BRPI0620091A2 - sal hidrogenossulafato, método para preparo e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

SAL HIDROGENOSSULFATO, MéTODO PARA PREPARO E USO DO MESMO. A presente invenção refere-se ao sal hidrogenossulfato do Composto 1 e seus solvatos, suas formas cristalinas e suas formas amorfas, e processos para sua preparação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SAL HIDRO- GENOSSULFATO, MÉTODO PARA PREPARO E USO DO MESMO ".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO PEDIDO DE PATENTE AFIM

O presente pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de patente provisório n2 de série 60/752.781, depositado em 21 de dezem- bro de 2005, que é aqui incorporado em sua totalidade como referência.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um sal inusitado, e mais parti- cularmente, a um sal inusitado da (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bro- mo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (aqui doravante denominado "Composto 1"), que é um inibidor de MEK útil no tra- tamento e/ou profilaxia de estados doentios, tais como câncer, em um mamí- fero. Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao sal hidroge- nossulfato do Composto 1, e processos para a preparação do dito sal. São fornecidas também composições farmacêuticas que contêm um sal hidroge- nossulfato do Composto 1, e o uso do sal na fabricação de medicamentos para o tratamento e/ou profilaxia de estados doentios proliferativos, tal como câncer, no corpo humano ou animal, e métodos para tratar estados doentios proliferativos, tal como câncer, em um mamífero, administrando uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de um sal hidrogenossulfato do Composto 1.

DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS ANTERIORES

A sinalização de células através de receptores de fatores do crescimento e proteínas cinases é um importante regulador do crescimento, proliferação e diferenciação de células. No crescimento normal de células, os fatores do crescimento, através da ativação de receptores (isto é, PDGF ou EGF e outros), ativam a vias de MAP cinase. Uma das vias mais impor- tantes e mais bem-entendidas, envolvidas no crescimento normal e descon- trolado de células, é a via de Ras/Raf cinase. Ras ligada a GTP ativa resulta na ativação e fosforilação indireta de Raf kinase. Raf, então, fosforila MEK1 e 2 em dois resíduos de serina (S218 e S222 no caso de MEK1 e S222 e S226 no caso de MEK2) (Ahn et aí., Methods in Enzymology, 332:417-431 (2001)). MEK ativada, então, fosforila seus únicos substratos conhecidos, as MAP cinases ERK1 e 2. A fosforilação de ERK por MEK oorre em Y204 e T202 no caso de ERK1 e YI85 e T183 no caso de ERK2 (Ahn et al, Methods in Enzymology 2001, 332:417-431). ERK fosforilada dimeriza e depois trans- loca para o núcleo, onde ela acumula (Khokhlatchev et al., Cell 93:605-615 (1998)). No núcleo, ERK está envolvida em várias funções celulares impor- tantes, incluindo, porém sem limitações, o transporte nuclear, transdução de sinais, reparo do DNA, montagem e translocação de nucleossomas, e pro- cessamento e translação do RNAm (Ahn et al., Molecular Cell, 6:1343-1354 (2000)). Além de tudo, o tratamento de células com fatores de crescimento leva à ativação de ERK1 e 2, o que resulta em proliferação e, em alguns ca- sos, diferenciação (Lewis et al, Adv. CancerRes. 74:49-139 (1998)).

Em doenças proliferativas, as mutações genéticas e/ou super- expressão de receptores de fatores do crescimento, a jusante de proteínas sinalizadoras, ou proteínas cinases envolvidas na via de ERK cinase, levam à proliferação descontrolada de células e, eventualmente, formação de tu- mores. Por exemplo, alguns cânceres contêm mutações que resultam na ativação continua desta via, devido à produção contínua de fatores do cres- cimento. Outras mutações levam a defeitos na desativação do complexo ati- vado GTP-Ras ligada, novamente resultando na ativação da via de MAP ci- nase. As formas mutadas e oncogênicas de Ras são encontradas em 50% dos cânceres colônicos e > 90% dos pancreáticcos, bem como muitos outros tipos de cânceres (Kohl et al., Science, 260:1834-1837 (1993)). Recente- mente, mutações de bRaf foram identificadas em mais do que 60% de mela- nomas malignos (Davies, H., et al., Nature 2002, 417:949-954 (2002)). Estas mutações em bRaf resultam em uma cascata de MAP cinase constitutiva- mente ativa. Estudos de amostras de tumores primários e linhagens de célu- las também demonstraram ativação constitutiva ou superativação da via de MAP cinase em cânceres do pâncreas, cólon, pulmão, ovário e rim (Hoshino, R., et al., Oncogene 18:813-822 (1999)). Assim sendo, há uma forte correla- ção entre cânceres e uma via de MAP cinase superativa, resultando em mu- tações genéticas. Como a ativação constitutiva ou a superativação da cascata de MAP desempenha um papel fundamental na proliferação e diferenciação de células, acredita-se que a inibição desta via seja benéfica em doenças hi- perproliferativas. MEK é um ator importante na via, pois ela está a jusante de Ras e Raf. Adicionalmente, ela é um alvo terapêutico atrativo porque os úni- cos substratos conhecidos para a fosforilação de MEK são as MAP cinases, ERK1 e 2. A inibição de MEK demonstrou ter benefício terapêutico potencial em vários estudos. Por exemplo, moléculas pequenas inibidoras de MEK demonstraram inibir o crescimento de tumores humanos em xenoenxertos de camundongos nus (Sebolt-Leopold et al., Nature-Medicine 1999, 5(7):810-816 (1999); Trachet et al., AACR 6-10 de abril de 2002, Pôster n2 5426; Tecle, H., IBC 2- Conferência Internacional de Proteínas Cinases, 9- 10 de setembro de 2002), alodinia estática de bloqueio em animais (docu- mento n- WO 01/05390) e inibem o crescimento de células de leucemia mie- lóide aguda (Milella et ai, J. Clin. Invest. 108(6):851-859 (2001)).

Moléculas pequenas inibidoras de MEK foram descritas. Pelo menos três pedidos de patente apareceram nós últimos anos: US 5.525.625; WO 98/43960; WO 99/01421; WO 99/01426; WO 00/41505; WO 00/42002; WO 00/42003; WO 00/41994; WO 00/42022; WO 00/42029; WO 00/68201; WO 01/68619; e WO 02/06213.

Os inibidores de MEK estão descritos também no documento n2 WO 03/077914. A (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenil- amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico, ou "Composto 1", es- tá exemplificada no documento n2 WO 03/077914 e possui a seguinte fórmu- la estrutural:

<formula>formula see original document page 4</formula>

Composto 1

O Composto 1 demonstrou possuir atividade inibitória contra MEK, e portanto, ser útil no tratamento de uma doença hiperproliferativa, tal como câncer.

O documento n2 WO 03/077914 descreve, em termos gerais, certos sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos lá descritos. Espe- cificamente, afirma-se no documento n- WO 03/077914 que os sais farma- ceuticamente aceitáveis dos compostos lá descritos possuem uma porção suficientemente básica podem formar sais de adição de ácido que contêm ânions farmaceuticamente aceitáveis, e vários desses ânions estão listados. Similarmente, sais apropriados dos compostos que possuem uma porção ácida devem ser formados pelo tratamento de um composto com um com- posto básico, e particularmente, uma base inorgânica.

A forma de um composto farmaceuticamente ativo, que é usada em medicamentos, é adequadamente uma que produz propriedades razoá- veis de manuseio, que permitem que ele seja processado e formulado. En- tretanto, é necessário também assegurar que as propriedades biológicas da formulação final, tais como a velocidade de dissolução de comprimidos e a biodisponibilidade do ingrediente ativo sejam otimizadas, e freqüentemente há compromissos a serem feitos ao selecionar uma forma específica que melhor atende a estes vários requisitos. Entretanto, em alguns casos, os sais não se formam facilmente e/ou não são estáveis, o que se deve prova- velmente a baixos valores de pKa. O valor de pKa expressa a potência de ácidos e bases, isto é, a tendência de um ácido perder um próton ou de uma base adicionar um próton (Bronsted, J.N., Rec. Trav. Chim. 47:718 (1923)).

Isso é particularmente verdadeiro para o Composto 1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um sal hidrogenossulfato (fárma- co:H2S041:1) do Composto 1 e várias formas dele, estando todas elas inclu- ídas no âmbito da invenção. O sal pode estar em várias formas, estando to- tas elas incluídas no âmbito da invenção. Estas formas incluem formas ani- dras, bem como solvatos. Uma outra forma pode ser produzida dessolvatan- do solvatos. Em uma modalidade específica, o sal está na forma anidra.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para usar um sal hidrogenossulfato do Composto 1 como um medicamento para tratar uma doença ou condição hiperproliferativa.

Um aspecto adicional da invenção é o uso de um sal hidroge- nossulfato do Composto 1 na preparação de um medicamento para o trata- mento ou prevenção de uma doença ou condição hiperproliferativa.

Vantagens e características inusitadas adicionais desta inven- ção serão enunciadas, em parte, no relatório descritivo que se segue, e em parte, ficarão evidentes para os versados nessas técnicas após o exame do relatório descritivo que se segue ou podem ser apreendidas pela prática da invenção. As vantagens da invenção podem ser realizadas e atingidas por meio de instrumentalidades, combinações, composições, e métodos assina- lados particularmente nas reivindicações apensadas. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os desenhos anexos, que são aqui incorporados e fazem parte do relatório descritivo, ilustram modalidades não-limitativas desta invenção, e em conjunto com a descrição detalhada, servem para explicar os princípios da invenção.

A Figura 1 ilustra a XRPD do sal hidrogenossulfato do Compos- to 1;

A Figura 2 ilustra o espectro infravermelho do sal hidrogenossul- fato do Composto 1, obtido usando a técnica de amostragem DRIFTS; e

A Figura 3 ilustra os resultados dos níveis da concentração plasmática do Composto 1 depois da administração de doses de 150 mg de dispersão oral equivalente da base livre do Composto 1 (x) e do sal hidroge- nossulfato a cães em jejum (A).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Far-se-á referência agora detalhadamente a certas modalidades da invenção, cujos exemplos estão ilustrados nas estruturas e fórmulas que a acompanham. Embora a invenção vá ser descrita em conjunto com as modalidades enumeradas, deve-se entender que elas não pretendem limitar a invenção a estas modalidades. Pelo contrário, a invenção pretende cobrir todas alternativas, modificações, e equivalentes, que possam estar incluídas dentro do âmbito da presente invenção, como definida pelas reivindicações. Os versados nessas técnicas devem reconhecer muitos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos, que poderiam ser usados na prática da presente invenção. A presente invenção não está de forma alguma limitada aos métodos e materiais descritos. Caso um ou mais artigos da literatura, patentes, e materiais similares difiram ou contradigam este pe- dido de patente, incluindo, porém sem limitações, os termos definidos, o uso dos termos, as técnicas descritas, ou similares, este pedido de patente pre- valece.

A presente invenção fornece um sal hidrogenossulfato (fármaco para H2SO4 1:1) do Composto 1 e várias formas dele, estando todas elas incluídas no âmbito da invenção. O sal pode estar em várias formas, estando todas elas incluídas dentro do âmbito da invenção. Estas formas incluem formas anidras bem como solvatos. Uma outra pode ser produzida dessolva- tando os solvatos. Em uma modalidade específica, o sal é o sal hidrogenos- sulfato do Composto 1. Além disso, a presente invenção fornece uma forma do sal hidrogenossulfato do Composto 1, que apresenta propriedades físicas e farmacêuticas singulares, que a tornam particularmente apropriada para uso em medicamentos.

Em certas modalidades, os sais do Composto 1 são cristalinos. Os sais cristalinos demonstraram ser mehores do que a base livre em ter- mos de suas propriedades de manuseio do ponto de vista de fabricação, particularmente suas propriedades estáticas e de fluidez. A formação de sais pode proporcionar um meio de purificação, pois as impurezas do processo podem ser separadas e os sais são genericamente mais fáceis de isolar do que a base livre.

Em uma modalidade da invenção, o sal hidrogenossulfato do Composto 1 é um sal cristalino que surpreendentemente demonstrou possuir melhores propriedades farmacêuticas em comparação com a base livre do Composto 1 e com certas outras formas de sais do Composto 1. Particular- mente, a velocidade de dissolução deste sal cristalino, bem como sua bio- disponibilidade, demonstraram ser particularmente altas em comparação com a base livre e outros sais, como ilustrado nos exemplos abaixo. A me- lhor biodisponibilidade do sal hidrogenossuIfato do Composto 1 em compa- ração com a base livre demonstrou ser independente da formulação usada para administração. A biodisponibilidade das formas base livre e hidroge- nossulfato foram aqui comparadas quando dosadas nas mesmas formula- ções de dispersão, mas diferenças similares na biodisponibilidade foram ob- servadas também para formulações de comprimidos.

Quando se afirma que a presente invenção refere-se a um sal do Composto 1 que é um sal cristalino, o grau de cristalinidade é convenien- temente maior do que cerca de 60%, mais convenientemente maior do que cerca de 80%, de preferência maior do que cerca de 90%, e mais preferi- velmente, maior do que cerca de 95%. Com a maior preferência, o grau de cristalinidade é maior do que cerca de 98%.

A extensão da melhor biodisponibilidade oferecida pelo sal hi- drogenossulfato é surpreendente e é particularmente útil, pois a base livre do Composto 1 foi classificada como um composto da Classe BCS 4. Os com- postos da Classe BCS 4 têm normalmente baixa biodisponibilidade devido à baixa velocidade de dissolução e permeabilidade, e a limitação da permabili- dade sobre a absorção significa que não se esperaria usualmente que tais sais exercessem um impacto substancial sobre a absorção (vide, por exem- plo: Dressman et ai (2001) Pharm Tech., julho de 68).

Os solvatos apropriados do sal hidrogenossulfato do Composto 1 são formados a partir de uma ampla faixa de solventes, particularmente solventes orgânicos tais como tetraidrofurano (THF), acetonitrila (ACN), eta- nol (EtOH) e metanol (MeOH). Os solventes orgânicos apropriados incluem ésteres tais como ésteres de alquilas de C1-6, por exemplo acetato de etila, e cetonas tais como alquil(Ci-6)-cetonas, por exemplo, metal-etil-cetona (2- butanona).

A preparação do sal pode ser efetuada reagindo uma pasta do Composto 1 com ácido sulfúrico em um solvente orgânico e água. Para a preparação de um sal 1:1, usa-se aproximadamente 1 equivalente de ácido sulfúrico. Assim sendo, em outro aspecto, a invenção fornece um método para preparar um sal hidrogenossuIfato do Composto 1, sendo que o dito método compreende:

(i) reagir uma pasta do Gomposto 1 com aproximadamente 1 equivalente de ácido sulfúrico em um líquido orgânico e água;

(ii) recuperar o sal a partir da solução resultante; e

(iii) depois disso, caso desejado ou necessário, formar um solva- to dele.

A razão molar da quantidade de ácido sulfúrico para o Compos- to 1 fica adequadamente na faixa entre 1,00:1 e 2:1, por exemplo, em uma faixa entre 1,05:1 e 1,15:1. O ácido sulfúrico usado está adequadamente na forma de ácido sulfúrico concentrado. Em uma modalidade específica, a ra- zão molar de ácido sufúrico para o Composto 1 é 1,10:1,0.

Adequadamente, a quantidade de água adicionada na etapa (i) fica restrita àquela necessária para assegurar que o sal seja formado. As quantidades precisas usadas dependerão da natureza específica do solven- te, da concentração do ácido sulfúrico etc., mas tipicalmente, a água deve estar presente em uma quantidade menor do que 20% v/v do líquido total presente, por exemplo, entre 13 e 17% v/v.

Em uma modalidade específica, o solvente orgânico usado na etapa (i) é 2-butanona (metal-etil-cetona), a água é aproximadamente 15% do volume do líquido, e a quantidade total de líquido usada em relação ao Composto 1 é aproximadamente 8 mL por grama do Composto 1.

Adequadamente, a adição de ácido sulfúrico na etapa (i) é con- duzida de uma maneira controlada, por exemplo, em uma temperatura abai- xo de 10°C, e o restante da etapa (i) é conduzido em temperatura elevada, por exemplo, entre 30 e 90°C, como um outro exemplo, em uma faixa entre 55 e 75°C, e como um outro exemplo, a cerca de 65°C.

Os líquidos orgânicos apropriados incluem solventes orgânicos nos quais o Composto 1 e seus sais são parcamente solúveis. Como aqui utilizada, a expressão "parcamente solúvel" significa ter uma solubilidade menor do que 100 mL de solvente por grama de soluto, por exemplo, entre 30 e 100 mL de solvente por grama de soluto. Estes solventes incluem al- quil-cetonas, por exemplo, alquil(Ci-6)-cetonas tais como 2-butanona, álcoois tais como álcoois de Ci-6, por exemplo, metanol ou etanol, e ésteres tais co- mo ésteres de alquilas de Ci-6, por exemplo, acetato de etila. Em uma moda- lidade, o solvente orgânico é metal-etil-cetona (2-butanona).

Adequadamente, a mistura reativa é filtrada entre as etapas (i) e (ii) para remover qualquer material estranho. O resíduo é opcionalmente la- vado, por exemplo, com uma mistura do líquido orgânico e água, e o sal de- sejado é cristalizado a partir do filtrado, que pode ser opcioanlmente combi- nado com a solução de lavagem.

Em certas modalidades, o sal hidrogenossulfato é recuperado na etapa (ii) resfriando a mistura reativa, opcionalmente com a adição de mais líquido orgânico, de tal modo que o sal hidrogenossulfato seja precipi- tado. O líquido orgânico a mais pode ser o mesmo líquido orgânico usado na etapa (i), ou ele pode ser um líquido orgânico diferente, desde que ele atue como um anti-solvente para o sal hidrogenossulfato do Composto 1. A se- meadura da solução com cristais do sal hidrogenossulfato do Composto 1 pode auxilar no processo de precipitação.

Em uma modalidade, antes do resfriamento, o filtrado é primei- ramente submetido a uma etapa de destilação, para remover água e assegu- rar que o sal seja recuperado com um rendimento aceitável. Em uma moda- lidade específica, o solvente é 2-butanona e o filtrado é destilado à pressão atmosférica.

Ao resfriar, o sal pode ser recuperado a partir da pasta resultan- te, por exemplo, por filtração. O material recuperado pode ser então secado, por exemplo, em temperatura elevada, por exemplo, entre 40-60°C, e como outro exemplo, a cerca de 50°C, até atingir peso constante. Caso o produto seja um solvato com o líquido orgânico tal como metanol, el epode ser des- solvatado caso desejado nesta hora por aquecimento.

As propriedades físicas do sal hidrogenossulfato foram investi- gadas e estão descritas adicionalmente nos exemplos.

A invenção inclui também compostos marcados com isótopos, que são idênticos àqueles enunciados na presente invenção, mas exceto que um ou mais átomos são substituídos por um átomo que tem uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa usualmente encontrado na natureza. Os exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor e cloreto, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F e 36CI, respectiva- mente. O sal hidrogenossulfato do Composto 1 e seus polimorfos que con- têm os isótopos supramencionados e/ou outros isótopos de outros átomos estão dentro do âmbito desta invenção. Certos compostos marcados com isótopos da presente invenção, por exemplo, aqueles nos quais os isótopos radioativos tais como 3H e 14C estão incorporados, são úteis em ensaios de distribuição de fármacos e/ou de tecidos no substrato. Os isótopos tritiados, isto é, 3H e carbono-14, isto é, 14C, são usados de forma particularmente ampla como resultado de sua facilidade de preparação e detectabilidade.

Além disso, a substituição por isótopos mais pesados, tais como deutério, isto é, 2H, pode produzir certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, maior meia-vida in vivo ou requisitos de dosagens reduzidos e, assim sendo, podem ser utilizados em algumas circunstâncias específicas. Os sais marcados com isótopos da presente in- venção podem ser preparados genericamente conduzindo os procedimentos descritos no documento n- WO 03/077914, substituindo um reagente não- marcado com isótopo por um reagente marcado com isótopo facilmente dis- ponível durante a preparação, ou, caso desejado, usando um ácido sulfúrico marcado com isótopo na preparação do sal.

A composição pode estar em uma forma apropriada para admi- nistração oral (por exemplo, como comprimidos, pastilhas, cápsulas duras ou moles, emulsões, pós ou grânulos dispersáveis, xaropes, elixires ou suspen- sões oleosas ou aquosas preparadas de forma extemporânea), para admi- nistração por inalação (por exemplo, como um pó finamente dividido ou um aerossol líquido), para administração por insuflação (por exemplo, como um pó finamente dividido), para injeção parenteral (por exemplo, como uma so- lução, suspensão ou emulsão estéril para disagem intravenosa, subcutânea, intramuscular, intravascular ou infusão), para administração tópica (por e- xemplo, como cremes, pomadas, géis, soluções ou suspoensões oleosas ou suspensões aquosas preparadas de forma extemporânea), ou para adminis- tração retal (por exemplo, como um supositório). Em uma modalidade, o sal hidrogenossulfato do Composto 1 é administrado por via oral. Genericamen- te, as composições acima podem ser preparadas de uma maneira conven- cional, usando excipientes convencionais.

A quantidade administrada do composto ativo dependerá do in- divíduo que está sendo tratado, da gravidade do distúrbio ou condição, da taxa de administração, da disposição do composto e do critério do médico prescribente. Entretanto, uma dosagem eficaz fica na faixa entre cerca de 0.01 e cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia, de prefe- rência cerca de 1 a cerca de 35 mg/kg/dia, emu ma dose única em em doses divididas. Para um humano de 70 kg, isto daria cerca de 0,7 a 7.000 mg/dia, de preferência cerca de 70 a cerca de 2.500 mg/dia. Em alguns casos, níveis de dosagem abaixo do limite inferior da faixa supramencionada podem ser mais do que adequados, enquanto que em outros casos, doses ainda maio- res podem ser empregadas sem causar qualquer efeito colateral nocivo, desde que essas doses maiores sejam primeiramente divididas em várias doses pequenas para administração durante o dia inteiro. Uma forma de do- sagem unitária, tal como um comprimido ou cápsula, deve conter usualmen- te, por exemplo 1-1000 mg de ingrediente ativo, e de preferência 5-420 mg de ingrediente ativo. De preferência, emprega-se uma dose diária na faixa de 0,03-6 mg/kg.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se um sal hidrogenossulfato do Composto 1, como aqui definido, para uso em um método de tratamento ou profilaxia do corpo humano ou animal por tera- pia. Outra característica da presente invenção é o sal hidrogenossulfato do Composto 1, como aqui definido, para uso como um medicamento. Em outro aspecto, a presente invenção fornece o sal hidrogenossulfato do Composto 1, como aqui definido, para uso como um medicamento para o tratamento de estados doentios mediados por MEK, particularmente distúrbios proliferati- vos, ou crescimento anormal de células, tal como câncer, em um mamífero homeotermo, tal como um ser humano. Conseqüentemente, um outro aspec- to da invenção fornece o uso do sal hidrogenossulfato do Composto 1, como aqui definido, na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de estados doentios mediados por MEK, particularmente distúrbios proliferati- vos, ou crescimento anormal de células, tal como câncer, em um mamífero homeotermo tal como um ser humano.

De acordo com outra característica da invenção, fornece-se um método para tratar estados doentios medidados por MEK, particularmente distúrbios proliferativos, ou crescimento anormal de células, tal como câncer, em um mamífero homeotermo, tal como um ser humano, que necessita de tal tratamento, compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantida- de eficaz de um sal hidrogenossulfato do Composto 1, como aqui defnido, ou de uma composição farmacêutica como aqui definida.

Os exemplos de distúrbios proliferativo, que podem ser tratados usando os sais ou composições da invenção, incluem distúrbios hiperprolife- rativos em um mamífero. Os cânceres específicos são câncer de cérebro, pulmão, células ecamosas, bexiga, estômago, pâncreas, mama, cabeça, pescoço, rim, ovário, próstata, cólon e reto, esôfago, testículo, ginecológico ou tiereóide.

Entretanto, os compostos e composições da invenção podem ser usados também no tratamento de um distúrbio hiperproliferativo não- canceroso, tal como hiperplasia benigna da pele (por exemplo, psoríase), restenose, ou da próstata (por exemplo, hipertrofia prostática benigna (B- PH)).

Outros exemplos de doenças mediadas por MEK, que podem ser tratadas usando os compostos ou composições da invenção incluem pancreatite ou doença renal (incluindo glomerulonefrite proliferativa e doença renal induzida por diabetes) ou o tratamento de dor em um mamífero.

Os compostos e composições podem ser usados também para a prevenção de implantação de blastócitos em um mamífero ou para tratar uma doença relacionada à vasculogênese ou angiogênese em um mamífero. Tais doenças podem incluir angiogênese de tumores, doença inflamatória crônica, tal como artrite reumatóide, aterosclerose, doença inflamatório do intestino, doenças da pele tais como psoríase, eczema, e escleroderma, dia- betes, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, degeneração ma- cular relacionada à idade, hemangioma, glioma, melanoma, sarcoma de Ka- posi e câncer ovariano, mamário, pulmonar, pancreático, prostático, colônico e epidermóide.

Os termos "crescimento anormal de células" e "distúrbio hiper- proliferativo" são utilizados de forma intercambiável neste pedido de patente e referem-se ao crscimento celular que é independente de mecanismos re- guladores normais (por exemplo, perda de inibição de contato). Isto inclui, por exemplo, o crescimento anormal de: (1) células tumorosas (tumores) que proliferam expressando uma tirosina cinase mutada ou a superexpressão de uma tirosina cinase receptora; (2) células benignas e malignas de outras do- enças proliferativas nas quais ocorre a ativação aberrante de tirosina cinase; (3) quaisquer tumores que proliferam por tirosina cinases receptoras; (4) quaisquer tumores que proliferam pela ativação aberrante de serina/treonina cinase; e (5) células benignas e malignas de outras doenças proliferativas nas quais ocorre a ativação aberrante de serina/treonina cinase.

O termo "tratar", como aqui utilizado, a menos que diferente- mente indicado, significa reverter, minorar, inibir a progressão, ou prevenir, o distúrbio ou condição para a qual tal termo se aplica, ou um ou mais sinto- mas de tal distúrbio ou condição. O termo "tratamento", como aqui utilizado, a menos que diferentemente indicado, refere-se ao ato de tratar como o ter- mo "tratar" está definido imediatamente acima.

Assim sendo, os pacientes que podem ser tratados com os compostos ou composições da presente invenção incluem, por exemplo, pacientes que foram diagnosticados como tendo psoríase, restenose, ate- rosclerose, BPH, câncer pulmonar, câncer pulmonar de células pequenas, câncer ósseo, CMML, câncer pancreático, colorretal, câncer de pele, câncer da cabeça e pescoço, melanoma (particularmente melanoma cutâneo ou intra-ocular),câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, testicular, tu- mores ginecológicos (por exemplo, sarcomas uterinos, carcinoma das tubas de Falópio, carcinoma do endométrico, carcinoma do colo uterino, carcinoma da vagina ou carcinoma da vulva), câncer ovariano, mieloma múltiplo, carci- noma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do in- testino delgado, câncer dos sitema endócrino (por exemplo, câncer da tireói- de, paratireóide ou glândulas supra-renais), sarcomas de tecidos moles, cia, linfomas linfocíticos, câncer da bexiaga, câncer do rim ou ureter (por e- xemplo, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal), ou neo- plasmas do sistema nervoso central (por exemplo, ;linfoma primário do sis- tema nervoso central, tumores do eixo espinhal, gliomas do tronco cerebral ou adenomas hipofisários).

O sal hidrogenossulfato do Composto 1 pode ser aplicado como uma terapia isolada ou pode envolver, além do sulfato hidrogenossulfato do Composto 1, uma ou mais outras substâncias e/ou tratamentos. Tal trata- mento conjunto pode ser realizado através da administração simultânea, se- qüencial ou separadados componentes individuais do tratamento. No campo da oncologia médica, é prática normal usar uma combinação de diferentes formas de tratamento para tratar cada paciente com câncer. Na oncologia médica, o(s) outro(s) componente(s) desse tratamento conjunto, além do sal hidrogenossulfato do Composto 1, pode(m) ser cirurgia, radioterapia ou qui- mioterapia. Tal quimioterapia pode cobrir categorias de agentes terapêuticos tais como:

(i) agentes antiangiogênicos, tais como aqueles que inibem os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (por exemplo, o anticorpo antifator do crescimento de células endoteliais vasculares, bevacizumab [A- vastin®], e inibidores de tirosina cinase receptora do VEGF, tais como 4-(4- bromo-2-flúor-anilino)-6-metóxi-7-(1 -metil-piperidin-4-il-metóxi)-quinazolina (ZD6474; Exemplo 2 dentro do documento n° WO 01/32651), 4-(4-flúor-2- metil-indol-5-ilóxi)-6-metóxi-7-(3-pirrolidin-1-il-propóxi)quinazolina (AZD2171; Exemplo 240 dentro do documento n2 WO 00/47212), vatalanib (PTK787; WO 98/35985) e SU11248 (sunitinib; WO 01/60814), compostos tais como aqueles descritos nos pedidos de patente n— W097/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 e WO 98/13354, e aqueles que funcionam por mecanismos diferentes daqueles aqui definidos (por exemplo, linomida, inibidores da fun- ção de integrina ανβ3, angiostatina, razoxina, talidomida, inibidores de MMP- 2 (metaloproteinase da matriz 2), inibidores de MMP-9 (metaloproteinase da matriz 9), e inibidores de COX-II (ciclooxigenase Il)), e

(ii) agentes apontadores vasculares (por exemplo, fosfato de combretastatina e os compostos descritos nos documentos n— WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 e WO 02/08213, e os agentes danificadores vasculares descritos no pedido de aptente internacio- nal n2 WO 99/02166, (por exemplo, N-acetilcolchinol-O-fosfato));

(iii) agentes citostáticos tais como antiestrogênios (por exemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, and iodoxifeno), reguladores descendentes de receptores de estrogênios (por exemplo, fulvestrant), pro- gestogênios (por exemplo, acetato de megestrol), inibidores de aromatases (por exemplo, anastrozol, letrazol, vorazol, e exemestano), antiprogestogê- nios, antiandrogênios (por exemplo, flutamida, nilutamida, bicalutamida, e acetato de ciproterona), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo, goserelin acetate, leuprorelin, and buserelin), inibidores de 5a-reductase (por exemplo, finasterida);

(iv) agentes antiinvasivos (por exemplo, inibidores de metalopro- teinases tais como marimastat e inibidores da função de receptores do ati- vador de plasminogênio uroquinase ou anticorpos para Heparanese;

(v) inibidores da função de fatores do crescimento (tais fatores do crescimento incluem, por exemplo, o fator de crescimento derivado de plaquetas e o fator do crescimento de hepatócitos), tais inibidores incluem anticorpos de fatores do crescimento, anticorpos de receptores de fatores do crescimento (por exemplo, o anticorpo anti-erbb2 trastuzumab [Herceptin®], o anticorpo anti-EGFR panitumumab, o anticorpo anti-erbB1 cetuximab [C225]), e quaisquer anticorpos de fatores do crescimento ou de receptores de fatores do crescimento descritos por Stern et ai, "Criticai reviews in onco- logy/haematology", 2005, Volume 54, páginas 11-29); tais inibidores incluem também inibidores de tirosina cinase, tais como os inibidores da família do fator decrescimento epidérmico (por exemplo, inibidores de tirosina cinase da família de EGFR, tais como N-(3-cloro-4-flúor-fenil)-7-metóxi-6-(3-morfoli- nopropóxi)- quinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1839), N-(3-etinil-fenil)-6,7-bis- (2-metóxi-etóxi)-quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) e 6-acrilamido-N-(3- cloro-4-flúor-fenil)-7-(3-morfolinopropóxi)-quinazolin-4-amina (Cl 1033)) e inibidores de tirosina cinase erbB2, tais como lapatinib, inibidores da família de fatores do crescimento de hepatócitos, inibidores da família de fatores do crescimento derivados de plaquetas tais como imatinib, inibidores de seri- na/treonina cinases (por exemplo, inibidores da sinalização de Ras/Raf, tais como inibidores de farnesil transferase, por exemplo, sorafenib (BAY 43- 9006)), inibidores da sinalização de células através de MEK e/ou AKT cina- ses, inibidores de c-kit, inibidores de cinase abi, inibidores da cinase recepto- ra de IGF (fator do crescimento semelhante à insulina); inibidores de aurora cinase (por exemplo, AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 e AX39459) e inibidores de cinases dpendentes de ciclina, tais como inibidores de CDK2 e/ou CDK4;

(vi) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos e combinações deles, como usados na oncologia médica, tais como antimetabólitos (por exemplo, antifolatos tais como metotrexato, fluoropirimidinas tais como 5- fluorouracila, tegafur, purina e análogos de adenosina, e citosina arabinosí- deo, hidroxiuréia ou, por exemplo, um dos antimetabólitos descritos especifi- camente no pedido de patente europeu n2 239362, tal como ácido N-(5-[N- (3,4-diidro-2-metil-4-oxoquinazolin-6-il-metil)-N-metil-amino-2-tenoil)-L-glutâ- mico; antibióticos antitumorais (por exemplo, antraciclinas tais como adriami- cina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina e idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina, e mitramicina); derivados de platina (por exem- pio, cisplatina e carboplatina); agentes alquilantes (por exemplo, mostarda nitrogenada, melfalano, clorambucil, bussulfan, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosouréias, e tiotepa); agentes antimitóticos (por exemplo, alcalóides de vinca, tais como vincristina, vinblastina, vindesina.e vinorelbina, e taxóides tais como taxol e taxotere); inibidores de topoisomerase (por exemplo, epi- podofiIotoxinas tais como etoposida e teniposida, amsacrina, topotecano, camptotecina e irinotecano); enzimas (por exemplo, asparaginase); e inibido- res de timidilato sintase (por exemplo, raltitrexed);

E tipos adicionais de agentes quimioterápicos, incluindo:

(vii) modificadores de respostas biológicas (por exemplo, interfe- ron);

(viii) anticorpos (por exemplo, edrecolomab);

(ix) terapias anti-sentido, por exemplo, aquelas direcionadas pa- ra os alvos listados acima, tais como ISIS 2503, um anti-ras anti-sentido·,

(x) abordagens de terapia gênica, incluindo, por exemplo, abor- dagens para substituir genes aberrantes, tais como p53 aberrante ou BRCA1 or BRCA2, GDEPT aberrante (terapia com pró-fármacos enzimas direciona- das a genes) abordagens tais como aquelas que usam citosina deaaminase, timidina cinase ou uma enzima nitro-redutase bacteriana e abordagens para aumentar a tolerância dos pacientes à quimioterapia ou radioterapia, tal co- mo a terapia gênica de resistência a múltiplos fármacos; e

(xi) abordagens de imunoterapia, incluindo, por exemplo, abor- dagens ex-vivo e in vivo para aumentar a imunogenicidade de células tumo- rosas de pacientes, tais como transfecção com citocinas tais como interleu- cina 2, interleucina 4 ou fator estimulador de colônias de granulóci- tos-macrófagos, abordagens para diminuir a anergia de células T, aborda- gens que usam células imunes transfectadas, tais como células dendríticas transfectadas com citocinas, abordagens que usam linhagens de células tu- morosas transfectadas com citocinas e abordagens que usam anticorpos antiidiotípicos.

Por exemplo, um sal hidrogenossulfato do Composto 1 pode ser usado em conjunto com uma quantidade eficaz de uma ou mais substâncias selecionadas entre agentes antiangiogênese, inibidores da transdução de sinais, e agentes antiproliferativos.

Emu ma modalidade específica, os agentes antiangiogênese, tais como inibidores de MMP-2 (metaloproteinase de matriz 2), inibidores de MMP-9 (metaloproteinase de matriz 9), e inibidores de COX-II (ciclooxigena- se II), podem sedr usados em conjunto com um sal hidrogenossulfato do Composto 1 da presente invenção e composições farmacêuticas aqui descri- tas. Os exemplos de inibidores de COX-II úteis incluem CELEBREX® (ale- coxib), valdecoxib, e rofecoxib. Os exemplos de inibidores de metaloprotei- nases de matriz estão descritos nos documentos n— WO 96/33172, WO 96/27583, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, patente n2 US 5.863.949, e patente n2 US 5.861.510, sendo todos estes documentos aqui incorporados em sua totalidade como referência. Os inibidores de MMP-2 e MMP-9 apropriados são aqueles têm pouca ou ne- nhuma atividade para inibir MMP-1. Particularmente, são usados aqueles que inibem seletivamente MMP-2 e/ou MMP-9 em relação a outras metalo- proteinases de matriz (isto é, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-I2, e MMP-I3). Os exemplos espe- cíficos de inibidores de MMPs úteis na presente invenção são AG-3340, RO 32-3555, e RS 13-0830.

Portanto, um outro aspecto da presente invenção é o sal hidro- genossulfato do Composto 1 em combinação com qualquer um dos agentes antitumorais listados nos itens (i) - (xi) acima. Um outro aspecto da presente invenção fornece o sal hidrogenossulfato do Composto 1 em combinação com um ou mais dos agentes antitumorais listados nos itens (i) - (xi) acima.

Um outro aspecto da presente invenção fornece o sal hidrogenossulfato do Composto 1 em combinação com qualquer uma das classes de agents anti- tumorais listados nos itens (i) - (xi) acima.

Neste relatório descritivo, quando o termo "combinação" é utili- zado, deve-se entender que ele refere-se à administração simultânea, sepa- rada ou seqüencial. Em um aspecto da invenção, "combinação" refere-se à administração simultânea. Em outro aspecto da invenção, "combinação" re- fere-se à administração separada. Em um outro aspecto da invenção, "com- binação" refere-se à administração seqüencial. Quando a administração é seqüencial ou separada, a demora em administrar o segundo componente não deve ser tal que se perca o efeito benéfico da combinação.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se um kit que compreende o sal hidrogenossulfato do Composto 1 em combi- nação com um agente antitumoral selecionado entre um listado nos itens (i) - (xi) acima.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se um kit que compreende:

a) o sal hidrogenossulfato do Composto 1 em uma primeira for- ma de dosagem unitária;

b) um agente antitumoral selecionado entre um listado nos itens (i) - (xi) acima; em uma segunda forma de dosagem unitária; e

c) um meio contentar para conter as ditas primeira e segunda formas de dosagem.

O Composto 1 demonstrou ter atividade no ensaio que se se- gue. MEK1 constitutivamente ativa, marcada com 6 His no terminal N (2- 393) é expressada em E. colie a proteína é purificada por métodos conven- cionais (Ahn et ai, Science 265:966-970 (1994)). A atividade de MEKI é ava- liada medindo a incorporação de y-33P-fosfato de γ-33Ρ-ΑΤΡ em ERK2 mar- cada com His no terminal N, que é expressada em E. colie é purificada por métodos convencionais, na presença de MEK1. O ensaio é conduzido em uma placa de polipropileno com 96 cavidades. A mistura de incubação (100 μI) compreende Hepes 25 mM, pH 7,4, MgCI2 10 mM, β-glicerolfosfato 5 mM, ortovanadato de sódio 100 μΜ, DTT 5 mM, MEK1 5 nM, e ERK2 1 μΜ. Os inibidores são colocados em suspensão em DMSO, e todas reações, in- cluindo os controles, são realizadas em uma concentração final de 1% de DMSO. As reações são iniciadas pela adição de ATP 10 μΜ (com 0,5 μΏ de y-33P-ATP/cavidade) e incubadas à temperatura ambiente por 45 minutos. Um volume igual de TCA a 25% é adicionado apra interromper a reação e precipitar as proteínas. As proteínas precipitadas são retidas sobre placas de filtro de fibra de vidro B, e o excesso de ATP marcado é removido por lava- gem usando um colhedor Tomtec MACH III. As placas são deixadas secar ao ar antes de adicionar 30 pL/cavidade de Packard Microscint 20, e as pla- ees são contadas usando um Packard TopCount. Neste ensaio, o Composto 1 apresentou uma Cl50 menor do que 50 micromolar.

EXEMPLOS

Para ilustrar a invenção, são incluídos os exemplos que se se- guem. Entretanto, deve-se entender que estes exemplos não limitam a in- venção e temcionam apenas sugerir um método para praticar a invenção. Os rendimentos são fornecidos para os exemplos como realizados, e poderiam ser possivelmente melhorados através de desenvolvimento adicional. O es- pectro de 1H RMN (400 MHz) foi referenciado para TMS (0,00 ppm), o es- pectro de 13C RMN (100 MHz) foi referenciado para o solvente da RMN (39,5 ppm) e o espectro de 19F RMN foi referenciado para tricloro-flúor-metano (0,00 ppm). Os espectros de FTIR foram obtidos em um espectrômetro Nico- let Magna 860 ESP FTIR de várias maneiras, incluindo a partir de uma dis- persão a 2% p/p deste material em kBr em pó, usando a técnica de amos- tragem DRIFTS, em cima da região espectral infravermelha mediana de 4.000-400 cm"1.

Exemplo 1

Preparação do sal hidrogenossulfato do Composto 1

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Adicionou-se ácido sulfúrico (12,3 mL, 0,226 mol), e em seguida água (115 mL), a uma suspensão da (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4- bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (100 g, 0,206 mol) (obtenível como descrito no Exemplo 10 do documento n- WO 03/077914, que é aqui incorporado como referência e como descrito abaixo) em 2-butanona (680 mL) e água (115 mL) sob agitação a 0-5°C, mantendo uma temperatura de 10°C ou mais baixa. A mistura sob agitação foi aquecida até 65°C e mantida por 30 minutos antes de filtrar para remover qualquer matéria estranha. O filtro foi lavado com uma mistura de 2- butanona (85 mL) e água (15 mL). Os filtrados combinados foram aquecidos até 72°C antes de adicionar 2-butanona (500 mL), mantendo uma tempera- tura entre 60-72°C. A mistura resultante foi destilada à pressão atmosférica (temperatura de destilação aproximada de 73-74°C) até que 500 mL de des- tilado fossem coletados.

Uma segunda fração de 2-butanona (500 mL) foi adicioanda, mantendo a temperatura da mistura acima de 70°C. A mistura resultante foi destilada novamente até que 250 mL de destilado fossem coletados. A mis- tura foi resfriada até 0-5°C durante aproximadamente 1 hora. A lama resul- tante foi filtrada, lavada com 2-butanona (240 mL) e secada sob pressão re- duzida a 50°C, até atingir peso constante, para dar o hidrogenossuIfato da (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3- metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (103,5 g, 0,186 mol, 90% de rendimen- to) como um sólido cristalino branco. 1H RMN (400 MHz, D6 DMSO) δ 3.58 (2H, t, CH2OH), 3.89 (2H, t, CH2ON), 3.99 (3H, s, CH3), 6.47 (1H, dd, ArH), 7.29 (1H, dd, ArH), 7.63 (1H, d, ArH), 7.91 (1H, s, ArH), 7.96 (3H, br, ROH, NH, SOH), 8.10 (1H, br, ArNH), 8.94 (1H, s, NCHN), 11.79 (1H, s, ONH). 13C RMN (100 MHz, D6 DMSO) δ 32.1 (CH3), 58.5 (CH2OH), 77.3 (CH2ON), 108.2 (CH), 109.6 (CBr), 115.8 (CH), 120.6 (CCI), 122.0 (C), 125.0 (CC=O)1 129.4 (C), 130.5 (CH), 131.1 (CH), 132.3 (C), 140.6 (C), 145.8 (CF), 146.5 (CH), 164.2 (C=O).

Os resultados da análise infravermelha estão ilustrados na Figu- ra 2. As designações espectrais estão resumidas na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 22</column></row><table> <table>table see original document page 23</column></row><table>

Exemplo 1A

Preparação do sal hidroaenossulfato do Composto 1

Adicionou-se ácido sulfúrico (1,52 mL, 27,86 mmols) a uma sus- pensão de (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-clorofenil-amino)-7- flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (10 g, 0,0214 mol) (obtenível como descrito no Exemplo 10 do documento n2 WO 03/077914, que é aqui incorporado como referência e como descrito abaixo) em tetraidrofurano (THF) (62 mL) e água (8 mL), sob agitação, mantendo uma temperatura de 10°C ou mais baixa. A mistura sob agitação foi aquecida até 65°C e mantida 5 por 30 minutos, antes de filtrar para remover qualquer matéria estranha. De- pois, adicionou-se THF (150 mL) à mistura, mantendo a temperatura acima de 60°C. A mistura foi então resfriada até 0-5°C durante aproximadamente 2 horas. A lama resultante foi filtrada, lavada com THF (30 mL) e secada sob pressão reduzida a 50°C até atingir peso constante, para dar o sal hidroge- nossulfato da (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenil- amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (9,81 g, 0,17 mol, 82% de rendimento) como um sólido cristalino esbranquiçado. O material foi igual àquele produzido no Exemplo 1 acima.

Exemplo 1B

Preparação da (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2- cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico

Etapa A: Ácido 2.3,4-triflúor-5-nitro-benzóico: Um frasco de 3 li- tros com fundo redondo e três gargalos foi carregado com 125 mL de H2SO4. Adicionou-se ácido nítrico fumegante (8,4 mL, 199 mmols) e a mistura foi agitada suavemente. Adicionoue ácido 2,3,4-triflúor-benzóico (25 g, 142 mmols) em 5 parcelas de 5 g durante 90 minutos. A solução amarelo- amarronzada escura foi agitada por 60 minutos quando a reação se comple- tou. A mistura reativa foi vertida sobre 1 litro de uma mistura de gelo/água e extraída com etóxi-etano (3 χ 600 mL). Os extratos combinados foram seca- dos (MgSO4) e concentrados sob pressão reduzida, para dar um sólido ama- relo. O sólido foi colocado em suspensão em hexanos e agitado por 30 min, e depois disso, ele foi filtrado para dar 29 g (92%) do produto desejado puro como um sólido amarelado: MS APCI (-) m/z 220 (M-1) detectado.

Etapa B: Ácido 4-amino-2,3-diflúor-5-nitro-benzóico: Adicionou- se solução de hidróxido de amônio (-30% em água) (35 mL, 271 mmols) a uma solução de ácido 2,3,4-triflúor-5-nitro-benzóico (15 g, 67,8 mmols) em 30 mL de água a 0°C sob agitação. Depois de completada a adição de hi- dróxido de amônio, a mistura reativa foi aquecida até a temperatura ambien- te sob agitação. Depois de 2,5 horas, a mistura reativa foi resfriada até 0°C e adicionou-se cuidadosamente HCI concentrado até que o pH da mistura rea- tiva fosse 0. A mistura reativa foi diluída com água (30 mL) e extraída com etóxi-etano (3 χ 50 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secados (MgSO4) e concentrados sob pressão reduzida, para dar 14 g (95%) do pro- duto desejado puro: MS APCI (-) m/z 217 (M-1) detectado.

Etapa C: 4-amino-2,3-diflúor-5-nitro-benzoato de metila: Uma solução 2 M de tetrametil-silano(TMS)-diazometano em hexanos (6,88 mL, 13,75 mmols) foi adicionada a uma suspensão de ácido 4-amino-2,3-diflúor- 5-nitro-benzóico (2,00 g, 9,17 mmols) em 25 mL de tetraidrofurano (THF): MeOH 4:1 a O0C sob uma atmosfera de nitrogênio. Depois de coketada a adição, a mistura reativa foi aquecida até a temperatura ambiente. Depois de 0,5 h, o excess de TMS-diazometano foi destruído pela adição cuidadosa de ácido acético. A reação foi então concentrada sob pressão reduzida e seca- da sob vácuo, para dar 1,95 g (92%) do produto desejado puro: MS APCI (-) m/z 231 (M-1) detectado.

Etapa D: 4-amino-3-flúor-5-nitro-2-fenil-amino-benzoato de meti- la: O 4-amino-2,3-diflúor-5-nitro-benzoato de metila (23,48 g, 101,1 mmols) foi colocado em suspensão em xilenos (125 mL) e adicionou-se anilina (92 mL, 1,011 mmol). A mistura reativa foi agitada a 125°C por 16 horas sob N2. A mistura reativa foi resfriada até a temperatura ambiente e os sólidos preci- pitaram para fora da solução. Os sólidos foram coletados por filtração e la- vados com xelenos e depois com etóxi-etano. Foram recuperados 22,22 g (72,78 mmols) de um sólido amarelo que era o produto desejado puro. O filtrado foi concentrado subpressão reduzida, redissolvido em cloreto de me- tileno e descarregado através de um botoque de sílica-gel, eluindo com clo- reto de metileno. As frações desejadas forma concentradas sob pressão re- duzida, para dar um sólido marrom que foi triturado com etóxi-etano para dar 5,47 g (17,91 mmols) de um sólido amarelo que era o produto desejado pu- ro. O rendimento do produto combinado foi de 27,69 g (90%). MS APCI (-) m/z 304 (M-1) detectado. Etapa Ε: 7-flúor-6-fenil-amino-3H-benzoimidazol-5-carboxilato de metila: 4-amino-3-flúor-5-nitro-2-fenil-amino-benzoato de metila (16,70 g, 54,71 mmols), ácido fórmico (250 mL, 6,63 mol) e 20% de Pd(OH)2/C (9,00 g, 16,91 mmols) em etanol (250 mL) foram agitados a 40°C por duas horas sob N2 e depois a 95°c por 16 horas. A mistura reativa foi resfriada até a temperatura ambiente e filtrada através de Celite, enxaguando com acetato de etila. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, para dar um sólido amarelo. O sólido foi triturado com etóxi-etano, para dar 13,47 g (86%) do produto desejado como um sólido bronzeado. MS APCI (+) M/Z 286 (M+1) detectado; MS APCI (-) m/z 284 (M-1) detectado.

Etapa F: 6-(4-bromo-fenil-amino)-7-flúor-3H-benzoimidazol-5- carboxilato de metila: 7-flúor-6-fenil-amino-3H-benzoimidazol-5-carboxilato de metila (4,99 g, 17,51 mmols) foi dissolvido em /V,/V-dimetil-formamida (275 ml). Adicionou-se N-bromo-succinimida (3,15 g, 17,70 mmols) como um sólido, e a mistura reativa foi agitada à temperatura ambiente sob N2. Depois de 30 minutos, a mistura reativa foi interrompida rapidamente pela adição de solução aquosa saturada de bissulfito de sódio. A mistura reativa foi então vertida para dentro de um funil separador, diluída com água e acetato de etila, e as camadas foram separadas. A camada quosa foi extraída com ace- tato de etila. Os extratos orgânicos combinados foram lavados três vezes com água, uma vez com salmoura e depois secados (Na2SO^ e concentra- dos sob pressão reduzida para produzir 6,38 g (100%) do produto desejado puro como um sólido bronzeado. MS ESI (+) m/z 364, 366 (padrão M+ Br) detectado.

Etapa G: 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3H-benzoimida- zol-5-carboxilato de metilar: 6-(4-bromo-fenil-amino)-7-flúor-3H-benzoimida- zol-5-carboxilato de metila (6,38 g, 17,51 mmols) foi dissolvido em N,N- dimetil-formamida (275 mL). Adicionou-se N-cloro-succinimida (2,36 g, 17,70 mmols) como um sólido e a mistura reativa foi agitada à temperatura ambi- ente sob N2 até completer a reação (5-6 dias). A mistura reativa foi interrom- pida rapidamente pela adição de solução aquosa saturada de bissulfito de sódio, para dar uma suspensão. Os sólidos resultantes foram coletados por filtração, lavados com água e etóxi-etano e secados sob pressão reduzida para produzir 6,07 g (87%) do produto desejado puro como um sólido bege. MS ESI (+) m/z 398, 400 (padrão M+ Br) detectado.

Etapa H: 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H- benzoimidazol-5-carboxilato de metila e 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7- flúor-1-metil-1H-benzoimidazol-5-carboxilato de metila: Uma solução de 6-(4- bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3H-benzoimidazol-5-carboxilato de metila (150 mg, 0,38 mmol), iodo-metano (28 μL, 0,45 mmol) e carbonato de potás- sio (78 mg, 0,56 mmol) em dimetil-formamida (1,5 mL) foram agitados a 75 °C por uma hora. A mistura reativa foi diluída com acetato de etila, lavada com solução aquosa saturada de carboanto de potássio (2x) e salmoura, e secada (Na2SO4). A cromatografia instantânea em coluna (cloreto de meti- leno/acetato de etila 20:1) produziu 56 mg (36%) do mais móvel 6-(4-bromo- 2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxilato de metila como um sólido branco. 19F RMN (376 MHz, CD3OD) - 133,5 (s). MS APCI (+) m/z 412, 414 (padrão M+, Br) detectado. Foram isolados também 54 mg (35%) de 6-4(-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-1-metil-1H-benzoimidazol- 5-carboxilato de metila como um sólido branco. 19F RMN (376 MHz, CD3OD) -139,9 (s). MS APCI(+) m/z 412, 414 (padrão M+, Br) detectado.

Etapa I: Ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil- 3H-benzoimidazol-5-carboxílico: 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3- metil-3H-benzoimidazol-5-carboxilato de metila (56 mg, 0,14 mmol) foi dis- solvido em THF/água 2:1 (3 mL) e adicionou-se NaOH (0,55 mL, solução aquosa 1,0 M, 0,55 mmol). Depois de agitar por duas horas, a reação foi e- vaporada até um quarto do volume inicial por intermédio de evaporação rota- tiva e o restante foi diluído até 50 mL com água. A solução aquosa foi acidifi- cada até pH 2 pela adição de solução aquosa 1,0 M de HC1 e extraída com tetraidrofurano/acetato de etila 1:1 (3x), secada (Na2SO4) e concentrada sob pressão reduzida para produzir 43 mg (79%) do ácido carboxílico puro como um sólido esbranquiçado. MS ESI (+) m/z 397, 398 (padrão M+, Br) detecta- do.

Etapa J: (2-vinilóxi-etóxO-amida do ácido 6-(4-bromo-2 cloro- fenil-amino-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxnico: O ácido 6-(4-bro- mo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (2,00 g, 5,0 mmols), 0-(2-vinilóxi-etil)-hidroxilamina (0,776 g, 7,5 mmols), HOBt (0,88 g, 6,5 mmols), trietil-amina (1,61 mL, 2,3 mmols) e EDC1 (1,3 g, 6,5 mmols) foram dissolvidos em dimetil-formamida (52 mL), e agitados à tem- peratura ambiente por 48 horas. A mistura reativa foi diluída com acetato de etila, lavada com água (3x), solução saturada de carboanto de potássio (2x), solução saturada de cloreto de amônio (2x), e salmoura, e secada (Na2SO4) e concentrada sob pressão reduzida para dar um sólido esbranquiçado. A trituração do sólido com etóxi-etano produziu 2,18 g (90%) do produto dese- jado como um sólido esbranquiçado. MS ESI (=) m/z 483, 485 (padrão M+ Br) detectado.

Etapa K:(2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro- fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico: Ácido clorídrico (14 mL, solução aquosa 1,0 M, 14 mmols) foi adicionado a uma suspensão de (2-vinilóxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3- metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (2,18 g, 4,50 mmols) em ètanol (50 mL), e a mistura reativa foi deixada agitando por 24 horas. A mistura reativa foi concentrada até secar por evaporação rotativa e os sólidos foram fracio- nados entre acetato de etila/tetraidrofurano 3:1 e solução saturada de carbo- anto de potássio. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila/ tetraidrofu- rano 3:1 (3x), os extratos orgânicos combinados foram secados (Na2SO4) e concentrados para produzir 2,11 g (100%) de (2-hidróxi-etóxi)-amida do áci- do 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carbo- xílico, como um sólido esbranquiçado. MS ESI (+) m/z 457, 459 (padrão M+, Br) detectado. 1H RMN (400 MHz, MeOH-d4) δ 8,26 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,24 (dd, 1H), 6,40 (dd, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,79 (m, 2H), 3,49 (m, 2H), 19F RMN (376 MHz, MeOH-d4)-133,68 (s). Exemplo 2

Investigação das propriedades físicas do sal hidroqenossulfato

O produto do Exemplo 1 foi submetido aos testes que se se- guem para determinar suas propriedades físicas. Difracão de raios X de pó (PXRD)

Todas amostras foram operadas em um difratômetro Bruker D5000. Os espectros da difração de raios X de pó foram determinados mon- tando uma amostra do sal cristalino sobre uma bolacha de monocristal de silício Siemens e espalhando a amostra em uma camada fina com o auxílio de uma lamina de microscópio. A amostra foi girada a 30 revoluções por mi- nuto (para melhorar a estatística da contagem) e irradiada com raios X gera- dos por um tubo de cobre com foco longo fino operado a 40 kV e 40 mA com um comprimento de onda de 1,5406 angstrons. A fonte de raios X colimados foi passada através de uma fenda de divergência variável automática ajusta- da em V20 e a radiação refletida foi direcionada através de uma fenda anti- dispersiva de 2 mm e uma fenda detectora de 0,2 mm. A amostra foi exposta por 1 segundo por increment de 0,02 grau 2-teta (modo de varredura contí- nuo) cobrindo a faixa de 2 graus até 40 graus 2-teta no modo teta-teta. O tempo de operação foi de 31 minutos e 41 segundos. O instrumento era e- quipado com um contador de cintilação como detector. O controle e a capta- ção dos dados foi por meio de uma Dell Optiplex 686 NT 4.0 Workstation, operand com o software Diffract+.

Os dados foram coletados cobrindo a faixa de 2-teta 2 - 40°, em incrementos de 2-teta 0,02° com 4 s por incremento e estão classificados na Tabela 2, com intensidades relativas derivadas a partir de difratogramas me- didos com fendas fixas.

Tabela 2

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Os resultados da varredura estão indicados na Figura 1, onde a linha cinza superior representa a XRPD do sal hidrogenossulfato do Com- posto 1 e a linha preta inferior representa a forma livre. Os picos mais inten- sos, iniciando com o mais intenso, estão indicados na Tabela 3. O pico a 24,59° é particularmente forte.

Tabela 3

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Os versados nessas técnicas de difração de raios X de pó de- vem avaliar que a intensidade relativa dos picos pode ser afetada, por e- xemplo, por grãos com tamanho acima de 30 mícrons e razões de aspecto não-unitárias, que podem afetar a análise das amostras. Os versados nes- sas técnicas devem avaliar também que a posição das reflexões pode ser afetada pela altura precisa na qual a amostra está assentada no difratômetro e pela calibração zero do difratômetro. A planaridade da superfície da amos- tra também pode ter um pequeno efeito. Assim sendo, os dados de padrões de difração apresentados não devem ser considerados como valores absolu- tos (vide Jenkins1 R. & Snyder, R.L., "Introduction to X-Ray Powder Diffrac- tometry", John Wiley & Sons, 1996, para obter mais informações).

Exemplo 3

Investigação ln-vivo: Estudo de sais versus base livre na formulação disper- sada

Foi realizado um estudo em cães para medir os níveis plasmáti- cos do Composto 1 em cães sob jejum após a administração de doses orais equivalentes a 150 mg de base livre em 7,5 mL de várias formulações em dispersão em agentes dispersantes farmaceuticamente aceitáveis com o Composto 1 contido como a forma livre do sal hidrogenossulfato. Doses únicas de 150 mg foram adminsitradas por via oral a cães beagle em jejum que pesavam 12-17 kg e tinham cerca de 2 a 6 anos de idade, em cada um dos três dias de dosagem. Os dias de dosagem foram espaçados em 1 semana.

Todas formulações foram preparadas de forma extemporânea momentos antes da dosagem, adicionando 7,5 mL da solução dispersante apropriada, por intermédio de uma seringa descartável de 10 mL, a frascos que continham 150 mg equivalentes de base livre da forma apropriada do fármaco, tampando e turbilhonando por 30 segundos, para formar uma dis- persão.

A dispersão foi removida do frasco usando a seringa descartável e dosada para o animal por intermédio de um tubo de gavagem posicionado dentro do estômago. Os frascos foram enxaguados duas vezes adicionando, em cada um dos dois enxágües, uma porção separada de 15 mL de água (volume total do enxágüe = 30 mL) por intermédio de uma seringa descartá- vel de 20 mL, tampando, turbilhonando por 5 segundos, removendo a solu- ção de lavagem do frasco usando a seringa descartável e administrando ao animal por intermédio do tubo de gavagem.

Os cães foram alimentados com cerca de 400 g de Dieta "Spe- ciai Diet Services Laboratory" A, em cada dia, e tinham água à vontade. O sangue total (2 mL) em tubos heparina lítio foi retirado pela veia jugular ime- diatamente antes da dosage e em 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 18, 24, 36 e 48 horas. O sangue foi centrifugado a 3.000 rpm por 15 minutos e o plasma foi removido para dentro de tubos de sangue vazios e o plasma foi estocado a - 20°C até a análise.

O plasma (50 μί) foi analisado quanto à concentração do Com- posto 1. Dois cães foram excluídos da análise, pois eles tinham vomitado momentos depois da dosagem. Os perfis das concentrações plasmáticas médias para o Composto 1 observados depois da dosagem oral estão indi- cados na Figura 3, onde a linha representada por ▲ ilustra uma formulação que incluía o sal hidrogenossuIfato do Composto 1, e a linha representada por χ ilustra os resultados da base livre do Composto 1 na mesma formula- ção.

Parece que mudanças da formulação tiveram um efeito relati- vamente pequeno sobre a exposição (resultados não ilustrados). Entretanto, quando o Composto 1 foi dosado como o sal hidrogenossulfato, um aumento substancial de aproximadamente 4 a 8 vezes na exposição foi produzido.

A descrição precedente é considerada como meramente ilustra- tiva dos princípios da invenção. Além disso, como inúmeras modificações e mudanças devem ficar facilmente evidentes para os versados nessas técni- cas, não se deseja limitar a invenção à construção exata e ao processo des- crito acima. Conseqüentemente, todas modificações e equivalentes apropri- ados podem ser válidos para o âmbito da invenção como definida pelas rei- vindicações que se seguem.

As palavras "compreender", "compreendendo", "incluir", "inclu- indo" e "inclui", quando utilizadas neste relatório descritivo e nas reivindica- ções que se seguem, pretendem especificar a presença das características, números inteiros, componentes, ou etapas assinaladas, mas elas não obs- tam a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, componentes, etapas, ou grupos delas.

Claims (16)

1. Sal hidrogenossulfato, caracterizado pelo fato de ser do com- posto (2-hidróxi-etóxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7- flúor-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico denominado composto 1.

2. Sal hidrogenossulfato de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de ser na forma anidra.

3. Sal hidrogenossulfato de acordo com a reivindicação 1, carac- ter1izado pelo fato de ser na forma de um solvato.

4. Sal hidrogenossulfato de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é cristalino.

5. Sal hidrogenossulfato de acordo com a reivindicação 4, carac- terizado pelo fato de que o dito sal hidrogenossulfato do composto 1 tem um padrão de difração de raios X de pó com pelo menos um pico específico a cerca de 24,59°.

6. Sal hidrogenossulfato de acordo com a reivindicação 5, carac- terizado pelo fato de que o dito sal hidrogenossulfato do composto 1 tem um padrão de difração de raios X de pó com picos específicos a cerca de 2-teta igual a 24,59°, 20,97°, 23,99°, 27,65°, 12,24°, 23,49°, 24,30°, 17,02°, 25,91° e 22,50°.

7. Sal hidrogenossulfato de acordo com a reivindicação 1, carac- -1 terizado pelo fato de que tem um padrão de difração de raios X de pó subs- tancialmente igual ap padrão de difração de raios X de pó ilustrado na Figura -1.

8. Sal hidrogenossulfato de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser na forma amorfa.

9. Método para preparar um sal hidrogenossulfato como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o método compreende (iv) reagir uma pasta do composto 1 em um líquido orgânico com pelo menos uma quantiade estequiométrica de ácido sulfúrico e água; (v) recuperar o sal a partir da solução resultante; e (vi) depois disso, caso desejado ou necessário, formar um solvato dele.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a quantidade de água adicionada na etapa (i) é restrita àquela quantidade necessária para assegurar que o sal seja formado.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteriza- do pelo fato de que a etapa (i) é conduzida em uma temperatura entre 40 e -80°C.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a -11, caracterizado pelo fato de que o líquido orgânico é uma alquil(Ci-6)- cetona.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a -12, caracterizado pelo fato de que o sal hidrogenossulfato é recuperado na etapa (ii) resfriando a mistura reativa, opcionalmente com a adição de mais líquido orgânico, de tal modo que o sal hidrogenossulfato seja precipitado.

14. Sal hidrogenossulfato de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medi- camento para o tratamento de estados doentios medidados por MEK.

15. Uso de um sal hidrogenossulfato como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de estados doentios mediados por MEK.

16. Método para tratar estados doentios medidados por MEK em um mamífero homeotermo que necessita de tal tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz de um sal hidrogenossulfato do composto 1 como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 8.