BRPI0619638A2 - materiais e métodos para o tratamento de doenças fibróticas crÈnicas - Google Patents

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Steven L Kunkel
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Abstract

MATERIAIS E METODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENçAS FIBROTICAS CRONICAS. Métodos e composições para o tratamento de doenças tibrosantes são descritos. Mais especiticamente, a invenção demonstra que a inibição, ou seja, a diminuição da atividade de CCL21 isoladamente ou em combinação com CCL19 será eficaz na redução da presença de lesões fibróticas e melhorando os sintomas de distúrbios fibrosantes.

Description

MATERIAIS E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS FIBRÓTICAS CRÔNICAS
O presente pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido Provisório número 60/753.647, que foi depositado em 23 de dezembro de 2005 e é especificamente aqui incorporado em sua totalidade por referência.
Essa invenção foi feita com o apoio governamental sob a Subvenção N0 P50 HL-56402 concedida pelo "National Institutes of Health". O Governo tem certos direitos na invenção.
Campo da invenção
A presente invenção relaciona-se a métodos e composições para o tratamento de distúrbios de fibrose crônica. Mais particularmente, a invenção relaciona-se à intervenção imunoterapêutica de distúrbios de fibrose crônica.
Fundamento da invenção
Inflamação é a resposta coordenada ao dano tecidual ou infecção. A inflamação inicia com a liberação local de fatores quimiotáticos, ativação de plaquetas e iniciações da coagulação e vias de complemento. Esses eventos estimulam o endotélio local, promovendo o extravasamento de neutrófilos e monócitos. A segunda fase de inflamação é caracterizada pelo influxo no tecido de células do sistema imune de adaptação, incluindo linfócitos. A subseqüente fase de resolução, quando ocorre a apoptose dos leucócitos em excesso e captação por macrófagos teciduais, é também caracterizada por reparação de dano tecidual por células estromais, como fibroblastos.
Em tais mecanismos de reparação fibroblastos locais quiescentes migram para a área afetada, produzem proteínas de matriz extracelular, e promovem contração ou fibrose do ferimento. Também foi sugerido que são essas células precursoras de fibroblastos circulantes, fibrócitos, que estão presentes no sangue migram, aos locais de dano ou fibrose, em que eles se diferenciam e medeiam a reparação tecidual e outras respostas fibróticas. Os fibrócitos se diferencial a partir de uma população precursora de monócitos de sangue periférico CDI4+ e expressa marcadores tanto de células hematopoiéticas (CD45, MHC classe II, CD34) quanto de células estromais (colágeno tipos I e III e fibronectina). Fibrócitos maduros entram rapidamente em locais de dano tecidual em que eles secretam citocinas inflamatórias, bem como proteínas de matriz extracelular, outras citocinas e moléculas pró-angiogênicas, que podem resultar em fibrose.
A diferenciação de fibrócito está associada com várias doenças fibróticas que incluem, mas não são limitadas a escleroderma, cicatriz quelóide, artrite reumatóide, lúpus, dermopatia fibrosante nefrogênica, e fibrose pulmonar idiopática. Eles têm um papel na formação de lesões fibróticas após infecções por Schistosoma japonictim em camundongos e também estão envolvidos em fibrose associada com doenças autoimunes. Fibrócitos estiveram envolvidos em fibrose patogênica associada com dano por radiação, Doença de Lyme e fibrose pulmonar, bem como remodelagem estromal em pancreatite e fibrose estromal, em que a ausência de tais fibrócitos é associada com tumores pancreáticos e adenocarcinomas. A fibrose ocorre adicionalmente em pacientes com asma e possivelmente outras doenças pulmonares como doença pulmonar obstrutiva crônica quando os fibrócitos sofrem diferenciação adicional em miofibroblastos.
Um conjunto específico de doenças que é conhecido por envolver resposta fibrótica não checadas são pneumonias intersticiais idiopáticas, um grupo diverso de doenças pulmonares crônicas caracterizadas por níveis variáveis de fibrose pulmonar. Os fatores principais que dirigem a resposta fibrótica pulmonar dominante associada com várias formas histologicamente distintas de pneumonia intersticial idiopática (IIP) permanece pouco definido, assim contribuindo para a ausência de tratamentos clínicos eficazes para essas doenças.(Green, Overview of pulmonary fibrosis. Chest 2002/122 (supl.6):334S-9S). embora várias dessas doenças exibam uma resposta fibroproliferativa no microambiente alveolar que leva a uma disfunção respiratória, o grau de mudança fibrótica varia consideravelmente entre eis. (Nicholason Am. J. Rest). Crit. Car Med/ 2000:162:2213-7; Chapman J. Clin., Invest., 2004; 113:148-57). É igualmente perplexa a clara demonstração de que agentes antiinflamatórios fornecem benefício terapêutico em formas menos severas de IIP, como pneumonia intersticial não específica (NSIP) e doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória (RBILD) , mas eles falham freqüentemente na prevenção de insuficiência respiratória em pacientes com a forma mais severa e mortal de pneumonia intersticial IIP—usual (UIP).
(Flaherty e cols., Am. J. Med., 110:278-282 (2001); Lynch e cols., Curr. Opin. Pulm. Med., 7:298-308 (2001); Flaherty e cols., Thorax, 58:143-148 (2003)). A existência de focos distintos de fibroblastos, ou focos fibroblásticos, é uma característica patológica importante associada com um prognóstico ruim e um resultado fatal em pneumonia intersticial idiopática. (King e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 164:1025-1032 (2001)). Tratamentos mais novos pode ser seguir após a elucidação dos eventos partilhados e divergentes que contribuem para mudanças fibróticas pulmonares durante o início e manutenção de IIP. (van den Blink e cols., Arch. Immunol.
Ther. Exp. (Warsz), 48:539-545 (2000)). Receptor 7 de quimiocina CC (CCR7; que liga MlP-3b/ CCLl9 e 6-Ckine/CCL21 (Nagira e cols., J. Biol. Chem., 272:19518-19524 (1997)) e receptor 4 de quimiocina CX (CXCR4; que liga SDFl/CXCLI2 (Forster e cols., J. Immunol., 160:1522-1531 (1998)) são receptores de quimiocina que foram amplamente reconhecidos como sendo limitados em sua expressão a células de origem hematopoiética. (Kim e cols., J. Leukoc. Biol., 66:455-461 (1999); Kim e cols., J. Clin. Invest., 108:1331-1339 (2001)). Durante respostas imunes, a expressão de CCR7 facilita o movimento de células dendríticas maduras (Sallusto e cols., Eur. J. Immunol., 29:1617-1625 (1999)) para tecidos linfóides, regula a localização de células T helper tipos 1 e 2 no baço, (Randolph e cols., Science, 286:2159-2162 (1999)) e direciona as células T helper tipo 2 para o pulmão alérgico. (Hammad e cols., J. Immunol., 169:1524-1534 (2002)). A expressão e efeitos de CXCR4 foram amplamente limitados a células imunes derivadas de medula óssea ed. (Ward e cols., Biochem. J., 333:457-470 . (1998); Gonzalo e cols., J. Immunol., 165:499-508 (2000)). Evidência recente que mostra que a expressão de CCR7 e CXCR4 por células de tumor de mama permite que essas células sofram metástase para o pulmão, modificou esse paradigma imunocêntrico. (Muller e cols., Nature, 410:50-56 (2001)) . As células de mama não expressam esses receptores de quimiocina ou respondem aos ligantes que os ligam. (Muller e cols., Nature, 410:50-56 (2001)). Essa observação tem se estendido a vários tipos de tumores que metastatizam, incluindo melanoma (Murakami e cols., J. Dermatol. Sci., 36:71-78 (2004)) e várias formas de leucemia. (Tavor e cols., Câncer Res., 64:2817-2824' (2004); Ghobrial e cols., Mayo Clin. Proc., 79:318-325 (2004)) .
Fibrose pulmonar crônica resulta de cicatrizes nos pulmões que podem ser causadas por várias condições que incluem processos inflamatórios crônicos (sarcoidose, granulomatose de Wegener), infecções, agentes ambientais (asbestos, sílica, exposição a certos gases), exposição a radiação ionizante (como terapia por radiação para tratar tumores do tórax), condições crônicas (lúpus, artrite reumatóide), e ainda certas medicações. Em uma condição conhecida como pneumonite por hipersensibilidade, a fibrose do pulmão pode se desenvolver após uma reação imune aumentada a poeiras orgânicas inaladas ou agentes químicos ocupacionais. Essa condição resulta mais freqüentemente da inalação de poeira contaminada com bactérias, fungos, ou produtos animais. Em alguns tipos de fibrose pulmonar, como pneumonite intersticial não específica (NSIP) , o indivíduo pode responder à terapia imune supressiva. Quando, como freqüentemente ocorre, a inflamação pulmonar crônica e fibrose se desenvolvem sem uma causa identificável, o indivíduo que sofre da doença freqüentemente não responderá à terapia médica. Isso é particularmente verdadeiro de indivíduos que sofrem de fibrose pulmonar idiopática (IPF). As opções de tratamento para fibrose pulmonar idiopática são muito limitadas. Não há qualquer evidência de que quaisquer medicações possam ajudar essa condição, uma vez que a cicatrização é permanente uma vez que ela se desenvolve. O transplante pulmonar é a única opção terapêutica disponível. Experimentos de pesquisa que usam diferentes medicamentos que podem reduzir as cicatrizes fibrosas estão em andamento. Uma vez que alguns tipos de fibrose pulmonar podem respondes a corticosteróides (como Prednisona) e/ou outras medicações que suprimem o sistema imune do corpo, esses tipos de medicamentos são algumas vezes descritos em uma tentativa de diminuir os processos que levam à fibrose. Todavia, é bem reconhecido que no momento não há tratamentos para doenças fibrosantes. É prática clínica padrão administrar aos pacientes prednisona e azatioprina mas não há qualquer dado que mostre que esses medicamentos forneçam qualquer benefício terapêutico. De fato, os efeitos colaterais desses medicamentos podem contribuir para a mortalidade de pacientes de UIP.
Embora quimiocinas possam estar envolvidas com a formação de focos fibroblásticos e a amplificação da resposta fibrótica em fibrose pulmonar, o papel particular do mediador pró-fibrótico presente no meio durante a fibrose pulmonar crônica permanece obscuro. A presente invenção identifica o papel de quimiocinas específicas e seus receptores e fornece novos métodos e composições para terapia, especialmente para os distúrbios idiopáticos que são refratários à terapia médica. Sumário da invenção
A presente invenção é direcionada a métodos e composições para o tratamento de doenças fibrosantes. Mais especificamente, a invenção demonstra que a inibição ou a diminuição na atividade de CCL21 isoladamente ou em combinação com CCL19 será eficaz na redução da presença de lesões fibróticas e melhoria dos sintomas de distúrbios fibrosantes.
Portanto, em modalidades específicas a invenção é direcionada a métodos de tratamento de um distúrbio fibrosante crônico em um mamífero que compreende a diminuição da presença ou atividade de CCL21 nos fibrócitos e/ou fibroblastos presentes na lesão fibrótica no referido distúrbio fibrosante. O método, em certas modalidades, também pode compreender a diminuição da presença ou atividade de CCL19 nos fibroblastos associados com o referido distúrbio fibrosante. Por exemplo, a diminuição da presença ou atividade de CCL21 podem compreender o contato do referido mamífero com um agente que remova CCL21 dos referidos fibroblastos, em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais dos sintomas do referido distúrbio fibrosante crônico. Um exemplo de tal agente pode ser um anticorpo que é especificamente imunorreativo com CCL21, como, por exemplo, um anticorpo que reconhece preferencialmente epitopos em CCL21 quando comparado a outras quimiocinas.
Em outras modalidades, a diminuição da presença ou atividade de CCL21 compreende o contato do referido mamífero com um agente que diminui a expressão de CCL21 nos referidos fibroblastos, em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais dos sintomas do referido distúrbio fibrosante crônico. Um exemplo de agente para tais modalidades pode ser uma molécula de siRNA direcionada contra CCL21.
0 distúrbio fibrosante tratável pela invenção pode ser qualquer distúrbio fibrosante, que inclui, mas não é limitado a um que é selecionado do grupo que consiste em fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose hepática, artrite reumatóide, insuficiência cardíaca congestiva, doença renal crônica, pneumonite por hipersensibilidade, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória, infecção por Schistosoma mansoni, hipertensão pulmonar primária (prevenção da formação da lesão plexiforme) doenças associadas ao herpes vírus, que incluem manifestações pulmonares e dermatológicas; cicatriz quelóide, lúpus, dermopatia de fibrose nefrogênica, lesões de fibrose associadas com infecção por Schistosoma japonicum, doenças autoimunes, fibrose patogênica, Doença de Lyme, remodelagem estromal em pancreatite e fibrose estromal, fibróides uterinos, fibrose ovariana, fibrose corneana insuficiência cardíaca congestiva e outras condições pós-isquêmicas, cicatrizes pós-cirúrgicas que incluem adesões abdominais, trabeculotomia de glaucoma de ângulo aberto, e qualquer combinação desses.
Hipertensão pulmonar típica a ser tratada de acordo com a invenção inclui hipertensão pulmonar primária (PPH); hipertensão pulmonar secundária (SPH); PPB familiar; PPH esporádico; hipertensão pulmonar pré-capilar; hipertensão arterial pulmonar (PAH); hipertensão da artéria pulmonar; hipertensão pulmonar idiopática; arteriopatia pulmonar trombótica (TPA); arteriopatia pulmonar plexogênica; hipertensão pulmonar de classes funcionais I a IV; e hipertensão pulmonar associada com, relacionada a, ou secundária a, disfunção ventricular esquerda, doença valvular mitral, pericardite constritiva, estenose aórtica, cardiomiopatia, fibrose mediastínica, drenagem venosa pulmonar anômala, doença veno-oclusiva pulmonar, doença vascular de colágeno, doença cardíaca congênita, infecção por vírus HIV, medicamentos e toxinas como fenfluraminas, doença cardíaca congênita, hipertensão pulmonar venosa, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, transtornos respiratórios do sono, distúrbio de hipoventilação alveolar, exposição crônica a alta altitude, doença pulmonar neonatal, displasia alveolar- capilar, doença falciforme, outro distúrbio da coagulação, tromboembolia crônica, doença do tendo conjuntivo, lúpus, esquistossomose, sarcoidose ou hemangiomatose capilar pulmonar.
Hipertensão pulmonar a ser tratada de acordo com a invenção é mais particularmente hipertensão pulmonar associada com distúrbios do sistema respiratório e/ou hipoxemia, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, distúrbios respiratórios do sono, distúrbios de hipoventilação alveolar, exposição crônica â alta altitude, doença pulmonar neonatal e displasia alveolar-capilar, mas especialmente doença pulmonar obstrutiva crônica. Em modalidades preferidas, o distúrbio fibrosante é fibrose pulmonar crônica. Nos métodos de tratamento, o composto pode ser administrado localmente ao local da lesão fibrosante. Em modalidades mais específicas, a lesão fibrosante está em um pulmão e a composição faz contato local com a referida lesão. Em certas modalidades, é contemplado que o agente compreende uma porção de direcionamento para localizar especificamente o referido agente ao local da lesão fibrosante.
Em modalidades específicas, o anticorpo ou a
composição anti-CCL21 ou anti CCL19 é administrada com o uso de um modo de administração selecionado do grupo que consiste em administração tópica, injeção, inalação, liberação contínua por depósito ou bomba, ou quaisquer combinações desses.
Um outro aspecto da invenção é um método A de inibição de proliferação de fibroblasto e/ou fibrócito que compreende o contato do referido fibroblasto e/ou fibrócito com uma composição que compreende um anticorpo anti-CCL21 ou uma molécula de siRNA designada contra CCL21. Em algumas modalidades, o método também compreende o contato do
referido fibroblasto com uma composição que compreende um anticorpo anti-CCL19 ou uma molécula de siRNA projetadas contra CCL19. Ainda em outras modalidades, o método também compreende o contato do referido fibroblasto com uma composição que compreende um anticorpo anti-CCR7 ou uma molécula de siRNA projetada contra o receptor CCR7. Os fibrócitos e/ou fibroblastos sendo tratados podem ser localizados in vitro, ou in vivo. Preferivelmente, eles são localizados in vivo. Mais preferivelmente, eles são localizados in vivo em tecido pulmonar. Também são incluídos métodos de inibição da migração de fibrócitos e/ou ativação de fibroblastos que compreende o contato dos referidos fibrócitos e/ou fibroblastos com uma composição que inibe aquela atividade de CCL21. Em tais métodos em que fibrócitos são localizados in vivo em um mamífero e o referido método inibe a migração de fibrócitos para o tecido pulmonar no referido mamífero, dessa forma evitando a excessiva produção de matriz extracelular. Nesses métodos os fibroblastos preferivelmente são fibroblastos pulmonares residentes localizados em tecido pulmonar em um mamífero e o referido método inibe a ativação dos referidos fibroblastos no tecido pulmonar no referido mamífero, dessa forma evitando a excessiva produção de matriz extracelular.
Também é ensinado aqui um método de tratamento de fibrose pulmonar que compreende a inibição da migração de fibrócitos e/ou a ativação de fibroblastos pulmonares residentes localizados em tecido pulmonar em um mamífero que sofre de doença pulmonar fibrótica por inibição da atividade ou expressão de CCL21 no referido fibrócitos e/ou os referidos fibroblastos dessa forma evitando a excessiva produção de matriz extracelular e melhorando os sintomas de fibrose pulmonar.
Também são contemplados métodos de tratamento de, inibição do desenvolvimento de, melhoria de um ou mais sintomas de, reversão da condição ou, de outro modo, atingir um resultado terapêutico em laminite pulmonar induzida por radiação e/ou fibrose pulmonar induzida por radiação em um indivíduo que compreende a administração ao referido indivíduo de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar do referido indivíduo, em que o referido agente é administrado antes, e/ou durante, e/ou após a administração de terapia por radiação. Tal método terapêutico também compreende a administração de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL19 no tecido pulmonar do referido indivíduo.
Um aspecto adicional da presente invenção contempla métodos de tratamento de, inibição do desenvolvimento de, melhoria de um ou mais sintomas de, reversão da condição ou, de outro modo, atingir um resultado terapêutico em fibrose pulmonar induzida por medicamento em um indivíduo que compreende a administração ao referido indivíduo de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar do referido indivíduo, em que o referido agente é administrada antes, e/ou durante, e/ou após a administração do medicamento. Novamente, pode ser desejável em tal método também administrar um agente que diminua a presença ou atividade de CCL19 no tecido pulmonar do referido indivíduo. Há inúmeros medicamentos que causam fibrose, tais agentes incluem, sem limitação, agentes citotóxicos, antibióticos, agentes anti-arrítmicos, agentes antiinflamatórios, e medicamentos ilícitos. Exemplos de agentes que causam fibrose pulmonar incluem, sem limitação, Anfotericina B, bleomicina, bromocriptina, busssulfan, carbamazepina, clorambucil, cocaína, ciclofosfamida, difenilhidantoína, ergotamina, flecainida, heroína, melfalan, metadona, metotrexate, metilfenidato, metilsergida, óleo mineral, nitrofurantoína, nitrosuréias, procarbazina, silicone, sulfasalazina tocainida, e a classe de alcalóides da vinca de agentes. Nos métodos de tratamento aqui descritos pode ser desejável apresentar como uma terapia adjunta um regime em que o agente terapêutico que afeta CCL21 e/ou CCL19 é combinado com um corticosteróide e/ou agente imunosupressor. Em métodos adicionais, a terapia de combinação pode compreender a administração de anticoagulantes, diuréticos, glicosídeos cardíacos, bloqueadores do canal de cálcio, vasodilatores, análogos de prostaciclina, antagonistas de endotelina, inibidores da fosfodiesterase, agonistas de beta-2, antimuscarínicos, inibidores da endopeptidase, agentes de diminuição de lipídeos e inibidores de tromboxano, ou combinações desses.
Além disso, a invenção também contempla o uso de um agente que diminua a presença ou atividade de CCL21 e/ou CCL19 nos fibrócitos e/ou fibroblastos presentes na lesão fibrótica para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio fibrosante crônico.
Em modalidades de exemplo, a invenção fornece o uso de um agente para a diminuição da presença ou atividade de CCL21, e opcionalmente um agente que diminui a presença ou atividade de CCLl9, nos fibrócitos e/ou fibroblastos presentes na lesão fibrótica para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio fibrosante crônico em um mamífero. Em certas modalidades, o agente é um anticorpo que é especificamente imunorreativo com CCL21, preferivelmente o anticorpo é um que preferencialmente reconhece epitopos em CCL21 quando comparado a outras quimiocinas. Em outras modalidades, o agente é uma molécula de siRNA direcionada contra CCL21. O medicamento é produzido para o tratamento de um distúrbio fibrosante selecionado do grupo que consiste em fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose hepática, artrite reumatóide, insuficiência cardíaca congestiva, doença renal crônica, pneumonite por hipersensibilidade, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória, infecção por Schistosoma mansoni, hipertensão pulmonar primária causada por lesões plexiformes, manifestação pulmonar de doenças associadas ao herpes vírus, manifestações dermatológicas de doenças associadas ao herpes vírus; cicatriz quelóide, lúpus, dermopatia de fibrose nefrogênica, lesões de fibrose associadas com infecção por Schistosoma j aponicum, doenças autoimunes, fibrose patogênica, Doença de Lyme, remodelagem estromal em pancreatite e fibrose estromal, fibróides uterinos, fibrose ovariana, fibrose corneana insuficiência cardíaca congestiva e outras condições pós-isquêmicas, cicatrizes pós-cirurgia abdominal, cicatriz pós-cirúrgica de trabeculotomia de glaucoma de ângulo aberto, e qualquer combinação desses. Preferivelmente, o distúrbio fibrosante é fibrose pulmonar crônica.
Os medicamentos são preferivelmente formulados para um modo de administração selecionado do grupo que consiste em administração tópica, injeção, inalação, liberação contínua por depósito ou bomba, ou quaisquer combinações desses.
Também é contemplado um uso de uma composição que compreende um anticorpo anti-CCL21 ou uma molécula de siRNA projetados contra CCL21 e opcionalmente um anti-CCL19 ou molécula de siRNA projetados contra CCL19, para a preparação de um medicamento para a inibição da proliferação de fibroblasto e/ou fibrócito. 0 uso também pode compreender o uso de um composição que compreende um anticorpo anti-CCR7 ou uma molécula de siRNA projetados contra o receptor CCR7 para a fabricação de um medicamento para a inibição da proliferação de fibroblasto e/ou fibrócito.
Um outro aspecto contempla o uso de uma composição que inibe aquela atividade de CCL21 para a fabricação de um medicamento para inibição da migração de fibrócitos e/ou ativação de fibroblastos. Também é contemplado o uso de uma composição que inibe a atividade ou expressão de CCL21 em fibrócitos e/ou a ativação de fibroblastos pulmonares residentes para a fabricação de um medicamento para o tratamento de fibrose pulmonar por prevenção da excessiva produção de matriz extracelular e melhorando os sintomas de fibrose pulmonar.
Em adição é aqui contemplado o uso de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21, e opcionalmente um agente que diminui a presença ou atividade de CCL19 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar para a fabricação de um medicamento para o tratamento de laminite pulmonar induzida por radiação e/ou fibrose pulmonar induzida por radiação.
O uso de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21, e opcionalmente um agente que diminui a presença ou atividade de CCL 19 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar para a fabricação de um medicamento para o tratamento de fibrose pulmonar induzida por medicamento também é contemplado. Em tal uso, o medicamento é fabricado para o tratamento de fibrose pulmonar não idiopática induzida por um medicamento selecionado do grupo que consiste em um agente citotóxico, um antibiótico, um agente anti-arritmico, um agente antiinflamatório, e um medicamento ilícito, por exemplo o medicamento pode ser selecionado do grupo que consiste em Anfotericina B, bleomicina, bromocriptina, busulfan, carbamazepina, clorambucil, cocaína, ciclofosfamida, difenilhidantoína, ergotamina, flecainida, heroína, melfalan, metadona, metotrexate, metilfenidato, metilsergida, óleo mineral, nitrofurantoína, nitrosuréias, procarbazina, silicone, sulfasalazina tocainida, e a classe de alcalóides da vinca de agentes. Em algumas modalidades, o uso combinado de agentes é contemplado para a preparação de um medicamento em que o medicamento baseado em CCLl9 ou CCL21 é combinado com um corticosteróide, um agente imunossupressor, um anticoagulante, um diurético, um glicosídeo cardíaco, um bloqueador de canal de cálcio, um vasodilator, um análogo de prostaciclina, um antagonista de endotelina, inibidores de fosfodiesterase, um agonista de beta-2, um agente antimuscarínico, um inibidor de endopeptidase, um agente de diminuição de lipídeo e inibidores de tromboxano, ou combinações desses. Breve descrição dos desenhos
Figura 1 análise de gene SuperArray de expressão de gene (A) CCR7 e (B) CXCR4 em biópsias cirúrgicas pulmonares de lobo superior e inferior de grupos de paciente com tumor UIP (n = 7) , NSIP (n =6), RBILD (n = 6), e margem normal (η 5) . Os dados mostrados são médias (SEM) . Nenhuma differença significativa foi observada. CCR7, receptor 7 de quimiocina CC; CXCR4, receptor 4 de quimiocina CX; GAPDH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 2 análise de gene SuperArray de expressão de gene (A) CCL19, (B) CCL21, e (C) CXCL12 em biópsias cirúrgicas pulmonares de lobo superior e inferior de grupos de paciente com tumor UIP (n = 7) , NSIP (n = 6), RBILD (n = 6) , e margem normal (η = 5) . Os dados mostrados são médias (SEM). Nenhuma diferença significativa foi observada. CCL, ligante de receptor de quimiocina CC; CXCL, ligante de receptor de quimiocina CX; GAPDHf gliceraldeídos 3- fosfato desidrogenase; NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 3 análise de reação de cadeia de polimerase Quantitative Taqman de expressão de gene CCR7 e CCL21 em biópsias cirúrgicas pulmonares de lobo superior e inferior de pacientes com UIP (n = 18), NSIP (n = 8), RBILD (n = 6), e margens normais (n = 6) . Os dados mostrados são médias (SEM) . ** ρ ( 0,01 comparado com o lobo adequado do grupo de paciente de tumor de margem normal. CCR7, receptor 7 de quimiocina CC; CCL21, ligante de receptor 4 de quimiocina CC; NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 4 análise de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima de CCL19, CCL21, e CXCLl2 em biópsias cirúrgicas pulmonares de lobo superior e inferior de pacientes com UIP (n = 18) , NSIP (n = 6) , RBI LD (n = 6) , e margens normais (η = 5). Os dados mostrados são médias (SEM). CCL, ligante de receptor de quimiocina CC; CXCL, ligante de receptor de quimiocina CX; NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; ULP, pneumonia intersticial usual.
Figura 5 análise imunohistoquímica representativa de CCR7 em SLBs de (A, B) UIP, (C, D) NSW, (E, F) RBILD, e (G, H) grupos de paciente com tumor de margem normal. Os painéis (A), (C), (E), e (G) mostram coloração de controle. A imunorreatividade de CCR7 (coloração vermelha) foi observada em áreas focais em SLBs de (B) UIP, (D) NSIP, e (F) RBILD, mas não (H) margens normais. Aumento original de 6.200. CCR7, receptor 7 de quimiocina CC; NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; SLB, biópsia cirúrgica pulmonar; LTIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 6 análise imunohistoquímica representativa de CXCR4 em SLBs de (A, B) UIP, (C, D) NSIP, (E, F) RBILD, e (G,H) grupos de paciente com tumor de margem normal. Os painéis (A), (C), (E), e (G) mostram coloração de controle. A imunorreatividade de CXCR4 (coloração vermelha) foi observada em células mononucleares presentes em IIP e SLBs de margem normal. Aumento original de 6.200. CXCR4, receptor 4 de quimiocina CX; NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; SLB, biópsia cirúrgica pulmonar; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 7 análise imunohistoquímica representativa de (Β, E) CCR7 e (C, F) CD4 5 em secções histológicas em série de grupos de pacientes (A—C) UIP e (D—F) NSIP. Os painéis (A) e (D) mostram coloração de controle. Em UIP SLBs, a imunorreatividade de CCR7 (coloração vermelha em B) sobrepôs parcialmente com a immunorreatividade de CD45 (C), com a maior parte da coloração dupla associada com células mononucleares(C). (A, F) Em secções histológicas em série, CCR7 e CD4 5 não pareceram estar localizados em NSIP SLBs. Aumento original de 6.2 00. CCR7, receptor 7 de quimiocina CC; NSIP, pneumonia intersticial não especifica; SLB, biópsia cirúrgica pulmonar; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 8 análise imunohistoquímica representativa de CD34 em SLBs de (A, B) UIP, (C, D) NSIP, (E, F) RBILD, e (G, H) grupos de paciente com tumor de margem normal. Painéis (A), (C), (E), e (G) mostram coloração de controle. CD34 immunorreatividade (coloração vermelha) foi observada em áreas intersticiais em todos os pacientes SLBs. (D) A mais alta expressão de CD34 foi observada em SLBs do grupo de paciente NSIP. Aumento original de 6.200. NSIP, pneumonia intersticial não especifica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; SLB, biópsia cirúrgica pulmonar; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 9 análise imunohistoquímica representativa de colágeno 1 em SLBs de (A, B) UIP, (C, D) NSIP, (E, F) RBILD, e (G, H) grupos de paciente com tumor de margem normal. Painéis (A), (C), (E), e (G) mostram coloração de controle. Imunorreatividade de colágeno (coloração vermelha) foi difusamente presente por todo SLBs de (B) UIP, (D) Nal), (F) RBILD, e (H) grupos de paciente com tumor de margem normal. Aumento original de 6.200. NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; SLB, biópsia cirúrgica pulmonar; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 10 análise imunohistoquímica representativa de grupos de pacientes (Β, E) colágeno 1 e (C, F) CCR7 em SLBs de (A—C) UIP e (D—F) RBILD. Painéis (A) e (D) mostram coloração de controle. Imunorreatividade de colágeno 1 (coloração vermelha) era presente em grupos de pacientes (B) UIP e (E) RBILD. No entanto, em secções histológicas em série, áreas que foram imunorreativas para colágeno 1 eram desprovidas de expressão de CCR7 (C, UIP; F, RBILD) . Aumento original de 6.200. CCR7, receptor 7 de quimiocina CC; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; SLB, biópsia cirúrgica pulmonar; UM, pneumonia intersticial usual.
Figura 11 análise imunohistoquímica representativa de a actina de músculo liso (aSMA) em SLBs de grupos de pacientes (A-C) UIP, (D-F) NSIP, e (G-I) RBILD. Painéis (A), (D), e (G) mostram coloração de controle. A imunorreatividade de CCR7 (coloração vermelha) foi observada em áreas focais de SLBs de pacientes com (B) UIP, (E) NSIP, e (H) RBILD. Em secções histológicas de tecido em série, a expressão de aSMA (coloração vermelha) foi também observada em grupos de pacientes (C) UIP, (F) NSIP, e (I) RBILD. No entanto, nenhuma sobreposição entre expressão de CCR7 e aSMA foi observada. Aumento original foi de 6.200. CCR7, receptor 7 de quimiocina CC; NSIP, pneumonia intersticial não específica; RBILD, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória; SLB, biópsia cirúrgica pulmonar; aSMA, uma actina de músculo liso; UIP, pneumonia intersticial usual.
Figura 12: expressão de transcrito para CCL21 em biópsias de cirurgia pulmonar de pacientes com várias formas de fibrose pulmonar crônica comparadas com aqueles que têm outros tipos de doenças não fibrosantes. A expressão do gene CCL21 (examinada por TAQMAN PCR) foi variável entre os grupos de pacientes. A mais alta expressão de CCL21 foi observada em pneumonia intersticial superior e inferior usual (UIP) SLBs, mas a discrepância entre UIP SLBs e todos os outros grupos foi mais pronunciada nos SLBs inferiores examinados. Juntos, esses dados sugeriram que a expressão de CCR7 e CCL21 foi muito aumentada durante ULP. NSIP = Pneumonia intersticial não específica; RBI LD = doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória.
Figura 13: expressão de proteína para CCL21 em biópsias de cirurgia pulmonar de pacientes com várias formas de fibrose pulmonar crônica comparadas com aqueles que têm outros tipos de doenças não fibrosantes. Análise de ELISA de amostras de biópsia de IIP e não IIP é aqui mostrada. Em biópsia de lobo superior, os níveis de proteína de CCL21 foram similares entre os grupos de UIP, NSIP, e não IIP. No entanto, nas amostras de lobo inferior (em que a fibrose pulmonar é mais agressiva em pacientes com UP), o níveis de CCL21 foram maiores nos grupos IIP (ou seja, grupos UIP, NSIP, e RBILD comparados com o grupo não- IIP) .
Figura 14: A migração de f ibroblastos UIP mas não de fibroblastos não IIP foi muito aumentada pela presença de CCL21. Esses experimentos envolveram a adição de fibroblastos humanos a um sistema de placa de cultura de transcavidade porosa e a contagem de fibroblastos que migraram durante uma incubação de 24 horas. Fibroblastos UIP migraram através da transcavidade para cavidade do fundo, e essa resposta foi muito aumentada se CCL21 fosse adicionado à cavidade de fundo, ou os fibroblastos foram tratados com TNF e CCL21 foi adicionado à cavidade de fundo. A presença de um anticorpo anti-CCL21 atenuou marcadamente a migração de fibroblasto nos últimos dois grupos mas não teve efeitos sobre o primeiro grupo.
Figura 15: é aqui mostrado o exame do efeito de CCL19 e CCL21 exógenos (embos a 10 ng/ml) sobre as respostas proliferativas de linhas de fibroblastos primários que crescem a partir de normal, pneumonite por hipersensibilidade, sarcoide LTIP SLBs. Foi aparente que fibroblastos UIP exibiram uma resposta proliferativa à presença de ligantes de CCL19 e CCL21.
Figura 16: tendo observado que a introdução de fibroblastos IIP em camundongos SCID promoveu o desenvolvimento de fibrose intersticial, os próximos estudos foram projetados para avaliar o efeito antifibrótico de anti-CCL21 nesse modelo. Grupos de cinco camundongos receberam IgG purificada ou anticorpo anti- CCL21 por injeção i.p. iniciando no dia 35 e em dias alternados subseqüentemente ao dia 63. No dia 63, os tecidos pulmonares foram removidos e secções representativas se seguiram. Os camundongos tratados com IgG exibiram marcante evidência de fibrose intersticial e remodelagem. De modo inverso, os grupos de tratamento com anticorpo anti-CCL21 mostraram pouca evidência de fibrose pulmonar baseado em análise histológica.
Descrição detalhada das modalidades preferidas da invenção
Fibrose envolve a proliferação incontrolada e diferenciação de fibrócitos. Fibrócitos são uma população distinta de células semelhantes a fibroblasto derivadas de monócitos do sangue periférico que normalmente entram em locais de dano tecidual para promover angiogênese e cicatrização de ferimentos. Na presente invenção é mostrado que a diminuição da presença ou atividade de CCL21 nos fibrócitos e/ou fibroblastos presentes na lesão fibrótica em fibrose resultará em um resultado benéfico de tratamento da fibrose por diminuição da presença de focos fibróticos, e/ou inibição da formação de focos fibróticos, e/ou melhoria de um ou mais dos sintomas de fibrose.
Fibrose pulmonar crônica de origem conhecida e idiopática apresenta extraordinários desafios clínicos para os quais as opções de tratamento mostram eficácia limitada ou toxicidade (Flaherty e cols., Am. J. Med., 110:278-282 (2001); (Hampton e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., I 4 9:A8 78 (1994)), e a taxa de sobrevivência média após o diagnóstico tem mudado muito pouco (Ryu e cols., Mayo Clic. Proc., 73:1085-1101 (1998); Lasky e cols., Environ. Health Perspect., 108 Suppl 4:751-762 (2000)). Estímulo pró- fibrótico conhecido inclui radiação, mineral inalado e partículas orgânicas, oxidantes gasosos, fármacos e organismos infecciosos, embora persista um debate em relação à identidade de fatores etiológicos que iniciam as entidades clinicopatológicas das pneumonias intersticiais idiopáticas (IIP). IIP são um grupo diverso de distúrbios que envolvem o parênquima pulmonar distai, que partilham numerosas características, mas são suficientemente diferentes para justificar a designação como distúrbios separados (Travis e cols., Am. J. Surg. Path., 24:19-33 (2 000)) . Sua patogênese permanece obscura mas acredita-se que esteja centrada em um dano (ou danos múltiplos) ao pulmão seguido por tentativas de cicatrizar esse dano. Focos fibroblásticos, pequenos agregados de fibroblastos ativamente proliferantes, representam a organização dos focos prévios de dano e indicam que a fibrose é ativa e progressiva.
Inicialmente, o uso de IIP como exemplos de distúrbios de fibrose crônica, aqui apresentados são dados que mostram que a expressão de CCR7 e/ou CXCR4 seria alta no distúrbio fibrótico (nesse caso IIP biópsias cirúrgicas de pulmão (SLBs)) e não é alta em SLBs de margem normal. Transcrito de gene detalhado e análise de proteína de SLBs e de grupos de pacientes de tumor de margem normal foram realizados. Análise de quimiocina e de transcrito de receptor de quimiocina revelaram que CCR7, mas não CXCR4, foi altamente expresso em áreas intersticiais focais em IIP, particularmente todas as biópsias de VIP analisadas, mas não em biópsias de margem normal. Áreas positivas de CCR7 em biópsias de IIP continham fibrócitos, no entanto, constatado que as células presentes em áreas positivas de CCR7 não coexpressam marcadores de fibrócitos, como CD34 e colágeno, as células positivas de CCR7 não são necessariamente células derivadas de medula óssea. Finalmente, é demonstrado que as células positivas de CCR7 em biópsias de IIP eram fibroblastos de tecido residente ativado. Portanto, os exemplos aqui apresentados demonstram expressão aumentada de CCR7 em LIP severa, e essa expressão foi localizada a áreas fibróticas focais desprovidas de fibrócitos e miofibroblastos.
Em investigações adicionais foi mostrado que a direcionamento dos ligantes de CCL21 e/ou CCL19 do receptor CCR7 é uma boa intervenção para o tratamento de doenças fibrosantes crônicas. Mais particularmente, dados de modelos clínicos e animais mostraram que a expressão de CCR7 e CCL21 foi marcadamente aumentada durante UIP. Também é demonstrado que a migração de fibroblastos UIP foi aumentada pela presença de CCL21. Por outro lado, preparações de anticorpo anti-CCL21 atenuam muito a migração de fibroblastos em UIP. Além disso, na presença de ligantes de CCL21 ou CCLl9 é aparente que fibroblastos UIP exibem uma resposta proliferativa.
Quando fibroblastos IIP são introduzidos em camundongos SCID, os camundongos são induzidos a desenvolver fibrose intersticial. Esse modelo serve como um modelo de SCID humanizado de IIP. Quando esses camundongos modelo são tratados com anticorpo anti-CCL21, os camundongos mostraram pouca ou nenhuma evidência histológica de fibrose pulmonar quando comparados a grupos similares de modelos de camundongos humanizados SOD de IIP que não foram tratados com anticorpos anti-CCL21.
Em vista dos dados aqui mostrados é contemplado que os métodos e composições que são direcionados para diminuir e/ou inibir a ação de CCL21 e/ou CCL19 serão particularmente úteis para o tratamento de distúrbios fibrosantes no pulmão bem como em outros tecidos. A resposta de fibroblastos humanos a CCL19 e CCL21 (devido a sua suprarregulação de CCR7) leva à ativação inadequada dessas células assim levando às respostas fibróticas exuberantes observadas em IIP. De forma interessante, o ambiente da citocina no pulmão de pacientes fibróticos pode favorecer a resposta aberrante a CCLl9 e CCL21 uma vez que outros investigadores documentaram níveis de proteína aumentados de TNF-α (Sallusto e cols., Eur. J. Immunol., 29:1617-1625 ()999); Randolph e cols., Science, 286:2159- 2162 (1999)) e IL-IO diminuída (Hammad e cols.)., J. Immunol., 169:1524-1534 (2002)), ambas citocinas que modulam o receptor ao qual esses ligantes se ligam. Fibroblastos humanos de pacientes com formas severas de fibrose pulmonar claramente respondem a CCL19 e CCL21, assim tornando esses ligantes alvos atrativos no tratamento de doenças fibrosantes no pulmão e possivelmente em outros tecidos.
Em vista da discussão acima deve-se compreender que em certas modalidades, é contemplado que as composições que visam CCL21 e/ou CCL19 inibem especificamente a interação da quimiocina com o receptor CCR7. Tais composições podem ser direcionadas contra CCL21 e/ou CCL19 (por exemplo, anticorpos contra essas quimiocinas, moléculas anti-senso projetadas contra essas quimiocinas ou moléculas siRNA projetadas contra essas moléculas). Alternativamente, as composições podem ser direcionadas contra o receptor CCR7 (por exemplo, anticorpos contra o receptor, moléculas anti- senso projetadas contra o receptor ou moléculas siRNA projetadas contra o receptor). Ainda em outras alternativas, a composição pode ser uma que compreende um inibidor de molécula pequena da interação das quimiocinas com o receptor CCR7. Essas composições e métodos de uso do mesmo para tratar e/ou melhorar os sintomas de doenças em um indivíduo são discutidos em maiores detalhes abaixo.
Qualquer distúrbio fibrosante pode ser tratado. Por exemplo, o distúrbio pode incluir fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose hepática, artrite reumatóide, insuficiência cardíaca congestiva, doença renal crônica, pneumonite por hipersensibilidade, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória, infecção por Schistosoma mansoni, hipertensão pulmonar primária (prevenção da formação da lesão plexiforme) doenças associadas ao herpes vírus, que incluem manifestações pulmonares e dermatológicas; cicatriz quelóide, lúpus, dermopatia de fibrose nefrogênica, lesões de fibrose associadas com infecção por Schistosoma japonicum, doenças autoimunes, fibrose patogênica, Doença de Lyme, remodelagem estromal em pancreatite e fibrose estromal, fibróides uterinos, fibrose ovariana, fibrose corneana insuficiência cardíaca congestiva e outras condições pós-isquêmicas, cicatrizes pós-cirúrgicas incluindo adesões abdominais, trabeculotomia de glaucoma de ângulo aberto, e qualquer combinação desses. Uma outra área em que os métodos serão úteis é na inibição da transição de célula epitelial para mesenquimal (EMT) . Esse é um fenômeno em que as células epiteliais em vários órgãos (particularmente o rim) "regridem" a um fenótipo células mais "primitivo" (como aquele dos fibroblastos). Esse processo ajuda a organizar a formação do plano do corpo, e embora EMT seja bem estudada no contexto de desenvolvimento embriônico, elas também tem um papel na gênese de fibroblastos durante a fibrose de órgão em tecidos adultos. O surgimento de evidência a partir de estudos de fibrose renal sugere que mais que um terço de todos os fibroblastos relacionados a doença se originam de epitélio tubular no local do dano. Esse processo pode ser inibido pelas composições da invenção Kalluri e Nielsen, J. Clin. Invest. 112:1776-1784 (2003).
Fibrose pulmonar pode surgir em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva, pneumonia atípica (incluindo por espécies de Pneumocystis) e disseminação linfática de câncer. Exposições ambientais ou ocupacionais, que incluem inalação de poeiras inorgânicas, por exemplo, silicone, asbestos, berílio, pulmão preto também tem sido reconhecida como causa dessas doenças pulmonares. A fibrose também pode se desenvolver a partir da exposição a antígenos protéicos (por exemplo, pulmão de fazendeiro, pulmão "de criador de pombos", pulmão de "hot-tub") e exposição a gases tóxicos, fumaças, aerossóis, e vapores (por exemplo, doença de trabalhadores de silos). A exposição à radiação (radiação ionizante, freqüentemente usada em terapêuticas médicas também é uma causa bem reconhecida de fibrose pulmonar, que é também observada em causas associadas com doenças reumáticas/do tecido conjuntivo, como: escleroderma; artrite reumatóide; doença do tecido conjuntivo mista; lúpus eritematoso disseminado. Fibrose também pode ser observada nas síndromes pulmonares- renais (ou seja, doença de Wegner ou Goodpasture) , sarcoidose e outras doenças granulomatosas (por exemplo, beriliose), doenças sistêmicas como Hepatite C, doença do inflamatórias do intestino, síndrome da imunodeficiência adquirida, DPLDs Idiopática ou rara, como as seguintes: COP (idiopática), histiocitose de células de Langerhans Pulmonar (rara), pneumonia eosinofílica. Além disso, a fibrose pode ser observada em IPF familiar ou sarcoidose, esclerose tuberosa, neurofibromatose, doença de Niemann- Pick, doença de Gaucher, e síndrome de Hermansky-Pudlak.
Ainda uma outra área em que as intervenções terapêuticas da presente invenção podem ser usadas é a área de fibrose que é causada em resposta a vários tratamentos para câncer. Por exemplo, os métodos terapêuticos da presente invenção formarão um auxiliar para os regimes de tratamento de oncologia por radiação. Laminite pulmonar induzida por radiação e subseqüente fibrose pulmonar são efeitos colaterais de terapia por radiação que prejudicam a eficácia da terapia por radiação. Tipicamente, por exemplo, no tratamento de câncer, a terapia por radiação é administrada em uma dose de 20-85 gray. No entanto, estudos em paciente mostraram uma relação quase linear de toxicidade pulmonar ma forma de laminite pulmonar à medida que a dose radiação aumenta. Subseqüentemente, lesões fibróticas também são observadas. É contemplado que a administração de um agente que diminua a presença ou atividade de CCL21 e/ou administração de um agente que diminua a presença ou atividade de CCLl9 melhorará o desenvolvimento ou progressão de laminite pulmonar induzida por radiação e/ou induzida por radiação fibrose pulmonar. Em certas modalidades, é contemplado que as terapias da invenção que diminuem a presença ou atividade de CCL19 e/ou CCL21 podem ser administradas antes e/ou, depois e/ou concomitantemente com a terapia por radiação. Em alguns casos, pode ser preferível administrar tais agentes em 1, 2, 3, 4, ou 5 dias após a administração da radioterapia.
Uma outra terapia para câncer que mostrou levar à significante fibrose pulmonar, é fibrose induzida por medicamento que ocorre após a administração de sulfato de bleomicina. Bleomicina se deposita na pele e pulmões e ela leva ã fibrose. Embora a cessação da administração do medicamento e administração de corticosteróides seja recomendada, não existe qualquer tratamento demonstrado para o dano pulmonar induzido por bleomicina. É contemplado que as terapias da invenção que diminuem a presença ou atividade de CCLl9 e/ou CCL21 são administradas antes e/ou, depois e/ou concomitantemente com sulfato de bleomicina e a administração dos agentes que diminuem a presença ou atividade de CCL19 e/ou CCL21 será eficaz na diminuição da presença ou desenvolvimento de fibrose pulmonar em pacientes que recebem sulfato de bleomicina.
Embora sulfato de bleomicina seja descrito como um exemplo de agente que causa fibrose pulmonar, outros medicamentos também induzem a doença pulmonar, uma área que tem estado em foco nos anos recentes. Em 1972 apenas 19 agentes foram reconhecidos como causadores de doença pulmonar. Uma revisão da literatura em 2001 reconheceu uma lista crescente de pelo menos 150 agentes que mostraram causar doença pulmonar. Desses, sabe-se que a fibrose pode ser causada por agentes citotóxicos, por exemplo, bleomicina, busulfan, metotrexate, antibióticos, por exemplo, nitrofurantoína, sulfasalazina, anti-arrítmicos, por exemplo, amiodarona, tocainida, medicações antiinflamatórias, como, por exemplo, ouro, penicilamina, medicamentos ilícitos como, por exemplo, crack, cocaína, heroína. Em modalidades específicas, os métodos e composições da invenção serão úteis no tratamento de fibrose induzida por Anfotericina B, bleomicina, bromocriptina, busulfan, carbamazepina, clorambucil, cocaína, ciclofosfamida, difenilhidantoína, ergotamina, flecainida, heroína, melfalan, metadona, metotrexate, metilfenidato, metilsergida, óleo mineral, nitrofurantoína, nitrosuréias, procarbazina, silicone, sulfasalazina tocainida, e a classe de alcalóides da vinca de agentes, incluindo mitomicina e agentes antimicrobianos. Foi observado que com o uso de nitrosuréias, por exemplo, carmustina, lomustina, e semustina, e particularmente, carmustina, até 25% de pacientes que receberam carmustina desenvolveram surgimento precoce (em 3 6 meses após o início da terapia com carmustina) de fibrose pulmonar.
Os termos "indivíduo" e "paciente" significam um membro ou membros de qualquer espécie de mamífero ou não mamífero que pode ter uma necessidade pelos métodos farmacêuticos, composições e tratamentos aqui descritos. Indivíduos e pacientes assim incluem, sem limitação, primatas (incluindo humanos), caninos, felinos, ungulados (por exemplo, eqüinos, bovinos, suínos (por exemplo, porco)), aves e outros indivíduos. Animais humanos e não humanos que têm importância comercial (por exemplo, gado e animais domestiçados) são de interesse particular. "Mamífero" significa membros de qualquer espécie de mamíferos e incluem, por via de exemplo, caninos; felinos; eqüinos; bovinos; ovinos; roedores etc. e primatas, particularmente humanos. Modelos de animais não humanos, particularmente mamíferos, por exemplo primata, murídeo, lagomorfa etc. podem ser usados para investigações experimentais.
As composições que contêm um ou mais agentes que suprimem a atividade, expressão ou quantidade de CCL21 e/ou CCL19 podem ser usados para suprimir fibrose em localizações inadequadas e em distúrbios fibrosantes e condições inflamatórias crônicas, entre outros. Tais composições podem ser aplicadas localmente ao local da lesão fibrótica ou alternativamente podem ser administradas sistemicamente. Além disso, as composições direcionadas para reduzir, inibir, suprimir ou abolir a atividade/efeitos de CCL21 e/ou CCLl9 podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outros agentes que podem ser úteis no tratamento de distúrbios fibrosantes. Tais outras composições podem incluir, por exemplo, corticosteróides, e outros agentes antiinflamatórios. Prednisona, azatioprina, e terapia de citocina com IFN gama também podem ser benéficas. Combinações dessas composições com composições anti- CCL21/anti-CCL19 são particularmente contempladas. Embora tenha sido previamente sugerido que o uso de um imunossupressor e um corticosteróide isoladamente seja suficiente para tratar fibrose pulmonar, agora é reconhecido que a terapia imunossupressora combinada com corticosteróides é ineficaz no tratamento dessa doença porque essa intervenção não é apenas ineficaz na alteração da progressão da doença, ela não leva a qualquer aumento no resultado de sobrevivência. O prognóstico para um indivíduo que apresenta fibrose pulmonar é que na ausência de intervenção cirúrgica a doença é fatal. Como tal, a única opção aberta a tais pacientes é o transplante pulmonar. As composições e métodos da primeira invenção, portanto, fornecem um avanço significativo nas terapias atualmente disponíveis pois eles fornecem um regime terapêutico que irá interromper ou diminuir o desenvolvimento e/ou progressão da doença.
Em modalidades específicas, composições que contêm anticorpos contra CCL21 podem ser operáveis para diminuir a concentração de CCL21 em locais alvo. As doses necessárias para para reduzir CCL21 e CCL19 em pessoas presumivelmente estará na faixa de microgramas. Por exemplo, anticorpos na faixa de dosagens aproximadas de 5-40 microgramas/kg podem ser usados. Idealmente, esses anticorpos funcionarão na faixa de dosagem menor de 5 a 10 microgramas/kg.
IL-12, laminina-1, IgG entrecruzada e agregados de IgG suprimem a diferenciação de monócitos em fibrócitos (Pedido de Patente US No. 20050238620) . Tais composições podem ser úteis nas combinações aqui discutidas.
Nos métodos de tratamentos, as composições podem ser supridas a um local alvo a partir de uma fonte exógena, ou elas podem ser feitas in vivo por células nos locais alvo ou células no mesmo organismo que o local alvo. Essas composições podem ser isoladas de tecidos humanos doados, incluindo fluidos biológicos. Elas também podem ser feitas como uma proteína recombinante em bactérias, células de cultura de tecidos, ou qualquer outro tipo de células ou tecidos conhecidos na técnica, ou em animais inteiros.
Elas também podem ser feitas de forma sintética ou por qualquer outra metodologia conhecida na técnica. Se essas composições são feitas in vivo, elas podem ser um produto da expressão de um transgene ou elas podem resultar de aumento da produção em uma fonte existente in vivo. Os níveis dessa composições, se elas são normalmente presentes em um local alvo, também pode ser elevada por redução de suas taxas normais de degradação. Adicionalmente, pode ser possível aumentar a capacidade de supressão de diferenciação de fibrócito dessas composições, por exemplo, por suprimento de co-fatores.
Embora os métodos da presente invenção sejam demonstrados como um exemplo de distúrbio fibrosante, de vê-se compreender que essa doença é usada como um paradigma para outros distúrbios fibrosantes. A partir dos ensinamentos aqui apresentados, aqueles habilitada na técnica perceberão que outras doenças que podem ser tratadas incluem quaisquer doenças em que seja desejável suprimir a fibrose. Como tal, os métodos da invenção são direcionados ao tratamento de fibrose que resulta de condições que incluem, sem limitação: escleroderma, cicatriz quelóide, artrite reumatóide, lúpus, dermopatia fibrosante nefrogênica, lesões fibróticas como aquelas formadas depois de infecção por Schistosoma japonicum, doenças autoimunes, fibrose patogênica, Doença de Lyme, remodelagem estromal em pancreatite e fibrose estromal, asma, fibrose pulmonar idiopática, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose pulmonar, fibróides uterinos, fibrose ovariana, outras formações fibrocisticas, fibrose corneana ou outras fibroses do olho, como aquela que resulta de cirurgia de refração cônica, e fibrose que resulta de insuficiência cardíaca congestiva e outras condições pós-isquêmicas, cicatrizes pós-cirúrgicas que incluem adesão abdominal, trabeculotomia de glaucoma de ângulo aberto. Em algumas dessas doenças fibrosantes, os fibrócitos podem não representar um estagio final de fibrose. Por exemplo, em asma, os fibrócitos também se diferenciam em miofibroblastos, que persistem em paredes de vias aéreas espessadas. Por tratamento, deve-se entender qualquer melhora dos sintomas da doença fibrosante, um efeito benéfico deve ser considerado como evidência de tratamento. Assim, "tratar" ou "tratamento" de uma condição ou doença inclui: (I) prevenção de pelo menos um sintoma da condições, ou seja, fazer com que um sintoma clínico não se desenvolva significativamente em um mamífero que pode ser exposto ou predisposto à doença mas ainda não experimentou ou apresentou sintomas da doença, (2) inibição da doença, ou seja, interrupção ou redução do desenvolvimento da doença ou seus sintomas, ou (3) alívio da doença, ou seja, regressão da doença ou de seus sintomas clínicos. Tratamento, prevenção e melhora de uma condição, como aqui usado, pode incluir, por exemplo, diminuição ou erradicação de uma condição deletéria ou prejudicial associada com doença fibrosante. Exemplos de tal tratamento inclui: diminuição da infecção bacteriana, aumento da função pulmonar, infra-regulação de pró-citocinas inflamatórias e supra-regulação de acúmulod e células mononucleares.
Em uma modalidade particular, fibrose pulmonar ou outras doenças pulmonares fibrosantes podem ser tratadas por administração de agentes que inibem ou reduzem a ação de CCL21 e/ou CCL19. Tratamento pode reduzir o crescimento celular associado com fibrose e também depósito de colágeno. 0 tratamento pode evitar fibrose adicional ou reduzir os efeitos da fibrose atual. O agente pode ser administrado em qualquer quantidade de dosagem e formulação de dosagem que seja capaz de reduzir pelo menos um sintoma da doença no paciente. A administração pode ser intravenosa e pode ocorrer em dias alternados por uma duração selecionada. Essa dose, método de administração e esquema de administração também podem ser úteis no tratamento de outras doenças fibrosantes. As dosagens, formulações e modos de administração podem ser otimizados com o uso de modelos animais da doença.
Um modelo de exemplo para fibrose pulmonar é dado nos exemplos fornecidos abaixo. No entanto, aqueles habilitados devem estar cientes de outros modelos desse distúrbio fibrosante. Por exemplos, em (Pedido de Patente US No. 20050238620), fibrose pulmonar foi induzida em ratos (Sprague Dawley, contendo catéteres jugulares cirugicamente implantados, Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.) por injeção de bleomicina em seus pulmões. Bleomicina é um agente antineoplásico que, quando injetado nas vias aéreas, causa fibrose nos pulmões de um animal. É uma via padrão de estudo de fibrose pulmonar. (Crouch, E. 1990. Pathobiology of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 259:L159-L184). Em tais métodos, para induzir fibrose, os ratos são anestesiados e monitorados para assegurar que um plano cirúrgico adequado de anestesia foi atingido e mantido. 0 lado ventral do pescoço é preparado para incisão raspando os pelos e desinfetando a área. Uma incisão média vertical é feita no lado ventral do pescoço, os músculos do pescoço são retraídos, e a traquéia é exposta. 3 00 microlitros de uma solução de 3,3 U/ml (1 unidade) de bleomicina (Calbiochem/EMD Biosciencesi San Diego, Calif.) em solução salina estéril a 0,9% foi injetada com uma seringa e uma agulha de calibre 26 no lúmen da traquéia. Os ratos de controle tiveram apenas solução salina infetada. A incisão é fechada com duas ou três suturas. Esse procedimento segue aquele publicado por Underwood e cols. (2000. SB 239063, um inibidor de p38 MAPK, reduz a neutrofilia, citocinas inflamatórias, MMP-9, e fibrose no pulmão. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279:L895-L902.) Durante o procedimento e no pós-operatório o animal foi mantido sob lâmpada de aquecimento, e então colocado de volta em sua gaiola uma vez que estivesse totalmente recuperado. Durante o procedimento o animal foi checado para assegurar que ele: i) estivesse respirando regularmente, ii) tivesse orelhas e membranas mucosas rosadas, iii) não puxasse seu pé quando os dedos fossem beliscados, e iv) não piscassem quando o olho ou pálpebra fosse tocado.
Para testar os efeitos em uma composição anti-CCL21, os modelos de fibrose são injetados com a composição anti- CCL21 por via intravenosa via um cateter jugular implantado pelo fornecedor. A composição pode ser formulada vantajosamente em soro fisiológico (0,9% NaCl) e passada através de filtro de 0,2 micron antes da administração.
Composições anti-CCL21 particularmente preferidas para uso nos métodos da presente invenção são anticorpos que são imunorreativos para CCL21. Preferivelmente, tais anticorpos são anticorpos monoclonais que são imunorreativos apenas com CCL21 e suas variantes e não com outras quimiocinas. Preferivelmente o anticorpo anti-CCL21 é um anticorpo humanizado que é formulado para administração a um indivíduo humano. Anticorpos anti-CCL21 para objetivos de pesquisa são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, R&D Systems (Minneapolis, MN) tem uma preparação comercialmente disponível. BAF457, que é um anticorpo anti-CC21 recombinante de camundongo gerado em E. coli que pode ser usado na invenção. PeproTech. (Rocky Hill, NJ) também tem anticorpos monoclonais anti-CCL21. Abeam (Cambridge, U.K., e Cambridge MA, USA), tem anticorpos policlonais imunorreativos com CCL21 (por exemplo, policlonal de cabra para produtos de CCL21 abl0350 e abl0364), que pode ser facilmente usado para reproduzir testes para mostrar que a inibição da ação de CCL21 em animais modelo melhora a fibrose.
Uma vez que anticorpos monoclonais de murídeo e cabra contra CCL21 são facilmente disponíveis na técnica, é contemplado que tais anticorpos podem ser facilmente usados como "modelos" para a geração de versões humanas dos mesmos para uso em terapia humana. Por exemplo, é contemplado que a apresentação de fago pode ser usada para dispositivo de comprimento total ou fragmentos de anticorpos que podem ser usados para os métodos terapêuticos da invenção. Em outras modalidades, pode ser possível gerar uma imunoglobulina de cadeia leve ou pesada de camundongo ou cabra humanizada de comprimento total que contém uma região constante humana, CDRs de camundongo ou cabra, e uma estrutura substancialmente de camundongo ou cabra que tem um número de alterações de aminoácidos de "humanização", que reduzirão a probabilidade de uma reação adversa para administração de tal anticorpo a um indivíduo humano. Em várias modalidades, um "anticorpo humanizado" é um anticorpo que compreende uma cadeia leve variável humanizada e/ou uma cadeia pesada variável humanizada. Um anticorpo modificados que foi "humanizado" pelo processo de "humanização" se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo parente que fornece as CDRs e é comumente menos imunogênico em humanos, quando comparado ao anticorpo parente. De fato a descrição acima para anticorpos contra CCL21 é também aplicável para CCL19, cujos anticorpos são também disponíveis na técnica.
Deve ser compreendido que como usado nessa, anticorpos podem conter um domínio Fc ou não conter um domínio Fc. Em algumas modalidades, anticorpos multivalentes podem ser usados como composições terapêuticas. Por "anticorpos multivalentes" entende-se moléculas semelhantes a anticorpo recombinantes que contêm domínios de ligação para mais de um epitopo. Por exemplo, um anticorpo multivalente que se liga a CCL21 e CCLl 9 pode ser considerado como sendo particularmente útil no tratamento de fibrose. Em outras composições terapêuticas, as proteínas derivadas de anticorpo incluem moléculas em que uma cadeia de anticorpo Fab foi fundida a domínios de ligação, por exemplo, (Fab- scFv bibodies ou tribodies). Essas moléculas são anticorpos biespecíficos recombinantes de peso intermediário úteis que não contêm uma porção Fe. A produção de anticorpos que são desprovidos do domínio Fc é vantajosa porque a presença de tal domínio em uma molécula terapêutica relacionadas a anticorpo tende a aumentar o tempo de persistência de soro da molécula por proteção dela do metabolismo no fígado e também pode cruzar outras células via sua interação com o receptor Fc, assim gerando efeitos colaterais tóxicos devido ao desencadeamento sistêmico de células efetoras imunes. Portanto, certas moléculas terapêuticas relacionadas a anticorpo são desprovidas de domínio Fc. Aqueles habilitados na técnica são cientes de métodos de construção de tais moléculas relacionadas a anticorpo. Por exemplo, anticorpos recombinantes podem ser produzidos a partir de uma combinação de blocos de construção derivados de anticorpo (como Fe, (Fab1 ) 2, Fab, scFv, diabody) com motivos de heterodimerização para criar de forma eficiente anticorpos multiespecíficos.
Além de anticorpos, é contemplado que as moléculas siRNA projetadas contra CCL21 e/ou CCLl9 também serão composições úteis para o tratamento de distúrbios fibrosantes. Aqueles habilitados na técnica são cientes de que RNA de duplo filamento (dsRNA) pode induzir silenciamento de gene pós-transcrição específico de seqüência em vários organismos por um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi) . Recentes trabalhos sugerem que fragmentos de RNA são os mediadores específicos de seqüência de RNAi (Elbashir e cols., Nature, 411, 494, 2001) . A interferência de expressão de gene por esses pequenos RNA de interferência (siRNA) é agora reconhecidas como uma estratégia que ocorre naturalmente para silenciamento de genes em C. elegans, Drosophila, plantas, e em células tronco embriônicas de camundongo, oócitos e embriões precoces (Cogoni e cols., Antonie Van Leeuwenhoek, 65, 205, 1994; Baulcombe, Plant Mol. Biol., 32, 79, 1996; Kennerdell, Cell, 95, 1017 1998; Timmons, Nature, 395, 854, 1998; Águahouso e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95, 13959, 1998; Wianny e Zemieka-Goetz, Nat. Cell Biol., 2, 70, 2000; Yang e cols., Mol. Cell Biol., 21, 7807, 2001; Svoboda e cols., Development, 127, 4147 2000). Em cultura de célula de mamífero, uma redução mediada por siRNA na expressão de gene foi realizada por transfecção de células com RNA oligonucleotídeos sintéticos (Caplan e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 98, 9742, 2001; Elbashir e cols., Nature, 411, 494, 2001).
Tipicamente, para realizar expressão intracelular do siRNA terapêutico, uma molécula de RNA é construída contendo uma seqüência de hairpin (como um hairpin de 21- bp) que representa seqüências direcionadas contra o gene de interesse, nesse casos o gene de CCL21, e o gene de CCL19. 0 siRNA, ou uma seqüência de DNA que codifica siRNA, é introduzido na célula alvo, como um célula que é produtora de CCL21 no local da lesão fibrótica. 0 siRNA reduz o mRNA alvo e a expressão de proteína de gene daquele agente. 0 uso de um promotor específico para tecido atingirá um direcionamento específico para tecido benéfico da molécula terapêutica de siRNA. A construção que codifica o siRNA terapêutico é configurada de modo que o promotor e o hairpin sejam imediatamente contíguos. 0 promotor usado em uma construção particular é selecionado de promotores prontamente disponíveis conhecidos na técnica, dependendo de se expressão indutível, específica para tecido ou célula do siRNA é desejada. A construção é introduzida na célula alvo, como por injeção, permitindo uma expressão de gene alvo diminuída na célula.
Portanto, em modalidades de exemplo, a presente invenção fornece um vetor (ou seja, um vetor viral tipicamente usado em expressão de gene recombinante e/ou liberação, por exemplo, adenoviral, lentiviral, viral adeno-associado (AAV), retroviral, poliovírus, vírus herpes simples (HSV) ou vetor viral de murideo baseado em Maloney e outros) que compreende um cassete de expressão, e que um cassete de expressão compreende uma seqüência de ácidos nucleicos isolada que codifica uma pequena molécula de RNA de interferência (siRNA) direcionada contra CCL21. a estrutura do ácido nucleico de CCL21 é bem conhecida por aqueles habilitados na técnica, como é a estrutura de CCL19, veja, por exemplo, No. de Acesso Genbank AB002409, que descreve a seqüência de mRNA de CCL21 humano; No. de Acesso Genbank NM_006274, que descreve a seqüência de mRNA de CCL21 humano; o No. de Acesso Genbank para CCL21 de macacos rhesus é dado em NM_001032855; as seqüências para porco, camundongo, e cães são também disponíveis em Genbank a partir da data desse pedido. Essas seqüências também podem ser preparadas e siRNA pode ser projetado contra aquelas regiões da molécula determinadas para serem importantes para a expressão funcional de CCL21 (note que as revelações de seqüência de proteína relacionada podem ser usadas para preparar anticorpos recombinantes dos mesmos e anticorpos gerados contra os mesmos). O siRNA pode ser direcionado a qualquer 10-30 estiramentos contíguos de ácidos nucleicos junto a uma tal seqüência de ácidos nucleicos, e especialmente úteis serão aquela seqüência que é importante para a expressão funcional da quimiocina. O siRNA pode formar estrutura de hairpin que compreende uma estrutura dupla e uma estrutura em alça. A estrutura em alça pode conter de 4 a 10 nucleotídeos, como 4, 5 ou 6 nucleotídeos. A dupla tem preferivelmente menos que 3 0 nucleotídeos de comprimento, como de 19 a 25 nucleotídeos. 0 siRNA também pode compreender uma região de ressalto. Tal ressalto pode ser uma região de ressalto de 3' , uma região de ressalto de 5', ou regiões de ressalto tanto de 3' quanto de 5' . A região de ressalto pode ter, por exemplo, de 1 a 6 nucleotídeos de comprimento. Um cassete de expressão também pode compreender um promotor.
Exemplos de promotores incluem promotores reguláveis e promotores constitutivos. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor CMV, RSV, ou polIII. Um cassete de expressão também pode compreender um sinal de poliadenilação, como um sinal de poliadenilação sintético mínimo. A seqüência de ácidos nucleicos também pode compreender um gene marcador.
De fato, além de composições direcionadas contra CCL21 e/ou CCLl9, as composições também podem ser direcionadas contra CCR7, o receptor para tais quimiocinas. Além disso, terapias de combinação são particularmente contempladas, em que os modos de tratamento direcionados contra a redução dos efeitos/atividade de CCL21 são combinados com modos de tratamento direcionados contra redução dos efeitos/atividade do receptor. Outras terapias de combinação específicas particularmente contempladas são aquelas em que os métodos de tratamentos baseados na redução da atividade de CCL21 na doença fibrosante são combinados com tratamentos para fibrose pré-existentes. Por exemplo, no momento, ciclofosfamida, isoladamente ou em combinação com micofenolato mofetil (MMF) ou prednisolona, ou outros corticosteróides provou ser eficaz na melhoria de fibrose pulmonar. Programas clínicos também mostraram resultados promissores com a segurança e eficácia de bosentan (Tracleere) na forma idiopática e relacionadas a escleroderma de fibrose pulmonar. Azatioprina também pode ter um papel na estabilização da função pulmonar e melhora os sintomas em distúrbios fibróticos. A terapia com Citocina (IFNgama) também pode ser um método de tratamento útil para o tratamento de distúrbios fibrosantes. Quaisquer composições podem ser usadas em combinação com terapias baseadas em anti-CCL21 e/ou terapias baseadas em anti-CCL19 (note que por terapias "baseadas em anti-CCL21" ou uantiCCL19" entende-se ambas terapias com anticorpo bem como terapias que empregam moléculas siRNA) para reduzir, eliminar ou abolir os sintomas da fibrose.
Sem levar em consideração de os anticorpos são gerados contra um antígeno específico em um animal ou são anticorpos quiméricos preparados através de apresentação de fago e técnicas de construção de anticorpo, tais anticorpos serão formulados e, formulações farmacêuticas para o tratamento de distúrbios fibróticos. Do mesmo modo, as composições de siRNA também serão formuladas em composições para o tratamento desses distúrbios. A liberação local das composições será preferida, mas é contemplado que a liberação sistêmica também é possível.
Composições farmacêuticas para administração de acordo com a presente invenção podem compreende qualquer uma das composições baseadas em anti-CCL21 e/ou anti-CCL19 acima discutidas. As composições farmacêuticas também incluem um outro agente que é usado para o tratamento de distúrbios de metabolismo de surfactante, por exemplo, broncodilatadores, particularmente se o paciente manifesta evidência de reatividade de via aérea presente bem como, agentes mucoliticos como acetilcisteína, tripsina, e ambroxol, e/ou GM-CSF, corticosteróide e outros agentes antiinflamatórios.
Cada uma dessas preparações é em alguns aspectos fornecida em uma forma farmaceuticamente aceitável opcionalmente combinada com um veículo farmaceuticamente aceitável. Essas composições são administradas por quaisquer métodos que atinjam seus objetivos pretendidos. Quantidades e regimes individualizados para a administração das composições para a inibição, abolição, ou outros sobre os efeitos de CCL21 ou CCL19 na lesão fibrótica que usam os métodos da presente invenção são determinados facilmente por aqueles com habilidade comum na técnica usando ensaios que são usados para o diagnóstico do distúrbio e determinação do nível de efeito que uma dada intervenção terapêutica produz.
No tratamento de IIP, qualquer um dos protocolos, formulações, vias de administração e outros que tenham sido previamente usados no tratamento de distúrbios pulmonares podem ser facilmente modificados para uso na presente invenção. Em alguns casos, a ventilação mecânica pode ser adequada, em que a diminuição da respiração é particularmente extrema. Tal ventilação pode incluir ventilação oscilatória de alta freqüência (HFOV) ou outras formas não convencionais de ventilação mecânica.
Composições dentro do escopo dessa invenção incluem todas as composições que compreendem pelo menos um agente para diminuição dos efeitos ou atividade de CCL21 em uma quantidade eficaz para atingir seu objetivo pretendido de redução, inibição, prevenção ou diminuição da atividade de CCL21 como exemplificado por uma diminuição ou redução na quantidade de fibroblastos em uma local de lesão de doença fibrótica. Em alguns aspectos, tal tratamento resultará em um alívio de um ou mais sintomas de TIP.
Em outros aspectos, as composições usadas na presente invenção são administradas com o uso de um inalante ou por via oral.
Entende-se que a dose adequada da composição de acordo com a presente invenção dependerá da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento concomitante, se houver, freqüência de tratamento, e da natureza do efeito desejado. No entanto, a dosagem é determinada individualmente, como é entendido e determinável por pessoa habilitada na técnica, sem experimentação desnecessária. Essa tipicamente envolve ajuste de uma dose padrão, por exemplo, redução da dose se o paciente tem um baixo peso corporal.
A dose total de agente terapêutico é administrada em múltiplas doses ou em uma dose única. Em certas modalidades, as composições são administradas isoladamente, em outras modalidades as composições são administradas junto com outros terapêuticos direcionados para a doença ou direcionados a outros sintomas dessa.
Em alguns aspectos, as composições da invenção são formuladas em composições farmacêuticas adequadas, ou seja, em uma forma adequada para aplicações in vivo na intervenção terapêutica de doença fibrosante. Geralmente, isso requer a preparação de composições que são essencialmente livres de pirógenos, bem como outras impurezas que podem ser danosas a humanos ou animais. Em alguns aspectos, as composições são preparadas para administração diretamente ao pulmão. Essas formulações são para administração oral via um inalante, no entanto, outras vias de administração são contempladas (por exemplo, injeção e outros). 0 achado de que CCL21 é altamente expresso em fibroblastos IIP mas não em fibroblastos normais ou outros tecidos leva a uma conclusão que um sítio principal dessa quimiocina é integralmente envolvido na formação das lesões fibróticas, isso parece ser particularmente verdadeiro em IIP. Como tal, é contemplado que as formulações e vias de administração que facilitam que as composições sejam facilmente administradas para o tecido pulmonar serão particularmente úteis.
É desejável geralmente o emprego de sais e tampões adequados para tornar as composições estáveis e permitir a absorção das composições no local alvo. Geralmente as composições de proteína da invenção são fornecidas em forma liofilizada a ser reconstituída antes da administração. Alternativamente, as composições podem ser também formuladas em comprimido ou outra forma de liberação oral. Tampões e soluções para a reconstituição dos agentes terapêuticos podem ser fornecidos com a formulação farmacêutica para produzir composições aquosas da presente invenção para administração. Tais composições aquosas compreenderão uma quantidade eficaz de cada um dos agentes terapêuticos sendo usados, dissolvidos ou dispersos em um veículo farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso. Tais composições também são referidas como inóculo. A frase "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" refere- se a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras reações quando administradas a um animal ou um humano. Como aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardo de absorção e outros. O uso de tal meio e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que como qualquer meio convencional ou agente é incompatível com as composições terapêuticas, seu uso em composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares são também incorporados nas composições.
Métodos de formulação de proteínas e ácido nucleico para administração terapêutica são também conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. A administração dessas composições de acordo com a presente invenção será por qualquer via comum desde que o tecido alvo seja disponível por essa via. Mais comumente, essas composições são formuladas para administração oral, como por um inalante. No entanto, outras vias de administração convencionais, por exemplo, subcutânea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, intraocular, retrobulbar, intrapulmonar (por exemplo, liberação de termo), aerossol, sublingual, nasal, anal, vaginal, ou liberação transdérmica, ou por implante cirúrgico em um local particular também são usadas particularmente quando a administração oral é problemática. 0 tratamento pode consistir em uma única dose ou uma pluralidade de doses por um período de tempo.
Em certas modalidades, os compostos ativos são preparados para administração como soluções de base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis em água adequadamente misturados com um surfactante, como hidroxipropilcelulose. Dispersões também são preparadas e glicerol, polietileno glicol liquido, e misturas desses e em óleos. Sob condições comuns de estocagem e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microorganismos.
As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos a forma deve ser estéril e deve ser fluida para facilitar a passagem pela seringa. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e estocagem e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos, como bactérias e fungos. Em alguns aspectos, o veículo é um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido e outros) , misturas adequadas desses, e óleos vegetais. A fluidez adequada é mantida, por exemplo, pelo uso de u revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho necessário da partícula no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microorganismos é feita por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e outros. Em vários casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis é feita pelo uso nas composições de agentes de retardo de absorção, por exemplo, monostearato de alumínio e gelatina. Soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos compostos ativos na quantidade necessária no solvente adequado com vários de outros ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daquelas acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são técnicas de secagem por vácuo e de liofilização que geram um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada previamente estéril desse.
Como aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardo de absorção e outros. 0 uso de tal meio e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que como qualquer meio convencional ou agente é incompatível com as composições terapêuticas, seu uso em composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares são também incorporados nas composições.
Em alguns aspectos, as composições da presente invenção são formuladas em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e outros. Sais formados com os grupos carboxil livres são também derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou hidróxidos férricos, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e outras.
Após a formulação, as soluções serão administradas em uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade como é terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em várias formas de dosagem como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de medicamento e outros. Para administração parenteral em um solução aquosa, por exemplo, a solução é adequadamente tamponada se necessário e o diluente líquido primeiramente torna-se isotônico com suficiente solução salina ou glicose. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal.
"Dose unitária" é definida como uma quantidade distinta de uma composição terapêutica dispersa em um veículo adequado. Em certas modalidades, a administração parenteral dos compostos terapêuticos é realizada com um bolo inicial seguido por infusão contínua para manter níveis circulantes terapêuticos circulantes de medicamento. Aqueles de habilidade comum na técnica irão otimizar dosagens eficazes e regimes de administração como determinado por boa prática médica e a condição clínica do paciente individual.
A freqüência da dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e das vias de administração. A formulação farmacêutica ótima será determinada por uma pessoa habilitada na técnica dependendo da via de administração e da dosagem desejada. Tais formulações podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, a dose adequada é calculada de acordo com o peso corporal, áreas de superfície corporal ou tamanho do órgão. A disponibilidade de modelos animais é particularmente útil na facilitação da determinação de dosagens adequadas de um dado terapêutico. O apuro adicional dos cálculos necessários para determinar a dose de tratamento adequada é rotineiramente feita por aqueles de habilidade comum na técnica sem experimentação indevida, especialmente em vista da informação de dosagem e ensaios aqui revelados bem como os dados de farmacocinética observados em experimentos clínicos com animais ou humanos.
Tipicamente, dosagens adequadas são confirmadas através do uso de ensaios estabelecidos para determinação dos níveis sangüíneos junto com dados de resposta de dose relevantes. O regime de dosagem final será determinado pelo médico, considerando fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo, a atividade específica do medicamento, severidade do dano e a resposta do paciente, da idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, da severidade de qualquer infecção; tempo de administração e outros fatores clínicos. Uma vez que estudos são conduzidos, informação adicional surgirá e relação aos níveis de dosagem adequados e duração do tratamento para doenças e condições específicas. Quaisquer dosagens podem ser otimizadas com o uso de modelos da doença como aqueles modelos de roedores aqui descritos.
Deve ser percebido que as composições farmacêuticas e métodos de tratamentos da invenção são úteis em campos de medicina humana e medicina veterinária. Assim, o indivíduo a ser tratado é um mamífero, como um humano ou outro animal mamífero. Para objetivos veterinários, indivíduos incluem, por exemplo, animais de fazenda incluindo vacas, carneiros, porcos, cavalos e cabras, animais de companhia como cães e gatos, animais exóticos e/ou de zoológico, animais de laboratório incluindo camundongos, ratos, coelhos, porquinho da índia e hamsters; e aves como galinhas, perus, patos e gansos.
A presente invenção também contemplada kits para uso no tratamento de distúrbios fibrosantes. Tais kits incluem pelo menos uma primeira composição que compreende as terapias baseadas em anti-CCL21 e/ou anti-CCL19 acima descritas em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um outro componente é um segundo agente terapêutico para o tratamento do distúrbio junto com recipientes e veículo adequados para administrações das composições terapêuticas. Os kits podem compreender adicionalmente soluções ou tampões para efetuar a liberação da primeira e segunda composições. Os kits também podem compreender cateteres, seringas ou outros dispositivos de liberação para a liberação de uma ou mais das composições usadas nos métodos da invenção. Os kits também podem compreender instruções contendo protocolos de administração para os regimes terapêuticos. Exemplos
Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar certas modalidades da invenção. Deve-se perceber por aqueles habilitados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e assim são consideradas como constituindo certos aspectos para sua prática. No entanto, aqueles de habilidade na técnica devem, em vista da presente revelação, perceber que várias mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obtêm um resultado semelhante ou similar sem fugir do espírito e escopo da invenção.
Exemplo 1: Métodos e Materiais usados para mostrar o papel de CCR7 em pneumonia intersticial idiopática
Pacientes suspeitos de ter IIP, como determinado a partir de uma compilação de achados clínicos, fisiológicos, radiográficos e patológicos (Flaherty e cols., Am. J. Med., 110:278-282 (2001); Flaherty e cols., Curr. Opin. Pulm. Med., 6:404-410 (2000); Kazerooni e cols., AJR Am. J. Roentgenol., 169:977-983 (1997); American Thoracic Society, European Respiratory Society (ATS/ERS), Am. J. Respir. Crit. Care Med., 165:277-304 (2002)). Nenhum dos pacientes participantes do presente estudo foram submetidos a cirurgia de biópsia prévia ou receberam tratamento para IIP. SLBs foram realizados como parte da avaliação para \ "University of Michigan Specialized Center of Research in the pathobiology of fibrotic Lung disease" entre maio de 2000 e agosto de 2004. Biópsias de pulmão histologicamente normal sem evidência patológica de doença foram obtidas das margens distantes de espécimes retirados em pacientes que se submetem à ressecção torácica para câncer pulmonar. Cada SLB foi processado separadamente usando técnica estéril em um tampo de fluxo laminar e processado para análise molecular, de proteína, e imunohistoquímica (veja abaixo).
Preparação de RNA e cDNA a partir de SLBs. A porção de cada SLB usada para análise molecular foi congelada em nitrogênio líquido e estocada a 280°C. Para isolação de RNA, essas amostras foram derretidas em gelo, e mecanicamente homogeneizadas em reagente TRIzolH (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, USA) e RNA total foi então preparado de acordo com as instruções do fabricante. RNA purificado de SLBs foi subseqüentemente transcrito de forma reversa em cDNA usando um kit de transcrição reversa BRL e iniciadores oligo (dT) 12-18. 0 tampão de amplificação continha 50 mM KCl, 10 mM Tris/HCl (pH 8,3), e 2,5 mM MgCl2.
Análise de arranjo de gene. Membranas de arranjo de gene Non-Rad GEArray de SuperArray Inc (Bethesda, Maryland, USA) foram usadas para analisar mudanças nos perfis de gene para quimiocinas e receptores de quimiocina humana, como descrito previamente. (Choi e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 170:508-515 (2004)). Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como o controle interno positivo porque ela foi consistentemente expressa em todos os SuperArrays analisados no presente estudo.
Análise de Taqman PCR de tempo real. Expressão de gene CCR7, CXCR4, CCLl9, CCL21, e CXCLl2 Humano em IIP e SLBs de margem normal foi analisada por um procedimento de reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa de tempo real (PCR) usando um sistema de detecção de seqüência ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, USA), como descrito previamente. (Jalcubzick e coIs.; Am. J. Pathol., 162:1475-1486 (2003)). Os cDNAs de SLBs de lobo superior e inferior foram analisados para expressão de receptor de quimiocina, quimiocina, e GAPDH (um controle interno). Todos os iniciadores e marcadores usados foram adquiridos de Applied Biosystems. Expressão de gene de quimiocina foi normalizada a GAPDH antes que a mudança de vezes na expressão de quimiocina fosse calculada. Os aumentos em vezes na expressão de gene de citocina foram calculados por comparação da expressão de gene em todos os pacientes com aquele detectado nos lobos superior ou inferior do grupo de pacientes de tumor de margem normal.
Análise de ELISA. As concentrações de CCLl9, CCL21, e CXCL12 humano foram medidas em 50 ml de amostras de sobrenadante livre de células de IIP homogeneizados e SLBs de margem normal usando uma técnica de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima padronizado de sanduíche (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) . Citocinas recombinantes humanas foram usadas para gerar curvas padrão das quais as concentrações presentes nas amostras foram derivadas. 0 limite de detecção para CCL19, técnicas de imunohistoquímica e imunoquímica rotineiras foram usadas para detectar CCR7, CXCR4, CD45, CD34, e aSMA em SLBs, como descrito previamente. (Jakubzick e cols., J. Clin. Pathol., 57:477-486 (2004)). Os seguintes anticorpos alvos e seus controles de isotipo adequados foram usados: anticorpo CCR7 anti-humano de camundongo e IgMk de camundongo adquiridos de BD Biosciences PharMingen (San Diego, Califórnia, USA); CXCR4 anti-humano de camundongo e IgG2B de camundongo adquiridos de R&D Systems; CD45, CD34 anti-humano de camundongo, e anticorpos colágeno 1 adquiridos de Abcam (Cambridge, Massachusetts, USA) e IgG1 de camundongo adquiridos de R&D Systems. SLBs de lobo superior e inferior de 10 pacientes com UIP, seis com NSIP, e cinco com RBILD foram analisadas usando essas técnicas de imunohistoquímica. As margens normais de tumores ressecados foram analisadas em cinco pacientes. Secções em série (5 mm de espessura) foram analisadas de cada SLB e a localização de CCR7 com outros antígenos foi realizada em secções em série imediatamente adjacentes serial.
Exemplo 2: Resultados que mostram papel de CCR7 em Pneumonia Interstitial Idiopática
Análise SuperArray de transcritos de CCR7, CXCR4, CCLl9, CCL21, e CXCLl2 em IIP e SLBs de margem normal. A presença de CCR7 e CXCR4 em IIP e SLBs de margem normal foi analisada com o uso de SuperArray GEArray específico.
Embora essa seja uma técnica qualitativa e não quantitativa, a expressão de CCR7 (Figura IA) e CXCR4 (Figura 1B) foi normalizada aquela de GAPDHf e os valores são mostrados para ambos receptores. A mais alta expressão de CCR7 e CXCR4 relativa foi observada em biópsias de lobo superior e inferior do grupo de paciente UIP (II = 7). Biópsias de lobo inferior e superior de (n = 6) , RBILD (n = 6), e margem normal (n = 5) grupos de paciente com tumor NSIP foram similarmente analisadas. Embora diferenças significativas não fossem detectadas, no geral, a expressão relativa de ambos receptores de quimiocina pareceu seguir um padrão de severidade de doença como se segue: UIP.NSLP .Rl3ILD.margem normal. Os dois ligantes de CCR7 identificados até hoje são CCLl 9 (Yoshida e cols. , I. Biol. Chem., 272:13803-13809 (1997)) e CCL21. (Campbell e cols., J. Cell Biol., 141:1053-1059 (1998)). CCLl9 (ou ELC, exodus-3, e CKb-1134) é constitutivamente expresso em endotélio linfóide aferente e a área de célula T de linfonodos, assim respondendo por seu papel principal no movimento de células dendríticas e células T para esses locais imunes. (Sallusto e cols., Eur. J. Immuno(., 29:1617-1625 (1999)). Estudos concomitantes mostraram que CCL21 (ou SLC, exodus-2, TCA-4, e CKb-99) tinham funções similares e umm padrão similar de expressão. No entanto, ambas quimiocinas foram detectadas no pulmão (Gunn e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:258-263 (1998)) e rim, (Banas e cols., J. Immunol., 168:4301-4307 (2002)) sugerindo que eles podem ter papeis fora da vigilância imune. A análise da expressão relativa de transcrito de CCL19 revelou maiores quantidades desse ligante de CCR7 em biópsias de lobo inferior e superior de UIP (Figura 2A) . quantidades similares de transcrito CCL19 foram detectadas em biópsias de NSIP e RBILD, e as menores quantidades foram observadas em biópsias de margem normal. No entanto, nenhum padrão claro de expressão de transcrito de CCL21 (Figura 2B) e CXCLl2 (Figura 2C) foram observados entre biópsias de IIP e de margem normal.
Análise de PCR quantitativa de tempo real de expressão de transcrito de CCR7, CXCR4, CCLl9, CCL21, e CXCLl2 em IIP e análise de PCR de tempo real de SLBs de margem normal Taqman de biópsias de lobo superior e inferior de quatro grupos de paciente revelou um aumento significativo na expressão de transcrito de CCR7 em SLBs superior e inferior de pacientes com UIP (n = 18) comparados com a biõpsia adequada do grupo de paciente de tumor de margem normal (rt = 5) (Figura 3A) . Os valores médios de transcrito de CCR7 foram aproximadamente 146 (SEM, 58) e 675 (SEM, 300) vezes maior em em UIP SLBs de lobo superior e inferior, respectivamente, comparado com o lobo adequado do grupo de pacientes de margem normal. Expressão de transcrito aproximadamente cinco vezes maior de CCR7 foi detectada em biópsias de lobo inferior UIP comparado com biópsias de UIP de lobo superior. Valores médios de transcrito de CCR7 foram aumentados em quatro vezes (SEM, 1) em lobo superior e inferior NSP SLBs comparado com SLBs de margem normal. Valores médios de transcrito de CCR7 foram também aumentados em RBILD SLBs em relação a SLBs de margem normal: 3 6 (SEM, 28) vezes em SLBs superior e 4,4 (SEM, 3,2) vezes em biópsias de lobo inferior. Aumentos na expressão de transcrito de CCR7 em NSIP e RBILD SLBs em relação a SLBs de margem normal não foram significativos.
Esses achados foram únicos para CCR7 porque a análise Taqman PCR de CXCR4 não encontrou aumento significativo em Expressão de transcrito de CXCR4 em IIP SLBs em relação a SLBs de margem normal (dados não mostrados) . Finalmente, nenhum padrão claro ou diferenças significativas em expressão de transcrito de CCL19 (dados não mostrados) , CCL21 (Figura 313) , e CXCL12 (dados não mostrados) foram aparentes ou detectados entre os grupos de paciente com IIP e tumor de margem normal examinados. No entanto, o maior aumento na expressão de transcrito de CCL21 em relação ao grupo de pacientes de tumor de margem normal foi observado nas biópsias de lobo superior e inferior de grupo de paciente com UIP (mais que 40 vezes maior que os valores de margem normal SLB). Maiores aumentos em expressão de transcrito de CCL21 foram observados em RBLLD SLBs inferior e superior comparado com NSIP SLE3s. Juntos, esses dados sugerem que a em expressão de transcrito de CCR7 foi muito aumentada em UIP, e que aumentos na expressão de transcrito de CCR7 foram também presentes em formas menos severas de IIP.
Análise de ELISA de proteína CCLl9, CCL21, e CXCL12 em IIP e SLBs de margem normal. Figura 4 mostra as concentrações de proteínas CCL19 (Figura 4A), CCL21 (Figura 4B), e CXCLl2 (Figura 4C) em sobrenadantes livres de células de SLBs homogeneizados. Nenhum padrão claro de expressão de CCL foi observado, e nenhuma diferença significativa foi observada entre so grupos de pacientes analisados. Portanto, esses dados sugerem que os eventos fibróticos em IIP não foram associados com a geração aumentada de ligantes de CCR7 e CXCR4 no pulmão.
Expressão de proteína intersticial focai CCR7 em IIP SLBs. A análise SuperArray e de transcrito de PCR de tempo real sugerem que a expressão de CCR7 foi muito maior em IIP SLBs que em SLBs de margem normal; portanto, a análise imunohistoquímica de secções de pulmões de IIP e SLBs de margem normal confirmam essas observações. Como mostrado na Figura 5, expressão focai intersticial de CCR7 foi observada em SLBs de grupos de pacientes UIP, NSLP, e RBILD. Embora a expressão de CCR7 fosse observada em macrófagos nos pacientes com RBILD (Figura 5F), o padrão focai intersticial de expressão de CCR7 não foi exclusivamente associada com células imunes em UIP (Figura 5B) e NSIP biópsias (Figure 5D) . Múltiplas áreas de expressão focai de proteína CCR7 foram presentes em áreas intersticiais de todos os SLBs de lobo superior e inferior de grupo de paciente UIP (n = 10) . Deve-se notar que o foco da expressão de CCR7 não compreende exclusivamente fibroblastos, outras células, incluindo células mononucleares e epiteliais, também expressam esse receptor de quimiocina. Subtipos NSIP e RBILD expressaram menos CCR7 que o subtipo mais severo UIP. Embora 50% dessas biópsias mostrassem coloração de CCR7, menos áreas focais de expressão de CCR7 foram observadas em SLBs de lobo superior e inferior no grupo de paciente NSIP (n=6) . CCR7 foi freqüentemente restrito a vasos sangüíneos e células mononucleares em três quartos do RBILD (n = 5) SLBs, mas a coloração de CCR7 foi infrequentemente detectada em áreas intersticiais das amostras de biópsia desse grupo de IIP. Em contraste à coloração proeminente vista em UIP SLBs, nenhuma expressão de CCR7 foi detectada por análise de imunohistoquímica em SLBs superior e inferior de pacientes com margens normais (n =5) (Figura 5H).
No mesmo IIP e SLBs de margem normal analisados para CCR7, CXCR4 a coloração pareceu ser limitada a células imunes, e mais importantemente, a expressão desse receptor de quimiocina não foi focai e não difere entre os quatro grupos de pacientes analisados. Tosas as biópsias de IIP e de margem normal analisadas mostraram forte expressão de CXCR4 associada a células mononucleares. Isso é apontado na Figura 6, que mostra coloração representativas de CXCR4 em UIP (Figura 6B), NSIP (Figura 6D), RBILD, (Figura 6F), e margem normal(Figura 5D) SLBs. Assim, uma pesquisa de imunohistoquímica revelou que CCR7, diferente de CXCR4, foi proeminentemente expresso em IIP SLBs mas não em SLBs de margem normal, e que a expressão de CCR7 pareceu ser localizado a áreas intersticiais focais em IIP.
Para elucidar a identidade das células que fazem as áreas positivas de CCR7 em IIP SLBs, experimentos de coloração adicional foram realizados em secções em série para a expressão de CD4 5 e CCR7 (Figura 7). Após exame de UIP SLBs, a expressão imunohistoquímica de CCR7 (Figura 7B) sobrepõe parcialmente com aquela de CD4 5 (Figura 7C). Células que expressam CCR7 e CD4 5 pareceram ser células mononucleares. Em contraste, embora CCR7 fosse altamente expresso em biópsias de NSIP (Figura 7E), a imunolocalização desse receptor de quimiocina não corresponde com aquela de CD45. Estudos de imunohistoquímica similares em RBILD SLBs revelou a mesma ausência de localização de CCR7 e CD45 (não mostrado). Portanto, expressão dupla de CD4 5 e de CCR7 em células mononucleares era presente em UIP mas não em outras formas de IIP. Como descrito acima, CD34 é um antígeno de célula tronco hematopoiética que foi identificado em fibrócitos de sangue periférico. (Abe e cols., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001) ). Os inventores a seguir examinaram se esse marcador poderia ser identificado em secções histológicas de IIP e biópsias de margem normal (Figura 8). De forma interessante, muito pouca expressão de CD34 foi observada em biópsias de UIP (Figura 8B), e quando ela foi detectada esse antígeno foi predominantemente localizado nas áreas intersticiais da biópsia. A mais alta expressão de CD34 foi observada em biópsias de NSIP, em que esse marcador foi altamente expresso em áreas intersticiais e em células mononucleares (Figura 8D). Forte expressão de CD34 foi também detectada em áreas intersticiais em SLBs de RBILD (Figura 8F) e margem normal (Figura 8H). Exame adicional da localização de CD34 e CCR7 não revela áreas em IIP ou SLBs de margem normal que mostraram expressão dupla dessas proteínas (não mostrado). Portanto, CD34 foi proeminentemente expresso em formas menos severas de IIP e em SLBs de margem normal.
Colágeno 1 é expresso principalmente por fibrócitos e essas células geram colágeno após recrutamento a locais de dano tecidual. (Abe e cols., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001) ). A Figura 9 resume a análise de imunohistoquímica de expressão de proteína colágeno 1 em IIP e SLBs de margem normal. Colágeno 1 foi imunolocalizado a áreas intersticiais em UIP (Figura 9B), NSIP (Figura 9D), RBILD (Figura 9F), e biópsias de pacientes com tumor de margem normal (Figura 91-1). A mais alta expressão de colágeno 1 foi observada em UIP SLBs, mas alta expressão de proteína colágeno 1 foi também notada em SLBs de margem normal. Para determinar se colágeno 1 e CCR7 colocalizados em biópsias de IIP, coloração foi também realizada em secções em série para determinar a expressão de ambas as proteínas (Figura 10). Embora colágeno I foi altamente expresso em todos UIP SLBs (Figura 10B), CCR7 não foi expresso em áreas com alta expressão de colágeno 1 (Figura 10C). Um padrão similar foi observado em NSIP (não mostrado) e RBILD (Figura 10E,F) SLBs, em que o colágeno 1 (Figura 10E) não parece se localizar com a expressão de CCR7 (Figura 10F). Portanto, áreas positivas de CCR7 em IIP SLBs não foram também positivas para colágeno 1.
Áreas positivas de CCR7 em IIP SLBs são desprovidas de expressão de aSMA. A Figura 11 mostra coloração imunohistoquímica representativa para CCR7 e aSMA em secções histológicas de pulmão de pacientes diagnosticados com UIP (Figura 11 A-C) , NSIP (Figura IlD-F) , e RBILD (Figura 11G—I) . Em todos os três grupos de paciente, focos de CCR7 (Figura 11B, Ε, H) expressão foram vistos em áreas intersticiais do pulmão, como descrito acima. No entanto, áreas que foram positivas para CCR7 não se sobrepuseram com aquelas que foram positivas para aSMA em secções em série (Figura 11C,F,I)).
O objetivo geral do estudo foi o de examinar o padrão de expressão de CCR7, CXCR4, CCLl9, CCL21, e CXCLl2 em amostras de biópsia de pulmão de IIP e grupos de pacientes de tumor de margem normal. Análise quantitativa de transcrito e análise de proteína qualitativa revelou que CCR7, mas não CXCR4, foi dramaticamente aumentada em UIP em relação a SLBs de margem normal. UIP SLBs, e a uma menor extensão NSlP SLBs, exibiram áreas intersticiais focais de intensa expressão de proteína CCR7 que não foram concomitantemente positivas para CD34, colágeno 1, ou aSMA. A expressão focai de proteína CCR7 foi observada em todos UIP SLBs e menores proporções das biópsias de NSIP e RBILD. Em DTP SLBs, a expressão focai intersticial de proteína CCR7 pareceu incluir algumas células CD45 positivas, (Sallusto e cols., Eur. J. Immunol., 28:2760- 2769 (1998) ) mas a maioria das células positivas de CCR7 eram desprovidas de expressão de CD45 e não houve sobreposição entre expressão de CCR7 e CD4 5 em biópsias de pacientes com NSIP e RBILD. Embora seja possível que a expressão de CCR7 em áreas intersticiais de biópsias de UIP e NSIP possa representar o recrutamento de fibrócitos derivados de medula óssea, (Bucala e cols., Mol. Med., 1:71-81 (1994)) não houve evidência de que áreas positivas de CCR7 nessas biópsias foram positivas para marcadores de fibrócito, como CD34 e colágeno I. Em adição, essas células positivas de CCR7 eram desprovidas do marcador de miofibroblasto aSMA. Esses dados levaram à especulação de que expressão focai de proteína CCR7 pode indicar sítios de dano idiopático, e a ativação inadequada de fibroblastos residentes, em vez do recrutamento de fibrócitos que expressam CCR7. Embora seu papel na doença humana ainda deva ser estabelecido, e nenhum marcador de superfície celular específico de fibrócito tenha sido identificado, vários modelos experimentais de fibrose apontam para um papel para células circulantes de medula óssea que se originam em eventos fibróticos na pele (Fathke e cols., Stem Cells, 22:812-822 (2004)) e pulmão ( Hashimoto e cols., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips e cols., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004); Epperly e cols., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:213-224 (2003); Schmidt e cols., J. Immunol., 171:38(-389 (2003)). A maior parte desses estudos experimentais usam modelos de quimera de medula óssea construídos pela transferência de medula óssea de murídeo que expressa transgenicamente proteína verde fluorescente quimérica em camundongos irradiados. Células positivas para proteína verde fluorescente derivadas de medula óssea, que assumiram morfologia semelhante a macrófago (Epperly e cols., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:213-224 (2003)) e/ou semelhante a fibroblasto (Hashimoto e cols., J. Clin. Invest., 113:243- 252 (2004); Phillips e cols., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)), mostraram ser grandes contribuintes para fibrose tecidual. Além disso, essas células derivadas de medula óssea foram sensíveis a manganês superóxido dismutase, (Epperly e cols., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:213- 224 (2003)) e expressaram colágeno 1, (Hashimoto e cols., J. Clin. Invest., 113:243- 252 (2004); Phillips e cols., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004); Schmidt e cols., J. Immunol., 171:.380-389 (2003)) CD34, (Schmidt e cols., J. Immunol., 171:380-389 (2003)) CD45, (Phi)Iips e cols., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)) telomerase transcriptase reversa, (Hashimoto e cols., J. CI in. Invest., 113:243-252 (2004)) CCR7, (Hashimoto e cols., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004)) e CXCR4 (Hashimoto e cols., i. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips e cols., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)).
Todavia, permanece controvérsia em relação a se fibrócitos se diferenciam em miofibroblastos uma vez que eles se localizam no pulmão. É atualmente aceito que fibrócitos recrutados no tecido brônquico depois de exposição a alérgenos (Schmidt e cols., J. Immunol., 171:380-389 (2003)) ou em sítios cutâneos danificados (Abe e cols., J. Immunol., ) 66:7556-7562 (2001)) se diferenciam em miofibroblastos, em que fibrócitos atraídos ao pulmão durante fibrose intersticial causada por bleomicina não expressam aSMA e não podem ser induzidos a expressar esse marcador de miofibroblasto. (Hashimoto e cols., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004)). Controvérsia adicional em relação a essas células é a observação de que nem todas as células derivadas de medula óssea parecem ser deletérias durante a reparação tecidual. Portanto, Ortiz e colegas (Ortiz e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 100:8407-8411 (2003)) mostraram que células tronco mesenquimais de murideo migram para o pulmão danificado, assumem um fenótipo semelhante a epitélio, e reduzem a inflamação e depósito de colágeno em camundongos que receberam bleomicina. Claramente, investigação adicional é necessária para delinear o papel de células derivadas de medula óssea na resposta fibróticos clinica.
Impulso para examinar CCR7 e CXCR4 em SLBs de pacientes com IIP procedentes de estudos prévios que mostram que CCL21, um ligante do receptor de quimiocina CCR7, foi um potente estimulo para a quimiotaxia de fibrócito in vitro e in vivo, (Abe e cols., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)) e que células CXCR4 positivas derivadas de medula óssea contribuem para fibrose experimentalmente induzida. (Hashimoto e cols., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips e cols., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)). É postulado que fibrócitos podem entrar rapidamente em sítios de dano tecidual através de CCR7, CXCR4, ou possivelmente outro receptor de quimiocina dependente de eventos quimiotáticos e contribuem para a patogênese de fibrose pulmonar. (Phillips e cols., J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)). No presente estudo, áreas focais de expressão de CCR7 foram examinadas para a presença de marcadores de fibrócito supostos, incluindo CD45, CD34, e colágeno 1. (Abe e cols., J. Immunol., 166:7556-7562 (2001); Hartlapp e cols., FASRR J., 15:2215- 2224 (2001) ) . CD4 5 foi o único marcador que era presente nas áreas focais de expressão de CCR7, e colocalização de CD4 5 e CCR7 foi apenas observada em células mononucleares presentes em UIP, e não em outras biópsias de IIP. Além disso, todos esses marcadores foram detectados em SLBs de margem normal embora as técnicas de imunohistoquímica tenham falhado para detectar CCR7 nessas biópsias. Embora os achados não impeçam a possibilidade de que as células positivas de CCR7 vistas em biópsias de paciente são fibrócitos, é possível que a expressão desses marcadores seja rapidamente infra-regulada com a migração de fibrócitos da circulação ao pulmão.
A observação de que CXCR4 não foi presente em áreas focais de IIP SLBs também não impede a importância desse receptor de quimiocina no recrutamento de fibrócitos e/ou células produtoras de colágeno derivadas de medula óssea ao pulmão. Uma padrão difuso de expressão de CXCR4 foi observado em todos SLBs analisados e a maior parte das células que expressam esse receptor de quimiocina pareceram ser células mononucleares.
Em vistas das características sintéticas e proliferativas anormais de fibroblastos UIP (apontadas por focos fibroblásticos histologicamente distintos (King e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 164:1025-1032 (2001)), os inventores supõem que essas células podem ser também inadequadamente responsivas a ligantes de quimiocina que comumente regulam a função de células imunes. Fibroblastos teciduais residentes compreendem um componente principal da arquitetura pulmonar, e vários investigadores propuseram que a ativação inadequada dessas células sustenta as resposta fibróticas patológicas vistas em UIP e possivelmente outras formas de IIP. (Suganuma e cols., Thorax, 50:984-989 (1995); Hogaboam e cols., Proc. Assoc. Am. Physicians, 110:313-320 (1998); Ramos e cols., Am. J. Respir. Cell Ma Biol., 24:591-598 (2001); Selman e cols., Respir. Res., 3:3 (2002)). Os fatores que contribuem para essa ativação inadequada ainda não foram elucidados, mas os dados de vários laboratórios indicam que quimiocinas podem ter um papel nesse processo, (van den Blink e cols., Arch. Immunot Ther. Exp. (Warsz), 48:539-545 (2000); Selman, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 168:730-731 (2003)). Por exemple, é agora bastante reconhecido que fibroblastos UIP de pulmões fibróticos migram mais rápido que aqueles de pulmões de controle, (Suganuma e cols., Thorax, 50:984-989 (1995)) e há alguma sugestão de estudos de camundongo de que as quimiocinas têm um grande papel nesse assunto. (Moore e cols., J. Immunol., 167:4368-4377 (2001)). Impulso adicional para examinar a possibilidade de que CCR7 e CXCR4 tenham um papel na atividade migratória aberrante de células em IIP foi derivado de recentes descobertas no campo de biologia de câncer, que documentaram a expressão de um único repertório de receptor de quimiocinas em células de câncer de mama que explica, em parte, as propriedades metastáticas de tumores de mama. (Muller e cols., Nature, 410:50-56 (2001)).
Portanto, o presente estudo demonstrou a expressão focai intersticial de CCR7 em IIP. A identidade das células que expressam esse receptor ainda está por ser elucidada, mas áreas que contêm expressão focai de CCR7 não foram positivas para CD34 e colágeno 1. CCR7 que expressa células nas áreas intersticiais de biópsias de IIP também não expressa aSMA, assim apontando a possibilidade de que essas células foram miofibroblastos.
No Exemplo 3 apresentado abaixo, são fornecidos dados que mostram que as propriedades sintéticas e proliferativas de fibroblastos IIP, mas não fibroblastos de margem normal, são diferencialmente influenciados por CCL19 e CCL21 exógeno. Esses estudos são de potencial importância terapêutica, dado que pode ser possível inibir a migração de fibrócitos e/ou a ativação de fibroblastos pulmonares residentes em resposta a quimiocinas específicas para CCR7, assim evitando a excessiva produção de matriz extracelular em favor de reparação pulmonar adequada.
Exemplo 3: Direcionamento de CCL19 ou CCL21 para tratamento de distúrbios de fibrose crônica
Esse exemplo detalha o novo potencial no direcionamento de CCL19 e/ou CCL21 durante fibrose crônica no pulmão. Fibrose pulmonar crônica de origem conhecida e idiopática apresenta extraordinários desafios clínicos para os quais as opções de tratamento mostram eficácia limitada ou toxicidade (Flaherty e cols., Am. J. Med., 110:278-282 (2001); Hampton e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 149:A878 (1994)), e a taxa média de sobrevivência após o diagnóstico tem mudado pouco (Ryu e cols., Mayo Clin. Proc., 73:1085-1101 (1998); Lasky e cols., Environ. Health Perspect., 108 Suppl 4:751-762 (2000)). Estímulos pró- fibróticos conhecidos incluem radiação, mineral inalado e partículas orgânicas, oxidantes gasosos, fármacos e organismos infecciosos, embora persista um debate em relação à identidade de fatores etiológicos que iniciem as entidades clinicopatológicas das pneumonias intersticiais idiopáticas (IIP). IIP são um grupo diverso de distúrbios que envolvem o parênquima pulmonar distai, que partilha numerosas características, mas são suficientemente diferentes para justificar a designação como distúrbios separados (Travis e cols., Am. J. Surg. Path., 24:19-33 (2000)). Sua patogênese permanece obscura mas acredita-se que esteja centrada em um dano (ou danos múltiplos) ao pulmão seguido por tentativas de cicatrizar esse dano. Focos fibroblásticos, pequenos agregados de fibroblastos ativamente proliferantes, representam a organização dos focos prévios de dano e indicam que a fibrose é ativa e progressiva. No momento, a hipótese é de que a resposta de fibroblastos humanos a CCLl9 e CCL21 (devido sua supra- regulação de CCR7) leva à ativação inadequada dessas células assim levando às respostas fibróticas exuberantes observadas em IIP.
De forma interessante, o ambiente da citocina no pulmão de pacientes fibróticos pode favorecer a resposta aberrante a CCL19 e CCL21 uma vez que outros investigadores documentaram níveis de proteína aumentados de TNF-a (Ziegenhagen e cols., J. Investig. Med., 46:223-231 (1998); Kapanci e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152:2163- 2169 (1995)) e IL-10 diminuída (Martinez e cols., Am. J. Physiol., 273:L676-683 (1997)), ambas citocinas que modulam o receptor ao qual esses ligantes se ligam. Fibroblastos humanos de pacientes com formas severas de fibrose pulmonar claramente respondem a CCL19 e CCL21, assim tornando esses ligantes alvos atrativos no tratamento de doenças fibrosantes no pulmão e possivelmente em outros tecidos.
Os inventores discutiram se é possível induzir fibrose pulmonar depois da introdução intravenosa de linhas de fibroblastos humanos em camundongos imunodeficientes. Com esse modelo, os inventores examinaram se os fibroblastos humanos injetada por via intravenosa podem iniciar a resposta fibrótica em um sistema in vivo que é desprovido da capacidade de montar uma resposta inflamatória.
Esses dados também mostram que esse modelo é adequado para o teste da eficácia de direcionamento de CCR7 ou seus ligantes durante o início ou depois do desenvolvimento de fibrose pulmonar. Parece que camundongo CB-17-bg SCID é ideal para estudos de transferência com fibroblastos humanos porque camundongos CB-17-bg são desprovidos de células TeB (similar aos C.B-17 e ICR SClDs) e também carregam as mutações bege, que levam ã disfunção da função de célula T citotóxica, macrófago e células NK.
A introdução intravenosa de fibroblastos que crescem de biópsias fibróticas humanas em C.B-17-bg resultou em fibrose pulmonar histologicamente evidente e proeminente baseado em coloração de tricomo de Masson.
Em outros estudos, tecidos pulmonares de camundongo SCID foram examinados no dia 35 depois da injeção de fibroblastos usando o ensaio de hidroxiprolina e foi encontrado que os níveis de hidroxiprolina são marcadamente elevados em amostras de pulmão dos . camundongos que receberam fibroblastos que crescem a partir de biópsias de fibróticos humanos comparados com camundongos que receberam fibroblastos humanos normais. Portanto, os dados do modelo de SCID humanizado sugerem que é possível "transferir" uma doença fibrótica com fibroblastos IIP humanos. Esse modelo de SCID humanizado deve permitir o exame do fator que contribui para a manutenção da fibrogênese pulmonar.
Em estudos humanos, foi mostrado que a expressão de transcrito (Figura 12) e proteína (Figura 13) para CCL21 é marcadamente aumentada em biópsias cirúrgicas de pulmão de pacientes com várias formas de fibrose pulmonar crônica comparadas com aqueles que têm outros tipos de doenças não fibrosantes. Os dados mostraram que os fibroblastos pulmonares obtidos de pacientes com evidência de fibrose pulmonar mas não fibroblastos de pacientes sem evidência de fibrose anormal, exibiram respostas migratórias (Figura 14) e proliferativas (Figura 15) em resposta a CCL19 ou CCL21 exógeno. A observação de que CCLl9 e CCL21 dirigem a migração de fibroblastos pulmonares (Figura 14) é excitante porque essa resposta pode contribuir para o desenvolvimento de focos de fibroblastos proliferantes, uma característica histopatólogica principal em UIP.
Finalmente, a eficácia terapêutica de CCL21 durante o início e manutenção de fibrose pulmonar foi demonstrada com o uso de modelo de SCID de murídeo de fibrose que é caracterizada por fibrose intersticial e focos fibroblásticos (Figura 16).
Exemplo 4: Direcionamento de CCL21 ou CCR7 é eficaz para abolir fibrose pulmonar induzida por Transferência de fibroblastos pulmonares humanos em camundongos imunodeficientes.
Como acima discutido, receptor 7 de quimiocina CC (CCR7) é expresso em biópsias de IIP e linhas de fibroblasto primário. No presente exemplo, são fornecidos detalhes de um estudo do papel in vivo de CCR7 em um modelo de fibrose pulmonar. Brevemente, 1,0 χ IO6 de fibroblastos primários que crescem de fibrose pulmonar idiopática/pneumonia intersticial usual (IPF/UIP) , pneumonia intersticial não específica (NSIP), ou biópsias histologicamente normais foram injetados por via intravenosa em camundongos C.B.-17SCID/bege (bg). Nos dias 35 e 63 depois da injeção de fibroblasto IPF/UIP, fibrose intersticial, e hidroxiprolina aumentada foram presentes nos pulmões de camundongos imunodeficientes. Fibroblastos NSlP transferidos causaram uma fibrose intersticial mais difusa e níveis aumentados de hidroxiprolina em ambos momentos mas a injeção de fibroblastos normais humanos não induziu mudanças de remodelagem intersticial em camundongos C.B-17SCID/bg. Imunoneutralização sistêmica terapêutica de CCR7 ou CCL21 humano, seu ligante, atenuou significativamente a fibrose pulmonar em grupos de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam cada tipo de fibroblastos IIP. Portanto, o presente estudo demonstra que a fibrose pulmonar é iniciada pela introdução intravenosa de linhas de fibroblasto humano primário em camundongos imunodeficientes, e essa resposta fibrótica é dependente da interação entre CCL21 e CCR7.
Modelos de camundongos de fibrose pulmonar forneceram paradigmas experimentais com os quais discutir a remodelagem tecidual anormal e cicatrização no sistema respiratório (Gharee-Kermani e cols., Meths. Mol. Med., 2005, 117:251-259). Inúmeras abordagens foram empregadas para induzir fibrose pulmonar e essas incluem transferência transgênica e de gene, radiação, irritantes inorgânicos como silica, e medicamentos que promovem danos inflamatórios induzidos por oxidante como bleomicina (Chua e cols., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005, 33:9-13). Desses modelos, o modelo de bleomicina permanece o mais amplamente empregado devido a sua reprodutibilidade e similaridade patológica a fibrose pulmonar humana ((Chua e cols., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005,33:9-13). Portanto, o modelo de bleomicina tem sido usado para avaliar inúmeros alvos de interesse em IPF/UIP (Kaminski e cols., Proc. Natl Acad. Sei. USA 200, 97:1778-1783; Pardo e cols., PLoS Med 2005, 2e251).
Infelizmente, não existe qualquer modelo animal que recapitule completamente as características clinicopatológicas de IPF/UIP, e ainda existe debate sobre a importância relativa de danos inflamatórios continuados (o modo primário para indução de fibrose experimental) à UIP de estágio final (Gauldie, Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002, 165:1205-1206; Stierter Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002, 165:1207-1208).
O presente exemplo dribla o problema na técnica por uso de uma estratégia alternativa para induzir fibrose pulmonar experimental. Camundongos geneticamente imunodeficientes, devido a vaias mutações combinadas de gene de imunodef iciência (scid) ou gene de ativação de recombinase 1 (rag-1), têm sido usados como hospedeiros in vivo de células humanas transferidas normais ou doentes. No presente exemplo é mostrado que a transferência intravenosa (i.v.) de IPF/UIP ou pneumonia intersticial não específica (NSIP; uma outra forma menos severas de IIP) mas não de fibroblastos normais em camundongos C.B-17 com a mutação de scid-bege (C.B-17SClD/bg) iniciaram e mantiveram fibrose pulmonar. Evidência histológica e bioquímica de fibrose foi primeiramente evidente em grupos de fibroblasto de IIP de camundongos C.B-17SCID/bg no dia 35 e foi proeminente no dia 63 depois da injeção de fibroblastos. Citocinas e quimiocinas parecem ter um papel importante na patogênese de IIP, e análise de ELISA de amostras de pulmão de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos de IPF/UIP ou NSIP revelou significantes elevações na IL-13, CCL6 e CCL21 de murídeo no dia 63 comparado com os níveis pulmonares medidos no ponto de tempo mais precoce ou em tecido pulmonar de camundongos que não recebem fibroblastos.
IL-13 e CCL6 são mediadores de fibrose pulmonar mas o papel de CCL21 em eventos de remodelagem pulmonar era desconhecido. Impulsos para examinar o papel de CCL21 e CCR7 nos eventos de remodelagem pulmonar precipitados por fibroblastos humanos IIP resultantes dos achados acima relatado que a expressão de CCR7 é aumentada em biópsias de IIP, e as propriedades migratórias, sintéticas e proliferativas de fibroblastos IIP são significativamente aumentadas por CCL21 (EMP e CMH, achados não publicados) . Em estudos separados de imunoneutralização, o direcionamento de CCL21 ou CCR7 humano (o receptor para CCL21) de dias 35 a 63 depois da injeção de fibroblasto de IIP em camundongos C.B-17SCID/bg reduziu significativamente todos os parâmetros de fibrose pulmonar comparados com grupos de camundongos C.B-17SCID/bg que recebem fibroblastos de IIP e IgG. Juntos, esses dados destacam a criação de movo modelo de murídeo de fibrose pulmonar iniciada e mantida pela introdução i.v. de fibroblastos IIP em camundongos C. B17SCID/bg, e demonstram um novo papel para CCL21 e CCR7 na manutenção de fibrose nesse modelo.
Camundongos: fêmeas, JCR-scid OICRSOD), C.B-17-scid (C.B-17SCID), e C.B-17- scid-bege (C.B-17SCID/bg) camundongos (6-8 semanas de idade) foram adquiridos de Taconic Farms (Germantown, NY) e todos os camundongos de SCID foram abrigados em uma instalação de barreira gnotobiótica na "University of Michigan Medical School". Os primeiros dois grupos de camundongos têm a mutação de imunodeficiência severa combinada (scid) que leva à ausência de linfócitos TeB devido a um defeito de recombinação de V(D)J enquanto os camundongos C.B-17SCID/bg têm duas mutações: a primeira é uma mutação de scid, e a segunda é uma mutação bege que leva a um defeito principal na função da célula T citotóxica e macrófagos e um impedimento seletivo na função de célula NK. Todos os camundongos tinham acesso a água autoclavada e dieta à vontade. Todos procedimentos descritos abaixo foram realizados em um ambiente estéril, laminar e foram aprovados por um comitê de cuidados e uso animais na "University of Michigan Medicai School".
Cultura de células de fibroblasto humano: uma população mista de células foi obtida de biópsias cirúrgicas de pulmão dissociadas mecanicamente de IPF/UIP e NSIP, e culturas de fibroblastos humanos puras foram derivadas como previamente descrito em detalhes em outra parte (Jakubzick e cols., Am. J. Pathol., 2004 164:1989- 2001). Fibroblastos pulmonares normais foram purificados da mesma forma a partir de suspensões de células de margens normais associada com tecido de tumor pulmonar retirado. No presente estudo, um total de 10 linhas IPF/UIP, 6 NSIP, e 4 de fibroblastos normais foram usadas depois da quarta passagem dos estudos de caracterização do modelo inicial, e de intervenção terapêutica aqui descritos.
Intravenosa introdução de fibroblastos humanos pulmonares em camundongos SCID: preparações de células únicas de IPF/UIP, NSIP, e fibroblastos normais foram obtidas com tripsinização de frascos de cultura de tecidos de 150 cm2 e rotulados com corante PKH26 de acordo com as direções do fabricante (Sigma Co., St. Louis, MO) . Cada linha de fibroblasto rotulada foi diluída a 1 X IO6 células/ml de PBS, e 1 ml dessa suspensão foi injetado via uma veia da cauda em grupos de cinco camundongos SCID. Outros grupos de cinco camundongos SCID foram injetados por via intravenosa com PKH26 e solução de rotulagem de PBS isoladamente (ou seja grupo de controle). Camundongos foram sacrificados por overdose de anestesia nos dias 7, 21, 35, 49, e 63 depois da transferência por via i.v. de fibroblastos pulmonares humanos. Tecido pulmonar inteiro foi dissecado nesses momentos para análise molecular, histológica, bioquímica, e/ou proteômica (veja abaixo).
Avaliação do papel de CCL21 e CCR7 em camundongos C.B- 17SCID/bg depois da transferência de fibroblastos pulmonares humanos: para avaliar o papel de CCL21 e CCR7, seu receptor, na resposta de remodelagem pulmonar depois da transferência ρ por via i.v. de fibroblastos pulmonares humanos, grupos de camundongos C.B-17SCID/bg receberam IPF/UIP (n=35 camundongos) , NSLP (n=2 0 camundongos) , fibroblastos normais n=15 camundongos), ou veículo (ou seja PBS) isoladamente (n=15 camundongos). Trinta e cinco dias depois todos os grupos de cinco camundongos C.B-17SCID/bg receberam uma IgG de camundongo, anticorpo monoclonal anti- humano CCL21 de camundongo, ou anticorpo monoclonal anti- humano CCR7 de camundongo (todos a 10 μg/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN) em dias alternados de dias 35 ao dia 63. No dia 63, todos os camundongos foram sacrificados por overdose de anestesia e tecido pulmonar foi dissecado para análise molecular, histológica, bioquímica, e proteomica (veja abaixo).
Análise molecular: RNA total foi isolado e cDNA gerado de amostras de pulmão como previamente descrito em detalhe (Jakubzick e cols., J. Immunol. 2003, 171:2684- 2693). Mudanças nos perfis para quimiocina humana e de murídeo e receptor de quimiocinas foram analisadas em amostras reunidas (n=5) usando membranas de arranjo de gene não radioativas GEArray de acordo com as instruções do fabricante (SuperArray, Inc., Bethesda, MD) e intensidades de sinal foram determinadas como previamente descrito em detalhe (Jalcubzick e cols., Am. J. Pathol., 162:1475-1486 (2003). Amostras de cDNA de pulmão individuais (n=5) foram analisadas para CCR7 humano, Colágeno I, catepsina E, metaloproteinase de matriz (MMP)-2, MMP-9, MMP-19, fibronectina, inibidores tciduais de metaloproteinases (TIMP)-1 e GAPDH expressão por procedimento quantitativo de RT-PCR de tempo real usando um sistema de PCR 7500 Real Time (Applied Biosystems, Foster City, CA) como previamente descrito (Jakubzick e cols., J. Immunol. 2003, 171:2684- 2693). Análise Histológica: Depois do sacrifício por anestesia, os lobos direitos de cada camundongo foram dissecados, totalmente inflados com solução de formalina a 10%, e colocados em formalina fresca por 24 horas. Técnicas histológicas padrão foram usadas para embeber em parafina cada lobo e secções de 5 μπι foram coradas com H&E e tricromo de Mason para análise histológica. Secções de tecido pulmonar adicionais não coradas foram analisadas via microscopia fluorescente.
Análise bioquímica: amostras do pulmão esquerdo foram homogeneizadas em IX PBS e peletizadas por centrifugação. Os sobrenadantes livres de células foram removidos para análise ELISA e os péletes foram secos por vácuo e ressuspensos em 0,5 M ácido acético glacial. 0 tecido foi então processado para concentração de hidroxiprolina como previamente descrito (Zhang e cols., J. Immunol. 1994, 153 : 4733-4741) .
Proteôomicos; proteínas IL-13 de murídeo, CCL6, CCL21, IFN-γ, IL-12, IL-4, CCL2, CCL7, CCL17, CCL3, CXCL13, TNF-a, CXCLlO, CXCL9, e CXCL2 foram analisadas em 50 μΐ de sobrenadantes livres de células de amostras pulmonares homogeneizadas usando uma técnica de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima padronizado de sanduíche (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, MN) como previamente descrito em detalhes (Jakubzick e cols., J. Immunol. 2003, 171:2684- 2693).
Análise estatística: todos os resultados são expressos como média ± SEM. A análise ANOVA de uma via e testes de comparações múltiplas de Tukey-Kramer ou Dunnett1S foram usadas para detectar diferenças estatísticas entre grupos de camundongos MP, NSIP, normal e controle SCID. A significância foi ajustada em p<0,05.
A transferência intravenosa de IPF/UIP ou NSIP, mas não de fibroblastos pulmonares normais promoveu histopatologia pulmonar e remodelagem em camundongos C.B- 17SCID/bg. Estudos iniciais foram feitos para avaliar o impacto de fibroblastos IIP e normais transferidos sobre a arquitetura pulmonar em várias cepas de camundongos SCID incluindo ICRSCID, C.B-17SCID, e C.B-17SCID/bg (n=5 por ponto de tempo). Esses estudos iniciais foram feitos usando 3 linhas IPF/UIP e 2 linhas de fibroblastos humanos normais. Todas as linhas de fibroblastos humanos foram rotuladas com PKH26 antes da injeção nos grupos de camundongo SCID assim permitindo a detecção de células rotuladas em secções histológicas. Nos dias 7 e 21 depois da injeção, coletas de fibroblastos humanos foram detectadas em vasos sangüíneos pulmonares em cada grupo de SCID. No entanto, a intensidade desse marcador diminui depois de 21 dias (informação da folha de dados fornecida por Sigma), e, portanto, nós falhamos em detectar fluorescência de PKH26 em secções histológicas de cada no dia 35 depois da injeção de fibroblastos (não mostrado). Outros órgãos (ou seja fígado, baço e rim) presumivelmente continham fibroblastos pulmonares humanos, mas nós não observamos qualquer evidência de alterações macroscópicas grandes a esses órgãos. Porque IIP é uma doença específica pulmonar, que não exibe fibrogênese em qualquer outro órgão, uma análise histológica detalhada de outros órgãos não foi feita no presente estudo.
Exame de secções pulmonares em grupos de camundongos SCID em pontos de tempo posteriores revelou que marcante remodelagem pulmonar foi apenas presente em camundongos C.B-17SCID/bg. Especificamente, nenhuma fibroproliferação foi observada no dia 4 9 depois da introdução de fibroblastos IPF/UIP em camundongos ICRSCLD (n=5 camundongos; não mostrado). Da mesma forma, a transferncia i.v. de fibroblastos IPF/UIP em camundongos C.B-17SCID falhou em despertar remodelagem pulmonar histologicamente evidente nos dias 7 (n=5 camundongos) , 21 (n=10 camundongos), 35 (n=5 camundongos), ou 4 9 (n=5 camundongos) depois da injeção i.v. de fibroblastos IPF/UIP.
Devido à presença de marcante histopatologia pulmonar no grupo C.B17SClD/bg, todos os estudos subseqüentes descritos abaixo envolveram a transferência de fibroblastos normais e IIP em camundongos C.B-17SCID/bg. No estudo de caracterização de modelo, quatro linhas de fibroblastos IPF/UIP, quatro NSIP, e uma normal foram transferidas em grupos separados de camundongos C.B17-SCID/bg e alterações histopatológicas, genômicas e proteômicas pulmonares foram analisadas nos dias 3 5 e 63 depois da transferência de fibroblastos.
Pouca ou nenhuma histopatologia pulmonar foi observada em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos pulmonares normais. No entanto, camundongos C.B-17SCLD/bg exibiram significativa histopatologia pulmonar, que foi evidente no dia 3 5 depois da injeção i.v. de linhas de fibroblastos NSIP ou IPF/UIP. A histopatologia pulmonar em camundongos C.B-17SCID/bg após fibroblastos pulmonares NSIP ou IPF/UIP foi caracterizada por rompimento do espaço alveolar, aparente fibroproliferação e a presença de granulócitos eosinófilos. A coloração de tricromo de Mason de secções de tecido histológico dos pulmões de camundongos C.B-17SCID/bg no dia 35 depois da transferência de fibroblastos pulmonares humanos normais, NSIP, ou IPF/UIP revelou a presença de matriz extracelular (corado em azul claro) em áreas remodeladas em grupos C.B-17SCID/bg que receberam IIP mas não os fibroblastos normais.
Análise posterior de secções histológicas de grupos C.B-17SCID/bg revelou grandes diferenças na extensão e aparência da remodelagem pulmonar precipitada pela introdução de fibroblastos IPF/UIP ou NSIP. Os pulmões de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos IPF/UIP 63 dias previamente exibiram uma aparência heterogênea com áreas de tecido pulmonar aparentemente normal adjacentes a áreas de severo rompimento intersticial e remodelagem. Também, focos de fibroblastos humanos foram aparentes no pulmões de Camundongos C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos IPF/UIP mas esses focos foram detectados em vasos sangüíneos e não em áreas intersticiais como em UIP clínica (Am. J. Resp. Crit. Care Med 2002, 165:277-304). 0 padrão histológico em secções de tecido pulmonar de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos NSIP 63 dias previamente foi caracterizado por espessamento intersticial e áreas fibróticas, e a remodelagem nesses camundongos pareceu envolver a maior parte do pulmão. Juntos, esses dados mostraram que a introdução de fibroblastos IIP em camundongos C.B-17SCID/bg causou lesões fibróticas nesses camundongos.
Níveis de Hidroxiprolina foram significativamente alterados em iam maneira temporariamente dependente e a introdução de fibroblastos IIP em camundongos C.B- 17SCID/bg: Hidroxiprolina é um marcador comumente usado de nova síntese de colágeno em modelos experimentais que envolvem remodelagem pulmonar (Jakubzick e cols. Am. J.
Pathol., 2004, 165:1222-1221). No presente estudo, os níveis de hidroxiprolina foram medidos em amostras de pulmão de camundongos C.B-17SCID/bg que não receberam fibroblastos ou fibroblastos pulmonares humanos normais, NSIP, ou IPF/UIP 35 ou 63 dias previamente. Os níveis de Hidroxiprolina não foram modificados nesses pontos de tempo depois da introdução de fibroblastos normais. Os níveis de hidroxiprolina nesses grupos de C.B-17SCID/bg foram 4,7 + 0,3 e 5,6 ± 0,5 μg/mg de proteína nos dias 35 e 63, respectivamente, e esses níveis de hidroxiprolina foram similares àqueles detectados em grupos de camundongo C.B17SCDD/bg que não receberam fibroblastos humanos (4,5 ± 1,3 μg/mg de proteína) . No entanto, os pulmões de camundongos continham maiores quantidades de hidroxiprolina no dia 35 depois de NSIP transferido por via intravenosa (11,4 ± 3,7 μg/mg de proteína) ou IPF/UIP (8,2 ± 2 ug/mg de proteína) fibroblastos comparados com o grupo de fibroblasto normal. Também, os níveis de hidroxiprolina foram aumentados 3 e 2,5 vezes em NSIP (31 ± 11 μg/mg de proteína) e IPF/UIP (22 ±4 μg/mg de proteína) grupos de fibroblasto, respectivamente, no dia 63 depois da transferência i.v. . No dia 63, o aumento nos níveis de hidroxiprolina nos grupos de C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos humanos NSIP ou IPF/LTIP atingiu significância estatística comparado com o grupo C.B-17SCID/bg que recebeu fibroblastos normais. Assim, a injeção intravenosa de fibroblastos humanos aumentou os níveis de hidroxiprolina no dia 35, e mais perceptivelmente, no dia 63 depois da transferência.
Análise de citocina pulmonar mostrou que IL-13 de murídeo, CCL6, e CCL21 foram significativamente elevadas nos pulmões de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos IIP: análise de ELISA pulmonar de várias citocinas, ligante de quimiocinas CC, e ligante de quimiocinas CXC em dias 35 e 63 depois da transferência i.v. de fibroblastos humanos normais ou IIP revelou inúmeras mudanças estatisticamente significativas em IL-13 de murldeo, CCL6, e CCL21. Embora os níveis pulmonares de IL-13 no grupo C.B-17SCID/bg que recebeu fibroblastos normais foram abaixo do nível de detecção por ELISA, os níveis de IL-13 pulmonar foram significativamente maiores no grupos C.B-17SCID/bg que recebeu fibroblastos NSTP ou IPF/UIP comparados com o grupo C.B-17SCID/bg que recebeu fibroblastos normais 35 e/ou 63 dias previamente. Também significativamente maior IL-13 foi detectada nos pulmões de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos IPF/UIP no dia 63 versus dia 35 depois da transferência de fibroblastos. Nos dias 63 depois da injeção de fibroblasto, os níveis de CCL6 pulmonar foram significativamente maiores nos grupos C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos IPF/UIP ou NSIP comparados com o grupo C.B17SCID/bg que recebeu fibroblastos normais. CCL6 significativamente maior foi detectada nos pulmões de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos IPF/UIP ou NSIP no dia 63 versus dia 35 depois da transferência de fibroblastos. 0 único outro ligante de CC de murídeo que foi alterado pela introdução de fibroblastos humanos em camundongos C.B-17SCID/bg foi CCL21. Essa quimiocina foi significativamente maior no grupo de fibroblasto NSIP e IPF/UIP C.B-17SCID/bgs no dia 63 comparado com o grupo de fibroblasto normal C.B- 17SCID/bgs no dia 63. Além disso, níveis de CCL21 pulmonar de murídeo foram significativamente elevados em grupos de fibroblasto IPF/UIP no dia 63 depois da transferência de fibroblasto comparado com o grupo de fibroblasto NSIP ao mesmo tempo. Finalmente, níveis significativamente maiores de CCL21 foram presentes em amostras pulmonares de grupo de fibroblastos IIP C. B-17SCID/bg no dia 63 depois de transferência comparado com o grupo de fibroblastos IIP C. B-17SCID/bgs no dia 35 depois de transferência. Assim, juntos, esses dados sugerem que a presença de fibroblastos IIP, mas não fibroblastos normais, em camundongos C.B- 17SCID/bg alterou significativamente os níveis pulmonares de citocinas de murídeo e quimiocinas com papeis pró- fibróticos estabelecidos (ou seja IL-13 e CCL6) e supostos (ou seja CCL21) no pulmão.
Transcritos de gene de CCR7 e CCL21 humano foram presentes nos pulmões de Camundongos C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos pulmonares humanos 35 dias antes: as mudanças nos níveis pulmonares de CCL21 de murídeo em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos NSIP ou IPF/UIP foram intrigantes em vista de estudos prévios que demonstram o importante papel de remodelagem desse ligante de CC no rim (Banas e cols., J. Inimunol., 2002 168:4301- 4307) e fígado (Bonaccgi e cols. Gastroenterology, 2003, 125:1060-1076). Isso incitou a análise adicional desse ligante de CC e de seu receptor, CCR7, durante as respostas de remodelagem pulmonar despertadas por fibroblastos humanos IIP. Transcritos humanos para CCR7 e CCL21 foram detectados por análise de gene SuperArray, e entre os três grupos C.B-17SCID/bgs a maior expressão de transcrito para CCR7 e CCL21 era presente em amostras de pulmão de grupo de fibroblasto IPF/UIP. Além disso, a presença de CCR7 foi confirmada por análise TAQMAN, e novamente o grupo de IPF/UIP exibiu a mais alta expressão de transcrito de CCR7 junto com o grupo C.B-17SCID/bgs. A análise SuperArray e TAQMAN de CCR7 de murideo e CCL21 também confirmaram a presença desses produtos de transcrito em todos os três grupos C.B- 17SCID/bgs que receberam fibroblastos humanos, e os níveis mais altos de transcritos foram presentes no grupo C.B- 17SCID/bgs que recebeu fibroblastos IPF/UIP. Assim, a transferência i.v. de fibroblastos normais e IIP resultou na presença de transcritos de gene humano para CCR7 e CCL21.
Análise quantitativa DIQMAN PCR de genes associados a matriz extracelular de murideo após a transferência de fibroblastos humanos em camundongos C.B-17SCID/bg:
alterações pulmonares em genes associados a matriz extracelular de murideo foram analisadas usando análise de PCR quantitativa. A expressão de colágeno 1, catepsina E, MMP-19, e TIMP-I era presente em camundongos C. B-17SCID/bg que receberam fibroblastos normais, NSIP, e IPF/UIP humanos 63 dias previamente. Mais importante, quando os níveis de transcrito para esses genes em camundongos que receberam fibroblasto foram comparados aos níveis de transcrito em camundongos de controle C.B-17SCID/bg, os aumentos na expressão de transcrito de colágeno 1 e catepsina em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam tipo de fibroblasto IIP e MMP-19 e TIMP-I transcrito expressão em camundongos que receberam fibroblastos IPF/UIP atingiu significância estatística quando comparados ao aumentos de transcrito para esses genes em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos humanos normais. Outros genes de matriz extracelular foram analisados por TAQMAN e sua presença foi confirmada: MMP-2, MMP-9, e fibronectina. Nenhuma diferença significante nos níveis desses transcritos foi observada entre os grupos de camundongos C.B-17SCID/bg, mas o maior aumento em MMP-2 e fibronectina foi observada no grupo IPF/UIP C.B-17SCID/bg enquanto menor aumento em MMP-9 foi observadas nesse mesmo grupo C. B-17SCID/bg. Portanto, esses dados mostraram que os níveis de transcrito para genes associados a matriz extracelular de murídeo foram alterados pela presença de fibroblastos humanos em camundongos C.B- 17SCID/bg.
Imunoneutralização em CCR7 humano ou CCL21 humanO aboliu a remodelagem pulmonar em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos IIP humanos: na próxima série de experimentos, os papéis de CCR7 e CCL21 humanos foram avaliados em Camundongos C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos humanos normais (η= 1 linha) ou IIP (n = 3 IPF/UIP e η = 2 NSIP linhas). Embora tentativas para medir CCL21 humano nas amostras de pulmão tenham sido mal sucedidas presumivelmente devido à presença desse ligante de CC em níveis abaixo do nível de detecção por ELISA, estudos prévios mostraram que CCL21 de camundongo e humano podem promover fluxo de cálcio celular via CCR7 humano (Jenh e cols., J. Immunol., 1999 162:3765- 3769). Em adição, a imunoneutralização de camundongo CCL21 usando um anticorpo policlonal aboliu a migração de células dendríticas humanas e a iniciação de células T humanas em um modelo humanizado de doença das vias aéreas alérgica induzida por poeira domestica (Hammad e cols. J. Immunol. 2002, 169:1524-1534). Dada à reatividade cruzada relatada de CCL21 de camundongo e humano, um protocolo terapêutico foi implementado em que CCL21 humano ou CCR7 humano foram direcionados para administração de anticorpo monoclonal dos dias 35 a 63 depois da transferência de f ibroblastos. Uma pesquisa histológica de tecidos pulmonares no dia 63 nos três grupos C.B-17SCID/bg com as três modalidades de tratamento testadas mostraram que no grupo C.B-17SCID/bg de fibroblasto normal, nenhuma evidência de remodelagem pulmonar foi intersticial evidente em qualquer um dos grupos de tratamento (tratamento por IgG; tratamento com anticorpo anti-CCL21; tratamento com anticorpo anti-CCR7). No entanto, o acúmulo vascular de fibroblastos normais foi histologicamente aparente nesses grupos C.B-17SCID/bg.
Nenhum tratamentos alterou essa característica em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos normais. A remodelagem intersticial foi aparente no grupo de fibroblasto NSIP C.B-17SCID/bg que recebeu IgG mas essa resposta de remodelagem foi abolida por administração de anticorpo anti-CCL21 ou anticorpo anti-CCR7 dos dias 35 ao 63 depois de transferência. Do mesmo modo, a remodelagem intersticial aparente no grupo de IgG C.B-17SCID/bg que recebeu fibroblastos IPF/UIP foi ausente nos grupos de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam administração de anticorpo anti-CCL21 ou anticorpo anti-CCR7 dos dias 35 ao 63 depois de transferência de fibroblastos IPF/UIP. Assim, terapêutica que visa CCL21 ou CCR7 aboliu a evidência histológica de remodelagem intersticial em camundongos C.B- 17SCID/bg que receberam fibroblastos IIP.
Análise quantitativa TAQMAN PCR de genes associados a matriz extracelular de murídeo após o direcionamento terapêutico de CCL21 ou CCR7 em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos humanos normais e IIP: Análise quantitativa TAQMAN dos grupos de tratamento de anticorpo também confirmou que os tratamentos de anti-CCL21 e anti- CCR7 também alteraram significativamente os níveis de transcrito de MMP-2 e MMP-19. Os níveis de transcrito para esses MMPs em camundongos tratados com anticorpo de controle C.B-17SCID/bg foram comparados aos níveis desses transcritos em camundongos tratados com anticorpo com dose de fibroblasto C.B17SCID/bg. 0 tratamento com anticorpo anti-CCL21 reduziu significativamente o aumento de vezes em níveis de transcrito MMP-2 no grupo C.B-17SCID/bgs que recebeu fibroblastos normais com comparação ao aumento em vezes nos níveis de transcrito em grupos C.B-17SCID/bg que receberam IgG. 0 tratamento com anticorpo anti-CCR7 reduziu significativamente o aumento de vezes em níveis de transcrito MMP-2 comparado com o grupo adequado IgG. Análise quantitativa TAQMAN de MMP-19 revelou que anti-CCR7 aumentou significativamente a mudança de vezes no grupo C.B-17SCID/bg que recebeu fibroblastos normais, enquanto ambos tratamentos de anticorpo aumentaram significativamente a mudança em vezes nesse transcrito comparado com o grupo adequado de IgG. "Portanto, os tratamentos de anticorpo empregados em camundongos C.B- 17SCID/bg que receberam fibroblastos humanos marcadamente alteraram a expressão de transcrito para genes associados a matriz extracelular de murideo.
Imunoneutraliζação em CCR7 humano ou CCL21 humano reduziu significativamente níveis pulmonares de hidroxiprolina em camundongos C.B-17SCID/bg que receberam fibroblastos IIP humanos: Níveis de hidroxiprolina em amostras pulmonares de camundongos C.B-17SCID/bg de controle tratados com IgG-, anti-CCL21-, ou antiCCR7- (ou seja camundongos que não recebem fibroblastos humanos) e grupos de camundongos tratados que receberam fibroblastos normal, NSIP, ou IPF/UIP foram medidos. Níveis de hidroxiprolina foram aumentados em amostras pulmonares de Camundongos C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos normais e IgG mas nenhum tratamento de anticorpo alterou esse níveis. No grupo de fibroblasto NSIP C.B-17SCID/bgs, níveis de hidroxiprolina foram significativamente aumentados acima daqueles níveis medidos no grupo de controle C.B-17SCID/bg, e as terapias com anticorpo anti-CCL21 e anticorpo anti- CCR7 significativamente reduziram os níveis de hidroxiprolina em 52 ± 6,7 e 51 ± 5,6%, respectivamente, comparado ao grupo de tratamento de IgG. No grupo de fibroblasto IPF/UIP C.B-17SCID/bg que recebeu IgG, níveis de hidroxiprolina foram novamente significativamente aumentados acima daqueles níveis medidos no grupo de controle C.B-17SCID/bg. Em adição, níveis de hidroxiprolina em camundongos com fibroblasto IPF/UIP foram reduzidos em 66 ± 7,2 e 59 ± 7,1% nos grupos de tratamento de anticorpo anti-CCL21 e anti-CCR7, respectivamente, comparados ao grupo tratada cm IgG de fibroblasto IPF/UIP C.B-17SCID/bg. Assim, esses dados confirmaram que o direcionamento de CCL21 ou CCR7 reduziu marcadamente e significativamente a remodelagem pulmonar precipitada pela transferência de fibroblastos NSIP ou IPF/UIP em camundongos C.B-17SCID/bg.
Análise de citocina pulmonar mostrou que níveis de CCL21 de murídeo foram significativamente reduzidos nos pulmões de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam terapia com fibroblastos IPF/UIP e anticorpo anti-CCR7: porque os níveis pulmonares de IL-13 de murídeo, CCL6, e CCL21 foram alterados e/ou aumentados pela presença de fibroblastos NSIP e IPF/UIP em camundongos C.B-17SCID/bg, os efeitos de tratamentos de IgG e anticorpo monoclonal sobre esses mediadores no dia 63 foram avaliados. As terapias com anticorpo anti-CCR7 e anti-CCL21 não afetam os níveis pulmonares de IL-13 ou CCL6 em qualquer um dos grupos de C.B-17SCID/bg fibroblasto. No entanto, a terapia com anticorpo anti-CCR7 reduziu significativamente os níveis pulmonares de CCL21 de murídeo no grupo C.B-17SCID/bg que recebeu fibroblastos IPF/UIP comparado ao grupo C.B- 17SCID/bg que recebeu fibroblastos IPF/UIP + IgG. Assim, o direcionamento terapêutico de CCR7 reduziu os níveis de CCL21 de murídeo mas não afetou os níveis dos outros dois mediadores de camundongo elevados nos modelos de fibroblasto IIP.
Discussão. 0 presente estudo avalia as seguintes duas questões: 1) os fibroblastos pulmonares humanos transferidos remodelam a arquitetura pulmonar em camundongos SCID? 2) qual o papel que CCL21 e CCR7 exercem na resposta de remodelagem precipitada pela transferência de fibroblastos humanos? A resposta à primeira questão foi afirmativa uma vez que a transferência i.v. de 1 x 106 fibroblastos IPF/UIP ou NSLP em Camundongos C.B17SCID/bg desprovidos de características imunes adaptativas e inatas causaram fibrose, que foi confirmada com o uso de análise histológica, molecular, e bioquímica. Essa fibrose foi abolida pela administração terapêutica de anticorpos monoclonais direcionados contra CCL21 humano ou CCR7 assim demonstrando um papel importante para esse ligante e seu receptor na fibrose pulmonar, similar a seus papéis na fibrose renal (Banas e cols., J. Immunol., 2002, 168:4301'- 4307 e do fígado (Bonacch( e cols., Gastroenterology 2003, 125:1060-1076) .
Embora equivalentes de murídeo de mediadores pró- fibróticos conhecidos e supostos foram aumentados em camundongos C.B-17SCLD/bg que receberam fibroblastos IPF/UIP ou NSIP, o papel desses mediadores nos processos fibróticos é questionável porque seus níveis foram não modificados em vários grupos de camundongos C.B-17SCID/bg que mostraram uma significante diminuição na remodelagem pulmonar. Assim , o presente estudo fornece evidência que a transferência de fibroblastos IIP promove fibrose em camundongos C.B-17SCID/bg e identifica um novo alvo terapêutico em IIP.
A modelagem de fibrose pulmonar clínica permanece um desafio no laboratório (Chua e cols., Am J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005 33:9-13). Embora sulfato de bleomicina seja o agente de escolha na indução de fibrose experimental, fibrose pulmonar induzida por bleomicina foi criticada como um modelo menos que ideal de LPF/UIP (Chua e cols., Am J. Resp. Cell Mol. Biol., 2005 33:9-13). Reconhecendo que modelos mais novos de fibrose pulmonar devem incorporar várias das características clínicas de IIP quanto possível, o presente estudo se baseou na observação de que o fibroblasto é primariamente responsável pela remodelagem profunda e freqüentemente letal nessas doenças (Zisman e cols., Meth. Mol. Med. 2005, 117:3-44). A transferência de fibroblastos IPF/UIP ou NSIP iniciou a remodelagem intersticial e fibrose histologicamente evidente foi observada no dia 35, mas não antes, depois da transferência i.v. dessas linhas. 0 retardo no surgimento de fibrose não é facilmente explicável mas esses achados são consistentes com estudos prévios em que a transferência de células endoteliais humanas em camundongos C.B-17SCID/bg requer aproximadamente 3 0 a 4 0 dias antes de vasos sangüíneos distintos serem aparentes (Skovseth e cols., Am... Pathol., 2002, 160:1629-1637). Portanto, o presente estudo que um modelo clinicamente relevante de fibrose pulmonar pode ser iniciado em camundongos imunodeficientes com a transferência de fibroblastos pulmonares humanos.
O benefício óbvio de modelos de fibroblasto IPF/UIP e NSIP C.B-17SCID/bg aqui descritos é sua utilidade no teste de novos terapêuticos para essa doenças. 0 presente estudo avalia os papéis de CCL21 e CCR7 humano uma vez que nós observamos que ambos são proeminentemente expressos em biópsias de IIP (Choi e cols., J. Clin. Pathol. 2006, 59:28- 39) e fibroblastos IIP cultivados. Nossa atual hipótese é que o efeito terapêutico de tratamentos com CCL21 anti-humano e Anticorpo CCR7 anti-humano relaciona-se com suas negações do efeitos pró-proliferativo de CCL21 em fibroblastos IPF/UIP e NSIP. Embora seja improvável que os anticorpos monoclonais aqui empregados afetam a migração de fibroblastos injetados i.v. uma vez que os tratamentos com anticorpo foram retardados at'um ponto de tempo em que a fibrose foi histologicamente aparente em camundongos C.B- 17SCID/bg, é concebivel que essa abordagem terapêutica, se empregada em outros modelos de fibrose pulmonar, possa ter um efeito sobre o recrutamento de fibrócitos no pulmão. CCR7 é proeminentemente expresso em fibrócitos (Abe e cols., J. Immunol., 2001, 166:7556-7563; Hashimoto e cols., J. Clin. Invest., 2004 113:243-252) e CCL21 promove seu recrutamento em vários locais de tecidos (Abe e cols., J. Immunol., 2001, 166:7556-7563). Estudos estão atualmente em andamento para avaliar o papel fibrócitos CCR7-positivos na fibrose pulmonar induzida por bleomicina que usa CCR7 de tipo selvagem e camundongos de gene deficiente.
A contribuição precisa dos fibroblastos IIP humanos transferidos e componentes de fibróticos associados a camundongo (ou seja células e mediadores) para a resposta de remodelagem pulmonar geral observada em camundongos C.B- 17SCID/bg permanece a ser determinada. No presente estudo, parece que houve uma interação entre os fibroblastos humanos transferidos e componentes de camundongo como evidenciado pelas mudanças dinâmicas nos transcritos associados a matriz extracelular de murídeo e proteínas solúveis pró-fibróticas de murídeo nos pulmões de camundongos C.B-17SCID/bg que receberam um dos dois tipos de fibroblasto IIP. Embora a importância relativa das proteínas solúveis de murídeo detectadas na resposta fibrótica de C.B-17SCID/bg seja questionável nesse ponto, as alterações na catepsina E, MMPs, componentes da matriz extracelular (ou seja colágeno e fibronectina), e os inibidores de MMPs no fibroblasto IIP grupo C.B-17SCID/bgs em relação ao fibroblasto normal grupo C.B-17SCID/bg pode indicar que os componentes fibróticos associados a camundongo foram ativamente envolvidos na resposta de remodelagem. TAQMAN PCR quantitativa confirmou que níveis de transcrito de colágeno I, catepsina E, MMP-19, e TIMP-I foram significativamente aumentados nos grupos de fibroblasto IIP C.B-17SCID/bg em relação a mudanças nos níveis de transcrito para esses genes em camundongos C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos normais. Essas mudanças de transcrito são relevantes para fibrose pulmonar clínica uma vez que catepsinas (Kimura e cols., J. Med. Invest 2005, 52:93-100; Wattiez e cols., Electrophoresis 2000, 21: 2703-2712) MMPs e TIMPs (revisto em Pardo e cols. Proc. Am. Thorac Soc., 2006, 3:383-388), e matriz extracelular (Kuhn e Mason, Am J. Pathol. 1995; Adachi Am J. Pathol 1988, 133: 193-203) são aumentados nas formas mais severas de IIP como IPF/UIP e NSIP. MMP-19 foi aumentados mais notavelmente em camundongos C.B17SCID/bg que receberam fibroblastos IPF/UIP, e embora essa proteinase pareça ter um papel importante nas respostas de cicatrização de ferimento dérmicos (comentário por Mauch J. Invest. Dermatol. 2003, 121), seu papel na fibrose pulmonar é desconhecido. Quase sem exceção, as terapias com anticorpo anti-CCL21 e anti-CCR7 reduziram todos os produtos de gene acima mencionados associados a matriz extracelular analisados com o uso de TAQMAN PCR quantitativo. Uma exceção foi MMP-19 e estudo da importância relativa de MMP-19 na resposta fibrótica pulmonar surgiu depois da transferência de fibroblastos IIP humanos ser garantida em vista desse e de outros achados.
Em resumo, esse exemplo confirma que a fibrose pulmonar pode ser transferida para camundongos C.B- 17SCID/bg após a transferência i.v. de linhas de fibroblastos primários IPF/UIP ou NSIP. A utilidade desse modelo no teste de novas estratégias terapêuticas foi demonstrada, e os achados também sustentam a possibilidade de que a interação CCL21-CCR7 pode ser um alvo importante em NSIP e IPF/UIP clínica.
Exemplo 5: Fibrose pulmonar idiopática Fibroblastos Migram e Proliferam a Ligante CC de Quimiocina 21
O objetivo desse Exemplo foi r a significância funcional e sinalização da expressão de CCR7 de fibroblastos primários que crescem de biópsias pulmonares cirúrgicas normais e de IPF/UIP. Fibroblastos primários foram cultivados a partir de biópsias cirúrgicas de pulmão de pacientes de IPF/UIP e normais. Fibroblastos tratados com ou sem ligante de quimiocina CC (CCL) 21 foram analisados para diferenças funcionais, de transcrito e proteômicas usando análise imunocitoquímica, arranjos de gene, Taqman PCR de tempo ral, migração, proliferação e ensaios de Western Blot.
CCR7 foi expresso por IPF-UIP, ma não por fibroblastos normais. Fibroblastos IPF/UIP, mas não normais, mostraram significante respostas migratórias e proliferativas quando expostos a CCL21, que foram inibidos por toxina de pertussis ou neutralização de anticorpos a CCR7. Exposição de fibroblastos IPF/UIP a CCL21 alterou o estado de fosforilação de MEK 1/2, ERK 1/2, e p90RSK nessas células, que foram abolidas por toxina de pertussis ou RNA pequeno de interferência específico para CCR7. Juntos, esses dados confirmam que CCL21 modula as propriedades funcionais de IPF/UIP, mas não de fibroblastos normais.
Devido à expressão intersticial de CCR7 em IIP SLBs, os inventores acreditaram que esse receptor de quimiocina pode ser expresso e funcionalmente ativo em fibroblastos primários derivados de SLB. No presente estudo, as atividades migratórias e de proliferação foram observadas em IPF/UIP, mas não em fibroblastos normais, expostos a CCL21. A exposição de fibroblastos IPF/UIP a CCL21 levou a fosforilação alterada de proteínas associadas com via de sinalização de quinase regulada por sinal extracelular (ERK 1/2) em fibroblastos IPF/UIP, que foi bloqueada por toxina de pertussis ou CCR7 siRNA. Portanto, esses dados demonstram que fibroblastos IPF/UIP são responsivos a ativação dependente de CCR7, tornando CCR7 um alvo atrativo em IPF/UIP.
Pacientes: todos os pacientes passaram por avaliação clínica, incluindo radiografia de tórax, medições de função pulmonar, e tomografia computadorizada de seção fina antes de broncoscopia de fibra ótica. Nesses pacientes, uma suspeita de IIP foi determinada a partir de uma coleção de sintomas, sintomas fisiológicos, e achados radiográficos. Nenhum desses pacientes no presente estudo teve cirurgia de biópsia prévia ou receberam terapia para IIP. SLBs foram obtidos via "Clinicai Core" associada com IIP especializada. O "Center of Research at the University of Michigan Medicai School" de pacientes suspeitos de ter UIP ou NSIP entre maio de 2000 e maio de 2003. SLBs foram obtidos de pelo menos dois lobos (normalmente no lado esquerdo) em todos os pacientes que passam por diagnóstico de SLB para IIP como previamente descrito em detalhe. Pulmão histologicamente normal foi obtido de espécimes retirados em pacientes que passam por ressecção torácica. Cada biópsia foi processada separadamente usando técnica estéril em uma capa de fluxo laminar e processada para a cultura de linhas de fibroblastos primários (veja abaixo).
Isolação e Cultura de Fibroblastos: Fibroblastos foram mecanicamente dissociados e cultivados de IPF/UIP ou SLBs histologicamente normais como previamente descrito (Hogaboam e cols., Meths. Mol. Med., 2005, 117:209-221).
Coleta de proteína e Extração de RNA: fibroblastos primários foram plaqueados em placas de cultura de tecido de 12 cavidades a 2,5 X 10'5 células/ml e deixada em adesão de um dia para o outro. Fibroblastos foram lavados uma vez com PBS. 500 μL e meio de Eagle modificado por Dulbeco com 0,5% FBS (DMEM-0,5) isoladamente ou com 10 ng/ml proteínas recombinantes CCLl9 ou CCL21 foram adicionados a cavidades em quadruplicata por 24 horas. Sobrenadantes livres de células foram coletados e estocados a -80°C até analisados para conteúdo de proteína solúvel. Depois da remoção de sobrenadantes, 250 μL de Trizol foi adicionado a cada cavidade e RNA foi extraído de acordo com as direções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Anticorpos: anticorpos Western incluem: Anticorpo Monoclonal Anti-humano CCR7 (R&D systems. Minneapolis, MN), Fosfo-p44/42 Map quinase (Thr202/Tyr204), Fosfo-MEKI /2 (Ser2I 7/221), Fosfo-p90RSK (Thr573), Fosf0-SEK1/MKK4 (Ser 257/Thr261), Fosfo-SAPK/INK (Thrl83/Tyrl85), Fosfo-c-Jun (Ser63) II, Fosfo-p38 MAP quinase (Thrl 80/Tyrl82), Fosfo- MKIC3 fMKK6 (serl89/207) (todos nCell Signaling", Danvers, MA) , Anti-beta Actina, Anti-GAPDH, policlonal de coelho para alfa actina de músculo liso (Abeam, Cambridge, MA) . Anticorpos secundários usados são: Anti-coelho, HRP conjugado, Anti-camundongo, I-IRP conjugado, anti-biotina, HRP conjugado (Ce11 Signaling, Danvers, MA).
Arranjos de Gene: A expressão de gene de CCRI1 CCL19, e CCL21 humanos foi analisada usando arranjo de gene de quimiocina e receptor de quimiocina específicos de SuperArray. (Carlsbad, CA).
Análise TAQMan: expressão de CCR7 e GAPDH foram analisadas em IPF/UIP e fibroblastos normais por procedimento de RT-PCR quantitativa de tempo real usado um "7500 Real Time PCR System" (Applied Biosystems, Foster City, CA) como previamente descrito (19) . Todos os anticorpos e marcadores foram adquiridos de Applied Biosystems (Foster City, CA) . A expressão de CCR7 foi normalizada para GAPDH antes da mudança em vezes na expressão ter sido calculada.
Imunocitohistoquímica: a expressão de proteína CCR7 humana foi analisada através de Imunocitohistoquímica usando kit de coloração de célula e tecido HRP-AEC de acordo com as instruções do fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN).
Ensaio de Migração de Fibroblasto. fibroblastos primários IPF/UIP e normais foram adicionados a inserções de cavidades de 8 μττι em placas de culturas de 6 cavidades na presença ou ausência de 10 ng/ml CCL19 ou CCL21 por 24 horas. Fibroblastos migraram em cavidades de fundo foram fixados e corados com hematoxilina e contados. Para testar a especificidade de receptor ou ligante, 5 μg/ml de CCR7, CCLl9 anti-humano, ou anticorpos CCL21 foram adicionados a cada cavidade. Como um controle, 5 μg/ml IgG ou 10 μΐ PBS foi adicionado.
Ensaio de proliferação: a capacidade proliferativa dos fibroblastos foi avaliada em laças de cultura de tecido de 24 cavidades usando incorporação de [3H]timidina como previamente descrito (9).
Ensaio de Sircol Colágeno: o conteúdo de colágeno solúvel foi determinado usando um ensaio de colágeno Biocolor Sircol (Accurate Chemical & Scientific Corp, Westbury, NY) . Para o ensaio, 100 μΐ de amostras de sobrenadante livre de células foram adicionadas a 1 ml de Sircol Dye e agitados em temperatura ambiente por 30 minutos. Os tubos foram então centrifugados por 10 minutos a 10.000 χ g. O corante removido e 1 ml de solução alcalina adicionado a cada tubo e misturado completamente. Para ler o ensaio, 200 μΐϋ de cada solução foi transferida para uma placa de fundo plano ótica de 96 cavidades junto com 200 μ]^ de padrões. A placa foi então lida a 540 usando um leitor de placa e as concentrações normalizadas à proteína total como determinado por ensaio de Bradford.
Ensaio de proteína Bioplex: amostras de sobrenadante livre de células foram analisadas para RANTES/CCL5 humano usando um kit de Anticorpo Extracelular (Invitrogen BioSource, Carlsbad, CA) e um sistema Bio-Rad Luminex Bio- Plex 200 (Hercules, CA) . Brevemente, 50 amostras de sobrenadante livre de células e padrões foram incubados com 50 μl de glóbulos multiplex por 3 0 minutos em um agitador. Os glóbulos foram lavados 3 vezes com 100 μΐ de tampão de lavagem e então incubados com 25 μΐ de solução de detecção anticorpo por 3 0 min em um agitador. Depois de mais 3 lavagens, estreptavidina-PE foi adicionada e os glóbulos foram incubados 10 minutos em um agitador e lavados mais 3 vezes. Os glóbulos foram então ressuspensos em tampão de ensaio e lidos usando o sistema acima.
Análise de Western Blot: Fibroblastos foram plaqueados a 5X105 células/cavidade em seis placas de cavidades e deixados para aderir de uma dia o outro. Os fibroblastos foram então colocados por 24 horas em DMEM livre de soro. Os fibroblastos foram tratados com 0,5% soro bovino fetal em DMEM isoladamente ou com 10 ng/ml CCLl 9 ou CCL21 proteínas recombinantes por 0,5, 2, 5 e 3 0 minutos. Alguns fibroblastos foram expostos a 2 00 nM de Toxina de Pertussis (Sigma, St. Louis, MO) 2 horas antes do tratamento, os fibroblastos foram então lavados com solução salina tamponada por fosfato gelada e então lisados em 500 μΐ de tampão de Iise gelado que consiste em 1% Triton X-IOO, 50 mM NaF, 2 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,01 M fosfato de sódio, 200 μΜ Ortovanadato de sódio, 5 μg/mL pepstatina, 5 μg/mL Leupeptina e 100 nM caliculina. Depois de incubação por 5 minutos em gelo, os lisados de fibroblasto foram raspados e transferidos para tubos. 0 conteúdo total de proteína foi determinado por ensaio de Bradford. Amostras contendo 20 μg de proteína total foram misturadas com 4 μL de 4X LDS tampão de amostra (Invitrogen, Carlsbad, CA) e água deionizada (ddH20) , fervidas a 90°C por 5 minutos e então separadas por SDS-PAGE em um 4-12% NuPage Bis-Tris gel (Invitrogeni Carlsbad, CA). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Invitrogen, Carlsbad, CA). Depois de bloqueio em 5% NFDM em IX TBS/T, as membranas foram blotted para fosfo-anticorpos primários, esvaziadas (RestoreTM Western Blot Stripping Buffer, Pierce, Rockford, IL), lavadas, e re-blotted para GAPDH, um controle.
Transfecção de siRNA: para bloquear a expressão de CCR7, RNA pequeno de interferência (siRNA) foram criados usando o sítio de síntese Qiagen. A eficácia dos dois siRNA candidatos foi testada através da transfecção com Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) em fibroblastos pulmonares IPF/UIP e analisadas usando análise Taqman para CCR7. O siRNA mais eficiente (aproximadamente 70% knockdown, AGCGGACATCAGCTGGTCAA) foi usado para análise de western blot de fosforilação de via Erk 1/2.
Expressão de gene de CCR7, CCL19, e CCL21 foram presentes em fibroblastos que crescem a partir de SLBs normal e IPF/UIP. Três linhas de fibroblastos normais e três linhas de fibroblastos IPF/UIP derivadas de SLB foram individualizadas para análise de RNA usando uma quimiocina humana específica e receptor de quimiocina SuperArray. Essa análise revelou que CCR7, CCL19, e CCL21 foram presentes em ambos os grupos, mas a expressão de CCR7 foi significativamente maior nas linhas de IPF/UIP comparada com as linhas de fibroblastos normais. Análise posterior de expressão de gene usando TAQMAN PCR de tempo real confirmou a presença de transcritos para CCR7, CCLl9, e CCL21 em todos as linhas de fibroblastos usadas nesse estudo.
Portanto, esses dados demonstram que transcritos de gene CCR7, CCL19, e CCL21 foram presentes em fibroblastos normal e IPF/UIP.
Expressão marcante de proteína CCR7 era presente em fibroblastos IPF/UIP mas não em fibroblastos normais. Os
inventores mostraram que quase 100% de MP SLBs, exibiram uma combinação de expressão focai e difusa de proteína CCR7 em áreas intersticiais. Também, as áreas focais de CCR7 pareceram coincidir com focos fibroblásticos histologicamente distintos. Para determinar se os fibroblastos primários crescem a partir de CCR7 normal e IPF/UIP SLBs expressos, coloração imunocitoquímica para CCR7 foi realizada, fibroblastos IPF/UIP foram fortemente positivos para CCR7 enquanto fibroblastos normais expressaram pouco ou nenhum CCR7.
CCL21 direcionou a migração de IPF/UIP ,as map fibroblastos normais, expressão de CCR7 é supra-regulada em células dendríticas maduras assim permitindo que essas Células migrem para os linfonodos para ativação imune (Sozzani e cols., J. Immun, 1998, 161(3):1083- 1086)). Em certas células de tumores de mama ((Muller e cols., Nature, 2001, 410(6824):50-56) e células de melanoma (Murakam e cols., J. Dermatol. Sci., 2004, 36 (2) :71-78), a interação entre CCR7 e CCL21 mostrou ser importante na metástase. No presente estudo, tanto CCLl9 quanto CCL21 promoveram a migração de IPF/UIP mas não de fibroblastos normais. No entanto. CCL21 foi o indutor mais potente de migração de fibroblasto IPF/UIP, aumentando a migração dessas células em aproximadamente 7 vezes acima daquela observada em culturas de fibroblastos IPF/UIP expostas a DMEM isoladamente. Para determinar se essa migração foi CCR7 dependente, um anticorpo IgG, anti-humano CCR7, ou anti- humano CCL21 (todos a 5 μg/ml) foi adicionado a cavidades em triplicata. Embora a presença de IgG não altere a migração de fibroblastos IPF/UIP, a presença de anticorpos anti-CCR7 ou anti-CCL21 significativamente inibiu a resposta migratória de fibroblastos IPF/UIP. Pré- aquecimento de fibroblastos com 200 ng/ml Toxina de Pertussis também inibiu a resposta migratória induzida por CCL21 em fibroblastos IPF/UIP. Assim, esses dados indicam que a ativação de CCR7 promoveu a migração de IPF/UIP, mas não de fibroblastos normais.
Ativação de CCR7 estimulou a proliferação de fibroblastos primários IPF/UIP. IPF/UIP é caracterizado por severa cicatrização alveolar e intersticial do pulmão devido, em parte, a extensiva fibroproliferação. A resposta proliferativa aumentada de linhas de fibroblasto IPF/UIP foi observada no presente estudo em que todas as três linhas de IPF/UIP exibiram um valor de base (ou seja, DMEM isoladamente) taxa de proliferação que foi aproximadamente 3 vezes maior que a de linhas de fibroblastos normais estudadas. Além disso, a adição de CCL21, mas não de CCLl9, a 10 ug/ml significativamente aumentou as propriedades proliferativas de todas as três linhas de fibroblastos primários IPF/UIP acima daquela observada em culturas expostas a DMEM isoladamente. As propriedades proliferativas de fibroblastos normais não foram alteradas pela presença de CCL19 ou CCL21.
Ativação de CCR7 promoveu CCL5 mas não nova geração de colágeno por fibroblastos primários IPF/UIP. estudos prévios mostraram que quimiocinas podem dirigir a expressão de outras quimiocinas em vários tipos de células. Por exemplo, a adição de CCL5 a culturas de fibroblastos IPF/UIP significativamente aumenta a expressão de CCL7, um biomarcador suposto em IPF/UIP. Para determinar se ativação de CCR7 via CCL21 alterou as propriedades de geração de quimiocina de IPF/UIP e fibroblastos normais, ambos os grupos de fibroblastos foram expostos a CCL21 por 24 horas antes da análise de proteína solúvel multiplex. CCL5 era presente em culturas de fibroblastos IPF/UIP e normais, e CCL21 significativamente aumentou os níveis de CCL5 em IPF/UIP, mas não em fibroblastos normais.
Surpreendentemente, a presença de CCL21 em culturas de fibroblastos IPF/UIP por 24 h não altera sua síntese de colágeno solúvel, como determinado com o uso de um ensaio de colágeno de Sircol. Esses dados, junto com os dados de estudos anteriores indicam que a ativação de CCR7 aumentou as capacidades sintéticas da quimiocina de fibroblastos IPF/UIP.
Expressão de alfa actina de músculo liso (aSMA) não foi alterada por CCL21 em fibroblastos primários IPF/UIP e normais.
aSMA é um marcador de proteína para um subtipo de fibroblasto altamente sintético conhecido como miofibroblastos (White e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006, 173(1):112-1121). Considerando-se os efeitos profundos de CCL21 sobre a síntese de quimiocinas por fibroblastos IPF/UIP, a seguir, avaliamos de os ligantes de CCR7 alteravam a expressão de aSMA nessas células. Análises Western blot mostraram que culturas de fibroblastos IPF/UIP expressavam níveis maiores de aSMA do que culturas de fibroblastos normais, consistente com as propriedades sintéticas mais elevadas das células IPF/UIP. No entanto, a expressão de aSMA não foi afetada pela presença de CCL21. Embora fibroblastos IPF/UIP aSMA- positivos expressassem CCR7 (com base na análise imunocitoquímica), a adição de CCL21 àquelas células parece não aumentar adicionalmente o nível dessa proteína, sugerindo que a ativação de CCR7 não foi um estímulo importante para a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos.
A via de sinalização de quinase P44/p42 extracelular relacionada ao sinal (ERK 1/2) em fibroblastos IPF/UIP foi ativada após ativação de CCR7 por CCL21. Muitas funções celulares importantes são reguladas por um grupo de proteínas de sinalização denominadas coletivamente vias de proteína quinase ativadas por mitógeno (MAPK). Cada via possui um efeito único sobre o ciclo celular, crescimento e migração em função, em parte, do fato de que cada via é ativada por estímulos distintos que incluem fatores do crescimento, estresse e citocinas inflamatórias. A cascata de ativação iniciada por esses estímulos envolve a fosforilação seqüencial de uma quinase MAPKK, uma quinase MAPK e uma MAPK. Essa etapa final permite que uma MAPK entre no núcleo e ative um ou vários fatores de transcrição abaixo levando, dessa forma, a respostas biológicas, tais como proliferação, migração e sobrevida celulares. Para determinar os efeitos de CCR7 ativado sobre as vias MAPK, proteínas associadas a fibroblastos não tratados e ativados por CCL21 foram coletadas em 3 0 segundos e 2, 5 e 30 minutos, e foi feita a análise western blot das vias de ERK 1/2, p38, e quinase c-Jun do terminal N (JNK) MAPK. Embora não tenha havido alterações na fosforilação de proteínas da sinalização associadas às vias p38 e JNK, as da via ERK 1/2 mostraram evidência de alterações da fosforilação após adição de CCL21 às culturas de fibroblastos IPF/UIP. Além disso, não houve evidências de fosforilação de c-RAE, a MAPKKK dessa via.
A proteína quinase ativada por mitõgeno (MEK 1/2) foi fosforilada fibroblastos IPF/UIP após exposição ao CCL21. Linhagens de fibroblastos não tratados (ou seja, com privação de soro) primários normais e linhagens de fibroblastos IPF/UIP não exibiram MEK 1/2 ativada constitutivamente. A adição de DMEM-0,5 isoladamente aos fibroblastos normais causou um aumento tempo-dependente na fosforilação de MEK 1/2, que alcançava um pico em 5 minutos. No entanto, esse perfil de fosforilação não foi alterado pela presença de 10 ng/ml de CCL21. Embora a adição de DMEM-0,5 isoladamente tenha promovido uma ativação tempo-dependente de MEK1/2 em fibroblastos IPF/UIP o pico de ativação em 5 minutos, a adição de CCL21 (a 10 ng/ml) resultou em um aumento da fosforilação em 2 e 5 minutos, com o nível de fosforilação de MEK 1/2 retornando aos níveis médios ao fim de 30 minutos. Em conjunto, esses dados sugerem a ativação acelerada de MEK 1/2 em fibroblastos IPF/UIP expostos ao CCL21.
CCL21 acelerou a fosforilação de ERK 1/2 em fibroblastos IPF/UIP. Fibroblastos primários normais não tratados e fibroblastos IPF/UIP exibiram fosforilação constitutiva de ERK 1/2, mas a atividade de base dessa MAPK pareceu ser maior em fibroblastos normais comparada com a dos fibroblastos IPF/UIP, que mostraram muito pouca fosforilação constitutiva de ERK 1/2. A adição de DMEM-0,5 isoladamente aos fibroblastos normais resultou no pico da ativação de ERK 1/2 em 5 minutos. Foi observado um padrão similar de ativação de ERK 1/2 em culturas de fibroblastos normais expostos a 10 ng/ml de CCL21 adicionados ao DMEM- 0,5, mas os níveis globais de fosforilação de ERK 1/2 foram menores nessas culturas. Em culturas de fibroblastos IPF/UIP, a adição de DMEM-0,5 isoladamente produziu um padrão de fosforilação de ERK 1/2 similar àquele observado em culturas de fibroblastos normais; no entanto, a magnitude da ativação foi bem maior em fibroblastos IPF/UIP comparados com fibroblastos normais. Em culturas de fibroblastos IPF/UIP expostos ao CCL21 e DMEM-0,5, houve um amento significativo da fosforilação em 2 minutos, comparada com a fosforilação de ERK 1/2 em culturas desses fibroblastos expostos ao DMEM-0,5 isoladamente. Em função da baixa fosforilação constitutiva de ERK 1/2 em fibroblastos IPF/UIP, os níveis de fosforilação após a exposição dessas ao DMEM-0,5 isoladamente ou DMEM-0,5 + 10 ng/ml de CCL21 variaram de 60 125 vezes maiores do que culturas que contêm fibroblastos IPF/UIP não tratados.
A fosforilação ribossômica de S6 quinase (p90RSK) em fibroblastos IPF/UIP foi promovida por CCL21. P90RSK demonstrou ser ativada pela quimiocina CXCL12 no contexto de mielopoiese (Lee e cols., 2002, Blood 99(12): 4307- 4317). A análise de p90RSK no presente estudo revelou que esse fator de transcrição (localizado abaixo de ERK 1/2) estava presente em um estado fosforilado em fibroblastos normais não tratados e fibroblastos IPF/UIP. As alterações da ativação de p90RSK foram similares em culturas de fibroblastos normais, independentemente da presença de CCL21. Em contraste, a presença de CCL21 em culturas de fibroblastos IPF/UIP em todos os pontos do tempo examinados aumentou a fosforilação desse fator de transcrição aproximadamente 2,5 vezes acima daquela observada em culturas não tratadas. Em conjunto, esses dados indicaram que CCR7 era um receptor ativo em fibroblastos IFF/UIP e, esses receptor pareceu que sinaliza, pelo menos em parte, através da via ERK 1/2. Embora fibroblastos normais tenham mostrado ativação da via ERK 1/2, essa ativação pareceu ser independente da presença de CCL21.
A inibição da proteína G com toxina de pertussis ou silenciamento do gene CCR7 com pequeno RNA de interferência atenuou a ativação de ERK 1/2 mediada por CCL21. Para confirmar o papel de CCR7 na ativação de fibroblastos IPF/UIP, foram realizados estudos adicionais para determinar se a toxina de pertussis (um inibidor da proteína Gi e Go) ou o silenciamento do gene CCR7 mediado por siRNA abolia os efeitos de CCL21 on sobre a ativação de ERK 1/2. A adição de um siRNA específico para CCR7 reduziu a expressão proteica desse receptor em aproximadamente 70% em 24 horas após a transfecção. Essa inibição da expressão protéica de CCR7 persistiu pela duração de 30 minutos desses estudos. Nem a siRNA específico para Lamina A/C nem um siRNA aleatório teve qualquer efeito sobre a expressão proteica de CCR7 em fibroblastos IPF/UIP. Dessa forma, esses dados mostraram que CCR7 foi direcionado com sucesso in vitro com o uso de um siRNA específico. A presença de toxina de pertussis ou um siRNA CCR7 em culturas de fibroblastos IPF/UIP reduziu a fosforilação de MEK 1/2, ERK 1/2 e p90RSK aos níveis observados em culturas expostos a DMEM-0,5 isoladamente. Vários estudos documentaram que fibroblastos pulmonares primários humanos exibem ativação pró-fibrótica em resposta a (Atamas e cols., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2003, 29 (6): 743-9; Keane e cols., J. Immunol., 1997, 159(3): 1437-1443; Prasse e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006, 173(7): 781-792; Puxeddu e cols., J. Allergy Clin. Immunol., 2006, 117(1):103- 110) e são uma fonte robusta de (Keane e cols.,. J. Immunol., 1997, 159 (3) :1437-1443; Prasse e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006, 173(7)781-79) quimiocinas.
O presente estudo avaliou o papel da expressão de CCR7 por fibroblastos primários IPF/UIP derivados de SLBs considerado no momento do diagnóstico da doença. Em contraste com fibroblastos primários normais derivados das margens normais de tumores pulmonares ressecados, fibroblastos IPF/UIP e miofibroblastos aSMA-positivos expressavam CCR7, um receptor que supostamente está restrito às células de origem hematopoiética. A ativação de CCR7, através de CCL21 mais do que CCLl9, promoveu e/ou aumentou significativamente a migração, proliferação e as propriedades de síntese de quimiocina de fibroblastos IPF/UIP. CCL21 exógeno ativou através de uma forma CCR7- dependente a via ERK 1/2 MAPK. Dessa forma, esse estudo sugere que fibroblastos IPF/UIP adquirem a habilidade para responder aos ligantes de CCR7, que são expressos abundantemente no pulmão, independentemente do estado de doença (Choi e cols., J. Clin. Pathol., 2006 59(1):28- 39), e essa capacidade de resposta pode ter um papel crucial na fibroproliferação excessiva que caracteriza IPF/UIP. Em resumo, esses exemplo mostra que fibroblastos primários humanos derivados de SLBs de IPF/UIP expressam CCR7 funcional. A ativação de CCR7 por seus ligantes, particularmente CCL21, induziu migração, proliferação e síntese de quimiocina em fibroblastos IPF/UIP. A ativação induzida por CCL21 através de CCR7 era dependente da proteína G, e envolvia a ativação da via ERK 1/2 MAPK. Considerando-se esses dados e outras evidências de que o direcionamento de CCL21 inibe a cicatrização glomerular experimental (Banas e cols., J. Immunol., 2002, 168(9):4301-4307) e hepática (Bonacchi e cols. Gastroenterology, 2003, 125(4): 1060-1076), acredita-se que CCR7 represente um alvo inédito em IPF/UIP. Além disso, os dados mostraram que a fosforilação de MEK 1/2, ERK 1/2, e p90RSK induzida por CCL21 era dependente de eventos de sinalização acoplados à proteína G funcional e CCR7.
Ao longo dessa especificação e nas reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija de forma diferente, a palavra "compreende", ou variações como "compreendendo" ou "que compreende", devem ser consideradas como implicando na inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas definidos, mas não na exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.
Todas as composições e/ou os métodos aqui apresentados e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação desnecessária à luz da presente revelação. Embora as composições e os métodos dessa invenção tenham sido descritos em termos de modalidades específicas, ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que podem ser feitas variações das composições e/ou dos métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descrito, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, ficará evidente que certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados podem ser servir de substitutos para os agentes aqui descritos, desde que sejam obtidos resultados iguais ou similares. Todos esses substitutos e modificações similares evidentes para aqueles habilitados na técnica são considerados como estando incluídos no espírito, escopo e conceito da invenção, como definida pelas reivindicações em anexo. As referências aqui citadas ao longo desse pedido, na medida em que forneçam detalhes de procedimentos ou outros detalhes exemplares suplementares àqueles aqui apresentados, são todos aqui especificamente incorporados por referência.

Claims (48)

1. Método de tratamento de um distúrbio fibrosante crônico em um mamífero caracterizado por compreender a diminuição da presença ou atividade de CCL21 nos fibrócitos e/ou fibroblastos presentes na lesão fibrótica no referido distúrbio fibrosante.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método também compreende a diminuição da presença ou atividade de CCL19 nos fibroblastos associados com o referido distúrbio fibrosante.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida diminuição da presença ou atividade de CCL2 1 compreende o contato do referido mamífero com um agente que remove CCL21 dos referidos fibroblastos, em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais dos sintomas do referido distúrbio fibrosante crônico.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido agente é um anticorpo que é especificamente imunorreativo com CCL21.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um que preferencialmente reconhece epitopos em CCL21 quando comparado a outras quimiocinas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida diminuição da presença ou atividade de CCL21 compreende o contato do referido mamífero com um agente que diminui a expressão de CCL21 nos referidos fibroblastos, em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais dos sintomas do referido distúrbio fibrosante crônico.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente é molécula de siRNA direcionada contra CCL21.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido distúrbio fibrosante é selecionado do grupo que consiste em fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose hepática, artrite reumatóide, insuficiência cardíaca congestiva, doença renal crônica, pneurnonite por hipersensibilidade, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória, infecção por Schistosoma mansoni, hipertensão pulmonar primária causada por lesões plexiformes, manifestação pulmonar de doenças associadas ao herpes vírus, manifestações dermatológicas de doenças associadas ao herpes vírus; cicatriz quelóide, lúpus, dermopatia de fibrose nefrogênica, lesões de fibrose associadas com infecção por Schistosoma japonicum, doenças autoimunes, fibrose patogênica, Doença de Lyme, remodelagem estromal em pancreatite e fibrose estromal, fibróides uterinos, fibrose ovariana, fibrose corneana, insuficiência cardíaca congestiva e outras condições pós-isquêmicas, cicatrizes pós-cirurgia abdominal, cicatrizes pós- cirúrgicas de trabeculotomia de glaucoma de ângulo aberto, e qualquer combinação desses.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio fibrosante é fibrose pulmonar crônica.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 6, caracterizado por compreender a administração do referido agente localmente ao local da lesão fibrosante.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida lesão fibrosante é em um pulmão e a referida composição faz contato localmente com a referida lesão.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente compreende uma porção de direcionamento para localizar especificamente o referido agente ao local da lesão fibrosante.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida lesão fibrosante é em um pulmão e a referida composição faz contato localmente com a referida lesão.
14. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é administrado com o uso de um modo de administração selecionado do grupo que consiste em administração tópica, injeção, inalação, liberação contínua por depósito ou bomba, ou quaisquer combinações desses.
15. Método para a inibição da proliferação de fibroblasto e/ou fibrócito caracterizado pelo fato de que compreende o contato do referido fibroblasto e/ou fibrócito com uma composição que compreende um anticorpo anti-CCL21 ou uma molécula de siRNA projetadas contra CCL21.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por também compreender o contato do referido fibroblasto com uma composição que compreende um anticorpo anti-CCL19 ou uma molécula de siRNA projetados contra CCL19.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado por também compreender o contato do referido fibroblast com uma composição que compreende um anticorpo anti-CCR7 ou uma molécula de siRNA projetados contra o receptor CCR7.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os referidos fibrócitos e/ou fibroblastos são localizados in vitro.
19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os referidos fibrócitos e/ou fibroblastos são localizados in vivo.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os referidos fibrócitos e/ou fibroblastos são localizados in vivo em tecido pulmonar.
21. Método para a inibição da migração de fibrócitos e/ou ativação de fibroblastos caracterizado pelo fato de que compreende o contato dos referido fibrócitos e/ou fibroblastos com uma composição que inibe aquela atividade de CCL21.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os referidos fibrócitos são localizados in vivo em um mamífero e o referido método inibe a migração de fibrócitos para o tecido pulmonar no referido mamífero, assim evitando a excessiva produção de matriz extracelular.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os referidos fibroblastos são fibroblastos pulmonares residentes localizados em tecido pulmonar em um mamífero e o referidos método inibe a ativação dos referidos fibroblastos no tecido pulmonar no referido mamífero, assim evitando a excessiva produção de matriz extracelular.
24. Método para o tratamento de fibrose pulmonar caracterizado pelo fato de que compreende a inibição da migração de fibrócitos e/ou a ativação de fibroblastos pulmonares residentes localizados em tecido pulmonar em um mamífero que sofre de doença pulmonar fibrótica por inibição da atividade ou expressão de CCL21 no referido fibrócitos e/ou os referidos fibroblastos assim evitando a excessiva produção de matriz extracelular e melhorando os sintomas de fibrose pulmonar.
25. Método para o tratamento ou inibição do desenvolvimento de laminite pulmonar induzida por radiação e/ou fibrose pulmonar induzida por radiação em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao referido indivíduo de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar do referido indivíduo, em que o referido agente é administrado antes, e/ou durante, e/ou após a administração de terapia por radiação.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o método também compreende a administração de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL19 nos fibroblastos associados com o referido distúrbio fibrosante.
27. Método para o tratamento ou inibição do desenvolvimento de fibrose pulmonar induzida por medicamento em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao referido indivíduo de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar do referido indivíduo, em que o referido agente é administrado antes, e/ou durante, e/ou após a administração do medicamento.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o método também compreende a administração de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL19 nos fibroblastos associados com o referido distúrbio fibrosante.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento é selecionado do grupo que consiste em um agente citotóxico, agente citotóxico, um antibiótico, um agente anti- arrítmico, um agente antiinflamatório, e um medicamento ilícito.
30. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento é selecionado do grupo que consiste em Anfotericina B, bleomicina, bromocriptina, busssulfan, carbamazepina, clorambucil, cocaína, ciclofosfamida, difenilhidantoína, ergotamina, flecainida, heroína, melfalan, metadona, metotrexate, metilfenidato, metilsergida, óleo mineral, nitrofurantoína, nitrosuréias, procarbazina, silicone, sulfasalazina tocainida, e a classe de alcalóides da vinca de agentes.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o referido agente é administrado em combinação com corticosteróide, um agente imunosupressor, um anticoagulante, um diurético, um glicosídeo cardíaco, um bloqueador de canal de cálcio, um vasodilator, um análogo de prostaciclina, um antagonista de endotelina, a inibidores de fosfodiesterase, um agonista de beta-2, um agente antimuscarínico, um inibidor de endopeptidase, um agente de diminuição de lipídeo e inibidores de tromboxano, ou combinações desses.
32. Uso de um agente para a diminuição da presença ou atividade de CCL21, e opcionalmente um agente que diminua a presença ou atividade de CCLl9, nos fibrócitos e/ou fibroblastos presentes na lesão fibrótica caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio fibrosante crônico em um mamífero.
33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido agente é um anticorpo que é especificamente imunorreativo com CCL21.
34. Uso, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que referido anticorpo é um que preferencialmente reconhece epitopos em CCL21 quando comparado a outras quimiocinas.
35. Uso, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido agente é molécula de siRNA direccionada contra CCL21.
36. Uso, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio fibrosante é selecionado do grupo que consiste em fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose hepática, artrite reumatóide, insuficiência cardíaca congestiva, doença renal crônica, pneumonite por hipersensibilidade, doença pulmonar intersticial/bronquiolite respiratória, infecção por Schistosoma mansoni, hipertensão pulmonar primária (prevenção da formação da lesão plexiforme) doenças associadas ao herpes vírus, que incluem manifestações pulmonares e dermatológicas; cicatriz quelóide, lúpus, dermopatia de fibrose nefrogênica, lesões de fibrose associadas com infecção por Schistosoma japonicum, doenças autoimunes, fibrose patogênica, Doença de Lyme, remodelagem estromal em pancreatite e fibrose estromal, fibróides uterinos, fibrose ovariana, fibrose corneana insuficiência cardíaca congestiva e outras condições pós-isquêmicas, cicatrizes pós-cirúrgicas que incluem adesões abdominais, trabeculotomia de glaucoma de ângulo aberto, e qualquer combinação desses.
37. Uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio fibrosante é fibrose pulmonar crônica.
38. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente é formulados para um modo de administração selecionado do grupo que consiste em administração tópica, injeção, inalação, liberação contínua por depósito ou bomba, ou quaisquer combinações desses.
39. Uso de uma composição que compreende um anticorpo anti-CCL21 ou uma molécula de siRNA projetados contra CCL21 e opcionalmente anti-CCL19 ou molécula de siRNA projetados contra CCLI 9, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para a inibição da proliferação de fibroblasto e/ou fibrócito.
40. Uso, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o referido uso também compreende o uso de uma composição que compreende um anticorpo anti-CCR7 ou uma molécula de siRNA projetadas contra o receptor CCR7 para a fabricação de um medicamento para a inibição da proliferação de fibroblasto e/ou fibrócito.
41. Uso de uma composição que inibe aquela atividade de CCL21 caracterizado por ser para a manufatura de um medicamento para a inibição da migração de fibrócitos e/ou ativação de fibroblastos.
42. Uso de uma composição que inibe a atividade ou expressão de CCL21 em fibrócitos e/ou a ativação de fibroblastos pulmonares residentes caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de fibrose pulmonar por prevenção da excessiva produção de matriz extracelular e melhorando os sintomas de fibrose pulmonar.
43. Uso de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21, e opcionalmente um agente que diminua a presença ou atividade de CCLl9 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de laminite pulmonar induzida por radiação e/ou fibrose pulmonar induzida por radiação.
44. Uso de um agente que diminui a presença ou atividade de CCL21, e opcionalmente um agente que diminua a presença ou atividade de CCL19 nos fibrócitos e/ou fibroblastos no tecido pulmonar caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de fibrose pulmonar induzida por medicamento.
45. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento é selecionado do grupo que consiste em um agente citotóxico, agente citotóxico, um antibiótico, um agente anti-arrítmico, um agente antiinflamatório, e um medicamento ilícito.
46. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento é selecionado do grupo que consiste em Anfotericina B, bleomicina, bromocriptina, busulfan, carbamazepina, clorambucil, cocaína, ciclofosfamida, difenilhidantoína, ergotamina, flecainida, heroína, melfalan, metadona, metotrexate, metilfenidato, metilsergida, óleo mineral, nitrofurantoína, nitrosuréias, procarbazina, silicone, sulfasalazina tocainida, e a classe de alcalóides da vinca de agentes.
47. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento é combinado com um corticosteróide, um agente imunosupressor, um anticoagulante, um diurético, um glicosídeo cardíaco, um bloqueador de canal de cálcio, um vasodilator, um análogo de prostaciclina, um antagonista de endotelina, inibidores de fosfodiesterase, um agonista de beta-2, um agente antimuscarínico, um inibidor de endopeptidase, um agente de diminuição de lipídeo e inibidores de tromboxano, ou combinações desses.
48. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida diminuição da presença ou atividade de CCL21 e CCL19 no referido fibrócitos e/ou fibroblastos compreende o contato do referido mamífero com um agente que remove CCL21 e CCL19 dos referidos fibrócitos e/ou fibroblastos, em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais dos sintomas do referido distúrbio fibrosante crônico
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