BRPI0616223A2

BRPI0616223A2 - combinaÇço de fÁrmacos

Info

Publication number: BRPI0616223A2
Application number: BRPI0616223-1A
Authority: BR
Inventors: Ki Whan Hong; Tomohiro Yoshikawa
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2006-09-14
Publication date: 2011-06-14
Also published as: MY145787A; RU2008114512A; HK1122996A1; AR057520A1; AU2006289752B2; KR20080049822A; NO20081811L; EP1942895B1; EP2275106A1; JP5179354B2; PL1942895T3; SG165379A1; DK1942895T3; EP1942895A1; KR101299320B1; US20090176826A1; AU2006289752A1; US8580818B2; RU2411945C2; CA2620296C

Abstract

COMBINAÇçO DE FÁRMACOS. A presente invenção refere-se a um combinação de fármacos que compreende uma combinação de um dos derivados de tetrazolilalcóxi diidrocarboestirila da fórmula: na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grur alquileno inferior, e a ligação entre as posições 3- e 4- do núcleo do carboestirila significa uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou um sal do mesmo e Probucol, que é útil para a prevenção e o tratamento de infarto cerebral incluindo infarto cerebral agudo e infarto cerebral crônico, arteriosclerose, doenças renais (como por exemplo, nefropatia diabética, insuficiência renal, nefrite) e diabetes devido aos efeitos sinérgicos da combinação na supressão do superóxido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMBINA-ÇÃO DE FÁRMACOS".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um combinação de fármacospara o tratamento e a prevenção do infarto cerebral, arteriosclerose, doen-ças renais, ou diabetes. Mais especificamente, ela se refere a um combina-ção de fármacos para o tratamento e a prevenção do infarto cerebral, arteri-osclerose, doenças renais, ou diabetes, que compreende uma combinaçãode pelo menos um dos derivados da tetrazolilalcóxi diidrocarboestirila dafórmula:

<formula>formula see original document page 2</formula>

na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferi-or, e a ligação entre as posições 3- e 4- do núcleo do carboestirila significauma ligação simples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma e Probucol.

O combinação de fármacos da presente invenção é eficaz sobreo do infarto cerebral, arteriosclerose, doenças renais, ou diabetes, devido àsupressão da atividade do superóxido com base nos efeitos sinérgicos atra-vés da combinação do derivado da tetrazolilalcóxi diidrocarboestirila (1) eProbucol (= 4,4'-isopropillidenoditiobis[2,6-di-terc-butilfenol]).

ANTEDECENTES DA TÉCNICA

O infarto cerebral, incluindo o infarto cerebral agudo e o infartocerebral crônico, também conhecido como acidente cerebrovascular ou tam-bém como cerebromalacia, é ocasionado pela interrupção do suprimento desangue a uma parte do cérebro devido à oclusão ou a coarctação de artériae/ou veia cerebral para resultar na necrose do tecido ou de células do cére-bro. Os fatores de risco mais importantes do mesmo são a hipertensão, do-ença cardíaca, diabetes e dependência de nicotina. Para remediar o infartocerebral é importante a inibição do desenvolvimento de necrose devido aradical livre e a expansão cerebral, tem sido usados anticoagulantes, agen-tes trombolíticos tais como a uroquinase, ativador do tecido plasmogênico(tPA).

A arteriosclerose, cujo termo é quase sempre usado de formaintercambiável com a aterosclerose, está na condição em que as paredesdas artérias de tornam espessas e rígidas e o fluxo de sangue para os ór-gãos e tecidos fica restringido. Embora a causa seja desconhecida, é suspei-to que ela se inicie com danos ou lesões da camada interna de uma artéria ea lesão pode der causada por diversos fatores, incluindo a pressão arterialelevada, colesterol elevado, um irritante (por exemplo, a nicotina) e determi-nadas doenças tais como a diabetes. Para remediar a arteriosclerose, diver-sos fármacos tem sido usados, por exemplo, agentes anticolesterol, (comopor exemplo, probucol, estatinas, clofibratos), agentes antiplaquetas (comopor exemplo, a aspirina), agentes anticoagulantes (como por exemplo, a he-parina, warfarina), agentes de controle da pressão sangüínea (como por e-xemplo, inibidores da enzima de conversão da angiotensina (ACE), bloquea-dores do canal de cálcio).

As doenças renais, incluindo a nefropatia diabética, insuficiênciarenal, e nefrite são características em mudanças funcionais tais como o ex-cesso de filtragem glomerular e abulminúria, e mudanças histológicas taiscomo esclerose glomerular devido ao aumento de proteína de matriz extra-celular. É considerado que as doenças renais são causadas pela alto teorcontinuado de açúcar no sangue, metabolismo intracelular anormal (comopor exemplo, o aumento do trajeto de poliol e do trajeto da hexosamina, e aativação da proteína quinase C (PKC) devido à hiperglicemia, acúmulo deprodutos avançados da glicação (AGE), sobrecarga de pressão devido àhipertensão glomerular ou aumento do esforço de oxidação, e as gênesesmais importantes das doenças renais são o aumento do esforço oxidantebem como a hiperglicemia na luz dos relatos de que os aumentos de oxigê-nio ativo no metabolismo intracelular anormal ou no processo da formaçãodo AGE (cf. Nature, 414, pp. 813 a 820, 2001) e que todo o aumento do tra-jeto da hexosamina, a ativação de PLC e o aumento das AGE são inibidasatravés da inibição do excesso de produção de superóxido no mitocôndrio(cf. Nature1 404, pp. 787 a 790, 2000).

É sabido que a exacerbação da resistência à insulina é um fatorimportante no aparecimento do diabetes, porém a exacerbação da resistên-cia à insulina se torna são somente a patogênese da síndrome metabólicatal como o diabetes porém também promove o aparecimento e o desenvol-vimento de doenças cardiovasculares e doenças renais (cf. Arterioscler. T-hromb. Vasc. Biol., 24, pp.816-823, 2004), e por esse motivo tem sido consi-derado que o aumento da resistência à insulina é útil para o tratamento dodiabetes e das complicações do diabetes. Também é relatado que o esforçode oxidação aumentado pode ser um fator importante para a indução da re-sistência à insulina (cf. Nature, 440, pp. 944-948, 2006), e por esse motivoum inibidor do esforço de oxidação pode ser útil para a prevenção e o trata-mento de diabetes e o aparecimento e o desenvolvimento de doenças renaisna luz do aumento da atividade de resistência à insulina.

Embora a população de pacientes diabéticos com doença renalesteja aumentando de ano para ano, nunca foi encontrada uma terapia ade-quada para o tratamento das doenças renais.

A propósito, tem sido conhecido que o oxigênio é essencial paraum corpo vivo com a finalidade da manutenção da vida, por exemplo, para amanutenção da produção normal de energia e metabolismo. O oxigênio po-de ser mudado para o assim chamado oxigênio ativo no corpo vivente. Ooxigênio ativo inclui o oxigênio radical e o oxigênio não radical. Entre o oxi-gênio ativo em um sentido amplo incluindo os materiais relacionados com oslipídios, este último oxigênio radical inclui um radical hidroxila (OH), um radi-cal alcóxi, um radical peróxido, um radical hidro peróxido, um monóxido denitrogênio, um dióxido de nitrogênio, superóxido (O2 ), etc. O grupo de oxi-gênio não radical mais recente inclui um oxigênio simples, peróxido de hi-drogênio (H2O2), um hidroperóxido de lipídio, etc.

Como um oxigênio ativo que pode ser eficaz em células de teci-do, existem os oxigênios radicais de O2" e OH e o oxigênio não radical deH2O2 (cf. YAKUGAKU ZASSHI 122(3), pp.203-218 (2002)). O O2- produzoxigênio e peróxido de hidrogênio através da ação da dismutase superóxido(SOD) no corpo com vida. O peróxido de hidrogênio é mudado em OH atra-vés da ação catalítica do íon ferro, íon cobre incluído nas células. O radicalhidroxila ataca diretamente as proteínas do DNA no corpo vivo. Por outrolado, o radical hidroxila reage com os lipídios e por mio disso é convertidoem radical lipídio e em seguida produz hiproperóxido de lipídio.

Desse modo, esses oxigênios ativos tais como OH, H2O2 quetêm relação com doenças sérias, são em sua maioria causados pelo O2", epor esse motivo, tem sido necessário encontrar uma substância que sejacapaz de suprimir o O2".

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores estudaram intensivamente as ativida-des farmacológicas da combinação do derivado (1) de tetrazolilalcóxi diidro-carboestirila que é conhecido como tendo uma atividade ativa de supressãode oxigênio com um agente anti-hiperlipêmico conhecido, Probucol, e des-cobriram que a combinação exibe uma excelente atividade sinérgica antioxi-dante bem como uma excelente atividade sinérgica com relação a supressãodo superóxido de causa o infarto cerebral, a arteriosclerose e as doençasrenais, e ainda exibe um melhoramento significativo da resistência à insulinae diminui de forma marcante a excreção urinária de glicose que é um dosíndices com relação às disfunções renais, e em seguida descobriram que acombinação do derivado (1) de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila e Probucolé efetiva com relação à prevenção e/ou o tratamento de infarto cerebral, ar-teriosclerose, doenças renais (como por exemplo a nefropatia diabética, in-suficiência renal, nefrite) ou diabetes devido à excelente atividade de su-pressão do superóxido.

Assim, um objetivo da presente invenção é o de prover um com-binação de fármacos para a prevenção e o tratamento do infarto cerebralcompreendendo um derivado(1) de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila e Pro-bucol.

Outro objetivo da invenção é o de prover um combinação defármacos para a prevenção e o tratamento de arteriosclerose compreenden-do um derivado(1) de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila e Probucol.

Um outro objetivo da invenção é o de prover um combinação defármacos para a prevenção e o tratamento de doenças renais compreen-dendo um derivado(1) de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila e Probucol.

Um outro objetivo da invenção é o de prover um combinação defármacos para a prevenção e o tratamento de diabetes, compreendendo umderivado(1) de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila e Probucol.

Um objetivo adicional da invenção é o de prover um supressorde superóxido aperfeiçoado que compreende uma combinação do deriva-do(1) de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila e Probucol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um gráfico que mostra a correlação entre a concen-tração de Cilostazol e a produção de O2" dependente de NAD(P)H na inibi-ção somente pelo Cilostazol ou por uma Combinação de Cilostazol e Probu-col sobre a produção de O2" dependente de NAD(P)H.

A figura 2 é um gráfico que mostra os efeitos de inibição de 0,3%de Cilostazol isolado, 0,1% de Probucol isolado ou uma combinação de0,3% de Cilostazol e de 0,1% de Probucol sobre a lesão aterosclerótica emcamundongos com o receptor de lipoproteína de baixa densidade derrubado,alimentados com colesterol elevado.

A figura 3 é um gráfico que mostra os efeitos de inibição de 0,3%de Cilostazol isolado, 0,5% de Probucol isolado ou uma combinação de-0,3% de Cilostazol e de 0,5% de Probucol sobre a lesão aterosclerótica emcamundongos com o receptor de lipoproteína de baixa densidade derrubado,alimentados com colesterol elevado.

A figura 4 é um gráfico que mostra os efeitos de Probucol e Ci-Iostazol isolados e de uma combinação de Probucol e Cilostazol contra lesãocerebral focai em ratos.

A figura 5 é um gráfico que mostra os efeitos de Probucol e Ci-lostazol isolados e de uma combinação de Probucol e Cilostazol contra aexcreção urinária de glicose em ratos.

A figura 6 é um gráfico que mostra os efeitos de Probucol e Ci-lostazol isolados e de uma combinação de Probucol e Cilostazol contra aresistência à insulina em ratos.

DESCRIÇÃO DETLHADA DA INVENÇÃO

O derivado de carbostirial a ser incluído como um componentedo combinação de fármacos da presente invenção são os derivados de te-trazolilalcóxi-diidrocarboestirila da fórmula:

<formula>formula see original document page 7</formula> na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferi-or, e a ligação entre as posições 3- e 4- do núcleo do carboestirila significauma ligação simples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma e Probucol.

Na fórmula (1) acima, o grupo cicloalquila inclui grupos de C3-C8cicloalquila tais como o ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ci-cloheptila, e ciclooctila. O de preferência é o ciclohexila. O grupo alquilenomais baixo inclui os grupos de CrC6 alquileno tais como metileno, etileno,propileno, tetrametileno, butireno, e pentileno, entre os quais o de preferên-cia é o tetrametileno.

O derivado de carboestirila de preferência é o 6-{4-(1 -ciclohexil-1H-tetrazol-5-il)butóxi]-3,4-diidrocarboestirila, que foi colocado no mercadosob o nome comercial de Cilostazol como um agente antiplaquetas.

Esses derivados da carboestirila (1) e os sais dos mesmos e umprocesso para a preparação dos mesmos estão descritos na Patente U.S.4.277.479. Também está descrito na Patente U.S. 6.743.806 que os deriva-dos (1) do carboestirila têm uma atividade de supressão do oxigênio ativo.

Um outro ingrediente ativo, o Probucol é um composto que temum nome químico de 4,4'-isopropilidenoditiobis[2,6-di-terc-butilfenol], e já foicolocado no mercado como um agente antilipidêmico. Também é sabido queesse composto tem uma atividade de inibição da produção de LDL oxidado(lipoproteína de baixa densidade) (cf. J. Clin. Invest., 77, p.641, 1986).

Esses ingredientes ativos, um derivado (1) de carboestirila e oProbucol podem ser administrados em conjunto ou de modo separado, aomesmo tempo ou em tempos diferentes. Esses ingredientes podem ser utili-zados de forma usual em uma formulação farmacêutica convencional. Emseguida, esses ingredientes podem ser preparados na formulação farmacêu-tica em uma forma de dosagem única ou em formas de dosagem separadas.

As formas de dosagem não são especificadas, porém podem ser quaisquer formulações farmacêuticas convencionais, por exemplo, prepara-ções para a administração oral, tais como comprimidos, cápsulas, grânulos,diversas preparações líquidas adequadas para a administração oral, ou pre-parações para a administração parenteral, tais como injeções e supositórios.

A dose desses ingredientes ativos não está limitada a uma faixaespecífica. Os derivados (1) de carboestirila ou um sal dos mesmos podemser usados em uma quantidade de 50 até 200 mg por dia em um adulto (50kg de peso corporal), que é administrada uma vez por dia ou dividida emduas a várias vezes por dia. O Probucol pode ser usado em uma quantidadede 100 até 1000 mg por dia em um adulto (50 kg de peso corporal), que po-de ser administradas de uma só vez porém pode de preferência ser adminis-trada através da divisão da dose diária em duas ou várias vezes por dia.Quando esses ingredientes são preparados em uma forma de dosagem úni-ca, eles são incorporados em uma proporção de 0,25 até 10 partes em pesode Probucol por uma parte em peso do derivado (1) de carboestirila ou umsal do mesmo.

As preparações tais como os comprimidos, cápsulas, líquidospara administração oral podem ser preparadas através de um método con-vencional. Os comprimidos podem ser preparados através da misturação doou dos ingredientes ativos com veículos farmacêuticos convencionais taiscomo a gelatina, amidos, lactose, estearato de magnésio, talco, goma arábi-ca, e os similares. As cápsulas podem ser preparadas através da misturaçãocom enchimentos ou diluentes farmacêuticos inertes e cheias em uma cáp-sula de gelatina rígida ou cápsula macia. As preparações líquidas orais taiscomo os xaropes ou elixires são preparados através da misturação do oudos ingredientes ativos e agentes adoçantes (como por exemplo, a sacaro-se), conservantes (como por exemplo o metil parabeno, propil parabeno),corantes, flavorizantes, e os similares. As preparações para a administraçãoparenteral também podem ser preparadas através de um método conven-cional, por exemplo, através da dissolução do ingrediente ou ingredientesativos da presente invenção em um veículo aquoso esterilizado, de prefe-rência água ou uma solução salina. A preparação líquida adequada de prefe-rência para a administração parenteral é preparada através da dissolução dadose diária dos ingredientes ativos como mencionados acima em água e umsolvente orgânico e ainda em um polietileno glicol que tenha um peso mole-cular de 300 até 5000, que é de preferência incorporado com um lubrificantetal como a carboximetil celulose de sódio, metilcelulose, polivinil pirrolidona eálcool de polivinila. As preparações líquidas acima podem de preferência serainda incorporadas com um desinfetante (como por exemplo, álcool de ben-zila, fenol, timerosal), um fungicida, e ainda opcionalmente com um agenteisotônico (como por exemplo, a sacarose, cloreto de sódio) um anestésicotópico, um estabilizador, um tampão, e os similares. Com vista em manter aestabilidade, a preparação para a administração parenteral pode ser cheiaem uma cápsula, seguida pela remoção do meio aquoso através de umatécnica de liofilização convencional e ser recuperada em uma preparaçãolíquida através da dissolução em um meio aquoso quando usada.

De acordo com a presente invenção, através da combinação doderivado (1) do carboestirila, especificamente o 6-{4-(1 -ciclohexil-1 H-tetrazol-5-il)butóxi]-3,4-diidrocarboestirila ou um sal do mesmo com o Probucol, elessão eficazes sobre o infarto cerebral, a arteriosclerose, doenças renais (co-mo por exemplo, nefropatia diabética, insuficiência renal, nefrite, ou diabe-tes.

Um dos mecanismos para a exibição de tais efeitos pode serdevido à excelente atividade de supressão do superóxido, isto é, eles exi-bem uma excelente atividade sinérgica antioxidante e efeitos sinérgicos desupressão do superóxido, através do qual o superóxido que afeta as célulasdo tecido é removido eficazmente. Alem disso, através da supressão do su-peróxido, resulta também na inibição da produção de OH, H2O2, que sãoderivados a partir do superóxido. O combinação de fármacos da presenteinvenção também pode inibir a produção de oxigênios ativos tais como O2"-,OH, H2O2, que são as causas principais de doenças graves. É sabido que osuperóxido causa o infarto cerebral (por exemplo, o infarto cerebral agudo,infarto cerebral crônico), arteriosclerose, doenças renais (como por exemplo,a nefropatia diabética, insuficiência renal, nefrite) (cf. Antioxidants & RedoxSignaling, 5, 2003, pp.597 a 607, que descreve a participação de O2 " no in-farto cerebral; Circ. Res., 86, 2000, pp. 494-501, que descreve que aNAD(P)H oxidase produz O2'- e que participa nas doenças do sistema circu-latório tais como a arteriosclerose; Eur. J. Pharmacol., 450, 2002, pp. 67-76,que descreve a participação de O2'- nas doenças renais).

Desse modo, através dos efeitos sinérgicos de supressão dosuperóxido, a combinação do derivado (1) do carboestirila e Probucol da pre-sente invenção pode exibir os efeitos desejados com relação à prevenção eo tratamento do infarto cerebral, arteriosclerose, doenças renais (como porexemplo, a nefropatia diabética, insuficiência renal, nefrite) ou diabetes.

EXEMPLOS

A presente invenção é ilustrada pelos exemplos de preparação eos experimentos de supressão da atividade do superóxido pelo agente depresente invenção, que se seguem e que porem não devem ser considera-dos como sendo Iimitativos da mesma.

PREPARAÇÃO 1.

Preparação de comprimidosComponentes Quantida-

de (g)

6-[4-(1 -ciclohexil-1 H-tetrazol-5-il)butóxi]-3,4-diidrocarboestirila 100

Probucol 250

Lactose (Farmacopéia Japonesa) 40Amido de milho (Farmacopéia Japonesa) 40

Celulose cristalina ( Farmacopéia Japonesa) 20

Hidróxipropil metilcelulose (Farmacopéia Japonesa) 4Estearato de magnésio (Farmacopéia Japonesa) 2

Os ingredientes ativos acima da presente invenção, a lactose, oamido de milho e a celulose cristalina são bem-misturados e a mistura é gra-nulada com uma solução aquosa a 5% de hidroxipropil metilcelulose, e amistura granulada é passada por uma peneira de tela com malha 200 parasecar os grânulos cuidadosamente, e em seguida os grânulos são compri-midos através de um método convencional para dar os comprimidos (1000comprimidos)

EXPERIMENTOS FARMACOLÓGICOS.EXPERIMENTO 1

Inibição Sinérgica pela Combinação de Cilostazol e Probucol15 sobre a Produção de O2 " dependente de NAD(P)H1 a partir de Células Endo-teliais Vasculares Humanas.

[1] Materiais e Métodos:

Culturas de células: HCAEC (células endoteliais de artéria coro-nária humana) foram cultivadas no meio basal -2 de célula endotelial BulletKit (EGM-2). As células foram cultivadas até a confluência à 37SC e, 5% deCO2 e usadas para os experimentos em uma passagem não maior do que 6.

Os materiais em teste foram (1) Cilostazol isolado (n = 4),[2]Probucol isolado (n = 4), [3] uma mistura de Cilostazol e de Probucol (n = 4):as concentrações finais com relação ao Cilostazol foram de 0,3, 1,0 e 3,0 μΜe do Probucol 0,01, 0,03 e 0,1 μΜ, que foram correspondentes à proporçãode Cilostazol e de Probucol entre 3:1 e 300:1 em peso molecular.MEDIÇÃO DO SUPERÓXIDO:

O Cilostazol e o Probucol foram dissolvidos em sulfóxido de di-metila como soluções-padrão de 10 nM. Imediatamente depois da adição doCilostazol e/ou do Probucol nas concentrações finais de 0,3, 1,0 e 3,0 μΜ ede 0,01, 0,03 e 0,1 μΜ, respectivamente dento do meio de cultura, foi adi-cionado TNF-a (50 ng/ml) e as HCAEC foram incubadas durante 4 horas.Depois que as células foram expostas ao TNF-α, os homogenatos endoteli-ais foram colocados dentro do luminômetro Microlumat LB96P, EG & G Ber-thold). Imediatamente antes de registrar a luminescência química, NADH eNADPH (concentração final, 100 mM cada um) foram adicionados, e a Iuci-genina adaptada ao escuro (nitrato de bis-N-metilacrinídio) foi adicionadaatravés de um autodispensador. A intensidade da luminescência química foiregistrada a cada 30 segundos durante 15 minutos, e os fundamentos res-pectivos foram subtraídos. A luminescência química foi expressa como con-tagens por segundo por miligrama de proteína.

A ANÁLISE ESTATÍSTICA FOI FEITA DA MANEIRA QUE SE SEGUE:

(1) Os efeitos do Cilostazol isolado e do Probucol isolado foramcomparados com os efeitos da combinação dos mesmos através do teste deDunnett.

(2) Com a finalidade de avaliar os efeitos sinérgicos da suacombinação, uma analise em dois sentidos da variação (ANOVA de doissentidos) foi executada entre o Controle, Cilostazol isolado, Probucol, isola-do e a combinação dos mesmos.

Todos os testes foram feitos através de teste de dois lados, comum nível significativo de 5% por meio de um software SAS (SAS Institute,Japão, R8.1).

(3) Resultados:

Os resultados são mostrados na figura 1 em anexo. Na figura 1,o eixo longitudinal significa a produção de O2" dependente de NAD(P)H, (%do Controle), e o eixo da abscissa significa a concentração de Cilostazol(μΜ, a linha com a marca de um romboedro significa os dados do Cilostazolisolado, isto é, sem o Probucol (PO), a linha com uma marca de um quadra-do significa os dados de uma mistura de Cilostazol com Probucol em umaquantidade de 0,01 μΜ, a linha com a marca de um triângulo significa os da-dos de uma mistura de Cilostazol com Probucol em uma quantidade de 0,03μΜ, e a linha com uma marca de "x" significa os dados de uma mistura deCilostazol com Probucol em uma quantidade de 0,1 μΜ.

Como é observado na figura 1, quando o Cilostazol foi usado emcombinação com o Probucol, a produção de O2" foi inibida de modo significa-tivo em comparação com o Cilostazol isolado. Além do mais, o efeito de su-pressão foi significativamente potenciado através da combinação de 3 μΜ deCilostazol e 0,1 μΜ de Probucol (p = 0,0322 através de ANOVA de dois sentidos).

EXPERIMENTO 2

Efeitos do Cilostazol e do Probucol Isolados e em Combinaçãosobre a Aterosclerose em Camundongos com o Receptor de Lipoproteína deBaixa Densidade Derrubado, Alimentados com Colesterol Elevado.

(1) Materiais e Métodos:

Foram usados camundongos com o receptor de lipoproteína debaixa densidade derrubado (LDLR-KO) (J. Clin. Invest. 1993; 92: 883-893)(machos, com 9 semanas de idade, que foram preparados por e mantidos naOtsuka Pharmaceutical Co. Ltd.). Os animais foram tratados por grupamentonos seus grupos que se seguem:

1) Grupo de controle (n = 13)

2) Grupo administrado com 0,3% de Cilostazol (n = 14)

3) Grupo administrado com 0,1% de Probucol (n = 14)

4) Grupo administrado com 0,5% de Probucol (n = 14)

5) Grupo administrado com 0,3% de Cilostazol + 0,1% de Probu-col (n = 14)

6) Grupo administrado com 0,3% de Cilostazol + 0,5% de Probu-col (n = 14).

Antes do início do experimento, o peso corporal dos animais e ototal de colesterol foram medidos, e com base em ambos os dados, ao ani-mais foram divididos em seis grupos de forma aleatória através do métodoaleatório estratificado (Sofware SAS, R8.1). As doses de Probucol e de Cilos-tazol foram determinadas com base nos relatórios (Horm. Metab. Res. 2001;33: 472-479, e J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005; 313: 502-509), respectiva-mente. No grupo de controle, os camundongos foram administrados comuma dieta de alto teor de gordura [isto é, uma ração convencional (CRF-1fabricada por Oriental Yeast Industries Co. Ltd.) suplementada com coleste-rol (1,25%) colato de sódio (0,5%) e manteiga de cacau (15%)],e no grupoadministrado com o material em teste, os camundongos foram administradoscom a dieta de alto teor de gordura com Cilostazol (0,3%) e/ou Probucol(0,1% ou 0,5%). A dieta de alto teor de gordura foi administrada aos camun-dongos LDLR-KO (desde as 9 semanas de idade) com a finalidade de indu-zir a arteriosclerose (no grupo de controle). Nos grupos da administração domaterial em teste, a dieta de ato teor de gordura misturada com o materialem teste foi administrada aos camundongos (desde as 9 semanas de idade).

Os camundongos em ambos os grupos foram dissecados em oito semanasdepois do inicio da administração da dieta. A lesão aterosclerótica foi avalia-da através da pegada da aorta total sob anestesia, expondo a face internada aorta e manchando as gorduras com Sudan IV. A área da lesão ateros-clerótica (que continha as gorduras/lipídios) em toda a aorta foi contada a-través da análise de imagem das áreas manchadas e a área total da aorta.

A ANÁLISE ESTATÍSTICA FOI FEITA DA MANEIRA QUE SE SEGUE:

1) Com a finalidade de confirmar os efeitos sinérgicos da combi-nação de Cilostazol e de Probucol, foi feita uma ANOVA em dois sentidosentre o grupo de controle e o grupo administrado com Cilostazol, bem comoentre o grupo administrado com o Probucol e dois grupos administrados como agente, e por meio disso foi observada a interação.

2) Os efeitos no grupo administrado com Cilostazol e Probucolforam comparados aos efeitos no grupo de controle através do teste deDunnett. Alem disso, os efeitos nos grupo administrado com Cilostazol ecom Probucol foram comparados com os efeitos do grupo administrado com

Cilostazol + Probucol através do teste de Dunnett.

(2) Resultados:

A área da lesão aterosclerótica foi calculada como uma propor-ção (%) da área manchada por Sudan IV com relação a área total da aorta.Os valores médios + do desvio padrão foram de 10,1 ± 4,7% no grupo deControle, 6,6 ± 2,6% no grupo administrado com Cilostazol, 6,2 ± 2,6% nogrupo administrado com 0,1% de Probucol, 4,7 ± 1,2% no grupo administra-do com 0,5% Probucol, 3,8 ± 1,2% no grupo administrado com Cilostazol +0,1% de Probucol, e de 2,9 ± 1,52% no grupo administrado com Cilostazol +0,5% de Probucol.

Como mostrado na figura 2 e na figura 3,o Cilostazol (0,3%) e oProbucol (0,1 e 0,5%) inibiram significativamente a lesão aterosclerótica noscamundongos LDLR-KO. Além disso, quando as combinações dos dois a-gentes foram administradas a arteriosclerose foi inibida de forma mais poten-te em cada uma das combinações com as doses de Probucol.EXPERIMENTO 3

Efeitos de Cilostazol e de Probucol Isolados e em Combinaçãocontra Lesão Cerebral Isquêmica Focai em Ratos.

(1) Materiais e Métodos.Ratos Spragle-Dawley machos pesando de 280 a 320 g foram

anestesiados com pentobarbital sódico (20 mg/kg, i.p.) e colocados em umcoxim de aquecimento (Homeothermic Blanket System, Harvard Apparatus,South Natick, MA) para ser mantida uma temperatura retal constante (37 +0,5QC). A pressão arterial sistêmica, o gás no sangue arterial e o pH forammedidos antes, durante e depois de 22 horas da reperfusão.

A isquemia cerebral focai foi induzida através da oclusão transi-tória da artéria média cerebral esquerda (MCA) como anteriormente descrito(Stroke 1989; 20:84-91). Fio de sutura cirúrgica de náilon (tamanho 3-0) coma ponta redonda foi avançado a partir da artéria carótida externa para dentrodo lúmen da artéria carótida interna até o bloqueio do fluxo da MCA. Duashoras depois da oclusão da MCA, a reperfusão foi permitida pela retirada dofio de sutura até que a ponta saiu da artéria carótida interna.

Para a analise do infarto cerebral, a 22 horas da reperfusão de-pois de 2 horas de ter parado a oclusão da MCA, os ratos foram administra-dos com uma overdose de tiopental sódico e decapitados e em seguida oscérebros foram rapidamente removidos e congelados por suspensão em ni-trogênio líquido. Os cérebros foram cortados em blocos coronarianos de 2mm de espessura. As fatias de cérebro foram imersas em uma solução a 2%de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) em solução salina normal a 37eCdurante 30 minutos e em seguida fixados em formalina tamponada com 10%de fosfato a 4-C. As fatias de cérebro manchadas com TTC foram fotografa-das com a utilização de uma câmera de vídeo CCD e o tamanho de um in-farto foi calculado com um sistema de analise de imagem(lmage-Pro Plus,Media Cybemetics1 Maryland) e expressos como a percentagem de tecidoenfartado com relação ao hemisfério "ipsilateral".

Cilostazol e Probucol foram dissolvidos em sulfóxido de dimetila(DMSO) como uma solução base de 30 mg/ml e diluída para 10 mg/ml comsolução salina tamponada com fosfato, respectivamente. Em um grupo, osratos receberam por via oral 20 mg/kg de cilostazol duas vezes a 5 minutose 4 horas depois de ser completada a oclusão da MCA, respectivamente. Ooutro grupo de ratos recebeu 30 mg/kg de probucol duas vezes por via oral à5 minutos e 4 horas depois de ser completada a oclusão da MCA, respecti-vamente. O grupo de ratos da combinação foram tratados com 20 mg/kg decilostazol mais 30 mg/kg de probucol por via oral em duas vezes, respecti-vamente. O grupo do veículo recebeu uma solução a 30% de DMSO (300 ul)por via oral sem cilostazol/probucol.

A analise estatística foi feita da seguinte maneira. Os dados fo-ram expressos como o S.E.M. + médio. A comparação dos resultados dasáreas hemisféricas enfartadas entre os grupos foi analisada através da aná-lise das medidas das variações seguida pelos testes de comparação múltiplade Turkey como uma comparação post hoc. As diferenças foram considera-das estatisticamente significativas à P < 0,05.

(2) Resultados:

A zona isquêmica cerebral foi identificada de forma consistenteno córtex e striatum do hemisfério cerebral esquerdo como uma área sepa-rada manchada de claro nos ratos submetidos a 2h de isquemia e 22 horasde reperfusão. Como mostrado na figura 4 em anexo, a área do infarto foireduzida marginalmente quando os animais receberam por via oral 20 mg/kgde cilostazol duas vezes a 5 minutos e à 4 horas depois de serem completa-da as duas horas de isquemia, enquanto que 30 mg/kg de probucol foi semefeito. O tratamento com cilostazol (20 mg/kg) e probucol (30 mg/kg) emcombinação reduziu de forma significativa a área hemisférica do infarto ce-rebral quando comparada com aquela do veículo, indicativo de um efeitosinérgico potente da terapia de combinação.

EXPERIMENTO 4

Efeitos do Probucol e do Cilostazol Isolados e em Combinaçãocontra a Excreção Urinária de Glicose e Resistência à insulina em Ratos.

[1] Material e Métodos.

Ratos machos Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) (6semanas de idade) foram divididos de forma aleatória nos quarto grupos quese seguem dependendo dos pesos corporais através do método aleatórioestratifiçado (usando o software SAS R8.1):

i) Grupodecontrole η = 10

ii) Grupo administrado com 0,3% de Cilostazol η = 10

iii) Grupo administrado com 0,5% de Probucol η = 10

iv) Grupo administrado com 0,3% de Cilostazol

+ 0,5% de Probucol η = 9

Imediatamente depois do agrupamento aleatório, foi administra-da uma dieta de alto teor de gordura ração comercialmente adequada (CRF-1 fabricada por Oriental Yeast Industries Co. Ltd.) suplementada com coles-terol (1,25%) colato de sódio (0,5%) e manteiga de cacau (15%)] aos ratosem cada um dos grupos com a finalidade de promover o aparecimento dadoença renal. Nos grupos administrados com o material do teste, a dieta dealto teor de gordura combinada com o material de teste foi administrada acada um dos camundongos imediatamente depois do agrupamento.

Na décima primeira semana depois do início da alimentação, oscamundongos foram sangrados a partir da veia da cauda sem anestesia, eglicose do plasma e o nível de insulina no plasma foram medidos. Separa-damente a urina foi colhida e a glicose na urina foi medida. A glicose foi me-dida através de um método enzimático com a utilização de um kit comerci-almente disponível para a medição de glicose, e a insulina foi medida atra-vés de um kit de ELISA comercialmente disponível.

A analise estatística foi feita da seguinte maneira:

1) Com a finalidade de confirmar os efeitos sinérgicos dacombinação de Cilostazol e Probucol1 foi executada uma ANOVA de duasdireções entre o grupo de controle e o grupo administrado com Cilostazol,bem como entre o grupo administrado com Probucol e o grupo administradocom os dois agentes, e por meio disso foi observada a interação.

2) Os efeitos no grupo administrado com Cilostazol e Pro-bucol foram comparados com os efeitos no grupo de controle através do tes-te de Dunnett. Além disso, os efeitos no grupo administrado com Cilostazol eProbucol foram comparados com os efeitos no grupo administrado com Ci-lostazol + Probucol através do teste de Dunnett.

Todos os testes foram feitos em teste de dois lados com um ní-vel significativo de 50% por meio do software SAS (SAS Institute Japan,R8.1) Os dados moram exibidos pela media ± SD (n).

[2] Resultados:

1) Os efeitos da combinação dos dois agentes sobre a gli-cose urinária:

O grupo de controle mostrou um nível de glicose urinária de 186±171 mg/dl (n=10) que foi muito mais alta do que os dados nos ratos nor-mais (menos do que 10 mg/dl). Nos grupos administrados com Cilostazol eProbucol cada um de forma isolada, a glicose urinária foi inibida de formasignificativa, cada dado sendo de 11 ± 2 mg/dl (n = 10) e 11 ±3 mg/dl (n =10), respectivamente, porém no grupo administrado com a combinação dosdois agentes, a glicose urinária foi inibida de forma mais significativa, como 8± 1 mg/dl (n = 9). Esses resultados são mostrados na figura 5 em anexo.

2) Os efeitos da combinação dos dois agentes sobre a re-sistência à insulina:

O grupo de controle mostrou um nível normal de glicose noplasma de 162 ± 16 mg/dl, porém mostrou um nível de insulina no plasmamaia alto de 9,9 ± 5,0 mg/ml (n = 10) em comparação com os dados nos ra-tos normais. Embora tanto o Cilostazol como o Probucol não mostraram ne-nhum efeito sobre a glicose no plasma, a combinação de Cilostazol com oProbucol mostrou efeitos significativos de inibição sobre o nível de insulinano plasma quando comparados com a administração do Cilostazol ou doProbucol isoladamente. Os resultados estão mostrados na figura 6 em ane-xo.

Desse modo, o combinação de fármacos de Cilostazol e de Pro-bucol exibiu excelentes efeitos de melhoria sobre a resistência à insulina.

Claims

1. Agente para a prevenção e o tratamento de infarto cerebral,caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de pelo menosum de derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila da fórmula<formula>formula see original document page 20</formula> na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferior, e a liga-ção entre as posições 3- e 4- do núcleo do carboestirila significa uma ligaçãosimples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma e Probucol.

2. Agente para a prevenção e o tratamento da arteriosclerose,caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de pelo menosum de derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) como definida nareivindicação 1, e Probucol.

3. Agente para a prevenção e o tratamento de doenças renais,caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de pelo menosum de derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) como definida nareivindicação 1, e Probucol.

4. Agente para a prevenção e o tratamento de diabetes, caracte-rizado pelo fato de que compreende uma combinação de pelo menos um dederivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) como definida na reivindi-cação 1, e Probucol.

5. Supressor de superóxido, caracterizado pelo fato de quecompreende uma combinação de pelo menos um de derivados de tetrazoli-lalcóxi-diidrocarboestirila (1) como definidas na reivindicação 1, e Probucol.

6. Agente para a prevenção e o tratamento de infarto cerebral,caracterizado pelo fato de que compreende um supressor de superóxido quecompreende uma combinação de pelo menos um dos derivados de tetrazo-lilalcóxi-diidrocarboestirila da fórmula:<formula>formula see original document page 21</formula>na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferior, e a liga-ção entre as posições 3- e 4- do núcleo do carboestirila significa uma ligaçãosimples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma e Probucol.

7. Agente para a prevenção e o tratamento da arteriosclerose,caracterizado pelo fato de que compreende um supressor de superóxido quecompreende uma combinação de pelo menos um dos derivados de tetrazoli-lalcóxi-diidrocarboestirila (1), como definido na reivindicação 6, e Probucol.

8. Agente para a prevenção e o tratamento de doenças renais,caracterizado pelo fato de que compreende um supressor de superóxido quecompreende uma combinação de pelo menos um de derivados de tetrazoli-lalcóxi-diidrocarboestirila (1) como definido na reivindicação 6, e Probucol.

9. Agente para a prevenção e o tratamento de diabetes, carac-terizado pelo fato de que compreende um supressor de superóxido quecompreende uma combinação de pelo menos um de derivados de tetrazoli-lalcóxi-diidrocarboestirila (1) como definido na reivindicação 6, e Probucol.

10. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 9, caracterizado pelo fato de que o derivado de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila é a 6-{4-(1-ciclohexil-1H-tetrazol-5-il)butóxi]-3,4-diidrocar-boestirila ou um sal da mesma.

11. Método para a prevenção e o tratamento de infarto cerebral,caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma combi-nação de uma quantidade eficaz de pelo menos um dos derivados de tetra-zolilalcóxi-diidrocarboestirila da fórmula:na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferior, e a liga-ção entre as posições 3- e 4- do núcleo da carboestirila significa uma ligaçãosimples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma e uma quantidade eficazde Probucol a um sujeito que esteja necessitando do mesmo.

12. Método para a prevenção e o tratamento de arteriosclerose,caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma combi-nação de uma quantidade eficaz de pelo menos um dos derivados de tetra-zolilalcóxi-diidrocarboestirila como definidas na reivindicação 11, e umaquantidade eficaz de Probucol a um sujeito que esteja necessitando do mesmo.

13. Método para a prevenção e o tratamento de doenças renais,caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma combi-nação de uma quantidade eficaz de pelo menos um dos derivados de tetra-zolilalcóxi-diidrocarboestirila como definida na reivindicação 11, e uma quan-tidade eficaz de Probucol a um sujeito que esteja necessitando do mesmo.

14. Método para a prevenção e o tratamento de diabetes, carac-terizado pelo fato de que compreende a administração de uma combinaçãode uma quantidade eficaz de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcó-xi diidrocarboestirila como definidas na reivindicação 11, e uma quantidadeeficaz de Probucol a um sujeito que esteja necessitando do mesmo.

15. Método para a supressão de superóxido, caracterizado pelofato de que compreende a administração de uma combinação de uma quan-tidade efeti eficaz va de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila como definidas na reivindicação 11, e uma quantidadeeficaz de Probucol a um sujeito que esteja necessitando do mesmo.

16. Método para a prevenção e o tratamento de infarto cerebral,caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quanti-dade eficaz de um supressor de superóxido que compreende uma combina-ção de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila dafórmula:<formula>formula see original document page 23</formula>na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferior, e a liga-ção entre as posições 3- e 4- do núcleo do carboestirila significa uma ligaçãosimples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma e Probucol a um sujeitoque esteja necessitando do mesmo.

17. Método para a prevenção e o tratamento de arteriosclerose,caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quanti-dade eficaz de um supressor de superóxido que compreende uma combina-ção de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1)como definidas na reivindicação 16, e Probucol a um sujeito que esteja ne-cessitando do mesmo.

18. Método para a prevenção e o tratamento de doenças renais,caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quanti-dade eficaz de um supressor de superóxido que compreende uma combina-ção de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1)como definidas na reivindicação 16, e Probucol a um sujeito que esteja ne-cessitando do mesmo.

19. Método para a prevenção e o tratamento de diabetes, carac-terizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidadeeficaz de um supressor de superóxido que compreende uma combinação depelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) comodefinidas na reivindicação 16, e Probucol a um sujeito que esteja necessi-tando do mesmo.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 19, caracterizado pelo fato de que o derivado de tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) é a 6-{4-(1-ciclohexil-1H-tetrazol-5-il)butóxi]-3,4-diidrocarboestirila ou um sal da mesma.

21. Uso de uma combinação de pelo menos um dos derivadosde tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila da fórmula:<formula>formula see original document page 24</formula>na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferior, e a liga-ção entre as posições 3- e 4- do núcleo da carboestirila significa uma ligaçãosimples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma e Probucol, caracteriza-do pelo fato de que é para a preparação de um fármaco para a prevenção eo tratamento de infarto cerebral.

22. Uso de uma combinação de pelo menos um dos derivadosde tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) de acordo com a reivindicação 21, eProbucol, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um fármacopara a prevenção e o tratamento de arteriosclerose.

23. Uso de uma combinação de pelo menos um dos derivadosde tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) de acordo com a reivindicação 21, eProbucol, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um fármacopara a prevenção e o tratamento de doenças renais.

24. Uso de uma combinação de pelo menos um dos derivadosde tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) de acordo com a reivindicação 21, eProbucol, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um fármacopara a prevenção e o tratamento de diabetes.

25. Uso de uma combinação de pelo menos um dos derivadosde tetrazolilalcóxi-diidrocarboestirila (1) de acordo com a reivindicação 21, eProbucol, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um fármacopara a supressão de superóxido.

26. Uso de um supressor de superóxido que compreende umacombinação de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocar-boestirila da fórmula:<formula>formula see original document page 25</formula>na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferior, e a liga-ção entre as posições 3- e 4- do núcleo da carboestirila significa uma ligaçãosimples ou uma ligação dupla, ou um sal do mesmo e Probucol, caracteriza-do pelo fato de que é para a preparação de um fármaco para a prevenção eo tratamento de infarto cerebral.

27. Uso de um supressor de superóxido que compreende umacombinação de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi diidrocarbo-estirila (1) de acordo com a reivindicação 26, e Probucol, caracterizado pelofato de que é para a preparação de um fármaco para a prevenção e o trata-mento de arteriosclerose.

28. Uso de um supressor de superóxido que compreende umacombinação de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocarbo-estirila (1) de acordo com a reivindicação 26, e Probucol, caracterizado pelofato de que é para a preparação de um fármaco para a prevenção e o trata-mento de doenças renais.

29. Uso de um supressor de superóxido que compreende umacombinação de pelo menos um dos derivados de tetrazolilalcóxi-diidrocar-boestirila (1) de acordo com a reivindicação 26, e Probucol, caracterizadopelo fato de que é para a preparação de um fármaco para a prevenção e otratamento de diabetes.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a- 29, caracterizado pelo fato de que o derivado de tetrazolilalcóxi-diidrocarbo-estirila (1) é a 6-{4-(1-ciclohexil-1H-tetrazol-5-il)butóxi]-3,4-diidrocarboestirilaou um sal da mesma.

31. Composição farmacêutica para a prevenção e o tratamentode infarto cerebral, arteriosclerose, doenças renais e diabetes, caracterizadapelo fato de que compreende pelo menos um dos derivados de tetrazolilal-cóxi-diidrocarboestirila da fórmula:<formula>formula see original document page 26</formula>na qual R é um grupo cicloalquila, A é um grupo alquileno inferior, e a liga-ção entre as posições 3- e 4- do núcleo da carboestirila significa uma ligaçãosimples ou uma ligação dupla, ou um sal da mesma, Probucol e veículo.