BRPI0617493B1

BRPI0617493B1 - Hidroxiapatita multisubstituída e seu compósito com um polímero natural e/ou sintético, preparo e usos dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0617493B1
Application number: BRPI0617493-0A
Authority: BR
Inventors: Landi Elena; Tampieri Anna; Sprio Simone; Pressato Daniele; De Luca Claudio; Celotti Giancarlo
Original assignee: Fin-Ceramica Faenza S.P.A.
Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2018-05-02
Also published as: JP2009511420A; WO2007045954A1; SI1948561T1; EP1948561B1; AU2006305677A1; BRPI0617493B8; ES2606466T3; CA2625173C; BRPI0617493A2; DK1948561T3; CA2625173A1; PL1948561T3; JP5524485B2; EP1948561A1; ITMI20051966A1; US9327976B2; AU2006305677B2; US20080262121A1

Abstract

<b>hidroxiapatita multisubstituídá e seu compósito com um polímero natural e/ou sintético, preparo e usos dos mesmos<d>a presente invenção refere-se a uma hidroxiapatita multisubstituída por espécies iônicas fisiologicamente compatíveis e a seu compósito biohíbrido com um polímero natural e/ou sintético, que são úteis na preparação de um substituto ásseo biomimético para o tratamento de defeitos em tecidos ósseos. além do mais, a presente invenção refere-se a um método para sua preparação e a seus usos.

Description

(54) Título: HIDROXIAPATITA MULTISUBSTITUÍDA E SEU COMPÓSITO COM UM POLÍMERO

NATURAL E/OU SINTÉTICO, PREPARO E USOS DOS MESMOS (51) Int.CI.: C01B 25/32; C01B 25/16; A61L 27/12; A61L 27/46; A61F 2/28 (30) Prioridade Unionista: 18/10/2005 IT MI2005A001966 (73) Titular(es): FIN-CERAMICA FAENZA S.P.A.. C.N.R. CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE (72) Inventor(es): ELENA LANDI; ΑΝΝΑ TAMPIERI; SIMONE SPRIO; DANIELE PRESSATO; CLÁUDIO DE LUCA; GIANCARLO CELOTTI

II r

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “HIDROXIAPATITA MULTISUBSTITUÍDA E SEU COMPÓSITO COM UM POLÍMERO NATURAL E/OU SINTÉTICO, PREPARO E USOS DOS MESMOS”.

A presente invenção refere-se a uma hidroxiapatita multisubstituída por espécies iônicas fisiologicamente compatíveis e a seu compósito biohíbrido com um polímero natural e/ou sintético, que pode ser usado na preparação de um substituto ósseo biomimético para o tratamento de defeitos em tecidos ósseos.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método para sua preparação e a seus usos.

A hidroxiapatita é um fosfato de cálcio considerado um dos materiais mais úteis como substitutos ósseos e/ou implantes, pois é um constituinte essencial da parte mineral/inorgânica dos ossos e dentes dos mamíferos. A dita parte inorgânica foi representada, durante muito tempo, como hidroxiapatita estequiométrica, Caio(P0₄)₆(OH)₂. Na verdade, a fase inorgânica fisiológica dos ossos e dos dentes não é constituída apenas de fosfato de cálcio estequiométrico, ou de hidroxiapatita (por razões de simplicidade, denominada como HA a seguir), conforme mencionado acima. De fato, a hidroxiapatita fisiológica, presente nos ossos e nos dentes, compreende ainda, em sua estrutura, uma certa quantidade de substituições químicas, tanto aniônicas quanto catiônicas, que, de um lado, tomam-na mais reabsorvível pelo organismo vivo, e do outro, conferem-na * λ- >

maior capacidade de estimular o crescimento de novos tecidos ósseos do que a hidroxiapatita estequiométrica. Os ditos substituintes, embora estejam presentes em pequena quantidade, podem ser associados às propriedades biológicas específicas da hidroxiapatita fisiológica e desempenham papel fundamental na bioquímica do osso, do esmalte e da dentina.

A presença desses substituintes iônicos é, portanto, fundamental para que seja obtido um biomaterial que, ao reproduzir da maneira ideal (e possivelmente melhor) a bioestrutura e bioquímica do tecido ósseo natural, pode se integrar e substituí-lo, com um tempo de integração e regeneração óssea extremamente reduzido em relação à hidroxiapatita estequiométrica convencional (que, como tal, é reabsorvida em tempos muito longos e gera uma ativação insuficiente dos osteoblastos).

Dentre os substituintes iônicos mais importantes, que estão presentes na hidroxiapatita fisiológica, podemos mencionar os seguintes:

- de um lado, ânions de silicato e carbonato, que 20 substituem parcialmente os íons fosfato (no assim chamado “sítio

B” da HÁ);

- do outro, cátions de Mg²⁺ e Sr²⁺, que substituem parcialmente os íons cálcio.

Além do mais, o íon carbonato também substitui 25 parcialmente os íons OH‘ do sítio A da HÁ, dessa forma resultando na substituição parcial em ambos os sítios A e B da e

mesma, principalmente na posição fosfato (sítio B) com respeito à posição hidroxila (sítio A). De fato, na HA fisiológica, tanto as carbonações do tipo A quanto do tipo B estão presentes, a uma razão molar mútua A/B de cerca de 0,7 a cerca de 0,9 (correspondendo a um percentual de razão molar A/V de cerca de 70% a cerca de 90%), dependendo da espécie e idade do indivíduo.

O silício é um dos microelementos essenciais nos processos biológicos. A importância do silício para a ío formação óssea e a calcificação foi comprovada por estudos científicos in vitro e in vivo. Por exemplo, a substituição de íons fosfato por íons silicato na hidroxiapatita aumenta a atividade das células dos osteoblastos com respeito à hidroxiapatita estequiométrica. De fato, foi observada uma deposição óssea superior e um remodelamento ósseo mais rápido na superfície dos implantes de HA substituída por íons silicato (por razões de simplicidade, silício-hidroxiapatita, SiHA), com respeito à HA estequiométrica. O teor de silício na apatita biológica varia de aproximadamente 0,2 a 0,8% em peso.

A presença do silício também parece promover a adesão celular e a formação da parte orgânica do osso, em particular do colágeno.

No que tange ao magnésio, ele parece desempenhar um importante papel nas modificações da qualidade

-1 da matriz óssea, resultando na fragilidade desta. A falta de Mg afeta negativamente todos os estágios do metabolismo do ¢1 esqueleto, provocando a interrupção do crescimento ósseo, a redução da atividade dos osteoblastos e osteócitos, osteopenia e fragilidade óssea.

Além disso, a hidroxiapatita sintética substituída por Mg²⁺ (por razões de simplicidade, MgHA) é mais solúvel, e, portanto, mais reabsorvível do que a HA não-substituída. Entretanto, há um limite na incorporação do Mg²⁺ na HA, uma vez que elevadas concentrações do dito íon tendem a desestabilizar sua estrutura. Razões molares de Mg²⁺/Ca²⁺ acima de 0,3 tomam proporcionalmente provável a formação de fosfato de magnésio tricálcio em detrimento de MgHA. De qualquer forma, a substituição do íon Ca por Mg pode ser vantajosamente aumentada pela incorporação simultânea de íons carbonato no sítio do fosfato (sítio B) da estrutura da apatita.

Como tal, o íon carbonato já está presente normalmente na estrutura do HA fisiológico a uma quantidade de 3% a 8% em peso, com respeito ao peso da HA, dependendo da idade do indivíduo.

Portanto, carbonações sintéticas devem ser realizadas preferencialmente no sítio B, também pelo fato de que a carbonação do tipo A resulta em uma afinidade inferior da apatita com as células dos osteoblastos, dando origem a uma adesão celular inferior e baixa produção de colágenos, com respeito à HA não-substituída. Portanto, seria proveitoso direcionar a carbonação da HA especificamente apenas em seu

Q ι sítio B. No que diz respeito ao íon Sr , sua presença varia de

acordo com a idade, o tecido e exercícios físicos. A razão molar de Sr²⁴VCa²⁺ na HA fisiológica é geralmente de 0,02 a 0,30, sendo que valores mais elevados estão associados a ossos jovens. Além do mais, o Sr tem um efeito estabilizante sobre a estrutura da apatita.

A presença de cada íon específico em quantidades adequadas possibilita uma contribuição específica ao processo biológico do remodelamento ósseo, e também varia as características de solubilidade, reabsorção, estabilidade e ίο resistência mecânica da HA substituída graças ao grande número de defeitos cristalinos provocados pela sua presença. Todas as substituições iônicas que se encontram naturalmente presentes na HA fisiológica contribuem, portanto, para determinar as características biológicas específicas do tecido ósseo.

Portanto, seria de extrema importância dispor de um material sintético capaz de reproduzir da maneira ideal (e possivelmente melhor) as características dadas ao tecido ósseo pelo seu componente inorgânico fisiológico complexo (apatita), de modo a obter substitutos ósseos biocompatíveis e biomiméticos a serem usados no tratamento de defeitos ósseos.

Infelizmente, não há notícia de um material que se enquadre satisfatoriamente nas características citadas acima. Portanto, ainda é necessário dispor de um material como o descrito acima, que seja completamente biocompatível e biomimético, cujas características de capacidade de reabsorção e

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osteogênese sejam de tal forma a torná-lo um substituto ideal do componente inorgânico do tecido ósseo natural.

O objetivo da presente invenção é oferecer uma resposta à altura da necessidade revelada acima.

Esse e outros objetivos, que ficarão evidentes na descrição detalhada seguinte, foram consumados pelo Titular, que descobriu por acaso que uma hidroxiapatita substituída por uma quantidade eficaz de silicato e/ou íons Sr e pelo menos uma espécie iônica fisiologicamente compatível, selecionada dentre carbonato, Mg²⁺ e/ou misturas destes, é capaz de oferecer uma resposta adequada aos problemas citados acima. Portanto, um dos objetivos da presente invenção é uma hidroxiapatita multisubstituída por uma quantidade eficaz de silicato e/ou íons Sr²* e, adicionalmente, com pelo menos uma outra espécie iônica fisiologicamente compatível, conforme revelado na reivindicação independente anexa.

Outro objetivo da presente invenção é um método para o preparo do composto acima, cujas características são reveladas na reivindicação independente anexa. Outro objetivo da presente invenção é o uso do composto acima para o preparo de um substituto ósseo, conforme revelado na reivindicação independente em anexo. Ainda outro objetivo da presente invenção é o substituto ósseo obtido com o composto acima, conforme revelado na reivindicação independente em anexo. Concretizações preferidas da presente invenção são reveladas nas reivindicações dependentes anexas. Entre estes, um

1+ objetivo particularmente preferido da presente invenção é um compósito biohíbrido compreendendo a hidroxiapatita acima e compreendendo, ainda, uma quantidade adequada de um polímero natural e/ou sintético, bem como um método para o preparo do dito compósito biohíbrido.

A presente invenção é revelada em detalhes na descrição a seguir. Além do mais, ela é revelada em detalhes em alguns de seus aspectos preferidos pelas Figuras acompanhantes de 1 a 6, nas quais:

- A FIG. 1 ilustra a comparação entre a tendência dependente do pH da condutividade da água de um dado número de suspensões (aquosas) dos pós de hidroxiapatitas multisubstituídas de acordo com a presente invenção;

- A FIG. 2 ilustra uma análise ESEM (Microscopia Eletrônica de Varredura Ambiental) de um compósito (is_SrSiMgCHA/Coll 70/30 SBF, descrito no Exemplo 2 revelado abaixo) de acordo com a presente invenção, constituído de uma fase inorgânica de hidroxiapatita multisubstituída (SrSiMgCHA), que é incorporada, durante sua síntese, à fase colágeno no processo de auto-organização da mesma (nucleação direta in-situ): o compósito é caracterizado por uma estrutura porosa compreendendo poros com dimensão extremamente variável; tanto macroporos com dimensões superiores a 300 pm, que permitem a penetração de osteoblastos, quanto micro-mesoporos, que permitem a permeação de toda a estrutura por fluidos fisiológicos, podem ser vistos;

iS í»

A FIG. 3 ilustra uma análise TEM (Microscopia Eletrônica de Transmissão) de um compósito de acordo com a presente invenção (is_SrSiMgCHA/Coll 70/30 SBF), daonde pode-se deduzir que o processo de nucleação in-situ da apatita no colágeno permite reduzir a dimensão das partículas do compósito com respeito ao que pode ser obtido com a dopagem química (substituição) apenas da fase inorgânica; De fato, tendo em vista que as hidroxiapatitas multisubstituídas, como tal, têm uma dimensão de 20 nm a 40 nm, dependendo dos íons dopagem, com ío nucleação de colágeno in-situ, são geradas apatitas multisubstituídas com núcleos tendo uma dimensão de 5 nm a 10 nm.

- A FIG. 4 ilustra uma análise XRD (Difração de Raios X; Radiação de Cu Ka) de um compósito de acordo com a presente invenção (is_SrSiMgCHA/Coll 70/30 SBF); o espectro é típico de uma fase com baixa cristanilinidade, mas no entanto, os picos característicos da fase apatita (002) a cerca de 26 graus de 2-Teta, (211) e (112) podem ser identificados, o que tende a criar uma banda incluindo o pico em (300), em torno de 32 graus de 2-Teta (Teta é o ângulo entre o raio x incidente e o raio x difratado pela amostra: via de regra, ele é a abscissa de um difratograma de raios x); A aparência do espectro condiz com a composição do material constituído de uma fase orgânica (colágeno) e de uma fase inorgânica (apatita multisubstituída) com um tamanho de cristaiitos extremamente pequeno;

- FIG. - A FIG. 5 ilustra uma análise FTIR (espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier) de um compósito de acordo com a presente invenção (is_SrSiMgCHA/Coll 70/30 SBF), em que a curvatura de carbonato no sítio B (874 cm-1) e o estiramento do grupo COOdo colágeno, deslocados em direção a valores de número de ondas menores (de 1340 a cerca de 1336,5 cm-1), evidenciam uma interação próxima entre a apatita e o colágeno; Isso confirma a nucleação da apatita dentro e nas fibras de colágeno, ao contrário ío do que ocorre quando a fase apatita pré-formada é misturada na fase colágeno (neste caso, as duas fases permanecem distintas);

- A FIG. 6 ilustra uma análise TGA (curva termogravimétrica e seu derivado, extraído da análise STA: STA inclui TGA e DTA, isto é, análise termogravimétrica + análise termodiferencial) de um compósito de acordo com a presente invenção (is_SrSiMgCHA/Coll 70/30 SBF); A curva de perda de peso permite avaliar a quantidade relativa de fases de apatita e colágeno; O compósito de apatita/colágeno 70/30 é caracterizado por uma razão de peso real de apatita/colágeno de cerca de 67/33;

De fato, se considerarmos que a fase apatita isoladamente é caracterizada por uma perda de peso, dependendo de sua estequiometria (geralmente de cerca de 10-15% - adsorção, água ocluída, carbonação e assim por diante), o teor relativo da fase colágeno pode ser inferido a partir da perda de peso total do compósito; O teor de peso de carbonato na apatita é inferido a uj partir da perda de peso (eliminação de CO₂ como resultado do processo de descarbonização) na faixa de 600 a 1000°C.

A presente invenção refere-se a uma hidroxiapatita (ou hidroxiapatita não estequiométrica, por razões de conveniência também chamado de nsHA) multisubstituída por espécies iônicas fisiologicamente compatíveis, em que a dita hidroxiapatita compreende uma quantidade eficaz de silicato e/ou íons Sr²⁺ e, ainda, pelo menos uma espécie iônica selecionada ι*Ί I dentre: carbonato, Mg e/ou suas misturas. Na dita hidroxiapatita ío citada acima:

- a razão molar de íons silicato para íons fosfato de hidroxiapatita é de 0,001 a 0,25, correspondendo a um porcentual de SiO₄/PO₄ de 0,1% a 25%; e

- a razão molar de íons Sr²⁺ para íons Ca²⁺ de 15 hidroxiapatita é de 0,002 a 0,35, correspondendo a uma porcentagem de razão molar de Sr/Ca de 0,2% a 35%. De preferência, a dita razão de silicato para fosfato é de 0,005 a 0,20, correspondendo a um porcentual de razão molar de SiO₄/PO₄ de 0,5% a 20%.

Mais preferencialmente, a dita razão de silicato para fosfato é de 0,01 a 0,10, correspondendo a um porcentual de razão molar de SiO₄/PO₄ de 1% a 10%.

Q | Q ι

Por sua vez, a dita razão de Sr para Ca é, de preferência, de 0,02 a 0,30, correspondendo a uma porcentagem de razão molar Sr/Ca de 2% a 30%.

Mais preferencialmente, a dita razão de Sr²⁺

O i para Ca é de 0,02 a 0,25, correspondendo a uma porcentagem de razão molar de Sr/Ca de 3% a 25%.

Em uma concretização preferida da invenção, a dita hidroxiapatita adicionalmente compreende pelo menos o íon carbonato.

O dito carbonato está presente a uma razão molar de carbonato para fosfato da hidroxiapatita de 0,01 a 0,80, correspondendo a uma porcentagem de razão molar de

CaCO₃/PO₄ de 1,00% a 80%; De preferência, de 0,05 a 0,30, correspondendo a uma porcentagem de razão molar de

CaCO₃/PO₄ de 5% a 30%. Em outra concretização preferida da invenção, a dita hidroxiapatita adicionalmente compreende pelo menos o carbonato Mg²⁺.

O dito carbonato está presente a uma razão molar de carbonato para fosfato da hidroxiapatita de 0,01 a 0,30, correspondendo a uma porcentagem de razão molar de CaCO₃/PO₄ de 1,00% a 80%; De preferência, a uma razão molar de 0,03 a 0,20, correspondendo a uma porcentagem de razão molar de Mg/Ca de 3% a 20%. Em uma concretização preferida adicional da invenção, a dita hidroxiapatita adicionalmente compreende uma mistura de íons carbonato e Mg , em que os ditos íons estão presentes em razões molares iguais às citadas acima. Em algumas das concretizações preferidas da invenção, a dita hidroxiapatita compreende os seguintes íons substituintes:

- silicato, Sr²⁺, carbonato; ou

ώ.

- silicato, Sr²⁺, Mg²⁺; ou

- silicato, carbonato, Mg²⁺; ou

- Sr²⁺, carbonato, Mg²⁺;

em que os ditos íons estão presentes em razões 5 molares iguais às citadas acima.

Em outra concretização preferida da invenção, a dita hidroxiapatita compreende íons substituintes silicato, Sr²⁺, carbonato e Mg²⁺, em que os ditos íons estão presentes em razões molares iguais às citadas acima; de preferência, os ditos íons estão presentes às seguintes razões:

- o íon silicato está presente a uma razão molar SÍO4/PO4 de 0,01 a 0,10;

- 0 íon Sr está presente a uma razão molar Sr/Ca de 0,03 a 0,25;

- o íon carbonato está presente a uma razão molar CO3/PO4 de 0,05 a 0,30;

- 0 íon Mg está presente a uma razão molar Mg/Cade 0,03 a 0,20;

Em uma concretização particularmente preferida 20 da invenção, a hidroxiapatita multisubstituída consiste de uma

O I hidroxiapatita substituída por: silicato, Sr , carbonato (SrSiCHA), em que os ditos íons estão presentes às mesmas razões molares citadas acima. Em outra concretização particularmente preferida da invenção, a hidroxiapatita multisubstituída consiste de uma hidroxiapatita substituída por: silicato, Sr²⁺, Mg²⁺ (SrSiMgHA), em que os ditos íons estão presentes às mesmas razões molares citadas acima. Em outra concretização particularmente preferida da invenção, a hidroxiapatita multisubstituída consiste de uma hidroxiapatita substituída por: silicato, carbonato, Mg²⁺ (SiMgCHA), em que os ditos íons estão presentes às mesmas razões molares citadas acima. Em outra concretização particularmente preferida da invenção, a hidroxiapatita multisubstituída consiste de uma hidroxiapatita substituída por: Sr²⁺, carbonato e Mg²⁺(SrMgCHA), em que os ditos íons estão presentes às mesmas razões molares citadas acima. Em uma concretização particularmente preferida adicional da invenção, a hidroxiapatita multisubstituída consiste de uma hidroxiapatita substituída por:

O -1- i.

silicato, Sr , carbonato e Mg (SrSiMgCHA), em que os ditos íons estão presentes às mesmas razões molares citadas acima.

Os pós de HA multisubstituída de acordo com a presente invenção foram sintetizados com um método convenientemente estudado e otimizado de maneira a obter resultados mais próximos possíveis aos encontrados na natureza.

O dito método para o preparo de uma hidroxiapatita multisubstituída de acordo com a presente invenção inclui neutralizar uma suspensão aquosa básica a) de Ca(OH)₂, compreendendo uma quantidade adequada de íons silicato e/ou Sr²⁺, pela adição de uma solução aquosa b) de H3PO4, em que, na dita reação de neutralização: i) a dita suspensão aquosa a) compreende, ainda, uma quantidade eficaz de íons Mg ; e/ou ii) a adição da dita solução b) é realizada simultaneamente à adição de uma solução aquosa de íons bicarbonato.

A dita reação de neutralização foi realizada à 5 temperatura ambiente ou fisiológica (de 20°C a 40°C; de preferência, de 25°C a 37°C). Toda a síntese é realizada sob condições de pH autocontrolado em aproximadamente 12 (evitando assim adições contínuas de agentes basificantes, como a amônia), assegurando a estabilidade termodinâmica da fase ío apatita com respeito ao bifosfato de cálcio, que compete com ele em baixos valores de pH.

Os íons substituintes cálcio e fosfato da hidroxiapatita são introduzidos no ambiente de reação usando-se como reagentes sais adequadas dos mesmos, tal como, de preferência mas não necessariamente (outros sais dos mesmos podem ser usados caso seja desejado): cloreto de magnésio, bicarbonato de sódio, tetraacetato de silício, nitrato de estrôncio, dissolvido na solução aquosa em quantidades adequadas.

De preferência, os ditos sais e reagentes (iniciais) são usados às seguintes concentrações:

- Ca(OH)₂: 10 a 1000 g/1, de preferência 30 a

250 g/1;

- Si(CH₃COO)₄: 5 a 500 g/1, de preferência 8 a g/1;

- Sr(NO₃)₂: 5 a 600 g/1, de preferência 25 a 300 g/i;

- MgCl₂ 6H₂O: 5 a 700 g/1, de preferência 25 a

250 g/1;

- H₃PO₄: 5 a 1.000 g/1, de preferência 50 a 200 g/i;

- NaHCO₃: 2 a 600 g/1, de preferência 8 a 70 g/1;

Em uma concretização preferida, uma suspensão de hidróxido de cálcio é adicionada (sob agitação e à temperatura ambiente ou fisiológica) com quantidades adequadas de soluções de tetraacetato de silício e/ou nitrato de estrôncio (e cloreto de magnésio, se desejado). Ainda sob agitação, a quantidade necessária de ácido ortofosfórico (e de bicarbonato de sódio, se desejado, gotejando-o separadamente do ácido ortofosfórico) é gotejada na suspensão acima. A Tabela 1 contém, a título de exemplo, as quantidades de reagentes usadas para as sínteses de algumas apatitas multisubstituídas de acordo com a invenção.

Tabela I

Ca(OH)2 ^Sl(^CH3^C00> Sr(NO₃)₂ H3PO4 NaHCOs

Faixa de concent. dos reagente s	10-1000 g/1 pref.: 30-250 g/1	2-500 g/1 pref.: 8-70 g/1	5-700 g/I pref: 25-250 g/1	5-600 g/1 pref: 25-300 g/1	5-1000 g/1 pref: 50-200 g/1	2-600 g/1; pref: 8-70 g/1
SiHA-1	20g em 600 ml de H₂O	l,94g em 200 ml de H₂O	—	—	16,63g em 200 ml de H₂O
SiHA-2	20g em 600 ml de H₂O	3,66g em 200 ml de H₂O		—	15,65g em 200 ml de h₂o	—
SiHA-3	20g em 500 ml de H₂O	6,55g em 200 ml de H₂O			14,00g em 200 ml de h₂o	—

SiCHA- 1	20g em 600 ml de H2O	1,94g em 200 ml de H₂O		—	16,63g em 200 ml de H₂O	8,12g em 400 ml de h₂o
SiCHA- 2	20g em 600 ml de H2O	1,94g em 200 ml de H₂O	—	—	16,63g em 200 mi de H₂O	1,82g em 200 ml de H₂O
SiCHA- 3	20g em 600 ml de H2O	1,94g em 200 ml de H₂O	—	—	16,63g em 200 ml de h₂o	4,00g em 300 ml de H₂O
SiMgH A-l	20g em 600 ml de H2O	1,94g em 200 ml de H₂O	7,86g em 200 ml de H₂O	—	16,63g em 200 ml de h₂o
SiMgCH A-l	20g em 600 ml de H₂O	1,94g em 200 ml de h₂o	7,86g em 200. ml de H₂O	—	16,63g em 200 ml de h₂o	8,12g em 400 ml de H₂O
LMgCH A-2	20g em 600 ml de H2O	1,94g em 200 ml de H₂O	7,86g em 200 ml de H₂O		16,63g em 200 ml de h₂o	1,82g em 200 ml de h₂o
LMgCH A-3	lOOg em 700 ml de H₂O	9,72g em 200 ml de H₂O	39,30g em 300 ml de H₂O	—	83,15g em 300 ml de H₂O	9,09g em 200 ml de h₂o
MgHA	lOOg em 800 ml de h₂o		45,67g em 200 ml de h₂o		88,8g em 600 ml de H₂O	—
SrMgH A-l	lOOg em 600 ml de H₂O		45,97g em 200 ml de h₂o	54,25g em 200 ml de H₂O	88,8g em 600 ml de H₂O	—
SrMgH A-2	lOOg em 600 ml de H₂O		65,13g em 200 ml de H₂O	54,25g em 200 ml de H₂O	88,8g em 500 ml de h₂o
SrMgH A-3	lOOg em 500 ml de h₂o	—	86,83g em 200 ml de H₂O	54,25g em 200 ml de h₂o	88,8g em 600 ml de H₂O
SrSiMg CHA	20g em 600 ml de H2O	l,94g em 200 ml de H₂O	7,86g em 200 ml de H₂O	8,22g em 200 ml de h₂o	16,23g em 200 ml de h₂o	l,82g em 200 ml de H₂O

Após gotejar a solução de ácido ortofosfórico (e de bicarbonato de sódio, se desejado) na suspensão de hidróxido ι 04de cálcio, adicionado de íons silicato e/ou Sr (e Mg , se desejado), a mistura resultante é deixada sob agitação durante 1 h e então em repouso por 2 h. Em seguida, remove-se o licor-mãe,

C6por exemplo, por meio de centrifugação (por exemplo, a 5000 rotações durante 3 minutos). A parte sólida é, de preferência, dispersa novamente em água destilada e em seguida centrifugada outra vez. Essa operação de lavagem pode ser repetida diversas vezes, se assim desejado. Ao seu término, o pó é seco (por exemplo, mediante secagem por congelamento ou secagem em um forno ventilado a 40 a 60°C) e reduzido à granulometria desejada para os seguintes usos. Em uma concretização da invenção, o pó de HA multisubstituída assim obtida é peneirado a

150 pm.

A título de exemplo, a Tabela II contém dados comparativos de razões molares de substituição (íon substituinte/íon substituído) usadas em algumas das soluções reagentes iniciais, comparadas com as obtidas nos pós sintetizados correspondentes das HAs multisubstituídas, com os rendimentos de substituição correspondentes.

Tabela II

	Molar de S1O4/PO4	Molar de CO3/PO4	Molar de Mg/Ca	Molar de Sr/Ca
	Sol. reag.	HA subst.	Rend	Sol. reag.	HA subst.	Rend	Sol. reag.	HA subst.	Rend	Reag . sol.	Subst. HA	Rend
SiHA-1	0,050	0,040	0,80	—	0,065		—	—
SiHA-2	0,100	0,081	0,81	—	0,066		—	—
SiHA-3	0,200	0,163	0,81	—	0,069		—	—
SiCHA-1	0,050	<0,01	0,00	0,670	0,153	0,23	—	—
SiCHA-2	0,050	0,026	0,64	0,150	0,112	0,75	—	—
SiCHA-3	0,050	0,006	0,12	0,330	0,111	0,34	—	—
SiMgHA	0,050	0,045	0,90	—	0,069		0,150	0,040	0,27
SiMgHA- 1	0,050	<0,01	0,00	0,670	0,081	0,12	0,150	0,140	0,93
SiMgHA- 2	0,050	0,025	0,50	0,150	0,118	0,79	0,150	0,104	0,59

a&

SiMgHA- 3	0,050	0,028	0,56	0,150	0,135	0,90	0,150	0,046	0,30
MgHA	—	—	—	—	0,087		0,150	0,043	0,29	—	—	—
SrMgHA -1	—	—	—	—	0,090		0,150	0,061	0,41	0,20	0,083	0,41
SrMgHA -2	—	—	—	—	0,093		0,200	0,078	0,39	0,20	0,085	0,42
SrMgHA -3	—	—	—	—	0,094		0,250	0,126	0,50	0,20	0,091	0,45
SrSiMgC HA	0,050	0,014	0,28	0,150	0,098	0,65	0,150	0,093	0,62	0,20	0,08	0,42

Por sua vez, a Tabela III contém a composição química dos compostos da Tabela II (teor em % de peso dos íons substituintes de interesse).

Tabela III

	% em peso dos íons substituintes na hidroxiapatita
	Si	CO³	Mg²⁺	Sr²*
SiHA-1	0,63	2,48	—	—
SiHA-2	1,26	2,41	—	—
SiHA-3	2,41	2,35	—	—
SiCHA-l	<0,005	5,58	—	—
SiCHA-2	0,41	4,13	—	—
SiCHA-3	0,09	4,17	—	—
SiMgHA-1	0,70	2,59	0,96	—
SiMgCHA-1	<0,005	3,15	2,97	—
SiMgCHA-2	0,38	4,34	2,38	—
SiMgCHA-3	0,42	4,87	1,08	—
MgHA	—	3,20	0,87	—
SrMgHA-1	—	3,35	1,48	7,97
SrMgHA-2	—	3,41	1,98	8,40
SrMgHA-3	—	3,45	2,98	8,39
SrSiMgCHA	0,20	3,70	2,03	6,64

Com base nas Tabelas II e III, é possível deduzir, entre outras coisas, que a hidroxiapatita substituída por íons silicato (SiHA), preparada conforme indicado acima, tem uma efetividade (rendimento) de substituição molar de SÍO4/PO4

Μ >

de cerca de 80%. Durante a síntese, realizada no ar (atmosfera não inerte), pode-se observar que os pós incorporam, do ar, pequenas quantidades de íons carbonato (Tabela II - SiHA; SiMgHA; MgHA; SrMgHA e Tabela III - 2,35 a 3,45 em % em peso) no sítio do fosfato, seja qual for o teor de silicato ou Sr²⁺ na solução. O grau de substituição iônica dentro da célula cristalina da HA nem sempre é diretamente proporcional à quantidade de íons usada como reagente substituinte. Isso ocorre especialmente com a síntese de apatitas multisubstituídas, em que a presença simultânea de alguns íons pode afetar tanto positivamente quanto negativamente a eficácia, e, portanto, o rendimento das substituições.

De preferência, o processo de síntese é ajustado para cada tipo de substituição por meio de um procedimento iterativo (isto é, pela realização de um número suficiente de testes variando-se repetidamente as razões molares mútuas entre os íons substituintes reagentes). Assim, otimizando as quantidades de reagentes iniciais, foi possível obter as substituições iônicas desejadas à porcentagem desejada.

Sendo assim, foi possível preparar hidroxiapatitas multisubstituídas caracterizadas pelas razões de substituição dos íons fosfato e cálcio conforme descritas acima. Inesperadamente, a análise de espectroscopia na região do infravermelho acusou a presença de carbonação no sítio A da hidroxiapatita. A otimização do método de preparação de acordo com a presente invenção, conforme descrito acima, portanto, permitiu a obtenção inesperada de hidroxiapatitas multisubstituídas seletivamente carbonatadas no sítio do fosfato B da hidroxiapatita. A substituição do Ca²⁺ da hidroxiapatita por Mg foi realizada e tal maneira a obter uma razão molar

Mg /Ca de 0,01 a 0,30, correspondendo a uma porcentagem de razão molar Mg/Ca de 1,00% a 30%; De preferência, a uma razão molar de 0,03 a 0,20, correspondendo a uma porcentagem de razão molar de Mg/Ca de 3% a 20%. Na hidroxiapatita substituída por íons silicato e carbonato (SiCHA), a substituição simultânea ío dos íons silicato e carbonato no sítio do fosfato (sítio B) foi avaliada aplicando-se, na solução reagente, uma razão molar SÍO4/PO4 = 0,05 e uma razão molar CO3/PO4 de 0,15 a 0,67 (Tabela II). O resultado foi que o silicato não aparece na estrutura da apatita caso concentrações elevadas de carbonato (CO3PO4 =

0,67) estejam presentes na solução, dado que pode haver uma substituição parcial de ambos os íons caso ocorra uma diminuição do teor de carbonato na solução. Em particular, tendo em vista que a razão molar real CO3/PO4 no pó final (HA substituída) é de cerca de 0,1, 0 teor de SiO₄ de fato substituindo PO₄ aumenta fortemente se a síntese for realizada com a aplicação, nas soluções iniciais, de uma razão molar CO3/PO4 = 0,15 em vez de = 0,33. De forma similar, tendo em vista que a fração de carbonato no pó final está pouco acima de 4%, em peso, em relação ao peso do pó (100 g de pó sintético contêm 4 g de íons carbonato) em ambos os casos, a porcentagem de peso de S1O4 sofre uma alteração de 0,1 para 0,4% (vide Tabela III). Os pós preparados com a aplicação &

de uma razão molar inicial CO3/PO4 = 0,15 têm um teor de íons substituintes similar ao dos tecidos biológicos. O efeito do carbonato agregado na redução da estabilidade da hidroxiapatita é bastante evidente, visto que SiCHA-1, preparado usando uma razão molar CO3/PO4 de 0,67, consiste de uma fase apatita de baixa cristalinidade com pequenas quantidades de calcita, visto que, nos pós preparados com a aplicação de razões molares CO3/PO4 = 0,15 e 0,33, não há formação de CaCO3. A hidroxiapatita cosubstituída por silicato e carbonato, SiCHA, tem alta estabilidade térmica com respeito à hidroxiapatita substituída por silicato, SiHA. De fato, após um tratamento térmico a 1400°C, a apatita SiCHA apresenta apenas pequenas quantidades de fases secundárias, por exemplo, beta-fosfato tricálcio, β-TCP, cerca de 1,5 vol%, e mais raramente, CaO.

Na hidroxiapatita substituída por íons silicato e

Mg (SiMgHA), sob as condições de síntese acima aplicadas de forma geral, uma certa quantidade de carbonato presente no ar e no ambiente de reação penetra espontaneamente na estrutura.

O rendimento de substituição do íon silicato, isto é, a quantidade que realmente penetra na estrutura da HA com respeito à quantidade introduzida na solução reagente, expressa como a razão molar SÍO4/PO4, é de 90%, considerando que apenas 1/3 do Mg introduzido na solução reagente (expressa como a razão molar Mg/Ca) está realmente presente na HA Subst.

Sintetizada (Tabelas II e III). As hidroxiapatitas substituídas por íons silicato, Mg e carbonato (SiMgCHA) foram preparadas com a aplicação, nas soluções iniciais, das razões molares S1O4/PO4 = 0,05; CO3/PO4 = 0,15-0,67; Mg/Ca- 0,15. Aqui, novamente, os elevados teores de carbonato na solução (CO3/PO4) = 0,67) limitam a incorporação de SiO₄ à estrutura da HA. Sob estas condições, 0 próprio carbonato apresenta um rendimento de substituição limitado (12%), mas aplicando-se uma razão molar CO3/PO4 = 0,15 entre a solução reagente, é possível obter, na hidroxiapatita sintética multisubstituída, rendimentos de incorporação de até 50% para silicato e até 90% para carbonato, com um teor, em % em peso de carbonato, no pó final, de 4,5 a 5%.

O efeito dos íons substituintes na redução da pureza da hidroxiapatita é bastante evidente, assim como a cristalinidade do pó e a dimensão cristalina média, por causa do caráter de cristalinidade geralmente baixo da hidroxiapatita multisubstituída resultante.

Considerando que a apatita SiMgCHA obtida utilizando-se um teor inicial elevado de carbonato na solução (razão molar CO3/PO4 = 0,67) contém cerca de 7% de calcita, ao reduzir 0 teor relativo de carbonato para 0,15, obtém-se apatita sem fases secundárias e estável até 1000°C, quando traços de pTCP começam a aparecer.

Um efeito positivo também foi obtido com 0

At A aumento da concentração de Ca e de PO4 (e, consequentemente, de todos os outros reagentes, de modo a manter as mesmas condições iniciais no que diz respeito às razões

K2t· molares) nas soluções reagentes. De fato, a cristalinidade do pó e a eficácia da substituição por íons externos são afetadas. Por exemplo, alterando de 20 g Ca(OH)₂ (0,27 mols de Ca²⁺) em um volume total de cerca de 1000 ml de solução (concentração de

Ca(OH)₂ de 20 g/1) para 100 g (1,28 mols de Ca²⁺) em um volume total de cerca de 1200 ml (concentração de Ca(OH)₂ de 83 g/1), e de 16,63g de H3PO4 (0,14 mols de PO4) em 200 ml (concentração de H3PO4 de 83,15 g/1) para 83,15 g (0,72 mols de PO₄) em 300 ml (concentração de H3PO4 de 277,17 g/1) (SiMgCHA-2 e

SiMgCHA-3), enquanto que o teor de SÍO4 nas apatitas sintéticas correspondentes, HAS Subst., é similar, 0 grau de carbonação aumenta e 0 teor de Mg²⁺ é reduzido quase pela metade.

Observou-se que 0 Mg2+ obtém êxito em penetrar nessas HAs multisubstituídas em uma quantidade de cerca de 2,5 a 3% em peso, com respeito ao peso do pó sintético, com um teor de carbonato acima de 4% em peso com respeito ao peso do pó sintético, e com um teor de Si de cerca de 0,4% em peso com respeito ao peso do pó sintético. Aqui, novamente, a substituição simultânea dos íons SiO₄ e carbonato era possível se a quantidade de carbonato introduzido como reagente fosse de 15% dos mols do fosfato.

A cristanilinidade e estequiometria dos pós de HA Subst. afetam em grande medida sua estabilidade térmica: Por exemplo, SiMgCHA-2 e SiMgCHA-1 se decompõe termicamente a 1000°C, ao passo que SiMgCHA-3 é razoavelmente estável, até

1400°C. Hidroxiapatita substituída por íons Sr²⁺, Mg²⁺ e carbonato (SrMgCHA).

A avaliação da eficácia do íon Sr²⁺ como estabilizador da MgHA-apatita tornou-se possível com a preparação de SrMgCHA. Sabe-se que o Mg²⁺ penetra com dificuldade, como substituinte de Ca²⁺, na célula da hidroxiapatita, devido à grande diferença de tamanho entre os dois íons (raio do íon Ca²⁺ = 1,00 A, raio do íon Mg²⁺ = 0,72A).

A introdução de um cátion bivalente com tamanho maior, tal ío como Sr²⁺ (raio do íon Sr²⁺ = 1,12A), que de qualquer forma está presente na apatita fisiológica, demonstrou ser capaz de contrabalançar o efeito desestabilizante do Mg . A comparação das propriedades químico-físicas dos pós de apatita obtidos por sínteses com concentrações variáveis de Mg²⁺ na solução inicial, na presença ou ausência de Sr²'¹’ (os outros parâmetros de processo permanecendo iguais), permitiu-nos observar que o Sr²⁺ pode aumentar a incorporação de Mg²⁺ na apatita. Por exemplo, utilizando-se, na solução inicial, uma porcentagem de razão molar Mg/Ca de 15%, uma integração de Mg de 4,3 em % molar (expressa como % Mg/Ca) e 0,87, em peso, no pó de apatita na ausência de estrôncio, a serem comparados com os valores de 6,1 em % molar e 1,48% em peso, respectivamente, obtidos com a

Λ I realização da síntese na presença de Sr (Tabelas I e II: pós de MhHA e SrMgHA-1).

As HAs cosubstituídas por Sr²⁺ e Mg²⁺ são resistentes ao tratamento térmico no ar de até 1000°C sem gerar fases secundárias, ao contrário da hidroxiapatita substituída somente por Mg, que tende a se transformar em hidroxiapatita estequiométrica segregando Mg na fase fosfato tricálcio. A possibilidade de cosubstituir SrMgHAs por íons carbonato tornam-nas sintetizáveis sob condições específicas apropriadas (atmosfera de dióxido de carbono, ciclo térmico otimizado) a temperaturas relativamente baixas com respeito à HA estequiométrica, com isso obtendo uma densificação satisfatória. Assim, é possível explorar em sinergia a capacidade peculiar do

Sr2+ e o efeito induzido por uma boa densificação para melhorar as propriedades mecânicas da apatita (o que é importante, por exemplo, para a produção de substitutos ósseos porosos).

Hidroxiapatita substituída por íons silicato, Sr²⁺, Mg²⁺ e carbonato (SiSrMgCHA).

Em uma concretização preferida da invenção, a síntese da apatita mencionada acima, multisubstituída por teores de íons substituintes dentro da faixa biológica, foi realizada usando, de preferência, concentrações dos reagentes na solução de modo a obter as seguintes razões molares: SÍO4/PO4 = 0,05;

CO₃/PO₄ = 0,15; Mg/Ca = 0,15; Sr/Ca = 0,20. O pó final (HA Subst.) obtido é caracterizado por valores de porcentagens de razão molar SÍO4/PO4 = 1,4%; CO₃/PO₄ = 9,8%; Mg/Ca = 9,3%; Sr/Ca = 8%, correspondendo a um teor em peso de 0,20% silicato, 3,70% CO₃, 2,03% Mg²⁺ e 6,64% Sr²⁺.

Para fins meramente indicativos, a hidroxiapatita não-estequiométrica multisubstituída de acordo

Γ-ο'ϊ com a presente invenção pode ser representada aproximadamente pela seguinte fórmula:

Ca₁0-x/2.₂._wMg_zSr_w(PO4)6.x._y(CO₃)_x(SiO4)_y(OH)2._yA mero título de exemplo e sem nenhuma intenção de restringir, um exemplo de preparação de uma hidroxiapatita multisubstituída de especial preferência de acordo com a presente invenção é revelada abaixo. Preparação de SrSiMgCHA (multisubstituição por quatro tipos de íons substituintes).

ío Todo o processo é realizado à temperatura ambiente (25°C).

Uma suspensão de hidróxido de cálcio é preparada em um frasco (capacidade de 2 litros) dispersando 20 g de Ca(OH)₂ a 95% em 600 ml de H₂O. A suspensão resultante é mantida sob agitação a cerca de 300 rpm por meio de um agitador de hélice mecânica. Separadamente, as seguintes soluções são preparadas e adicionadas consecutivamente à suspensão de hidróxido de cálcio:

- 1,94 g de tetraacetato de Si (98% de pureza) em 200 ml de H₂O;

- 7,86g de MgCl2*6 H₂O (99% de pureza) em

200 ml de H2O;

- 8,22g Sr(NO₃)₂ (99% de pureza) em 200 ml de H₂O. Separadamente, as seguintes soluções são preparadas:

- 15,63g de H₃PO₄ (85% de pureza) em 200 ml de H₂O;

- 1,82g de NaHCOj em 200 ml de H₂O.

Essas duas soluções são adicionadas gota-a-gota na suspensão de Ca(OH)₂, preparada anteriormente, em cerca de 3 horas, simultaneamente mas com alimentadores separados. Assim que o gotejamento estiver completo, o sistema é mantido sob agitação durante 1 hora, em seguida sendo deixado em repouso por uma noite. O licor sobrenadante é então removido por centrifugação e três ciclos de lavagem e centrifugação, cada um com 1 1 de H₂O, são realizados. O produto assim obtido é então seco em um forno ventilado (40°) (ou por secagem por congelamento) e por fim peneirado a 150 mícrons.

Como mencionado acima, em todas as HAS multisubstituídas sintetizadas de acordo com a presente invenção, não houve carbonaçâo no sítio A (hidroxila), confirmando assim a eficácia do método de síntese de acordo com a presente invenção em maximizar a carbonaçâo do tipo B (sítio do fosfato).

Todos os pós de HAs multisubstituídas têm tamanho nanométrico; O tamanho médio das partículas tende a diminuir com o aumento no número de cosubstituições. A título de exemplo, para a HA multisubstituída, observaram-se tamanhos médios de SiSrMgCHA de 20 a 25 nm.

As análises de Difractometria de Raios X (XRD) mostraram que todas as apatitas sintetizadas são puras (isto é, sem fases secundárias) e caracterizadas por um baixo nível de cristanilinidade, como conseqüência das condições específicas ideais do processo (reagentes, temperatura, envelhecimento). Os espectros de XRD são muito similares ao espectro da fase inorgânica fisiológica. Além do mais, as hidroxiapatitas multisubstituídas por pelo menos três íons substituintes demonstraram ser de particular preferência no que diz respeito à biomimética e à capacidade de reabsorção, isto é, a melhor similaridade com o comportamento biológico da fase apatita do tecido ósseo natural.

As hidroxiapatitas multisubstituídas por quatro íons substituintes, conforme descrito acima, demonstraram ser ainda mais preferíveis.

Os valores de densidade dos pós da HA multisubstituída diminuem de um valor de 3,15 g/cm , caracterizando a hidroxiapatita estequiométrica, quanto mais cosubstituições são realizadas, de acordo com o aumento dos defeitos estruturais e o desvio da estequiometria relacionada aos mesmos.

O efeito da multisubstituição iônica na HA sobre sua solubilidade, e, portanto, sobre sua capacidade de reabsorção in-vivo, foi avaliada indiretamente pela medição da condutividade das suspensões aquosas dos pós da dita HA multisubstituída em função do pH. Tais análises mostraram, conforme ilustrado na FIG. 1 em anexo, que a solubilidade varia de acordo com a seqüência SiHA<SiCHA, SiMgHA<SiMgCHA<SrSiMgCHA. A condutividade aumenta, partindo de valores de pH mais básicos, de acordo com a seqüência acima, e, em particular, é possível observar que, de qualquer forma, para todas as apatitas, no pH fisiológico 7,4, que a curva de condutividade aumentou a partir do valor de patamar, contrariamente ao que ocorre com uma hidroxiapatita estequiométrica, que é quase insolúvel (Kps em tomo de 10-56). Além do mais, os valores de condutividade absoluta de SiMgCHA e SrSiMgCHA são maiores do que os das outras apatitas comparadas, o que as tomam potencialmente mais bioreabsoríveis do que estas. Testes diretos de solubilidade das hidroxiapatitas multisubstituídas em um fluido fisiológico sintético (solução equilibrada de Hank) confirmam basicamente a seqüência acima, bem como o aperfeiçoamento in-vivo conseqüente. Isso confirma o que foi apontado anteriormente sobre as vantagens relacionadas às hidroxiapatitas sintéticas multisubstituídas por pelo menos três íons substituintes (preferencialmente quatro) no que tange à sua biomimética e capacidade de reabsorção.

As HAs multisubstituídas de acordo com a presente invenção demonstraram ser extremamente similares, tanto do ponto de vista estrutural quanto biológico, à HA fisiológica presente nos tecidos ósseos do organismo.

Como conseqüência, elas representam o substituto sintético ideal da HA fisiológica na preparação de um substituto ósseo biocompatível e biomimético.

Para esse fim, em uma concretização particularmente preferida da presente invenção, o método para o preparo da HA multisubstituída de acordo com a presente invenção é realizado na presença de uma quantidade adequada de um polímero natural e/ou sintético apropriado; de preferência, na presença de fíbrilas de colágeno, simultaneamente ao processo de auto-organização das ditas fíbrilas. Sendo assim, é possível obter um material compósito biohíbrido com elevada biomimética composicional, morfológica e estrutural, uma vez que o dito compósito é produzido simulando o processo de osteogênese.

Portanto, um objetivo particularmente preferido da presente invenção é o compósito biohíbrido mencionado acima, isto é, uma hidroxiapatita substituída, conforme descrita acima, a dita hidroxiapatita compreendendo, ainda, uma quantidade eficaz de um polímero natural ou sintético biocompatível (tal como ácido polilático). O dito polímero é, de preferência, escolhido entre polímeros naturais de origem protéica ou polissacarídeos: gelatinas, albuminas, alginatos, goma gelana, amidos, quitosanas, celuloses, colágeno, dentre outros. Mais preferencialmente, o dito polímero natural é o colágeno, em particular fíbrilas de colágeno auto-organizáveis.

O dito colágeno está presente a uma concentração tal que a razão de peso mútuo (p/p) da fase inorgânica final da apatita, nucleada dentro das e nas fíbrilas de colágeno, para o colágeno, SubstHA/Col, É de cerca de 85 a 15; de preferência, a dita razão é de 80 a 20; mais preferencialmente, de 75 a 25.

Ainda mais preferida é uma razão SubstHA/Col de cerca de 70/30 p/p, o que está próximo à razão peso/peso da apatita biológica/componente orgânico do tecido ósseo. De acordo com um procedimento preferencial, a quantidade desejada de colágeno é misturada com a solução de ácido ortofosfórico. A solução resultante é gotejada, se desejado, simultaneamente a uma solução de bicarbonato de sódio (ou outra fonte de íons bicarbonato), em uma suspensão aquosa de hidróxido de cálcio, contendo quantidades adequadas de íons silicato e/ou Sr²⁺, e, se desejado, íons Mg , os ditos íons estando presentes às razões descritas acima na seção relacionada à preparação de pós de HA multisubstituída de acordo com a presente invenção. Os ditos íons substituintes mencionados acima estão presentes como sais solúveis em água; de preferência, como tetraacetato de silício, nitrato de estrôncio, cloreto de magnésio ou outros sais similares.

No final do gotejamento, que foi realizado usando o mesmo método descrito anteriormente, a hidroxiapatita é formada (nucleada) dentro e nas fibrilas de colágeno autoorganizáveis.

O compósito biohíbrido assim obtido é lavado diversas vezes com água e liofilizado.

A biomimética do método de preparação descrito acima, e, portanto, do produto biohíbrido obtido, pode ser otimizada se a dita preparação for realizada sob condições fisiológicas de temperatura (37°C) e pH (7,4) do agente dispersante aquoso. Em uma concretização particularmente preferida, a síntese é realizada usando, como solvente para o componente básico, não água pura, mas sim fluido fisiológico sintético (SBF) contendo os mesmos íons presentes no plasma humano, e com pH = 7,4 (pH fisiológico). As condições de diluição são cruciais para obter, como fase inorgânica, hidroxiapatita substituída pura (isto é, não contaminada por outras fases). As ditas condições para uma diluição ideal serão encontradas experimentalmente a cada vez, dependendo da qualidade e quantidade de substituição desejada (aqui, novamente, utiliza-se um processo iterativo como o descrito acima).

A seguir são apresentados, a mero titulo de exemplo não restritivo, os procedimentos de síntese preferidos de dois compósitos multisubstituídos HA/colágeno em uma razão 70/30 peso/peso.

Exemplo 1

Preparação do compósito? SiMgCHA/Col

70/30_SBF

Condições iniciais (solução reagente) - as razões molares iniciais são as seguintes: Razão molar de Mg/Ca = 0,15; Razão molar de S1O4/PO4 = 0,05; Razão molar de CO3/PO4 = 0,15. Método de operação:

Uma solução aquosa A) é preparada, contendo: 120 g de 1 em % em peso de gel de colágeno acético (correspondendo a 1,2 g de colágeno) adicionado a uma solução de 85% de H3PO4 (0,0157 mols, correspondendo a 1,809 g) em 250 ml de água.

Uma solução aquosa B) é preparada, contendo: NaHCO₃ (0,00141 mols, correspondendo a 0,1184 g) em 100 ml de água.

Uma suspensão aquosa C) é preparada, contendo a quantidade necessária de reagentes para nucleação insitu, dentro e nas fibras de colágeno, de 2,8 g de HA multisubstituída, isto é:

95% de Ca(OH)2 (0,0279 mols, correspondendo a 2,176 g) em 35 ml de SBF + 700 ml de H₂O;

MgCl₂*6H₂O (0,00487 mols, correspondendo a 0,990 g) em 100 ml de H₂O;

98% de Si(CH₃COO)₄ (0,000785 mols, correspondendo a 0,218 g) em 100 ml de H₂O. As duas soluções A) e B) são gotejadas simultaneamente (de preferência, separadamente) na suspensão C), mantidas sob agitação a 37°C em cerca de 30 a 60 minutos. Ao final da adição, a mistura é deixada em repouso por 1 hora.

O licor sobrenadante é removido por filtração (ou centrifugação).

O compósito é lavado 3 vezes, cada vez com

300 ml de água.

O produto é filtrado e seco por congelamento. O produto assim obtido tem a seguinte composição:

molar de Mg/Ca = 0,052; molar de CO₃/PO₄ = 0,135; molar de SiO₄/PO₄ = 0,005

Exemplo 2

Preparação do compósito SrSiMgCHA/Col

70/30_SBF

Condições iniciais (solução reagente) - as razões molares iniciais são as seguintes: Razão molar de Mg/Ca = 0,15; Razão molar de S1O4/PO4 = 0,05; Razão molar de CO3/PO4 = 0,15; Razão molar de Sr/Ca = 0,20. Método de operação:

95% de Ca(OH)₂ (0,0279 mols, correspondendo a 2,176 g) em 35 ml de SBF + 700 ml de H₂O;

MgCl₂»6H₂O (0,00487 mols, correspondendo a 0,990 g) em 100 ml de H₂O;

Sr(NO₃)₂ (0,0058 mols, correspondendo a 1,1807 g) em 100 ml de H₂O;

98% de Si(CH₃COO)₄ (0,000785 mols, correspondendo a 0,218 g) em 100 ml de H₂O.

Μ

As duas soluções A) e B) são gotejadas simultaneamente (de preferência, separadamente) na suspensão C), mantidas sob agitação a 37°C em cerca de 30 a 60 minutos.

Ao final da adição, a mistura é deixada em repouso por 1 hora. O licor sobrenadante é removido por filtração (ou centrifugação).

O compósito é lavado 3 vezes, cada vez com

300 ml de água.

ío molar de Mg/Ca = 0,067; molar de Sr/Ca =

0,177; molar de CO₃/PO₄ = 0,139, molar de S1O4/PO4 = 0,006.

A composição do SBF usado nos Exemplos 1 e é a seguinte:

Reagentes	Mols/litro de SBF
NaCl	0,112
NaHCO₃	0,027
KC1	0,005
Na₂HPO₄.2H₂O	0,0010
MgCl₂.6H₂O	0,0015
CaCl₂.2H₂O	0,0025
Na₂SO₄	0,0005
(CH₂OH)₃CNH₂	0,0501
HCI	0,0400

De forma similar, os compósitos SiMgHA/Col 15 70/30 e SrSiMgHA/Col 70/30 foram preparados seguindo 0 mesmo procedimento experimental, eliminado a adição intencional de íons carbonato e o uso do SBF. Obtiveram-se as seguintes razões molares, respeçtivamente:

SiMgHA/Col 70/30; molar de Mg/Ca = 0,066; molar de CO3/PO4 = 0,05; molar de S1O4/PO4 = 0,011.

- SrSiMgHA/Col 70/30; molar de Mg/Ca = 0,069; molar de Sr/Ca = 0,177; molar de CO3/PO4 = 0,06, molar de SiO₄/PO₄ = 0,011.

Além do mais, as condições iniciais dos reagentes (razões molares substituintes dos íons) foram modificadas de modo a obter compósitos com diferentes características de biomimética e capacidade de reabsorção, para serem usados para diversos fins em diferentes áreas de regeneração. A Tabela IV contém, a título de exemplo, os dados das análises químicas de alguns dos compósitos sintetizados.

Tabela IV

	Molar de Mg/Ca	Molar de Sr/Ca	Molar de S1O4/P O₄	CO₃ % em peso na hidroxiapatita substituída
SiMgCHA/Col 70/30	0,044 0,052	-	0-0,15	>4 introd. intencional
SrSiMgCHA/C ol 70/30	0,052 0,067	0,149- 0,187	0-0,15	>4 introd. intencional
SiMgHA/Col 70/30	0,054 0,066	-	0,01 ΙΟ,05	2-3 espontânea
SrSiMgHA/Co 1 70/30	0,064 0,069	0,128- 0,144	0,11 ΙΟ,05	2-3 espontânea

Os compósitos sintetizados foram analisados a partir dos pontos de vista composicional, químico, físico, morfológico e estrutural usando as várias técnicas de análise conhecidas na área (por exemplo: ESEM (Microscopia Eletrônica de Varredura Ambiental), TEM (Microscopia Eletrônica de

Transmissão), XRD (Difração de Raios X), FTIR (espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier), STA (Análise Térmica Simultânea); EDS (Espectroscopia Dispersiva de Energia, conforme ilustrado a título de exemplo nas Figuras acompanhantes de 1 a 6). Em termos gerais, podemos fazer as seguintes observações.

- a introdução dos íons carbonato na síntese limita a introdução de íons silicato na HA substituída.

Na preparação do compósito HA ío multisubstituída/colágeno, era possível sintetizar uma apatita substituída por íons silicato (na posição fosfato, sítio B) limitando o teor dos íons carbonato que pode se tomar conflitante.

De fato, considerando os compostos 15 SiMgHA/Col 70/30 e SrSiMgHA/Col 70/30 preparados sem a adição intencional de íons carbonato, conforme revelado anteriormente, observou-se que, apesar de ocorrer espontaneamente uma carbonação parcial da fase inorgânica constituindo o compósito biohíbrido no sítio B (conforme indicado pelos picos específicos na FTIR), com valores porcentuais dentro da faixa da carbonação biológica, a introdução de íons silicato pode ser obtida sob essas condições (Tabela IV). Portanto, é preferível usar pequenas quantidades iniciais de carbonato (como já indicado acima para a preparação de HAs substituídas não nucleadas no colágeno).

ί*

- A capacidade do íon Sr em promover uma introdução mais elevada de íons Mg na estrutura, isto é, para aumentar o rendimento de incorporação de Mg²⁺, é confirmada.

A presença de íons Sr²⁺ junto com o íon Mg²⁺durante a síntese possibilita aumentar a estabilidade da fase apatita, isto é, contrabalancear o efeito desestabilizante introduzido propriamente dito pelo Mg , e ao mesmo tempo, aumentar o teor de Mg²⁺, que pode ser introduzido na fase inorgânica, como já indicado na síntese apenas da fase inorgânica.

O desenvolvimento de apatitas sintéticas multisubstituídas de acordo com a presente invenção, com um nível controlado e completo de substituições iônicas na estrutura da HA demonstrou ser de extrema importância, pois como já indicado acima, o comportamento do material sintético assim obtido foi idealmente similar ao do osso natural.

O dito comportamento, em particular do ponto de vista da reatividade, solubilidade, integração do implante de apatita, deveu-se não apenas à presença do elemento de dopagem específico/substituintes iônicos no material (e à quantidade mútua destes), mas também ao maior número de defeitos na célula cristalina da HA multisubstituída, defeitos estes que são induzidos exatamente pelo própria presença dos íons substituintes. O Titular descobriu, vantajosamente, que a maior velocidade de dissolução da hidroxiapatita multisubstituída de acordo com a presente invenção está relacionada a um remodelamento ósseo mais rápido ao redor do implante, em relação à hidroxiapatita estequiométrica.

A reatividade aumentada com o osso pré-existente resultou em maior estabilidade no sítio de implante, graças à formação de uma forte ligação mecânica entre o implante e a área circundante. Assim, o tempo de reabilitação para o paciente é reduzido.

Além do mais, ao realizar a nucleação das HAs multisubstituídas de acordo com a presente invenção em materiais de modelo orgânicos auto-organizáveis, natural ou sintéticos (tal como, por exemplo, fibrilas de colágeno de auto-organizáveis), foi possível obter tecidos ósseos sintéticos, isto é, materiais compósitos biohíbridos que possuem as mesmas propriedades dos tecidos ósseos naturais. Tal biomimética foi assegurada pela interação profunda que ocorre entre a fase inorgânica r orgânica durante a síntese da fase inorgânica, graças a um processo que simula in-vivo o processo da osteogênese. A hidroxiapatita multisubstituída e seu compósito biohíbrido correspondente com colágeno de polímeros naturais ou sintéticos adequados, de acordo com a presente invenção, demonstrou ser, portanto, particularmente vantajosa na preparação de um substituto ósseo biomimético, biocompatível e completamente reabsorvível.

Portanto, um dos objetivos da presente invenção é também o seu uso para a preparação do dito substituto ósseo, bem como o substituto ósseo incluindo os mesmos.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Hidroxiapatita multisubstituída com espécies de íons, caracterizada pelo fato de que a referida hidroxiapatita compreende:

Íons Sr²+ e íons Mg²+ em que a razão molar de íons Sr²+ e íons Ca²+ de hidroxiapatita é de 0,002 a 0,35 correspondente a uma razão percentual de razão Sr/Ca de 0,2% a 35% e, em que adicionalmente, sendo o referido Mg²⁺presente na razão molar de íons Mg²⁺ e Ca²⁺ de hidroxiapatita de 0,01 a 0,30, correspondendo a uma razão percentual molar Mg/Ca de 1% a 30%.
2. Hidroxiapatita de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão molar de Sr²⁺ para Ca²⁺ é de 0,02 a 0,30, correspondendo a uma percentagem de razão molar Sr/Ca de 2% a 30%; mais preferencialmente, a razão entre Sr²⁺ e Ca²⁺ é de 0,03 a 0,25, correspondendo a uma percentagem de razão molar Sr/Ca de 3% a 25%.
3. Hidroxiapatita de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a razão molar de Mg²⁺ para Ca²⁺ é de 0,03 a 0,20, correspondendo a uma razão percentual molar Mg/Ca de 3% a 20%.
4. Hidroxiapatita de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreender ainda íons de silicato na razão molar de silicato para fosfato de 0,001 a 0,25, correspondendo a uma percentagem de razão molar SiO₄/PO₄ de 0,1% a 25%.
5. Hidroxiapatita de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida razão de silicato em fosfato ser de 0,005 a 0,20, correspondendo a uma percentagem de razão molar SiO4/PO4 de 0,5% a 20%, de preferência a referida razão de silicato a fosfato é de 0,01 a 0,10, correspondendo a uma razão percentual de relação SiO4/PO4 de 1% a 10%.
6. Hidroxiapatita de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreender ainda íons de carbonato; os referidos íons de carbonato estão presentes numa razão molar

Petição 870170089282, de 20/11/2017, pág. 8/11

2/2 de carbonato para fosfato de hidroxiapatita de 0,01 a 0,80, correspondendo a uma percentagem de razão molar CaCO₃/PO₄ de 1,00% a 80%; de preferência de 0,05 a 0,30, correspondendo a uma percentagem de razão molar de 5% a 30%.
7. Hidroxiapatita de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida hidroxiapatita compreender ainda um polímero natural ou sintético escolhido entre: gelatinas, albuminas, alginatos, goma de gelatina, amidos, quitosanas, celuloses, colágeno, ácido poli-láctico; de preferência, o referido polímero é colágeno.

08. Método para preparar uma hidroxiapatita multisubstituída definida de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que incluir as etapas de:

neutralizar uma suspensão aquosa básica a) de Ca (OH) 2, que compreende íons Sr²+, por adição de uma solução aquosa b) de H3PO4, em que, na referida reação de neutralização, a referida suspensão aquosa a) compreende ainda íons Mg²+.

09. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que suspensão aquosa básica a) de Ca (OH) 2, compreendendo ainda um silicato.
10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que adição da referida solução b) é realizado simultaneamente à adição de solução aquosa de íons de bicarbonato.
11. Uso de Hidroxiapatita definida de acordo com as reivindicações 1 a 7 caracterizado por ser para preparação de um substituto ósseo.

Petição 870170089282, de 20/11/2017, pág. 9/11

CL·

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CONDUTIVIDADE [S/m]

-» SrSiMCHA SiMCHA-3 SrMHA-1 SiCHA-2 SiMHA-2 SiHA-3