-srtD)) e seu derivadopor eliminação rlrA (D39 V (rrgA-srtD) Δ (rlrA)).

Fig. 4. (A) Aderência de D39 e D39V (rrgA-srtD), alémde D39V(rrgA-srtD) A(rlrA) , às monocamadas de célulasepiteliais pulmonares A549. (B-D) Microscopia porimunof luorescência de D39 (B), D39V (rrgA-srtD) (C) eD39 V( rrgA-srtD)A(rlrA) (D) que aderem às célulasepiteliais pulmonares A54 9. É mostrada a marcação depneumococos com anticorpo anticapsular (verde) e avisualização de F-actina epitelial com rodamina (vermelho).

Fig. 5. (A-E) Ataque intranasal de camundongos C57BL/6com T4 com fímbrias e seu mutante isogênico por eliminaçãosem fímbrias Τ4Δ (rrgA-srtD) . (A e B) Sobrevida decamundongos após inoculação com 5 χ IO6 cfu (dose alta, A)ou 5 χ IO5 cfu (dose média, Β) . A sobrevida foi analisadapela utilização do teste log-rank de Kaplan-Meier. (C, E)Experimentos de infecção por competição in vivo, em que T4e seu mutante isogênico Τ4Δ (rrgA-srtD) foram misturados emuma proporção de 1:1, antes da infecção intranasal. 0Índice competitivo (CI) foi calculado, como descritoabaixo; cada círculo representa o CI para um camundongoindividual em cada conjunto de experimentos de competição.Um CI abaixo de 1 indica uma desvantagem competitiva domutante em relação à cepa do tipo selvagem. Os valores doCI < IO"4 foram ajustados para IO"4. Todos os camundongosforam colonizados. (C) CI na colonização, pneumonia ebacteremia após ataque de dose alta (n = 20) . De 20camundongos, somente 14 apresentaram pneumonia (definidacomo bactérias recuperadas dos pulmões) e 14 apresentarambacteremia. (D) CI na colonização após ataque com dosemédia (n = 10) . De 10 camundongos, somente 5 apresentarampneumonia e apenas 1 apresentou bacteremia. (E) CI nacolonização após ataque com dose baixa (n = 10) . De 10camundongos, somente 4 apresentaram pneumonia e novedesenvolveram bacteremia. (F) CI na colonização e pneumoniaapós com infecção mista com D3 9 do tipo selvagem e seuderivado por inserção isogênico de ilhota de fímbrias D39V(rrgA-srtD) ou D39V (rrgA-srtD) Δ {rirA) com o gene rlrAinativado. Um CI acima de 1 indica um ganho de virulênciapela presença da ilhota rirA em D39V (rrgA-srtD) .

Fig. 6. Papel da ilhota de fímbrias rlrA na respostainflamatória sistêmica do hospedeiro. Os camundongos foramatacados i.p. com dose de ataque alta (5 χ IO6 a 2 χ IO7cfu) de T4, ST16219F e seus mutantes isogênicos Τ4Δ (rrgA-srtD) e ST16219FA (rrgA-srtD) e mortos em 6 horas após ainfecção. (A) Crescimento bacteriano no sangue após ataquecom dose alta i.p. São mostrados resultados de camundongosindividuais. As linhas horizontais representam as medianas,e a análise pelo teste U de Mann-Whitney teste não mostradiferenças significativas (P > 0,05). (B) Resposta séricade TNF. Os dados são apresentados como médias e SEMs. Foiestabelecida a significância estatística pelo teste de UMann-Whitney (**, P < 0,0001; *, P < 0,001). (C e D)Resposta de TNF para camundongos individuaiscorrelacionados com os níveis de bacteremia após inoculaçãocom T4 e Τ4Δ (rrgA-srtD) (C) ou ST16219F e ST16219FA (rrgA-srtD) (D).

Fig. 7. Análise da resposta de IL-6 para os mesmosataques i.p. mostrados na Fig. 6. O crescimento bacterianono sangue é mostrado na Fig. 6A. (A) Resposta sérica de IL-6 em 6 horas após infecção. Os dados são apresentados comomédias e SEMs (teste U de Mann-Whitney; *, P < 0,0001). (B)Resposta de IL-6 para camundongos individuaiscorrelacionada com os níveis de bacteremia após inoculaçãocom T4 e Τ4Δ (rrgA-srtD) .

A Fig. 8 é uma análise das proteínas estruturais RrgA

RrgB e RrgC de fímbrias pneumocócicas T4. 8A é um desenhoesquemático de padrões previstos encontrados em proteínasde fímbrias gram-positivas. 8B é uma ilustração deseqüências de padrões previstos de fímbrias e E-box em s.pneumoniae (T4), quando presentes. Seqüências de padrões defímbrias e E-box de Corynebacterium sp. São mostradas parareferência (Ton-That e cols., 2004, Mol. Microbiol., 53:251-261; Ton-That e Schneewind, 2004, Trends Microbiol.,12: 228-34; Scott e Milner; 2006, Mol. Microbiol., 62: 320-330). 8C é um resumo de padrões encontrados na T4pneumocócica RrgA, RrgB e RrgC. 8A e 8C, S: peptídeosinalizador do terminal Ν, P: padrão de fímbria, E: E-box,C: padrão de sinalização de triagem da parede celular, M:trecho hidrofóbico e extremidade com carga.

A Fig. 9A revela um gel de poliacrilamida corado comazul Coomassie que mostra uma auto-associação de proteínasRrgA e RrgB purificadas.

A Fig. 9B revela um imunoblot que mostra a auto-associação de proteínas RrgA e RrgB purificadas.

A Fig. 9C revela uma série de traçados decromatografia por exclusão de tamanho de proteínas RrgA,RrgB e RrgC purificadas. Foram observados complexos compeso molecular maior para RrgA e RrgB.

A Fig. 10A revela um gráfico de linhas que mostra apurificação de fímbrias pneumocócicas T4 nativas, de altopeso molecular, por gradiente de sacarose.

A Fig. 10B revela um traçado que revela a purificaçãode fímbrias pneumocócicas T4 nativas, de alto pesomolecular, por cromatografia por exclusão de tamanho.

A Fig. 10C revela géis de poliacrilamida que mostramos resultados da purificação de fímbrias pneumocócicas T4nativas, de alto peso molecular. O gel da esquerda mostraos resultados da coloração com prata. O gel da direitamostra um imunoblot com anticorpo que se ligaespecificamente à RrgB.

A Fig. 11A revela os resultados de uma análise deEdmann para determinar a seqüência de aminoácidos doterminal N de proteínas das fímbrias (sublinhadas),comparada com a seqüência de aminoácidos prevista de RrgB.O terminal N das proteínas de fímbrias corresponde ao sítiode sinal clivagem da peptidase (/) previsto.

A Fig. IlB revela os resultados de uma análise porespectroscopia de massa de um digerido tríptico de fímbriaspurificadas de alto peso molecular. Uma seqüência depeptídeo tríptico (em itálico) de fímbrias de alto pesomolecular (isoladas de um gel de SDS-PAGE) combina com aseqüência de aminoácidos de RrgB prevista (em negrito).

A Fig. 12 mostra bacteremia e mortalidade decamundongos BALB/C imunizados (IP) com anti-soros parafímbrias de HMW (50 μΐ/camundongo) e atacados (IP) com 260CFU de T4/camundongo. Uma preparação de fímbria Τ4Δ serviucomo controle negativo. A. Bacteremia em 24 horas pós-ataque. Círculos = valores de CFU por ml de sangue deanimais únicos; barras horizontais = média geométrica decada grupo; linha tracejada = limite de detecção (ou seja,não foram detectados CFUs nas amostras de sangue abaixo dalinha tracejada). B. Evolução da mortalidade. Diamantes =dias de sobrevida de animais únicos, barras horizontais =mediana de dias de sobrevida de cada grupo; linha tracejada= ponto final da observação (ou seja, animais acima dalinha tracejada sobreviveram no ponto final). ctrl =camundongos que receberam somente o adjuvantecorrespondente mais solução salina; antifímbria = anti-soros para fímbrias purificadas de HMW; anti-sorosantifímbria Δ para controle purificado (fímbria Τ4Δ); * = P< 0,05 e ** = P < 0,01, em comparação com o grupo decontrole correspondente.

A Fig. 13 revela uma série de gráficos que mostram osresultados da ligação de proteínas recombinantespurificadas (BSA, RrgA, RrgB, RrgC) e fímbrias nativas paraBSA e proteínas da matriz extracelular mucina 1, ácidohialurônico, vitronectina, sulfato de condroitina,lactoferrina, colágenos I e IV, laminina, fibronectina efibrinogênio. BSA serviu como controle negativo. A ligaçãofoi quantificada por ELISA em uma absorbância de 405 nm.

A Fig. 14 revela uma série de gráficos de barras quemostram a indução de citocinas inflamatórias TNF-alfa, IL-12p40 e IL-6 por células mononucleares (PBMC) e monócitosdo sangue periférico atacadas in vitro com fímbriaspurificadas e uma preparação de controle de fímbrias delta.

A Fig. 15 revela uma microfotografia eletrônica de umabactéria Streptococcus pneumoniae marcada por imuno-ourocom um anticorpo específico para RrgB.

a Fig. 16 revela uma microfotografia eletrônica de umapreparação de fímbrias purificadas marcada por imuno-ourocom anticorpos específicos para RrgA (conjugados apartículas de ouro de 15 nm), RrgB (conjugados a partículasde ouro de 5 nm) e RrgC (conjugados a partículas de ouro de10 nm) . RrgB é o principal componente da fímbria. RrgA eRrgC são encontradas ao longo do comprimento da fímbria,RrgA sendo encontrada freqüentemente em agrupamentos.

A Fig. 17 revela uma microfotografia eletrônica defímbrias purificadas coradas negativamente com ácidofosfotúngstico (PTA) e visualizada com um aumento de 5000X.

A Fig. 18 é um diagrama esquemático de análiseestrutural das fímbrias para determinar o diâmetro médiodas fímbrias.

A Fig. 19 é um diagrama esquemático de análiseestrutural das fímbrias para determinar o volume dasfímbrias.

A Fig. 20 é um diagrama esquemático de um método degeração de uma representação 2D aprimorada de uma fímbriapela média e filtração das microfotografias eletrônicas dasfímbrias.

A Fig. 21 é um diagrama esquemático de visualizações2D rodadas de uma fímbria que mostra uma estruturahelicoidal constituída por três protofilamentos.

A Fig. 22 é um diagrama esquemático da determinação deperfis de densidade através da estrutura da fímbria em duasposições.

A Fig. 23 revela um modelo da estrutura de umafímbria. As fímbrias são feitas por pelo menos 3"protofilamentos" dispostos em uma estrutura coiled-coilcom um diâmetro médio de 10,5-11,0 nm e uma inclinação de13,2 nm. 0 diâmetro das fímbrias na posição nodal é de 6,8nm, e cada "protofilamento" possui um diâmetro de 3,5 nm.

Descrição Detalhada

Os requerentes isolaram e caracterizaram fímbrias deuma bactéria gram-positiva, Streptococcus pneumoniae(também conhecido como pneumococo). Essas fímbrias foramidentificadas como expressas por TIGR4 de S. pneumoniae, umisolado clínico capsular do sorotipo 4, cujo genoma foiseqüenciado pelo "The Institute for Genomic Research" (vejaa página da Internet tigr.org). Essas fímbrias sãocodificadas por uma ilha de patogenicidade, a ilhota rirA,que está presente em alguns, mas não em todos, isoladosclínicos pneumocócicos. Demonstrou-se que as fímbrias sãoimportantes para a aderência pneumocócica às célulasepiteliais pulmonares, bem como para a colonização em ummodelo murídeo de infecção. Da mesma forma, as fímbriastambém demonstraram afetar o desenvolvimento de pneumonia ebacteremia em camundongos. Além disso, pneumococos queexpressam fímbria provocaram uma resposta de fator denecrose tumoral (TNF) maior durante infecções sistêmicas doque mutantes isogênicos sem fímbrias, indicando que asfímbrias participam da resposta inflamatória do hospedeiro.Conseqüentemente, essa especificação apresenta, inter alia,composições de fímbrias e de proteína de fímbriabacterianas gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae)e uso das mesmas em métodos de tratamento e imunizaçãocontra infecções bacterianas gram-positivas (por exemplo,de S. pneumoniae).

Fímbrias De Streptococcus pneumoniaeas fímbrias pneumocócicas são codificadas por umailhota rlrA presente em TIGR4 de S. pneumoniae, que contém3 sortases e 3 genes que codificam proteínas que contêmpadrões LPXTG (rrgA, rrgB e rrgC) . A marcação por imuno-ouro com anticorpos contra as proteínas RrgA, RrgB e RrgCdetectou estruturas filamentosas alongadas na superfície deS. pneumoniae. Demonstrou-se que anti-RrgA marca asuperfície da célula bacteriana, o que sugere que RrgAancora a estrutura da fímbria à parede celular. Verificou-se que anti-RrgB decora toda a fímbria, enquanto anti-RrgCera concentrada nas pontas das fímbrias. A eliminação dosgenes de fímbria eliminou a coloração das fímbrias,enquanto a eliminação de um regulador negativo do óperon dafímbria (mgrA) gerou uma quantidade aumentada de fímbriasna superfície da célula. A localização da superfície dacélula das fímbrias de S. pneumoniae a torna atrativa comoantígenos.

As fímbrias foram isoladas até a homogeneidade ouquase homogeneidade de TIGR4 de S. pneumoniae, e mostrarammassas moleculares que variam de 2 χ 106 a 3 χ 106 Da. Asfímbrias purificadas estavam presentes como filamentosalongados com comprimento de até cerca de 1 pm e cerca denm de diâmetro. A marcação por imuno-ouro detectou tantoas proteínas RrgB quanto as RrgC nas fímbrias isoladas.

Uma seqüência de ácidos nucléicos de rrgrA exemplar(Anotação TIGR N0 Sp0462) é aqui fornecida:

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{id. de seq. n°: i)

Uma seqüência de aminoácidos de RrgA exemplar (Anotação

TIGR N0 SP04 62) é aqui fornecida:mlnrethmkkvrkifokavaglccisoltafssivaiaetpetspaigkvviketge

Ggallgdavfelknntdgttvsqrteaqtgeaifsnikpgtytlteaqppvgykpstkqwtvevekngrttvqgeqvenreealsdqypqtgtypdvqtpyqiikvdgsekngq

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RrgA contém um padrão de substrato de sortase YPXTG(ID. DE SEQ. n°: 8), mostrado em sublinhado no ID. DE SEQ.n°: 2, acima. Dois supostos domínios da proteína Cna dotipo B (De ivanayagam e cols., 2000, Structurel 8: 67-78)foram identificados nos resíduos de aminoácidos 62-132 e751-824 do ID. DE SEQ. n°: 2. Um suposto domínio do fatorde von Willebrand do tipo A foi identificado (Sadler, 1998,Ahnu. Rev. Biochem., 67: 395-424; Ponting e cols., 1999, J.Mol. Biol., 289: 729-4 226-579). Esse domínio do fator devon Willebrand do tipo A pode estar envolvido naspropriedades de mediação da adesão celular ou desinalização celular de fímbrias de S. pneumoniae.Uma seqüência de ácidos nucléicos de rrgB exemplar(Anotação TIGR N0 sp04 63) é aqui fornecida:

ATGAAATCAATCAAC7LAATTTTTAACAATOGTTGCTGCCTTATTACTGACAGCGAGTAGCCTGTTTTCAGÇTGCAACAGTTTTTGÇGGCTGGGACGAGAAGAA.CATCTGTTACCGTTCATAAACTATTGGC^CAGATGG<^ATATGGATAAAATTGCAAATGAGTTAGAAACAGGTAACTATGCTGGTAATAAAGTGGGTGTTCTACCTGCAAATGCAAAAGAAATi'GCCGGTGTTATGTTCGTTTGGACAAATACTAATAATGAAATTATTGATGAAAATGGCCAAACTCTAGGAGTGAATATTGATCCACAAACATTTAAACTCTCAGGGGGAATGCGGGCAACTGCAA TGAAAAAATrAACAGAAGCTGAAGGAGCTAAATTTAACACGGCAAATTTACCAGCTGCTAAGTATAAAATTTATGAAATTCACAGTTTATCAACTTATGTCGGTGAAGATGGAGCAACCTTAAí^GGTTCTAAAGCAGTTCCAATTGAAATTGAATTACCATTGAACGATGTTGTGGATGCGCATGTGTATCCAAAAAATACAGAAGCAAAGCCAAAA.ATTGAT AAAGATTTCAAAGGTAAAGCAAATCCAGATACACCACGTGTAGATAAAGATAC^CCTGTGAACCACCAAGTTGGAGATGTTGTAGAGTACGAAATTCTTACAAAAATTCCAGCACTTGCTAATTATGCAACAGCT^AACTGGAGCGATAGAATGACTGAAGGTTTGGCATTCAACLAAAGGTACAGTGAAAGTAACTGTTGATGATGTTGCACTTGAAGCAGGTGATTATGCTCTAACAGAAGTAGCAACTGGTriTGATTTGAAATTAACAGATGCTGGTTTAGCTAAA.GTGAATGACCAAAACGCTGAAAAAACTGTGAAAATCACTTATTCGGCAACATTGÁATGACAAAGCAATTGTAGAAGTACCAGAATCTAATGATGTAACATTTAAC

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GGCGATTTGACATTGACCAAGACATG&GTrGATGCTACAGGTGCACCAATTCCGGCT

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ATGGGTATI^AGTGTACGCATATGTTAAAAACtaa (seq w n0;3)

Uma seqüência de aminoácidos de RrgB exemplar

(Anotação TIGR. N0 SP0463) é aqui fornecida:

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Uma seqüência de ácidos nucléicos de rrgC exemplar

(Anotação TIGR N0 sp0464) é aqui fornecida:

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Uma seqüência de aminoácidos de RrgC exemplar

(Anotação TIGR. N0 SP0464) é aqui fornecida:

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dtrkelvtvvknn krpridvpdtgeetlyilmlvaillfgsgyyltkkpnn(id. de seq, n0: 6>

Dois supostos domínios da proteína Cna do tipo B(Deivanayagam e cols., 2000, Structure, 8:67-78) foramidentificados nos resíduos de aminoácidos 163-251 e 273-352do ID. DE SEQ. N° : 6. RrgC contém um padrão de substrato desortase VPXTG (ID. DE SEQ. N°: 10), mostrado em sublinhadono ID. DE SEQ. N°: 6, acima.Outras fímbrias bacterianas gram-positivas

Os métodos e composições aqui descritos podem serusados com fímbrias de qualquer bactéria gram-positiva.Foram identificadas proteínas de fímbrias conhecidas epresumíveis em GAS (por exemplo, Streptococcus pyogenes)(Mora e eols., 2005, Proe. Natl. Aead. Sei. USA, 102:15.641-6), GBS (por exemplo, Streptoeoeeus agalaetiae)(Lauer e eols., 2005, Science, 309: 105; WO 2006/078318),Actinomycetes naeslundii (Yeung e eols., 1998, Infect.Iirniun., 66: 148-291), Corynebacterium diphtheriae (Ton-Thate eols., 2003, Mol. Microbiol., 50: 1.429-38; Ton-That e

Schneewind, 2004, Trends. Microbiol., 12: 228-34),Clostridium perfringens e Enterococcus faecalis.

Fímbrias de outras bactérias gram-positivas podem serusadas nos métodos e composições aqui descritos. Essasbactérias gram-positivas incluem, sem limitação,firmicutes, tais como aqueles dos gêneros Streptoeoeeus(por exemplo, S. pneumoniae, S. agalaetiae, S. pyogenes, S.suis, S. zooepidemieusa, S. viridans, S. mutans, S.gordonii, S. equi) , Bacillus (por exemplo, B. anthraeis, B.eereus, B. subtilis), Listeria (por exemplo, L. innoeua, L.

monoeytogenes) , Staphyloeoeeus (por exemplo, S. aureus, S.epidermidis, S. Capraef S. saprophytieus, S. Iugdunensis,S. sehleiferi) , Enteroeoeeus (por exemplo, E. faecalis, E.faecium), Lactobacillus, Lactococcus (por exemplo, L.lactis), Leuconostoc (por exemplo, L. mesenteroides) ,

Pectinatus, Pedioeoecus, Aeetobacterium, Clostridium (porexemplo, C. botulinum, C. diffieile, C. perfringens, C.tetani), Ruminococcus (por exemplo, R. albus) ,Heliobacterium, Heliospirillum e Sporomusa; eactinobactérias, tais como aquelas dos gênerosAetinomycetes (por exemplo, A. naeslundii), Corynebaeterium(por exemplo, C. diphtheriae, C. effieiens) , Arthrobaeter,Bifidobaeterium (por exemplo, B. longum) , Frankia,Mierococeus, Micromonospora, Myeobaeterium (por exemplo, M.tubereulosis, M. leprae, M bovis, M. afrieanum, M.microti), Noeardia (por exemplo, N. asteroides) ,Propionibaeteriun e Streptomyees (por exemplo, S.somaliensis, S. avermitilis, S. eoelieolor).

Fímbrias isoladas

Fímbrias gram-positivas isoladas (por exemplo, de S.pneumoniae) e outras estruturas semelhantes a fimbria queincluem proteínas de fímbrias gram-positivas (por exemplo,RrgA, RrgB e RrgC), ou fragmentos ou variantes destas,podem ser usadas nos métodos aqui descritos e comoantígenos em composições imunogênicas para a produção deanticorpos e/ou a estimulação de uma resposta imunológicaem um indivíduo. Fímbrias que incluem variantes deproteínas de fimbria gram-positiva também podem ser usadasnos métodos aqui descritos e como antígenos em composiçõesimunogênicas para a produção de anticorpos e/ou aestimulação de uma resposta imunológica em um indivíduo. Umpolipeptídeo de uma semelhante a fimbria gram-positiva (porexemplo, de 3. pneumoniae) que contém pelo menos 8 0% deidentidade de seqüência, por exemplo, 85%, 90%, 95%, 98% ou99%, com uma seqüência de aminoácidos de uma proteína gram-positiva (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 2, 4 ou 6), também éútil nos novos métodos. Além disso, um polipeptídeo defímbria gram-positiva com até 50, por exemplo, 1, 3, 5, 10,15, 20, 25, 30 ou 40 inserções, deleções ou substituiçõesde aminoácidos, por exemplo, substituições conservativas deaminoácidos, será útil nas composições e nos métodos aquidescritos.

A determinação do percentual de identidade entre duasseqüências de aminoácidos pode ser obtida com a utilizaçãodo programa BLAST 2.0, que está disponível ao público emncbi.nlm.nih.gov/BLAST. A comparação de seqüências érealizada com o uso de um alinhamento sem lacunas eutilizando-se os parâmetros padronizados (matriz BLOSUM 62,custo de existência de lacuna [gap] de 11, por custo delacuna de resíduo de 1, e uma proporção lambda de 0,85). 0algoritmo matemático usado nos programas BLAST é descritoem Altschul e cols., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3.389-3.402.

Como aqui usado, o termo "substituição conservativa deaminoácido" significa uma substituição de um aminoácido emum polipeptídeo dentro de uma família de aminoácidos.Famílias de aminoácidos são reconhecidas na técnica e sebaseiam nas propriedades físicas e químicas das cadeiaslaterais do aminoácido. Famílias incluem as seguintes:aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo,lisina, arginina e histidina); aminoácidos com cadeiaslaterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácidoglutâmico); aminoácidos com cadeias laterais polares nãocarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina,serina, treonina, tirosina e cisteína); aminoácidos comcadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina,leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina etriptofano); aminoácidos com cadeias laterais ramificadas(por exemplo, treonina, valina e isoleucina); e aminoácidoscom cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina,fenilalanina, triptofano e histidina). Um aminoácido podepertencer a mais de uma família.

Em algumas modalidades, as composições imunogênicas dainvenção compreendem uma proteína de uma fímbria gram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) , que pode serformulada ou purificada em uma forma oligomérica (fímbria).

Em algumas modalidades, a forma oligomérica éum hiperoligômero. Em algumas modalidades as composiçõesimunogênicas da invenção compreendem uma proteína defímbria gram-positiva que foi isolada em uma formaoligomérica (fímbria). As estruturas de oligômero ouhiperoligômero da fímbria que compreendem proteínas defímbria gram-positiva podem ser purificadas ou de algumoutro modo formuladas para uso em composições imunogênicas.

Uma ou mais seqüências de polinucleotídeos do quadrode leitura aberta da proteína da fímbria de 3. pneumoniaepodem ser substituídas por uma seqüência depolinucleotídeos que codifica um fragmento do ORFsubstituído. Alternativamente, um ou mais dos quadros deleitura aberta da proteína da fímbria de S. pneumoniaepodem ser substituídos por uma seqüência que possuihomologia de seqüência para o ORF substituído.

Uma ou mais das seqüências da proteína de fímbriagram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) tipicamenteincluem um padrão LPXTG (por exemplo, LPXTG (ID. DE SEQ.N°: 11)) OU outro padrão de substrato de sortase. 0 padrãode substrato de sortase LPXTG de uma fímbria da proteína deS. pneumoniae pode ser geralmente representado pela fórmulaX1X2X3X4G, em que X na posição de aminoácido 1 é um L, um V,um Ef um Y, um I ou um Q, em que X na posição de aminoácido2 é um P, caso X na posição de aminoácido 1 seja um L, emque X na posição de aminoácido 2 é um V, caso X na posiçãode aminoácido 1 seja um E ou um Q, em que X na posição deaminoácido 2 é um V ou um P, caso X na posição deaminoácido 1 seja um V, em que X na posição de aminoácido 3é qualquer resíduo de aminoácido, em que X na posição deaminoácido 4 é um T, caso X na posição de aminoácido 1 sejaum V, E ou Q, e em que X na posição de aminoácido 4 é um T,S ou A, caso X na posição de aminoácido 1 seja um L. Algunsexemplos de padrões LPXTG incluem YPXTG (ID. DE SEQ. N°:8), IPXTG (ID. DE SEQ. N°: 9), LPXSG (ID. DE SEQ. N° : 57),WXTG (ID. DE SEQ. N° : 12), EVXTG (ID. DE SEQ. N° : 13),VPXTG (ID. DE SEQ. N° : 10), QVXTG (ID. DE SEQ. N°: 14),LPXAG (ID. DE SEQ. N° : 15), QVPTG (ID. DE SEQ. N° : 16) eFPXTG (ID. DE SEQ. N°: 17).

Uma ou mais das seqüências da proteína de fímbriagram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) podem incluiruma seqüência de padrão de fímbrias. Alguns exemplos de seqüências de padrão de fímbrias incluemWLQDVHVYPKHQXXXXXXK (ID. DE SEQ. N0 : 58) ,WNYNWAYPKNTXXXXXXK (ID. DE SEQ. N0 : 59) ,WLYDVNVFPKNGXXXXXXK (ID. DE SEQ. N0 : 60) ,WIYDVHVYPICNEXXXXXXK (ID. DE SEQ. N0 : 61) ,WNYNVHVYPKNTXXXXXXK (ID. DE SEQ. N0 : 62) ,FLSEINIYPKNVXXXXXXK (ID. DE SEQ. N°: 63) , e DWDAHVYPKNTXXXXXXK (ID. DE SEQ. N°: 64). Uma seqüência deconsenso de padrão de fímbrias exemplar é (W/F/E/D)-X-X-X-

(V/I/A)-X-(V/I/A)-(Y/F)-P-K-(N/H/D)-XXXXXXX-(KJL) (ID. DE

SEQ. N° : 65) OU WXXXVXVYPK (ID. DE SEQ. N° : 76). A lisinainterna conservada do padrão de fímbrias pode atuar como um

ucleófilo na reação de sortase.

Uma ou mais das seqüências da proteína de fímbriagram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) podem incluiruma seqüência de padrão E-box. Alguns exemplos deseqüências de padrão E-box incluem FCLVETATASGY (ID. DESEQ. N°: 66), FCLKETKAPAGY (ID. DE SEQ. N°: 67),YVLVETEAPTGF (ID. DE SEQ. N° : 68), YCLVETKAPYGY (ID. DESEQ. N°: 69), YKLKETKAPYGY (ID. DE SEQ. N°: 70),YPITEEVAPSGY (ID. DE SEQ. N°: 71), YRLFENSEPAGY (ID. DESEQ. N°: 72), YYLWELQAPTGY (ID. DE SEQ. N°: 73) e YYLEETKQPAGY (ID. DE SEQ. N°: 74). Uma seqüência deconsenso de padrão E-box exemplar é (Y/F)-X-(L/I)-X-E-T-X-(AJQ/T) - (P/A)-X-G-(Y/F) (ID. DE SEQ. N°: 75) ou LXET (ID.

DE SEQ. N0: 77).

As fímbrias gram-positivas (por exemplo, de S.pneumoniae) aqui descritas podem afetar a capacidade dasbactérias gram-positivas (por exemplo, S. pneumoniae) de seaderirem e invadir as células epiteliais. As fímbriastambém podem afetar a capacidade de bactérias gram-positivas (por exemplo, S. pneumoniae) para se deslocaratravés de uma camada da célula epitelial. De preferência,uma ou mais fímbrias gram-positivas são capazes de se ligarou de algum outro modo se associar à superfície de umacélula epitelial. Fímbrias gram-positivas também podem sercapazes de se ligar ou se associar ao fibrinogênio,fibronectina ou colágeno.Acredita-se que proteínas de sortases gram-positivas(por exemplo, de 3. pneumoniae) estejam envolvidas nasecreção e ancoragem das proteínas de superfície que contêmLPXTG. As proteínas de sortase de S. pneumoniae sãocodificadas por genes (srtB, srtC e srtD) encontrados namesma patogenicidade de ilhota que os genes rrgA, rrgB errgC. Proteínas sortase e variantes de proteínas sortaseúteis nos métodos aqui descritos podem ser obtidas debactérias gram-positivas.

As proteínas de uma fímbria gram-positiva (porexemplo, de S. pneumoniae) podem ser anexadascovalentemente à parede celular bacteriana portranspeptidases associadas à membrana, por exemplo, umasortase. A sortase pode funcionar para clivar a proteína desuperfície, preferivelmente entre os resíduos treonina eglicina de um padrão LPXTG. A sortase pode, então, ajudarna formação de uma ligação amida entre o grupo carboxil detreonina e um precursor da parede celular como, porexemplo, lipídeo II. 0 precursor pode então ser incorporadono peptidoglicano por meio das reações de transglicosilaçãoe transpeptidação da síntese da parede bacteriana. VejaComfort e cols., Infection & Immunity (2004) 72(5): 2.710 -2.722.

Em algumas modalidades, a invenção inclui umacomposição que compreende estruturas oligoméricassemelhantes a fímbria que compreendem uma proteína de umafímbria gram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) (porexemplo, RrgA, RrgB ou RrgC (por exemplo, ID. DE SEQ. N° :2, 4 ou 6)). A estrutura oligomérica semelhante a fímbriapode compreender numerosas unidades de proteína de fímbria.Em algumas modalidades, as estruturas oligoméricassemelhantes a fímbria compreendem duas ou mais proteínas defímbria. Em algumas modalidades, a estrutura oligoméricasemelhante a fímbria compreende uma estruturahiperoligomérica semelhante a fímbria que compreende pelomenos duas (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 150, 200 ou mais) subunidades oligoméricas,em que cada subunidade compreende uma proteína de fímbriaou um fragmento desta. As subunidades oligoméricas podemser associadas covalentemente por meio de uma lisinaconservada dentro de um padrão de fímbrias. As subunidadesoligoméricas podem· ser associadas covalentemente por meiode um padrão LPXTG, preferivelmente, por meio do resíduo deaminoácido treonina ou serina, respectivamente. Em algumasmodalidades, a estrutura oligomérica semelhante a fímbria éuma fímbria isolada.

Proteínas de uma fímbria gram-positiva (por exemplo,de S. pneumoniae) ou fragmentos destas a serem incorporadasnas estruturas oligoméricas semelhantes a fímbria dainvenção incluirão, em algumas modalidades, um padrão defímbrias.

A fímbria oligomérica pode ser usada isoladamente ounas combinações da invenção. Em algumas modalidades, ainvenção compreende uma fímbria de S. pneumoniae em formaoligomérica. Em algumas modalidades, a fímbria está em umaforma hiperoligomérica.

Métodos de purificação de fímbrias

As fímbrias podem ser purificadas de células, porexemplo, células bacterianas, que expressam fímbrias gram-positivas ou estruturas semelhantes a fímbria (por exemplo,fímbrias estreptocócicas, tais como fímbrias de S.pneumoniae, estreptococos do grupo A e estreptococos dogrupo B) por separação das fímbrias das células, porexemplo, por cisalhamento mecânico ou digestão enzimática,e o isolamento das fímbrias separadas.

Células bacterianas adequadas à purificação defímbrias incluem cepas bacterianas gram-positivasfimbriadas, bactérias gram-positivas não fimbriadas queforam transformadas com uma ou mais proteínas da fímbriagram- positiva, por exemplo, RrgA, RrgB e RrgC de S.pneumoniae (por exemplo, IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4 e 6) , ecélulas gram-negativas ou outras células transformadas comuma ou mais proteínas da fímbria gram-positiva, porexemplo, RrgA, RrgB e RrgC de 3. pneumoniae (por exemplo,IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4 e 6). Tipicamente, uma célula usadapara purificação de fímbrias produzirá apenas o tipo outipos de fímbrias desejados, por exemplo, fímbriasendógenas ou heterólogas. Para a produção de fímbriasheterólogas, a célula pode ser alterada, por exemplo, pormutação ou métodos de DNA recombinante, de modo a nãoproduzir fímbrias endógenas. Tipicamente, uma célulabactériana gram-positiva produtora de fímbrias útil àpurificação expressará uma ou mais sortases compatíveis, deforma que as fímbrias sejam expressas na superfície dacélula.

A separação de fímbrias de células bacterianas gram-positivas é tipicamente obtida por cisalhamento mecânico,digestão enzimática, diminuição ou inibição da atividade deSrtA, ou tratamento com um composto que interfere com aintegridade da parede celular. O cisalhamento mecânico poderemover fisicamente as fímbrias das células, enquantooutros métodos podem eliminar o ponto de adesão dasfímbrias (por exemplo, por degradação de componentes daparede celular ou da fímbria). Após a separação dasfímbrias das células, as fímbrias e as células podem serseparadas, por exemplo, por centrifugação.

Exemplos não limitantes de métodos de cisalhamentomecânico incluem ultrassonificação, cisalhamento comglóbulo de vidro e mistura. Métodos de sonificação sãodiscutidos, por exemplo, em Yamaguchi e cole., 2004,Current Microbial., 49:59-65. Métodos de cisalhamento comglóbulo de vidro são discutidos, por exemplo, em Levesque eCOls., 2001, J. Bacteriol., 183: 2.724-32. Métodos geraisde cisalhamento mecânico são discutidos, por exemplo, emWolfgang e cols., 1998, Mol. Microbiol., 29: 321-30Trachtenberg e cols., 2005, J. Mol. Biol., 346: 665-676Parge e cols., 1990, J. Biol. Chem., 265: 2.278-85Isaacson. e cols., 1981, J. Bacteriol., 146: 784-9; Korhonene cols., 1980, Infect. Inmun., 27: 569-75; Hahn e cols.,2002, J. Mol. Biol., 323: 845-57; St. Geme e cols., 1996,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 11.913-18; Weber e cols.,2005, J. Bacteriol., 187: 2.458-68; e Mu e cols., 2002, J.Bacteriol., 184: 4.868-74.

Exemplos não limitantes de enzimas adequadas àdigestão enzimática incluem enzimas de degradação da paredecelular como, por exemplo, mutanolisina, lisostafina elisozimas. Métodos de digestão enzimática são discutidos,por exemplo, em Bender e cols., 2003, J. Bacteriol., 185:6.057-66; Ton-That e cols., 2004, Mol. Microbial., 53: 251-61; e Ton-That e cols. , 2003, Mol. Microbial., 50: 1.429-38. Para administração de fímbrias aos indivíduos, pode-seutilizar várias enzimas para remover componentes da paredecelular que possam causar uma reação indesejada aohospedeiro.

Exemplos não limitantes de métodos de inibição oudiminuição da atividade de SrtA incluem a diminuição daatividade de SrtA por introdução de um alelo de "perda defunção" de SrtA, eliminação do gene SrtA endógeno,expressão de um ácido nucléico que diminui a expressão deSrtA (por exemplo, um anti-senso ou miRNA), e o tratamentodas células com um composto que inibe a atividade de SrtA(veja, por exemplo, Marrafini e cols., Microbial. Mol.

Biol. Rev., 70: 192-221, 2006).

Inibidores da sortase A exemplares incluem metano-tiossulfonatos (por exemplo, MTSET e (2-sulfonatoetil)metano-tiossulfonato) (Ton-That e Schneewind, J. Biol.Chem., 274: 24.316-24.320, 1999), ácido p-hidroximercuribenzóico, glucosilesterol p-sitosterol-3-0-glicopiranol (Kim e cols., Biosci. Biotechnol. Biochem.,67: 2.477-79, 2003), cloreto de berberina (Kim e cols.,Biosci. Biotechnol. Biochem., 68: 421-24, 2004), peptidil-diazometano (LPAT-CHN2) (Scott e cols., Biochem. J., 366:953-58, 2002), peptidil-clorometano (LPAT-CH2Cl), peptidil-vinil sulfona [LPAT-SO2(Ph)] (Conolly e cols., J. Biol.Chem., 278: 3.4061-65, 2003), vinil sulfonas (por exemplo,di-, etil-, metil- e fenil vinil sulfonas) (Frankel ecols., J. Am. Chem. Soc., 126: 3.404-3.405, 2004),peptídeos do padrão LPXTG com o resíduo treoninasubstituído por um grupo fosfinato (por exemplo, LPEW{PO2H-CH2}G) (Kruger e cola., Bioorg. Med. Chem., 12: 3.723-29, 2004), (Z)-diaril-acrilonitrilas substituídas (Oh ecols., J. Med. Chem., 47: 2.418-21, 2004), e extratos devárias plantas medicinais (Kim e cols., Biosci. Biotechnol.Biochem., 66: 2.751-54, 2002).

Exemplos não limitantes de compostos que interferemcom a integridade da parede celular incluem glicina eantibióticos como, por exemplo, penicilinas (por exemplo,meticilina, amoxicilina, ampicilina), cefalosporinas (porexemplo, cefalexina, cefproxil, cefepima), glicopeptídeos(por exemplo, vancomicina, teicoplanina, ramoplanina) eciclosserina.

Fímbrias separadas podem ser separadas de outroscomponentes por densidade, por exemplo, pela utilização decentrifugação por gradiente de densidade. Por exemplo, asfímbrias podem ser separadas por centrifugação em umgradiente de sacarose.

Tipicamente, uma amostra contendo fímbrias gram-positivas conterá polímeros de diferentes pesos molecularesem função de diferentes números de subunidades de proteínade fímbria presentes nas fímbrias. Para reduzir apolidispersibilidade, uma amostra contendo fímbrias gram-positivas pode ser separada por tamanho. Por exemplo, podeser usada uma coluna de filtração em gel ou exclusão portamanho. Uma membrana de ultrafiltração também pode serusada para reduzir a polidispersibilidade de fímbrias gram-positivas.

As fímbrias gram-positivas também podem ser isoladascom o uso de métodos de afinidade como, por exemplo,cromatografia por afinidade. Uma proteína que se ligaespecificamente a uma fímbria gram-positiva, por exemplo,um anticorpo que se liga especificamente a um componente dafímbria ou um anticorpo que se liga preferencialmente àsfímbrias, pode ser imobilizado em um substrato sólido (porexemplo, um substrato de cromatografia) e uma amostracontendo fímbrias gram-positivas exposta à proteína deligação imobilizada. Esses métodos de isolamento porafinidade também podem ser usados para isolar, purificar ouenriquecer preparações de células que expressam fímbriasgram-positivas.

Fímbrias gram-positivas também podem ser isoladas como uso de qualquer outro método de purificação de proteínaconhecido na técnica, por exemplo, precipitações, métodosde cromatografia em coluna e concentrações de amostra. Oisolamento pode incluir, por exemplo, cromatografia porfiltração em gel, cromatografia por troca iônica,cromatografia de fase reversa ou cromatografia porafinidade. Métodos adicionais são descritos, por exemplo,em Ruffolo e cola., 1997, Infect. Iwmun., 65: 339-43.Métodos de purificação de proteínas são descritos emdetalhe, por exemplo, em Scopes, R.K., "ProteinPurification: Principies and Practice", 3a ed. , 1994,Springer, NY.

A presença de fímbrias gram-positivas em fraçõesdurante purificação pode ser seguida por eletroforese (porexemplo, eletroforese em poliacrilamida), medida da ligaçãode um agente que se liga especificamente às fímbrias gram-positivas (por exemplo, um anticorpo contra uma proteína dafímbria ou um anticorpo que se liga preferencialmente àsfímbrias) e/ou a medida de uma atividade das fímbrias como,por exemplo, a ligação a proteínas ou células.

Anticorpos

As fímbrias gram-positivas (por exemplo, de S.pneumoniae) da invenção também podem ser usadas para apreparação de anticorpos específicos para a fímbria gram-positiva ou para proteínas da fímbria gram-positiva. Emalgumas modalidades, os anticorpos se ligam especificamente(por exemplo, preferencialmente) a uma forma oligomérica ouhiperoligomérica de uma proteína de fímbria gram-positiva.A invenção também inclui combinações de anticorposespecíficos para proteínas da fímbria gram-positivaselecionadas para fornecer proteção contra uma gamaaumentada de isolados de sorotipos de cepas.

Os anticorpos específicos para fímbrias gram-positivas(por exemplo, de S. pneumoniae) da invenção incluem uma oumais porções biológicas que, por meios químicos ou físicos,podem se ligar ou se associar a um epitopo de umpolipeptídeo de fímbria gram-positiva. Os anticorpos dainvenção incluem anticorpos que se ligam preferencialmentea uma fímbria gram-positiva, quando comparada com proteínasisoladas da fímbria. A invenção inclui anticorpos obtidosde preparações tanto policlonais quanto monoclonais, alémdos seguintes: moléculas de anticorpos híbridos(quiméricos) (veja, por exemplo, Winter e cols. (1991)Nature 349: 293-299; e Patente U.S. N0 4.816.567);fragmentos F(ab')2 e F(ab); moléculas Fv (heterodímeros nãocovalentes, veja, por exemplo, Inbar e cols. (1972) Proc.Natl. Acad. Sci USA 69: 2.659-2.662; e Ehrlich e cols.(1980) Biochem. 19: 4.091-4.096); moléculas Fv de cadeiasimples (sFv) (veja, por exemplo, Huston e cols. (1988)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5.897-5.883); fragmentosdiméricos e triméricos de construções de anticorpo;winibodies (veja, por exemplo, Pack e cols. (1992) Biochem.31: 1.579-1.584; Cumber e cols. (1992) Immunology 149B:120-126); moléculas de anticorpo humanizado (veja, porexemplo, Riechmann e cols. (1988) Nature 332: 323-327;Verhoeyan e cols. (1988) Science 23 9: 1.534-1.53 6; ePublicação de Patente U.K. N0 GB 2.276.169, publicada em 21de setembro de 1994); e quaisquer fragmentos funcionaisobtidos dessas moléculas, em que tais fragmentos retêm aspropriedades de ligação imunológica da molécula doanticorpo parente. A invenção ainda inclui anticorposobtidos por meio de processos não convencionais, porexemplo, exibição de fago.

Os anticorpos da presente invenção podem serpoliclonais, monoclonais, recombinantes, por exemplo,quiméricos ou humanizados, totalmente humanos, não humanos,por exemplo, murídeos, ou anticorpos de cadeia simples.Métodos de produção desses anticorpos são conhecidos. Emalguns casos, os anticorpos possuem função efetora e podemfixar complemento. Os anticorpos também podem ser acopladosa toxinas, grupos repórteres ou agentes de imagem.

Em algumas modalidades, os anticorpos específicos paraa proteína de fímbria gram-positiva da invenção sãoanticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais incluem umacomposição de anticorpo que possui uma população homogêneade anticorpos. Anticorpos monoclonais podem ser obtidos dehibridomas murídeos, bem como de anticorpos humanosmonoclonais obtidos com o uso de hibridomas humanos e nãomurídeos. Veja, por exemplo, Cote, e cols. "MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, 1985, ρ 77.

Anticorpos quiméricos, humanizados, por exemplo,completamente humanos, são desejáveis para aplicações queincluem administração repetida, por exemplo, tratamentoterapêutico (e algumas aplicações diagnosticas) de umindivíduo humano.

Os anticorpos também podem ser usados no tratamentoprofilático ou terapêutico de infecção bacteriana gram-positiva (por exemplo, por S. pneumoniae). Os anticorpospodem bloquear a adesão ou alguma outra atividade debactérias gram-positivas em células hospedeiras.Adicionalmente, os anticorpos podem ser usados para liberaruma toxina ou um agente terapêutico como, por exemplo, umantibiótico, às células bacterianas gram-positivas.os anticorpos podem ser usados em aplicações

diagnosticas, por exemplo, para detectar a presença ouausência de fímbrias gram-positivas ou de proteínas dafímbria gram-positiva em uma amostra biológica. Anticorposantifímbrias ou antiproteína de fímbria podem ser usados deforma diagnostica para monitorar os níveis de proteína notecido como parte de um procedimento de teste clínico, porexemplo, para determinar a eficácia de certo regime detratamento. A detecção pode ser facilitada por acoplamento(ou seja, ligado fisicamente, por exemplo, direta ouindiretamente) do anticorpo para uma substância detectável(ou seja, marcação do anticorpo). Exemplos de substânciasdetectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos,materiais fluorescentes, agentes de contraste, materiaisluminescentes, materiais bioluminescentes e materiaisradioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluemperoxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, p-galactosidase e acetilcolinasterase; exemplos de complexosde grupo prostético adequados incluemestreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos demateriais fluorescentes adequados incluem umbeliferona,fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina,diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ouficoeritrina; exemplos de agentes de contraste incluemmateriais eletrodensos úteis para microscopia eletrônica,por exemplo, partículas de ouro ou materiais magneticamenteativos úteis para imagens de ressonância magnética, porexemplo, partículas supermagnéticas de ferro; um exemplo deum material luminescente inclui luminol; exemplos demateriais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina eaequorin, e exemplos de materiais radioativos adequadosincluem 125I, 131I, 35S e 3H. Esses anticorpos diagnósticospodem ser usados em métodos para detectar a presença debactérias gram-positivas fimbriadas (por exemplo, S.pneumoniae) em um paciente infectado, por exemplo, porteste de uma amostra do paciente. 0 esquema de tratamentopode então ser selecionado com base na presença ou ausênciade bactérias gram-positivas fimbriadas. Por exemplo, umpaciente infectado com bactérias gram-positivas nãofimbriadas poderia ser tratado com um antibiótico, enquantoum paciente infectado com bactérias gram-positivasfimbriadas também poderia ser tratado um composto deligação de fímbrias, por exemplo, um anticorpo e/ou umagente antiinflamatório (por exemplo, IL-6 ou um agenteanti-TNF como, por exemplo, um anticorpo anti-TNF).

Ensaios de rastreamentoEm alguns aspectos; a invenção fornece métodos (aquitambém denominados "ensaios de rastreamento") para aidentificação de moduladores, ou seja, compostos ou agentescandidatos identificados a partir de um ou mais compostosde teste (por exemplo, anticorpos, proteínas, peptídeos,peptidomiméticos, peptóides, pequenas moléculasinorgânicas, pequenas moléculas orgânicas não ácidonucléico, ácidos nucléicos (por exemplo, ácidos nucléicosanti-senso, siRNA, oligonucleotídeos ou oligonucleotídeossintéticos) ou outras drogas) que inibem uma atividade, porexemplo, uma atividade de ligação de fímbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) ou uma proteínade fímbria gram-positiva. Os compostos assim identificadospodem ser usados para modular a atividade de ligação ouadesão de bactérias gram-positivas em um protocoloterapêutico, ou para elaborar a função biológica defímbrias gram-positivas.

Em algumas modalidades, são fornecidos ensaios para orastreamento de compostos de teste para identificar aquelesque podem se ligar às fímbrias gram-positivas (por exemplo,de S. pneumoniae) ou a uma proteína de uma fímbria gram-positiva ou uma porção desta. Compostos que se ligam àsfímbrias gram-positivas ou uma proteína de uma fímbriagram-positiva podem ser testados quanto à sua habilidadepara modular uma atividade associada às fímbrias gram-positivas como, por exemplo, adesão, infecção ou umaresposta inflamatória.

Os compostos de teste usados nos métodos aquidescritos podem ser obtidos com o uso de várias abordagensem métodos de biblioteca combinatória conhecidos natécnica, que incluem: bibliotecas biológicas; bibliotecasde peptóides (bibliotecas de moléculas que possuem asfuncionalidades de peptídeos, mas com uma estrutura centralnão peptidica inédita, que são resistentes à degradaçãoenzimática, mas que, no entanto, permanecem bioativas;veja, por exemplo, Zuckermann e cols., 1994, J. Med. Chem.,37: 2.678-2.685); bibliotecas de fase sólida ou de fase desolução espacialmente localizáveis em paralelo; métodos debiblioteca sintética que exigem a desconvolução; o métodode biblioteca de "um glóbulo/um composto"; e métodos debiblioteca sintética que utilizam seleção por cromatografiapor afinidade. Aa abordagens de biblioteca biológica e debiblioteca de peptóide se limitam a bibliotecas depeptídeos, enquanto as outras quatro abordagens sãoaplicáveis às bibliotecas de compostos de peptídeos, deoligômero não peptídico ou de pequena molécula (Lam, 1997,Anticancer Drug Des., 12: 145) .

Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecasmoleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo,em: DeWitt e cols. (1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6.909; Erb e cols., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:11.422; Zuckermann e cols., 1994, J. Med. Chem., 37: 2.678;Cho e cols., 1993, Science, 261: 1.303; Carrell e cols.,1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 2.059; Carell ecols., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 2.061; e emkGallop e cols., 1994, J. Med. Chem., 37: 1.233).

Bibliotecas de compostos podem ser apresentadas emsolução (por exemplo, Houghten, 1992, Biotechniques, 13:412-421) ou em glóbulos (Lam, 1991, Nature, 354: 82-84),chips (Fodor, 1993, Nature, 364: 555-556), bactérias(Ladner, Patente U.S. N0 5.223.409), esporos (Ladner,Patente U.S. N0 5.223.409), plasmídeos (Cull e cola., 1992,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 1.865-1.869), ou em fago(Scott e Smith, 1990, Science, 249: 386-390; Devlin, 1990,Science, 249: 404-406; Cwirla e cols. , 1990, Proc. Watl.Acad. Sei. USA, 87: 6.378-6.382; Felici, 1991, J. Mol.Biol., 222: 301-310; e Ladner supra).

Em algumas modalidades, o ensaio é do tipo com base emcélulas no qual uma célula, por exemplo, uma célulabacteriana que expressa fímbrias gram-positivas (porexemplo, de S. pneumoniae) ou uma proteína de fímbriasgram-positivas ou porção biologicamente ativa desta, écolocada em contato com um composto de teste, e ahabilidade do composto de teste para modular uma atividadede fímbrias gram-positivas ou de uma proteína de fímbriasgram-positivas é determinada, por exemplo, pormonitoramento de ligação celular. A célula, por exemplo,pode ser de origem mamífera, por exemplo, murídea, de rato,ou de origem humana. A célula pode ser uma célulaepitelial, por exemplo, uma célula epitelial pulmonar A549.

A habilidade do composto de teste para modular umaatividade de ligação de fímbrias gram-positivas (porexemplo, de S. pneumoniae) ou de uma proteína de fímbriagram-positiva e um ligante ou substrato, por exemplo, umacélula ou uma proteína como, por exemplo, fibrinogênio,fibronectina ou colágeno, pode ser avaliada, por exemplo,por acoplamento do composto, por exemplo, o substrato, comum radioisótopo ou marcador enzimático, de tal forma que aligação do composto, por exemplo, do substrato, às fímbriasgram-positivas ou a uma proteína de fímbria gram-positivapossa ser determinada por detecção do composto marcado, porexemplo, substrato, em um complexo. Alternativamente,fímbrias gram-positivas ou uma proteína de fímbria gram-positiva podem ser acopladas a um radioisótopo ou marcadorenzimático para monitorar a habilidade de um composto deteste para modular a ligação de fímbrias gram-positivas oude uma proteína de fímbrias gram-positivas a um substratoem um complexo. Por exemplo, os compostos (por exemplo,parceiro de ligação de fímbrias gram-positivas ou de umaproteína de fímbrias gram-positivas) podem ser marcados comum radioisótopo (por exemplo, 125I, 35S, 14C ou 3H) , direta ouindiretamente, e o radioisótopo detectado por contagemdireta de radioemissão ou por contagem de cintilação.Alternativamente, os compostos podem ser marcadosenzimaticamente, por exemplo, com peroxidase de raiz-forte,fosfatase alcalina ou luciferase, e o marcador enzimáticodetectado por determinação da conversão de um substratoapropriado em produto.

A habilidade de um composto para interagir comfímbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) ouuma proteína de fímbrias gram-positivas, com ou sem amarcação de qualquer um dos participantes pode seravaliada. Por exemplo, pode ser usado um microfisiômetropara detectar a interação de um composto com fímbrias gram-positivas ou com uma proteína de fímbrias gram-positivas,sem marcação do composto ou das fímbrias gram-positivas oude uma proteína de fímbrias gram-positivas (McConnell ecols., 1992, Science 257: 1.906-1.912). Como aqui usado, um"microfisiômetro" (por exemplo, Cytosensor®) é uminstrumento analítico que mede a taxa na qual uma célulaacidif ica seu ambiente com o uso de um sensorpotenciométrico acessível por luz (LAPS). Alterações nessataxa de acidificação podem ser usadas como um indicador dainteração entre um composto e fímbrias gram-positivas ouuma proteína de fímbrias gram-positivas.

Em algumas modalidades, é fornecido um ensaio semcélulas, no qual uma fímbria gram-positiva (por exemplo, deS. pneumoniae), ou uma proteína de fímbria gram-positiva ouporção biologicamente ativa desta, é colocada em contatocom um composto de teste, e a habilidade do composto deteste para se ligar à fímbria gram-positiva, ou a umaproteína de fímbria gram-positiva ou porção biologicamenteativa desta, é avaliada. Em geral, porções biologicamenteativas das fímbrias gram-positivas ou de proteínas defímbrias gram-positivas a serem usadas nos novos ensaiosincluem fragmentos que participam em interações comfímbrias gram-positivas ou com moléculas de proteína defímbrias gram-positivas.

Ensaios sem células envolvem a preparação de uma mistura de reação da proteína do gene-alvo e do composto deteste, sob condições e por um período suficiente parapermitir que os dois componentes interajam e se liguem,formando, dessa forma, um complexo que pode ser removidoe/ou detectado.

a interação entre duas moléculas também pode serdetectada, por exemplo, com o uso de transferência deenergia de fluorescência (FET) (veja, por exemplo, Lakowicze cols., Patente U.S. N0 5.631.169 e Stavrianopoulos ecols., Patente U.S. N0 4.868.103). É selecionado ummarcador de fluoróforo na primeira molécula "doadora" detal forma que sua energia fluorescente emitida sejaabsorvida por um marcador fluorescente em uma segundamolécula "receptora", a qual, por sua vez, é capaz defluorescer em função da energia absorvida.

Alternativamente, a molécula "doadora" de proteína podesimplesmente utilizar a energia fluorescente natural deresíduos de triptofano. São escolhidos marcadores queemitem diferentes comprimentos de onda de luz, de tal formaque o marcador da molécula "receptora" possa serdiferenciado da "doadora". Na medida em que a eficiência detransferência de energia entre os marcadores estárelacionada à distância que separa as moléculas, orelacionamento espacial entre as moléculas pode seravaliado. Em uma situação em que ocorre ligação entre asmoléculas, a emissão fluorescente do marcador da molécula"receptora" no ensaio deve ser máxima. Um evento de ligaçãoFET pode ser convenientemente medido por meio de meiospadronizados de detecção fluorométrica bem conhecidos natécnica (por exemplo, com o uso de um fluorímetro).

Em algumas modalidades, a determinação da habilidadede uma fímbria gram-positiva (por exemplo, de S.pneumoniae) ou de uma proteína de uma fímbria gram-positiva(por exemplo, de S. pneumoniae) para se ligar a umamolécula-alvo (por exemplo, um polipeptídeo defibrinogênio, fibronectina ou colágeno, ou fragmentodestes) pode ser obtida com o uso de Análise de InteraçãoBiomolecular (BIA) em tempo real (por exemplo, Sjolander ecols., 1991, Anal. Chem., 63: 2.338-2.345 e Szabo e cols.,1995, Curr. Opin. Struct. Biol., 5: 699-705). A"ressonância por plasmônio de superfície" ou "ΒΙΑ" detectainterações bioespecíficas em tempo real, sem marcação denenhum dos reagentes (por exemplo, BIAcore). Mudanças namassa na superfície de ligação (indicativas de um evento deligação) causam alterações do índice refrativo da luzpróximo à superfície (o fenômeno óptico de ressonância porplasmônio de superfície (SPR)), produzindo um sinaldetectável que pode ser usado como uma indicação de reaçõesem tempo real entre moléculas biológicas.

Em algumas modalidades, o produto gênico-alvo ou asubstância de teste é ancorado em uma fase sólida. Oscomplexos de produto gênico-alvo/composto de testeancorados na fase sólida podem ser detectados ao final dareação. 0 produto gênico-alvo pode ser ancorado em umasuperfície sólida, e o composto de teste, que não estáancorado, pode ser marcado, direta ou indiretamente, com ummarcador detectável aqui discutido.

Vários produtos gênicos-alvo podem ser ancorados emuma fase sólida com o uso da tecnologia de microarranjo deproteína, que também é conhecida por outros nomes,incluindo: tecnologia de chip de proteína e tecnologia dearranjo de proteína de fase sólida. A tecnologia demicroarranjo é bem conhecida por aqueles habilitados natécnica e está baseada, sem limitação, na obtenção de umarranjo de peptídeos ou proteínas identificados em umsubstrato fixado, a ligação de moléculas-alvo ouconstituintes biológicos aos peptídeos, e avaliação dessaligação. Veja, por exemplo, G. MacBeath e S.L. Schreiber,"Printing Proteins as Microarrays for High-ThroughputFunction Determination", Science 289 (5485): 1.760-1.763,2000. Substratos de microarranjo incluem, sem limitação,vidro, sílica, aluminossilicatos, borossilicatos, óxidosmetálicos, por exemplo, alumina e óxido de níquel, váriasargilas, nitrocelulose ou náilon. Os substratos demicroarranjo podem ser revestidos com um composto paraaumentar a síntese de uma sonda (por exemplo, um peptídeo)no substrato. Agentes ou grupos de acoplamento no substratopodem ser usados para ligar covalentemente o primeiroaminoácido ao substrato. Diversos agentes ou grupos deacoplamento são conhecidos por aqueles habilitados natécnica. Podem ser sintetizadas sondas peptídicasdiretamente no substrato em uma tela predeterminada.Alternativamente, sondas peptídicas podem ser salpicadas nosubstrato e, nesse caso, o substrato pode ser revestido comum composto para aumentar a ligação da sonda ao substrato.Nessas modalidades, sondas pré-sintetizadas são aplicadasao substrato em um volume e em um padrão de telapredeterminados, precisos, preferivelmente com a utilizaçãode um robô controlado por computador para aplicar a sondaao substrato de uma forma por impressão por contato ou deuma forma sem contato como, por exemplo, jato de tinta ouliberação piezelétrica. As sondas podem ser ligadascovalentemente ao substrato. Em algumas modalidades, um oumais peptídeo ou moléculas de proteína de controle sãoanexados ao substrato. Peptídeo ou moléculas de proteína decontrole permitem a determinação de fatores, tais comoqualidade e características de ligação do peptídeo ou daproteína, qualidade e eficácia do reagente, sucesso dahibridização e limiares e sucesso da análise.

Em algumas modalidades, é desejável imobilizar asfímbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) oude uma proteína de fímbrias gram-positivas, um anticorpoantifímbria ou antiproteína de fímbria ou uma proteína deligação de fímbria gram-positiva (por exemplo, umanticorpo) para facilitar a separação de formas em complexode formas que não estão em complexo ou ambas as proteínas,bem como acomodar a automatização do ensaio. A ligação deum composto de teste às fímbrias gram-positivas ou a umaproteína de fímbria gram-positiva, ou a interação defímbrias gram-positivas ou de uma proteína de fímbria gram-positiva com uma molécula-alvo na presença ou ausência deum composto candidato, pode ser obtida em qualquer vasoadequado para conter os reagentes. Exemplos desses vasosincluem placas de microlitro, tubos de ensaio e tubos damicrocentrífuga. Em uma modalidade, pode ser fornecida umaproteína de fusão que adiciona um domínio que permite queuma ou ambas as proteínas sejam ligadas a uma matriz. Porexemplo, proteínas de fusão de glutationa-S-transferase/proteína de fímbria ou proteínas de fusãoglutationa-S-transferase/alvo podem ser adsorvidas sobreglóbulos de glutationa Sefarose™ (Sigma Chemical, St.Louis, MO) ou placas de microlitro derivatizadas comglutationa, que são então combinadas com o composto deteste, ou o composto de teste e a proteína-alvo nãoadsorvida ou fímbrias gram-positivas ou uma proteína defímbrias gram-positivas, e a mistura incubada sob condiçõesque conduzem à formação de complexos (por exemplo, emcondições fisiológicas para sal e pH) . Após incubação, osglóbulos ou os poços de uma placa de microtitulação sãolavados para a remoção de componentes não ligados, damatriz imobilizada, no caso de glóbulos, o complexo édeterminado direta ou indiretamente, por exemplo, comodescrito acima. Alternativamente, os complexos podem serdissociados da matriz, e o nível de ligação ou da atividadede fímbrias gram-positivas ou de uma proteína de fímbriagram-positiva é determinado com o uso de técnicaspadronizadas.

Outras técnicas para a imobilização de fímbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) ou de umaproteína de fímbrias gram-positivas ou de um alvo deligação sobre matrizes incluem o uso da conjugação debiotina e estreptavidina. Fímbrias gram-positivas ou umaproteína de fímbria gram-positiva ou moléculas-alvobiotiniladas podem ser preparadas a partir de biotina-NHS(N-hidróxi-succinimida) com o uso de metodologiasconhecidas na técnica (por exemplo, kits de biotinilação dePierce Chemicals, Rockford, IL), e imobilizadas nos poçosde placas de 96 poços revestidas com estreptavidina (PierceChemical).

Para a realização do ensaio, o componente nãoimobilizado é adicionado à superfície revestida que contémo componente ancorado. Após o término da reação, oscomponentes não reagidos são removidos (por exemplo, porlavagem) sob condições que façam com que quaisquercomplexos formados permaneçam imobilizados na superfíciesólida. A detecção de complexos ancorados na superfíciesólida pode ser efetuada por várias formas. Quando ocomponente previamente não imobilizado é pré-marcado, adetecção do marcador imobilizado na superfície indica queforam formados complexos. Quanto o componente previamentenão imobilizado não é pré-marcado, pode ser usado ummarcador indireto para a detecção de complexos ancorados nasuperfície; por exemplo, o uso de um anticorpo específicomarcado para o componente imobilizado (o anticorpo, por suavez, pode ser marcado diretamente ou marcado indiretamentecom, por exemplo, um anticorpo anti-Ig marcado).

Em algumas modalidades, esse ensaio é realizado com autilização de anticorpos que se ligam especificamente àsfímbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) oua uma proteína de uma fímbria gram-positiva (por exemplo,de S. pneumoniae) ou alvos de ligação, mas não interferemcom a ligação das fímbrias gram-positivas ou da proteína defímbrias gram-positivas ao seu alvo. Esses anticorpos podemser derivatizados para os poços da placa, e o alvo, oufímbrias gram-positivas ou proteína de fímbrias gram-positivas, não ligado capturado nos poços por conjugação deanticorpo. Métodos para a detecção desses complexos, alémdaqueles descritos acima para os complexos imobilizados emGST, incluem a imunodetecção de complexos com o uso deanticorpos reativos com as fímbrias gram-positivas ou comuma proteína de fímbria gram-positiva ou molécula-alvo, bemcomo ensaios ligados à enzima que se baseiam na detecção deuma atividade enzimática associada às fímbrias gram-positivas ou a uma proteína de fímbria gram-positiva oumolécula-alvo.

Em algumas modalidades, ensaios sem células podem serrealizados em uma fase líquida. Em um ensaio desse tipo, osprodutos de reação são separados de componentes nãoreagidos, por qualquer uma entre diversas técnicaspadronizadas, incluindo, sem limitação: centrifugaçãodiferencial (por exemplo, Rivas e cols., 1993, TrendsBiochem. Sci., 18: 284-287); cromatografia (cromatografiapor filtração em gel, cromatografia por troca iônica);eletroforese (por exemplo, Ausubel e cols., eds., 1999,"Current Protocols in Molecular Biology", J. Wiley: NovaYork.); e imunoprecipitação (por exemplo, Ausubel e cols.,eds., 1999, "Current Protocols in Molecular Biology", J.Wiley: Nova York). Essas resinas e técnicas cromatográficassão conhecidas por aqueles habilitados na técnica (porexemplo, Heegaard, 1998, J. Mol. Recognit., 11: 141-148 eHage e cols., 1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. Appl.,699: 499-525). Além disso, a transferência de energia defluorescência também pode ser convenientemente utilizada,como aqui descrito, para detectar a ligação, sempurificação adicional do complexo da solução.

Em algumas modalidades, o ensaio inclui o contato dasfímbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) oude uma proteína de uma fímbria gram-positiva (por exemplo,de S. pneumoniae) ou uma porção biologicamente ativa desta,com uma célula ou um composto conhecido (por exemplo, umaproteína) que se liga às fímbrias gram-positivas ou com umaproteína de uma fímbria gram-positiva para formar umamistura de ensaio, o contato da mistura de ensaio com umcomposto de teste e a determinação da habilidade docomposto de teste para afetar a ligação das fímbrias gram-positivas ou uma de proteína de fímbria gram-positiva àcélula ou ao composto.

Em algumas modalidades, um ensaio para ligação dascélulas bacterianas que expressam fímbrias de S. pneumoniaeenvolve a incubação de células bacterianas que expressamfímbrias de S. pneumoniae com células epiteliais pulmonaresΑ54 9, lavagem para a remoção de células bacterianas nãoaderentes, e a detecção das células bacterianas aderentes.A aderência bacteriana pode ser medida por qualquer meioconhecido na técnica, por exemplo, detecção da ligação deum anticorpo às células bacterianas aderentes ou Iise dascélulas epiteliais e contagem do número de célulasbacterianas associadas. Células HEP2, células CHO oucélulas HeLa também podem ser usadas em ensaios de ligaçãode células bacterianas que expressam fímbrias de S.pneumoniae.

Composições imunogênicas

As composições imunogênicas da invenção que incluemfimbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae)podem ainda compreender um ou mais agentes antigênicos.Antígenos exemplares incluem aqueles listados abaixo.Adicionalmente, as composições da presente invenção podemser usadas para tratar ou evitar infecções causadas porqualquer um dos micróbios listados abaixo ou micróbiosrelacionados. Antígenos para uso nas composiçõesimunogênicas incluem, sem limitação, um ou mais dosseguintes apresentados abaixo, ou antígenos derivados de umou mais dos seguintes apresentados abaixo:

Antígenos bacterianos

N. meningitidis: um antígeno protéico de N.25 meningitidis sorogrupo A, C, W135 Y e/ou B (1-7) ; umapreparação de vesícula da membrana externa (OMV) de N.meningitidis sorogrupo B. (8, 9, 10, 11); um antígenosacarídico, incluindo LPS, de N. meningitidis sorogrupo A,B, C Wl35 e/ou Y como, por exemplo, o oligossacarídeo do30 sorogrupo C (veja PCT/US99/09346; PCT IB98/01665; e PCT11399/00103);

Streptococcus pneumoniae: um antígeno sacarídico ouprotéico, particularmente um sacarídeo de Streptococcuspneumoniae ou uma proteína ou peptídeo antigênico de PhtD(BVH-11-2, SP1003, spr0907) (Adamou e eols., Infeet.Iwmun., 69: 949-53, 2001; Hamel e eols., Infeet. Immun.,72: 2.659-70, 2004); PhtE (BVH-3, SP1004, spr0908) (Adamoue eols., Infeet. Immun., 69: 949-53, 2001; Hamel e eols.,Infeet. Immun., 72: 2.659-70, 2004); PhtB (PhpA, BVH-11,SP1174, sprl060) (Adamou e eols., Infeet. Immun., 69: 949-53, 2001; Zhang e eols., Infeet. Immun., 69: 3.827-36,2001; Hamel e eols., Infeet. Immun., 72: 2.659-70, 2004);PhtA (BVH-11-3, SP1175, sprl061) (Adamou e eols., Infeet.Immun., 69: 949-53, 2001; Wizemann e eols., Infeet. Immun.,69: 1.593-98, 2001; Zhang e eols., Infeet. Immun., 69:3.827-36, 2001; Hamel e eols., Infeet. Immun., 72: 2.659-70, 2004); NanA (SP1693, sprl536) (Tong e eols., Infeet.Immun., 73: 7.775-78, 2005); SP1872 (sprl687) (Brown eeols., Infeet. Immun., 69: 6.702-06, 2001); PspC (CbpA,SP2190, sprl995) (Ogunniyi e eols., Infeet. Immun., 69:5.997-6.003, 2001); PspA (SP0177, spr0121, sprl274) (Brilese eols., Vaeeine, 19: S87-S95, 2001); SP0498 (spr0440);LytB (SP0965, spr0867) (Wizemann e eols., Infeet. Immun.,69: 1.593-98, 2001); AliB (SP1527, sprl382); PpmA (SP0981,spr0884) (Overweg e eols., Infeet. Immun., 68: 4.180-4.188,2000); LytC (SP1573, sprl431) (Wizemann e eols., Infeet.Immun., 69: 1.593-98, 2001); PsaA (Briles e eols., Vaeeine,19: S87-S95, 2001); PdB (Ogunniyi e eols., Infeet. Immun.,69: 5.997-6.003, 2001); RPhp (Zhang e eols., Infeet.Immun., 69: 3.827-36, 2001); PiuA (Jomaa e eols., Vaeeine,24: 5.133-39, 2006); PiaA (Jomaa e cols., Vaccine, 24:5.133-39, 2006); 6 PGD (Daniely e cols., Clin. Εχρ.Iwmunol., 144: 254-263, 2006); ou PppA (Green e cols.,

Infect. Iwmun., 73: 981-89, 2005);

Streptococcus agalactiae: particularmente, antigenosestreptocócicos do Grupo B;

Streptococcus pyogenes: particularmente, antigenosestreptocócicos do Grupo A;

Enterococcus faecalis ou Enterococcus faecium:

particularmente uma repetição de trissacarideo ou outrosantigenos derivados de Enterococcus fornecidos na PatenteU.S. N0 6.756.361;

Helicobacter pylori: incluindo antigeno Cag, Vac, Nap,HopX, HopY e/ou urease;

Bordetella pertussis: por exemplo, holotoxina depertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B.pertussis, opcionalmente também combinação com pertactinae/ou antigeno de aglutinógenos 2 e 3;

Staphylococcus aureus: incluindo polissacarídeoscapsulares de S. aureus do tipo 5 e 8, opcionalmenteconjugados à exotoxina A atóxica recombinante dePseudomonas aeruginosa, por exemplo, StaphVAX , ouantigenos derivados de proteínas de superfície, invasinas(leucocidina, quinases, hialuronidase), fatores desuperfície que inibem o engolfamento fagocítico (cápsula,Proteína A) , carotenóides, produção de catalase, ProteínaA, coagulase, fator de coagulação e/ou toxinas quedanificam a membrana (opcionalmente detoxifiçadas) quelisam membranas celulares eucarióticas (hemolisinas,leucotoxina, leucocidina);Staphylococcus epidermis: particularmente, antígeno deS. epidermidis associado ao biofilme slime (SAA);

Staphylococcus saprophytieus: (que causam infecções dotrato urinário), particularmente a hemaglutinina de 160 kDado antígeno de S. saprophytieus;

Pseudomonas aeruginosa: particularmente, endotoxina A,proteína Wzz, LPS de P. aeruginosa, mais particularmenteLPS isolado de PAOl (sorotipo 05) e/ou proteínas damembrana externa, incluindo proteínas da membrana externa F(OprF) (Infeet. Immun. maio de 2001; 69(5): 3.510-3.515);

Baeillus anthraeis (antraz): por exemplo, antígenos deB. anthraeis (opcionalmente detoxifiçados) de componentes A(fator letal (LF) e fator de edema (EF)), ambos podendocompartilhar um componente B comum conhecido como antígenoprotetor (PA);

Moraxella eatarrhalis: (respiratória) incluindoantígenos da proteína da membrana externa (HMW-OMP),antígeno C e/ou LPS;

Yersinia pestis (praga): por exemplo, antígenocapsular Fl (Infeet. Immun. janeiro de 2003; 71(1)): 374-383, LPS (Infeet. Immun. outubro de 1999; 67(10): 5395),antígeno V de Yersinia pestis {Infeet. Immun. novembro de1997; 65(11): 4.476-4.482);

Yérsinia enteroeolitiea (patógeno gastrintestinal):particularmente LPS {Infeet. Immun. agosto de 2002; 70(8):4.414) ;

Yersinia pseudotubereulosis: antígenos de patógenogastrintestinal;

Myeobaeterium tubereulosis: por exemplo,lipoproteínas, LPS, antígenos de BCG, uma proteína de fusãode antígeno 85B (Ag85B) e/ou ESAT-6, formuladosopcionalmente em vesículas lipídicas catiônicas (Infect.Immun. outubro de 2004; 72 (10): 6148), antígenos associadosà isocitrato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis(Mtb) (Proc. Natl. Acad. Sci USA. 24 de agosto de 2004; 101(34): 12.652) e/ou antígenos MPT51 (Infeet. Immun. julho de2004; 72 (7) : 3829) ;

Legionella pneumophila (doença dos legionários):antígenos de L. pneumophila opcionalmente derivados delinhagens celulares com genes asd rompidos (Infeet. Immun.maio de 1998; 66(5): 1898);

Riekettsia: incluindo proteínas da membrana externa,incluindo a proteína da membrana externa A e/ou B (OmpB)(Bioehim. Biophys Aeta. Io de novembro de 2004; 1.702(2):145), LPS e antígeno de proteína de superfície (SPA) (J.Autoimmun. junho de 1989; 2 Supl.:81);

E. eoli: incluindo antígenos de E. eolienterotoxigênica (ETEC), E. eoli enteroagregativa (EAggEC) ,E. eoli difusamente aderente (DAEC) , E. eolienteropatogênica (EPEC) e/ou E. eoli enterohemorrágica(EHEC);

Vibrio eholerae: incluindo antígenos de proteinase,LPS, particularmente lipopolissacarídeos de Vibrio eholeraeII, polissacarídeos 01 Inaba 0-específicos, V. eholera013 9, antígenos de vacina IEMl08 (Infeet. Immun. outubro de2003; 71(10): 5.498-504) e/ou toxina da Zonula oeeludens(Zot);

Salmonella typhi (febre tifóide): incluindopolissacarídeos capsulares preferivelmente conjugados (Vi,ou seja, vax-TyVi);Salmonella typhimurium (gastrenterite) : antígenosderivados deste são contemplados para terapias microbianase de câncer, incluindo inibição da angiogênese e modulaçãode flk;

Listeria monocytogenes (infecções sistêmicas empessoas imunocomprometidas ou idosas, infecções do feto):antígenos derivados de L. monocytogenes são usadospreferivelmente como veículos/vetores para liberaçãointracitoplasmática de conjugados/composições associadas dapresente invenção;

Porphyromonas gingivalis: particularmente, proteína damembrana externa (OMP) de P. gingivalis;

Tétano: por exemplo, antígenos de toxóide tetânico(TT) , usados preferivelmente como uma proteínatransportadora em conjunto/conjugada com as composições dapresente invenção;

Difteria: por exemplo, um toxóide diftérico (porexemplo, CRMi97) , adicionalmente antígenos capazes demodular, inibir ou se associar à ribosilação de ADP sãocontemplados para combinação/co-administração/conjugaçãocom as composições da presente invenção; os toxóidesdiftéricos podem ser usados como proteínas transportadoras;

Borrelia burgdorferi (doença de Lyme): por exemplo,antígenos associados ã P3 9 e P13 (uma proteína integral damembrana, Infect. Immun. maio de 2001; 69(5): 3.323-3.334),proteína de variação antigênica VlsE (J. Clin. Microbiol.dezembro de 1999; 37(12): 3.997);

Haemophilus influenzae B: por exemplo, um antígenosacarídico deste;

Klebsiella: por exemplo, uma OMP, incluindo OMP A ouum polissacarídeo opcionalmente conjugado ao toxóidetetânico;

Neisseria gonorrhoeae: incluindo uma proteína Por (ouporina), por exemplo, PorB (veja Zhu e cols., Vaccine(2004) 22:660-669), uma proteína de ligação detransferrina, por exemplo, TbpA e TbpB (veja Price e cols.,Infection and Immunity (2004) 71 (1): 277-283), umaproteína de opacidade (por exemplo, Opa), uma proteínamodificável por redução (Rmp) e preparações de vesícula damembrana externa (OMV) (veja Plante e cols., J. InfectiousDisease (2000) 182:848-855); veja também, por exemplo, WO99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280, WO 02/079243;

Chlamydia pneumoniae: particularmente antígenosprotéicos de C. pneumoniae;

Chlamydia trachomatis: incluindo antígenos derivadosde sorotipos A, B, Ba e C (são agentes do tracoma, umacausa de cegueira), sorotipos LI, L2 e L3 (associados aolinfogranuloma venéreo) e sorotipos, D-K;

Treponema pallidum (sífilis): particularmente umantígeno TmpA; e

Haemophilus ducreyi (que causa o cancróide): incluindoproteína da membrana externa (DsrA).

Quando não citados especificamente, antígenosbacterianos da invenção adicionais podem ser antígenoscapsulares, antígenos polissacarídicos ou antígenosprotéicos de qualquer um dos citados acima. Antígenosbacterianos adicionais também podem incluir uma preparaçãode vesícula da membrana externa (OMV). Adicionalmente,antígenos incluem versões vivas, atenuadas e/ou purificadasde qualquer uma das bactérias mencionadas anteriormente. Osantígenos derivados de bactérias ou micróbios da presenteinvenção podem ser gram-negativos ou gram-positivos eaeróbicos ou anaeróbicos.

Adicionalmente, qualquer um dos sacarídeos derivadosde bactérias acima (polissacarídeos, LPS, LOS ouoligossacarideos) pode ser conjugado a outro agente ouantígeno, por exemplo, uma proteína transportadora (porexemplo, CRMi97) . Essa conjugação pode ser uma conjugaçãodireta efetuada por aminação redutiva de porções carbonilno sacarídeo em grupos amino na proteína, como fornecido naPatente U.S. N0 5.360.897 em Can. J. Biochem. Cell Biol.maio de 1984; 62(5): 270-5. Alternativamente, os sacarídeospodem ser conjugados por meio de um vinculador, porexemplo, com succinimida ou outras ligações fornecidas em"Bioconjugate Techniques", 1996 e "CRC, Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-Linking", 1993.

Antígenos virais

Influenza: incluindo partículas virais inteiras(atenuadas), divididas ou subunidades que compreendemproteínas de superfície hemaglutinina (HA) e/ouneuraminidase (NA); os antígenos de influenza podem serderivados de embriões de galinha ou propagados em culturade células e/ou os antígenos de influenza são derivados deinfluenza tipo A, B e/ou C, entre outros;

Vírus respiratório sincicial (RSV): incluindo aproteína F da cepa A2 de RSV (J. Gen. Virol. novembro de2004; 85 (Pt li;:3229; e/ou glicoproteína G;

Vírus Parainfluenza (PIV) : incluindo PIV do tipo 1, 2,e 3, preferivelmente contendo glicoproteínas hemaglutinina,neuraminidase e/ou de fusão;Poliovírus: incluindo antígenos de uma família depicornaviridae, preferivelmente antígenos de poliovíruscomo, por exemplo, OPV ou, preferivelmente IPV;

Sarampo: incluindo antígeno do vírus dividido dosarampo (MV)1 opcionalmente combinado com Protollin e/ouantígenos presentes na vacina MMR;

Caxumba: incluindo antígenos presentes na vacina MMR;

Rubéola: incluindo antígenos presentes na vacina MMR,além de outros antígenos de Togaviridae, incluindo o vírusda dengue;

Raiva: por exemplo, o vírus inativado liofilizado(RabAvert™) ;

Vírus Flaviviridae: por exemplo, o vírus da febreamarela (e antígenos derivados deste), vírus da encefalitejaponesa, vírus da dengue (tipos 1, 2, 3 ou 4) , vírus daencefalite transmitida por carrapato e vírus do Niloocidental;

Caliciviridae: antígenos destes;

HIV: incluindo antígenos da cepa HIV-I ou HIV-2, porexemplo, gag (p24gag e p55gag), env (gpl60 e gp41), pol,tat, nef, rev vpu, miniproteínas, (preferivelmente p55 gage gpl40v dele te) e antígenos dos isolados Hlllb, HIVsf2,HIVlav, HIViA J, HIVmn, HIV-Icm235 , HIV-Ius4, HIV-2; vírus daimunodeficiência dos símios (SIV), dentre outros;

Rotavírus: incluindo proteínas VP4, VP5, VP6, VP7, VP8(Protein Expr Purif. dezembro de 2004; 38(2): 205) e/ouNS P4 ;

Pestivirus: por exemplo, antígenos do vírus da febresuína clássica, vírus da diarréia bovina viral e/ou vírusda doença da fronteira;Parvovírus: por exemplo, parvovírus B19;

Coronavírus: incluindo antigenos do vírus da SARS,particularmente proteína ou proteases spike destes, além deantigenos incluídos em WO 04/92360;

Vírus da hepatite A: por exemplo, vírus inativado;

Vírus da hepatite B: por exemplo, os antigenos desuperfície e/ou centrais (sAg), além das seqüências pré-superfície, pré-Sl e pré-S2 (anteriormente denominadas pré-S), bem como combinações dos acima citados, por exemplo,sAg/pré-Sl, sAg/pré-S2, sAg/pré-Sl/pré-S2 e pré-Sl/pré-S2,(veja, por exemplo, "AHBV Vaccines - Human Vaccines andVaccination", pp. 159-176; e Patentes U.S. Nos 4.722.840,5.098.704, 5.324.513; Beames e cols., J. Virol. (1995) 69:6.833-6.838, Birnbaum e cols., J Virol. (1990) 64: 3.319-3.330; e Zhou e cols., Virol. (1991) 65: 5.457-5.464);

Vírus da hepatite C: por exemplo, El, E2, E1/E2 (veja,Houghton e cols., Hepatology (1991) 14: 381), poliproteínaNS345, poliproteína central NS 345, núcleo e/ou peptídeosdas regiões não estruturais (Publicações Internacionais NosWO 89/04669, WO 90/11089 e WO 90/14436);

Vírus da hepatite Delta (HDV): antigenos derivadosdeste, particularmente antígeno 6 de HDV (veja, porexemplo, Patente U.S. N0 5.378.814);

Vírus da hepatite E (HEV): antigenos derivados deste;

Vírus da hepatite G (HGV): antigenos derivados deste;

Virus da varcicella zoster: antigenos derivados dovírus varicela zoster (VZV) (J. Gen. Virol. (1986) 67:1.759);

Vírus de Epstein-Barr: antigenos derivados do EBV(Baer e cols., Nature (1984) 310: 207);Citomegalovírus: antígenos do CMV7 incluindo gB e gH("Cytomegaloviruses" (J.K. McDougall, ed., Springer-Verlag1990) pp. 125-169);

Vírus do herpes simples: incluindo antígenos de cepasHSV-I ou HSV-2 e glicoproteínas gB, gD e gH (McGeoch ecols. , J. Gen. Virol. (1988) 69: 1.531 e Patente U.S. N05.171.568) ;

Vírus do herpes humano: antígenos derivados de outrosherpesvírus humanos, tais com o HHV6 e HHV7; e

HPV: incluindo antígenos associados ou derivados dopapilomavírus humano (HPV), por exemplo, um ou mais de El -E7, L1, L2, e fusões destes, particularmente as composiçõesda invenção podem incluir uma partícula semelhante a vírus(Ví rus-like)(VLP) que compreende a proteína principal docapsídeo LI, mais particularmente ainda, os antígenos doHPV são protetores contra um ou mais dos sorotipos do HPV6, 11, 16 e/ou 18.

São ainda fornecidos antígenos, composições, métodos,e micróbios incluídos em "Vaccines", 4* Edição (Plotkin eOrenstein ed. 2004); "Medicai Microbiology" 4a Edição(Murray e cols. ed. 2002); "Virology", 3a Edição (W.K.Joklik ed. 1988); "Fundamental Virology", 2a Edição (B.N.Fields e D.M. Knipe7 eds. 1991), que são contemplados emconjunto com as composições da presente invenção.

Adicionalmente, antígenos incluem versões vivas,atenuadas, divididas e/ou purificadas de qualquer um dosvírus mencionados anteriormente.

Antígenos fúngicos

Antígenos fúngicos para uso na invenção, associados avacinas, incluem aqueles descritos: nas Patentes U.S. Nos4.229.434 e 4.368.191 para profilaxia e tratamento detricofitose causada por Trichophyton mentagrophytes ;Patentes U.S. Nos 5.277.904 e 5.284.652 para uma vacinapara dermatófito de amplo espectro para a profilaxia. deinfecção por dermatófitos em animais, por exemplo,porquinhos-da-índia, gatos, coelhos, cavalos e cordeiros,esses antígenos compreendendo uma suspensão de T equinum,T. mentagrophytes (var. granulare), M. canis e/ou M.gypseum mortos em uma quantidade eficaz, opcionalmentecombinados com um adjuvante; Patentes U.S. Nos 5.453.273 e6.132.733 para uma vacina para tinha que compreende umaquantidade eficaz de fungos homogeneizados, mortos porformaldeído, ou seja, cultura de Microsporum canis em umveículo; Patente U.S. N0 5.94 8.413, que envolve proteínasextracelulares e intracelulares para pitiose. Antígenosadicionais identificados dentro das vacinas antifúngicasincluem Ringvac bovis LTF-13 0 e Bioveta.

Além disso, antígenos fúngicos para uso na invençãopodem ser derivados de Dermatophytres, incluindo:Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporumcanis, Microsporum distortum, Microsporum equinum,Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophytonconcentrieum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae,Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophytonmentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophytonrubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans,Triehophyton verrueosum, T verrucosum var. álbum, var.discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum e/ouTrichophyton faviforme.

Patógenos fúngicos para uso como antígenos ou naderivação de antígenos em conjunto com as composições dapresente invenção compreendem Aspergillus fumigatus,Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillusnidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi,Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus,Blastoschizomyces capitatus, Candida albieans, Candidaenolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candidakrusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candidakusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candidapseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporiumcarrionii, Coccidioides immitis, Blastomyees dermatidis,Cryptococcus neoformans, Geotriehum elavatum, Histoplasmaeapsulatum, Paraeoceidioides brasiliensis, Pneumoeystisearinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale,Saeharomyees eerevisae, Saccharomyees boulardii,Saccharomyees pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrixsehenekii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii,Penieilli um marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp. ,Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp.,Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp,Mortierella spp, Cunninghamella spp e Saksenaea spp.

Outros fungos dos quais antígenos podem ser derivadosincluem Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporiumspp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp,Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp,Pithomyces spp e Cladosporium spp.

Processos para a produção de antígenos fúngicos sãobem conhecidos na técnica (veja Patente U.S. N0 6.333.164).Em algumas modalidades, uma fração solubilizada é extraídae separada de uma fração insolúvel que pode ser obtida decélulas fúngicas das quais a parede celular foisubstancialmente removida ou pelo menos parcialmenteremovida, caracterizada pelo fato de que o processocompreende a obtenção de células fúngicas vivas; a obtençãode células fúngicas das quais a parede celular foisubstancialmente removida ou pelo menos parcialmenteremovida; o rompimento das células fúngicas das quais aparede celular foi substancialmente removida ou pelo menosparcialmente removida; a obtenção de uma fração insolúvel;e a extração e separação de uma fração solubilizada dafração insolúvel.

Antígenos STD

Em algumas modalidades, micróbios (bactérias, víruse/ou fungos) contra os quais as presentes composições emétodos podem ser implementados incluem aqueles que causamdoenças sexualmente transmitidas (DSTs) e/ou aqueles queapresentam em sua superfície um antígeno que possa ser oalvo ou a composição de antígeno da invenção. Em algumasmodalidades da invenção, as composições são combinadas comantígenos derivados de um STD viral ou bacteriano.Antígenos derivados de bactérias ou vírus podem seradministrados em conjunto com as composições da presenteinvenção para fornecer proteção contra pelo menos uma dasseguintes DSTs, dentre outras: clamídia, herpes genital,hepatite (particularmente HCV), condiloma acuminatum,gonorréia, sífilis e/ou cancróide (veja, por exemplo, WO00/15255) .

Em algumas modalidades, as composições da presenteinvenção são co-administradas com um antígeno para aprevenção ou o tratamento de uma DST.Antígenos derivados dos seguintes vírus associados àsDSTs, que foram descritos com mais detalhes acima, são co-administrados com as composições da presente invenção:hepatite (particularmente HCV), HPV, HIV ou HSV.

Adicionalmente, antígenos derivados das seguintesbactérias associadas às DSTs, que foram descritas com maisdetalhes acima, são co-administrados com as composições dapresente invenção: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydiapneumoniae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum ouHaemophilus ducreyi.

Antígenos respiratórios

Em algumas modalidades, o antígeno de fímbria gram-positiva (por exemplo, de S. pneumoniae) é um antígenorespiratório, e é usado em uma composição imunogênica paramétodos de prevenção e/ou tratamento de infecção por umpatógeno respiratório, incluindo um vírus, bactérias oufungos como, por exemplo, o vírus sincicial respiratório(RSV), PTV, vírus da SARS, influenza, Bacillus anthracis,particularmente por redução ou prevenção de infecção e/ouum ou mais sintomas de infecção por um vírus respiratório.Uma composição que compreende um antígeno aqui descrito,por exemplo, um derivado de um vírus, uma bactéria ou umfungo respiratório, é administrada em conjunto com ascomposições da presente invenção a um indivíduo em risco deser exposto àquele micróbio respiratório em particular, quefoi exposto a um micróbio respiratório ou que estáinfectado com um vírus, uma bactéria ou um fungorespiratório. As composições da presente invenção podem serco-administradas ao mesmo tempo ou na mesma formulação comum antígeno do patógeno respiratório. A administração dacomposição resulta em uma incidência e/ou gravidadereduzida de um ou mais sintomas de uma infecçãorespiratória.

Antígenos pediátricos/geriâtricos

Em algumas modalidades, as composições da presenteinvenção são usadas em conjunto com um ou mais antigenospara o tratamento de uma população pediátrica, como em umantigeno pediátrico. Em algumas modalidades, a idade dosindivíduos na população pediátrica é de menos de cerca de 3anos de idade, ou menos de cerca de 2 anos, ou menos decerca de 1 ano de idade. Em algumas modalidades, o antigenopediátrico (em conjunto com a composição da presenteinvenção) é administrado várias vezes ao longo de pelomenos 1, 2 ou 3 anos.

Em algumas modalidades, as composições da presenteinvenção são usadas em conjunto com um ou mais antigenospara o tratamento de uma população geriátrica, como em umantigeno geriátrico. Em algumas modalidades, a idade dosindivíduos na população geriátrica é maior do que 50, 55,60, 65, 70 ou 75 anos de idade.

Outros antigenos

Outros antigenos para uso em conjunto com ascomposições da presente invenção incluem antigenosassociados a infecções hospitalares (nosocomiais).

Em algumas modalidades, antigenos parasíticos sãocontemplados em conjunto com as composições da presenteinvenção. Exemplos de antigenos parasíticos incluem aquelesderivados de organismos que causam doenças, incluindo, semlimitação, malária e/ou doença de Lyme.

Em algumas modalidades, os antigenos, em conjunto comas composições da presente invenção, estão associados e/ousão eficazes contra uma doença transmitida por um mosquito.

Em algumas modalidades, os antígenos em conjunto com ascomposições da presente invenção estão associados com e/ousão eficazes contra encefalite. Em algumas modalidades, osantígenos, em conjunto com as composições da presenteinvenção, estão associados e/ou são eficazes contra umainfecção do sistema nervoso.

Em algumas modalidades, os antígenos, em conjunto comas composições da presente invenção, são antígenostransmissíveis por meio do sangue ou de líquidos corporais.

Formulações de antígeno

Em alguns aspectos da invenção, são fornecidos métodosde produção de micropartículas que possuem antígenosadsorvidos. Os métodos compreendem: (a) o fornecimento deuma emulsão por dispersão de uma mistura que compreende:(i) água, (ii) um detergente, (iii) um solvente orgânico, e(iv) um polímero biodegradável selecionado do grupo queconsiste em um poli(α-hidróxi ácido), um ácido poli-hidróxibutírico, uma policaprolactona, um poliortoéster, umpolianidrido e um policianoacrilato. 0 polímero estátipicamente presente na mistura em uma concentração decerca de 1% a cerca de 30% em relação ao solvente orgânico,enquanto o detergente está tipicamente presente na misturaem uma proporção peso-por-peso detergente-para-polímero decerca de 0,00001:1 a cerca de 0,1:1 (mais tipicamente,cerca de 0,0001:1 a cerca de 0,1:1, cerca de 0,001:1 acerca de 0,1:1, ou cerca de 0,005:1 a cerca de 0,1:1); (b)a remoção do solvente orgânico da emulsão; e (c) a adsorçãode um antígeno na superfície das micropartículas. Emalgumas modalidades, o polímero biodegradável está presenteem uma concentração de cerca de 3% a cerca de 10% emrelação ao solvente orgânico.

Em algumas modalidades, as micropartículas para uso nainvenção podem ser formadas por materiais que sãoesterilizáveis, atóxicos e biodegradáveis. Tais materiaisincluem, sem limitação, poli(α-hidróxi ácido), ácido poli-hidróxi butírico, policaprolactona, poliortoéster,polianidrido, PACA e policianoacrilato. Em algumasmodalidades, as micropartículas para uso com a presenteinvenção são derivadas de um poli(α-hidróxi ácido), emparticular, de uma poli (Iactida) ("PLA") ou um copolímerode D7L-Iactida e glicolida ou ácido glicólico, por exemplo,uma poli(D,L-lactida-co-glicolida) ("PLO" ou "PLGA"), ou umcopolímero de D7L-Iactida e caprolactona. Asmicropartículas podem ser derivadas de qualquer um dentrevários materiais poliméricos de partida que possuem umavariedade de pesos moleculares e, no caso dos copolímeroscomo PLG, diversas proporções de lactida:glicolida, cujaseleção será, em grande parte, uma questão de escolha,dependendo, em parte, da macromolécula co-administrada.Esses parâmetros serão discutidos com mais detalhe abaixo.

Antígenos adicionais também podem incluir umapreparação de vesícula da membrana externa (OMV).

Os antígenos também podem ser adsorvidos apeptidoglicanos de várias bactérias gram-positivas para aprodução de partículas gram-positivas intensificadoras damatriz (GEM), como descrito em Bosnia e cols., Appl. Env.Microbiol., 72: 880-889, 2006, cujo conteúdo total é aquiincorporado por referência. Esse método se baseia naligação não covalente do padrão LysM (Buist e cols., J.Bact., 177: 1.554-63, 1995; Bateman e Bycroft, J. Mol.Biol., 299: 1.113-19, 2000) para o peptidoglicano da paredecelular de células tratadas com ácido. Resumidamente, umantígeno polipeptídico ligado a um ou mais padrões LysM(por exemplo, não covalentemente ou covalentemente (porexemplo, como uma proteína de fusão ou por conjugação)) éadicionado às bactérias gram-positivas tratadas com ácido.

Os peptídeos do antígeno se ligam com alta afinidade, epodem ser usados em composições imunogênicas. Ácidosexemplares usados nesses métodos incluem ácidotricloroacético (por exemplo, a 0,1%-10%), acético ácido(por exemplo, a 5,6 Μ), HCl (por exemplo, a 0,01 Μ), ácidolático (por exemplo, a 0,72 M) e ácido fórmico (porexemplo, a 0,56 M).

Métodos de formulação e antígenos adicionais(especialmente antígenos tumorais) são fornecidos naPatente U.S. N0 de Série 09/581.772.

Referências de antígenos

As seguintes referências, cada uma das quais éespecificamente incorporada por referência em suatotalidade, incluem antígenos úteis em conjunto com ascomposições da presente invenção:

Pedido de patente internacional WO 99/24578.

Pedido de patente internacional WO 99/36544.

Pedido de patente internacional WO 99/57280.

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Pedido de patente internacional depositado em 3 dejulho de 2 001, que reivindica prioridade para GB 0016363.4;WO 02/02606; PCT IB/01/00166.

Kalman e cols. (1999) Nature Genetics 21: 385-389.Read e cols. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1.397-406.Shirai e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181(Supl. 3):S524-S527.

Pedido de patente internacional WO 99/27105.Pedido de patente internacional WO 00/27994.Pedido de patente internacional WO 00/37494.Pedido de patente internacional WO 99/28475.Bell (2000) Pediatr. Infect. Dis. J. 19: 1.187-1.188.Iwarson (1995) APMIS 103: 321-326.

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Proteínas de fusão

As proteínas gram-positivas (por exemplo, de S.pneumoniae) usadas na invenção podem estar presentes nacomposição como polipeptídeos separados individuais. Emalgumas modalidades, pelo menos dois (ou seja, 2, 3, 4, 5,6' 7> 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18) dosantígenos são expressos como uma cadeia polipeptídicasimples (um polipeptídeo "híbrido" ou de "fusão") queinclui uma subunidade da fímbria. Esses polipeptídeos defusão oferecem duas vantagens principais: primeiro, umpolipeptídeo que pode ser instável ou pouco expresso por sipróprio pode ser auxiliado por adição de um parceiro defusão adequado que supera o problema; em segundo lugar, afabricação comercial é simplificada, na medida em queapenas uma expressão e uma purificação precisam ser usadasa fim de produzir dois polipeptídeos que são, ambos,antigenicamente úteis.

O polipeptídeo de fusão pode compreender uma ou maisseqüências polipeptidicas de fimbrias gram-positivas (porexemplo, de S. pneumoniae). Conseqüentemente, a invençãoinclui um ou mais peptídeos de fusão que compreendem umaprimeira seqüência de aminoácidos e uma segunda seqüênciade aminoácidos, em que as referidas primeira e segundaseqüências de aminoácidos são selecionadas de uma proteínade fímbria gram-positiva ou um fragmento desta. Em algumasmodalidades, a primeira e a segunda seqüências deaminoácidos no polipeptídeo de fusão compreendem epitoposdiferentes da mesma proteína.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornecehíbridos (ou fusões) que compreendem seqüências deaminoácidos de dois, três, quatro, cinco, sais, sete, oito,nove ou dez antígenos. Em algumas modalidades, a invençãofornece híbridos que compreendem seqüências de aminoácidosde dois, três, quatro ou cinco antígenos.

Diferentes polipeptídeos híbridos podem ser misturadosem conjunto em uma única formulação. Dentro dessascombinações, seqüência de uma fímbria gram-positiva (porexemplo, de S. pneumoniae) pode estar presente em mais deum polipeptídeo híbrido e/ou como um polipeptídeo nãohíbrido. Em algumas modalidades, um antígeno está presentecomo um híbrido ou como um não híbrido, mas não como ambos.

Polipeptídeos híbridos podem ser representados pelafórmula NH2-A- {-X-L- }n-BC00H, em que: X é uma seqüência deaminoácidos de uma proteína de uma fímbria gram-positiva(por exemplo, de S. pneumoniae) ou um fragmento desta; L éuma seqüência de aminoácidos vinculadora opcional; A é umaseqüência de aminoácidos do terminal N opcional; B é umaseqüência de aminoácidos do terminal C opcional; e η é 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.

Caso uma porção -X- possua uma seqüência peptídicalíder em sua forma do tipo selvagem, essa pode ser incluídaou omitida na proteína híbrida. Em algumas modalidades, ospeptídeos líderes são eliminados, exceto aquele da porção-X- localizado no terminal N da proteína híbrida, ou seja, opeptídeo líder de Xi será retido, mas os peptídeos líderesde X2 ... Xn serão omitidos. Isso eqüivale a eliminar todosos peptídeos líderes e com o uso do peptídeo líder de X1como porção -A-.

Para cada η casos de {-X-L-}, a seqüência deaminoácidos vinculadora -L- pode estar presente ou ausente.Por exemplo, quando η = 2, o híbrido pode ser NH2-Xi-Li-X2-L2-COOH, NH2-Xi-X2-COOH, NH2-Xi-Li-X2-COOHi NH2-Xi-X2-L2-COOHetc. Seqüências de aminoácidos vinculadoras -L- tipicamenteserão curtas (por exemplo, 2 0 aminoácidos ou menos, ouseja, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, 1). Exemplos compreendem seqüências peptídicascurtas que facilitam a clonagem, vinculadores de poli-glicina (ou seja, que compreendem Glyn, em que η = 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais), e tags de histidina (ou seja,His, em que η = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais). Outrasseqüências de aminoácidos vinculadoras adequadas ficarãoevidentes para aqueles habilitados na técnica. Umvinculador útil é GSGGGG (ID. DE SEQ. N°: 53), com odipeptídeo Gly-Ser sendo formado por um sítio de restriçãoBawHIl ajudando, dessa forma, a clonagem e manipulação, e otetrapeptídeo (Gly)4 sendo um vinculador de poli-glicinatípico.

Em algumas modalidades, -A- é uma seqüência deaminoácidos do terminal N opcional. Ela tipicamente serácurta (por exemplo, 40 aminoácidos· ou menos, ou seja, 39,38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24,23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Exemplos incluem seqüênciaslíderes para dirigir o trafego de proteína, ou seqüênciaspeptídicas curtas que facilitam a clonagem ou purificação(por exemplo, tags de histidina, ou seja, Hisn, em que η =3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais). Outras seqüências deaminoácidos do terminal N adequadas ficarão evidentes paraaqueles habilitados na técnica. Caso Xi não possua suaprópria metionina do terminal N, em algumas modalidades -A-é um oligopeptídeo (por exemplo, com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou8 aminoácidos) que fornece uma metionina do terminal N.

Em algumas modalidades, -B- é uma seqüência deaminoácidos do terminal C opcional. Essa tipicamente serácurta (por exemplo, 40 aminoácidos ou menos, ou seja, 39,38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24,23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Exemplos incluem seqüências paradirigir o tráfego de proteínas, seqüências peptídicascurtas que facilitam a clonagem ou purificação (porexemplo, que compreendem tags de histidina, ou seja, Hisn,em que η = 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais), ou seqüências queaumentam a estabilidade da proteína. Outras seqüências deaminoácidos do terminal C adequadas ficarão evidentes paraaqueles habilitados na técnica.

Em algumas modalidades, η é 2 ou 3.

Composições imunogênicas e medicamentos

Em algumas modalidades, as composições da invenção sãocomposições imunogênicas. Em algumas modalidades, ascomposições são composições de vacina. Em algumasmodalidades, o pH da composição é entre 6 e 8 e, em algumasmodalidades, é de cerca de 7. O pH pode ser mantido pelouso de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou isentade pirogênio. A composição pode ser isotônica com relaçãoaos seres humanos. Em algumas modalidades, a composição éum injetável estéril.

Vacinas de acordo com a invenção podem serprofiláticas (ou seja, para evitar a infecção) outerapêuticas (ou seja, para tratar a infecção).

Conseqüentemente, a invenção fornece métodos para otratamento terapêutico ou profilático de uma infecçãobacteriana gram-positiva (por exemplo, por S. pneumoniae)em um animal suscetível a essa infecção bacteriana gram-positiva (por exemplo, por S. pneumoniae) que compreende aadministração ao referido animal de uma quantidadeterapêutica ou profilática das composições da invenção. Porexemplo, a invenção inclui métodos para o tratamentoterapêutico ou profilático de uma infecção por S.pneumoniae em um animal suscetível à infecçãoestreptocócica que compreende a administração ao referidoanimal de uma quantidade terapêutica ou profilática dascomposições da invenção.

A invenção também fornece composições da invenção parauso das composições aqui descritas como um medicamento. Emalgumas modalidades, o medicamento desperta uma respostaimunológica em um mamífero (ou seja, ele é uma composiçãoimunogênica). Em algumas modalidades, o medicamento é umavacina.

A invenção também fornece o uso das composições dainvenção na fabricação de um medicamento para despertar umaresposta imunológica em um mamífero. Em algumasmodalidades, o medicamento é uma vacina.

A invenção também fornece kits que compreendem um oumais recipientes de composições da invenção. As composiçõespodem estar em forma líquida ou podem ser Iiofilizadas, bemcomo antígenos individuais. Recipientes adequados para ascomposições incluem, por exemplo, garrafas, frascos,seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem serformados por diversos materiais, incluindo vidro ouplástico. Um recipiente pode ter uma entrada de acessoestéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa desolução intravenosa ou um frasco que possui uma tampa quepossa ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica).

A composição pode compreender um primeiro componente quecompreende uma ou mais fímbrias gram-positivas (porexemplo, de S. pneumoniae) ou proteínas da fímbria. Emalgumas modalidades, as fímbrias gram-positivas ouproteínas da fímbria estão em uma forma oligomérica ouhiperoligomérica.

0 kit pode ainda compreender um segundo recipiente quecompreende um tampão farmaceuticamente aceitável, porexemplo, solução salina tamponada com fosfato, solução deRinger ou solução de dextrose. Ele também pode conteroutros materiais úteis ao usuário final, incluindo outrostampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. 0 kittambém pode compreender um segundo ou terceiro recipientecom outro agente ativo, por exemplo, um antibiótico.

O kit também pode compreender uma bula que contenhainstruções escritas para os métodos de indução de imunidadecontra uma bactéria gram-positiva (por exemplo, S.pneumoniae) ou para o tratamento de infecções bacterianasgram-positivas. A bula pode ser uma versão preliminar nãoaprovada da bula ou pode ser uma bula aprovada pelo FDA("Food and Drug Administration" - agência governamentalamericana que regula e fiscaliza a fabricação decomestíveis, drogas e cosméticos) ou por outra agênciareguladora.

A invenção também fornece um dispositivo de liberaçãopré-preenchido com as composições imunogênicas da invenção.

A invenção também fornece métodos para a indução deuma resposta imunológica em um mamífero que compreendem aetapa de administração de uma quantidade eficaz de umacomposição da invenção. A resposta imunológica é, emalgumas modalidades, protetora e, em algumas modalidades,envolve imunidade por anticorpos e/ou imunidade mediada porcélulas. Essa resposta imunológica preferivelmente induziráimunidade por anticorpos duradoura (por exemplo,neutralização) e uma imunidade mediada por células quepossa responder rapidamente mediante exposição a um ou maisantígenos gram-positivos (por exemplo, de S. pneumoniae). 0método pode despertar uma resposta de reforço.

A invenção fornece um método de neutralização de umainfecção bacteriana gram-positiva (por exemplo, por S.pneumoniae) em um mamífero que compreende a administraçãoao mamífero de uma quantidade eficaz das composiçõesimunogênicas da invenção, uma vacina da invenção ouanticorpos que reconhecem uma composição imunogênica dainvenção.

Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.Quando a vacina for para uso profilático, o ser humanopoderá ser do sexo masculino ou feminino (uma criança ou umadolescente). Alternativamente, o ser humano pode ser umidoso (por exemplo, acima 50, 55, 60, 65, 70 ou 75 anos deidade) e pode ter uma doença subjacente como, por exemplo,diabetes ou câncer. Em algumas modalidades, o ser humano éuma mulher grávida ou um adulto idoso.

Em algumas modalidades, esses usos e métodos são paraa prevenção e/ou o tratamento de uma doença causada por umabactéria gram-positiva (por exemplo, 3. pneumoniae). Ascomposições também podem ser eficazes contra outrasbactérias estreptocócicas. As composições também podem sereficazes contra outras bactérias gram-positivas.

Um método para verificar a eficácia do tratamentoterapêutico envolve o monitoramento da infecção bacterianagram-positiva (por exemplo, por 3. pneumoniae) após aadministração de uma ou mais composições da invenção. Asrespostas imunológicas contra os antígenos gram-positivos(por exemplo, de S. pneumoniae) nas composições da invençãopodem ser monitoradas após a administração das composições.

Um método não limitante de avaliação daimunogenicidade das proteínas componentes das composiçõesimunogênicas da presente invenção é a expressão dasproteínas de forma recombinante e pesquisar o soro dopaciente ou suas secreções mucosas por imunoblot. Umareação positiva entre a proteína e o soro do pacienteindica que o paciente desenvolveu previamente uma respostaimunológica à proteína em questão, ou seja, a proteína é umimunógeno. Esse método também pode ser usado paraidentificar proteínas e/ou epitopos imunodominantes.

Outro método não limitante de verificação da eficáciado tratamento terapêutico envolve o monitoramento dainfecção bacteriana gram-positiva (por exemplo, por S.pneumoniae) após administração das composições da invenção.

Um meio de verificar a eficácia do tratamento profiláticoenvolve o monitoramento das respostas imunológicas tantosistemicamente (por exemplo, monitoramento do nível deprodução de IgGl e IgG2a) quanto nas mucosas (por exemplo,monitoramento do nível de produção de IgA) contra osantígenos gram-positivos (por exemplo, de S. pneumoniae)nas composições da invenção após administração dacomposição. Tipicamente, respostas de anticorpos séricosespecíficos para bactérias gram-positivas são determinadaspós-imunização, mas pré-ataque.

As composições de vacina da presente invenção podem,em algumas modalidades, ser avaliadas em modelos animais invitro e in vivo antes da administração ao hospedeiro, porexemplo, ao ser humano.

A eficácia de composições imunogênicas da invençãotambém pode ser determinada in vivo atacando-se modelosanimais de infecção por bactérias gram-positivas (porexemplo, por S. pneumoniae), por exemplo, porquinhos-da-índia ou camundongos, com as composições imunogênicas. Ascomposições imunogênicas podem ou não ser derivadas dosmesmos sorotipos que os sorotipos de ataque. Em algumasmodalidades, as composições imunogênicas são deriváveis dosmesmos sorotipos que os sorotipos de ataque. Em algumasmodalidades, a composição imunogênica e/ou os sorotipos deataque são deriváveis do grupo de sorotipos gram-positivos(por exemplo, de S. pneumoniae).

Modelos de eficácia in vivo incluem, sem limitação:

(i) um modelo de infecção murideo que utiliza sorotipos debactérias gram-positivas humanas (por exemplo, de S.pneumoniae); (ii) um modelo de doença murideo que é ummodelo murideo que usa uma cepa de bactérias gram-positivasadaptada ao camundongo (por exemplo, S. pneumoniae), taiscomo aquelas cepas que são particularmente virulentas emcamundongos e (iii) um modelo primata que usa isolados debactérias gram-positivas humanas (por exemplo, de S.pneumoniae).

A resposta imunológica pode ser uma ou ambas de umaresposta imunológica THl e uma resposta TH2.

A resposta imunológica pode ser uma respostaimunológica aumentada ou intensificada ou uma respostaimunológica alterada.

A resposta imunológica pode ser uma ou ambas de umaresposta imunológica sistêmica e uma resposta imunológicamucosa.

Em algumas modalidades, a resposta imunológica é umaresposta sistêmica e/ou mucosa aumentada.

Uma imunidade sistêmica e/ou de mucosa aumentada érefletida em uma resposta imunológica THl e/ou TH2aumentada. Em algumas modalidades, a resposta imunológicaaumentada inclui um aumento na produção de IgGl e/ou IgG2ae/ou IgA.Em algumas modalidades, a resposta imunológica mucosaé uma resposta imunológica TH2. Em algumas modalidades, aresposta imunológica mucosa inclui um aumento na produçãode IgA.

Células TH2 ativadas aumentam a produção de anticorpoe são, portanto, úteis na resposta às infecçõesextracelulares. Células TH2 ativadas podem secretar um oumais de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-IO. Uma resposta imunológicaTH2 pode resultar na produção de IgGl, IgE, IgA e células Bde memória para proteção futura.

Uma resposta imunológica TH2 pode incluir um ou maisde um aumento em uma ou mais das citocinas associadas a umaresposta imunológica TH2 (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-6 eIL-10), ou um aumento na produção de IgGl, IgE, IgA ecélulas B de memória. Em algumas modalidades, a respostaimunológica TH2 aumentada incluirá um aumento na produçãode IgGl.

Uma resposta imunológica THl pode incluir um ou maisde um aumento em CTLs, um aumento em uma ou mais dascitocinas associadas a uma resposta imunológica THl (porexemplo, IL-2, IFN-γ e TNF-β), um aumento em macrófagosativados, um aumento da atividade de NK ou um aumento naprodução de IgG2. Em algumas modalidades, a respostaimunológica THl aumentada incluirá um aumento na produçãode IgG2.

As composições imunogênicas da invenção, emparticular, as composições imunogênicas que compreendem umou mais antígenos de fímbrias gram-positivas (por exemplo,de S. pneumoniae) da presente invenção, podem ser usadastanto isoladamente quanto em combinação com outrosantígenos, opcionalmente com um agente imunorreguladorcapaz de despertar uma resposta Thl e/ou Th2.

As composições da invenção geralmente serãoadministradas diretamente a um paciente. Certas vias podemser favoráveis a certas composições, na medida em queresultam na geração de uma resposta imunológica maiseficaz, preferivelmente uma resposta CMI, ou em que possuemmenor probabilidade de induzir efeitos colaterais, ou emque são mais fáceis para administração. A liberação diretapode ser obtida por injeção parenteral (por exemplo,subcutânea, intraperitoneal, intradérmica, intravenosa,intramuscular ou no espaço intersticial de um tecido), oupor administração retal, oral (por exemplo, comprimido,spray), vaginal, tópica, transdérmica (por exemplo, veja WO99/27961) ou transcutânea (por exemplo, veja WO 02/074244 eWO 02/064162), intranasal (por exemplo, veja WO 03/028760),ocular, aural, pulmonar ou a outra mucosa.

Em algumas modalidades, a invenção pode ser usada paradespertar imunidade sistêmica e/ou mucosa.

Em algumas modalidades, a composição imunogênicacompreende um ou mais antígenos de fímbrias gram-positivas(por exemplo, de S. pneumoniae) que despertam uma respostade anticorpo neutralizante e um ou mais antígenos defímbrias gram-positivas (por exemplo, de S. pneumoniae) quedespertam uma resposta imunológica mediada por células. Emalgumas modalidades, a resposta de anticorpo neutralizanteevita ou inibe uma infecção bacteriana gram-positivainicial, enquanto a resposta imunológica mediada porcélulas capaz de despertar uma resposta celular Thlaumentada evita a disseminação posterior da infecção. Acomposição imunogênica pode incluir um ou mais antigenos defímbrias gram-positivas e um ou mais antigenos que não sãode fímbrias gram-positivas, por exemplo, antigenoscitoplasmáticos. Em algumas modalidades, a composiçãoimunogênica compreende um ou mais antigenos de superfíciegram-positivos ou semelhantes e um ou mais antigenos, porexemplo, um antígeno citoplasmático capaz de despertar umaresposta celular Thl.

A dosagem do tratamento pode ser um esquema de doseúnica ou um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplaspodem ser usadas em um esquema de imunização primária e/ouem um esquema de imunização de reforço. Em um esquema dedoses múltiplas, as várias doses podem ser dadas pela mesmavia ou por vias diferentes, por exemplo, uma dose inicialparenteral e um reforço mucoso, uma dose inicial mucosa eum reforço parenteral etc.

As composições da invenção podem ser preparadas emvárias formas. Por exemplo, as composições podem serpreparadas como injetáveis, tanto como soluções líquidasquanto como suspensões. Formas sólidas adequadas parasolução, ou suspensão, em veículos líquidos, antes dainjeção, também podem ser preparadas (por exemplo, umacomposição liofilizada). A composição pode ser preparadapara administração tópica, por exemplo, como uma pomada,creme ou pó. A composição pode ser preparada paraadministração oral, por exemplo, como um comprimido ou umacápsula, como um spray ou como um xarope (opcionalmenteflavorizado). A composição pode ser preparada paraadministração pulmonar, por exemplo, como um inalador, como uso de um pó fino ou um spray. A composição pode serpreparada como um supositório ou pessário. A composiçãopode ser preparada para administração nasal, aural ouocular, por exemplo, como gotas. A composição pode ser naforma de kit, projetado de tal forma que uma composiçãocombinada seja reconstituída imediatamente antes daadministração a um paciente. Esses kits podem compreenderum ou mais antígenos em forma líquida e um ou maisantígenos Iiofilizados.

As composições imunogênicas usadas como as vacinascompreendem uma quantidade imunologicamente eficaz deantígeno(s), além de quaisquer outros componentes, porexemplo, antibióticos, como for necessário. 0 termo"quantidade imunologicamente eficaz" significa que aadministração daquela quantidade a um indivíduo, tanto emuma dose única quanto como parte de uma série, é eficazpara o tratamento ou a prevenção, ou para aumento de umaresposta imunológica mensurável, ou para evitar ou reduzirum sintoma clínico. Essa quantidade varia, dependendo dasaúde e da condição física do indivíduo a ser tratado, daidade, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (porexemplo, primata não humano, primata etc.), da capacidadedo sistema imunológico do indivíduo para sintetizaranticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação davacina, da avaliação do médico responsável pela situaçãomédica e de outros fatores relevantes. Espera-se que aquantidade caia em uma faixa relativamente ampla que podeser determinada por meio de experimentos de rotina.

Componentes adicionais da composição

As composições da invenção compreenderão tipicamente,além dos componentes mencionados acima, um ou mais"veículos farmaceuticamente aceitáveis", que incluemqualquer veículo que, por si próprio, não induza a produçãode anticorpos danosos ao indivíduo que recebe a composição.

Veículos adequados são tipicamente macromoléculas grandes,lentamente metabolizadas como, por exemplo, proteínas,polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos,aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos eagregados lipídicos (por exemplo, gotícuias de óleo oulipossomos). Esses veículos são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. As vacinas também podem conterdiluentes, por exemplo, água, solução salina, glicerol etc.

Adicionalmente, substâncias auxiliares, por exemplo,agentes umidificantes ou emulsificantes, substâncias detamponamento do pH, e semelhantes, podem estar presentes.

Uma discussão detalhada sobre excipientes farmaceuticamenteaceitáveis está disponível em Gennaro (2000) "Remington:The Science and Practice of Pharmacy". 20a ed., ISBN:0683306472.

Adjuvantes

As vacinas da invenção podem ser administradas emconjunto com outros agentes imunorreguladores. Emparticular, as composições incluirão normalmente um ou maisadjuvantes. Adjuvantes para uso com a invenção incluem, semlimitação, um ou mais dos seguintes apresentados abaixo:

A. Composições que contêm minerais

Composições que contêm minerais adequadas para usocomo adjuvantes na invenção incluem sais minerais, taiscomo sais de alumínio e sais de cálcio. A invenção incluisais minerais como, por exemplo, hidróxidos (por exemplo,oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos,ortofosfatos), sulfatos etc. (por exemplo, veja oscapítulos 8 e 9 de "Vaccine Design" (1995) eds. Powell &Newman. ISBN: 030644867X. Plenum), ou misturas dediferentes compostos minerais (por exemplo, uma mistura deum adjuvante fosfato e um adjuvante hidróxido,opcionalmente com um excesso do fosfato), com os compostosassumindo qualquer forma (por exemplo, gel, cristalina,amorfa etc.), e com adsorção aos sais sendo preferida. Ascomposições que contêm minerais também podem ser formuladascomo uma partícula de sal metálico (WO 00/23105).

Sais de alumínio podem ser incluídos nas vacinas dainvenção de tal forma que a dose de Al3+ esteja entre 0,2 e1,0 mg por dose.

B. Emulsões oleosas

Composições de emulsão oleosas adequadas para uso comoadjuvantes na invenção incluem emulsões esqualeno-água,tais como MF59 (Esqualeno 5%, Tween 80™ 0,5% e Span™ 850,5%, formuladas em partículas submícron com o uso de ummicrofluidificador). Veja WO 90/14837. Veja também Podda,"The adjuvanted influenza vaccinnes with novel adjuvants:experience with the MF59-adjuvanted vaccinne", Vaccine(2001) 19: 2.673-2.680; Frey e cols., "Comparison of thesafety, tolerability, and immunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvanted influenzavaccine in non-elderly adults", Vaccine (2003) 21: 4.234-4.237. MF59 é usado como o adjuvante na vacina desubunidade trivalente do vírus influenza FLUADTM.

Em algumas modalidades, adjuvantes para uso nascomposições são emulsões submícron óleo-em-água. Em algumasmodalidades, emulsões submícron óleo-em-água para uso nainvenção são emulsões esqualeno/água que opcionalmentecontêm quantidades variáveis de MTP-PE, por exemplo, umaemulsão submícron óleo-em-água que contém esqualeno 4-5%p/v, Tween 80™ 0,25-1,0% p/v (monooleato depolioxietillenossorbitano) e/ou Span™ 85 0,25-1,0%(trioleato de sorbitano) e, opcionalmente, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(P-21-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfophoriloxi)-etilamina (MTP-PE), porexemplo, a emulsão submícron óleo-em-água conhecida como"MF59" (Publicação Internacional N0 WO 90/14837; PatentesU.S. Nos 6.299.884 e 6.451.325, aqui incorporados porreferência em sua totalidade; e Ott e cols., "MF59 - Designand Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for HumanVaccines" em "Vaccine Design: The Subunit and AdjuvantApproach" (Powell, M. F. e Newman, M.J. eds.) Plenum Press,Nova York, 1995, pp. 277-296). MF59 contém Esqualeno 4-5%p/v (por exemplo, 4,3%), 0,25-0,5% p/v Tween 80™, e 0,5%p/v Span 85™ e, opcionalmente, contém várias quantidadesde MTP-PE, formulado em partículas submícron com o uso deum microfluidificador, por exemplo, o microfluidificadorModelo IlOY (Microfluidics, Newton, MA). Por exemplo, MTP-PE pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0-500pg/dose, cerca de 0-250 pg/dose e cerca de 0-100 pg/dose.

Como aqui usado, o termo "MF59-0" refere-se à emulsãosubmícron óleo-em-água acima desprovida de MTP-PE, enquantoo termo "MF59-MTP" representa uma formulação que contémMTP-PE. Por exemplo, "MF59-100" contém 100 pg de MTP-PE pordose, e assim por diante. MF69, outra emulsão submícronóleo-em-água para uso na invenção, contém esqualeno 4,3%p/v, Tween 80™ 0,25% p/v e Span 85™ 0,75% p/v e,opcionalmente, MTP-PE. Ainda outra emulsão submícron óleo-em-água é MF75, também conhecido como SAF, que contémesqualeno 10%, Tween 80™ 0,4%, 5% polímero bloqueado-plurônico L121 e thr-MDP, também microfluidizado em umaemulsão submícron. MF75-MTP representa uma formulação MF75que inclui MTP, por exemplo, de 100-4 00 pg de MTP-PE pordose.

Emulsões submícron óleo-em-água, métodos de suafabricação e agentes imunoestimulantes, por exemplo,muramil peptídeos, para uso nas composições, são descritosem detalhe na Publicação Internacional N0 WO 90/14837 ePatentes U.S. Nos 6.299.884 e 6.451.325, aqui incorporadospor referência em sua totalidade.

O adjuvante completo de Freund (CFA) e o adjuvanteincompleto de Freund (IFA) também podem ser usados comoadjuvantes na invenção.

C. Formulações de saponina

Formulações de saponina também podem ser usadas comoadjuvantes na invenção. Saponinas são um grupo heterólogode glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóideque são encontrados na casca, folhas, caules, raízes e atémesmo nas flores de uma ampla gama de espécies de plantas.

A saponina da casca da árvore Molina Quillaia saponaria foiamplamente estudada como adjuvante. A saponina também podeser obtida comercialmente de Smilax ornata (sarsaprilla),Gypsophilla paniculata (mosquitinho - brides veil) eSaponaria officianalis (saponária - soap root). Formulaçõesadjuvantes de saponina incluem formulações purificadas, porexemplo, QS21, além de formulações lipídicas, por exemplo,ISCOMs.Composições de saponina foram purificadas com o uso decromatografia em camada delgada de alto rendimento (HP-LC)e cromatografia líquida de alto rendimento de fase reversa(RP-HPLC). Foram identificadas frações purificadasespecíficas com o uso dessas técnicas, incluindo QS7, QS17,QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. De preferência, a saponina éQS21. Um método de produção de QS21 é revelado na PatenteU.S. N0 5.057.540. As formulações de saponina também podemcompreender um esterol, por exemplo, colesterol (veja WO96/33739).

Combinações de saponinas e colesteróis podem serusadas para formar partículas únicas denominadas complexosimunoestimulantes (ISCOMs). ISCOMs tipicamente tambémincluem um fosfolipídeo, por exemplo, fosfatidiletanolaminaou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode serusada em ISCOMs. Em algumas modalidades, o ISCOM inclui umou mais de Quil A, QHA e QHC. ISCOMs são ainda descritos emEP0109942, WO 96/11711 e WO 96/33739. Opcionalmente, osISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional. VejaWO 00/07621.

Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes baseadosem saponina pode ser encontrada em Barr, e cols., "ISCOMsand other saponin based adjuvants", Advanced Drug DeliveryReviews (1998) 32: 247-271. Veja também Sjolander, e cols.,"Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponinand ISCOM vaccines", Advanced Drug Delivery Reviews (1998)32: 321-338.

D. Virossomas e partículas semelhantes a vírus (VhPs)

Virossomas e partículas semelhantes a vírus (VLPs)também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Essasestruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas de umvírus, opcionalmente combinadas ou formuladas com umfosfolipídeo. Elas são geralmente não patogênicas, nãoreplicantes e, geralmente, não contêm nada do genoma viralnativo. As proteínas virais podem ser produzidas de formarecombinante ou isoladas do vírus inteiro. Essas proteínasvirais adequadas para uso em virossomas ou VLPs incluemproteínas derivadas do vírus influenza (por exemplo, HA ouNA), vírus da hepatite B (por exemplo, proteínas centraisou do capsídeo), vírus da hepatite E, vírus do sarampo,vírus Sindbis, rotavírus, vírus da febre aftosa,retrovírus, vírus de Norwalk, papiloma vírus do humano,HIV, RNA-fagos, Qp-fago (por exemplo, proteínas derevestimento), GA-fago, fr-fago, fago AP205 e Ty (porexemplo, proteína do retrotransposon Ty pl) . VLPs sãodiscutidos ainda em WO 03/024480, WO 03/024481 e Niikura ecols., "Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-LikeParticles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting ForeignEpitopes", Virology (2002) 293: 273-280; Lenz e cols.,"Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation ofDendritic Cells", Journal of Immunology (2001) 5.246-5.355;Pinto, e cols., "Cellular Immune Responses to Humanpapillomavirus (HPV)-16 Ll Healthy Volunteers Immunizedwith Recombinant HPV-16 Ll Virus-Like Particles", Journalof Infectious Diseases (2003) 188: 327-338; e Gerber ecols., "Human papillomavirus Virus-Like Particles AreEfficient Oral Immunogens when Coadministered withEscherichia coli Heat-Labile Enterotoxin Mutant R192G orCpG", Journal of Virology (2001) 75(10): 4.752-4.760.Virossomas são discutidos ainda, por exemplo, em Gluck ecols., "New Technology Platforms in the Development ofVaccines for the Future", Vaccine (2002) 20: B10-B16.Virossomas de influenza imunopotencializadoresreconstituídos (IRIV) são usadas como o sistema deliberação de antígeno de subunidade no produto intranasaltrivalente INFLEXAL™ (Mischler & Metcalfe (2002) VaccineSupl. 5: B17-23) e no produto INFLUVAC PLUSTM.

E. Derivados bacterianos ou microbianos

Em algumas modalidades, adjuvantes adequados para usona invenção incluem derivados bacterianos ou microbianoscomo, por exemplo:

(1) Derivados atóxicos de lipopolissacarídeoenterobacteriano (LPS)

Esses derivados incluem monofosforil lipídeo A (MPL) eMPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL é uma mistura demonofosforil lipídeo A 3 des-O-acilado com 4, 5 ou 6cadeias aciladas. Um exemplo não limitante de uma "pequenapartícula" de monofosforil lipídeo A 3 des-0-acilado érevelado em EP 0 689 454. Essas "pequenas partículas" de3dMPL são suficientemente pequenas para serem esterilizadaspor filtração por meio de uma membrana de 0,22 mícron (vejaEP 0 689 454). Outros derivados atóxicos de LPS incluemmiméticos de monofosforil lipídeo A, por exemplo, derivadosde fosfato de aminoalquil glicosaminida, por exemplo, RC-529. Veja Johnson e cols. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett.9: 2.273-2.278.

(2) Derivados de lipídeo A

Derivados de lipídeo A incluem derivados de lipídeo Ade Escherichia coli, por exemplo, OM-174. OM-174 édescrito, por exemplo, em Meraldi e cols., "OM-174, a NewAdjuvant with a Potential for Human Use, Induces aProtective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from the circumsporozoite proteinof Plasmodium berghei", Vaccine (2003) 21: 2.485-2.491; ePajak, e cols., "The Adjuvant OM-174 induces both themigration and maturation of murine dendritic cells invivo", Vaccine (2003) 21: 836-842.

(3) Oligonucleotídeos imunoestimulantes

Oligonucleotídeos imunoestimulantes adequados para usocomo adjuvantes na invenção incluem seqüências denucleotídeos que contêm um padrão CpG (uma seqüência quecontém uma citosina não metilada, seguida por guanosina, eligada por uma ligação fosfato). RNA bacteriano de fitadupla ou oligonucleotídeos que contêm seqüênciaspalindrômicas ou poli(dG) também demonstraram serimunoestimulantes.

Os CpGs podem incluir modificações/análogos denucleotídeos como, por exemplo, modificações fosforotioato,e podem ser de fita dupla ou de fita simples.

Opcionalmente, a guanosina pode ser substituída com umanálogo como, por exemplo, 21-desoxi-7-deazaguanosina. VejaKandimalla, e cols., "Divergent synthetic nucleotide motifrecognition pattern: design and development of potentimmunomoduladory oligodeoxyribonucleotide agents withdistinct cytokine induction profiles", Nucleic AcidsResearch (2003) 31(9): 2.393-2.400; WO 02/26757 e WO99/62923 para exemplos de possíveis substituições análogas.

0 efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpG é aindadiscutido em Krieg, "CpG motifs: the active ingredient inbacterial extracts?", NatureMedicine (2003) 9(7): 831-835;McCluskie, e cols., "Parenteral and mucosal prime-boostimmunization estrategies im mice with hepatitis B surfaceantigen and CpG DNA", FEMS Immunology and MedicaiMicrobiology (2002) 32: 179-185; WO 98/40100; Patente U.S.N0 6.207.646; Patente U.S. N0 6.239.116 e Patente U.S. N06.429.199.

A seqüência CpG pode ser dirigida a TLR9, por exemplo,o padrão GTCGTT (ID. DE SEQ. N°: 54) ou TTCGTT (ID. DE SEQ.N°: 55). Veja Kandimalla, e cols., "Toll-Iike receptor 9:modulation of recognition and cytokine induction by novelsynthetic CpG DNAs", Biochemical Society Transactions(2003) 31 (parte 3): 654-658. A seqüência CpG pode serespecífica para a indução de uma resposta imunológica Thl,por exemplo, um ODN CpG-A, ou ela pode ser mais específicapara a indução de uma resposta de célula B, por exemplo, umODN CpG-B. ODNs CpG-A e CpG-B são discutidos em Blackwell,e cols., "CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-InducibleProtein-10 Production is Regulated by PlasmacytoidDendritic Cell Derived IFN-alpha", J. Immunol. (2003)170(8): 4.061-4.068; Krieg, "From A to Z on CpG", TRENDS inImmunology (2002) 23(2): 64-65 e WO 01/95935. Depreferência, o CpG é um ODN CpG-A.

Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo CpG éconstruído de forma que a extremidade 5· seja acessívelpara reconhecimento de receptor. Opcionalmente, duasseqüências de oligonucleotídeos CpG podem ser anexadas emsuas extremidades 3' para formar "imunômeros". Veja, porexemplo, Kandimalla, e cols., "Secondary structures in CpGoligonucleotides affect immunostimulatory activity", BBRC(2003) 306: 948-953; Kandimalla, e cols., nToll-Iikereceptor 9: modulation of recognition and cytokineinduction by novel synthetic GpG DNAs", Biochemical SocietyTransactions (2003) 31 (parte 3): 664-658; Bhagat e cols.,"CpG penta- e hexadeoxyribonucIeotides as potentimmunomoduladory agents" BBRC (2003) 300: 853-861 e WO03/035836.

(4) Toxinas de ribosilação de ADP e derivadosdetoxificados destas

Toxinas bacterianas de ribosilação de ADP e derivadosdetoxifiçados destas podem ser usadas como adjuvantes nainvenção. Em algumas modalidades, a proteína é derivada deE. coli (ou seja, enterotoxina termolábil de E. coli "LT"),cólera ("CT") ou pertussis ("PT"). 0 uso de toxinas deribosilação de ADP detoxifiçadas como adjuvantes mucosos édescrito em WO 95/17211, e como adjuvantes parenterais emWO 98/42375. Em algumas modalidades, o adjuvante é ummutante detoxifiçado de LT como, por exemplo, LT-K63, LT-R72 e LTR192G. 0 uso de toxinas de ribosilação de ADP ederivados detoxifiçados destas, particularmente LT-63 e LT-R72, como adjuvantes pode ser encontrado nas seguintesreferências, cada uma delas sendo aqui especificamenteincorporada por referência em sua totalidade: Beignon, ecols., "The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin ofEscherichia coli Enhances the Ability of Peptide Antigensto Elicit CD4+ T Cells and Secrete Gamma Interferon afterCoapplication onto Bare Skin", Infection and Immunity(2002) 70(6): 3.012-3.019; Pizza, e cols., "Mucosalvaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosaladjuvants", Vaccine (2001) 19: 2.534-2.541; Pizza, e cols.,"LTK63 and LTR72, two mucosal adjuvants ready for clinicaitrials" Int. J. Med. Microbiol. (2000) 290(4-5): 455-461;SchartonKersten e cols., "Transcutaneous Immunization withBacterial ADP-Ribosylating Exotoxinas, Subunits andUnrelated Adjuvants", Infection and Immunity (2000) 68(9):5.306-5.313; Ryan e cols., "Mutants of Escherichia coliHeat-Labile Toxin Aet as Effeetive Mueosal Adjuvants forNasal Delivery of an Aeelular Pertussis Vaeeine:Differential Effeets of the Nontoxie AB Complex and EnzymeAetivity on Thl and Th2 Cells" Infection and Immunity(1999) 67(12): 6.270-6.280; Partidos e cols., "Heat-labileenterotoxin of Eseheriehia coli and its site- directedmutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cellresponses to intranasally co-immunized synthetic peptides",Immunol. Lett. (1999) 67(3): 209-216; Peppoloni e cols.,"Mutants of the Eseheriehia coli heat-labile enterotoxinaas safe and strong adjuvants for intranasal delivery ofvaccines", Vaccines (2003) 2(2): 285-293; e Pine e cols.,(2002) "Intranasal immunization with influenza vaccine anda detoxified mutant of heat labile enterotoxin fromEscherichia coli (LTK63)" J. Control Release (2002) 85 ( 1-3): 263-270. As referências numéricas para substituições deaminoácidos são preferivelmente com base nos alinhamentosdas subunidades A e B de toxinas de ribosilação de ADPapresentados em Domenighini e cols., Mol. Microbiol. (1995)15(6): 1.165-1.167, aqui especificamente incorporado porreferência em sua totalidade.

F. Bioadesivos e mucoadesivos

Bioadesivos e mucoadesivos também podem ser usadoscomo adjuvantes na invenção. Bioadesivos adequados incluemmicroesferas de ácido hialurônico esterifiçado (Singh ecols. (2001) J. Cont. Rele. 70: 267-276) ou mucoadesivoscomo, por exemplo, derivados entrecruzados de poli(ácidoacrílico), álcool polivinílico, polivinil pirrolidona,polissacarídeos e carboximetilcelulose. Quitosana ederivados desta também podem ser usados como adjuvantes nainvenção. Por exemplo, veja WO 99/27960.

G. Micropartículas

Micropartículas também podem ser usadas comoadjuvantes na invenção. Micropartículas (ou seja,partículas de -100 nm a -150 μτη de diâmetro, de -200 nm a-30 μτη de diâmetro, e de -500 nm a -10 μπι de diâmetro),formadas por materiais que são biodegradáveis e atóxicos(por exemplo, um poli(ácido α-hidróxi), um ácido poli-hidróxi butírico, um poliortoéster, um polianidrido, umapolicaprolactona etc.), com poli(lactida-co-glicolida), sãopreferidas, opcionalmente tratadas para ter uma superfíciecarregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou asuperfície carregada positivamente (por exemplo, com umdetergente catiônico, por exemplo, CTAB).

H. Lipossomos

Exemplos de formulações de lipossomo adequadas parauso como adjuvantes são descritas na Patente U.S. N06.090.406, Patente U.S. N0 5.916.588 e EP 0 626 169.

j. Formulações de éter de polioxietileno e és ter depolioxietileno

Em algumas modalidades, adjuvantes adequados para usona invenção incluem éteres de polioxietileno e ésteres depolioxietileno. WO 99/52549. Essas formulações aindaincluem tensoativos de éster de polioxietileno sorbitano emcombinação com um octoxinol (WO 01/21207), além detensoativos de éteres ou éster de polioxietileno alquil emcombinação com pelo menos um tensoativo não iônicoadicional como, por exemplo, um octoxinol (WO 01/21152).

Em algumas modalidades, éteres de polioxietileno sãoselecionados do seguinte grupo: polioxietileno-9-Iauriléter (laureth 9), polioxietileno-9-esteoril éter,polioxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauriléter, polioxietileno-35-Iauril éter e polioxietileno-23-lauril éter.

J. Polifosfazeno (PCPP)

Formulações de PCPP são descritas, por exemplo, emAndrianov e cols., "Preparation of hydrogel microspheres bycoacervation of aqueous polyphophazene solutions",Biomaterials (1998) 19(1-3): 109-115 e Payne e cols.,uProtein Release from Polyphophazene Matrices", Adv. Drug.DeliveryReview (1998) 31(3): 185-196.

K. Muramil peptídeos

Exemplos de muramil peptídeos adequados para uso comoadjuvantes na invenção incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-l-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) e N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutaminil-l-alanina-2-(1'-2·-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE).

L. Compostos de imidazoquinolona

Exemplos de compostos de imidazoquinolona adequadospara uso como adjuvantes na invenção incluem, semlimitação, Imiquamod e seus homólogos, descritos com maisdetalhe em Stanley, "Imiquimod and the imidazoquinolones:mechanism of action and therapeutic potential" Clin. Exp.Dermatol. (2002) 27(7): 571-577 e Jones, "Resiquimod 3M",Curr. Opin. Investig. Drugs (2003) 4(2): 214-218.

A invenção também fornece composições que compreendemcombinações dos adjuvantes identificados acima. Porexemplo, as seguintes composições adjuvantes são exemplosnão limitantes de combinações de adjuvantes que podem serusadas na invenção:

(1) uma saponina e uma emulsão óleo-em-água (WO99/11241);

(2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivadoatóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) (veja WO 94/00153);

(3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivadoatóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) + um colesterol;

(4) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12(opcionalmente + um esterol) (WO 98/57659);

(5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ouemulsões óleo-em-água (veja o Pedidos de patente européia0835318, 0735898 e 0761231);

(6) SAF, que contém Esqualano 10%, Tween 80 0,4%,polímero em bloco-plurônico 5% L121 e thr-MDP,microfluidizado em uma emulsão submícron ou turbilhonadopara gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior.

(7) Sistema Ribi (RAS), (Ribi Immunochem), que contémEsqualeno 2%, Tween 80 0,2%, e um ou mais componentes daparede celular bacteriana do grupo que consiste emmonofosforilipídeo A (MPL), dimicolato de trehalose (TDM),e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL +CWS (Detox™);

(8) um ou mais sais minerais (por exemplo, um sal dealumínio) +' um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dPML).(9) um ou mais sais minerais (por exemplo, um sal dealumínio) + um oligonucleotídeo imunoestimulante (porexemplo, uma seqüência de nucleotídeos que inclui um padrãoCpG). A combinação N0 (9) é uma combinação de adjuvantespreferida.

M. Jmunomoduladores humanos

Imunomoduladores humanos adequados para uso comoadjuvantes na invenção incluem citocinas, por exemplo,interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,IL-7, IL-12 etc.), interferons (por exemplo, interferon-γ),fator de estimulação de colônias de macrófagos e fator denecrose tumoral.

Em algumas modalidades, sais de alumínio e MF59 sãoadjuvantes preferidos para uso com vacinas injetáveis deinfluenza. Em algumas modalidades, toxinas e bioadesivosbacterianos são adjuvantes preferidos para uso com vacinasde liberação mucosa, por exemplo, vacinas nasais.

As composições imunogênicas da presente invenção podemser administradas em combinação com um regime de tratamentocom antibiótico. Em algumas modalidades, o antibiótico éadministrado antes da administração do antígeno da invençãoou da composição que compreende um ou mais dos antígenos dainvenção.

Em algumas modalidades, o antibiótico é administradosubseqüente à administração de um ou mais antígenos dainvenção ou da composição que compreende um ou maisantígenos da invenção. Exemplos de antibióticos adequadospara uso no tratamento de infecções estreptocócicasincluem, sem limitação, penicilina ou um derivado desta ouclindamicina ou semelhantes.A invenção é adicionalmente ilustrada, sem limitação,pelos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Materiais e métodos

Construção de mutantes pneumocócicos

Cepas pneumocócicas e mutantes por eliminação criadasnesses produtos de base são descritas na Tabela 1.Mutagênese com ligação por PCR (23) foi usada para criarmutantes knockout de T4 e ST16219F. Fragmentos acima eabaixo dos genes-alvo foram amplificados com pares deiniciadores específicos. Os fragmentos acima foramconstruídos com sítios ApaI e os fragmentos abaixo comsítios BamHI. Os iniciadores usados para construção erastreamento de alelos de eliminação estão listados naTabela 2. Os produtos de PCR (1.000 bp) foram digeridos comenzimas de restrição correspondentes, purificados e ligadoscom o cassete erm (1.306 bp) (número de acesso no GenBankAB057644) ou com o cassete Kan-rpsL, Janus (24) (1.368 bp),que contém sítios ApaI e BamHI. A mistura de ligação foientão transformada, como descrito em (25), na cepapneumocócica receptora, e plaqueada em placas de ágar-sangue contendo eritromicina (1 pg/ml) ou canamicina (400pg/ml). A inserção correta foi confirmada por PCR eseqüenciamento.

Tabela 1. Cepas de S. pneumoniae usadas

<table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table>

EmR, resistente à eritromicina; KmR, resistente àcanamicina; SpcR, resistente à espectinomicina; SmR,resistente à estreptomicina; CmR, resistente àcloranfenicol.

Tabela 2. Iniciadores e enzimas de restrição usados na criacao de mutantes

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Para criar um mutante de inserção de D3 9 (cepa dosorotipo 2) contendo a ilhota rlrA, células D3 9 competentesforam transformadas com DNA genômico de CH155, uma cepa dosorotipo 4 de S. pneumoniae com uma inserção de transposonmagellan5 em um dos elementos JS1167 que flanqueiam ailhota rlrA. 0 evento de recombinação duplo foi selecionadopara plaqueamento em espectinomicina, e a presença dailhota foi confirmada por PCR. Para gerar um derivadomutante rlrA de D39V(rrgA-srtD), foi realizada aamplificação por PCR da região mutada na cepa do sorotipo 4mutante com pares de iniciadores RLRAFR/RLRARX, e oamplicon purificado transformado no fundo necessário dosorotipo 2. 0 evento de recombinação foi selecionadoplaqueando-se em cloranfenicol para rlrA e confirmado por PCR.

Clonagem, expressão e purificação de RrgA, RrgB e RrgC

Técnicas padronizadas de DNA recombinante foram usadaspara construir todos os plasmídeos de expressão. pET 21b+foi adquirido de Invitrogen. PCR foi realizado com PfuTurbo Taq™ (Roche) durante 25 ciclos de amplificação comDNA genômico. Os produtos de PCR foram purificados,digeridos, ligados em um vetor, transformados em E. coliTOPOlO, e subseqüentemente subclonados em E. coli BLR(DE3).As proteínas recombinantes foram expressas e purificadasdas bactérias transformadas de acordo com as instruções dofabricante.

Soros animais

RrgA, RrgB e RrgC recombinantes purificadas foramconcentradas com uma coluna spin Centricon YM-30(Millipore) e subseqüentemente usadas para imunizarcamundongos BALB/C (20 pg) e coelhos brancos da NovaZelândia (100 pg).

Coloração negativa

Para coloração negativa, as bactérias cresceram emágar-sangue por até 16 horas, e as colônias foram re-suspensas em tampão de cacodilato de sódio 0,15 M. Umaalíquota de 4 μΐ foi adicionada a uma tela revestida comuma película de suporte Formvar™ por 5 minutos. A soluçãoem excesso foi retirada por um papel de filtro e a tela foicorada com acetato de uranil 0,5% em água por 5 segundos, eseca ao ar. As amostras foram examinadas em um microscópioeletrônico Tecnai™ 10 (Phillips) a 80 kV.

Microscopia imunoeletrônica

S. pneumoniae cresceu de um dia para o outro em meiolíquido THY. Um mililitro de suspensão bacteriana com umaOD600 de 0,5 foi centrifugado a 3.000 rpm a 4 0C e re-suspenso em 500 μΐ de PBS filtrado estéril. Vintemicrolitros de amostra foram adicionados a telas de níquelrevestidas Formvar™ e deixados em repouso por 5 minutos.

As telas foram subseqüentemente fixadas em paraformaIdeido1%/PBS e incubadas com anticorpos policlonais de camundongo1:10 para RrgA, RrgB ou RrgC em tampão de bloqueio (soronormal de coelho 1%, BSA 1%, Ix PBS). As amostras foramlavadas cinco vezes por 5 minutos em tampão de bloqueio, eincubadas com anticorpos secundários conjugados ao ouro a1:20 (IgG de cabra anticamundongo, partículas de ouro de 5nm; IgG de cabra anticoelho, 10 nm). As amostras foramlavadas cinco vezes em tampão de bloqueio por 5 minutos, esubseqüentemente fixadas por 30 minutos em paraformaIdeido1%/PBS. As amostras foram lavadas em água destilada cincovezes por 5 minutos, e deixadas para secar. As telas foramcoradas por 15 segundos com acetato de uranil aquoso, eprocessadas em um microscópio eletrônico de transmissão dealto campo TecnaiTM.

Western Blotting

As bactérias cresceram em placas de ágar-sangue poraté 16 horas. As bactérias (peso líquido de 30 mg) foramre-suspensas em 1 ml de 5 0 mM Tris-HCl, pH 6,8, contendo400 unidades de Mutanolisina (Sigma), e incubadas por 2horas a 37 °C. Após três ciclos de congelamento edescongelamento, os restos celulares foram removidos porcentrifugação a 13.000 rpm por 15 minutos. Cinqüentamicrolitros do sobrenadante foram tratados com tampão deamostra NuPage™ e mercaptoetanol por 10 minutos a 70°C, e10 μΐ foram carregados em um Gel NuPage Novexm Bis-Tris 4-12% ou 3-8% (Invitrogen). 0 eletroblotting e a detecção comanticorpo de RrgB (soros imunes de camundongo) diluído a1:500 foram efetuados de acordo com as instruções dofornecedor.

Ensaios de aderência de A549

As células de S. pneumoniae cresceram até a faseexponencial média (OD600 = 0,3-0, 4), foram incubadas comcélulas A549 por 30-40 minutos a 37°C sob a CO2 5%/95% deatmosfera do ar, e lavadas três vezes com PBS (pH 7,4) pararemover bactérias não aderentes. Para enumeração debactérias aderentes e/ou internalizadas, as célulasepiteliais foram destacadas dos poços por tratamento com200 μΐ de tripsina 0,25%/l mM EDTA, e lisadas pela adiçãode 800 μΐ de Triton X-100 0,025% gelado. As diluiçõesapropriadas foram plaqueadas em placas de ágar-sangue paracontar o número de bactérias aderentes às célulaseucarióticas. A titulação das bactérias aderentes para cadacepa foi comparada com a titulação inserida, e apercentagem de bactérias aderentes foi determinada.

Para microscopia por fluorescência, monocamadas deA549 foram desenvolvidas em lamínulas em placas de culturade tecido de 24 poços. As camadas de células infectadas naslamínulas foram fixadas em paraformaldeído 3% e marcadascom anticorpos após a incubação de 3 0 a 40 minutos elavagem com PBS. As bactérias foram marcadas com anticorpoanticapsular, e as células epiteliais foram visualizadasapós permeabilização por coloração de F-actina comfaloidina conjugada à rodamina. Todos os experimentos foramrealizados em quadruplicata, e cada experimento foireplicado três vezes em dias diferentes.

Ataque ao camundongo

T4 e ST16219F e seus respectivos mutantes isogênicoscresceram por 16 horas em placas de ágar-sangue a 370C sobCO2 5%. As colônias foram retiradas diretamente das placas,e re-suspensas gentilmente em PBS até OD62o = 0,5 ouinoculadas em meio semi-sintético C+Y e crescidas até afase logarítmica média (OD620 = 0/ 5) para inoculaçãointranasal, e OD620 = 0,2 para inoculação intraperitoneal(i.ρ.). Foram feitas diluições apropriadas para obter aconcentração desejada. Camundongos C57BL/6 de 6 a 8 semanasde idade foram usados para ataque bacteriano intranasal ei.p. de T4 e ST16219F e seus mutantes, como descrito em (5).D39 e seus mutantes isogênicos cresceram em caldo THYsuplementado com antibióticos apropriados. Fêmeas decamundongos CDl (UK) de 6 a 10 semanas de idade (CharlesRiver Laboratories) foram usadas para ataque intranasal comIx IO7 bactérias.

Para experimentos de competição, bactérias mutantes edo tipo selvagem foram misturadas em uma proporção de 1:1.0 resultado da cfu do mutante comparada com a cfu do tiposelvagem foi determinado por seleção em placas de ágar-sangue com eritromicina, estreptomicina e/ou cloranfenicol.Os índices de competição (CI) in vivo foram calculados comoa proporção do resultado da cfu de mutante para a do tiposelvagem dividido pela cfu de entrada pelo mutante emrelação ao tipo selvagem.

A determinação de TNF e IL-6 após ataque i.p. no sorofoi realizada pela utilização de kits comerciais de ELISA(BD Biosciences).

Análise estatística

Os dados foram analisados quanto à significânciaestatística pela utilização de GraphPad PRISM™ Versão 4.As variáveis contínuas foram comparadas pela utilização doteste t ou do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Asignificância estatística foi definida como P < 0,05.

Análise FACS

Isolados de S. pneumoniae [T4, ST16219F, Τ4Δ (mgrA) eΤ4Δ (rrgA-srtD)] cresceram em cultura líquida THY de um diapara o outro a 37°C sob CO2 5%. As amostras foram diluídase permitiu-se que crescessem até OD62O = 0,250 (~1 χ IO8 porml). As culturas bacterianas foram centrifugadas a 3.000rpm, e re-suspensas em Ix PBS. Quinze microlitros desuspensão bacteriana foram adicionados a placas de 96poços. Cinco microlitros de soro normal de coelho 20% foramadicionados a cada poço, juntamente com anticorposprimários (anti-RrgB, PI anti-RrgB, Nm anti-961) a 1:3.200.

As amostras foram incubadas no gelo por 30 minutos, edepois 150 μΐ de tampão de bloqueio (BSA 1%/PBS) foramadicionados aos poços. A placa de 96 poços foi centrifugadaa 2.500 rpm por 5 minutos a 4°C. Um anticorpo secundárioanticamundongo marcado com ficoeritrina (JacksonImmunoResearch) foi adicionado em uma concentração final de1:100, e a mistura foi incubada por 30 minutos no gelo. Aseguir, 150 μΐ de tampão de bloqueio foram adicionados, eas amostras foram centrifugadas como acima. As amostrasforam re-suspensas em 200 μΐ de paraformaldeído 1%/PBS eanalisadas em um FACSCaliber™ (Becton Dickinson).

Criação de revertido em Τ4Δ (rrgA-srtD)

A ilhota rirA foi reintroduzida em Τ4Δ (rrgA-srtD) porreintrodução dos genes knocked-out junto com um cassete decanamicina. O cassete de canamicina primeiro foi integradoabaixo dos genes-alvo na cepa T4 do tipo selvagem pormutagênese com ligação por PCR. O DNA cromossômico dessesmutantes foi usado para transformar os knockouts erestaurar o fenótipo do tipo selvagem. Na primeira etapa, ocassete de canamicina foi amplificado de Janus (Sung ecols., 2001, Appl. Environ. Microbiol., 67: 5.190-6) com osiniciadores KanApa e Kan-Bam, criando um produto de PCR comterminais ApaI e BamHI. Fragmentos acima e abaixo dossítios-alvo foram amplificados com iniciadores fímbrias-rev-1-4 para o mutante Τ4Δ (rrgA-srtD). Os fragmentos acimaforam construídos com sítios ApaI, e os fragmentos abaixocom sítios BamHI. Todos os fragmentos foram digeridos comendonucleases de restrição correspondente, e foram feitasligações com quantidades eqüimolares de fragmento acima,fragmento abaixo e fragmento de canamicina. Apóstransformação em T4, foram selecionados transformantes emplacas de ágar-sangue contendo 200 mg/l de canamicina. ApósPCRs de controle confirmação da construção correta, DNAcromossômico desses transformantes foi usado paratransformar Τ4Δ (rrgA-srtD). Novamente, a seleção foi feitaem placas contendo canamicina, e os mutantes foramconfirmados por verificação da sensibilidade à eritromicinae expressão de fímbrias.

Exemplo 2

Evidências por microscopia eletrônica de transmissão paraestruturas semelhantes a fímbria em pneumococos

Por microscopia eletrônica de transmissão e coloraçãonegativa, verificou-se que pneumococos cultivados por até16 horas em placas de ágar-sangue e em meio (C+Y) ou (THY)expressam estruturas semelhantes a fímbria. Essasestruturas foram encontradas na cepa T4 (TIGR4), quepertence ao clone altamente invasivo do sorotipo 4 deseqüência multilócus tipo ST205, bem como em um isoladoclínico do tipo 19F, com seqüência multilócus tipo 162(cepa ST16219f) (Fig. IA). Esse clone 19F está associadotanto a casos de portadores quanto de doença invasiva emseres humanos, e demonstrou ser um colonizador eficiente dotrato respiratório de camundongos C57BL/6 e BALB/C (5).

Embora um mutante não encapsulado de T4 (T4R) fosse capazde formar fímbrias, não foram observadas fímbrias na cepade laboratório não encapsulada R6.

Exemplo 3

A ilhota rlrA no genoma pneumocócico codifica estruturasfímbrias-Iike

A comparação do óperon spaABC de Corynebacteriumdiphtheriae (12) e adesão da ilhota 1 de estreptococos dogrupo B (16) revelou um agrupamento de supostos genes defímbria dentro do genoma de T4 (Fig. 2). Os genes defímbria estão localizados na ilhota de patogenicidade deStreptococcus pneumoniae descrita previamente rlrA (18,19). A ilhota pneumocócica rlrA consiste em sete genes, dosquais prevê-se que rrgA, rrgB e rrgC codificam componentesda superfície microbiana que contêm LPXTG que reconhecemmoléculas adesivas da matriz (MSCRAMMs) que se ligam aoscomponentes da matriz extracelular do hospedeiro (20). Alémdisso, a ilhota rlrA também contém genes para trêssortases, srtB, srtC e srtD, além de rlrA (regulador rofA-like), um regulador positivo do agrupamento gênico (18)(Fig. 2). A ilhota genômica é flanqueada por JS1167 quecontém repetições invertidas, características de elementosgenéticos móveis (Fig. 2). A cepa seqüenciada R6 e suaprogenitora D39 são desprovidas da ilhota de fímbrias rlrA(Fig. 2). 0 repressor da transcrição mgrA se localizaexternamente à ilhota rlrA, e está envolvido na regulaçãodos genes de fímbria (21). A análise de seqüências apósamplificação por PCR da região correspondente no isoladoclínico ST16219F do sorotipo 19F revelou um agrupamentogênico homólogo com 98% de identidade para a ilhota rlrA deT4. No entanto, um pequeno ORF de função desconhecida em T4estava ausente no isolado ST16219F. Mutantes knockout com ogene mgrA eliminado de T4 e ST16219F foram construídos pormutagênese com ligação por PCR produzindo, dessa forma,cepas que superexpressam os genes da ilhota rlrA. Alémdisso, eliminamos a região rrgA-srtD em T4 (Fig. 1B) eST16219F, bem como em seus respectivos derivados mgrA.

Mediante coloração negativa e microscopia eletrônica,verificou-se que os mutantes de T4 mgrA e ST16219F mgrAproduzem fímbrias abundantes (Fig. 1C), enquanto bactériasque contêm a eliminação rrgA-srtD não possuíam fímbrias nogeral (Fig. 1D).

Foram desenvolvidos anti-soros contra proteínas RrgA,RrgB e RrgC expressas em Escherichia coli, e usos namarcação por imuno-ouro da fímbria expressa por T4. Osanticorpos de RrgB decoravam todo o polímero da fímbria(Fig. 1 E-G). A análise FACS, que faz uso de anticorposespecíficos para RrgB7 revelou que 84% e 90% das células deT4 e ST16219f, respectivamente, expressavam estruturas defímbrias. Nos derivados do mutante mgrA, quase todas asbactérias (99%) eram fimbriadas. As células desprovidas dailhota rlrA não tinham fímbrias medidas por análise FACS.

Para verificar a natureza polimérica das estruturasdas fímbrias observadas em T4 e ST16219F, extratos totaisdessas cepas e seus respectivos derivados por eliminaçãorrgA-srtD foram tratados com mutanolisina, separados emgéis de gradiente de poliacrilamida 4-12% (Fig. 3A) e 3-8%(Fig. 3B), e submetidos a imunoblot com anti-sorosespecíficos para RrgB. Foi observado um escalonamento depolímeros de alto peso molecular (HMW) variando de < 100kDa até > 1.000 kDa, similares àqueles descritospreviamente em C. diphtheriae (12, 13). Embora quantidadesiguais de extrato de proteína tenham sido carregadas nogel, as bandas coradas pelos anticorpos de RrgB eram maisintensas para os mutantes mgrA do que para suas respectivascepas do tipo selvagem, corroborando os dados damicroscopia eletrônica de transmissão e da análise FACS deque uma percentagem maior de pneumococos expressavaestruturas de fímbrias no mutante mgrA . Como esperado, osmutantes por eliminação de rrgA-srtD, em T4 e ST162,respectivamente, não mostraram bandas reativas à RrgB (Fig.3). No entanto, quando a ilhota de fímbrias erareintroduzida no mutante por eliminação Τ4Δ (rrgA-srtD), aanálise Western JbIot com o anti-soro de RrgB detectoupolímeros HMW similares àqueles para a cepa de T4 do tiposelvagem. Utilizando-se Western blotting, foi observado queas fímbrias estavam presentes em cepas pneumocócicascultivadas tanto em meios líquidos quanto em placas, emboraas fímbrias nem sempre pudessem ser detectadas pelautilização de microscopia eletrônica de transmissão,explicando porque as fímbrias não haviam sido encontradaspreviamente.

Exemplo 4

A ilhota rlrA ê importante para aderência pneumocócica àscélulas epiteliais pulmonares

A cepa D3 9 do sorotipo 2, como seu derivado nãoencapsulado R6, não possui a ilhota rirA (Fig. 2). A ilhotarlrA completa de T4 foi introduzida em D39 (D39V (rrgA-srtD) ). Esse mutante de inserção da ilhota de D3 9expressava fímbrias, como foi evidenciado por umescalonamento de polímeros HMW com base em Western blottingcom anti-RrgB (Fig. 3B). A expressão de fímbrias em D39V(rrgA-srtD) era dependente do regulador positivo rlrA, poisnão foram detectados polímeros HMW em um derivado domutante de rlrA de D3 9V (rrgA-srtD) (Fig. 3B). D39, D39V(rrgA-srtD) e D39V [rrgA-srtD)Δ[rlrA) foram usados paraestudar a aderência às células epiteliais pulmonares A54 9(Fig. 4). Somente D39V (rrgA-srtD) que expressa fímbriasse ligou a essas células (Fig. 4). Essa ligação era similaràquela de T4 que expressa fímbrias, enquanto um mutanterlrA de T4 não mostrou ligação detectável às células A549.

Exemplo 5

A ilhota rlrA afeta a virulência em modelos de camundongoPara investigar o papel da fimbria na colonizaçãopneumocócica e na doença invasiva, cepas T4 e Τ4Δ (rrgA-srtD) foram usadas em modelos de infecção murídea. Parasimular a via de infecção natural, camundongos C57BL/6 com6 a 8 semanas de idade foram inoculados por via intranasalcom doses altas [5 χ 10^6 unidades formadoras de colônias(cfu)] e médias (5 χ 10^5 cfu) de pneumococos. A colonizaçãofoi estimada realizando-se lavagens nasofaringeas-traqueaisem animais post-mortem. O mutante não fimbriado eram menosvirulento do que a cepa do tipo selvagem, como revelado poruma taxa de sobrevida maior de camundongos infectados pelomutante (Fig. 5A e 5B) . Esse defeito na virulência podiaser restaurado por reintrodução da ilhota rlrA.

Pneumococos tanto do tipo selvagem quanto mutanteadministrados separadamente foram capazes de colonizarcamundongos em um grau similar (não significante pelo testeU de Mann—Whitney, P > 0,05). No entanto, quando númerosiguais de bactérias T4 do tipo selvagem e mutante foramdados juntos por via intranasal, o mutante deficiente emfímbrias foi suplantado pelo tipo selvagem nas vias aéreassuperiores, pulmões e sangue, na maioria dos casos (Fig.5C-E) . A cepa do tipo 2 D3 9, o derivado por inserção dailhota D39V (rrgA-srtD) e o mutante de rlrA D39V (rrgA-srtD)A(rlrA) também foram usados em experimentos decompetição para colonização nasofaringea e pneumonia. 0 D39do tipo selvagem não fimbriado foi suplantado pelo mutantede inserção de ilhota fimbriado D39V (rrgA-srtD) , enquantoo mutante desprovido de rlrA não o foi (Fig. 5F). Os dadosatuais demonstram que as fimbrias pneumocócicas participamda colonização, pneumonia e doença invasiva.Exemplo 6

A ilhota rlrA tem uma participação nas respostasinflamatórias do hospedeiro

0 surgimento de uma infecção pneumocócica é afetadopela resposta inflamatória do hospedeiro, que pode promovera depuração bacteriana, além de contribuir para o danolocal (pneumonia) ou dano sistêmico (do qual a forma maissevera é o choque séptico). Demonstramos recentemente quediversos clones pneumocócicos provocam respostas pró-inflamatórias de citocina distintas, quando administradosi.p. aos camundongos (26). Demonstrou-se aqui que uma cepado sorotipo 6B e as cepas T4 e ST16219F produzem fímbrias,e todas provocaram uma resposta de TNF elevada após ataquei.p. (5). Em contraste, uma cepa do sorotipo 19F de um tipoclonal diferente, ST42519F, não foi tão eficiente nacolonização das vias aéreas superiores de camundongos, eprovocaram uma resposta de TNF baixa (5). Isso também eraverdade para um isolado do sorotipo 1 e do sorotipo 7F (5,22), que pertencem aos tipos clonais invasivos associados àdoença invasiva relativamente leve e ausência demortalidade em seres humanos (22) . Esses clones foramanalisados quanto à presença da ilhota de fímbrias rlrA porPCR, seqüenciamento e hibridização por Southern blot. Osresultados demonstraram que cepas pneumocócicas ilhotarlrA-positivas (ST2054 e ST16219F do tipo 4 e 19F,respectivamente) despertaram uma resposta de citocinaelevada, enquanto cepas ilhota rlrA-negativas (ST1917F,ST2281, e ST3061 do tipo 7F e 1, respectivamente) induziramuma resposta de TNF baixa (5) . A presença ou ausência dailhota pneumocócica de fímbrias poderia, portanto, explicara diferença na resposta de TNF. Para testar essapossibilidade diretamente, a resposta inflamatória foimedida durante infecção pneumocócica invasiva após ataquedos camundongos i.p. com mutantes por eliminação fimbriadosdo tipo selvagem e rrgA-srtD desprovido de fimbrias. Asinfecções com os dois mutantes por eliminação também foramfeitas com doses maiores de infecção para assegurar que asrespostas de TNF baixas não eram causadas pelos númerosreduzidos de bactérias na corrente sangüínea. Os mutantesT4 por eliminação fimbriados, bem como os basais ST162,mostraram uma resposta de TNF (Fig. 6) e uma resposta deIL-6 (Fig. 7) significativamente menores, comparados comsuas respectivas cepas do tipo selvagem. Tabulando-se osvalores de TNF contra os números de bactérias, ficouevidente que a resposta de TNF aos pneumococos fimbriadosfoi significativamente maior do que para o númeroequivalente de pneumococos não fimbriados (Fig. 6C e D).

Além disso, a reintrodução da ilhota rirA em Τ4Δ (rrgA-srtD) restaurou a alta resposta de TNF de T4 com fimbrias.

Esses resultados demonstram que S. pneumoniae produzestruturas semelhantes a fímbria que se projetam dasuperfície da célula bacteriana. A fímbria pneumocócica écodificada pela ilhota de fimbrias rlrA, encontrada emalgumas, mas não em todas, as cepas pneumocócicas. No S.pneumoniae encapsulado, as fimbrias contribuem para aadesão de células epiteliais cultivadas, e para acolonização e doença invasiva em modelos murídeos deinfecção. A expressão de fimbrias também aumenta a respostainflamatória do hospedeiro. Pneumococos utilizam diversosmecanismos para interagir com seu hospedeiro em estágiosdiferentes de infecção. A expressão de fímbrias podefacilitar a aderência bacteriana inicial, promovendocolonização da nasofaringe. Simultaneamente, bactérias queexpressam essas estruturas podem ter uma tendência maior adesencadear inflamação mucosa que pode promover depuração,mas potencialmente também podem levar à invasão dospneumococos no tecido, caso a inflamação leve ao dano dabarreira mucosa.

Exemplo 7

Purificação de fímbrias de Streptococcus pneumoniae

Estoque de TIGR4 de S. pneumoniae em glicerol (-80°C)foi crescido em ágar soja tríptico suplementado com 5%sangue de carne de carneiro desfibrinado (de um dia para ooutro a 37°C em CO2 5%). Foram usadas bactérias frescaspara incubar novas placas de ágar, e cultivadas por cercade 12 horas a 37°C em CO2 5%. As bactérias coletadas decerca de 10 placas foram lavadas uma vez em 35 ml de PBS, ere-suspensas em 2 ml de tampão PPB de protoplasto (10 mMMgCl2, 50 mM fosfato de sódio pH 6,3, 20% de sacarose)contendo conjunto de coquetel de inibidor de protease(Calbiochem). Cerca de 450 U de mutanolisina em 100 . mM defosfato de sódio pH 6,3 foram adicionadas a cada metade dasuspensão, e incubadas a 37°C por cerca de 5 a 8 horas comagitação suave até a formação de protoplasto ser detectadapor microscopia. O sobrenadante contendo material digeridode fímbrias foi carregado em um gradiente de sacarose (25 a56% em 10 mM MgCl2, 50 mM fosfato de sódio pH 6,3) eprocessado por cerca de 20 horas a 38.000 rpm a 4°C (Fig.10A). Todas as etapas posteriores foram realizadas a 4°Ccom o uso de tampões contendo inibidores de protease. Alémdisso, nuclease Benzonase™ (Novagen) foi adicionada pararemover impurezas de DNA e RNA. As frações de gradientecoletadas foram testadas quanto ao material de fímbria como uso de anticorpos anti-RrgB. Frações contendo fímbriasforam reunidas em pool e dialisadas contra 10 mM MgCl2, 50mM fosfato de sódio pH 6,3 por cerca de um dia para removera sacarose.

Para reduzir a polidispersibilidade, foramacrescentadas etapas adicionais de cromatografia. Quandonecessário, pools de preparações de fímbria foramconcentrados antes de carregá-los em uma coluna deSuperose™ 6 10/300 GL (Amersham Biosciences) (Fig. 10B). Afiltração do gel resultou na separação de material fímbriacontendo fímbrias de diferentes pesos moleculares. Asfrações de fímbrias purificadas foram avaliadas como sendohomogêneas com base na microscopia eletrônica e emeletroforese em gel de sódio dodecil sulfato poliacrilamidae imunoblot com um anticorpo específico de RrgB (Fig. 10C).As amostras foram armazenadas a -80°C ou em nitrogêniolíquido até uso posterior.

Fímbrias purificadas de alto peso molecular mostrarammassas moleculares que variam de 2 χ IO6 a 3 χ IO6 Da. 0tratamento de fímbrias com calor na presença de SDSresultou em sua dissociação em moléculas menores, gerandoum escalonamento de bandas de peso molecular menor em umgel poliacrilamida-SDS. A degradação de Edmarm das fímbriaspurificadas identificou uma seqüência que corresponde aoterminal N previsto da proteína RrgB produzida por clivagemda seqüência sinalizadora (AGTTTTSVTVHXL; ID. DE SEQ. N°:56) (Fig. 11A) . A análise da seqüência de aminoácidos dasseqüências de peptídeo tríptico das fímbrias identificou umfragmento da proteína RrgB de pneumococo TIGR4 com aseqüência de aminoácidos LAGAEFV1ANADNAGQYLAR (ID. DE SEQ.N°: 7) (Fig. 11 B). Foi realizada a investigação commicroscopia eletrônica nas preparações de fímbriaspurificadas coradas negativas (PTA 1%), marcadas por imuno-ouro. Foram observados filamentos tubulares alongados até 1pm de comprimento e cerca de 10 pm de diâmetro, similaresàqueles detectados em bactérias inteiras. Além defilamentos de fímbrias únicos, foram observados feixes deestruturas individuais intensamente compactadas. Anti-sorocontra RrgB e RrgC purificadas reagiram com fímbriasisoladas sob EM por imuno-ouro (Fig. 15) e na análisewestern (Fig. 10C). O padrão de marcação com ouro de anti-RrgA, anti-RrgB e anti-RrgC é mostrado na Fig. 16.

Exemplo 8

Proteínas de fímbrias RrgA e RrgB se associam in vitro

As proteínas de fímbrias RrgA, RrgB e RrgC forampurificadas, como descrito no Exemplo 1. As preparações deproteína purificada foram incubadas in vitro em temperaturaambiente, 37°C, 65°C e 95°C por 5 minutos. As preparaçõesincubadas foram processadas em um gel desnaturante depoliacrilamida. Foram observados complexos de alto pesomolecular nas preparações de RrgA e RrgB7 mas não naspreparações RrgC-His (Fig. 9A). A presença de RrgA e RrgBnos complexos de alto peso molecular foi confirmada porWestern blotting (Fig. 9B). Também foram detectadoscomplexos de alto peso molecular nas preparações de RrgA eRrgB por cromatografia por exclusão de tamanho (Fig. 9C).

Exemplo 9Anti-soros preparados contra fímbrias são protetores contrainfecção

Os camundongos foram atacados i.p. com bactérias T4,como descrito no Exemplo 1, exceto que os camundongosreceberam a administração de anti-soros contra fímbriaspurificadas (antifímbria), anti-soros contra a preparaçãopurificada sob condições idênticas de bactérias que nãoproduzem fímbrias (anti-Afímbria) ou controle de soluçãosalina (ctrl). Em experimentos paralelos, os camundongosreceberam a administração de anti-soros idênticos diluídos1:10. Os animais foram observados ao longo de dez diasquanto à mortalidade, e a carga bacteriana foi medida em 24horas pós-ataque. Todos os camundongos tratados com sorosantifímbria não diluídos tiveram cargas bacterianas abaixodo nível de detecção; o tratamento com soros diluídos a1:10 ainda gerou alguma proteção (Fig. 12A). Sorosantifímbria tanto diluídos quanto não diluídos forneceramuma redução significativa da mortalidade, comparados com ocontrole de solução salina (Fig. 12B). Além disso, os sorospreparados contra fímbrias forneceram maior proteção contrabacteremia e mortalidade do que os soros anti-Afímbria(Figs. 12A-B). Esse exemplo demonstra que soros específicospara fímbrias purificadas forneceram proteção significativacontra infecção por S. pneumoniae em um animal modelo.

Exemplo 10

Fímbrias purificadas e proteínas de fímbrias se ligam aoscomponentes da matriz extracelular

A ligação de RrgA, RrgB, RrgC, fímbrias purificadas efalsas fímbrias purificadas aos componentes extracelularesfoi determinada por ELISA. A ligação de componentes defímbrias aos componentes da matriz extracelular mucina Ifvitronectina, lactoferrina, colágenos I e IV, laminina,fibronectina e fibrinogênio foi medida. Resumidamente,placas de fundo achatado de 96 poços Maxisorp™ (Nunc,Roskilde, Dinamarca) foram revestidas por 1 hora a 37°C,seguida por uma incubação de um dia para o outro a 40C com2 pg/poço com mucina I, vitronectina, lactoferrina,colágenos I e IV e fibrinogênio, e com 1 pg/poço comlaminina e fibronectina em solução salina tamponada comfosfato pH 7,4 (PBS) . Uma placa revestida com BSA serviucomo controle negativo. Os poços revestidos foram lavados 3vezes com PBS/Tween 20™ 0,05%, e bloqueados por 2 horas a37°C com 200 μl de BSA 1%. As placas foram lavadas 3 vezescom PBS/Tween 20™ 0,05%. As amostras de proteínas (RrgA,RrgB e RrgC) foram inicialmente diluídas até 0,4 pg/μl comPBS. Duzentos μΐ de solução de proteína e 25 μΐ depreparação de fímbria (em um volume total de 2 00 μl comPBS) e os respectivos controles foram transferidos emplacas bloqueadas revestidas nas quais as amostras foramdiluídas serialmente duas vezes com PBS. As placas foramincubadas por 2 horas a 3 7 0C e de um dia para o outro a4°C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS/Tween 20™0,05% e incubadas por 2 horas a 37°C com anticorposprimários de camundongo anti-Rrg (diluições de 1/10.000):placas revestidas com RrgA, RrgB e RrgC com anti-RrgA,anti-RrgB e anti-RrgC, respectivamente, placas revestidascom fímbrias foram incubadas com anticorpos anti-RrgB. Apósmais 3 etapas de lavagem, a IgG antígeno-específ ica foirevelada com IgG de cabra anticamundongo conjugada àfosfatase alcalina (Sigma Chemical Co., SA Louis, Mo.) após2 horas de incubação a 37°C.

Foi observada uma ligação significativa ao colágeno I,à lactoferrina, laminina, fibronectina e ao fibrinogênio(Fig. 13). Em todos os casos, a ligação mais forte foiobservada para RrgA, seguida por RrgC e RrgB em níveismenores. As fímbrias purificadas mostraram ligação menor,mas detectável. Esse exemplo demonstra a ligação defímbrias purificadas e proteínas isoladas das fímbrias aoscomponentes da matriz extracelular, e sugere uma função dasfímbrias na adesão/colonização.

Exemplo 11

Fímbrias purificadas induzem respostas de citocina in vitro

Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) emonócitos foram colocados em contato in vitro com umapreparação purificada de fímbrias e uma falsa preparaçãopurificada de T4 que não expressa fímbrias. A produção decitocinas pelas células em resposta às fímbrias foi medidapor ELISA. Fímbrias purificadas induziram a produção decitocinas inflamatórias TNF-alfa, IL-12p40 e IL-6,comparadas com o controle de fímbria delta (Fig. 14) . Nãofoi observada indução para TLRs 2, 7, 8 e 9.

Exemplo 12

Análise por microscopia eletrônica por análise de fímbriaspurificadas

Cinco microlitros da preparação de fímbriaspurificadas foram colocados em uma tela de cobre de trama300 revestida com uma fina película de carbono. As telasforam então coradas negativamente por adição de 5microlitros de PTA 1% (ácido fosfotúngstico). O excesso delíquido foi removido.As telas foram observadas com o uso de um microscópioeletrônico FEG200. As imagens foram registradas em umavoltagem de aceleração de IOOkV e aumento nominal de 50000Xsob condições de baixa dose. As fímbrias foram observadascomo estruturas alongadas e flexíveis (Fig. 18).

As microfotografias eletrônicas foram escaneadas, e asimagens foram então convertidas no formato IMAGIC 5(imagic5.de). Porções idênticas de fímbrias foramescolhidas dos negativos digitalizados pela utilização decaixas quadradas (300 χ 300 pixels) pela utilização dosoftware EMAN. Entre a coleção de fímbrias totalmente nascaixas, somente fímbrias lineares com alguma direção decrescimento e diâmetros similares foram processadas.

Na primeira análise, as fímbrias na caixa foraminvertidas em densidade, filtradas por passagem alta epassagem baixa e depois alinhadas para a projeção de umcilindro-modelo com o mesmo diâmetro (Fig. 18). 0alinhamento rotacional foi aplicado com o uso da função deautocorrelação, seguida por alinhamento translacionalperpendicular somente ao eixo do cilindro.

O perfil de densidade através do eixo do filamento damédia foi calculado, e mostrado por representação gráfica.

0 perfil de densidade indicou fortemente que a fímbria éuma estrutura sólida, compacta, sem orifícios no meio, eque a estrutura global possui um diâmetro médio calculadode 11,5 nm (Fig. 18). Um diâmetro similar (11 nm) foicalculado a partir do volume tridimensional obtido porsimetria de rotação, atribuindo-se ângulos de rotaçãoaleatoriamente aos segmentos-haste alinhados (Fig. 19).

Além disso, o volume mostrou que a superfície das fímbriasnão é suave (Figs. 18-19).

Vários dos segmentos-haste pré-alinhados queapresentam fortes características estruturais de umarepetição de 13 nm foram ainda alinhados por geração de umamédia axial com a geração de uma imagem bidimensionalaprimorada com um sinal mais forte (Fig. 20).

As imagens bidimensionais (projeções de uma estruturatridimensional) (Figs. 21-22) mostram claramente que asfímbrias são feitas por pelo menos 3 "protofilamentos"dispostos em uma estrutura coiled-coil com um diâmetromédio de 10,5-11,0 nm e uma inclinação de 13,2 nm (Fig.23). 0 diâmetro das fímbrias na posição nodal é de 6,8 nm ecada um dos "protofilamento" possui um diâmetro de 3,5 nm(Fig. 23).

REFERÊNCIAS

(cada uma das quais é incorporada por referência em suatotalidade)

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Diversas modalidades da invenção foram descritas. Noentanto, será subentendido que podem ser feitas váriasmodificações, sem se afastar do espírito e escopo da invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Movartis Vaccines & Diagnostics

<iia-> PURIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS BACTERIANOS

<130> 20366-0S9WO1

<150> US 60/774,450<151> 17/02/2 006

<1GQ> 77

<170> PastSiQ para Versão Windows 4.0

<21Q> 1 -

<211> 2682<Z12> DNA

<213> Streptoeoccas p&@ux»oxilaê TÍGR4

<400> 1

atgcttaaca gggagacaca Catgaaaaaa gtaaçaaaga tafcttcagaa ggeagttgca 60ggacteftgct gtatatetea gttgacagct ttttettcga tagttgcnnt ?gcagaaacg 120écfcgaaacca gtccagcgaC.aggaaaagta gtgattaagg agacaggcga «ggaggpgcg 180cttctaggag atgcegtctt tgagttgaaa aacaatacgg atggeacaac tgtttcgcaa 240aggacagãgg cgcaaacagg agaagcgata Ctttçaa.aca taaaaectgg gacatacace 300ttg&eagaag çccaaeetce agttqqttate àaaceefcíifcs otraaacaatg gaotgttgaa 3C0qrttgagaaga atggtcggac gactgtccaa ggtgaacagg cagaaaatcg agaagaggct 420ctatetgaec agtatccaca aacagggact tatceagatg ttcaaacaçc ttatcagatt 480 âttaaggtag átggtrtcgge aaaaaacgga cagcecaagg egttgaatee gaatccatat 540gaaegtgtga ttccagaagg tacaetttca aagagaattt atcaagCgaa taatttggat €00çataaccaat atggaatcga attgacggtt agtgggaaaa cagtgtatga aeaaaaagat €60aagtctgfcgc cgctggatgt cgttatcttg ctcgataact caaatagtat gagtaacatt 720egaaacaaga atgctsçacg tgeggaaaga gdtçgtgagg egacacgttc tettattgat, 780aaaattacat etcratteaga aaatagggi-Λ. yçgcttgtga ottatgctjtc caeuattittc 8 40gatgggaccg agtttacagt agaaaaaggg gtagcagata aaaacggaaa gcgattgaat 900gattctettt tttggaatta tgatcagacg agttttacaa ccaataccaa agattatagt 960tetttaaagc tgactaatga táagaatgac attgtagaat fcaaaaaatâa ggtaeetacc -1020cfaçcrcagaaç accatgatgg ^astagattg afegtaccaat tcggtgüüdc ttttSCC.cãg 1080aaagctttga tgaaggcaga tgagattttg acacaacaag cgagacaaaa tagtcaaaaa 114 0gtcattttce atattaeggá tggtgtccca actatgtcgt atecgattaa tCtcaatcat 1200gctacgtttg ctecatcata tcanaatcaa ctaaatgcat tttttagtaa atctcetaat 12€Qaaagatooaa tactar.fc.-iag tçatfcfctatt oegceagcaii cLciytggaga acataeaatt 1320gtaegcçgag atgggcaaag ttaccagatg tttacagata agáeagttta tgaaa.aaggt 13Ô0gctcctgcag ctttcceagt taaaçctegaa aaatattetg aaatgaagge ggctggttat 1440gcagttatag gcgatccaat taatggtgga tatatttggc ttaattggag agagagtatt'1500ctggcttatc cgtttaattc taatactgct aaaíittacca ateatggtga ccctacaaga 1560tggtactata acgggaatai tgctcetgat gggtatgatg tetttacggt aggtattggt 1620attaacçgag atectggtaç ggatgaagca' acggctacta gttttatgca aagtatttct 1680agtaaaeetg aaaactatac caatgttact gaeacgacaa aaatattgga acagttgaat 1740r-gttatttee Beaeeatogt aactgaaaag aaateâàttg agaatggtac gattacagat 1B00ccgatgggtg agttaattga tttgcaattg ggcacagatg gaagatfctga teeagcagát. 18 60tacaetttaa ctgcaaacga tggtagtcgc ttggagaatg gaeaagctgt aggtggtcca 1920caaaa,tgatg gtggtttgtt aaaaaatgca aaagtgctet at^atacgac tgagaaaagg I^eOattcgtgtaa caggtctgta ccttggaacg gatgaaaaag ttacgttgac ctacaatgtt 2040cgtttgaatg,atgagtfctgt oageaataaa ttttafcgata ecaatggtcg aacaaççtta 2100catcctaagg aagtagaaca gaacacagtg egcgacttec egattecfcaa gattcgtgãt·21S0gtgcggaagt atccagaaac cacaatttca aaagagaaaa aacttggtga cattgagttt 2220ãttaaggtca ataaaaatga taaaaaacca·ctgagaggtg cggtctttag tcttcaaaaa 2280caacàtdcgg attatccaga tatttatgga gctattgatc aaaatggcac ttatcaaãât 2340gtgagaaeag gtgeagatgg taagttgacc tttaaeaaCc tgtcagatgg gaaatátcga 29 00ttatttgaaa attetgaacc agetggttat aaacccgttc aaaataagcc tatcgttgce 2460ttccaaatag taaatggaga agtcagagat gtgacttcaa tcgCtccaca agatatacca 2520gcgggttacg·agtttacgaa tgataagcac tatattac&a atgaacetat tcctccaaag 2580agagaatatq cfcegaa&tgg tggtafcegga atfttgceat tctatctgat aggttgcatg 2640atgatgggag gagfctctatt atâeacaçgg anacatccgt aa 2682

<210> 2 <211> 893 <212> PRT

<213> StreptOCOCCUS pneurnoniae TIGR4-<400> 2

Ket Leu Asn Arg Glu Thr His Net Iya Lys Val Arg Lys Ile Phé Gln

1 5 10 15

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20 25 30

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33 40 45

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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195 200 205

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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Ale Thr Phe Ala Pro Ser Tyr Gln Asn Gln Leu Asn Ala Pfte Phe Ser

405 410 15

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420 425 430

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435 440 45

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450 455 460

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530 535 540

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565 570 575

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580 585 530

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595 600 605

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610 615 620

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675 690 685

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690 695 700

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725 730 735

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740 745 750

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770 775 780

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<210> 3C211> 1998<212> DNA

<213> Streptococcus pneumoniae TIGR4<400> 3

afcgaa&tcaa tcaacaaatx tttaacaatg cttgctgcet tattactgac agcgagtagc 60efcgttttcag ctgcaacagt ttttgcggct gggacgaeaa caacatctgt taccgttoat 120aaacfcattgg caacagatgg ggatatggat aaaattgcaa atgagttaga aacaggtãac·180tatgctggta ataaagtggg tgttctaeet gcaaatgeaa aagasaCttrc cggtgttatg 240ttogtttgga caaatactaa taatgaaatt attgatgaaa atggccaaae tctaggágtg 300aâtattgatc cacaaacatt taaactctca ggggcaatgc cggceactgc aatgaaaaaa 3GOfetaacagaag ctgaaggagc caaatttaac acggcaaátt taccagctgc fcaagtataaa, 420atfctatga&a tfccacagttt atcaacttat gtcggtgaag atggageaac cttaacaggt 480tçtaaàgeag tfcceaattga aattgaattet ccattgaaeg atgttgtgga .tgjcgcatgtg 540tatccaaaaa atacagaagè aaagccaaaa attgataaag atttóaaagg taaagcaaat 600eeagatacac caegtgtaga taaagataea cctgtgaacc accaagttgg açatgttgta 660gagtacgaaa ttgttacaam aattceagca cttgctaatt atgcaaeaçc aaactggagc 720gatagaatga cfcgaaggttt ggcattcaac aaaggtacag tçaaagtaac tgttgatgat 780gttgcacttg aagcaggtgõ ttatgctcca acagaagtag caactggttt tgatttgaaa 840ttaacagatg.ctggtttagc taaagtgaat gaccaaaacg ctgaaaaaac tgtgaaaatc 900acttattcgg c-aacattgaa tgacaaagea attgtagaag taccagaatc taatgatgta 960acatfctaact atggtaataa teeagateac gggaatactc caaagccgao.taagccaaat 1020gaaaaeggeg atttgacatt gaccaagaca tgggttgatg ctacaggtgc acoaattccg 1080gctggagetg aagcaacgtt cgatttggtt aatgcecaga ctggtaaagt tgtacaaact 1140gtaactttgo caueagacaa aaatacagtt actgfctâacg gattggataa aaataeagaa 1200tataaattcg ctgaaegtag tataaaaggg tatteageag attatcaaga aatcaetaca 1260gctggagaaa ttgetgleaa gaartggaaa gacgaaaatc caaaacoact .tgatccaaca 1320gagccaaaag ttgttacaea tggtaaaaag tttgtcaaag ttaatgataa agataatcgt 13Θ0ttagctgggg cagaatttgfe aattgcaaat gctgataatg ctggtcaaca tttagcacgt 1440aaogcagata aagtgagtca agaagagaaç cagttggttg ttacaecaaa ggatgcttta 1500gatagoçcag ttgctgctCa taacgctett actgcacaac aacaaactca gcaagaaaaa 1560gagaaagttg acaaagcfcca agctgettat aatgctgctg tgattgctgc caacaatgca 1520tttgaatggg tggcagataa ggacaatgaa aatgttgtga aattagtttc· tgatgcacaa .1CQ0.ggtcgetttg aaattacagg ccttctt<jca ggtacacatt SCttagaagai aacaaaacag 1740octgctggtt atgcattact aactagccgt cagaaatttg aagtcactgc aacttcttat 1800tcagegactg gacaaggçat tgagtatact gctggttcag gtaaagatga cgctacaaaa' 1860gtagtcaaca aaaaaatcác tatcecacaa acgggtggta ttggtacaat tatctttgct 1920gtagcggggg ctgcgattet gggtattgca gtgfcacgeat atgttaaaaa .caacaaagafc 1980gãggateaac ttgcttaa 1958

<210> 4

<2U> 665

<212> PRT

<2I3> Streptococcus pneumoniae TIGR4

<400> 4

Met fcya Ser Ile Asn Lys Phe Leu Thr Ket teu Ala Ala Leu teu teu

1 5 10 IS

Th Ala Ser Ser Leu Phe Ser Ala Ala Thr Val Phe Ala AXa Gly Thr

20 25 30

Thr Thr Thr Ser Val Thr Val His Lya Leu Leu Ala Thr Asp Gly Asp

35 40 . ·' 45

Mot Asp Lys Ile Ala Asn Glu Leu Giu Thi Gly Aen Tyr Ala Gly Asn

50 55 60

Lya Val Gly Val Leu Pro Ala Asnl AIa Lys Glu Xle Ala Cly Val Met65 70. 75 80

Phe Val Trp Thr Asn Thr Asn Asn Glu Ile Xle Asp Glu Asn Gly, GiO

85 90- 95

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100 105 110 ' · .

Ket Pro' Ala Ttuc Ala Mot Lys-Lys Leu. Thr GXu Ala Clu Gly Ala Lys

115 · 120 125

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130 135 140

His Ser teu Ser Thr Tyr Val Gly Glu Aap Gly Alá Thx Leu Thr Gly145 150 " 155 160

Sèr Lys Ala Val Fro Ile Glu Ile Glu Leu Pro Leu Asn Asp Val Val

16S 170 1?S

Asp Ala Hls Val Tyr Pro Lys Aan Thsc Glu Ala 'Lys Pro Lys Ile Asp

180 185 ISO

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ISS - 200 2OS

Asp Thr Pro vai Asn Hls Gin Val Gly Asp Val Val Glu Tyr GIu Ile

210 , 215 220 ...

Val Thr Lys Ile Pro Ala Leu Ala Asn Tyr Ala Thr Ala Asn Trp Ser225 230 235 240

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24S · 250 - 1 255

Thr Val Asp Asp Val Aia Lau Glu Ala Gly Asp Tyr Ala Leu Thr Glu

260 , 265 270

Val Ala Thr Gly &he Aap, Leu. -Lys LewThx Aap Ale' Gly Lau Ala Lys

275 280 285

Val Asn Aep Gln Asn Ala Glu Lys Thr Vai·Lya Ile Thr Tyr Sar Ala

290 295 300

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Thr Phé Asn Tyr Sly Asn Aen Pro Asp Hls Gly ASn Thr Pro Lys Pro

325 . 330 335

Asn Lys Pro Asn' Glxt- Asn Gly Asp Leu Thr Leu Thr Lys Thr Trp vai

340 345 350

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355 - 360 36S

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<210> 5

<211> 1182 <212> DHA

<2l3> Streptecoccus jpaeüraoftiâè TIGM

<400> S

atgfttagtc gtatetfcctt tgttatggct ctgtgttttt ctcttgtatg gggtgeacat 60gcagtceaag cgcaagaaga teacacgttg 'gtcttgcaafc tggagaacta teaggaggfcg 120gfctagtcaat tgccafcctcg tgatggtcat cggttgcaag tatggaagtt·ggafcgattcg IflOtattcctatg atgaccgggt gcaaattgto ;agagacttgc attcgtggga tgagaataaa 240ctttcttett tcaaaaagac ttcgtttgag atgaccttec ttgagaatea gattgaagea 300tctcatafctc caaatggtct Jfcta-Otatgtfe egctctatta feceagaegg^ fcgcggttfcct 360tateeagctg aatttctttt tgaaatgaca. gatcaaacgg tagagccttfc ggtcattgta 420gcgaaaaaaa eagatacaat gacaacaaag gtgaagctga taaaggtggá tcaagãccac «80aatcgcttgg ágggtgtegg ctttaaèttg gtatçagtag caagagatgt ttctgaaaaa 5Ί 0gaggttccct tgattggaça ataccgttac agttcttctg çtcaagtagg gagaactctc 600tatactgata aaaatggaga gatttttgtg acaáatcttc ctcttgggaa cfcatcgtttc 660aaggaggtgg agccactggc aggctátgct gttacgacge tggatacggã tgtecagctg 720gc&gateatc agctggtgac gatcacggtt gtcaatcaga aafctaecacg tggcããtgtt 780gactttatga aggtggatgg tcggaccaat acctctcttc aaggggcaat gttcaaagtc 840afegaaaaaag aaagcggaca ctatactcct gttcttcaaa atggtaagga agtagttgta 900acafrcaggga aaçjatggtcg tttccgagtg gaaggtetag agtatgggac atactattta 960.tggoagctcc aãgctccaâc tggttfttgtt caa.ttaacat cgcctgtttc etttac«at<t 1020gggaaagats ctcgtaagga aceggtaaca'gtggtcaaaa ataacaagcg fÇggattgatgtgccag atacagggga agaaaectfcg tatatcttga tgcttgttgc cattttg-ttg 1140tttggtagtg gttattatct tacgaaaaaa çeaaataact ça 1182

<210> 6<211> 393<212> PRT

<2l3> SfeKeptococcus pneurnoni a ô TIGR4

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20 ·25 30

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35 40 45

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85 90 95

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130 13S 140

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145 ......· ' 150 155 160

Asn Arg Leu Glu Gly Val Gly Phtf Lys Leu Val Ser Val Ala Arg Asp

1€S · ItO 175

Val Ser Glu Lys Glu Val Pro Leu Ile Gly Glu Tyr .Arg Tyr Se* Ser · ,

180 105 Í90

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195 ' ■ 200 205

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210 21S ' 220

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245 .250: 255

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260 26S " 2:70

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275 280 · 285

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290 ■ " 29S ' * 1 -300

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- ' .....·' 325 . ■ 330 . 335

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355 360 365

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370 ·375 3Θ0

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<210> 7

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<2:X3> Streptococcus paeumonlae TXGR4 ■

<400> 7 ■ -. ·

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15 10 15

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20 ,

<210> 8

<21l> S

<212> PRT _ * .

<213> sequência Artificial

<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente

<220> · -<221 > VARIANTE"<222> 3

<223> Xaa =Aminoácido não definido

<4θό> β, ' , ;

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<210> 9<211> 5<212> PRT

<213>" sequênci a Arti fi ci al<22Q>

<223> Peptideo gerado sinteticamente

<220><221><222><223>

VARIANTE · ,3

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'-<4 00> 9

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1 5<210> 10<211> 5<212> ΡΆΤ

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> peptideo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE

<222> 3

<223> Xae = Aminoácido qualquer<400> 10

Vel Pro Xaa Shx Gly ' ,

1 5

<210> Il<21l> 5<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE'<222> 3

<223> Xaa » Aminoácido qualquer

<400> 11

faço Xaa Thr ,Sly1 -5

< 210> 12<211> S

<212> PRT ...

<213> seqüência Artificial

<220>

<22 3> peptideo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE'<222> 3

<223> Xaa "Aminoácido não definido<400> 12

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<210> 13<211> ·5<212> PftT<213> sequência Artificial<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente<Z20>

<221> VARIANTE<222> 3

<223>.Xaa = Ami noácido qualquer

<400> 13ClM Vel Xaa Thr GIy

1 S

<21Q> 14

<21ϊ> 5<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente

<220> <221> VARIANTE<222> 3

<223> Xaa = Aminoácido qualquer<400> 14

Gln Val Xaa Thr Gly1 5

<210> 15<211> S

<212> PRT

<213> seqúeiicia Artificial

<220>

<223> peptideo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 3

<223> Xaa = Aminoácido qualquer<40Ò> 15

Lcu Pro Xaa Alá Gly1 5

<210> 16<211> S<212> ?RT

<213> Sequencia-Artificial

<220><223> Peptideo gerado sinteticamente<4Q0> 16

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1 5

<2l0> 17<211> 5<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo gerado sinteticamente<220>

<221 > VARIANTE *

<222> 3 ,

<223> Xaa » any amlno acid

' <400> 17Phe Bco Xaa Thr Sly

1 5

<210> 13<21l> 32<212» DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador<400> 18

tttttgggce ettegtgttc gtçfctgactt gc

<210> 19, <21t> 33. <212> DNA<213> seqüência Artificial

• <220><223> Ini ci ador

<400> 15

tttttggatc cgatgttgcfc ^attaagacg age

<210> 20<211» 21<212> DKA

<213> sequênci a Arti fi ci al<220>

<223> ; Iniciador<4Q0>'20 ·

aacctctttt acgtttccgc c<210> 21

<211> IS

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> C1

<400> 21

accgaaagac agacçjagcc

<210> 22<211>·32<212> DNA

<2ΐ'3> sequênci a Arti fi ci al<220>

<223> : Ini ci ador

<400> 22

ttggatccct ttaaataetg tágaaaagag ga

<210> 23 ·

<211> 31<212> DHA

<213> sequência Artificial<22 0>

<223> : Iniciador

<4QÍ)> 23

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<210> 24<2ll> 33<212> DMA '

<213> sequência Artificial<220>

<223> : Ini Ci ador<4·00> 24

tctatgccca teeeagagga aatggatcgg ate

<2IÓ> 25<211> 2«<212> .DHA

<213> seqüência Artificial<220>

<223>. In"> c^ ador<400> 25

ctagggcect ttccttatgc ttttggac

<210> 26<211> 22<212> DNA

<213> seqüência Artificial

<220> <223> ΙΠΊ C1 ador

<400> 26

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<210> 27<211> 20<212> DNft

<213> SequenciaArtificial

<223> mi ciador<400> 27

ceagagcaca gcgtggtgct

<210> 28<211> 21<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> ; Iniciador<4Ρ0> 28

caaggfeccáá acctactgaa c

<210> 29<211> 29<212> HNA

<213> seqüência Artificial<22 0>

<223> : Ιη"· c^ ador<4 00> 29

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<210? 30

<211> 29<212> cm

<213> seqüência Artificial<220>

<223> : mi ci ador<400> 30

cgggatccct ggeafctfcCfcg ggiLatcctg

<210> 31<211> - 23 ·<212> ΟΗΛ .<213> sequênci a Arti fi ci al<220>

<223> Iniciador

<400> 31

cgfcttcaàçt gctaecactg ttc 23

<210> 32

<211> 26 <212> DNA

<213> sequência Artificial

<220> <223> Imciador

<ÍOO> 32

atataacatg aacaejttggg ttctjg 26

<210> 33 ·

<21l> 33

<212> Dna

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 33

atataggocc caacctcttg caattata.cc aca 33

<210> 34

<211> 32<212> DKA

<213> seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 34

Atataggate ccgcgtttga aetgtàectc aa. 32

<210> 33

<211>·27

<212> ONA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 35

etatace0ta actgceccftt ecaaatc 2:7

<210> 36

<211> 29

<212 > DNA

<213> sequência Artificial<2Ζ0>

<223> iniciador<400> 36

atatactgct tcaatccatt agttatttc

<210> 37<211> 30<212> DNA

<213> seqüência Artificial

<220> <223> Iniciador

<400> 37

statattsist tgtaaaãatt ccatctetág

<210> 30<211> 30<212> DHft

<213» sequência Artificial<220>

<223> !iniciador<400> 33

ttggateett atttccctcg tegtaaacgt

<210> 39<211> 32«212» DNA

<213> seqüência Artificial<22 0 >

<223> '■ In'i ci ac|or<4 00> 39

ttgggcccaa agaaatgaaa ggnaagctaà gg

<21D> 40<211> 21<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223>:Iniciador<400> 49

ceeggtccaa acctectgaa'c<210> 41

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<213> sequência Artificial

<220>'

<223> :iniciador<400>41 gcgggcecet gagatataca, gcacagtcc

<210> 42<211> 29<212> DNA

<2X3> seqüêncí a Arti fi ciaL<220>

<223> mi ci ador<400> 42

cgggatccct .ggcatttctg ggaatcctg

«210> 43<211> 23<212> DfiA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> :Iniciador<400> 43

cgfcfctcaagt gctatcaetg ttc

<2ÍO> 44<Zll> '22 -<212>

<213> sequência Artificial

<220> . .<223> : Im ci ador

<4O0> 44·

gcccsatcct gccctcactg cg

<210> 45<211> 26<212> DNA

<213> seqüência Artificial<22Q>

<223>'Inici ador<400> 45

atataaeatg aacagttggg ttettg '

<2Í0> 46 *<211> 33<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223>;Iniciador<40£t> 46atatagggce caacctcttg .caattatacc aca

<210> 47<211> 32<212> DNA

<2l3> seqüência Artificial

<220><223>:Inlc'lador

<400> 47

atataggatc cegeçtttga actgtacctc aa

<2t0> 48<2U> 27

DSA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> : Inl C1 ador<400> 49

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<210> 49<211> 29<212> DNA

<2X3> seqüência Artificial

<220> . ,<223> : mi ei ador

<400> 49 atatactgct tcaátccatt 'agttattte

<210> SO<211> 30<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Irvi c^ ador<aoo> 5o

atatattgât tgtaaaaatc ccatctatag<210> 51

<211> 43 <212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> : Ini ci ador

<400> 51 cgcggatcca aaggagaatc, atcatgctaa acaaatacat tga<210> 52 <211> 30

<212> DSIft

<2ΐ3> Seqüência Artificial

<220> <223> C1

<400>52

ccctctagat.fcataacaaat agtgagcctt

<210> 53 ] ■■ '

<211> 6<212>· PRT -

<213> seqüência Artificial ·<220>

<223> peptideo gerado sinteticamente

■ <4Q0> 53

■ Gly Ser,Gly Gly Giy Gly

1 S

<ZX0> 54<211> 6<2Í2> DNA

<213> seqüência Artificial

<220> ■ ,, -<223> Padrão de Exemplo

<400> 54gtegtt

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<213> seqüência Artificial<220> -

<223> Padrão de Exemplo

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<2i0> 56<21i> 13

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<213> seqüência Artificial

<220> ·

<223> peptideo gerado sinteticamente

<220>

<221> VARIANTE '<222> 12<223> Kaa = Aminoácido qualquer<400> 56

Gly Thr Thr Thr Th3: Ser Val Thr Val His Xaa Leu1 5 10

<210> 57<211> 5<212> PRT<213> Sequencia Artificial

<223> Peptideo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 3

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Leu Pro Xaa Ser .Gly

1 5

<210> 58 <211> 19<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente<220>

<2Z1> VARIANTE "

<222> 13, 14, 15, 16, 17, 18

<223> Xaa " Aminoácido qualquer

<400> 58

Trp Leu Gln Asp VAl His Val Tyr Pro Lys His Gln Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

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<210> 59<211> 19<212> PRT

<213> Sequencia Artificial

<223> Peptídeo gerado sinteticamente

<220>

<221> VARIANTE

<222> 13, 11, 15, 16, l7, 18

<223> Xaa - Aminoácido qualquerXaa Xaa hys

<210> . 60'<211> 19 ·

<212> PRT

<213> sequênci a Artificial

<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamentee<220>

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<222> 13, 14, 15, 16, 17, 18,

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<400> 60 '

Tro Leu Tyτ Asp Val Agn Val Phe Vsa Lys Asn Gly Xaa Xaa xaa Xaa

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Xaa Xaa Lys

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<223> Peptideo gerado sinteticamente

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<221> VARIANTE

<222> 13, 14, 15, 16, 17, 18

<223> Xaa -Aminoácido qualquer

<400> 61

Trp Ile Tyr Asis Val Jlls Val Tyr Pco Lya Asn Glu Xaa Xea Xea Xaa

1 5 10 15

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<210> 62 '<211> 19<212> PRT

<213> Seqüência Artificial .<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente*<220><221> VARIANTE

<222> 13, 14, 15, 16, 17, 18

<223> Xaa w Anrinoácido qualquer

<400> 62

Trp Asn Tyr Asn vai Hls vai Tyr Pro Lya Asn Thr Xaa xaa Xaa xaa

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Xaa Xaa Lys

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<223> Peptideo gerado sinteticamente ι<220>

<221> VARIANTE

<222> 13, 14, 15, 16, 17, 18

<223> Xaa =■ Aminoácido qualquer . '

<400> 63 ' .

Phe Lé\i ser Glu Ile Asa Ile Tyr Pro Lys Asn Val Xaa Xaa Xaa Xaa

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Xaa Xaa Lys

<210> 64

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<2Ϊ3> seqüência Artificial ·<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE * '

<222> 13, 14, 1S, 16, 17, 10<223> Xaa ■=" Ami noáci do qualquer

<400> 64

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1 S 10 15

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<213> ,seqüência Artificial

<220>.<223> Seqüência consenso

<220>

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<220>

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<220>

<221> VARIANTE<222> 11

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<220>

<221> VARIANTE

<222> 2, 3, 4> 12, 13,. 14, 15, 16, 17, IS

<223> Xaa = aminoácido qualquer

<220> <221> VARIANTE<22 2> 19

<223> Xaa = Iys ou Leu

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Xaa Xaa Xaa

<210> 65<2ll> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente®<40O> 66

Phe Gys Leu Val GXu Tiir AXa Thr Ala Ser Sly Tyr1 5 10

<210> 67<211> 12<212> PRT

<213> seqüência Artificial<22Ó>

<223> Peptideo gerado si nteti camente

Phe0Cys7Leu Lys Glu THc Lys AlS Pro Ala Gly íyr

1 5 10

<210> 68<2U> 12<212> PRT

<213> -seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente

<400> es -

Tvr Vml Leu Val Glu Thr Giu Ala Pco Thr Gly Phe1 5 10

<210> 69<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente<40Q> 69

Tvr Cvs teu Val Glu Thr Lys Ala Pro Tyr Gly Tyrí 5 10

<210> 70<211> 12<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo gerado sinteticamente

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Tyr- Lya Lau Lys Glu Tiir Lys Ala Pro Tyr Gly Tyr

<210> 71<211> 12<212> PRT

<2l3> seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo gerado sinteticamente

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Tyi- Pro íIe Thr Glu Glu Val Ala Pro Ser Gly Tyr10

<210> 72

<211> 12 <212> PRT

<2ΐ3> seqüência Artificial<2Ζ0> <223> Peptideo gerado sinteticamente<«00> 72

Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Sex Glu Prô Alia Giy íyx1 5 10

<210> 73 <2!1> 12<212> mt

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo gerado sinteticamente

<400> 73

Tyr «yr Ttp Glu teu Gln Ala Pro Thr Gly Tys

<21Q> 74 <211> 12<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> peptideo gerado sinteticamente

Tvr Tvr Leu Glu «au Thr tys Gliv Pro Ala Gly Iyr1 5 10

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<213> seqüência Artificial<220>

<2Z3> seqüenci a consenso<220>

<221> VARIANTE<222> 1 12

<223> Xaa - Tyr ou Phe<220>

<221> VARIANTE<222> 3<223> Xaa Iieu ou Iie<220>

<221> VARIANTE<222> 8

<223> Xaa - Ala, Gln or ThrC220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Pro ou Ala<220>

<221> VARIANTE<222> 2, 4, 1, 10

<223> Xaa = Aminoácido qualquer "<4<JÔ> 7S .

Xaa Xaa Xae Xaa Glu Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa1 5 10

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<2i3> sequência Artificial<22Q>

<22 3> peptídeo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE

<222> 2, 3«· 4, 6,

<223> Xaa = Aminoácido qualquer

<40Q> 76

Trp Xaa Xaa Xea Val Xaa Vâl Tyr Pro Lyo1 5 10

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<2i3> seqüência Artificial

<22 o>

<223> peptídeo gerado sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa f Ami noáci do qual quer

<400> 77Itétt Xaa Glu fhxT

Claims

1. Fímbria estreptocóccica isolada caracterizada pelofato de que é: uma fímbria de Streptococcus pneumoniae; umafímbria de Streptococcus pyogenes; ou uma fímbria deStreptococcus agalaetiae.

2. Fímbria, de acordo com a reivindicação I7caracterizada pelo fato de que é uma fímbria deStreptoeoeeus pneumoniae que compreende uma proteína RrgB.

3. Fímbria, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de possuir um peso molecular de 2 χ-IO6 a 3 χ IO6 Da.

4. Fímbria, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de ter sido separada de células pordigestão enzimática ou cisalhamento mecânico.

5. Fímbria, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que o cisalhamento mecânicocompreende ultrassonificação.

6. Fímbria, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada por sersubstancialmente livre de células bacterianas.

7. Fímbria, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fatode que a fímbria compreende três protofilamentos.

8. Composição imunogênica caracterizada porcompreender uma ou mais fímbrias de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.

9. Método de produção da fímbria de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 caracterizado porcompreender a submissão de uma célula bacteriana que produza fímbria à digestão enzimática ou ao cisalhamentomecânico, e o isolamento da fímbria da célula.

10. Método de isolamento de fímbrias de Streptococcuspneumoniae caracterizado por compreender:- a submissão das células bacterianas que produzemfímbrias de Streptococcus pneumoniae à digestão enzimáticaou ao cisalhamento mecânico; e- o isolamento das fímbrias das células.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que as células bacterianas sãocélulas de Streptocoeeus pneumoniae (por exemplo, célulasTIGR4), em que as células são submetidas àultrassonificação ou â digestão com uma enzima lítica, e emque os componentes não celulares são separados após aultrassonificação ou a digestão, mas antes da etapa deisolamento.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que ainda compreende adegradação de ácidos nucléicos com uma nuclease.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o cisalhamento mecânicocompreende ultrassonificação.

14. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que a digestão enzimática érealizada com o uso de mutanolisina.

15. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelofato de que o isolamento compreende uma ou maiscentrifugações por gradiente de densidade ou etapas decromatografia.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que os componentes não celularessão separados com o uso de centrifugação por gradiente dedensidade.

17. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelofato de que a etapa do isolamento compreende a redução dapolidispersibilidade.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a polidispersibilidade éreduzida por separação das fímbrias de Streptococcuspneumoniae por tamanho usando cromatografia por filtraçãoem gel.

19. Anticorpo que se liga especificamente a umafímbria de Streptococcus pneumoniae caracterizado pelo fatode que o anticorpo preferencialmente (i) se liga a umcomplexo de fímbrias, como comparada com a ligação doanticorpo a uma proteína da fímbria que não esteja emcomplexo, selecionada do grupo que consiste em RrgA, RrgB eRrgC, ou (ii) não se liga especificamente à RrgA, RrgB ouRrgC que não esteja em complexo.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado dogrupo que consiste em um anticorpo monoclonal, um anticorpopoliclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, umanticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia simples ou umfragmento Fab.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado.

22. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o marcador é uma enzima, umradioisótopo, agente de contraste, uma toxina ou umfluoróforo.

23. Método de indução de uma resposta imunológicacontra Streptococcus pneumoniae caracterizado porcompreender a administração de uma quantidade eficaz defimbrias isoladas de Streptococcus pneumoniae a um indivíduo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

25. Método de detecção de uma infecção bacterianagram-positiva em um indivíduo caracterizado por compreendero teste de uma amostra do indivíduo quanto à presença de umanticorpo para fimbrias bacterianas gram-positivas, em queo anticorpo se liga preferencialmente a um complexo defimbrias, comparado com um componente das fimbrias.

26. Método de detecção de uma infecção porStreptoeoecus pneumoniae em um indivíduo caracterizado porcompreender o teste de uma amostra do indivíduo quanto àpresença de um anticorpo para fimbrias de Streptoeoecuspneumoniae, em que o anticorpo se liga preferencialmente aum complexo de fimbrias, comparado com um componente defimbrias.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizado pelo fato de que a amostra é soro.

28. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de queo indivíduo é um ser humano.

29. Método de detecção de uma infecção porStreptoeoecus pneumoniae em um indivíduo caracterizado porcompreender contatar uma amostra com um anticorpo dequalquer uma das reivindicações 19, 20, 21 ou 22 e adetecção da ligação do anticorpo com um componente daamostra.

30. Método de tratamento de um indivíduo que possuiuma infecção por Streptococcus pneumoniae caracterizado porcompreender a administração ao indivíduo de uma quantidadeeficaz de um agente que se liga especificamente às fímbriasde Streptococcus pneumoniae.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que o agente é um anticorpo.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o anticorpo bloqueia adesãodo Streptococcus pneumoniae às células.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que as células são célulasepiteliais.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato de que as células epiteliais sãocélulas epiteliais do pulmão ou da nasofaringe.

35. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 31, 32, 33 ou 34, caracterizado pelo fato deque o anticorpo (i) se liga preferencialmente a um complexode fímbrias, comparada com a ligação do anticorpo a umaproteína da fímbria que não esteja em complexo selecionadado grupo que consiste em RrgA, RrgB e RrgC, ou (ii) não seliga especificamente à RrgA, RrgB ou RrgC que não esteja emcomplexo.

36. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 31, 32, 33, 34 ou 35, caracterizado pelofato de que o anticorpo bloqueia pelo menos 50% da adesãode Streptococcus pneumoniae à célula, medida em um ensaioque mede a adesão de Streptococcus pneumoniae às célulasepiteliais pulmonares A549, comparado com um controle.

37. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizadopelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

38. Fímbria isolada ou multímero semelhante a fímbriacaracterizada pelo fato de compreender um polipeptídeo quecompreende a seqüência de aminoácidos de uma proteína defímbria de Streptococcus pneumoniae com até 3 0substituições, inserções ou deleções de aminoácidos.

39. Fímbria ou multímero semelhante a fímbria, deacordo com a reivindicação 38, caracterizada por ter: (i)até 20 substituições, inserções ou deleções de aminoácidos;(ii) até 10 substituições, inserções ou deleções deaminoácidos; ou (iii) até 5 substituições, inserções oudeleções de aminoácidos.

40. Fímbria ou multímero semelhante a fímbria, deacordo com a reivindicação 3 8 ou 39, caracterizada pelofato de que as substituições, inserções ou deleções deaminoácidos são substituições de aminoácidos.

41. Fímbria ou multímero semelhante a fímbria, deacordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato deque as substituições de aminoácidos são substituiçõesconservativas de aminoácidos.

42. Fímbria ou multímero semelhante a fímbria, deacordo com qualquer uma das reivindicações 38, 39, 4 0 ou-41, caracterizada pelo fato de que a proteína é RrgA, RrgBou RrgC.

43. Método de purificação de Streptococcus pneumoniaede uma amostra compreendendo Streptococcus pneumoniaecaracterizado por compreender:a) o fornecimento de uma matriz de afinidade quecompreende o anticorpo de qualquer uma das reivindicações-14, 15, 16 ou 17 ligado a um suporte sólido;b) o contato da amostra com a matriz de afinidade paraformar um complexo matriz de afinidade-Streptococcuspneumoniae;c) a separação do complexo matriz de afinidade-Streptoeoceus pneumoniae do restante da amostra; ed) a liberação do Streptoeoceus pneumoniae da matrizde afinidade.

44. Método de identificação de um modulador de umaatividade de Streptoeoceus pneumoniae caracterizado porcompreender: (i) o contato de uma célula suscetível àinfecção por Streptoeoceus pneumoniae com um compostocandidato e Streptococcus pneumoniae, e a determinação dese uma atividade de Streptoeoceus pneumoniae é inibida, emque a inibição da atividade de Streptococcus pneumoniae éindicativa de um inibidor de Streptoeoceus pneumoniae, ou(ii) o contato de uma célula animal suscetível à ligaçãodas fímbrias de Streptoeoceus pneumoniae com um compostocandidato e uma célula bacteriana que possui fímbrias deStreptococcus pneumoniae, e a determinação de se a ligaçãoda célula bacteriana à célula animal é inibida, em que ainibição da atividade de ligação é indicativa de uminibidor da ligação de fímbrias de Streptococcuspneumoniae, ou (iii) o contato de uma célula suscetível àligação de fímbrias de Streptococcus pneumoniae com umcomposto candidato e fímbrias de Streptoeoceus pneumoniae,e a determinação de se a ligação das fimbrias à célula éinibida, em que a inibição da atividade de ligação éindicativa de um inibidor da ligação de fimbrias deStreptococcus pneumoniae, ou (iv) o contato de uma célulasuscetível à ligação de fimbrias de Streptococcuspneumoniae com um composto candidato e uma proteína defímbria de Streptococcus pneumoniae ou fragmento de ligaçãocelular desta, e a determinação de se a ligação da proteínade fímbria ou de fragmento desta à célula é inibida, em quea inibição da atividade de ligação é indicativa de uminibidor da ligação de fimbrias de Streptococcuspneumoniae.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de que a atividade de Streptoeoceuspneumoniae é a adesão de Streptoeoceus pneumoniae àscélulas epiteliais pulmonares A549.

46. Método, de acordo com a reivindicação 44 ou 45,caracterizado pelo fato de que a célula suscetível éisolada ou cultivada.