JPS62185148A - 酵素活性測定用センサとこれを用いた測定装置及び方法 - Google Patents

酵素活性測定用センサとこれを用いた測定装置及び方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料の接触反応による酵素活性の光学的決定
のための方法とこの方法を実施するためのシステムであ
って、測定されるべき試料が酵素基質と接触するものに
関する。
酵素の接触反応による活性の決定は生化学や臨床分析に
おいて大変重要な役割りをもっている。
基準活性からの偏差は、大体病気の発生を特徴づける。
例えば、酵素″酸性フ４スファターゼ″の活性は骨腫瘤
又は前立せん腫瘤が生じた際、はっきっと高くなり、か
なりの診断上の意味がこの決定には与えられる。
〔従来の技術〕
酵素の活性を決定する多くの方法が知られている。これ
らは、Ｇ−Ｇ、ギルボールド（ＧＵＩＬＢＡＵＬＴ）著
の「分析の酵素法（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｍｅｔｈｅｄ
ｓ　ｏｆ＾ｎａｌｙｓｉｓ）　Ｊ　、パーガモン・プレ
ス、オックスフォード、１９７０年、及びＨ・ベルクマ
イヤ（ＥＲＧＭＥＹＥＲ）著の［酵素分析の基礎（Ｇｒ
ｕｎｄｌａｇｅｎ　　ｄｅｒｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅ
ｎ　人ｎａｌｙｓｅ　）　Ｊ　、フエアラーク・ヘミ−
、ワインハイムーニューヨーク、１９７７年にまとめら
れている。また合成プロテアーゼ基質を用いたバクテリ
ア病因の確認にも最近興味が集っている。（コバーン（
ＣＯＢＵＲＮ）、ライトル（ＬＹＴＬＥ）、フーバ（Ｈ
ＵＢＥＲ）による「分析化学（Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ）　
　５７．１６６９．１９８５年）、例えば、合成の着色
又は蛍光の基質を用いて酵素の活性を決定することは知
られている。そのために、酵素の影響下で分裂され着色
生成物に分解する酵素基質が使用される。時間とともに
色や蛍光強度の増加は、酵素話性の計測単位値として用
いられる。この運動　　酸性法を使って特に良好に決定
可能な加水分解酵素と　　側車してカルボキシルエステ
ラーゼ、フォスファター　　　こゼ、スルファターゼ、
デアルキラーゼ、グリコシ　　試料ターゼそしてプロテ
アーゼが挙げられる。　　　　　　ゼの典型的な例とし
てコラ−（ＫＯＬＬＥＲ）とヴオルフバ　　リリイス（
ＷＯＬＦＢＥＩＳ　）による「分析生化学」１４３、　
　　能に１４６．１９８４年で発表されたフオスファタ
ー　　　カゼの決定のための方法が引用される。この方
法は　　はア次の構造Ａであるリン酸エステルが、　　
　　　　　　られ酵素″酸性フォスファターゼ“によっ
て２つの断　　る反対に分裂されることに基づいている
。イオン加水　　が生分解生成物Ｂ及び自由リン酸イオ
ンが発生する。　　　〔発そのヘノラード−イオンＢは
、出発基質Ａとは逆　　公知に、強度の黄色等及び青緑
の蛍光によって特徴づ　　るたけられている。時間経過
に伴う色と蛍光の増加が″　は今）オスファターゼ″の
活性のための直接の計１立として用いられる。
の決定方法は大変感度が高く、ミリリットルあたり約ｏ
、ｏｏｔ活性単位フォスファター測光検出分、及び蛍光
測定による決定ではミツトルあたり約６０マイクロ単位
の検出を可する。
ルポキシルエステラーゼ、スルファターゼ又ミラーゼの
決定のための対応方法も同様に知でいる。
ロチアーゼは、上記のコバーン、ライトル、バの論文に
記載されているように、合成ペブ又はアミド含使って類
似の方法で決定されるができる。これらの全ての方法は
、酵素によ応によって異なる着色又は異なる蛍光生成物
しることが共通点である。
明によって解決される問題点〕 の方法のどれもが生きている有機体に適用すめには適し
ていないので、酵素の活性の決定まで試験管内でのみ行
なわれていた。しかしこのことは、例えば試験管内での
決定はかなり速く、実時間で行なわれるので、種々の理
由から望まれているようである。これとは反対に、今ま
で知られていた方法を使えば試料採取が必要であり、そ
の際偽和、これは、試料採取や試料準備のときに生じる
のであるが、これは避けられることができない。
その他、合成酵素基質を用いた前述の及びその信金ての
決定方法は、実際上光学的に透明な溶剤又は試料が与え
られている場合にのみ適している。
これらは全血液や生体内の決定には適していない。
上記から理解できるように、本発明の課題は、上述の問
題点を解消し特に酵素活性の生体内での決定が許される
接触反応による酵素活性の決定方法とその装置を提供す
ることである。すなわち従来の方法及び装置ではこの課
題が解決されなかったことが問題点となっていた。
〔問題点を解決するための手段〕
上記問題点を解決するために、本発明によれば、酵素基
質が光ケーブルの端部に配設されているとともに測定さ
れるべき試料に接触させられ、酵素による反応により引
き起こされる酵素基質又は酵素基質の反応生成物のスペ
クトル特性の時間単位あたりの変化が求められ、そして
酵素活性を決定するために用いられる。
〔作用・効果〕
本発明は、生体内で決定するという問題を例えば加水分
解活性酵素のための酵素基質が光ケーブルの端部に配設
されることで解決される。この端部は試料と接触し、そ
の際試料の酵素活性によりその酵素基質はスペクトル特
性を変化させる。この変化は光ケーブルを介して見守ら
れ、現下の酵素活性のための計測単位として用いられる
。これでもって初めて、全血液や他の光学的に透明でな
い液体での活性決定が前もって試料を準備しなくとも可
能となる。
〔その他の好ましい手段と作用効果〕
本発明による方法の他の実施態様において、酵素による
反応により引き起こされる好ましくは合成酵素基質の吸
収の変化が光ケーブルを介して得られ酵素活性の決定の
ために用いられるものがある。
本発明による方法のさらに他の実施態様において、酵素
による反応により引き起こされる好ましくは酵素基質の
蛍光ビームのスペクトル変化、例えば蛍光強度の変化や
蛍光最大値のずれが光ケーブルを介して得られ酵素活性
の決定のために用いられるものがある。その際最初の方
法では酵素基質や酵素基質の反応酸生物によって後方散
乱される励起光が測定され、その励起光の強度は接触反
応による酵素活性によって影響される基質の吸収能に左
右される。もう１つの方法では、例えばフィルタ又はエ
ネルギ分散検知システムを使って酵素の接触反応による
活性を原因とする酵素基質の蛍光強度の変化が光ケーブ
ルを介して測定され、その測定値は評価系に送られる。
この方法の別態様として、酵素活性に加えてそれ自体は
公知な方法で試料のＰＨ−値が測定され、この測定値が
前もって決定された酵素活性の修正のために用いられる
ものがある。
多くの酵素反応の速度は溶液のＰＨ−値によって強く左
右される。それとともに多くの加水分解の際遊離された
色素の解離度もＰＨ−値に左右される。生理的試料のＰ
Ｈ−値はある範囲で変動するので、実際に測定された酵
素活性をＰＨ−値に関して修正する必要がある。これは
実際的方法で最もうまくいく、酵素による活性のＰＨ−
依存性は大変多くの酵素から既に知られているが、固定
化酵素の場合新しく決定しなければならない。試料の個
々のＰＨ−値の測定のためには酵素活性の測定と同時に
ＰＨ−値も調べられることが有効である。本当の酵素活
性の決定は、現下のＰＨ−値の関数として活性と相対的
な信号変化の実験的に定めた関係を決定のために用いる
ことによって最も良好に行なわれる。
本発明による方法を実施するための初めに述べた種類の
システムは、酵素基質が光ケーブルの端部に配設され、
出力側に信号評価装置と接続する光検出器が備えられ、
この光検出器は酵素基質又は酵素基質の反応生成物から
放出される蛍光又は反射された励起光を測定するもので
ある。そこには、ビーム分配器を使って励起光の一部分
を基準光検出器に送られる場合これによって励起光源の
変動が除去されうるという利点がある。酵素に対する課
題設定あるいは酵素の性質の種類によって種々の測定技
術上のシステムが可能である。しかしながら全ての測定
システムは、例えば合成の酵素基質が光ケーブルの端部
に配設されていることや、スペクトル特性の変化が光ケ
ーブルを使って見守られることで共通である。
光検出器として光電子倍増管、フォトトランジスタ又は
フォトダイオードを使うのが効果的である。特にフォト
ダイオードは安価であるが、可視スペクトル領域でのみ
感応するので、その分裂が４５０ナノメ一タ以上の波長
で、理想的には５００ナノメ一タ以上の波長で見守られ
るような酵素基質が優先的に組み込まれる。４６０ナノ
メ一タ以上の分析波長のもつ利点は光源として経済的な
発光ダイオードの使用の可能にある。
光源として白熱電球、蛍光灯、発光ダイオード又はレー
ザが取り上げられる。ビーム分配器も、散乱又は反射し
た励起光を蛍光から良好に分けるため、二色性の鏡によ
って代用されることができる。光ケーブルは単一のファ
イバが好ましいが、ファイバ束でもよい。
蛍光は１．もちろん反射した励起光からフィルタを使っ
ても分けることができる。
本発明によるシステムの１つに酵素基質が光ケーブルの
端部に化学的又は物理的に固定化されているものがある
。その際、酵素基質は直接光ケーブルの研摩された出口
面に固定される。その酵素基質を光ケーブルの端部付近
の被覆部をはがした後光ケーブルの中央部の周囲面に固
定することも可能である。光の衰弱又は蛍光は、この場
合いわゆる微光波（ＥＶ人ＮＥＳＣＥＮＣＥ　ＬＩＣＩ
ＩＴ　ＷＡＶＥ）　ニよッテ作用される。これは光ケー
ブルの境界面での全反射の際電磁波がここでは光学的に
薄いメディウムである酵素基質的数ナノメータに入るか
らである。
微光波の到達距離内に色素が存在する場合、励起光は、
そこで吸収されるし、また蛍光を誘導することができる
０反射光あるいは放射光は光ケーブルを通じて戻され測
定される。
酵素基質の固定化は種々の方法で行なわれる。
例えば、クマリンから誘導された次の構造の基質エ プチルーコリンエスターゼの決定には適しているが、次
の方法によって光ケーブルの端部に固定化される。
２００マイクロメータ厚さの水晶光ケーブルのむきだし
の端部が精密研摩され、２０％の硫酸水溶液で活性化さ
れる。これにより表面のイオン的汚れが取り除かれ、表
面が化学的に反応性となる。
続いて、ガラス誘導化された試薬アミノプロピル−トリ
エトオキシシランでもって公知の方法で変換される。こ
の変換は、実質的にはガラスの活性表面がトリオルの１
０％のシラン溶液中で１００℃で２時間加熱され、アセ
トンで洗われ、１２０℃、乾燥されるということにある
。これによってその端部に自由アミノ基を備えた光ケー
ブルが得られる。
このアミン基にそれ自体公知な化学方法を使って酵素基
質が結合される。先に述べた基質■はペプチド連成−試
薬エチル−Ｎ”−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド−塩化水素酸塩を使って固定化される。他
の選択では、その基質を対応する塩化カルボン酸内に移
し、それがらガラス表面のアミノ基と反応させる。
このようにして得た光ファイバの端部を酵素ブチリルコ
リンエステラーゼを含む溶液と接触させ、特許請求の範
囲第５項に記載された測定システムにおいてしばらく、
４１０〜４３０ナノメータの分析波長において光吸収の
明確な増加及び４６０〜４７０ナノメータにおいて蛍光
強度の増加が観測される。
この例と同様な方法で、同じ基本分子から導き出された
スルファターゼ、アミラーゼ、プロテアーゼのため典型
的な基質が固定化され、そこでスルファターゼ、アミラ
ーゼ、プロテアーゼはそれぞれの次の構造■、■、■、
をもつ： 全ての場合において、試料の酵素による活性は４２０ナ
ノメータで吸収の、４６０ナノメータで蛍光の増加をも
たらす。
これは■で示す構造をもつ１−ハイドロキシピレン−３
，６，８−トリスルフオ−トから導き出されるが、例と
して静電力で固定化される合成酵素基質のために使われ
る。この固定化は基質の負に帯電したスルフォン基と担
体として用いられる陰イオン交換体の正に帯電した表面
アン、モニウム基との間の相互作用に基づく。
本発明によるさらに別な実施態様において、酵素基質を
薄い担体フィルムに固定化しておき、これを光ケーブル
の端部に張って取り付けているものがある０次に典型的
な方法での、静電力によって固定化された酵素基質をも
った膜の製造を説明する： 陰イオン交換膜を５０ｍ１のメタノールに１ｇの１−ヒ
ドロキシピレン−３，６，８−トリスルフオート■の溶
液に浸積する。約２分後黄色に着色し緑色に蛍光を発す
る膜を引き上げ、これをまずＰＨ７の約０．０６モルの
リン酸塩緩衝で、それから水で洗う、乾燥の後これをジ
オクザンに１００ｍｇのラウリン酸無水物の溶液に置き
、これによって表面につながれた■がＶに移行する。ラ
ウリン酸無水物の溶液は１　ｍｌのジオクザンに０．１
ｇの　。
ラウリン酸を溶かし、０．１ｇのＮ、Ｎ’−ジシクロへ
キシルカルビジ°イミドを添加し、生じた沈澱物をろ過
することによって作られる。２時間後この膜は溶液から
出され、乾性アセトンで洗われる、これは青−紫の蛍光
を有し、その黄色は消え去っている。
この膜は光ケーブルの端部に張って取り付けられ、酵素
リパーゼの溶液に接触させられると、その基質は酵素に
よって黄色の、強く緑色の蛍光を発する加水分解生成物
に変えられる。４６０ナノメータで吸収の増加、あるい
は５２０〜５３５ナノメータで緑の蛍光の増加が光ケー
ブルを使って送られる。これが試料内を支配している酵
素活性のための直接の計測単位である。基質の分裂はど
ちらにしても酵素リパーゼによってではなく、血清アル
ブミンによって行なわれる。ｔ＆者の活性はかなり高い
ので、このセンサは人間の血清アルブミン、例えば血液
中の、これの決定のためにも用いられる。
最後に記載された方法は、しドロラーゼのための他の固
定化酵素基質の製造のためにも適している。これは酵素
感応層の製造のための選択的な方法としてだけではなく
既に使用されたセンサの再生のためにも用いられる。
固定化酵素基質の、種々の加水分解酵素により生じさせ
られた分裂は固い表面つまり基質のための担体材料上で
起きる。そのような分裂は化学的に固定化された基質の
場合溶液中でより明らかにゆっくりと起こり、そこでは
その基質は全ての方向から酵素の攻撃にさらされる。加
水分解が遅ければ遅いほど、それに加えて妨害影響が常
にわずかな単位で経過する非酵素による基質の加水分解
により大きく現れてくる。
本発明に従って、光ケーブルの表面つまり担体フィルム
の表面と酵素基質との間に長鎖の結晶空間群が存在して
いる場合、固定化された合成の基質の加水分解速度は酵
素によって本質的に加速されることがわかる。
結晶空間群として、例えばヘキサメチレンジアミンのよ
うな長鎖のジアミンが用いられる。結晶空間群はシリン
ン化試薬（Ｓｉｌｙｌｉｅｒｕｎｇｓｒｅａｇｅｎｓ　
）をもって例えばいわゆる″長鎖アミン″を使って直接
導入される。
光学システムに対する強く着色した試料材料、例えば血
液の妨害影響を阻止するため、光ケーブルの端部を保護
カバーで覆うことができ、この保護カバーは着色した大
きな粒子、例えば赤血球の侵入を阻止する。これに対し
、酵素はこの保護カバーを透過することができる。蛋白
質透過性の保護カバーのための理想的な材料はセルロー
ゼである。
光ケーブルの端部に直接酵素基質を固定化する代りに、
本発明によれば、光ケーブルの端部が反応空間を形成す
る酵素透過性膜によって包みこまれ、この膜は酵素基質
を含んでいるとともに試料の細胞成分に対し不透過であ
るものも可能である。
そのような反応空間は決定されるべき酵素が出入りでき
なければならないが、同時にこれから酵素基質を拡散す
ることができなくてもよい。
酵素基質の拡散は、本発明によれば、酵素基質が水溶性
又は水膨化可能なポリマに、例えば化学的固定化により
、つながれていることによって阻ＩＦされる。
酵素基質の拡散は、本発明によれば、その酵素基質が水
溶性の又は水膨化可能なポリマに、例えば化学的固定化
によりつながれているものにより阻止される。水溶性又
は水膨化可能なポリマ、しかも反応空間に存在する酵素
基質のための担体として用いられるものとして次のもの
がある：デキストラン、アガローゼ、ポリエチレン、ポ
リアクリルアミド又はポリアルコールである。このケー
スでは、担体ポリ４７の分子が保護カバーを通り抜ける
ことを避けるに十分に大きいという事情がポリマ担体の
選択に際して決定的なものとなる。酵素による加水分解
により固定化酵素は分裂され、これによりそのスペクト
ラル特性が変化させられる。この変化は光ケーブルを介
して送られ、酵素活性のための計測単位として用いられ
る。発生した色素はある量だけセルローゼ膜を通じて拡
散することができるので、酵素による反応が反応泡から
の拡散よりはるかに速く経過することが必ず要求される
。
最後に挙げられたシステムにおいては、そのスベクトラ
ル特性が酵素による反応により明確に変化するような酵
素基質だけが使われる。この原因は、光ケーブルが酵素
基質及びその分裂物を光学的にとらえるということにあ
る。それ故、本発明によるさらに別な実施態様において
、その酵素基質が光ケーブルの端部に配設されている好
ましくは円柱状の反応空間を形づくる円筒の内側表面に
固定化され、その際反応空間がその試料の方を向いた側
に試料の細胞成分を透過させない酵素透過性膜を備え、
かつ酵素による反応によって作られた反応生成物が反応
空間内へ拡散するものが提案される。その基質がその分
裂生成物によって空間的に分離されて存在することによ
り、分裂生成物の形成を独特に見守ることができる６ 簡単な方法での光学的な分離は、与えられた励起光の射
出角αとその射出角αに適応させた前記円柱状反応空間
の直径と長さとの関係により、前記酵素基質が直接励起
されることにより実現する。
表面に付けられた基質を含む円柱壁は、射出角αにより
与えられる光ケーブルの数値的なアパーチャの外側に存
在し、その基質は、酵素による反応が経過しない限り、
光ケーブルによってとらえられない。
決定されるべき酵素が反応空間に入り込むと、酵素によ
る反応が色素を出しながら起こる。その色素は反応空間
内で分散し、その色あるいは蛍光は、光ケーブノ、しに
よってとらえられる。色あるいは蛍光強度の増加は接触
反応による酵素活性のための計測単位として用いられる
。
最後に述べたシステムは２．３の原理的な利点を備えて
いる。
ａ）酵素基質と分裂物は、空間的に分離しているために
スペクトル的に、もはや重複することができないので、
高い無効値が避けられる。
ｂ）合成の酵素基質のみが組み込まれるだけではなく、
色素で際立っている自然の基質も組み込まれることがで
きる。
次の例は、本発明によるシステムの適用範囲の広さを図
示しており、その固定化はほとんどがポリマ担体、結晶
空間群、そし、て本来の色素の化学的結合によって行な
われる： １）７−オキシクマリン−３−カルボン酸の結晶空間群
（アジピン酸）を介してのセルローゼ膜又は他のＯＨ基
をもつポリマの表面への固定化は、Ｃ０−０−結合の酵
素による分裂は色素の発生を引き起こし、この色素は光
ケーブルの視界内に拡散し、決定される。
２）３−シアン−７−オキシクマリンのＣＩ２−Ｃ１（
２−ＣＩＬ２−　Ｃ１１２結晶空間群を介してのＯＨを
含むポリマへの固定化は次の化学式をもつ構造要素を生
じる固定化色素はデアルキラーゼのための合成の基質で
ある。これはエーテル基を分裂させ、蛍光色素７−オキ
シクマリン−３−カルボン酸を遊離させ、この色素は光
ケーブルによってとらえることができる。
３）下の書かれたものはガラス表面に固定化されたプロ
テアーゼ基質の構造要素が示される：反応空間の表面に
色素で際立たされた自然の基質、例えば蛋白質が固定イ
ヒされる。そのために例えば卵白リゾチームが壁の表面
に固定化され、それからフルオレジインイソチオシアン
酸塩で蛍光を際立たせる。酵素トリプシンとの接触でこ
の基質は分裂する。フルオレジインとりゾチームのフル
オレジインの際立った破片は、光ケーブルにより光学的
にとらえられる空間内に拡散し、そこで蛍光分析により
とらえられることができる。
固定化された蛋白質は簡単に作ることができるが、購入
することもできる。サツカライド、つまり糖状化合物も
固定化された形で市販品から入手することもできる。例
えば固定化Ｎ−アセチルグルコサミン、乳糖、メリビオ
ーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコーゼ、マンノ
ーゼ、セロビオーゼ、ザラクトーゼ、そしてグルコーゼ
である。
これらの材料は反応空間の壁に付けられ、色素で際立た
せられることができる。そのような色素として、フルオ
レジイン−イソ千オシアン酸塩、ダンシル塩化物、フル
オレシアミン、ナフチルイソシアミン酸塩そしてユーロ
ピウムキレートがある。
酵素による反応により、際立たされた分子は遊離し、そ
れに基づいてこの分子は反応空間に拡散し、光ケーブル
によってとらえられる。
反応空間をとり囲む材料はその基質自体である。
そこでは例えばポリグルコシドに属するアミローゼが収
り扱われ、これはその内側表面に蛍光で際立たせられな
ければならない。またポリペプチドや脂肪酸エステルは
、基質及び壁材料である材料として考慮される。もちろ
ん、その際、非水溶性の材料が扱われる。
着色された自然の酵素基質の使用によって生じる利点は
、この方法で自然の基質のための酵素が有する高い特性
を利用することができることにある。蛍光分析と組み合
わせて感度及び特徴的な決定方法の目的が達成される。
多くの酵素が１つの形でのみ現れるのではなく、さらに
亜属を形成する、このための典型的な例はフォスファタ
ーゼである。これには、アルカル溶液内で活性最大を有
するようなもの、いわゆるアルカリ性フォスファターゼ
と酸性溶液内で活性最大を有するようなもの、つまり酸
性フォスファターゼがある。臨床的に重要な酸性フォス
ファターゼの決定は例えばＰＨ７，４では、アルカリ性
フォスファターゼの活性を少なくとも持ち分に応じて同
時にとらえることなしにはできない この問題を回避するために、２つの酵素感応性ファイバ
オプティカルカテーテルを使うことが必要となる。これ
らは、両酵素基質がそれぞれの終端で酵素に対する異な
った！相方を有し、最大の変換速度が異なっていること
が区別されなければならない、基質に対する酵素の親和
力は、ミカエリス−メンテン定数によって決められ、こ
の定数は最大変換を決める値による最大速度である。
〔実施例〕
次に本発明は第１図から第５図に図示された実施例を用
いて詳しく説明される。
第１図において、光源１から放たれた光はコリメータレ
ンズ２で集光され、フィルタ３を通ったのちフォーカス
レンズ４によって光ケーブル６の入力側端部５に入り込
む。その光の波長はフィルタ３を使って、酵素による加
水分解で遊離した色素の吸収散大に調整される。光の一
部分はビーム分配器７により標準光検出器８の方に偏向
される。
この標準光検出器８は光源１の強度変動を除去するため
に用いられる。
光ケーブル６を介してその光は、例えば合成の酵素基質
９に送られ、この酵素基質は光ケーブル６の出口側端部
１０に固定化された形で存在している。酵素基質９は相
応な酵素によって分裂させられると、生じた光は着色し
た反応生成物９′の形成のためどんどん吸収され、それ
で減衰する。
その相応な色素が蛍光性であれば、他方でどんどん強く
なっていく蛍光強度が観測される９反射された光及び蛍
光は同じ光ケーブル６により戻され、ビーム分配器７の
ハーフミラとなっている表面１１によりレンズ１２．１
３を通って光検出器１４に向けられる。蛍光を測定する
場合、ビーム分配器７ないしレンズ１２と検出器１４と
の間になお反射励起光を通さない第２の光学フィルタ１
５を介装し、これにより大変選択されて蛍光だけがとら
えられる。
光検出器１４で測定された信号Ｓならびに標準光検出器
８で測定された標準信号Ｒは増幅され、ここでは図示さ
れていない表示ないしは評価装置に送られる。
第２図は中央部１６と被覆部１７が異なった屈折係数を
もつ光ケーブル６の端部１０を拡大して示している。そ
こでは、基質９は薄い担体フィルム１８、例えばセルロ
ーゼ、イオン交換膜又はポリアクリルアミドから作られ
たもの、これに固定化され、光ケーブル６の出口側端部
１０に張って取り付けられる。
酵素基質９は、第３図に示されるように、光ケーブル６
の円柱状の中央部１６の外面１９に付けることもでき、
その際光ケーブル６の端部付近では被覆部１７は、はが
されている。光ケーブル６は、その円形状の出口面２０
に光を反射するキャップ２１が着けられている。
第４図には、例えばセルローズから作られた蛋白質透過
性膜２３によって形作られた泡状の反応空間２２をその
端部１０に備えた光ケーブル６が示されている。比較的
小さい分子で組織されているので膜２３の壁を通じて拡
散される酵素基質９が反応空間２２に存在している。こ
の拡散を阻止するために酵素基質９が大きな分子をもっ
た水溶性のポリマに固定化される０反応空間２２に与え
られる酵素基質のための担体としては、まず水溶性又は
水膨化可能なポリマが考慮される。
第５図に示されたシステムを使って反応生成物９′をも
ともと与えられていた酵素基質９がら空間的に分離する
ことができる。光ケーブル６の端部１０には、円柱状の
反応空間２４が存在し、その試料の方を向いた側面は、
例えばセルローズ又はポリ炭酸塩から作られた酵素が透
過可能な膜２３で覆われている。反応空間２４を形成す
る円筒体２６の内側壁２５には着色又は蛍光酵素基質９
が存在している。前に述べたシステムとは違って反応空
間内は一様には分布しておらず、円筒体２６の内側壁２
５にだけ静電力又は物理的に固定化されている。
測定されるべき酵素が矢印２つに沿って膜２３を通って
反応空間２４に入るやいなや、酵素による反応が反応生
成物９′を出しながら起こる。この反応生成物９′は反
応空間２４内を自由に動き、励起光の射出角αによって
定められる領域内に拡散する。そこでは、反応空間を形
作る円筒体２６の直径２７と長さ２８は、放射される励
起光が円筒体の壁、つまりそこに固定化された酵素基質
９に当たらないように選択されなければならない。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明による試料の接触反応による酵素活性の
光学的決定のための方法を実施するためのシステムの一
実施例の概略図、第２図から第５図は第１図で示された
システムの光ケーブルの端部の種々な実施例の拡大図で
ある。 １・・・・・・光源　　　　６・・・・・・光ケーブル
７・・・・・・ビーム分配器

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、酵素基質が光ケーブルの端部に配設されているとと
    もに測定されるべき試料に接触させられ、酵素による反
    応により引き起こされる酵素基質ないしはその酵素基質
    の反応生成物のスペクトル特性の時間単位当たりの変化
    が求められ、そしてその変化が酵素活性を決定するため
    に用いられることを特徴とする試料の接触反応による酵
    素活性の光学的決定のための方法。 ２、酵素による反応により引き起こされる合成酵素基質
    等の吸収の変化が光ケーブルを介して得られ、この変化
    が酵素活性の決定のために用いられることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、酵素による反応により引き起こされる合成等の蛍光
    ビームの蛍光強度の変化や蛍光最大値のずれといったス
    ペクトル変化が光ケーブルを介して得られ、酵素活性の
    決定のために用いられることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。 ４、酵素活性に加えて試料のＰＨ−値も測定され、この
    ＰＨ−測定値が前もって決定された酵素活性の修正のた
    めに用いられることを特徴とする特許請求の範囲第１項
    〜第３項のいずれかに記載の方法。 ５、酵素基質（９）が光ケーブル（６）の端部（１０）
    に配設され、その出力側で信号評価装置に接続されてい
    る光検出器（１４）が備えられ、この光検出器（１４）
    が酵素基質（９）又はこの酵素基質の反応生成物（９′
    ）によって放出される蛍光や反射された励起光を測定す
    ることを特徴とする試料の接触反応による酵素活性の光
    学的決定のためのシステム。 ６、前記酵素基質（９）が前記光ケーブル（６）の端部
    （１０）に化学的又は物理的に固定化されていることを
    特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のシステム。 ７、前記酵素基質（９）を薄い担体フィルム（１８）に
    固定化しておき、これを前記光ケーブル（６）の端部（
    １０）に張って取り付けることを特徴とする特許請求の
    範囲第５項に記載のシステム。 ８、前記光ケーブル（６）の表面あるいはその光ケーブ
    ル（６）の表面に付けられた担体フィルム（１８）の表
    面と前記酵素基質との間に長鎖の結晶空間群が存在して
    いることを特徴とする特許請求の範囲第６項又は第７項
    に記載のシステム。 ９、前記光ケーブル（６）の端部（１０）が反応空間（
    ２２）を形成する酵素透過性膜（２３）によって包み込
    まれ、この膜（２３）が前記酵素基質（９）を含んでい
    るとともに試料の細胞成分を透過させないものであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載システム。 １０、前記酵素基質（９）が水溶性の又は水膨化可能な
    ポリマに結びつけられて提供されることを特徴とする特
    許請求の範囲第９項に記載のシステム。 １１、前記酵素基質（９）が、前記光ケーブル（６）の
    端部（１０）に配設されているところの、反応空間（２
    ４）を形づくる円筒状等の内側表面（２５）に固定化さ
    れ、この反応空間（２４）がその試料の方を向いた側に
    試料の細胞成分は透過させない酵素透過性膜（２３）を
    備え、酵素による反応によって作られた反応生成物（９
    ′）がその反応空間（２４）内へ拡散することを特徴と
    する特許請求の範囲第５項に記載のシステム。 １２、与えられた励起光の射出角αとその射出角αに適
    応させた前記円柱状反応空間（２４）の直径（２７）と
    長さ（２８）との関係により、前記酵素基質（９）が直
    接励起されることが避けられることを特徴とする特許請
    求の範囲第１１項に記載のシステム。
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