BRPI0707607A2 - monitoramento de misturas de enzima - Google Patents

Abstract

MONITORAMENTO DE MISTURAS DE ENZIMA. A invenção refere-se a um método para detecção simultânea da presença de pelo menos duas enzimas em uma amostra, o referido método compreendendo as etapas de: i) fornecimento de um primeiro substrato para uma primeira enzima, o referido primeiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo, ii) fornecimento de um segundo substrato para uma segunda enzima, o referido segundo substrato sendo rotulado com um segundo fluoróforo, iii) exposição dos substratos rotulados à amostra para permitir que as primeira e segunda enzimas presentes na amostra interajam com os respectivos primeiro e segundo substratos fluoróforo-rotulados para formar respectivos primeiro e segundo fragmentos de substrato fluoróforo-rotulados; e detecção da presença dos referidos fragmentos de substrato fluoróforo-rotulados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MONITORAMENTO DE MISTURAS DE ENZIMA".

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a métodos para monitoramento dapresença de pelo menos duas enzimas em uma amostra. As enzimas podemser consideradas misturas de enzimas. Em modalidades da invenção, o mé-todo compreende monitoramento de misturas enzimáticas em uma basecontínua ou quase que contínua. Os métodos da presente invenção tambémpodem ser usados para determinar a concentração de uma enzima a qualestá compreendida dentro de uma mistura de enzimas. Também incluídosna presente divulgação são produtos e aparelhos para uso no método.

Antecedentes da Invenção

Enzimas de vários tipos são amplamente usadas por toda umavariedade de indústrias, tais como a indústria farmacêutica, a indústria debiotecnologia, a indústria de sabão e detergente e a indústria de alimentos.Foi observado que inalação de enzimas liberadas na atmosfera do local detrabalho podem causar efeitos prejudiciais para a saúde aos trabalhadoresexpostos, resultantes de sensibilização respiratória. Limites de exposiçãoregulamentais foram identificados, tal como para a enzima proteolítica subti-lisina e enzimas relacionadas e é um requisito obrigatório que o limite deexposição no local de trabalho (WEL) de 40 ng/m3 para essa classe de en-zima seja imposto [1]. De modo a se conformar a esse requisito, é necessá-rio monitorar a exposição em intervalos regulares ou em uma base contínuadurante períodos prolongados.

Sistemas para monitoramento de enzimas trazidas pelo ar con-sistem atualmente em captura da enzima do ar, extração da enzima captu-rada em solução e análise da solução resultante com relação às enzimasconstituintes. O método mais comum para captura consiste em passar o aratravés de um filtro e a análise é grandemente baseada em métodos espec-trofotométricos ou espectrofluorescentes nos quais a enzima hidrolisa molé-culas de substrato rotulado em solução [2] ou em um formato de imunoen-saio, tal como ELISA [3]. A combinação de captura sobre filtros seguido porextração complexa e análise não pode ser desenvolvida para produzir ummétodo sensível, sem reagente e contínuo para monitoramento quase queem tempo real de enzimas trazidas pelo ar e os resultados obtidos represen-tam valores médios com o tempo, uma vez que liberação intermitente deenzimas não pode ser monitorada.

Foi descrito um método que combina captura do ar via impactosobre a superfície de um ciclone e análise imediata da enzima capturada dasuperfície lavada do ciclone. A última é obtida usando um substrato fluores-cente-rotulado específico para a enzima em questão que é imobilizado sobreum suporte em fase sólida contido dentro de um leito fixo ou biorreator. Pas-sagem da enzima através do biorreator resulta em digestão parcial do subs-trato e detecção dos fragmentos fluorescentemente rotulados a jusante [4].Esse sistema permite monitoramento contínuo e quase que em tempo realde uma única enzima, a qual pode estar presente na atmosfera [5].

Até o momento, nenhum sistema foi descrito que pode monitorarsimultaneamente misturas as quais compreendem pelo menos duas enzimastrazidas pelo ar em uma base contínua e quase que em tempo real. É umobjetivo de modalidades da invenção proporcionar um método para monito-ramento de misturas enzimáticas para uso em uma base contínua ou paramonitoramento em intervalos freqüentes.

Sumário da Invenção

É um objetivo da presente invenção proporcionar um métodoaperfeiçoado de monitoramento de enzimas o qual é adequado para uso emuma base contínua ou para monitoramento em intervalos curtos freqüentes.Em particular, os métodos e aparelhos descritos aqui podem monitorar apresença de uma pluralidade de enzimas em uma amostra rapidamente esem a necessidade de etapas de análise externas. Os métodos e aparelhosdescritos têm aplicações em vários campos, por exemplo, o monitoramentode enzimas trazidas no ar em locais nos quais a presença de tais enzimaspoderia ter um efeito prejudicial sobre a saúde do pessoal que trabalha nes-sa área.

O método aqui descrito permite o monitoramento qualitativo ouquantitativo de uma amostra com relação à presença de pelo menos duasenzimas a serem analisadas.

De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado ummétodo para a detecção simultânea de pelo menos duas enzimas em umaamostra, o referido método compreendendo as etapas de:

(a) exposição de (i) um primeiro substrato para uma primeira en-zima, o primeiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo e (ii)um segundo substrato para uma segunda enzima, o segundo substrato sen-do rotulado com um segundo fluoróforo na amostra para permitir que as pri-meira e segunda enzimas presentes na amostra, se presentes, interajamcom os respectivos primeiro e segundo substratos fluoróforo-rotulados paraformar respectivos primeiro e segundo fragmentos de substrato fluoróforo-rotulados; e

(b) detecção da presença dos fragmentos de substrato fluorófo-ro-rotulados.

Em uma modalidade, o método da presente invenção é um mé-todo para detecção da presença e/ou níveis de concentração de enzimastrazidas pelo ar em um ambiente no qual as enzimas são produzidas e/ouusadas, por exemplo, um laboratório ou andar de uma fábrica.

Em um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado umrecipiente para uso na detecção simultânea da presença de pelo menos du-as enzimas em uma amostra, o recipiente compreendendo um primeirosubstrato para uma primeira enzima, o primeiro substrato sendo rotuladocom um primeiro fluoróforo e um segundo substrato para uma segunda en-zima, o segundo substrato sendo rotulado com um segundo fluoróforo.

Em um outro aspecto da invenção, é proporcionado um aparelhopara uso na detecção simultânea de pelo menos duas enzimas em uma a-mostra, o referido aparelho compreendendo um recipiente compreendendoum primeiro substrato para uma primeira enzima, o referido substrato sendorotulado com um primeiro fluoróforo e um segundo substrato para uma se-gunda enzima, o referido segundo substrato sendo rotulado com um segun-do fluoróforo, o referido aparelho ainda compreendendo meios de detecçãopara detecção de fragmentos de substrato fluorescentes.

Também incluído na presente invenção é o uso de um aparelhodescrito aqui para a detecção de pelo menos duas enzimas em uma amos-tra. O uso pode ser para a detecção da presença de enzimas trazidas peloar. O uso também pode quantificar os níveis de pelo menos duas enzimaspresentes dentro de uma amostra de ar.Descrição Detalhada da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um métodopara a detecção simultânea de pelo menos duas enzimas em uma amostra,o referido método compreendendo as etapas de:

(a) exposição de (i) um primeiro substrato para uma primeira en-zima, o primeiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo e (ii)um segundo substrato para uma segunda enzima, o segundo substrato sen-do rotulado com um segundo fluoróforo na amostra para permitir que as pri-meira e segunda enzimas presentes na amostra, se presentes, interajamcom os respectivos primeiro e segundo substratos fluoróforo-rotulados paraformar respectivos primeiro e segundo fragmentos de substrato fluoróforo-rotulados; e

(b) detecção da presença dos fragmentos de substrato fluorófo-ro-rotulados.

O presente método é para a detecção simultânea da presençade uma pluralidade de enzimas em uma amostra. Conforme usado aqui, otermo "simultânea" se refere à detecção da presença de pelo menos duasenzimas ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo, por e-xemplo, a detecção de pelo menos duas enzimas ocorre dentro de uma úni-ca operação do método. O método pode se referir à detecção de uma plura-lidade de enzimas dentro da mesma amostra, o que não requer qualquerentrada adicional de um usuário entre a detecção da primeira enzima e adetecção da segunda enzima.

Será evidente que embora o método seja para a detecção depelo menos duas enzimas em uma amostra, em determinadas modalidadesou determinadas ocasiões, a amostra pode conter apenas uma ou nenhumaenzima. Contudo, o método será adequado para detecção de pelo menosduas enzimas se elas estão presentes na amostra.

O método descrito aqui refere-se, principalmente, ao monitora-mento de duas enzimas. Será evidente para aqueles versados que o métododa presente invenção também pode ser usado para detectar a presença e/ouquantificar os níveis de mais de duas enzimas, por exemplo, 3, 4, 5, 6 oumais. Se o método é usado para detectar mais de duas enzimas em umaamostra, um número correspondente de substratos rotulados é proporciona-do. Por exemplo, se o método é usado para detectar três tipos de enzima emuma amostra, três substratos rotulados são proporcionados, cada substratocorrespondendo a uma enzima, isto é, para cada enzima a ser detectada, éproporcionado um substrato rotulado o qual interage com a mesma detecta-velmente.

Em uma modalidade, o método é para a detecção da presençade pelo menos duas enzimas trazidas pelo ar.

Nessa modalidade, o método pode compreender primeira mistu-ra de uma primeira amostra de ar com um líquido para formar uma solução aqual forma a amostra que contata os substratos. Nessa modalidade, o méto-do pode compreender aspiração da primeira amostra de ar em um aparelhoo qual coleta partículas, por exemplo, partículas de enzima, as quais sãotrazidas pelo ar. O método pode ainda compreender suprimento do aparelhocom um líquido o qual se mistura com as partículas coletadas para produzira solução. Em uma modalidade, o aparelho é um cone afunilado. Em umamodalidade, o método pode compreender monitoramento da taxa de fluxo dear no aparelho e, se requerido, ajuste do fluxo de ar para assegurar que eleimita, em geral, a taxa de captação de ar quando uma pessoa inalada. Issopermite que uma comparação seja feita entre os dados obtidos abrangendoo método e a provável quantidade de enzimas trazidas pelo ar captadas porum indivíduo durante respiração normal.

Em uma modalidade, o líquido é adicionado a partir de um re-servatório ao aparelho em uma base contínua. Nessa modalidade, o nível delíquido no reservatório é mantido constante através de enchimento contínuodo mesmo. Em uma modalidade alternativa, o nível de líquido no reservató-rio não é mantido constantemente. Antes, o método compreende esvazia-mento do reservatório e reenchimento do mesmo em uma base regular, porexemplo, após cada vez que uma primeira amostra de ar é captada ou, porexemplo, após um determinado número de amostras de ar ter sido captado,por exemplo, duas, três, quatro ou cinco ou mais amostras de ar. O reserva-tório pode ser esvaziado e reenchido após um ciclo do método ter ocorrido.Em uma modalidade, quando está sendo usado, o reservatório pode ser es-vaziado e reenchido cerca de a cada 10 a 20 minutos, por exemplo, cerca dea cada 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais minutos.

Em uma modalidade, o método pode compreender transporte daamostra do aparelho descrito acima para uma área de reação na qual a a-mostra é mantida em contato com os substratos fluoróforo-rotulados. A áreade reação pode compreender um recipiente de reação ou uma pluralidadede recipientes. O método compreende manter a amostra em contato com ossubstratos durante um tempo suficiente para permitir uma reação entre asenzimas e seus substratos correspondentes para formar um produto de rea-ção, por exemplo, um fragmento de substrato rotulado. A produto de reaçãopode, então, ser detectado. Em uma modalidade, a etapa de detecção com-preende o uso de um meio de detecção o qual detecta o nível de sinal emiti-do pelo fluoróforo preso ao fragmento de substrato. Em uma modalidade, omeio de detecção é um espectrofotômetro o qual pode, então, ser usadopara determinar a presença e/ou quantidades de enzima(s) presente(s) naamostra. Em uma modalidade, o meio de detecção inclui fibras ópticas pre-sas a cada célula de fluxo e as quais são ligadas à fontes de luz pré-sintonizadas (excitação) e múltiplos tubos multiplicadores de fótons (siste-mas de detecção - pmt).

Em algumas modalidades, a amostra é contatada com os primei-ro e segundo substratos durante um tempo de reação de pelo menos cercade 1 seg, 5 seg, 10 seg, 15 seg, 20 seg, 25 seg, 30 seg, 35 seg, 40 seg, 45seg, 50 seg, 55 seg, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9min, 10 min, 11 min, 12 min, 13 min, 14 min, 15 min, 16 min, 17 min, 18 min,19 min, 20 min, 21 min, 22 min, 23 min, 24 min, 25 min, 26 min, 27 min, 28min, 29 min, 30 min, 31 min, 32 min, 33 min, 34 min, 35 min, 36 min, 37 min,38 min, 39 min, 40 min, 41 min, 42 min, 43 min, 44 min, 45 min, 46 min, 47min, 48 min, 49 min, 50 min, 51 min, 52 min, 53 min, 54 min, 55 min, 56 min,57 min, 58 min, 59 min ou 60 min. De preferência, a amostra é contatadacom os substratos rotulados durante um tempo de reação de pelo menoscerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 10minutos ou pelo menos cerca de 15 minutos.

Tipicamente, os substratos usados no presente método são se-lecionados dentre aqueles com os quais a enzima a ser monitorada rea-ge/digere. Conforme usado aqui, o termo "substrato" se refere a uma subs-tância a qual interage com uma enzima de uma forma a causar uma altera-ção na substância. Por exemplo, a enzima pode reagir com o substrato e/oupode digerir o substrato em fragmentos. Os substratos usados na presenteinvenção são rotulados de uma forma tal a permitir a detecção da interaçãoentre a enzima e o substrato. Em particular, o rótulo é um fluoróforo.

Em uma modalidade preferida da invenção, o substrato é umaproteína ou polipeptídeo. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína"são usados permutavelmente aqui para se referir a polímeros de aminoáci-dos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, po-de compreender aminoácidos ou análogos de aminoácido e pode ser inter-rompido por não-aminoácidos. Os termos também abrangem um polímerode aminoácido que tenha sido modificado naturalmente ou através de inter-venção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, Iipida-ção, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação,tal como conjugação com um componente de rotulação.

Substituições de aminoácido podem oscilar de alteração ou mo-dificação de um ou mais aminoácidos para remodelar completamente umaregião, tal como a região variável. Substituições de aminoácido são, de pre-ferência, substituições conservativas que não afetam prejudicialmente a du-plicação ou propriedades funcionais do peptídeo. Grupos de aminoácidosfuncionalmente relacionados dentro dos quais substituições conservativaspodem ser feitas são glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagi-na/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina/metionina;lisina/arginina; e fenilalanina/tirosina/triptofano. Polipeptídeos usados na pre-sente invenção podem estar na forma glicosilada ou não glicosilada, podemser modificados pós-traducionalmente (por exemplo, acetilação e fosforila-ção) ou podem ser modificados sinteticamente (por exemplo, a fixação deum grupo de rotulação).

Em uma modalidade, o primeiro substrato é selecionado do gru-po consistindo em gelatina, tiroglobulina de porco, colágeno, uma imunoglo-bulina e albumina de soro bovino. Em uma modalidade, o segundo substratoé selecionado do grupo consistindo em gelatina, tiroglobulina de porco, colá-geno, uma imunoglobulina e albumina de soro bovino. Em uma modalidade,o primeiro substrato é gelatina. Os primeiro e segundo substratos podem seros mesmos ou podem ser diferentes um do outro.

Os fluoróforos usados nos métodos da invenção para rotular ossubstratos são selecionados para serem detectáveis através de métodosfluorométricos normais. Além disso, os fluoróforos são particularmente esco-lhidos de modo que cada propriedade espectral dos fluoróforos não interfi-ram com os sinais fluorescentes dos outros fluoróforos co-liberados via areação de outras enzimas presentes na mistura com seus substratos especí-ficos. De preferência, os fluoróforos selecionados não são influenciados porvariações em condições ambientais, tal como o nível de pH. Em uma moda-lidade, os primeiro e segundo fluoróforos são independentemente seleciona-dos do grupo consistindo em fluoresceína e seus derivados, rodamina, Te-xas Red®, violeta cresol e amarelo lúcifer. De preferência, os fluoróforosusados para rotular o primeiro substrato são diferentes do fluoróforo usadopara rotular o segundo substrato.

Os substratos rotulados são, em muitos casos, vantajosamente,trazidos sobre um suporte adequado, por exemplo, embora não limitado a,glóbulos de vidro, celulose fibrosa ou partículas de sol-gel. Suportes, porexemplo, suportes em fase sólida, são bem conhecidos na técnica e podemser biológicos, não biológicos, orgânicos, inorgânicos ou uma combinaçãode qualquer um desses, contanto que eles não interfiram com a reação entreos substratos rotulados e quaisquer enzimas presentes na amostra. Exem-plos de suporte sólido os quais podem ser usados na presente invenção in-cluem, mas não estão limitados a, partículas, glóbulos, fitas, precipitados,géis, folhas, tubulação, esferas, recipientes, capilares, almofadas, lâminas,filmes, placas, pedaços. O tamanho de partícula pode oscilar de 100 nm a100 μιτι de diâmetro.

Os substratos rotulados podem ser presos ao suporte através devários meios conhecidos na técnica. Por exemplo, o substrato pode ser co-valentemente preso à superfície do suporte. Em uma modalidade, o substra-to pode ser ligado via absorção direta à superfície do suporte.

Em ainda uma outra modalidade preferida da invenção, o supor-te compreende glóbulos que são magnetizáveis. Em uma modalidade, o su-porte compreende uma pluralidade de partículas sobre as quais o(s) substra-to(s) é(são) preso(s). Outros tipos de suporte sólido são conhecidos na téc-nica e abrangidos pela presente invenção.

Em algumas modalidades, o substrato pode não estar sobre umsuporte. Por exemplo, no caso de celulose, em vista de sua insolubilidadeem água, o substrato pode ser usado como partículas sólidas sem tal supor-te.

O método é usado para monitorar a presença de pelo menosduas enzimas em uma amostra. Exemplos de tipos de enzima os quais po-dem ser detectados através de aplicação dos métodos da presente divulga-ção incluem, mas não estão limitados a, membros das famílias da protease,celulase, lipase, amilase ou colagenase. Em uma modalidade, celulases po-dem ser monitoradas usando colágeno rotulado como um dos substrato.

Em uma modalidade, uma das pelo menos duas enzimas é umaprotease. Em uma modalidade, a protease pode ser selecionada do grupoconsistindo em enzima do tipo subtilisin, tripsina, papaína, esperase e alca-lase.

Em uma modalidade da invenção, o primeiro substrato é gelati-na. Nessa modalidade, a primeira enzima a qual tem de ser detectada e/ouquantificada é uma enzima do tipo subtilisin. Em uma modalidade, o segun-do substrato é selecionado de amido, amilose e amilopectina. Nessa modali-dade, a segunda enzima é α-amilase. Várias combinações de enzimas po-dem ser detectadas através dos métodos da presente divulgação.

Se a amostra contém enzima(s) a(s) qual(is) interage(m) compelo menos um dos substratos, uma vez que a amostra é exposta aos subs-tratos, uma reação entre a(s) enzima(s) presente(s) e o substrato correspon-dente ocorre. Em uma modalidade, reação entre a enzima e o substrato re-sulta em formação de fragmentos do substrato. Os fragmentos de substratorotulados liberados de cada recipiente após exposição da amostra contendoas enzimas são monitorados a jusante usando espectrofluorímetro(s) sinto-nizado(s) em um fluoróforo em particular ou uma pluralidade de fluoróforo. Ométodo pode ainda compreender a etapa de sintonização do espectrofluo-rômetro para detectar os primeiro e segundo fluoróforos.

Conforme descrito acima, em uma aplicação desse método, aamostra é derivada de uma primeira amostra de ar. Uma aplicação do pre-sente método é na área de trabalho, onde há limites regulatórios quanto àexposição dos empregados a enzimas trazidas pelo ar. Em particular, o mé-todo pode ser realizado em áreas nas quais enzimas estão sendo usadaspara produzir, por exemplo, pós de lavagem e gêneros alimentícios.

O método pode ser colocado em prática de várias formas. Emuma modalidade, o método é realizado sob uma base contínua transportan-do a amostra continuamente a um coletor contendo uma solução. A amostra,então, contata os substratos rotulados em uma área de reação a qual con-tém, por exemplo, um recipiente ou uma pluralidade de recipientes.

Conforme descrito acima, em uma modalidade na qual a amos-tra é derivada de uma primeira amostra de ar, o ar é colocado em solução.Em uma modalidade, a solução é um tampão o qual é escolhido levando-seem conta um determinado pH para passagem através do sistema. Assim, emuma modalidade, a solução é um tampão aquoso. Em uma modalidade, otampão aquoso é, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.

Em uma modalidade, a reprodutibilidade dos sinais de flúores-cência é ainda intensificada através da inclusão de uma pequena quantidadede um detergente na solução. Em uma modalidade, o método compreendefornecimento de um detergente à solução. O detergente pode ser, por e-xemplo, Tween 20. O detergente pode ser utilizado para reduzir a ligaçãonão-específica entre fragmentos liberados e superfícies dentro do sistema deanálise de injeção de fluxo.

Em uma modalidade do método da invenção, os substratos sãofornecidos dentro de um recipiente de reação, de modo que a(s) enzima(s)contida(s) dentro da amostra contata(m) simultaneamente o primeiro subs-trato e o segundo substrato. Por exemplo, em uma modalidade na qual ossubstratos são suportados sobre glóbulos, o recipiente de reação contémuma mistura heterogênea de glóbulos, alguns dos quais suportam um pri-meiro substrato rotulado e alguns dos quais suportam um segundo substratorotulado. Em uma modalidade, o(s) recipiente(s) de reação(ões) é(são) umacoluna. Em uma modalidade, o(s) recipiente(s) de reação(s) pode(m) serpequeno(s), isto é, dimensionado(s) para ser(em) facilmente transportado(s)ou instalado(s) no local a ser monitorado.

Em uma modalidade alternativa do método da invenção, as en-zimas derivadas da amostra contatam seqüencialmente o primeiro substratoe o segundo substrato. Por exemplo, o recipiente de reação contém cama-das homogêneas estratificadas dos diferentes substratos.

Assim, o recipiente de reação pode compreender camadas desuporte, cada camada contendo essencialmente um tipo de substrato. Comoum resultado, a amostra contendo a mistura de enzimas entra em contatocom uma camada, por exemplo, de primeiro substrato suportado seguido poruma camada de um segundo substrato suportado.

Alternativamente, o método compreende fornecimento de umapluralidade de recipientes de reação em série, cada recipiente de reaçãocontendo um único tipo de substrato rotulado. Como um resultado, a amos-tra contata um primeiro substrato e, então, contata um segundo substrato.

Assim, em uma modalidade, a invenção utiliza pelo menos doisrecipientes de reação os quais são posicionados em série, cada um conten-do diferentes substratos. Os recipientes podem ser ligados com um condutopara permitir que a amostra seja transportada entre os recipientes. Nessamodalidade da invenção, o primeiro recipiente pode conter o primeiro subs-trato e o segundo recipiente pode conter o segundo substrato. Outros recipi-entes de reação contendo outros substratos para outras enzimas podem serproporcionados.

Em uma modalidade, a invenção pode compreender fornecimen-to de uma mistura de diferentes tipos de recipiente contatando a amostraseqüencialmente com o primeiro substrato e o segundo substrato via umapluralidade de recipientes de reação.

Em modalidades nas quais é esperado que a amostra que estásendo analisada contenha uma protease, um dos primeiro ou segundo subs-tratos é um substrato para a protease. Nessa modalidade, é preferível asse-gurar que a amostra contata os substratos seqüencialmente. Ainda mais pre-ferivelmente, o substrato para a protease está posicionado adjacente aomeio de detecção. Descobriu-se que fragmentos do substrato de proteasedigerido podem aderir ao suporte, por exemplo, ao suporte em fase sólida, oqual traz o(s) outro(s) substrato(s). Assim, por exemplo, quando o método épara detecção de uma mistura de enzimas incluindo α-amilase e uma enzi-ma do tipo subtilisin, o substrato para a enzima do tipo subtilisin é, de prefe-rência, posicionado adjacente ao meio de detecção, isto é, a jusante comrelação ao(s) outro(s) substrato(s). Assim, o recipiente de reação contendoum substrato para uma enzima protease está posicionado a jusante do(s)recipiente(s) de reação contendo substratos para outros tipos de enzimas.

A detecção do fragmento de substrato fluorescentemente rotula-do pode ser realizada no local (por exemplo, em uma fábrica), se o equipa-mento apropriado, por exemplo, um espectrofotômetro, está disponível. Al-ternativamente, o recipiente de reação pode ser levado a um laboratório,onde a análise é realizada.

O método pode ainda compreender calibração dos resultadosatravés de comparação da quantidade das pelo menos duas enzimas pre-sentes na amostra com um padrão.De acordo com um outro aspecto da invenção, é proporcionadoum recipiente para uso na detecção simultânea de pelo menos duas enzi-mas em uma amostra, o referido recipiente compreendendo um primeirosubstrato para uma primeira enzima, o referido primeiro substrato sendo ro-tulado com um primeiro fluoróforo e um segundo substrato para uma segun-da enzima, o referido segundo substrato sendo rotulado com um segundofluoróforo.

Em uma modalidade da invenção, os substratos rotulados sãotrazidos sobre um suporte adequado, conforme descrito acima. Em uma mo-dalidade, o suporte é ou compreendido, por exemplo, de glóbulos de vidro,celulose, por exemplo, celulose fibrosa, sílica, por exemplo, partículas desílica ou partículas de sol-gel. Se o suporte compreende matéria em partícu-la, o tamanho de partícula pode oscilar de cerca de 100 nm a cerca de 100μm de diâmetro.

Em uma modalidade da invenção, quando o suporte é, por e-xemplo, glóbulos de vidro ou partículas de sílica, o recipiente de reação con-tém uma mistura heterogênea de glóbulos ou partículas. Isto é, uma porçãodos glóbulos ou partículas suporta o primeiro substrato, enquanto que umaporção dos glóbulos ou partículas suporta o segundo substrato e não há or-dem discernível da disposição dos glóbulos. Em uma modalidade alternativada invenção, o recipiente de reação contém camadas homogêneas estratifi-cadas dos substratos.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é proporcionadoum aparelho para uso na detecção simultânea de pelo menos duas enzimasem uma amostra, o referido aparelho compreendendo um recipiente com-preendendo um primeiro substrato para uma primeira enzima, o referidosubstrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo e um segundo substratopara uma segunda enzima, o referido substrato sendo rotulado com um se-gundo fluoróforo, o referido aparelho ainda compreendendo meios de detec-ção para detecção de produtos de reação fluorescentes. Em uma modalida-de, os primeiro e segundo fluoróforos são fluoróforos diferentes. Os fluorófo-ros podem ser conforme descrito aqui.Em uma modalidade, os primeiro e segundo substratos podemformar camadas estratificadas dentro do recipiente. Em uma modalidade, umdos primeiro ou segundo substratos é um substrato para uma protease.Nessa modalidade, o recipiente compreende uma camada de substrato deprotease em uma posição a qual está mais próxima de um meio de detecçãodo que os outros substratos. Assim, em uma modalidade, o substrato parauma enzima protease está localizado adjacente ao referido meio de detec-ção, isto é, a jusante dos outros substratos.

De preferência, o meio de detecção é um espectrofotômetro.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é proporciona-do um aparelho para a detecção simultânea de pelo menos duas enzimasem uma amostra, o referido aparelho compreendendo, em uso, um primeirorecipiente compreendendo um primeiro substrato para uma primeira enzima,o referido primeiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo, oreferido primeiro aparelho sendo conectável a um segundo recipiente, emque o segundo recipiente compreende um segundo substrato para uma se-gunda enzima, o referido segundo substrato sendo rotulado com um segun-do fluoróforo, o referido aparelho ainda compreendendo meios de detecçãopara detecção de produtos de reação fluorescentes. Os produtos de reaçãosão produzidos a partir de interação entre uma enzima e seu substrato rotu-lado com fluoróforo.

Em uma modalidade preferida do aparelho, o substrato no se-gundo recipiente é uma protease e o segundo recipiente está localizado ad-jacente ao meio de detecção.

Em uma modalidade, o aparelho compreende mais de dois reci-pientes de reação, por exemplo, três, quatro, cinco ou mais recipientes dereação. Cada recipiente de reação pode compreender um substrato rotuladocom fluoróforo para uma enzima.

De preferência, o meio de detecção é um espectrofotômetro.

Por toda a descrição e reivindicações do presente relatório des-critivo, as palavras "compreende" e "contém" e variações das palavras, porexemplo, "compreendendo" e "compreendem", significam "incluindo mas nãolimitado a" e não se destinam (e não) excluem outras porções, aditivos,componentes, inteiros ou etapas.

Por toda a descrição e reivindicações do presente relatório des-critivo, o singular abrange o plural, a menos que o contexto venha a requererde outro modo. Em particular, onde o artigo indefinido é usado, o resultadodescritivo deve ser compreendida como considerando uma pluralidade, bemcomo uma singularidade, a menos que o contexto venha a requerer de outromodo.

Aspectos, inteiros, características, compostos, porções químicasou grupos descritos em conjunto com um aspecto, modalidade ou exemploem particular da invenção devem ser entendidos como sendo aplicáveis aqualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo descrito aqui, a menos queincompatível com o mesmo.

Breve Descrição dos Desenhos

A invenção será agora descrita à guisa de exemplo apenas ecom referência aos desenhos em anexo, nos quais:

Figura 1a: plotagem de calibração para a enzima protease (Sa-vinase™) do tipo subtilisin apenas.

Figura 1b: plotagem de calibração para a enzima oc-amilase(Termamyl™) apenas.

Figura 1c: plotagem de calibração para α-amilase em uma mis-tura de equi-concentração da protease do tipo subtilisin e a-amilase.

Figura 2: Representação esquemática de um sistema de moni-toramento das modalidades da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1

Um sistema é descrito o qual é capaz de monitorar concentra-ções trazidas pelo ar de uma variedade de enzimas trazidas pelo ar incluin-do, por exemplo, enzimas do tipo subtilisin, na atmosfera do local de trabalhoem uma base contínua. A amostragem compreende dois estágios: usandouma cabeça de amostragem que é projetada para imitar a respiração huma-na a aproximadamente 1 m s"1 em uma taxa de amostragem de 600 I min"1.No segundo estágio, as partículas capturadas são depositadas através deimpacto da corrente de ar sobre a superfície interna de um ciclone que écontinuamente lavado com um jato de solução tampão. Partículas deposita-das são, então, lavadas em um reservatório do qual amostras são tomadas acada 5-6 min e injetadas automaticamente em um sistema de análise porinjeção de fluxo contínuo. Enzima proteolítica na amostra passa através deum biorreator mantido em torno de 40 °C. Em uma modalidade, esse contémuma matriz em fase sólida de celulose sobre a qual está covalentementeimobilizada gelatina rotulada com Texas Red como substrato. O biorreatortambém pode conter um segundo substrato para uma enzima adicional. Al-ternativamente, um biorreator separado contendo um segundo substrato éconectado ao primeiro biorreator (não mostrado).

Em outras modalidades da invenção, o substrato pode ser imobi-lizado sobre partículas de sílica. A(s) enzima(s) que passa(m) digere(m) par-cialmente o(s) substrato(s), liberando fluoróforo(s) que é(são) detectado(s) ajusante em uma célula de fluxo acoplada a um fluorímetro. O sistema é cali-brado usando padrões de enzima e a intensidade dos picos resultantes apartir das amostras ex-ar é convertida para concentrações trazidas pelo arusando um modelo matemático programado em um PC. O sistema tem umlimite de detecção de 4,8 ng m"3 e uma faixa dinâmica de 5-60 ng m"3. A pre-cisão dentro do ensaio (RSD) é de 6,3-9,6% sobre essa faixa. A precisãodentro do lote é de 20,3% a 20 ng m"3 e o valor entre lote correspondente éde 19,5%. O sistema foi operado durante períodos até 8 h e durante até 4 he os valores obtidos comparados com os valores médios com o tempo obti-dos a partir de um amostrador Galley e análise no-laboratório quando con-cordância razoável dos resultados foi observada. A estabilidade do sistemadurante 21 dias de uso contínuo com padrões injetados periodicamente foiestudada. Linearidade foi observada para todas as plotagens de padrão. Aofinal de 21 dias, após uma exposição total equivalente a 2395 ng ml"1 de Sa-vinase, o sinal em virtude do padrão de 5,0 ng ml"1 ainda era facilmente de-tectável.

Aparelho ExperimentalO sistema é mostrado na Fig. 2. Ele inclui uma cabeça de amos-tragem compreendendo um par de placas de metal circulares (A) preso viauma tubulação de plástico a um ciclone de vidro (B). Ar é aspirado atravésde A e B usando um limpador a vácuo comercial (C). A taxa de fluxo de ar foimonitorada usando uma placa com orifício e ajustada conforme necessário.

Uma agulha (D) foi presa a B e solução tampão foi bombeada através deseu orifício usando uma bomba peristáltica ajustável (E). À medida que o arfluía através do ciclone, esse jato de água cobria a superfície interna do ci-clone e fluía para um reservatório (F) do qual ela era reciclada via E de voltapara o ciclone. O ciclone é descrito em maiores detalhes abaixo.

Após amostragem de ar, volumes conhecidos de tampão sãotomados periodicamente de F em um sistema por injeção de fluxo automáti-co (G) preso a um biorreator ou uma pluralidade de biorreatores dentro deum aquecedor de coluna termostaticamente controlado (Η). A jusante estálocalizada uma célula de fluxo óptica (I) equipada com duas fibras ópticaspresas a uma fonte de luz (J) e um espectrofotômetro (K). Solução salinatamponada com fosfato é passada através de do sistema FIA usando umabomba peristáltica (L) e o sinal de K registrado usando um Iap top PC (M).

Esse PC também controlou o sistema por injeção de fluxo automático. Emambos os casos, os programas usados foram aqueles fornecidos pelo fabri-cante desses dois sistemas (FIAIab, Medina, WA1 EUA).

Em um método alternativo, o reservatório não é enchido conti-nuamente para manter os níveis do reservatório constantes. Antes, amostrassão tomadas durante cerca de 12 minutos conforme descrito acima. A amos-tra é, então, analisada e o reservatório é completamente esvaziado ou reen-chido. Um novo ciclo de obtenção de amostras e análise é, então, iniciado.

Esse método tem a vantagem de não requerer um sistema complexo de cál-culo do efeito que o reenchimento do reservatório tem sobre a concentraçãode enzima. Como um resultado, esse método pode ser mais simples de realizar.

O sistema por injeção de fluxo automático (G) era um modelo3500 da FIAIab Instruments. O aquecedor de coluna (H) era um aquecedorEppendorf CH500 (Phenomenex, Macclesfield, Cheshire, Reino Unido), oqual foi ajustado para operar em uma temperatura do tampão de saída de 400C em uma taxa de fluxo de 0,7 ml min"1. A célula de fluxo (I) era um modeloX da FIAIab que também forneceu as duas fibras ópticas revestidas de açoinoxidável (P400-2), a fonte de luz de halogênio de tungstênio LS-1 e o es-pectrômetro S2000 (J). A bomba peristáltica (K) era um modelo P-1 daPharmacia (Milton Keynes, Buckinghamshire, Reino Unido).Design do ciclone

Um ciclone com dimensões de 40 mm de diâmetro, saída de 20mm, entrada retangular de 10 mm e um corpo principal de 80 mm de com-primento e cone de 80 mm de comprimento foi construído, o qual tinha trêsorifícios pré-perfurados no tubo de entrada de ar para permitir até três posi-ções da agulha para a introdução do fluido de reciclagem. Esses orifíciosforam posicionados no centro do tubo de entrada e 6 mm ao lado. Uma agu-lha hipodérmica de aço inoxidável foi curvada em um ângulo reto (10 mm apartir da ponta) para permitir que o fluido de reciclagem fosse bombeadopara o ciclone.

O ciclone foi testado para medir seu grau de eficiência carregan-do pó fino através da entrada do ciclone e medindo a diferença no tamanhode partícula e concentração do pó inserido no ciclone e aquela do pó que saido ciclone usando um dimensionador de partícula aerodinâmico (APS).Reagentes e materiais usados no sistema de análise por injeção de fluxo

A composição dos tampões, fontes de enzimas e produtos quí-micos e outros materiais usados no sistema de injeção de fluxo e na produ-ção no biorreator são aqueles previamente descritos5"8. Gelatina do tipo B(cerca de 75 bloom) era da Sigma (Poole, Dorset, Reino Unido). Succinimidiléster Texas Red® era da Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). As enzimasproteolíticas do tipo serina estudadas foram Purafect (Genencor InternationalInc., Rochester, EUA) e Savinase da Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca,que também forneceu as enzimas Iipase e celulase. Papaína era da PapayerLatex e fornecida pela Sigma.

Síntese de conjugado de oelatina-Texas RedUm dos substratos é um conjugado de gelatina-Texas Red. Ge-latina (0,105 g) foi dissolvida em tampão de bicarbonato de sódio (10 ml de0,1 M em um pH de 8,3) com ligeiro aquecimento (40 0C). Succinimidil ésterTexas Red® (5 mg) foi dissolvido em 500 ml de sulfóxido de dimetila. Essamistura foi, então, adicionada à solução de gelatina dissolvida. O recipientefoi coberto com uma folha de estanho e misturado em um misturador girató-rio durante 1 h em temperatura ambiente. Quando armazenada a 4 °C, essasolução de gelatina rotulada é estável durante aproximadamente 3-4 semanas.

Síntese de fase sólida de celulose-qelatina-Texas Red

Fibra de celulose média (5 g) foi enxaguada com água desioni-zada e centrifugada (2000 rpm durante 6 min) antes de remoção da soluçãode sobrenadante. Isso foi repetido três vezes, após o que a celulose foi fil-trada sob vácuo usando um funil de vidro sinterizado tamanho 2 (BDH Poole,Dorset). Solução de m-periodato de sódio (80 ml de 0,5M) foi adicionada àcelulose úmida e a mistura girada durante 210 min em temperatura ambien-te. A celulase ativada foi, então, filtrada e lavada com 2 L de água desioni-zada conforme acima. A celulose ativada foi armazenada a 4 0C em águadesionizada contendo 0,02% de azida de sódio e era estável durante 3-4semanas.

Celulose ativada (2,5 g após filtração) foi suspensa em tampãode fosfato de sódio dibásico anídrico a 0,1 M (65 ml). A essa foi adicionada oconjugado de gelatina-Texas Red (10 ml). O recipiente foi revestido comuma folha de alumínio e girado durante 45 min em temperatura ambienteantes da adição de ciano-borohidreto de sódio (250 mg). O tubo foi recolo-cado sobre o aparelho giratório e deixado misturar durante a noite em tem-peratura ambiente. Após acoplamento, a fase sólida de celulose-gelatina-Texas Red foi filtrada sob vácuo conforme acima e lavada com 2 L de águadesionizada. A fase sólida de celulose-gelatina-Texas Red resultante tam-bém era estável durante 3-4 semanas quando armazenada sob refrigeraçãoem água desionizada contendo 0,02% de azida de sódio.

Desenvolvimento do sistema de análise por injeção de fluxoCondições de FIA. O tampão de FIA e aquele para os padrõesde enzima eram solução salina tamponada com fosfato (PBST). Esse conti-nha cloreto de sódio (7,2 g), fosfato de sódio dibásico anídrico (1,48 g), mo-nohidrato de dihidrogen ortofosfato de sódio (0,5 g), azida de sódio (0,5 g) emonolaurato de polioxietileno-sorbitan (1,0 ml) (Tween 20, ICI Américas,Inc.) por litro. A taxa de fluxo de FIA foi mantida a 0,7 ml min"1 usando pe-quenos ajustes da bomba peristáltica. O programa de amostragem foi compi-lado usando o FIALab for Windows versão 5. O volume de amostragem usa-do foi de 100 ml, volume total de injeção de 180 ml em uma taxa de 12 min"1.Um filtro de 590 nm foi inserido no trajeto da fonte de luz (J) e o espectrofo-tômetro (K) foi ajustado a 612 nm.

Resultados

Design do sistema de amostragem de ar

Testagem do design do ciclone e seu desempenho. O ciclone foi tes-tado através de uma faixa de fluxos de ar (nove diferentes fluxos de ar de175 a 732 I min"1) e foi mostrado que, a 608 I min"1, havia uma d50 de apro-ximadamente 0,77 mm, com um SD de 1,1%. Pode ser observado que o ci-clone captura eficazmente pelo menos 90% das partículas de 1,5 mm e aci-ma em um fluxo de ar de B600 I min"1. Isso estabelece que o ciclone é capazde capturar os tamanhos de partícula conforme requerido pelo projeto e deum tamanho similar aos filtros usados em amostradores Galley os quais têmum tamanho de poro de 1,2 mm.

O design do ciclone foi conectado a um sistema de entrada deamostragem de ar. Esse é projetado para imitar a respiração humana quan-do operando em uma taxa de amostragem de cerca de 600 I min"1 e em umfluxo de entrada de cerca de 1 ms-1.

Com o sistema analítico, um novo substrato foi usado para pro-duzir os sinais requeridos para uma das enzimas. Gelatina foi conjugadacom Texas Red® para produzir um rótulo fluorescente que foi, então, cova-lentemente imobilizado sobre uma matriz de suporte de celulose. Gelatina foiescolhida como um dos substratos da invenção porque ela proporciona mui-tos sítios para conjugação fluorescente e hidrólise potencial da enzima.Quando de exposição a enzimas protease do tipo subtilisin, clivagem proteo-Iftica da gelatina imobilizada ocorreu, resultando em sinais fluorescentes queforam registrados pelo espectrofotômetro. Outros substratos também sãoutilizados no presente método.

O aparelho descrito acima constitui um sistema quase que emtempo real para determinação da concentração trazida pelo ar, por exemplo,de enzimas na indústria. O tampão escolhido é adequado para manutençãoda atividade de protease da enzima e do sinal do fluoróforo. Seu uso tam-bém minimiza a lixívia de fluoróforos, assim, prolongando a vida útil do bior-reator (dados não mostrados).

O sistema tem boa precisão de ensaio e variabilidade entre edentre lote razoável. A variação se origina principalmente de empacotamen-to inconsistente das colunas durante fabricação dos biorreatores. Isso é atu-almente realizado manualmente, mas um sistema automático provavelmentelevaria a uma consistência de lote muito melhor.

O sistema é relativamente portátil e foi demonstrado obter su-cesso durante períodos prolongados. O sistema também proporciona umregistro quase contínuo de concentrações trazidas no ar de enzimas por to-do o período de amostragem. O sistema é um sistema em tempo real, comrespostas de 5 min e uma capacidade para monitoramento contínuo duranteperíodos de 8 h sob condições industriais.

Exemplo 2

Em uma modalidade alternativa, o método utiliza um suporte di-ferente para os substratos.

Partículas de sol-gel ativadas com glicidóxi propiltrimetóxi silanoforam tratadas com gelatina pré-rotulada com Texas Red® para produzir umsuporte em fase sólida revestido-substrato em fase sólida para proteases dotipo subtilisin (por exemplo, Savinase™).

Outras partículas de sol-gel com aminopropil trimetóxi silano fo-ram tratadas com amido rotulado com etileno diamina de fluoresceína paraproduzir um substrato em fase sólida para α-amilase (por exemplo, Termam-yl™).Massas iguais dos reagentes em fase sólida foram colocadasem camadas e, então, empacotadas em uma mini-coluna, de modo que acamada inferior consistia das partículas revestidas com o substrato para aenzima do tipo subtilisin e a camada superior consistia das partículas reves-tidas com o substrato para α-amilase. A mini-coluna foi alimentada, em umataxa de fluxo de 0,7 ml/min, com amostras contendo 5 a 25 ng/ml de mistu-ras de savinase e amilase ou o componente enzimático individual, em solu-ção salina tamponada com fosfato (pH de 7,4) com Tween 20 (0,1%). Asamostras foram obtidas usando o ciclone descrito acima. A mini-coluna foiligada a jusante a dois espectrofluorímetros conectados em série, o primeiroajustado na fluorescência de fluoresceína (excitação de 490 nm, emissão de535 nm) e o segundo na fluorescência do Texas Red® (excitação de 590nm, emissão de 620 nm) e as intensidades de fluorescência dos dois fluoró-foros simultânea e continuamente monitorados. Um tempo de resposta de 2minutos foi observado para cada enzima com repetições de amostra possí-veis a cada 5 minutos. Curvas padrões de concentração/sinal linear foramobtidas para as enzimas unicamente (figura 1a, protease apenas; figura 1b,amilase apenas) e para a mistura das duas enzimas sobre essa faixa deconcentração (figura 1c, resposta para amilase mostrada) quando injetadana coluna.

Exemplo 3

Preparo de substratos fluorescentes para uso em empacotamento de biorre-atores para alfa-amilase

Preparo da etileno diamina fluoresceína-rotulada (EDA-FITC)O material usado foi Isômero I de Isotiocianato de Fluoresceína

(FITC), Sigma (F-7250), N1N-Dimetiformamida (DMF), Aldrich (31.993-7), 1,4Dioxano, Aldrich (27.053-9) e Etileno diamina, Aldrich (E 2,626-6).

Tomar uma garrafa de vidro de 50 ml seca, limpa e pesar preci-samente 39 mg de FITC. Dissolver FITC através da adição de 200 μΙ de DM.Adicionar 4,8 ml de 1,4 Dioxano à solução de FITC. Adicionar 6,68 μΙ de Eti-leno diamina ao FITC. Agitar a solução de EDA-FITC durante 1 h sobre umagitador magnético em temperatura ambiente mantendo coberto com umafolha de alumínio. Um precipitado de cor laranja escuro será formado.

Após agitação de 1 h, remover a garrafa e centrifugar a 3000rpm durante 3 minutos. Descartar o sobrenadante em solvente residual eadicionar 5 ml de 1,4 dioxano, submeter a turbilhonamento e centrifugar a3000 rpm durante 3 minutos. Descartar o sobrenadante em solvente residuale transferir o precipitado para um frasco de fundo redondo usando umaquantidade mínima de 1,4 dioxano. Evaporar o solvente através de evapora-ção giratória a 50 0C durante aproximadamente 3 horas. Uma vez que o pre-cipitado está seco, pesá-lo e transferir para um frasco de vidro seco, limpo earmazenar em um secador a 4 °C, assegurando de cobri-lo com uma folha.Ativação de etileno diamina rotulada (EDA-FITC)

Os materiais requeridos são cloreto cianúrico, Aldrich (C 9.550-1), etileno diamina rotulada (EDA-FITC) (veja ref 1 acima), N1N-Dimetilformamida (DMF), Aldrich (31.993-7), Trietilamina, Fluka (90340) esolução salina tamponada com fosfato com azida, pH de 7,4 (PBS com azi-da) (veja SOP-Buffers 003).

Preparar 4,3 ml de solução de EDA-FITC a 10 mg/ml pesando43 mg de EDA-FITC conforme preparado em 1 em uma garrafa de vidro se-ca, limpa e dissolver o mesmo em 4,3 ml de DMF. Pesar 21,5 mg de cloretocianúrico e adicionada à solução de EDA-FITC. Adicionar 20 ml de soluçãode trietilamina a 1 mg/ml preparada através da adição de 27,5 μΙ de trietila-mina em 20 ml de PBS com azida à solução de EDA-FITC ativada. Subme-ter a mistura a turbilhonamento para assegurar mistura completa. Um preci-pitado se formará. Armazenar o precipitado no escuro a 4 0C.Acoplamento de etileno diamina rotulada ativada (ACT-EDA-FIFC) a substra-to de amido (amilopectina e amilose também podem ser usadas)

Os materiais requeridos são: amido solúvel, Sigma (S-9765),solução salina tamponada com fosfato com azida, pH de 7,4 (PBS com azi-da), EDA-FITC ativada (veja acima) e carbonato de sódio, Sigma (S-7795).

Preparo de solução de carbonato de sódio a 0,5 M:

Pesar 5,495 g de carbonato de sódio em um frasco volumétricode 100 ml e dissolver usando uma quantidade mínima de água desionizada.Uma vez dissolvido, compor até a marca.Acoplamento de Act-EDA-FITC ao substrato de amido

Pesar 0,5 g de amido solúvel em uma garrafa de vidro seca, lim-pa de 25 ml. Adicionar 15 ml de PBS ao amido e aquecer em um banho deágua mantendo aproximadamente 60 - 70 0C com agitação contínua até queuma suspensão transparente seja formada. Uma suspensão transparentecom consistência de geléia será formada.

À suspensão de amido, adicionar 2 ml de EDA-FITC ativada (Ref2 acima) e submeter a turbilhonamento para proporcionar uma suspensãouniforme. Colocar de volta no banho de água e continuar o aquecimento(-60-70 °C) através de agitação contínua no escuro. Após 10 minutos, adi-cionar 200 μΙ de solução de carbonato de sódio a 0,5M e continuar a agitar a70 0C durante 1 hora no escuro. Remover a suspensão do banho de águaquente após uma hora e esfriar para a temperatura ambiente colocando emuma câmara com coifa.

Uma vez esfriada, transferir a suspensão para um tubo de diálisee submeter à diálise contra água desionizada mantendo a 37 °C. Continuar adiálise até que mais nenhuma fluorescência seja observada na água desio-nizada. Isso levará aproximadamente três a quatro dias. Uma vez submetidaà diálise, transferir a suspensão para um tubo Sterilin de 30 ml e armazenarna geladeira enrolando em uma folha.

Preparo de partículas de gel de sílica, sílica ou sol-gel revestidas com ami-nopropil trietóxi-silano (APTES)

Os materiais requeridos são partículas de sol-gel, aminopropiltrietóxi-silano (APTES), Sigma (A3648) e solução salina tamponada comfosfato, pH de 7,2 (PBS com azida).

Pesar aproximadamente 10 g de partículas de sol-gel secas(125-180 μηι) em um tubo Sterilin de 50 ml. Adicionar 20 ml de PBS e sub-meter as partículas a turbilhonamento. Centrifugar a 3000 rpm durante 3 mi-nutos. Descartar o sobrenadante e adicionar 2 ml de APTES e girar durante2 horas em um aparelho giratório. Remover do aparelho giratório e centrifu-gar a 3000 rpm durante 3 minutos. Descartar o sobrenadante em solventeresidual e adicionar 20 ml de PBS e submeter a turbilhonamento durante 30seg e girar durante 5 minutos. Repetir as lavagens mais 3 vezes seguindo asetapas 5 e 6, isto é, remover do aparelho giratório e centrifugar a 3000 rpmdurante 3 minutos. Descartar o sobrenadante em solvente residual e adicio-nar 20 ml de PBS e submeter a turbilhonamento durante 30 seg e girar du-rante 5 minutos. As partículas revestidas com APTES estão prontas parauso. Para armazenamento, suspender as partículas em uma quantidade mí-nima de PBS e armazenar a 4°C.

Imobilização de amido-EDA-FITC à partículas de sol-qel e sílica similaresrevestidas com APTES

Os materiais requeridos são partículas de sol-gel revestidas comAPTES (veja acima), solução salina tamponada com fosfato, pH de 7,2 (PBScom azida) e amido-EDA-FITC (veja acima).

Pesar cerca de 5 g de peso úmido de partículas de sol-gel reves-tidas com APTES (125-180 μηι) em um tubo plástico Sterilin de 30 ml. Adi-cionar 20 ml de PBS-azida e submeter as partículas a turbilhonamento. Adi-cionar 5 ml de substrato amido-EDA-FITC e girar durante a noite. Removerdo aparelho giratório e centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos. Descartaro sobrenadante em solvente residual e adicionar 20 ml de PBS e submeter aturbilhonamento durante 30 seg e girar durante 5 minutos. Repetir as lava-gens mais 3 vezes seguindo as etapas de remoção do aparelho giratório ecentrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos e, então, descartar o sobrenadanteem solvente residual e adicionar 20 ml de PBS e submeter a turbilhonamen-to durante 30 seg e girar durante 5 minutos. O substrato de amido imobiliza-do sobre partículas de sol-gel está pronto para empacotamento.

Armazenar as partículas de amido imobilizadas em uma quanti-dade mínima de PBS-azida a 4 0C e usar dentro de 3 dias de preparo. Em-pacotar cerca de 0,8 g de partículas derivatizadas úmidas em colunas con-forme descrito para gelatina-celulose acima e condições conforme para ascolunas no biorreator de protease.

Referências

1. EH40/2005 Workplace exposure limits, Environmental Hygie-ne Guidance Note EH40, HSE Books, ISBN 0717629775

2. Rothgeb1 T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H. & Smith,L.A., J. Am. Oil Chemists Soe, 65, 806 (1988)

3. Miao, Z-H1 Rowell, F.J., Reeve1 R.N., Cumming, R.H., Journalof Environmental Monitoring, 2, 451-454 (2000)

4. Monitoring of Enzymes, PCT/GB96/03052

5. Tang, LX., Rowell, FJ., Cumming, R.H., Annals OccupationalHygiene, 40, 381-389 (1996)

6. D. Sykes e colaboradores, J. Aerosol Sci., 2000, 31, S90-91

7. LX. Tang e colaboradores, Analyst, 1995, 120, 1949

8. Tang, LX., Rowell, F.J., Cumming, R.H., Anal. Proc. Incl. Anal.Comm. 1995, 32 519

Também incluídos na presente descriçã estão o assunto emquestão dos seguintes parágrafos:

1. Um método para detecção simultânea da presença de pelomenos duas enzimas em uma amostra, o referido método compreendendoas etapas de: fornecimento de um primeiro substrato para uma primeira en-zima, o referido primeiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluorófo-ro, fornecimento de um segundo substrato para uma segunda enzima, o re-ferido segundo substrato sendo rotulado com um segundo fluoróforo, expo-sição dos substratos rotulados à amostra para permitir que as primeira e se-gunda enzimas presentes na amostra interajam com os respectivos primeiroe segundo substratos fluoróforo-rotulados formem respectivos primeiro esegundo fragmentos de substrato fluoróforo-rotulados; detecção da presençados referidos fragmentos de substrato fluoróforo-rotulados.

2. Um método de acordo com o parágrafo 1, em que o primeiroe/ou segundo substrato é uma proteína ou polipeptídeo.

3. Um método de acordo com o parágrafo 2, em que a proteínaou polipeptídeo é selecionado do grupo de: gelatina, tiroglobulina de porco,colágeno, imunoglobulina ou albumina de soro bovino.

4. Um método de acordo com qualquer parágrafo precedente,em que pelo menos um dos substratos é trazido sobre um suporte.

5. Um método de acordo com o parágrafo 4, em que o suporte éum suporte em fase sólida compreendendo: glóbulos de vidro ou sol-gel oufibras de celulose.

6. Um método de acordo com o parágrafo 4 ou 5, em que os gló-bulos são magnetizáveis.

7. Um método de acordo com o parágrafo precedente em que asprimeira e segunda enzimas são selecionadas do grupo de enzima consis-tindo em: protease, celulase, lipase, D-amilase ou colagenase.

8. Um método de acordo com o parágrafo 7, em que a proteaseé selecionada do grupo consistindo em: tipo subtilisin, tripsina, papaína, es-perase ou alcalase.

9. Um método de acordo com qualquer parágrafo precedente emque o primeiro e segundo fluoróforo são fluoresceína, rodamina, TexasRed® ou amarelo lúcifer.

10. Um método de acordo com qualquer parágrafo precedenteem que a amostra é ar.

11. Um método de acordo com qualquer parágrafo precedenteem que a(s) enzima(s) derivada(s) da amostra contata(m) simultaneamenteo primeiro substrato e o segundo substrato.

12. Um método de acordo com qualquer parágrafo precedenteem que a(s) enzima(s) derivada da amostra contata(m) seqüencialmente oprimeiro substrato e o segundo substrato.

13. Um método de acordo com o parágrafo 11 ou 12, em que osegundo substrato é um substrato para uma protease.

14. Um recipiente para uso na detecção simultânea da presençade pelo menos duas enzimas em uma amostra, o referido recipiente com-preendendo um primeiro substrato para uma primeira enzima, o referido pri-meiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo e um segundosubstrato para uma segunda enzima, o referido segundo substrato sendorotulado com um segundo fluoróforo.

15. Um recipiente de acordo com o parágrafo 14, em que pelomenos um dos substratos é trazido sobre um suporte sólido.

16. Um recipiente de acordo com o parágrafo 15, em que o su-porte é um suporte em fase sólida compreendendo: glóbulos de vidro ou sol-gel ou fibras de celulose.

17. Um recipiente de acordo com o parágrafo 16, em que o reci-piente contém uma mistura heterogênea dos primeiro e segundo substratos.

18. Um recipiente de acordo com o parágrafo 16, em que o reci-piente contém uma camada do primeiro substrato e uma camada do segundo substrato.

19. Aparelho para uso na detecção simultânea de pelo menosduas enzimas em uma amostra, o referido aparelho compreendendo um re-cipiente compreendendo um primeiro substrato para uma primeira enzima, oreferido substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo e um segundosubstrato para uma segunda enzima, o referido segundo substrato sendorotulado com um segundo fluoróforo, o referido aparelho ainda compreen-dendo meios de detecção para detecção de fragmentos de substrato fluo-rescentes.

20. Aparelho de acordo com o parágrafo 19, em que os primeiroe segundo substratos estão em camadas dentro do recipiente e a camadado segundo substrato, sendo um substrato para uma protease, está Iocaliza-da adjacente ao referido meio de detecção.

21. Aparelho para uso na detecção simultânea de pelo menosduas enzimas em uma amostra, o referido aparelho compreendendo umprimeiro recipiente compreendendo um primeiro substrato para uma primeiraenzima, o referido substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo, oreferido primeiro aparelho sendo conectável a um segundo recipiente, emque o segundo recipiente compreende um segundo substrato para uma se-gunda enzima, o referido substrato sendo rotulado com um segundo fluorófo-ro, o referido aparelho compreendendo ainda meios de detecção para detec-ção de fragmentos de substrato fluorescentes.

22. Aparelho de acordo com o parágrafo 21, em que o substratono segundo recipiente é uma protease e o segundo recipiente está localiza-do adjacente ao meio de detecção.23. Um método, recipiente ou aparelho conforme substancial-mente aqui descrito com referência ao exemplo em anexo e Figura 1.

Claims (32)

1. Método para detecção simultânea da presença ou ausênciade pelo menos duas enzimas em uma amostra, o referido método compre-endendo as etapas de:(i) exposição de (a) um primeiro substrato para uma primeira en-zima, o referido primeiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluorófo-ro e (b) um segundo substrato para uma segunda enzima, o referido segun-do substrato sendo rotulado com um segundo fluoróforo à amostra parapermitir que as primeira e segunda enzimas presentes na amostra, se pre-sentes, interajam com os respectivos primeiro e segundo substratos fluorófo-ro-rotulados para formar respectivos primeiro e segundo fragmentos desubstrato fluoróforo-rotulados;(ii) detecção da presença dos referidos fragmentos de substratofluoróforo-rotulados.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o método épara a detecção dos níveis de pelo menos duas enzimas trazidas no ar e oqual compreende as seguintes etapas:(i) antes de exposição dos substratos à amostra, obtenção deuma primeira amostra de ar atmosférico; e(ii) captura de quaisquer partículas enzimáticas as quais estãopresentes na primeira amostra.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, ainda compreen-dendo mistura das partículas de enzima capturadas com um líquido paraformar a amostra.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o líquido éum tampão aquoso.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, ainda compreen-dendo transporte da amostra de uma área na qual a primeira amostra é mis-turada com o líquido para uma área de reação na qual a amostra é expostaaos substratos.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes em que a etapa de exposição da amostra aos substratos é realiza-da durante um período de tempo suficiente para permitir interação entre asprimeira e/ou segunda enzima com o respectivo substrato para formar umfragmento de substrato fluoróforo-rotulado.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, em que a etapa de detecção envolve detecção de um sinal emitidopelo primeiro e/ou segundo fragmento de substrato fluoróforo-rotulado.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes em que o primeiro e/ou segundo substrato é uma proteína ou poli-peptídeo.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a proteínaou polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo em gelatina, tiroglobulinasuína, colágeno, uma imunoglobulina ou fragmento da mesma e albumina desoro bovino.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes em que pelo menos um dos substratos é carregado sobre umsuporte.

11. Método de acordo com a reivindicação 10 em que o suporteé um suporte de fase sólida.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou a reivindicação-11, em que o suporte é produzido a partir de ou compreende vidro, glóbulosde sol gel, fibras de celulose ou partículas de sílica.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10a 12 em que o suporte é magnetizável.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes em que a primeira e/ou segunda enzima é selecionada do gru-po de enzimas consistindo em protease, celulase, lipase, σ-amilase ou cola-genase.

15. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a protea-se é selecionada do grupo consistindo no tipo subtilisin, tripsina, papaína,esperase e alcalase.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes em que o primeiro e/ou o segundo fluoróforo é selecionado defluoresceína e derivados da mesma, rodamina, Taxas Red® e amarelo lúci-fer.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes em que a amostra é derivada de uma primeira amostra de ar.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14a 17, em que um ou ambos dos primeiro e segundo substrato são um subs-trato para uma protease.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, o qual compreende primeiro exposição da amostra a um dosprimeiro ou segundo substratos e subseqüentemente exposição da amostraao outro dos primeiro ou segundo substratos.

20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que pe-lo menos uma das enzimas que está sendo monitorada é uma protease epelo menos um dos primeiro e segundo substratos é um substrato para pro-tease.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a enzimaé uma enzima do tipo subtilisin e o substrato é a-amilase.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-18, o qual compreende exposição da amostra ao primeiro substrato e ao se-gundo substrato ao mesmo tempo.

23. Recipiente para uso na detecção simultânea da presença depelo menos duas enzimas em uma amostra, o referido recipiente compreen-dendo, em uso, um primeiro substrato para uma primeira enzima, o referidoprimeiro substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo e um segundosubstrato para uma segunda enzima, o referido segundo substrato sendorotulado com um segundo fluoróforo.

24. Recipiente de acordo com a reivindicação 23, o qual com-preende um suporte sobre o qual pelo menos um dos primeiro e segundosubstratos é suportado.

25. Recipiente de acordo com a reivindicação 23 ou a reivindica-ção 24, em que o suporte é um suporte de fase sólida compreendendo vidroou glóbulos de sol gel, partículas de sílica ou fibras de celulose.

26. Recipiente de acordo com a reivindicação 25, em que o reci-piente contém uma mistura heterogênea do primeiro substrato e do segundosubstrato.

27. Recipiente de acordo com a reivindicação 26, em que o reci-piente contém pelo menos uma camada a qual é substancialmente compos-ta do primeiro substrato e pelo menos uma camada a qual é substancialmen-te composta do segundo substrato.

28. Aparelho para uso na detecção simultânea de pelo menosduas enzimas em uma amostra, o referido aparelho compreendendo um re-cipiente compreendendo um primeiro substrato para uma primeira enzima, oreferido substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo e um segundosubstrato para uma segunda enzima, o referido segundo substrato sendorotulado com um segundo fluoróforo, o referido aparelho ainda compreen-dendo meios de detecção para detecção de fragmentos de substrato fluo-rescente.

29. Aparelho de acordo com a reivindicação 28, em que os pri-meiro e segundo substratos estão em camadas dentro do recipiente.

30. Aparelho de acordo com a reivindicação 29, em que quandoum dos primeiro substrato e segundo substrato é um substrato para umaenzima protease, ele está posicionado de modo a estar a jusante dos outrossubstratos.

31. Aparelho para uso na detecção simultânea de pelo menosduas enzimas em uma amostra, o referido aparelho compreendendo umprimeiro recipiente compreendendo um primeiro substrato para uma primeiraenzima, o referido substrato sendo rotulado com um primeiro fluoróforo, oreferido primeiro aparelho sendo conectável a um segundo recipiente, emque o segundo recipiente compreende um segundo substrato para uma se-gunda enzima, o referido substrato sendo rotulado com um segundo fluorófo-ro, o referido aparelho ainda compreendendo meios de detecção para detec-ção de fragmentos de substrato fluorescente.

32. Aparelho de acordo com a reivindicação 31 em que, quandoum dos primeiro substrato ou segundo substrato é um substrato para umaenzima protease, ele está situado no recipiente a jusante do outro recipientee está localizado adjacente ao meio de detecção.