JP3090692B2

JP3090692B2 - 酵素反応測定方法及びその測定装置

Info

Publication number: JP3090692B2
Application number: JP53078397A
Authority: JP
Inventors: 茂俊岡崎; 浩幸松本
Original assignee: 株式会社分子バイオホトニクス研究所
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2000-09-25
Anticipated expiration: 2017-02-24
Also published as: WO1997032198A1; EP0884584A1; EP0884584A4; US5905030A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、反応容器内に基質溶液と酵素溶液とを供給
することにより反応を行わせ、その酵素反応を連続的に
赤外分光法により観測する酵素反応測定方法及びその測
定装置に関する。

背景技術酵素は、生物の生産する一種の触媒であり、主に蛋白
質からなっている。酵素が触媒する反応の反応物質は基
質と呼ばれる。生体内のほとんど全ての反応にそれぞれ
応じた酵素が存在しており、それら酵素反応は、生体内
の緩和な条件下で円滑に行われ、生命の維持に役立って
いる。従って、生体内反応に関与している酵素の働き
（酵素活性）の低下は疾患の原因となり得るため、血液
や尿中のある種の酵素の活性を測定することにより病気
の診断を行うことが、臨床検査の場では広く行われてい
る。

また、酵素反応は、基質特異性が高く、省エネルギー
型の工業プロセスとしても広く利用されている。例え
ば、油脂化学工業においては、油脂の分解にリパーゼが
用いられている。リパーゼは、長鎖脂肪酸のグリセロー
ルエステル（トリグリセリド）を加水分解する酵素であ
り、消化管内のリパーゼは、主に膵臓に由来し、一部胃
や腸からも分泌される。膵疾患においては血中リパーゼ
活性が上昇することが知られており、血中のリパーゼ活
性を測定することにより膵疾患の判定がなされている。

酵素反応を測定することは、酵素が触媒する反応の反
応物質である基質およびその反応によって生成される生
成物それぞれの量的および時間的な変化を測定すること
である。すなわち、基質が生成物へと変化する割合が大
きいほど酵素活性は高いことになる。逆にその割合が小
さいほど酵素活性は低いことになる。また、基質の生成
物への変化を経時的に測定することで、酵素反応の反応
速度を解析することが可能となる。

従来より、基質と生成物の量的な変化を測定する方法
は、基質と生成物の物理的あるいは化学的性質の違いを
利用して識別することにより、それぞれの量的な変化を
測定している。例えば、（１）酵素反応停止後に基質あ
るいは生成物を特異的に発色させて比色定量することに
より、基質あるいは生成物の増減量を求める方法（比色
定量法）、（２）放射性同位元素で標識された化合物
（放射性化合物）を基質として用い、酵素反応により生
じる生成物が別の放射性化合物となることを利用して、
それぞれの放射性化合物を分離し、放射能量を測定する
ことにより、基質あるいは生成物の増減量を求める方
法、（３）酵素反応により生成した脂肪酸を反応停止後
に中和滴定する方法（滴定法）、（４）基質を水に懸濁
させ、酵素反応により基質が分解されることによる基質
溶液の濁度の変化を測定することにより、基質の増減量
を求める方法（濁度測定法）、あるいは、（５）基質と
生成物の分光学的な違いを利用し、それぞれの物質が特
異的に吸収する波長の光（吸収波長）を用い、吸光度の
変化から基質あるいは生成物の増減量を求める方法（分
光学的測定法）などがある。このうち特に、分光学的測
定法および濁度測定法は、連続的に酵素反応を測定する
ことが可能である。

しかし、上記測定方法それぞれには以下のような問題
点がある。まず、比色定量法は、酵素反応停止後に基質
あるいは生成物を特異的に発色させるため発色試薬を反
応させなければならず、操作が煩雑かつ測定に時間がか
かり、連続的な酵素反応の測定を行うことができない。
さらに、基質が水懸濁液である場合、光を透過させるこ
とが困難であり、十分な測定が行えないという問題点が
ある。

放射性元素を用いる方法は、酵素反応を停止させた後
に基質あるいは生成物を分離して、放射能量を測定する
ために、操作が煩雑であり測定に時間を要する上、連続
的な酵素反応の測定が不可能である。また、放射性同位
体を使用するため、安全面での問題点や使用する場所の
制限が大きいという問題点がある。

滴定法は、酵素反応停止後に基質と生成物を分離する
ことなく測定可能であるが、連続的な酵素反応の測定が
できないという問題点がある。

濁度測定法は、操作が容易で酵素反応の連続的測定が
可能であるが、観測しているものが、基質自体ではな
く、懸濁している基質からの散乱光である。したがっ
て、この方法は、酵素反応自体を観測していないため、
信頼性に問題がある。

一方、分光学的測定法は、基質あるいは生成物を分離
することなく、簡便かつ連続的に酵素反応を測定するこ
とが可能であるという点で有用な手段である。しかしな
がら、測定する溶液が濁度を持つ場合、特に基質が水溶
性でない場合には、定量的な測定が困難であるという問
題があり、従来このような水溶液中で、しかも濁った試
料での応用例は無かった。特に測定波長が紫外領域から
可視領域の場合、上記濁度の影響は大きいものである。
さらには測定波長が赤外光の場合には、濁度による影響
はむしろ小さくなるが、赤外領域においては溶媒たる水
の吸収が大きく、数百ミクロン程度の厚さのセルを用い
るか、全反射吸収法（平石次郎編「フーリエ変換赤外分
光法」学会出版センター、（1985）pp.163−171）を用
いなければならないことが知られている。

しかし、分光学的測定法の酵素反応への応用に際して
は、酵素反応の撹拌速度の依存性等のために厳密な撹拌
が必要とされるが、上記数百ミクロン程度の厚さのセル
では撹拌が不可能であった。さらに、通常の全反射吸収
法測定装置も、撹拌することができないため、正確な酵
素活性の測定ができないものであった。

本発明は、分光学的測定法に基づく上記の本質的な問
題をなくすためになされたものであり、基質と生成物と
の分離が不要、操作が容易、酵素反応の連続測定が可
能、かつ、信頼性の高い酵素反応の測定が可能な酵素反
応方法及びその測定装置を供給することを目的とするも
のである。

発明の開示本発明に係る酵素反応測定方法は、エステル結合の加
水分解反応を触媒する酵素と基質とを含む測定溶液を一
定温度の下で攪拌し、測定溶液に一定の面が接して配さ
れた全反射吸収用プリズムの当該一方の面と測定溶液と
の界面に全反射吸収用プリズムの側から赤外光を入射さ
せて全反射させ、その全反射された赤外光のスペクトル
を測定して赤外線吸収スペクトルまたは吸光度の変化を
求め、測定溶液中の酵素反応を測定することを特徴とす
る。

このようにすることによって、測定溶液が濁度を持つ
場合や基質が水溶性でない場合であっても、基質と生成
物とを分離することなく、簡便な操作で連続的に、信頼
性の高い酵素反応の測定が可能となる。

ここで、酵素は、エステル結合の加水分解反応を触媒
することを特徴とするものであり、カルボン酸エステル
加水分解酵素またはリパーゼである。

また、本発明に係る酵素反応測定装置は、基質溶液と
酵素溶液とが混合されてなる測定溶液を容れる反応容器
と、基質溶液を反応容器内に供給する基質溶液供給手段
と、酵素溶液を反応容器内に供給する酵素溶液供給手段
と、測定溶液の温度を制御する温度制御手段と、測定溶
液を攪拌する撹拌手段と、測定溶液に一方の面が接して
配された全反射吸収用プリズムと、全反射吸収用プリズ
ムの上記一方の面と測定溶液との界面で全反射するよう
に赤外光を全反射吸収用プリズムに入射させる赤外光源
と、全反射吸収用プリズムから出射された赤外光のスペ
クトルを測定する赤外光検出手段と、赤外光検出手段に
より測定された赤外光のスペクトルに基づいて赤外吸収
スペクトルあるいは吸光度の変化を求めて測定溶液中の
酵素反応を測定する演算部と、を備えることを特徴とす
る。

このことによって、基質溶液供給手段および酵素溶液
供給手段それぞれから反応溶液に供給された基質溶液お
よび酵素溶液それぞれは反応溶液内で混合されて測定溶
液とされ、その測定溶液は、温度制御手段により一定温
度に制御され、攪拌手段により攪拌される。赤外光源か
ら出射された赤外光は、この測定溶液に一方の面が接し
て配された全反射吸収用プリズムの当該一方の面と測定
溶液との界面に全反射吸収用プリズムの側から入射して
全反射し、その全反射された後に全反射吸収用プリズム
から出射した赤外光のスペクトルは、赤外光検出手段に
より測定される。そして、演算部により、赤外線吸収ス
ペクトルまたは吸光度の変化が求められ、測定溶液中の
酵素反応が測定される。したがって、測定溶液が濁度を
持つ場合や基質が水溶性でない場合であっても、基質と
生成物とを分離することなく、簡便な操作で連続的に、
信頼性の高い酵素反応の測定が可能となる。

また、本発明に係る酵素反応測定装置は、反応容器内
の測定溶液を排出する溶液排出手段と、反応容器内を洗
浄する洗浄液を反応容器内に供給する洗浄液供給手段
と、を更に備えることを特徴とする。このことによっ
て、１つの酵素反応の測定が終了した後、反応容器内の
測定溶液は、溶液排出手段により排出され、また、反応
容器内は、洗浄液供給手段により供給された洗浄液によ
り洗浄されるので、続けて次の酵素反応の測定が可能と
なる。

また、全反射吸収用プリズムは、少なくとも測定溶液
に接触する領域がテフロン・コーティングされているこ
とを特徴とする。このことによって、測定溶液中の基質
が全反射吸収用プリズムに析出することが防止される。

図面の簡単な説明第１図は、本発明に係る酵素反応測定装置の構成図で
あり、第２図は、本装置の反応容器の斜視図であり、第
３図は、本装置の反応容器の断面図であり、第４図は、
本装置の測定動作のフローチャートであり、第５図は、
本装置を用いたリパーゼによるオリーブ油の加水分解反
応の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態本発明をより詳細に説述するために、添付の図面に従
ってこれを説明する。

第１図は、本発明に係る酵素反応測定装置の一実施形
態を示す構成図であり、本装置の構成を明確にするため
反応容器26については断面図を示している。この実施の
形態においては分光器を使用した赤外分光光度計を示し
ているが、フーリエ変換型赤外分光光度計または目的波
長のみの光を発する光源と検出器の組み合わせを使用し
たものでも良い。

この酵素反応測定装置は、主に、赤外分光光度計本体
１および赤外分光光度計試料室２を備え、更に、洗浄
液、基質溶液、酵素溶液および停止液それぞれの供給部
15〜18等をも備えている。赤外分光光度計本体１内部に
は、赤外光源３、分光器４、赤外光検出器５、および、
これらを制御する制御部６が内蔵されている。また、赤
外分光光度計試料室２内部には、主に、反応容器26およ
び全反射吸収用プリズム28が内蔵されている。

赤外光源３は、赤外光を出射する光源であり、この赤
外光源３から出射された赤外入射光36は、全反射吸収用
プリズム28の入射面に入射する。この全反射吸収用プリ
ズム28は、上面と下面（反応容器26の側の面）とが平行
であって、これらに対して入射面および出射面が斜めに
形成されている。この全反射吸収用プリズム28の入射面
に入射した赤外光は、全反射吸収用プリズム28の上面と
下面との間を全反射を繰り返しながら伝搬し、出射面か
ら出射する。

この全反射吸収用プリズム28は、屈折率が大きいZnSe
製が最も好適であり、Ge製またはSi製も好適である。ま
た、赤外光の全反射吸収用プリズム28の下面への入射角
は、40度から60度の範囲が好適であり、特に45度が好ま
しい。なお、全反射吸収用プリズム28の屈折率と測定溶
液40の屈折率との差が小さいほど、赤外光が全反射吸収
用プリズム28の下面で全反射する際に測定溶液40中に発
生するエバネセントの染み込みは深くなり、基質による
赤外吸収スペクトルが増強されることになる。

さらに、全反射吸収用プリズム28は、その下面のうち
少なくとも測定溶液40と接する領域が、テフロン・コー
ティングされているのが好適である。このようにするテ
フロン・コーティングすることで、測定溶液40中の基質
が全反射吸収用プリズム28に析出することを防止でき
る。なお、赤外光が全反射吸収用プリズム28の下面で全
反射する際に測定溶液40中に生じるエバネセント波の染
み込み深さは、その赤外光の波長の1/5から1/7程度であ
り、また、目的波長が約７μｍであるので、赤外光のエ
バネセントが測定溶液40に達するようにするためには、
テフロン・コーディングの厚みは数百nm以下であること
が必要である。

全反射吸収用プリズム28の出射面から出射された赤外
透過光37は、分光器４に入射する。この分光器４は、そ
の赤外透過光37のうちの目的波長成分を選択し、赤外光
検出器５は、その目的波長成分を検出し、その強度に応
じた信号を出力する。そして、赤外光検出器５により検
出された信号は、制御部６およびデータ転送ライン39を
経て、演算・制御用コンピュータ７に転送される。な
お、電源32は、赤外分光光度計本体１内の赤外光源３、
分光器４、赤外光検出器５および制御部６それぞれに電
力を供給するためのものである。

全反射吸収用プリズム28は、パッキン27を介して反応
容器26に取り付けられており、全反射吸収用プリズム28
の下面の一部領域は、反応容器26内に容れられる測定溶
液40と接する。このパッキン27は、全反射吸収用プリズ
ム28と測定溶液40とが接する領域の面積を規定するため
孔が中央部に設けられている。

このパッキン27は、測定する波長領域に吸収のないも
の、すなわち、エステル基およびカルボキシル基を含ま
ない材質（例えば、シリコンゴムまたはテフロン製）の
ものが好ましい。また、パッキン27として、全反射吸収
用プリズム28と反応容器26とを接着するシリコンゴム系
接着剤であっても良い。また、全反射吸収用プリズム28
の下面のうち測定溶液40と接する領域以外の領域に金属
（例えば、アルミニウム、金、など）を蒸着して、この
蒸着膜をパッキン27としても良い。

反応容器26は、測定溶液40（具体的には、基質溶液お
よび酵素溶液）を容れるための容器である。全反射吸収
用プリズム28に接する反応容器26の側面には、測定溶液
40と全反射吸収用プリズム28の下面とを接触させるため
の孔が設けられており、その孔は、パッキン27に設けら
れた孔と対応する位置にある。反応容器26の材質は、テ
フロンまたは表面をテフロン・コーティングしたアルミ
ニウムが好ましい。なお、この反応容器26の内部空間と
赤外分光光度計試料室２の内部空間とは物理的に遮断さ
れており、測定溶液40と赤外分光光度計試料室２とは直
接接触することはない。

反応容器26内には、攪拌回転子22が設けられている。
この撹拌回転子22は、反応容器26内における酵素反応を
条件を一定にするために測定溶液40を一定速度で撹拌す
るためのものであり、磁気式撹拌装置本体21の指示によ
り回転し、また、その回転速度は、磁気式撹拌装置制御
部20により一定速度に制御される。なお、電源34は、磁
気式撹拌装置制御部20に電力を供給するためのものであ
る。

反応容器26の他の側面には、パネルヒータ24が設けら
れている。このパネルヒータ24は、反応容器26内におけ
る酵素反応の温度条件を一定にするために、測定溶液40
を一定温度に保つためのものである。また、反応容器26
内には、温度センサ25が設けられている。この温度セン
サ25は、反応容器26内の測定溶液40の温度を測定するた
めのものである。また、温度制御装置23は、温度センサ
25により測定された反応容器26内の測定溶液40の温度に
基づいてパネルヒータ24を制御して、反応容器26内の測
定溶液40の温度を所定値に維持するためのものである。
なお、電源35は、温度制御装置23に電力を供給するため
のものである。

また、反応容器26には、空気排出部29、溶液供給用パ
イプ30および溶液排出用パイプ31それぞれが接続されて
いる。

空気排出部29は、反応容器26内へ各種溶液が供給され
る時に反応容器26内部より押し出される空気を排出する
ためのものであり、反応溶液26の内部空間から赤外分光
光度計試料室２の外部まで導かれており、その途中に電
磁弁13が設けられている。

溶液供給用パイプ30は、洗浄液、基質溶液、酵素溶液
および停止液それぞれを供給するためのパイプである。
この溶液供給用パイプ30には、洗浄液を供給するための
洗浄液供給部15、基質溶液を供給するための基質溶液供
給部16、酵素溶液を供給するための酵素溶液供給部17、
および、停止液を供給するための停止液供給部18それぞ
れが、電磁弁８乃至11それぞれを介し、更に電磁弁12を
介して接続されている。

溶液排出用パイプ31は、反応容器26内の測定溶液40を
排出するためのパイプであり、電磁弁14を介して、溶液
排出部19に接続されている。この溶液排出部19は、反応
容器内26内部の測定溶液40を吸引することにより、測定
溶液40を排出する。

これら電磁弁８乃至14、洗浄液供給部15、基質溶液供
給部16、酵素溶液供給部17、停止液供給部18および溶液
排出部19は、制御・電源供給ライン38を介して演算・制
御用コンピュータ７に接続されており、演算・制御用コ
ンピュータ７より制御される。電源33は、演算・制御用
コンピュータ７に電力を供給するためのものである。
尚、洗浄液供給部15、基質溶液供給部16、酵素溶液供給
部17および停止液供給部18それぞれは、演算・制御用コ
ンピュータ７の指示に基づいて、一定量の各溶液を溶液
供給用パイプ30に送り出した後、空気または不活性気体
（例えば窒素ガス等）を一定量送り出し、溶液供給用パ
イプ30内に各溶液が残ることなく定量的に反応容器26内
部に各溶液を供給できる構造となっている。

図２は、反応容器26、パッキン27および全反射吸収用
プリズム28を斜め上方から見たときの斜視図であり、図
３は、全反射吸収プリズム28の下面に垂直な面で切断し
たときのこれらの断面図である。なお、これらの図は、
反応容器26、パッキン27および全反射吸収用プリズム28
それぞれの実際の配置の方位を示している。

これらの図に示すように、反応容器26の一方の側面に
は孔が設けられており、その孔が全反射吸収用プリズム
28のテフロン・コーティングされた面で塞がれる構造と
なっている。反応容器26の下部には磁気式攪拌装置21が
設けられ、また、反応容器26内には攪拌回転子22が設け
られている。また、空気排出部29、溶液供給用パイプ30
および溶液排出用パイプ31は、反応容器26の上方より、
反応容器26の内部空間に導かれており、そのうち、空気
排出部29および溶液供給用パイプ30それぞれの先端は、
反応容器26内部空間の上面近傍まで導かれ、溶液排出用
パイプ31の先端は、反応容器26の内部空間の底面近傍ま
で導かれている。

次に、上記構成の酵素反応測定装置を用いた酵素反応
測定方法を説明する。図４は上記構成の装置における測
定動作のフローチャートの一例である。以下、図４に従
って測定動作を説明する。なお、図４は、測定検体数が
５検体であって、各検体毎に酵素反応を１分間隔で11回
測定するためのフローチャートである。また、以下の処
理は、演算・制御用コンピュータ７の指示に従って行わ
れるものである。

先ず、ステップS1では、安定した測定を行うために、
装置の全ての電源32乃至35は予め測定開始前にオンにさ
れ、装置は初期化設定される。すなわち、赤外分光光度
計試料室２内は予め乾燥空気または窒素でパージされ、
温度制御装置23により反応容器26内の反応温度が設定さ
れ、磁気式攪拌装置制御部20により攪拌回転子22の撹拌
速度が設定される。また、演算・制御用コンピュータ７
において、検体数Ｓを数えるカウンタ及び測定回数Ｎを
数えるカウンタそれぞれは値０に初期化される。なお、
この時点において、本装置の全ての電磁弁８乃至14は閉
じられている。

続くステップS2では、電磁弁13、電磁弁12及び電磁弁
９それぞれが開かれ、基質溶液供給部16より一定量の基
質溶液が溶液供給用パイプ30を通して反応容器26内に供
給され、その後、一定量の窒素ガスが供給されて、定量
的に基質溶液が反応容器26内に供給された後、電磁弁９
および電磁弁12が閉じられる。ステップS3では、反応容
器26内の基質溶液が設定温度になるよう、装置は10分間
放置される。

次にステップS4では、基質溶液のみの赤外吸収スペク
トルがバックグランドとして測定される。すなわち、赤
外光源３から出射した赤外入射光36が全反射吸収用プリ
ズム28の入射面に入射し、その赤外光は全反射吸収用プ
リズム28の上面および下面の間で全反射しながら伝搬
し、全反射吸収用プリズム28の出射面から出射した赤外
透過光37の各波長成分が分光器４により選択されて赤外
光検出器５により検出される。

このとき、全反射吸収用プリズム28の下面は反応容器
26内の基質溶液と接しているので、赤外光が全反射吸収
用プリズム28の下面で全反射すると、そのエバネセント
が基質溶液に発生する。しかも、全反射吸収用プリズム
28の上面および下面の間で赤外光は全反射を繰り返すの
で、全反射吸収用プリズム28の下面と基質溶液とが接す
る広い領域に亘ってエバネセントが発生する。したがっ
て、全反射吸収プリズム28の出射面から出射された赤外
透過光37は、基質溶液による吸収の影響を強く受けたも
のとなる。ステップS5では、このようにして得られたバ
ックグランドの赤外吸収スペクトルのデータが、制御部
６を経て演算・制御用コンピュータ７に転送される。

次にステップS6では、電磁弁12および電磁弁10が開か
れ、酵素溶液供給部17より一定量の検体である酵素溶液
が溶液供給用パイプ30を通して反応容器26内に供給さ
れ、その後、一定量の窒素ガスが供給されて、定量的に
基質溶液が反応容器26内に供給される。その後、電磁弁
10および電磁弁12は閉じられる。

次にステップS7では、基質溶液と酵素溶液とが混合さ
れた測定溶液40について赤外吸収スペクトルが測定され
る。その測定は、ステップS4の場合とほぼ同様である。
ただし、ステップS7における測定対象は、基質溶液と酵
素溶液とが混合された測定溶液40であって、攪拌回転子
22により一定回転測度で攪拌されて懸濁状態となってい
る。しかし、このような場合であっても、赤外光が全反
射吸収用プリズム28の下面で全反射すると、そのエバネ
セントが測定溶液40内に発生する。この場合、全反射吸
収用プリズム28の出射面から出射された赤外透過光37
は、基質と酵素との反応により減少した基質の影響を受
けたものとなる。

ステップS8では、ステップS7で測定されたスペクトル
データが、制御部６を経て演算・制御用コンピュータ７
に転送される。そして、演算・制御用コンピュータ７に
より、そのスペクトルデータとステップS5で既に転送さ
れたバックグランド・スペクトルデータとの差が求めら
れる。

次にステップS9では、装置は１分間放置され、ステッ
プS10では、測定回数カウンタＮと値10とが大小比較さ
れ、測定回数カウンタＮが値10以下である場合にはステ
ップS11に進み、そうでない場合にはステップS12に進
む。ステップS11では、測定回数カウンタＮに値１が加
算され、ステップS7のスペクトル測定に戻る。すなわ
ち、ステップS7乃至S11からなるループにおいて、測定
溶液40についてスペクトルデータが１分毎に計11回測定
され、かつ、そのスペクトルデータとバックグランド・
スペクトルデータとの差が求められる。

ステップS12では、電磁弁14が開かれ、溶液排出部19
により反応容器26内の測定溶液40が排出される。ステッ
プS13では、電磁弁12及び電磁弁８が開かれ、洗浄液供
給部15より洗浄液が溶液供給用パイプ30を通して反応容
器26に供給され、反応容器26内が十分に洗浄された後、
電磁弁13が閉じられる。そして、一定量の窒素ガスが供
給され、反応容器26内にある洗浄液が完全に排出された
後、電磁弁８、電磁弁12および電磁弁14が閉じられる。
以上で、１検体について測定が終了する。

次にステップS14では、検体数カウンタＳと値５とが
比較され、検体数カウンタＳが値５未満の場合には、ス
テップS15に進み、そうでない場合には、測定は全て終
了する。ステップS15では、測定回数カウンタＮが値０
に設定されるとともに、検体数カウンタＳに値１が加算
され、ステップS2に戻る。すなわち、ステップS2乃至S1
5からなるループにおいて、５検体それぞれにつき、測
定溶液40についてスペクトルデータが１分毎に計11回測
定され、かつ、そのスペクトルデータとバックグランド
・スペクトルデータとの差が求められる。

したがって、以上の操作が行われることにより、演算
・制御用コンピュータ７には、５検体の酵素による酵素
反応による赤外吸収スペクトルの１分ごとの変化が得ら
れ、その変化量より各酵素の酵素活性の解析が可能とな
り、また、赤外吸収スペクトルの経時変化より各酵素の
反応速度論的解析が可能となる。

次に、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、
本発明は、その要旨を超えない限り以下の実施例に限定
されるものではない。以下に上記の装置で測定した酵素
反応測定の実施例を示す。

使用された試薬は、オリーブ油（リパーゼ測定用特
製試薬）、ナカライテスク社製、ポリビニルアルコー
ル（クラレポバール、PVA−117）クラレ社製、ポリビ
ニルアルコール（クラレポバール、PVA−205）、クラレ
社製、および、リパーゼOF（360,000U/g）、名糖産業
社製、である。

ポリビニルアルコール溶液の調製は以下のように行わ
れた。すなわち、ポリビニルアルコール（クラレポバー
ル、PVA−117）18.5gとポリビニルアルコール（クラレ
ポバール、PVA−205）1.5gとが、500ml程度のMilliQ水
と混合されて、スターラーで撹拌され、その後、オート
クレーブ（121℃、２〜３分間）処理され、更にスター
ラーで撹拌されて完全に溶解された。そして、この混合
液は、室温まで冷却された後、MilliQ水が加えられて総
量１リットルとされ、さらに撹拌された後、濾過されて
室温保存された。

酵素溶液用バッファ（0.1Mりん酸バッファ）の調製は
以下のように行われた。すなわち、りん酸二水素ナトリ
ウム（無水）2.4gがMilliQに溶解されて、最終的に200m
lのMilliQ水とされた。また、りん酸水素二ナトリウム
（無水）7.1gがMilliQ水に溶解されて、最終的に500ml
のMilliQ水とされた。次に、上記りん酸二水素ナトリウ
ム溶液200mlは、容量500mlあるいは１リットルのビーカ
に容れられて、pHメータにセットされ、これにりん酸水
素二ナトリウム溶液が加えれらて、pHが7.0になるよう
設定された。そして、これが濾過されて冷蔵保存され
た。

オリーブ油エマルションの調製は以下のように行われ
た。すなわち、オリーブ油（リパーゼ測定用特製試薬）
20mlとポリビニルアルコール溶液60mlとが、容量150ミ
リリットルの容器に計り取られ、その容器の周りが氷で
おおわれて冷却されながら、撹拌機で撹拌（2000回転／
分で10分間）された後、氷冷下で１時間放置された。

酵素溶液の調製は以下のように行われた。すなわち、
リパーゼOF（360,000U/g）0.028gが計り取られ、容量10
mlのプラスチック試験管に入れて、これに酵素溶液用バ
ッファ10mlが加えられ、泡立たないようにして転倒混和
（1,000U/ml）されて、氷冷保存された。

そして、以上のようにして調整された基質溶液（オリ
ーブ油エマルション溶液、酵素溶液用バッファ）および
酵素溶液について、本実施形態に係る酵素反応測定装置
および装置により酵素反応が測定された。なお、反応容
器26内の測定溶液40の温度は、温度制御装置23、パネル
ヒータ24および温度センサ25により、37℃に設定され
た。また、攪拌回転子22の撹拌速度は、磁気式攪拌装置
制御部20および磁気式攪拌装置本体21により、約1000回
転／分に設定された。

まず、反応容器26内に、基室溶液としてオリーブ油エ
マルション溶液2mlおよび酵素溶液用バッファ1.6mlが供
給され、10分間放置された後、バックグランド測定さ
れ、バックグランド・スペクトルデータが得られた。次
に、反応容器26内に、酵素溶液0.4mlが供給され、20分
間に亘り１分間隔で計21回、スペクトル測定され、赤外
吸収スペクトルデータが得られた。

そして、酵素溶液と基質溶液とが混合された測定溶液
についての赤外吸収スペクトルデータは、バックグラン
ド・スペクトルデータが差し引かれ、酵素反応の反応速
度は、この結果に基づいて得られる。図５は、バックグ
ランドが減算された赤外吸収スペクトルのうち、波数17
45cm^-1における吸光度の変化を示すものである。本実施
形態に係る酵素反応測定装置による測定結果は、別個に
滴定法によって測定した結果とも良く一致し、本装置を
用いて酵素反応の測定が可能であることがわかる。

産業上の利用可能性以上のように本発明に係る酵素反応測定方法及びその
測定装置は、測定溶液が濁度を持つ場合や基質が水溶性
でない場合であっても、基質と生成物とを分離すること
なく、簡便な操作で連続的に、信頼性の高い酵素反応の
測定が可能となる。したがって、本発明に係る酵素反応
測定方法及びその測定装置は、臨床検査の場において、
血液中や尿中の或種の酵素活性を測定することによる病
気の診断や、血液中のリパーゼ活性を測定することによ
る膵疾患の判定に用いるのに好適であり、また、油脂化
学工業等の工業プロセスにおいても、油脂とリパーゼと
の反応速度の測定に好適に用いられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 21/75 G01N 21/27 G01N 21/78 G01N 21/75 - 21/78

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】エステル結合の加水分解反応を触媒する酵
素と基質とを含む測定溶液を一定温度の下で撹拌し、前
記測定溶液に一方の面が接して配された全反射吸収用プ
リズムの当該一方の面と前記測定溶液との界面に前記全
反射吸収用プリズムの側から赤外光を入射させて全反射
させ、その全反射された赤外光のスペクトルを測定して
赤外線吸収スペクトルまたは吸光度の変化を求め、前記
測定溶液中の酵素反応を測定することを特徴とする酵素
反応測定方法。
【請求項２】前記酵素がカルボン酸エステル加水分解酵
素であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の酵素
反応測定方法。
【請求項３】前記酵素がリパーゼであることを特徴とす
る請求の範囲第１項記載の酵素反応測定方法。
【請求項４】基質溶液と酵素溶液とが混合されてなる測
定溶液を容れる反応容器と、前記基質溶液を前記反応容器内に供給する基質溶液供給
手段と、前記酵素溶液を前記反応容器内に供給する酵素溶液供給
手段と、前記測定溶液の温度を制御する温度制御手段と、前記測定溶液を撹拌する攪拌手段と、前記測定溶液に一方の面が接して配された全反射吸収用
プリズムと、前記全反射吸収用プリズムの前記一方の面と前記測定溶
液との界面で全反射するように赤外光を前記全反射吸収
用プリズムに入射させる赤外光源と、前記全反射吸収用プリズムから出射された赤外光のスペ
クトルを測定する赤外光検出手段と、前記赤外光検出手段により測定された前記赤外光のスペ
クトルに基づいて赤外吸収スペクトルあるいは吸光度の
変化を求めて、前記測定溶液中の酵素反応を測定する演
算部と、を備えることを特徴とする酵素反応測定装置。
【請求項５】前記反応容器内の前記測定溶液を排出する
溶液排出手段と、前記反応容器内を洗浄する洗浄液を前記反応容器内に供
給する洗浄液供給手段と、を更に備えることを特徴とする請求の範囲第４項記載の
酵素反応測定装置。
【請求項６】前記全反射吸収用プリズムは、少なくとも
前記測定溶液に接触する領域がテフロン・コーティング
されていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の酵
素反応測定装置。