WO1997032198A1 - Procede et appareil pour le dosage de reactions enzymatiques - Google Patents

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WO1997032198A1
WO1997032198A1 PCT/JP1997/000513 JP9700513W WO9732198A1 WO 1997032198 A1 WO1997032198 A1 WO 1997032198A1 JP 9700513 W JP9700513 W JP 9700513W WO 9732198 A1 WO9732198 A1 WO 9732198A1
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solution
enzyme
reaction
prism
measurement
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PCT/JP1997/000513
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shigetoshi Okazaki
Hiroyuki Matsumoto
Original Assignee
Laboratory Of Molecular Biophotonics
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Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring an enzyme reaction and a device for measuring the enzyme reaction, in which a reaction is carried out by supplying a substrate solution and an enzyme solution into a reaction vessel, and the enzyme reaction is continuously observed by infrared spectroscopy.
  • Enzymes are a type of catalyst produced by living organisms, and are mainly composed of proteins.
  • the reactants of a reaction catalyzed by an enzyme are called substrates.
  • Enzymes corresponding to almost all reactions in the living body exist, and these enzymatic reactions are carried out smoothly under mild conditions in the living body, which contributes to the maintenance of life. Therefore, a decrease in the activity (enzyme activity) of an enzyme involved in the in vivo reaction may cause a disease, so that a diagnosis of the disease can be made by measuring the activity of a certain enzyme in blood or urine.
  • it is widely used in clinical laboratories.
  • Lipase is used to decompose fats and oils.
  • Lipase is an enzyme that hydrolyzes glycerol esters of long-chain fatty acids (triglycerides).
  • triglycerides long-chain fatty acids
  • Measuring an enzymatic reaction measures the quantitative and temporal changes in each of the substrate, which is the reactant of the reaction catalyzed by the enzyme, and the products produced by the reaction. Is Rukoto. That is, the greater the rate at which the substrate is converted to the product, the greater the enzymatic activity. Conversely, the smaller the ratio, the lower the enzyme activity. Also, by measuring the change of the substrate to the product over time, it becomes possible to analyze the reaction rate of the enzyme reaction.
  • the method of measuring the quantitative change of a substrate and a product has been to discriminate using differences in the physical or chemical properties of the substrate and the product to measure the quantitative change of each.
  • a method in which the color of a substrate or a product is specifically developed and colorimetrically quantified after termination of an enzyme reaction to determine the amount of substrate or product extinction (colorimetric method)
  • radioisotope By using a compound labeled with an element (radioactive compound) as a substrate and utilizing the fact that the product generated by the enzymatic reaction becomes another radioactive compound, each radioactive compound is separated and the amount of radioactivity is measured.
  • the colorimetric Jt method requires the reaction of a coloring reagent in order to specifically develop a substrate or product after the enzyme reaction is stopped. The reaction cannot be measured. Further, when the substrate is a water-suspended rinsing solution, it is difficult to transmit light, and there is a problem that sufficient measurement cannot be performed.
  • the titration method can measure without separating the substrate and the product after stopping the enzyme reaction, but has the problem that continuous enzyme reaction cannot be measured.
  • the dodgability measurement method is easy to operate and enables continuous measurement of the enzymatic reaction.
  • this method has a problem in reliability because the enzyme reaction itself is not observed.
  • spectroscopic measurement is a useful tool in that enzyme reactions can be measured simply and continuously without separating substrates or products.
  • the solution to be measured has turbidity, especially when the substrate is not water-soluble, there is a problem that it is difficult to perform a constant measurement.
  • the ivy sample There was no application example for the ivy sample.
  • the measurement wavelength is from the ultraviolet region to the visible region, the influence of the rinsing degree is large.
  • the measurement wavelength is infrared light
  • the effect of turbidity is rather small, but in the infrared region, the absorption of water as a solvent is large, and the force using a cell with a thickness of several hundred microns is total reflection.
  • Absorption method (Jiro Hiraishi)
  • the present invention has been made to eliminate the above-mentioned essential problems based on a spectroscopic measurement method, and does not require separation of a substrate and a product, is easy to operate, enables continuous measurement of an enzyme reaction, and It is an object of the present invention to provide an enzyme reaction measuring method and a measuring device capable of measuring an enzyme reaction with high reliability. Disclosure of the invention
  • the method for measuring an enzyme reaction comprises the steps of: * stirring a measurement solution containing an enzyme and a substrate at a constant temperature; and agitating a total reflection absorption prism disposed in contact with the measurement solution and an interface between the measurement solution and the prism.
  • Infrared light is incident from the side of the reflection / absorption prism and totally reflected.
  • the spectrum of the totally reflected infrared light is measured to determine the change in the infrared absorption spectrum or absorbance, and the measurement solution is measured. It is characterized by measuring an enzymatic reaction therein.
  • the enzyme is characterized in that it catalyzes a hydrolysis reaction of an ester bond, and is a carboxylate hydrolase or a lipase.
  • the enzyme reaction measuring device comprises: a reaction container containing a measurement solution in which a substrate solution and an enzyme solution are mixed; a substrate solution supply means for supplying the substrate solution into the reaction container; An enzyme solution supply means for supplying the reaction solution into the reaction vessel, a temperature control means for controlling the temperature of the measurement solution, a stirring means for stirring the measurement solution, a prism for total reflection absorption arranged in contact with the measurement solution; An infrared light source that causes infrared light to enter the total reflection / absorption prism so as to be totally reflected at the interface between the reflection / absorption prism and the measuring solution; and a spectrum of infrared light emitted from the total reflection / absorption prism. An infrared light detection means for measuring the infrared absorption spectrum or the change in absorbance based on the infrared light spectrum measured by the infrared light detection means.
  • a calculation unit for measuring the reaction It is characterized by having.
  • the substrate solution and the enzyme solution supplied from the substrate solution supply means and the enzyme solution supply means to the reaction solution are mixed in the reaction solution to form a measurement solution, and the measurement solution is controlled by the temperature control means. It is controlled at a constant temperature and is conveniently stirred by a stirring means.
  • the infrared light emitted from the infrared light source is applied to the total reflection / absorption prism at the interface between the total reflection / absorption prism arranged in contact with the measurement solution and the measurement solution.
  • the spectrum of the infrared light emitted from the prism for total reflection and absorption after being totally reflected after being incident from the side of the prism is measured by the infrared light detecting means.
  • the enzyme reaction in the measurement solution is measured. Therefore, even when the measurement solution has a high degree of concentration or the substrate is not water-soluble, the enzyme reaction can be continuously and reliably measured by a simple operation without separating the base S from the product. Becomes possible.
  • the enzyme reaction measuring device further comprises: a solution discharging means for discharging the measuring solution in the reaction vessel; and a cleaning liquid supply means for supplying a cleaning liquid for cleaning the inside of the reaction vessel to the reaction vessel ⁇ . It is characterized by. As a result, after the measurement of one enzyme reaction is completed, the measurement solution in the reaction vessel ⁇ is discharged by the solution discharging means, and the inside of the reaction vessel is washed by the cleaning liquid supplied by the cleaning liquid supply means. Therefore, measurement of the next enzymatic reaction can be continued.
  • the prism for total reflection and absorption is characterized in that at least a region in contact with the measurement solution is coated with Teflon. This prevents the substrate in the measurement solution from depositing on the prism for total reflection absorption.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of an enzyme reaction measuring device S according to the present invention
  • FIG. 2 is a perspective view of a reaction container of the present device
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of a reaction container of the present device.
  • FIG. 4 is a flowchart of the measurement operation of the main snow cover
  • FIG. 5 is a diagram showing the result of the hydrolysis reaction of olive oil by lipase using the present apparatus.
  • FIG. 1 is a configuration diagram showing an embodiment of an enzyme reaction measurement device according to the present invention.
  • a cross-sectional view of a reaction vessel 26 is shown.
  • an infrared spectrophotometer using a spectroscope is shown, but an infrared spectrophotometer using a Fourier transform type or a combination of a light source that emits light of only a target wavelength and a detector is used. But it is good.
  • This enzyme reaction measurement device mainly includes an infrared spectrophotometer main body 1 and an infrared spectrophotometer sample chamber 2, and further includes a supply section 15 to 1 for a washing solution, a substrate solution, an enzyme solution, and a stop solution. It also has 8 mag. Inside the infrared spectrophotometer main body 1, an infrared light source 3, a spectroscope 4, an infrared light detector 5, and a control unit 6 for controlling these are built in. Further, inside the sample chamber 2 of the infrared spectrophotometer, a reaction vessel 26 and a prism 28 for total reflection absorption are mainly stored.
  • the infrared light source 3 is a light source that emits infrared light.
  • the infrared incident light 36 emitted from the infrared light source 3 is incident on the incident surface of the prism 28 for total reflection absorption.
  • the prism 28 for total reflection and absorption has an upper surface and a lower surface (the surface on the side of the reaction vessel 26) parallel to each other, and the entrance surface and the exit surface are formed oblique to these surfaces.
  • the infrared light incident on the incident surface of the prism 28 for total reflection absorption propagates between the upper surface and the lower surface of the prism 28 for total reflection absorption while repeating total reflection, and exits from the light exit surface.
  • the prism 28 for total reflection absorption is most preferably made of ZnSe having a large refractive index, and is also preferably made of Ge or Si.
  • the incident angle of the infrared light to the lower surface of the prism 28 for total reflection absorption is preferably in the range of 40 degrees to 60 degrees, particularly preferably 45 degrees. Note that the smaller the difference between the refractive index of the prism 28 for total reflection and absorption and the refractive index of the measurement solution 40, the smaller the difference between the measurement solution 4 The permeation of evanescent generated during the deepening becomes deep, and the infrared absorption spectrum by the substrate is enhanced.
  • the prism 28 for total reflection absorption preferably has at least a region of the lower surface thereof that is in contact with the measurement solution 40, which is coated with Teflon '.
  • Teflon By coating with Teflon in this manner, the substrate in the measurement solution 40 can be prevented from being deposited on the prism 28 for absorbing total reflection.
  • infrared light is The penetration depth of the evanescent wave generated in the measurement solution 40 when totally reflected by the lower surface of the rhythm 28 is about 1/5 to 17 of the wavelength of the infrared light, and the target wavelength Is about 7 ⁇ , so that the thickness of the Teflon 'coating needs to be several hundred nm or less in order for the evanescent infrared light to reach the measurement solution 40.
  • the spectroscope 4 selects a target wavelength component of the infrared transmitted light 37, and the infrared light detector 5 detects the target wavelength component and outputs a signal corresponding to the intensity. Then, the signal detected by the infrared light detector 5 is transferred to the arithmetic and control computer 7 via the control unit 6 and the data transfer line 39.
  • the light source 32 supplies power to each of the infrared light source 3, the spectroscope 4, the infrared light detector 5, and the control unit 6 in the infrared spectrophotometer main body 1.
  • the total reflection / absorption prism 28 is attached to the reaction vessel 26 via a packing 27, and a partial area on the lower surface of the total reflection / absorption prism 28 is a measurement solution contained in the reaction vessel 26. Touch 4 0.
  • the packing 27 is provided with a hole at the center in order to define the area of the region where the total reflection absorbing prism 28 and the measurement solution 40 are in contact with each other.
  • the packing 27 preferably has no absorption in the wavelength region to be measured, that is, a material that does not contain an ester group and a carboxyl group and is made of a material (for example, silicon rubber or Teflon).
  • the packing 27 may be a silicone rubber-based adhesive for bonding the prism 28 for total reflection and absorption to the reaction vessel 26.
  • a metal for example, aluminum, gold, or the like
  • the reaction vessel 26 is a vessel for containing the measurement solution 40 (specifically, a substrate solution and an enzyme solution). Side view of reaction vessel 2 6 in contact with prism 28 for total reflection absorption A hole for contacting the measurement solution 40 and the lower surface of the total reflection / absorption prism 28 is provided in the hole, and the hole is located at a position corresponding to the hole provided in the packing 27.
  • the material of the reaction vessel 26 is preferably Teflon or aluminum whose surface is coated with Teflon. The internal space of the reaction vessel 26 and the internal space of the infrared spectrophotometer sample chamber 2 are physically blocked, and the measurement solution 40 and the infrared spectrophotometer sample chamber 2 are in direct contact with each other. None.
  • the reaction vessel 26 is provided with an S stirring rotor 22.
  • the stirring rotor 22 is used to stir the measurement solution 40 at a constant speed in order to stabilize the conditions of the enzyme reaction in the reaction vessel 26 ⁇ . It rotates according to the instruction, and its rotation speed is controlled to a constant speed by the magnetic stirring device control unit 20.
  • the source 34 is for supplying power to the magnetic stirrer control unit 20.
  • a panel heater 24 is provided on the other side of the reaction vessel 26 .
  • the panel heater 24 is for keeping the measurement solution 40 at a constant temperature in order to keep the temperature conditions of the enzyme reaction in the reaction vessel 26 ⁇ constant.
  • a temperature sensor 25 is provided in the reaction vessel 26.
  • the temperature sensor 25 is for measuring the temperature of the measurement solution 40 in the reaction vessel 26.
  • the temperature controller 23 controls the panel heater 24 based on the temperature of the measurement solution 40 of the reaction vessel 26 measured by the temperature sensor 25 to control the measurement solution 4 in the reaction vessel 26. This is for maintaining the temperature of 0 at a predetermined value.
  • the power supply 35 is for supplying senile to the temperature control device 23.
  • the reaction vessel 26 is connected to an air discharge section 29, a solution supply pipe 30, and a solution discharge pipe 31.
  • the air discharge part 29 is for discharging air pushed out from the inside of the reaction vessel 26 when various solutions are supplied to the reaction vessel 26 ⁇ , and infrared spectroscopy is performed from the partial space of the reaction solution 26. It is led to the outside of the photometer sample chamber 2 and a solenoid valve 1 3 Is provided.
  • the solution supply pipe 30 is a pipe for supplying a washing solution, a substrate solution, an enzyme solution, and a stop solution, respectively.
  • the solution supply pipe 30 includes a cleaning solution supply unit 15 for supplying a cleaning solution, a substrate solution supply unit 16 for supplying a substrate solution, and an enzyme solution supply unit 17 for supplying an enzyme solution.
  • a stop fluid supply unit 18 for supplying the stop fluid are connected via solenoid valves 8 to 11 and further via a solenoid valve 12.
  • the solution discharge pipe 31 is a pipe for discharging the measurement solution 40 in the reaction vessel 26, and is connected to the solution discharge section 19 via a solenoid valve 14.
  • the solution discharge section 19 discharges the measurement solution 40 by sucking the measurement solution 40 inside the reaction vessel # 26.
  • FIG. 2 is a perspective view of the reaction vessel 26, the packing 27, and the total reflection / absorption prism 28 when viewed obliquely from above.
  • FIG. 3 is a view perpendicular to the lower surface of the total reflection / absorption prism 28. It is these sectional views when it cut
  • a magnetic stirring device 21 is provided below the reaction vessel 26, and a stirring rotor 22 is provided inside the reaction vessel 26.
  • the air discharge section 29, the solution supply pipe 30 and the solution discharge pipe 31 are guided from above the reaction vessel 26 to the internal space of the reaction vessel 26, and the air discharge section 2
  • the tip of each of the pipe 9 and the solution supply pipe 30 is led to near the upper surface of the internal space of the reaction vessel 26, and the tip of the solution discharge pipe 31 is led to near the bottom of the internal space of the reaction vessel 26. Has been.
  • FIG. 4 is an example of a flowchart of a measurement operation in the apparatus having the above configuration.
  • the measurement operation will be described with reference to FIG.
  • FIG. 4 shows a flow chart for measuring the enzyme reaction once at one-minute intervals for each of the five measurement samples. Further, the following processing is performed in accordance with an instruction from the arithmetic and control computer 7.
  • step S1 all the sources 32 to 35 of the device S are turned on in advance before the measurement is started, and the device is initialized to perform a stable measurement. That is, the infrared spectrophotometer sample chamber 2 ⁇ is previously purged with dry air or nitrogen, the reaction temperature in the reaction vessel 26 is set by the temperature control device 23, and the magnetic stirrer control unit 20 sets the reaction temperature in the reaction container 26. The stirring speed of the stirring rotor 22 is set. Further, in the arithmetic control unit 7, the counter for counting the number of samples S and the counter for counting the number of measurements N are each initialized to a value of zero. At this point, all the solenoid valves 8 to 14 of the present device are closed.
  • step S 2 the solenoid valves 13, 12 and 9 are opened, and a certain amount of the substrate solution is supplied from the substrate solution supply section 16 through the solution supply pipe 30 to the reaction vessel 26. After that, a certain amount of nitrogen gas is supplied and quantitatively After the substrate solution is supplied into the reaction vessel 26, the solenoid valves 9 and 12 are closed.
  • step S3 the apparatus is left for 10 minutes so that the substrate solution in the reaction vessel 26 reaches the set temperature.
  • step S4 the infrared absorption spectrum of only the substrate solution is measured as a background. That is, the infrared incident light 36 emitted from the infrared light source 3 is incident on the incident surface of the total reflection / absorption prism 28, and the infrared light is totally transmitted between the upper surface and the lower surface of the total reflection / absorption prism 28.
  • Each wavelength component of the infrared transmitted light 37 that propagates while being reflected and emitted from the emission surface of the total reflection absorption prism 28 is selected by the spectroscope 4 and detected by the infrared light detector 5.
  • step S5 the data of the background infrared absorption spectrum obtained in this manner is transferred to the computing / control computer 7 via the control unit 6.
  • step S6 the solenoid valve 12 and the magnetic valve 10 are opened, and a certain amount of the enzyme solution, which is a sample, is supplied from the enzyme solution supply section 17 through the solution supply pipe 30 into the reaction vessel 26. After that, a certain amount of nitrogen gas is supplied, and the substrate solution is supplied quantitatively into the reaction vessel 26. Thereafter, the magnetic shunt valve 10 and the solenoid valve 12 are closed.
  • step S7 an infrared absorption spectrum is measured for the measurement solution 40 in which the substrate solution and the enzyme solution are mixed.
  • the measurement is almost the same as in step S4.
  • the measurement target in step S7 is a substrate solution and an enzyme solution.
  • Is a mixed solution 40 which is agitated at a constant rotation speed by a conventional stirring rotor 22 and is in a suspended state.
  • the infrared light is totally reflected by the lower surface of the total reflection / absorption prism 28, the evanescent light is generated in the measurement solution 40 °.
  • the infrared transmission light 37 emitted from the emission surface of the total reflection absorption prism 28 is affected by the substrate that has been reduced by the reaction between the substrate and the enzyme.
  • step S8 the spectrum data measured in step S7 is transferred to the control computer 7 via the control unit 6.
  • the difference between the spectrum data and the background spectrum data already transferred in step S5 is obtained by the arithmetic and control computer 7.
  • step S9 the apparatus is left for 1 minute, and in step S10, the measurement number counter N and the value 10 are compared in magnitude. Proceed to step SI1, otherwise proceed to step S12.
  • step SI1 the value 1 is added to the measurement number counter N, and the process returns to step S7 in which the spectrum is measured. That is, in the loop consisting of steps S7 to S11, the spectrum data of the measurement solution 40 is measured once every minute for a total of once, and the spectrum data and the background spectrum are measured. The difference from the data is required.
  • step S12 the electromagnetic valve 14 is opened, and the measurement solution 40 in the reaction vessel 26 is discharged by the solution discharge unit 19.
  • step S13 the solenoid valve 12 and the solenoid valve 8 are opened, and the cleaning liquid is supplied from the cleaning liquid supply section 15 to the reaction vessel 26 through the solution supply pipe 30, and the inside of the reaction vessel 26 is sufficiently filled.
  • the turtle valve 13 is closed.
  • the turtle magnet valve 8, the solenoid valve 12 and the solenoid valve 14 are closed. The measurement is completed for one sample.
  • step S14 the sample number counter S is compared with the value 5, and if the sample number counter S is less than the value 5, the process proceeds to step S15, otherwise, the measurement is performed. All the settings are completed.
  • step S15 the number-of-measurements counter N is set to 0, and the value 1 is added to the sample counter S, and the process returns to step S2. That is, in the loop consisting of steps S2 to S15, the spectrum data of the measurement solution 40 is measured once every minute for each of the five samples, and the spectrum data and the back-up data are measured. The difference from the ground spectrum data is required.
  • the arithmetic control computer 7 obtains a change of the infrared absorption spectrum every minute caused by the enzyme reaction of the five samples of the enzyme.
  • the enzyme activity of the enzyme can be analyzed, and the kinetic analysis of each enzyme can be performed based on the change over time in the infrared absorption spectrum.
  • the reagents used were: 1 Olive oil (special reagent for lipase measurement), manufactured by Nacalai Tesque, 2 Polyvinyl alcohol (Kuraray Povar, PVA-117), Kuraray 3 Polyvinyl alcohol (Kuraray Poval, PVA-205), Kuraray And Lipase OF (360,000 U / g), manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.
  • Preparation of the polyvinyl alcohol solution was performed as follows. That is, 18.5 g of polyvinyl alcohol (Kurarepovar, PVA-117) and 1.5 of polyvinyl alcohol (Kurarepovar, PVA-205) were mixed with about 500 ml of MilliQ water and stirred with a stirrer. Then, the mixture was autoclaved (121, 2-3 minutes) and further stirred with a stirrer to completely dissolve. After the mixture was cooled to room temperature, MilliQ water was added to make the total amount 1 liter. After stirring, the mixture was filtered and stored at room temperature.
  • the buffer for the enzyme solution (0.1 M phosphate buffer) was prepared as follows. That is, 2.4 g of sodium dihydrogen phosphate (anhydrous) was dissolved in MilliQ water to make a final 20 Om 1 MilliQ water. Also, disodium hydrogen phosphate (no (Water) 7.1 g was dissolved in MilliQ water to make up to 50 Om1 MilliQ water. Next, the sodium dihydrogen phosphate solution 20 Om1 was placed in a 5 OOml or 1 liter beaker and set in a pH meter, and the disodium hydrogenphosphate solution was added thereto. PH was set to 7.0. This was filtered and stored refrigerated.
  • Preparation of olive oil emulsion was performed as follows. Oribe oil (special reagent for lipase measurement) was measured in a container of 20 ml of polyvinyl alcohol solution, 6 Om 1 of polyvinyl alcohol solution, and 50 milliliter of capacity, and the container was covered with ice and stirred while being cooled. The mixture was stirred (2000 rpm for 10 minutes at Z minute) and left for 1 hour under ice-cooling.
  • Oribe oil special reagent for lipase measurement
  • Preparation of the enzyme solution was performed as follows. That is, 0.028 g of lipase OF (360,000 U / g) was weighed and placed in a plastic test tube having a capacity of 1 Om1, to which 1 Om1 of the enzyme solution buffer was added to prevent foaming. The mixture was mixed (l, OOOUZml) and stored on ice.
  • the enzyme reaction of the substrate solution (olive oil emulsion solution, enzyme solution buffer) and the enzyme solution prepared as described above was measured by the enzyme reaction measuring apparatus and the apparatus according to the present embodiment.
  • the temperature of the measurement solution 40 in the reaction vessel 26 was set to 37 ° by the temperature controller 23, the panel heater 24 and the temperature sensor 25.
  • the stirring speed of the stirring rotor 22 was set at about 1000 rpm by the magnetic stirring device * control unit 20 and the magnetic * stirring device main body 21.
  • the enzyme reaction measurement method and the measurement apparatus according to the present invention can be used without separating the substrate and the product even when the measurement solution has a high temperature or the substrate is not water-soluble. Continuous and highly reliable enzyme reaction measurement is possible with simple operation. Therefore, the enzyme reaction measuring method and the measuring device according to the present invention can be used in a clinical test site to diagnose a disease by measuring a certain enzyme activity in blood or urine or to measure lipase activity in blood. It is also suitable for use in the determination of knee disease by performing the method, and is also suitably used for measuring the reaction rate between fat and oil and lipase in industrial processes such as fat and oil chemical industry.

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Description

明 細 書 酵素反応測定方法及びその測定装置 技術分野
本発明は、 反応容器内に基質溶液と酵素溶液とを供給することにより反応を行 わせ、 その酵素反応を連続的に赤外分光法により観測する酵素反応測定方法及び その測定装置に関する。 背景技術
酵素は、 生物の生産する一種の触媒であり、 主に蛋白質からなっている。 酵素 が触媒する反応の反応物質は基質と呼ばれる。 生体内のほとんど全ての反応にそ れぞれ応じた酵素が存在しており、 それら酵素反応は、 生体内の穏和な条件下で 円滑に行われ、 生命の維持に役立っている。 従って、 生体内反応に関与している 酵素の働き （酵素活性） の低下は疾患の原因となり得るため、 血液や尿中のある 種の酵素の活性を測定することにより病気の診断を行うことが、 臨床検査の場で は広く行われている。
また、 酵素反応は、 基質特異性が高く、 省エネルギー型の工業プロセスとして も広く利用されている。 例えば、 油脂化学工業においては、 油脂の分解にリパー ゼが用いられている。 リパーゼは、 長鎖脂肪酸のグリセロールエステル （トリグ リセリ ド） を加水分解する酵素であり、 消化管内のリパーゼは、 主に膝臓に由来 し、 一部胃や腸からも分泌される。 膝疾患においては血中リパーゼ活性が上昇す ることが知られており、 血中のリパ一ゼ活性を測定することにより腌疾患の判定 がなされている。
酵素反応を測定することは、 酵素が触媒する反応の反応物質である基質および その反応によって生成される生成物それぞれの量的および時間的な変化を測定す ることである。 すなわち、 基質が生成物へと変化する割合が大きいほど酵素活性 は髙いことになる。 逆にその割合が小さいほど酵素活性は低いことになる。 また、 基質の生成物への変化を経時的に測定することで、 酵素反応の反応速度を解析す ることが可能となる。
従来より、 基質と生成物の量的な変化を測定する方法は、 基質と生成物の物理 的あるいは化学的性質の違いを利用して識別することにより、 それぞれの量的な 変化を測定している。 例えば、 （1) 酵素反応停止後に基質あるいは生成物を特異 的に発色させて比色定量することにより、 基質あるいは生成物の增滅量を求める 方法 （比色定量法） 、 （2) 放射性同位元素で標識された化合物 （放射性化合物） を基質として用い、 酵素反応により生じる生成物が別の放射性化合物となること を利用して、 それぞれの放射性化合物を分離し、 放射能量を測定することにより、 基質あるいは生成物の增滅量を求める方法、 （3) 酵素反応により生成した脂肪酸 を反応停止後に中和滴定する方法 （滴定法） 、 （4) 基質を水に懋獨させ、 酵素反 応により基質が分解されることによる基質溶液の渴度の変化を測定することによ り、 基質の增滅量を求める方法 （滞度測定法） 、 あるいは、 （5) 基質と生成物の 分光学的な違いを利用し、 それぞれの物質が特異的に吸収する波長の光 （吸収波 長） を用い、 吸光度の変化から基質あるいは生成物の增滅量を求める方法 （分光 学的測定法） などがある。 このうち特に、 分光学的測定法および濯度測定法は、 連続的に酵素反応を測定することが可能である。
しかし、 上記測定方法それぞれには以下のような問題点がある。 まず、 比色定 Jt法は、 酵素反応停止後に基質あるいは生成物を特異的に発色させるため発色試 薬を反応させなければならず、 操作が煩雑かつ測定に時間がかかり、 連続的な酵 素反応の測定を行うことができない。 さらに、 基質が水懸濯液である場合、 光を 透過させることが困難であり、 十分な測定が行えないという問題点がある。
放射性元素を用いる方法は、 酵素反応を停止させた後に基質あるいは生成物を 分離して、 放射能量を測定するために、 操作が煩雑であり測定に時間を要する上、 連続的な酵素反応の測定が不可能である。 また、 放射性同位体を使用するため、 安全面での問題点や使用する場所の制限が大きいという問題点がある。
滴定法は、 酵素反応停止後に基質と生成物を分離することなく測定可能である が、 連続的な酵素反応の測定ができないという問題点がある。
獨度測定法は、 操作が容易で酵素反応の連続的測定が可能であるが、 観測して いるものが、 基質自体ではなく、 懸濁している基質からの散乱光である。 したが つて、 この方法は、 酵素反応自体を観測していないため、 信頼性に問題がある。
—方、 分光学的測定法は、 基質あるいは生成物を分離することなく、 簡便かつ 連続的に酵素反応を測定することが可能であるという点で有用な手段である。 し かしながら、 測定する溶液が濁度を持つ場合、 特に基質が水溶性でない場合には、 定 S的な測定が困難であるという問題があり、 従来このような水溶液中で、 しか も溷つた試料での応用例は無かった。 特に測定波長が紫外領域から可視領域の場 合、 上記濯度の影響は大きいものである。 さらには測定波長が赤外光の場合には、 濁度による影響はむしろ小さくなるが、 赤外領域においては溶媒たる水の吸収が 大きく、 数百ミクロン程度の厚さのセルを用いる力 全反射吸収法 （平石次郎編
Γフーリエ変換赤外分光法」 学会出版センタ一、 （1985) pp. 163-171 ) を用いな ければならないことが知られている。
しかし、 分光学的測定法の酵素反応への応用に際しては、 酵素反応の撹拌速度 の依存性等のために厳密な撹拌が必要とされるが、 上記数百ミクロン程度の厚さ のセルでは撹捭が不可能であった。 さらに、 通常の全反射吸収法測定装置も、 撹 拌することができないため、 正確な酵素活性の測定ができないものであった。 本発明は、 分光学的測定法に基づく上記の本質的な問題をなくすためになされ たものであり、 基質と生成物との分離が不要、 操作が容易、 酵素反応の連続測定 が可能、 かつ、 信頼性の高い酵素反応の測定が可能な酵素反応測定方法及びその 測定装置を供給することを目的とするものである。 発明の開示
本発明に係る酵素反応測定方法は、 酵素と基質とを含む測定溶液を一定温度の 下で *拌し、 測定溶液に接して配された全反射吸収用プリズムと測定溶液との界 面に全反射吸収用プリズムの側から赤外光を入射させて全反射させ、 その全反射 された赤外光のスぺク トルを測定して赤外線吸収スぺク トルまたは吸光度の変化 を求め、 測定溶液中の酵素反応を測定することを特徴とする。
このようにすることによって、 測定溶液が濁度を持つ場合や基質が水溶性でな い場合であっても、 基質と生成物とを分離することなく、 簡便な操作で連続的に、 信頼性の高い酵素反応の測定が可能となる。
ここで、 酵素は、 エステル結合の加水分解反応を触媒することを特徴とするも のであり、 カルボン酸エステル加水分解酵素またはリパ一ゼである。
また、 本発明に係る酵素反応測定装置は、 基質溶液と酵素溶液とが混合されて なる測定溶液を容れる反応容器と、 基質溶液を反応容器内に供給する基質溶液供 給手段と、 酵素溶液を反応容器内に供給する酵素溶液供給手段と、 測定溶液の温 度を制御する温度制御手段と、 測定溶液を撹拌する撹拌手段と、 測定溶液に接し て配された全反射吸収用プリズムと、 全反射吸収用プリズムと測定溶液との界面 で全反射するように赤外光を全反射吸収用プリズムに入射させる赤外光源と、 全 反射吸収用プリズムから出射された赤外光のスぺク トルを測定する赤外光検出手 段と、 赤外光検出手段により測定された赤外光のスぺク トルに基づいて赤外吸収 スぺク トルあるいは吸光度の変化を求めて測定溶液中の酵素反応を測定する演算 部と、 を備えることを特徴とする。
このことによって、 基質溶液供給手段および酵素溶液供給手段それぞれから反 応溶液に供給された基質溶液および酵素溶液それぞれは反応溶液内で混合されて 測定溶液とされ、 その測定溶液は、 温度制御手段により一定温度に制御され、 攪 拌手段により慷拌される。 赤外光源から出射された赤外光は、 この測定溶液に接 して配された全反射吸収用プリズムと測定溶液との界面に全反射吸収用プリズム の側から入射して全反射し、 その全反射された後に全反射吸収用プリズムから出 射した赤外光のスペクトルは、 赤外光検出手段により測定される。 そして、 演算 部により、 赤外線吸収スぺク トルまたは吸光度の変化が求められ、 測定溶液中の 酵素反応が測定される。 したがって、 測定溶液が «度を持つ場合や基質が水溶性 でない場合であっても、 基 Sと生成物とを分離することなく、 簡便な操作で連続 的に、 信頼性の高い酵素反応の測定が可能となる。
また、 本発明に係る酵素反応測定装置は、 反応容器内の測定溶液を排出する溶 液排出手段と、 反応容器内を洗浄する洗浄液を反応容器內に供給する洗浄液供給 手段と、 を更に備えることを特徴とする。 このことによって、 1つの酵素反応の 測定が終了した後、 反応容器內の測定溶液は、 溶液排出手段により排出され、 ま た、 反応容器内は、 洗浄液供給手段により供給された洗浄液により洗浄されるの で、 続けて次の酵素反応の測定が可能となる。
また、 全反射吸収用プリズムは、 少なくとも測定溶液に接触する領域がテフ口 ン 'コーティングされていることを特徴とする。 このことによって、 測定溶液中 の基質が全反射吸収用プリズムに析出することが防止される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明に係る酵素反応測定装 Sの構成図であり、 第 2図は、 本装置 の反応容器の斜視図であり、 第 3図は、 本装置の反応容器の断面図であり、 第 4 図は、 本装雪の測定動作のフローチャートであり、 第 5図は、 本装置を用いたリ パーゼによるォリーブ油の加水分解反応の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明をより詳細に説述するために、 添付の図面に従ってこれを説明する。 第 1図は、 本発明に係る酵素反応測定装置の一実施形態を示す構成図であり、 本装置の構成を明確にするため反応容器 2 6については断面図を示している。 こ の実施の形態においては分光器を使用した赤外分光光度計を示しているが、 フー リエ変換型赤外分光光度計または目的波長のみの光を発する光源と検出器の組み 合わせを使用したものでも良い。
この酵素反応測定装置は、 主に、 赤外分光光度計本体 1および赤外分光光度計 試料室 2を備え、 更に、 洗浄液、 基質溶液、 酵素溶液および停止液それぞれの供 給部 1 5〜 1 8等をも備えている。 赤外分光光度計本体 1内部には、 赤外光源 3、 分光器 4、 赤外光検出器 5、 および、 これらを制御する制御部 6が内蔵されてい る。 また、 赤外分光光度計試料室 2内部には、 主に、 反応容器 2 6および全反射 吸収用プリズム 2 8が內蔵されている。
赤外光源 3は、 赤外光を出射する光源であり、 この赤外光源 3から出射された 赤外入射光 3 6は、 全反射吸収用プリズム 2 8の入射面に入射する。 この全反射 吸収用プリズム 2 8は、 上面と下面 （反応容器 2 6の側の面） とが平行であって、 これらに対して入射面および出射面が斜めに形成されている。 この全反射吸収用 プリズム 2 8の入射面に入射した赤外光は、 全反射吸収用プリズム 2 8の上面と 下面との間を全反射を橾り返しながら伝搬し、 出射面から出射する。
この全反射吸収用プリズム 2 8は、 屈折率が大きい Z n S e製が最も好適であ り、 G e製または S i製も好適である。 また、 赤外光の全反射吸収用プリズム 2 8の下面への入射角は、 4 0度から 6 0度の範囲が好適であり、 特に 4 5度が好 ましい。 なお、 全反射吸収用プリズム 2 8の屈折率と測定溶液 4 0の屈折率との 差が小さいほど、 赤外光が全反射吸収用プリズム 2 8の下面で全反射する際に測 定溶液 4 0中に発生するエバネセントの染み込みは深くなり、 基質による赤外吸 収スぺクトルが増強されることになる。
さらに、 全反射吸収用プリズム 2 8は、 その下面のうち少なくとも測定溶液 4 0と接する領域が、 テフロン ' コーティングされているのが好適である。 このよ うにするテフロン · コーティングすることで、 測定溶液 4 0中の基質が全反射吸 収用プリズム 2 8に析出することを防止できる。 なお、 赤外光が全反射吸収用プ リズム 2 8の下面で全反射する際に測定溶液 4 0中に生じるエバネセント波の染 み込み深さは、 その赤外光の波長の 1 / 5から 1 7程度であり、 また、 目的波 長が約 7 μ πιであるので、 赤外光のエバネセントが測定溶液 4 0に達するように するためには、 テフロン ' コーティングの厚みは数百 n m以下であることが必要 である。
全反射吸収用プリズム 2 8の出射面から出射された赤外透過光 3 7は、 分光器 4に入射する。 この分光器 4は、 その赤外透過光 3 7のうちの目的波長成分を選 択し、 赤外光検出器 5は、 その目的波長成分を検出し、 その強度に応じた信号を 出力する。 そして、 赤外光検出器 5により検出された信号は、 制御部 6およびデ ータ転送ライン 3 9を経て、 演算 '制御用コンピュータ 7に転送される。 なお、 «源3 2は、 赤外分光光度計本体 1内の赤外光源 3、 分光器 4、 赤外光検出器 5 および制御部 6それぞれに電力を供給するためのものである。
全反射吸収用プリズム 2 8は、 パッキン 2 7を介して反応容器 2 6に取り付け られており、 全反射吸収用プリズム 2 8の下面の一部領域は、 反応容器 2 6内に 容れられる測定溶液 4 0と接する。 このパッキン 2 7は、 全反射吸収用プリズム 2 8と測定溶液 4 0とが接する領域の面積を規定するため孔が中央部に設けられ ている。
このパッキン 2 7は、 測定する波長領域に吸収のないもの、 すなわち、 エステ ル基およびカルボキシル基を含まなレ、材質 （例えば、 シリコンゴムまたはテフ口 ン製） のものが好ましい。 また、 パッキン 2 7として、 全反射吸収用プリズム 2 8と反応容器 2 6とを接着するシリコンゴム系接着剤であっても良い。 また、 全 反射吸収用プリズム 2 8の下面のうち測定溶液 4 0と接する領域以外の領域に金 属 （例えば、 アルミニウム、 金、 など） を蒸着して、 この蒸着膜をパッキン 2 7 としても良い。
反応容器 2 6は、 測定溶液 4 0 (具体的には、 基質溶液および酵素溶液） を容 れるための容器である。 全反射吸収用プリズム 2 8に接する反応容器 2 6の側面 には、 測定溶液 4 0と全反射吸収用プリズム 2 8の下面とを接触させるための孔 が設けられており、 その孔は、 パッキン 2 7に設けられた孔と対応する位置にあ る。 反応容器 2 6の材質は、 テフロンまたは表面をテフロン ' コーティングした アルミニウムが好ましい。 なお、 この反応容器 2 6の内部空間と赤外分光光度計 試料室 2の內部空間とは物理的に遮断されており、 測定溶液 4 0と赤外分光光度 計試料室 2とは直接接触することはない。
反応容器 2 6內には、 S拌回転子 2 2が設けられている。 この擾拌回転子 2 2 は、 反応容器 2 6內における酵素反応の条件を一定にするために測定溶液 4 0を 一定速度で撹拌するためのものであり、 磁気式携拌装置本体 2 1の指示により回 転し、 また、 その回転速度は、 磁気式撹拌装置制御部 2 0により一定速度に制御 される。 なお、 源3 4は、 磁気式撹拌装置制御部 2 0に電力を供給するための ものである。
反応容器 2 6の他の側面には、 パネルヒータ 2 4が設けられている。 このパネ ルヒータ 2 4は、 反応容器 2 6內における酵素反応の温度条件を一定にするため に、 測定溶液 4 0を一定温度に保っためのものである。 また、 反応容器 2 6内に は、 温度センサ 2 5が設けられている。 この温度センサ 2 5は、 反応容器 2 6内 の測定溶液 4 0の温度を測定するためのものである。 また、 温度制御装置 2 3は、 温度センサ 2 5により測定された反応容器 2 6內の測定溶液 4 0の温度に基づい てパネルヒータ 2 4を制御して、 反応容器 2 6内の測定溶液 4 0の温度を所定値 に維持するためのものである。 なお、 電源 3 5は、 温度制御装置 2 3に耄カを供 給するためのものである。
また、 反応容器 2 6には、 空気排出部 2 9、 溶液供給用パイブ 3 0および溶液 排出用パイプ 3 1それぞれが接続されている。
空気排出部 2 9は、 反応容器 2 6內へ各種溶液が供給される時に反応容器 2 6 内部より押し出される空気を排出するためのものであり、 反応溶液 2 6の內部空 間から赤外分光光度計試料室 2の外部まで導かれており、 その途中に電磁弁 1 3 が設けられている。
溶液供給用パイプ 3 0は、 洗净液、 基質溶液、 酵素溶液および停止液それぞれ を供給するためのパイプである。 この溶液供給用パイプ 3 0には、 洗浄液を供給 するための洗浄液供給部 1 5、 基質溶液を供給するための基質溶液供給部 1 6、 酵素溶液を供袷するための酵素溶液供給部 1 7、 および、 停止液を供給するため の停止液供給部 1 8それぞれが、 電磁弁 8乃至 1 1それぞれを介し、 更に電磁弁 1 2を介して接続されている。
溶液排出用パイプ 3 1は、 反応容器 2 6内の測定溶液 4 0を排出するためのパ イブであり、 電磁弁 1 4を介して、 溶液排出部 1 9に接続されている。 この溶液 排出部 1 9は、 反応容器內 2 6内部の測定溶液 4 0を吸引することにより、 測定 溶液 4 0を排出する。
これら電磁弁 8乃至 1 4、 洗浄液供給部 1 5、 基質溶液供給部 1 6、 酵素溶液 供袷部 1 7、 停止液供給部 1 8および溶液排出部 1 9は、 制御 ·電源供給ライン 3 8を介して演算 ·制御用コンピュータ 7に接続されており、 演算 ·制御用コン ピュ一タ 7より制御される。 電源 3 3は、 演算 .制御用コンピュータ 7に電力を 供給するためのものである。 尚、 洗浄液供給部 1 5、 基質溶液供給部 1 6、 酵素 溶液供給部 1 7および停止液供給部 1 8それぞれは、 演算 '制御用コンピュータ 7の指示に基づいて、 一定量の各溶液を溶液供給用パイプ 3 0に送り出した後、 空気または不活性気体 （例えば窒素ガス等） を一定量送り出し、 溶液供給用パイ ブ 3 0內に各溶液が残ることなく定量的に反応容器 2 6内部に各溶液を供給でき る構造となっている。
図 2は、 反応容器 2 6、 パッキン 2 7および全反射吸収用プリズム 2 8を斜め 上方から見たときの斜視図であり、 図 3は、 全反射吸収プリズム 2 8の下面に垂 直な面で切断したときのこれらの断面図である。 なお、 これらの図は、 反応容器 2 6、 パッキン 2 7および全反射吸収用プリズム 2 8それぞれの実際の配置の方 位を示している。 これらの図に示すように、 反応容器 2 6の一方の側面には孔が設けられており、 その孔が全反射吸収用プリズム 2 8のテフロン · コーティングされた面で塞がれ る構造となっている。 反応容器 2 6の下部には磁気式携拌装置 2 1が設けられ、 また、 反応容器 2 6内部には 拌回転子 2 2が設けられている。 また、 空気排出 部 2 9、 溶液供給用パイプ 3 0および溶液排出用パイプ 3 1は、 反応容器 2 6の 上方より、 反応容器 2 6の内部空間に導かれており、 そのうち、 空気排出部 2 9 および溶液供給用パイプ 3 0それぞれの先端は、 反応容器 2 6の内部空間の上面 近傍まで導かれ、 溶液排出用パイプ 3 1の先端は、 反応容器 2 6の内部空間の底 面近傍まで導かれている。
次に、 上記構成の酵素反応測定装置を用いた酵素反応測定方法を説明する。 図 4は上記構成の装置における測定動作のフローチャートの一例である。 以下、 図 4に従って測定動作を説明する。 なお、 図 4は、 測定検体数が 5検体であって、 各検体毎に酵素反応を 1分間隔で 1 1回測定するためのフローチヤ一トである。 また、 以下の処理は、 演算 '制御用コンピュータ 7の指示に従って行われるもの である。
先ず、 ステップ S 1では、 安定した測定を行うために、 装 Sの全ての髦源 3 2 乃至 3 5は予め測定開始前にオンにされ、 装置は初期化設定される。 すなわち、 赤外分光光度計試料室 2內は予め乾燥空気または窒素でパージされ、 温度制御装 匿 2 3により反応容器 2 6内の反応温度が設定され、 磁気式攪拌装置制御部 2 0 により «拌回転子 2 2の撹拌速度が設定される。 また、 演算 '制御用コンビユー タ 7において、 検体数 Sを数えるカウンタ及び測定回数 Nを数えるカウンタそれ ぞれは値 0に初期化される。 なお、 この時点において、 本装置の全ての電磁弁 8 乃至 1 4は閉じられている。
統くステップ S 2では、 電磁弁 1 3、 電磁弁 1 2及び電磁弁 9それぞれが開か れ、 基質溶液供給部 1 6より一定量の基質溶液が溶液供給用パイプ 3 0を通して 反応容器 2 6內に供給され、 その後、 一定量の窒素ガスが供給されて、 定量的に 基質溶液が反応容器 2 6内に供給された後、 電磁弁 9および電磁弁 1 2が閉じら れる。 ステップ S 3では、 反応容器 2 6内の基質溶液が設定温度になるよう、 装 置は 1 0分間放置される。
次にステップ S 4では、 基質溶液のみの赤外吸収スぺク トルがバックグランド として測定される。 すなわち、 赤外光源 3から出射した赤外入射光 3 6が全反射 吸収用プリズム 2 8の入射面に入射し、 その赤外光は全反射吸収用プリズム 2 8 の上面および下面の間で全反射しながら伝搬し、 全反射吸収用プリズム 2 8の出 射面から出射した赤外透過光 3 7の各波長成分が分光器 4により選択されて赤外 光検出器 5により検出される。
このとき、 全反射吸収用プリズム 2 8の下面は反応容器 2 6内の基質溶液と接 しているので、 赤外光が全反射吸収用プリズム 2 8の下面で全反射すると、 その エバネセントが基質溶液に発生する。 しかも、 全反射吸収用プリズム 2 8の上面 および下面の間で赤外光は全反射を繰り返すので、 全反射吸収用プリズム 2 8の 下面と基質溶液とが接する広い領域に！:つてェパネセントが発生する。 したがつ て、 全反射吸収プリズム 2 8の出射面から出射された赤外透過光 3 7は、 基 溶 液による吸収の影響を強く受けたものとなる。 ステップ S 5では、 このようにし て得られたバックグランドの赤外吸収スぺクトルのデータが、 制御部 6を経て演 算 ·制御用コンピュータ 7に転送される。
次にステップ S 6では、 電磁弁 1 2および «磁弁 1 0が開かれ、 酵素溶液供給 部 1 7より一定量の検体である酵素溶液が溶液供給用パイプ 3 0を通して反応容 器 2 6内に供給され、 その後、 一定量の窒素ガスが供給されて、 定量的に基質溶 液が反応容器 2 6内に供給される。 その後、 整磁弁 1 0および電磁弁 1 2は閉じ られる。
次にステップ S 7では、 基質溶液と酵素溶液とが混合された測定溶液 4 0につ いて赤外吸収スペクトルが測定される。 その測定は、 ステップ S 4の場合とほぼ 同様である。 ただし、 ステップ S 7における測定対象は、 基質溶液と酵素溶液と が混合された測定溶液 4 0であって、 慣拌回転子 2 2により一定回転速度で擾拌 されて懸濁状態となっている。 しかし、 このような場合であっても、 赤外光が全 反射吸収用プリズム 2 8の下面で全反射すると、 そのエバネセントが測定溶液 4 0內に発生する。 この場合、 全反射吸収用プリズム 2 8の出射面から出射された 赤外透過光 3 7は、 基質と酵素との反応により滅少した基質の影響を受けたもの となる。
ステップ S 8では、 ステップ S 7で測定されたスペク トルデータが、 制御部 6 を経て演算 '制御用コンピュータ 7に転送される。 そして、 演算 ·制御用コンビ ユータ 7により、 そのスぺク トルデータとステップ S 5で既に転送されたバック グランド ·スぺク トルデータとの差が求められる。
次にステップ S 9では、 装置は 1分間放置され、 ステップ S 1 0では、 測定回 数カウンタ Nと値 1 0とが大小比較され、 測定回数カウンタ Nが値 1 0以下であ る場合にはステップ S I 1に進み、 そうでない場合にはステップ S 1 2に進む。 ステップ S I 1では、 測定回数カウンタ Nに値 1が加算され、 ステップ S 7のス ぺク トル測定に戻る。 すなわち、 ステップ S 7乃至 S 1 1からなるループにおい て、 測定溶液 4 0についてスペク トルデータが 1分毎に計 1 1回測定され、 かつ、 そのスぺク トルデータとバックグランド ·スぺクトルデータとの差が求められる。 ステップ S 1 2では、 電磁弁 1 4が開かれ、 溶液排出部 1 9により反応容器 2 6内の測定溶液 4 0が排出される。 ステップ S 1 3では、 電磁弁 1 2及び黧磁弁 8が開かれ、 洗浄液供給部 1 5より洗浄液が溶液供給用パイプ 3 0を通して反応 容器 2 6に供給され、 反応容器 2 6内が十分に洗浄された後、 亀磁弁 1 3が閉じ られる。 そして、 一定量の窒素ガスが供給され、 反応容器 2 6内にある洗浄液が 完全に排出された後、 亀磁弁 8、 電磁弁 1 2および電磁弁 1 4が閉じられる。 以 上で、 1検体について測定が終了する。
次にステップ S 1 4では、 検体数カウンタ Sと値 5とが比較され、 検体数カウ ンタ Sが値 5未満の場合には、 ステップ S 1 5に進み、 そうでない場合には、 測 定は全て終了する。 ステップ S 15では、 測定回数カウンタ Nが値 0に設定され るとともに、 検体数カウンタ Sに値 1が加算され、 ステップ S 2に戻る。 すなわ ち、 ステップ S 2乃至 S 1 5からなるループにおいて、 5検体それぞれにっき、 測定溶液 40についてスペク トルデータが 1分毎に計 1 1回測定され、 かつ、 そ のスぺクトルデータとバックグランド ·スぺクトルデータとの差が求められる。 したがって、 以上の操作が行われることにより、 演算 '制御用コンピュータ 7 には、 5検体の酵素による酵素反応による赤外吸収スぺク トルの 1分ごとの変化 が得られ、 その変化量より各酵素の酵素活性の解析が可能となり、 また、 赤外吸 収スぺク トルの経時変化より各酵素の反応速度論的解析が可能となる。
次に、 実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、 本発明は、 その要旨を超 えない限り以下の実施例に限定されるものではない。 以下に上記の装置で測定し た酵素反応測定の実施例を示す。
使用された試薬は、 ①ォリーブ油 （リパーゼ測定用特製試薬） 、 ナカライテス ク社製、 ②ポリビニルアルコール （クラレポバール、 PVA— 117) 、 クラレ ③ポリ ビニルアルコール （クラレポバール、 PVA— 205) 、 クラレ社 製、 および、 ④リパーゼ OF (360,000 U/g) , 名糖産業社製、 である。
ポリビニルアルコール溶液の調製は以下のように行われた。 すなわち、 ポリビ -ルアルコール （クラレポバール、 PVA— 1 17) 18. 5 gとポリ ビニルァ ルコール （クラレポバール、 PVA— 205) 1. 5 とが、 500ml程度の MilliQ水と混合されて、 スターラーで攪拌され、 その後、 ォ一トクレーブ （1 21で、 2〜3分間） 処理され、 更にスターラーで撹拌されて完全に溶解された。 そして、 この混合液は、 室温まで冷却された後、 MilliQ水が加えられて総量 1 リ ッ トルとされ、 さらに撹拌された後、 濂過されて室温保存された。
酵素溶液用バッファ （0.1Mりん酸バッファ） の調製は以下のように行われた。 すなわち、 りん酸二水素ナトリウム （無水） 2. 4 gが MilliQ水に溶解されて、 最終的に 20 Om 1の MilliQ水とされた。 また、 りん酸水素ニナトリウム （無 水） 7. 1 gが MilliQ水に溶解されて、 最終的に 50 Om 1の MilliQ水とさ れた。 次に、 上記りん酸二水素ナトリウム溶液 20 Om 1は、 容量 5 O Om lあ るいは 1リ ッ トルのビーカに容れられて、 pHメータにセットされ、 これにりん 酸水素ニナトリウム溶液が加えられて、 pHが 7. 0になるよう設定された。 そ して、 これが濂過されて冷蔵保存された。
ォリーブ油エマルシヨンの調製は以下のように行われた。 すなわち、 オリ一ブ 油 （リパーゼ測定用特製試薬） 20m l とポリビニルアルコール溶液 6 Om 1 と 力 容 il 50ミリリツトルの容器に計り取られ、 その容器の周りが氷でおおわ れて冷却されながら、 撹拌機で撹拌 （2000回転 Z分で 10分間） された後、 氷冷下で 1時間放置された。
酵素溶液の調製は以下のように行われた。 すなわち、 リパーゼ OF (360, 000 U/g) 0. 028 gが計り取られ、 容量 1 Om 1のプラスチック試験管に入れ て、 これに酵素溶液用バッファ 1 Om 1が加えられ、 泡立たないようにして転倒 混和 （l,OOOUZm l ) されて、 氷冷保存された。
そして、 以上のようにして調整された基質溶液 （ォリーブ油エマルシヨン溶液、 酵素溶液用バッファ） および酵素溶液について、 本実施形態に係る酵素反応測定 装置および装置により酵素反応が測定された。 なお、 反応容器 26内の測定溶液 40の温度は、 温度制御装置 23、 パネルヒータ 24および温度センサ 25によ り、 37¾：に設定された。 また、 擾拌回転子 22の撹拌速度は、 磁気式 «拌装 * 制御部 20および磁気式 *拌装置本体 21により、 約 1000回転ノ分に設定さ れた。
まず、 反応容器 26内に、 基質溶液としてオリーブ油エマルシヨン溶液 2m l および酵素溶液用バッファ 1. 6m lが供給され、 10分間放置された後、 バッ クグランド測定され、 バックグラウンド 'スぺク トルデータが得られた。 次に、 反応容器 26內に、 酵素溶液 0. 4mlが供給され、 20分間に亙り 1分間隔で 計 21回、 スぺク トル測定され、 赤外吸収スぺク トルデータが得られた。 そして、 酵素溶液と基質溶液とが混合された測定溶液についての赤外吸収スぺ クトルデータは、 パックグラウンド ' スぺクトルデータが差し引かれ、 酵素反応 の反応速度は、 この結果に基づいて得られる。 図 5は、 バックグラウンドが減算 された赤外吸収スぺク トルのうち、 波数 1 7 4 5 c m— 1における吸光度の変化を 示すものである。 本実施形態に係る酵素反応測定装置による測定結果は、 別個に 滴定法によつて測定した結果とも良く一致し、 本装置を用いて酵素反応の測定が 可能であることがわかる。 産業上の利用可能性
以上のように本発明に係る酵素反応測定方法及びその測定装置は、 測定溶液が 灞度を持つ場合や基質が水溶性でない場合であつても、 基質と生成物とを分離す ることなく、 簡便な操作で連続的に、 信頼性の高い酵素反応の測定が可能となる。 したがって、 本発明に係る酵素反応測定方法及びその測定装置は、 臨床検査の場 において、 血液中や尿中の或種の酵素活性を測定することによる病気の診断や、 血液中のリパーゼ活性を測定することによる膝疾患の判定に用いるのに好適であ り、 また、 油脂化学工業等の工業プロセスにおいても、 油脂とリパーゼとの反応 速度の測定に好適に用いられる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 酵素と基質とを含む測定溶液を一定温度の下で *拌し、 前記測定溶液に接し て配された全反射吸収用プリズムと前記測定溶液との界面に前記全反射吸収用プ リズムの側から赤外光を入射させて全反射させ、 その全反射された赤外光のスぺ ク トルを測定して赤外線吸収スぺク トルまたは吸光度の変化を求め、 前記測定溶 液中の酵素反応を測定することを特徴とする酵素反応測定方法。
2 . 前記酵素がエステル結合の加水分解反応を触媒することを特徴とする請求の 範囲第 1項記載の酵素反応測定方法。
3 . 前記酵素がカルボン酸エステル加水分解酵素であることを特徴とする請求の 範囲第 2項記載の酵素反応測定方法。
4 . 前記酵素がリパーゼであることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の酵素反 応測定方法。
5 . 基質溶液と酵素溶液とが混合されてなる測定溶液を容れる反応容器と、 前記基質溶液を前記反応容器内に供給する基質溶液供給手段と、
前記酵素溶液を前記反応容器内に供給する酵素溶液供給手段と、
前記測定溶液の温度を制御する温度制御手段と、
前記測定溶液を浸拌する撹拌手段と、
前記測定溶液に接して配された全反射吸収用プリズムと、
前記全反射吸収用プリズムと前記測定溶液との界面で全反射するように赤外光 を前記全反射吸収用プリズムに入射させる赤外光源と、
前記全反射吸収用プリズムから出射された赤外光のスぺク トルを測定する赤外 光検出手段と、
前記赤外光検出手段により測定された前記赤外光のスぺク トルに基づいて赤外 吸収スぺク トルあるいは吸光度の変化を求めて、 前記測定溶液中の酵素反応を測 定する演算部と、 を備えることを特徴とする酵素反応測定装置。
6 . 前記反応容器内の前記測定溶液を排出する溶液排出手段と、
前記反応容器内を洗浄する洗浄液を前記反応容器内に供給する洗浄液供給手段 と、
を更に備えることを特徴とする請求の範囲第 5項記載の酵素反応測定装置。
7 . 前記全反射吸収用プリズムは、 少なく とも前記測定溶液に接触する領域がテ フロン . コーティングされていることを特徴とする請求の範囲第 5項記載の酵素 反応測定装置。
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