BRPI0615284A2 - chaperonina 10 modificada - Google Patents

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BRPI0615284A2
BRPI0615284A2 BRPI0615284-8A BRPI0615284A BRPI0615284A2 BR PI0615284 A2 BRPI0615284 A2 BR PI0615284A2 BR PI0615284 A BRPI0615284 A BR PI0615284A BR PI0615284 A2 BRPI0615284 A2 BR PI0615284A2
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BR
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polypeptide
cpn10
cpnio
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immunomodulatory activity
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BRPI0615284-8A
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Dean Jason Naylor
Barbara Jane Johnson
Caroline Amanda Dobbin
Christopher Bruce Howard
Linda Allison Ward
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Cbio Ltd
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Abstract

CHAPERONINA 10 MODIFICADA. A presente invenção refere-se aos polipetídeos isolados chaperonina 10 apresentando atividade imunomodulatória, mas que falta ou substançialmente falta atividade de enovelamento da proteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CHAPERONINA 10 MODIFICADA".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a polipeptídeos de chaperonina10 e a ácidos nucléicos que codificam esses polipeptídeos. A presenteinvenção refere-se adicionalmente a polipeptídeos de chaperonina 10 queapresentam atividade imunomoduladora, a métodos que usam esses poli-peptídeos e a composições que compreendem esses polipeptídeos.
Antecedentes da Técnica
Chaperonina 10 (CpnIO) de mamíferos, também conhecidacomo proteína do choque térmido 10 (Hsp10) e fator de gravidez precoce(EPF), caracteriza-se tipicamente como uma proteína mitocondrial de 'cha-perona molecular' envolvida em enovelamento protéico juntamente comchaperonina 60 (Cpn60; Hsp60). Cpn10 e Cpn60 são homólogos das proteí-nas bacterianas GroES e GroEL, respectivamente. GroES e Cpn10 oligome-rizam-se cada uma em anéis de sete membros e ligam-se como tampa auma estrutura semelhante a barril que compreende quatorze moléculas deGroEL ou sete moléculas de Cpn60, respectivamente, que prendem proteí-nas desnaturadas ao complexo (Bukau e Horwich, 1998, Cell 92:351-366;Hartl e Hayer-Hartl, 2002, Science 295:1852-1858).
Proteínas CpnIO são espécies cruzadas altamente conservadas.CpnIO humana é 100% idêntica a Cpn10 bovina e difere de Cpn10 de ratosomente em uma única posição de aminoácido. Cpn10 humana compartilha30% de identidade de seqüências (60% de similaridade) com GroES de Eschi-richia coli. Como ilustrado pela estrutura heptamérica de cristais de GroES deE. coli (ver Figura 1A; Xu e outros, 1997, Nature 388:741-750). ProteínasCpn10/GroES são compreendidas essencialmente de três regiões estruturaisdiferentes, uma região em forma de barril β antiparalela que é flanqueada poruma região de "teto" em Ioop em forma de grampo de cabelo β e uma regiãoem "loop móvel". A região em Ioop móvel media interação com Cpn60/GroELe é, assim, crítica para a formação do complexo com Cpn60/GroEL e para aatividade de enovelamento protéico de 'chaperona molecular'.Entretanto, além de seu papel intracelular como chaperona mole-cular, Cpn10 é também freqüentemente encontrada na superfície celular (verBelles e outros, 1999, Infect Immun 67:4191 -4200) e no fluido extracelular (verShin e outros, 2003, J Biol Chem 278:7607-7616) e está crescentemente sen-do reconhecida como um regulador da resposta imune. Por exemplo, tem-sedemonstrado que Cpn10 apresenta atividade imunossupressora em encefa-Iomielite auto-imune experimental, hipersensibilidade do tipo retardado e mo-delos de rejeição de aloenxerto (Zhang e outros, 2003, J Neurol Sci 212:37-46; Morton e outros, 2000, Immunol Cell Biol 78:603-607).
Os presentes inventores também demonstraram recentementeque Cpn10 pode inibir ativação de NF-κΒ induzida por LPS, reduzir secreçãode TNFa e RANTES induzida por LPS e aumentar produção de IL-10 emvários sistemas humanos e murinos diferentes in vitro e modelos de doençashumanos (Johnson e outros, 2005, J Biol Chem 280:4037-4047 e Pedido dePatente Internacional Ns PCT/AU2005/000041, cuja descrição é incorporadaaqui como referência), sugerindo que Cpn10 possui considerável potencialcomo imunoterapêutico para o tratamento de doenças auto-imunes e infla-matórias.
Contudo, o(s) sítio(s) na molécula de Cpn10 responsável(eis)por mediação dessa(s) atividade(s) imunomoduladora(s) permanece(m) in-definível(eis).
A presente invenção refere-se a modificações nas moléculas deCpn10 e ao efeito dessas modificações em atividade imunomoduladora.
Sumário da Invenção
Conseqüentemente, a presente invenção proporciona polipeptí-deos de Cpn10 que compreendem uma ou mais substituições, supressõese/ou adições de aminoácidos em comparação com Cpn10 do tipo selvagem,polipeptídeos estes que apresentam atividade imunomoduladora.
De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, pro-porciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que possui atividade imuno-moduladora, mas em que falta, ou substancialmente falta, atividade de eno-velamento protéico.De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, pro-porciona-sé um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imu-nomoduladora, compreendendo esse polipeptídeo uma ou mais substitui-ções, supressões e/ou adições de aminoácidos na região em loop móvel emcomparação com um polipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
O polipeptídeo de Cpn10 poderá apresentar atividade imunomo-duladora pelo menos similar ao nível de atividade imunomoduladora do poli-peptídeo de Cpn 10 correspondente do tipo selvagem.
Em uma modalidade, um ou mais resíduos do tripeptídeo IML daregião em loop móvel do polipeptídeo de Cpn 10 poderão ser substituídos porresíduos carregados.
Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de Cpn10 que com-preende O tripeptídeo IML poderá ser substituído pelo tripeptídeo EEE.O polipeptídeo de Cpn10 que comprende o tripeptídeo EEE poderá apresen-tar-se em ID SEQ NQ: 39. O polipeptídeo de Cpn10 poderá ser codificadopela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em ID SEQ Ns: 40.
Em uma outra modalidade ainda, o polipeptídeo de Cpn10 quecompreende o tripeptídeo IML poderá ser substituído pelo tripeptídeo III.O polipeptídeo de Cpn10 que comprende o tripeptídeo III poderá apresentar-se em ID SEQ N9: 37. O polipeptídeo de Cpn10 poderá ser codificado pelaseqüência de nucleotídeos conforme apresentado em ID SEQ Ns: 38.
Em uma outra modalidade ainda, o polipeptídeo de Cpn10 quecompreende o tripeptídeo IML poderá ser substituído pelo tripeptídeo IFI.O polipeptídeo de Cpn10 que comprende o tripeptídeo IFI poderá apresen-tar-se em ID SEQ N9: 35. O polipeptídeo de Cpn10 poderá ser codificadopela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em ID SEQ N9: 36.
De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, pro-porciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imu-nomoduladora, polipeptídeo este em que substancialmente falta a região emloop móvel de um polipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
Em uma modalidade, o polipeptídeo de Cpn10 em que substan-cialmente falta a região em loop móvel compreende a seqüência de aminoá-cidos conforme apresentado em IDs SEQS Nes: 3 ou 24. O polipeptídeo deCpn10 em que substancialmente falta a região em loop móvel poderá sercodificado pela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em IDsSEQS Nes: 4, 5 ou 25.
O polipeptídeo de Cpn10 poderá apresentar atividade imunomo-duladora pelo menos similar ao nível de atividade imunomoduladora do poli-peptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, pro-porciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imu-nomoduladora, compreendendo esse polipeptídeo uma ou mais substitui-ções, supressões e/ou adições de aminoácidos na região de cobertura emforma de grampo de cabelo β em comparação com um polipeptídeo deCpn10 correspondente do tipo selvagem.
O polipeptídeo de Cpn10 poderá apresentar atividade imunomo-duladora pelo menos similar ao nível de atividade imunomoduladora do poli-peptídeo de CpnIO correspondente do tipo selvagem.
De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, pro-porciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imu-nomoduladora, polipeptídeo este em que substancialmente falta a região decobertura em forma de grampo de cabelo β de um polipeptídeo de Cpn10correspondente do tipo selvagem.
Em uma modalidade, o polipeptídeo de Cpn10 em que substan-cialmente falta a região de cobertura em forma de grampo de cabelo β (IDSEQ Ne: 13) compreende uma seqüência de aminoácidos conforme apre-sentado em IDs SEQS Nes: 6 ou 26. O polipeptídeo de Cpn10 em que subs-tancialmente falta a região de cobertura em forma de grampo de cabelo βpoderá ser codificado pela seqüência de nucleotídeos conforme apresentadoem IDs SEQS N93: 7, 8 ou 27.
O polipeptídeo de Cpn10 poderá apresentar atividade imunomo-duladora pelo menos similar ao nível de atividade imunomoduladora do poli-peptídeo de Cpn 10 correspondente do tipo selvagem.De acordo com um sexto aspecto da presente invenção, propor-ciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imuno-moduladora, polipeptídeo este que compreende uma ou mais substituições,supressões e/ou adições de aminoácidos na região em loop móvel e na re-gião de cobertura em forma de grampo de cabelo β em comparação com umpolipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção, pro-porciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado, polipeptídeo este em quesubstancialmente falta tanto a região em loop móvel quanto a região de co-bertura em forma de grampo de cabelo β do polipeptídeo de Cpn10 corres-pondente do tipo selvagem.
O polipeptídeo de Cpn10 isolado poderá apresentar atividadeimunomoduladora pelo menos similar ao nível de atividade imunomodulado-ra do polipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
Em uma modalidade, o polipeptídeo de Cpn10 compreende aseqüência de aminoácidos conforme apresentado em IDs SEQS Nes: 9 ou28. O polipeptídeo de Cpn10 poderá ser codificado pela seqüência de nucle-otídeos conforme apresentado em IDs SEQS Nes: 10 ou 29.
De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção, pro-porciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imu-nomoduladora, polipeptídeo este que compreende uma supressão de umresíduo extra de alanina com término N em comparação com um polipeptí-deo Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
O polipeptídeo de Cpn10 poderá carecer de um grupo acetila notérmino N em comparação com o polipeptídeo de Cpn10 correspondente dotipo selvagem. O polipeptídeo de Cpn10 poderá apresentar um nível reduzi-do de atividade imunomoduladora em comparação com o nível de atividadeimunomoduladora do polipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selva-gem.
Em uma modalidade, o polipeptídeo de Cpn10 que compreendea supressão do resíduo extra de alanina com término N poderá compreendera seqüência de aminoácidos conforme apresentado em ID SEQ N-: 23.O polipeptídeo de Cpn10 que compreende a supressão do resíduo extra dealanina com término N poderá ser codificado pela seqüência de nucleotídeosconforme apresentado em ID SEQ N9: 44.
De acordo com um nono aspecto da presente invenção, propor-ciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imuno-moduladora no qual o término N do polipeptídeo de Cpn10 é substancial-mente substituído por um término N de Cpn10 bacteriano.
O Cpn10 bacteriano poderá ser GroES.
O polipeptídeo de Cpn10 poderá apresentar um nível reduzidode atividade imunomoduladora em comparação com o nível de atividadeimunomoduladora do polipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selva-gem.
Em uma modalidade, o polipeptídeo de Cpn10 poderá compre-ender a seqüência de aminoácidos conforme apresentado em ID SEQ N9:14. O polipeptídeo de Cpn 10 poderá ser codificado pela seqüência de nucle-otídeos conforme apresentado em ID SEQ Ns: 43.
De acordo com um décimo aspecto da presente invenção, pro-porciona-se um polipeptídeo de Cpn10 isolado que apresenta atividade imu-nomoduladora no qual um resíduo de glicina substitui um resíduo extra dealanina com término N do polipeptídeo de Cpn10 em comparação com umpolipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
O polipeptídeo de Cpn10 poderá apresentar um nível reduzidode atividade imunomoduladora em comparação com o nível de atividade i-munomoduladora do polipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
Em uma modalidade, o polipeptídeo de Cpn10 poderá compre-ender a seqüência de aminoácidos conforme apresentado em ID SEQ N9:30. O polipeptídeo de Cpn10 poderá ser codificado pela seqüência de nucle-otídeos conforme apresentado em ID SEQ Ne: 31.
De acordo com um décimo primeiro aspecto da presente inven-ção, proporciona-se um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeode Cpn10 de acordo com qualquer um do primeiro ao décimo aspectos.De acordo com um décimo segundo aspecto da presente inven-ção, proporciona-se um constructo de expressão que compreende um ácidonucléico de acordo com o décimo primeiro aspecto, operavelmente ligado auma ou mais seqüências reguladoras.
De acordo com um décimo terceiro aspecto da presente inven-ção, proporciona-se uma célula hospedeira que expressa um polipeptídeo dequalquer um do primeiro ao décimo aspectos, ou que compreende um ácidonucléico do décimo primeiro aspecto ou um constructo de expressão do no-no aspecto.
De acordo com um décimo quarto aspecto da presente inven-ção, proporciona-se um anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptí-deo de qualquer um do primeiro ao décimo aspectos.
De acordo com um décimo quinto aspecto da presente inven-ção, proporciona-se uma composição farmacêutica que compreende um po-lipeptídeo de qualquer um do primeiro ao décimo aspectos, um ácido nucléi-co do décimo primeiro, um constructo de expressão do décimo segundo ouum anticorpo do décimo quarto aspecto.
A composição farmacêutica poderá compreender um ou maisagentes adicionais. Por exemplo, para o tratamento de esclerose múltipla acomposição poderá adicionalmente compreender uma quantidade eficaz deIFNp.
De acordo com um décimo sexto aspecto da presente invenção,proporciona-se um método de tratamento de um indivíduo, método este queinclui a etapa de administrar a esse indivíduo uma quantidade eficaz de umpolipeptídeo de Cpn10 de qualquer um do primeiro ao décimo aspectos ouum ácido nucléico do décimo primeiro aspecto.
O tratamento poderá modular a resposta imune no indivíduo.
A resposta imune poderá ser modulada via modulação de sinalização dereceptores semelhantes a Toll.
De acordo com um décimo sétimo aspecto da presente inven-ção, proporciona-se um método de tratamento ou prevenção de uma doençaou condição em um indivíduo, método compreendendo administrar ao indiví-duo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de CpnIO de qualquer umdos primeiro ao décimo aspectos ou um ácido nucléico do décimo primeiroaspecto.
A doença, distúrbio ou condição poderão ser selecionados dedoenças inflamatórias agudas ou crônicas, asma, alergia, esclerose múltipla,GVHD ou uma doença infecciosa. A doença infecciosa poderá resultar deuma infecção bacteriana ou viral. As bactérias poderão ser bactérias gram-negativas.
De acordo com um décimo oitavo aspecto da presente invenção,proporciona-se um método para modular sinalização de TLR4 em um indiví-duo, ou em pelo menos uma célula, tecido ou órgão desse indivíduo, métodoeste que compreende administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídeode Cpn10 de qualquer um dos primeiro ao décimo aspectos ou um ácidonucléico do décimo primeiro aspecto.
Tipicamente, a Cpn10 regula sinalização de TLR4 induzida poragonista.
De acordo com um décimo nono aspecto da presente invenção,proporciona-se um método para modular a produção e/ou secreção de umou mais imunomoduladores em um indivíduo, ou em pelo menos uma célula,tecido ou órgão desse indivíduo, método este que compreende administraruma quantidade eficaz de um polipeptídeo de Cpn10 de qualquer um dosprimeiro ao décimo aspectos ou um ácido nucléico do décimo primeiro as-pecto.
A Cpn10 poderá regular sinalização de TLR4.
O imunomodulador poderá ser uma citocina ou quimocina pró-inflamatória ou uma citocina ou quimocina antiinflamatória. A citocina ouquimocina poderá ser selecionada de TNF-α, IL-6, RANTES, IL-10, TGF-βou um interferon tipo I. O interferon tipo I poderá ser IFNa ou IFNp.
De acordo com um vigésimo aspecto da presente invenção,proporciona-se um método de identificação de um composto que se liga aum polipeptídeo de qualquer um dos primeiro ao décimo aspectos, métodoeste que compreende as etapas de:(a) contatar um composto candidato com esse polipeptídeo;
e
(b) ensaiar em relação à formação de um complexo entre ocomposto candidato e esse polipeptídeo.
O ensaio em relação à formação de um complexo poderá serum ensaio de ligação competitiva ou um ensaio de híbrido duplo.
De acordo com um vigésimo primeiro aspecto da presente in-venção, proporciona-se um método de seleção de um composto que modulaa atividade de um polipeptídeo de qualquer um dos primeiro ao décimo as-pectos, método este que compreende as etapas de:
(a) contatar esse polipeptídeo com um composto candidatosob condições adequadas para permitir interação desse composto candidatocom esse polipeptídeo; e
(b) ensaiar em relação a atividade desse polipeptídeo.
Ensaiar em relação a atividade do polipeptídeo poderá compre-ender adicionar um substrato marcado e medir uma alteração no substratomarcado.
A invenção também contempla variantes, derivados, homólogos,análogos e fragmentos dos polipeptídeos e polinucleotídeos de CpnIG modi-ficados de acordo com os aspectos e modalidades acima.
De acordo com os aspectos e modalidades acima, os polipeptí-deos e polinucleotídeos de Cpn10 poderão ser derivados de qualquer ani-mal, poderão ser gerados usando tecnologias de DNA recombinante ou po-derão ser sinteticamente produzidos. Tipicamente, o Cpn10 é um Cpn10 eu-cariótico.
De acordo com os aspectos acima, o polipeptídeo de Cpn10 dotipo selvagem poderá ser um polipeptídeo de Cpn10 humana que compre-ende a seqüência de aminoácidos conforme apresentado em IDs SEQSN-os: 1 ou 21.
De acordo com os aspectos acima, o polipeptídeo de Cpn10 dotipo selvagem poderá ser codificado pela seqüência de nucleotídeos confor-me apresentado em IDs SEQS Nes: 2 ou 22.De acordo com os aspectos e modalidades acima, a atividadeimunomoduladora de um polipeptídeo de CpnIO poderá envolver geração deheptâmeros do polipeptídeo.
Definições
No contexto deste relatório descritivo, o termo "compreendendo"significa "incluindo principalmente, mas não necessariamente apenas". Alémdisso, variações da palavra "compreendendo", tais como "compreendem" ou"compreende", apresentam significados correspondentemente variados.
O termo "do tipo selvagem", como usado aqui em relação a poli-peptídeos de Cpn10, inclui polipeptídeos em sua forma nativa ou não-nativa.Por exemplo, Cpn10 humana nativa é acetilada em seu término N; a presen-te invenção contempla, dentro do escopo do termo do tipo selvagem, poli-peptídeos acetilados ou não-acetilados. Adicionalmente, polipeptídeos deCpn10 do tipo selvagem poderão compreender um resíduo de alanina (A)adicional no término N (WO 2004/041300, cuja descrição é incorporada aquicomo referência).
O termo "polipeptídeo" significa um polímero composto de ami-noácidos ligados por ligações peptídicas. O termos "polipeptídeo" e "proteí-na" são usados aqui intercambiavelmente, embora para os fins da presenteinvenção um "polipeptídeo" possa constituir uma porção de uma proteína decomprimento completo.
O termo "polinucleotídeo" como usado aqui refere-se a um polí-mero de bases de desoxirribobucleotídeo ou de ribonucleotídeo de filamentosimples ou duplo ou análogos conhecidos de nucleotídeos naturais ou mistu-ras dos mesmos. O termo inclui referência à seqüência especificada, bemcomo à seqüência complementar à mesma, a não ser que indicado de outramaneira. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico" são usados inter-cambiavelmente neste relatório.
O termo "isolado" significa que a molécula em questão foi remo-vida de seu ambiente ou hospedeiro natural e impurezas associadas reduzi-das ou eliminadas tal que a molécula em questão seja a espécie predomi-nante presente (isto é, sob uma base molar, ela é mais abundante do quequaisquer outras espécies individuais na composição/amostra). Tipicamente,uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espé-cie-objeto compreende pelo menos cerca de 30 por cento (sob uma basemolar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, umacomposição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80 a 90de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Mais tipi-camente, a espécie-objeto é purificada até homogeneidade essencial (espé-cies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodosde detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmenteem uma única espécie macromolecular.
Como usado neste relatório, o termo "substancialmente" significaa maioria, mas não necessariamente todos, e, assim, em relação a um poli-peptídeo modificado em que "substancialmente" falta uma região componen-te de um polipeptídeo correspondente do tipo selvagem, o polipeptídeo mo-dificado poderá reter uma porção dessa região componente. Por exemplo,um polipeptídeo modificado em que "substancialmente" falta uma regiãocomponente de um polipeptídeo correspondente do tipo selvagem poderáreter aproximadamente 50 por cento ou menos da seqüência da região com-ponente, embora tipicamente a região componente torne-se estrutural e/oufuncionalmente inativa em virtude da proporção das seqüências da regiãoomitida.
O termo "substituição conservativa de aminoácidos", como usa-do aqui, refere-se a uma substituição ou deslocamento de um aminoácidopor um outro aminoácido com propriedades similares em uma cadeia poli-peptídica (seqüência primária de uma proteína). Por exemplo, a substituiçãodo aminoácido carregado ácido glutâmico (GIu) pelo aminoácido similarmen-te carregado ácido aspártico (Asp) seria uma substituição conservativa deaminoácidos.
Como usado neste relatório, os termos "tratamento", "tratar" evariações dos mesmos referem-se a quaisquer e todos os usos que remedi-am um estado de doença ou sintomas, previnem o estabelecimento de do-ença, ou também previnem, bloqueiam, retardam ou revertem a progressãode doença ou outros sintomas indesejáveis, de certo modo quaisquer quesejam.
Como usado neste relatório, o termo "quantidade eficaz" incluiem seu significado uma quantidade não-tóxica, mas suficiente, de um agenteou composto para proporcionar o efeito terapêutico ou profilático desejado. Aquantidade exata exigida variará de indivíduo para indivíduo, dependendo defatores tais como a espécie que é tratada, a idade e condição geral do indi-víduo, a gravidade da condição que é tratada, o agente particular que é ad-ministrado e o modo de administração e assim por diante. Desse modo, nãoé possível especificar uma "quantidade eficaz" exata. Entretanto, para qual-quer caso dado, uma "quantidade eficaz" apropriada poderá ser determinadapor qualquer versado na técnica, usando somente experimentação de rotina.
Como usado neste relatório, os termos "modulação", "modula" evariações dos mesmos referem-se a aumento ou diminuição do nível de ati-vidade, produção, secreção ou funcionamento de uma molécula na presençade uma molécula ou agente particular da invenção em comparação com onível de atividade, produção, secreção ou outro funcionamento daquela mo-lécula na ausência da molécula ou agente. Esses termos não implicamquantificação do aumento ou diminuição. A modulação poderá ser de qual-quer magnitude suficiente para produzir o resultado desejado e poderá serdireta ou indireta.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1. A. Estrutura cristalina de Cpn10 de E. coli (GroES)mostrando a região em forma de barril β antiparalela, a região de "teto" emloop em forma de grampo de cabelo β e a região em "loop móvel". Cpn10 écompreendida de sete subunidades idênticas de 10 kDa. B. Seqüência deaminoácidos de monômero de Cpn10 humana do tipo selvagem. Loop móvelde 18 aminoácidos preditos em itálico e negrito. Cobertura em forma degrampo de cabelo β de 14 aminoácidos preditos em negrito e sublinhado.
Figura 2. Efeito de AIa-Cpn10 Humana e GroES de E. coli nasinalização de TLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS res-ponsiva a dose (uma medida indireta de atividade de NFkB) por AIa-Cpn10humana (batelada CH001), mas não GroES de E. coli. O painel B mostra osresultados do painel A como inibição percentual de atividade de Iuciferase(atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferase produzida com LPSisoladamente. As amostras de LPS isoladamente são a média de 4 replica-tas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas. RLU = unidadesde luz relativas. Atividade de NFkB foi induzida com 5 ng/ml de Lipopolissa-carídeo (LPS).
Figura 3. Géis de SDS-PAGE. Atribuições de cavidades paragéis A a O, exceto H: Cavidade 1, marcadores de pesos moleculares (kDa);cavidades 2 a 6, 60 pg, 6 pg, 3 pg, 1,2 pg e 0,3 pg de Cpn10, respectiva-mente. A. 4-12% de gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie bri-lhante de AIa-Cpn10 purificada (CH001); B. 4-12% de gel de SDS-PAGEcorado com azul de Coomassie brilhante de AIa-Cpn10 purificada (CH003);C. 4-12% de gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie brilhante deAla-Cpnl 0-EEE-cHis purificada; D. 4-12% de gel de SDS-PAGE corado comazul de Coomassie brilhante de Ala-Cpnl0-cHis purificada; E. 4-12% de gelde SDS-PAGE corado com azul de Coomassie brilhante de AIa-Gpn10-IFIpurificada; F. 4-12% de gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassiebrilhante de AIa-Cpn10-III purificada; G. 4-12% de gel de SDS-PAGE coradocom azul de Coomassie brilhante de AIa-Cpn10-Aml purificada; H. Reticula-ção parcial de CpnIO-AmI com glutaraldeído (cavidade 2) mostra 7 bandasdistintas sobre gel de SDS-PAGE 4-12% corado com prata, revelando a es-trutura heptamérica da molécula. Cavidade 1, marcadores de pesos molecu-lares (kDa). I. 4-12% de gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassiebrilhante de AIa-Cpn10-Ateto purificada; J. 4-12% de gel de SDS-PAGE co-rado com azul de Coomassie brilhante de Ala-Cpn10-barril β; Κ. 4-12% degel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie brilhante de GroES de E.colr, L. 4-12% de gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie brilhan-te de Cpn10-termNES; M. 4-12% de gel de SDS-PAGE corado com azul deCoomassie brilhante de GroES de E. coli purificada; N. 4-12% de gel deSDS-PAGE corado com azul de Coomassie brilhante de GIy-Cpn10 purificada.Figura 4. Efeito de Ala-Cpn10, AIa-Cpn10-III, Ala-Cpnl0-IFI,Ala-Cpn10-EEE-cHis e Ala-Cpn10-cHis na sinalização de TLR4. Inibição deativação de HIV-LTR induzida por LPS responsiva a dose por Ala-Cpn10humana (batelada CH001), ponta de hexaistidina com término C em Ala-Cpn10 (Ala-Cpn10-cHis) e numerosos mutantes de loops móveis. Os painéisB, D, F, H mostram os resultados dos painéis A, C, E, G como inibição per-centual de atividade de luciferase (atividade dé NFkB) em relação aos níveisde luciferase produzida com LPS isoladamente. As amostras de LPS isola-damente são a média de 4 replicatas, todas as outras amostras são a médiade 2 replicatas. RLU = unidades de luz relativas. Atividade de NFkB foi indu-zida com 5 ng/ml de Lipopolissacarídeo (LPS).
Figura 5. Efeito de Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10 Aml na sinalizaçãode TLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsiva adose por Ala-Cpn10 humana (batelada CH001) e Ala-Cpn10-Aml. O painel Bmostra os resultados do painel A como inibição percentual de atividade deluciferase (atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferase produzidacom LPS isoladamente. As amostras de LPS isoladamente são a média de 4replicatas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas. RLU = uni-dades de luz relativas. Atividade de NFkB foi induzida com 5 ng/ml de Lipo-polissacarídeo (LPS).
Figura 6. Efeito de Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10 Ateto e GroES de E.coli na sinalização de TLR4. Inibição de ativação de HlV-LTR induzida porLPS responsiva a dose por AIa-Cpn10 humana (batelada CH001) e Ala-Cpn10-Ateto. O painel B mostra os resultados do painel A como inibiçãopercentual de atividade de luciferase (atividade de NFkB) em relação aosníveis de luciferase produzida com LPS isoladamente. As amostras de LPSisoladamente são a média de 6 replicatas, todas as outras amostras são amédia de 2 replicatas. CPS = contagens relativas por segundo. Atividade deNFkB foi induzida com 5 ng/ml de Lipopolissacarídeo (LPS).
Figura 7. Efeito de Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10-barril β na sinaliza-ção de TLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsivaa dose por AIa-Cpn10 humana (batelada CH001) e Ala-Cpnl0-barril β. Opainel B mostra os resultados do painel A como inibição percentual de ativi-dade de luciferase (atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferaseproduzida com LPS isoladamente. As amostras de LPS isoladamente são amédia de 6 replicatas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas.
CPS = contagens relativas por segundo. Atividade de NFkB fói induzida com5 ng/ml de Lipopolissacarídeo (LPS).
Figura 8. Efeito de Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10-termNES na sinali-zação de TLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsi-va a dose por Ala-Cpn10 humana do tipo selvagem (batelada CH001), masnão Cpnl0-termNES. O painel B mostra os resultados do painel A como ini-bição percentual de atividade de luciferase (atividade de NFkB) em relaçãoaos níveis de luciferase produzida com LPS isoladamente. As amostras deLPS isoladamente são a média de 6 replicatas, todas as outras amostrassão a média de 2 replicatas. CPS = contagens relativas por segundo; DP =desvio padrão. Atividade de NFkB foi induzida com 5 ng/ml de Lipopolissaca-rídeo (LPS).
Figura 9. Efeito de AIa-Cpn10 e X-Cpn10 na sinalização deTLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsiva a dosepor Ala-Cpn10 humana (batelada CH003) e X-Cpnl0. O painel B mostra osresultados do painel A como inibição percentual de atividade de luciferase(atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferase produzidos comLPS isoladamente. As amostras de LPS isoladamente são a média de 6 re-plicatas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas. CPS = con-tagens relativas por segundo. Atividade de NFkB foi induzida com 5 ng/ml deLipopolissacarídeo (LPS).
Figura 10. Efeito de AIa-Cpn10 e Gly-Cpn10 na sinalização deTLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsiva a dosepor Ala-Cpn10 humana (batelada CH003) e Gly-CpnI0. O painel B mostraos resultados do painel A como inibição percentual de atividade de Iuciferase(atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferase produzida com LPSisoladamente. As amostras de LPS isoladamente são a média de 6 replica-tas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas. CPS = contagensrelativas por segundo. Atividade de NFkB foi induzida com 5 ng/ml de Lipo-polissacarídeo (LPS).
Figura 11. Efeito de Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10 Aml na sinalizaçãode TLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsiva adose por Ala-Cpn10 humana (batelada CH003) e Ala-Cpn10-Aml. O painel Bmostra os resultados do painel A como inibição percentual de atividade deluciferase (atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferase produzi-dos com LPS isoladamente. As amostras de LPS isoladamente são a médiade 6 replicatas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas. CPS= contagens relativas por segundo. Atividade de NFkB foi induzida com 5ng/ml de Lipopolissacarídeo (LPS).
Figura 12. Efeito de Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10 Ateto na sinalizaçãode TLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsiva adose por Ala-Cpn10 humana (batelada CH003) e Ala-Cpn10-Ateto. O painelB mostra os resultados do painel A como inibição percentual de atividade deluciferase (atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferase produzidacom LPS isoladamente. As amostras de LPS isoladamente são a média de 6replicatas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas. CPS =Contagens relativas por segundo. Atividade de NFkB foi induzida com 5ng/ml de Lipopolissacarídeo (LPS).
Figura 13. Efeito de Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10-barril β na sinaliza-ção de TLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsivaa dose por Ala-Cpn10 humana (batelada CH001) e Ala-Cpn10-barril β. Opainel B mostra os resultados do painel A como inibição percentual de ativi-dade de luciferase (atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferaseproduzida com LPS isoladamente. As amostras de LPS isoladamente são amédia de 6 replicatas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas.CPS = contagens relativas por segundo. Atividade de NFkB foi induzida com5 ng/ml de Lipopolissacarídeo (LPS).
Figura 14. Efeito de Ala-Cpn10 e Gly-Cpn10 na sinalização deTLR4. Inibição de ativação de HIV-LTR induzida por LPS responsiva a dosepor AIa-Cpn10 humana (batelada CH003) e Gly-Cpnl0. O painel B mostraos resultados do painel A como inibição percentual de atividade de luciferase(atividade de NFkB) em relação aos níveis de luciferase produzida com LPSisoladamente. As amostras de LPS isoladamente são a média de 6 replica-tas, todas as outras amostras são a média de 2 replicatas. CPS = contagensrelativas por segundo. Atividade de NFkB foi induzida com 5 ng/ml de Lipo-polissacarídeo (LPS).
Figura 15. Atividade de Cpn10 em um modelo inflamatório muri-no de endotoxemia. Cpn10 e variantes de Cpn10 reduziram produção séricade TNF-α, IL-10 e IL-6 induzida por LPS. Soros de camundongos 'desafia-dos com LPS' (ver Tabela 1, grupos 1, 3, 5, 7, 9 e 11) ou 'controle salino'(ver Tabela 1, grupos 2, 4, 6, 8, 10 e 12) foram analisados em relação a cito-cinas associadas a processo inflamatório usando CBA (ver Métodos). Osníveis de citocinas de A, B) TNF-α, C,D) IL-6 e E5F) IL-10 foram traçados emgráfico com a média de cada grupo apresentada (barra horizontal). AnáliseANOVA de 1 via com teste post hoc de Tukey foi realizada para cada con-junto de dados. Significância estatística nos dados é indicada entre parênte-ses (p < 0,05) (ver texto para detalhes).
Figura 16. Diagrama do término N de Acetil-Cpn10, AIa-Cpn10 eGly-Cpn10.
Referências de Seqüências
Tabela 1: A tabela de referências abaixo fornece nomenclaturade polipeptídeos de Cpn10 usada em todo este relatório descritivo. Essa ta-bela contém descrições de características de polipeptídeos de Cpn10 apre-sentados aqui e seus números de ID de seqüências de aminoácidos e áci-dos nucléicos correspondentes.
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Modalidade Preferida de Realização da Invenção
Cpn10 é um anel heptamérico em forma de domo de subunida-des de 10 kDa idênticas (ver Figura 1). A superfície interna do domo é hidró-fila e altamente carregada. Cada subunidade de Cpn10 forma uma topologiairregular em forma de barril β da qual se projetam duas grandes extensões.A primeira extensão é um loop em forma de grampo de cabelo β que se es-tende na direção do centro do heptâmero e forma a estrutura semelhante adomo. Intrigantemente, considerando que a cobertura de GroES (Cpn10 deE. coli) é negativamente carregada sob condições fisiológicas, a coberturade Cpn10 de mamífero é positivamente carregada, embora uma grande por-ção da cobertura esteja completamente faltando da Cpn10 de bacteriófago(Gp31). A molécula também apresenta uma outra extensão que é um loopmóvel flexível de 18 aminoácidos que se estende da base do domo e mediauma interação com Cpn60. Mutagênese orientada a sítios identificou diver-sos resíduos no loop móvel os quais são cruciais para a interação comCpn60, a saber três resíduos hidrofóbicos (30-IML-32) na base do loop mó-vel que constituem o verdadeiro sítio de ligação com Cpn60 e dois resíduos(26-T e 33-P) que restringem a flexibilidade do loop móvel (Richardson eoutros, 2001, J Biol Chem 276:4981 -4987). Portanto, a associação de Cpn10com Cpn60 é mediada pelo loop móvel de 18 aminoácidos de Cpn10 (verFigura 1D). Em GroES de E. coli o tripeptídeo do sítio de ligaçãoCpn60/GroEL é menos hidrofóbico (25-IVL-27) e o loop móvel é mais flexíveldo que Cpn10 de mamífero. Essas alterações diminuem a afinidade de Gro-ES por Cpn60/GroEL e, como resultado, GroES não pode formar uma inte-ração produtiva com Cpn60 enquanto tanto Cpn10 quanto GroES funcionamcom GroEL.
Começando com a hipótese de que o mecanismo pelo qualCpn10 extracelular produz seus efeitos imunomoduladores envolve Cpn60(Johnson e outros, 2005, J Biol Chem 280:4037-4047), os presentes invento-res geraram mutantes de Cpn10 específicos a sítios que direcionam a regiãoem loop móvel e demonstram aqui que mutações que perturbam interaçõescom Cpn60 retêm atividade imunomoduladora.
Conseqüentemente, em um aspecto a presente invenção pro-porciona polipeptídeos de Cpn10 isolados que apresentam atividade imuno-moduladora, mas em que substanciálmente falta capacidade de enovela-mento protéico.
Demonstra-se também aqui que supressão de uma porção subs-tancial da região em loop móvel e/ou da região de cobertura em forma degrampo de cabelo β de Cpn10 não elimina a capacidade de Cpn10 modularsinalização do TLR4 de receptores semelhantes a Toll.
Conseqüentemente, a presente invenção também proporcionapolipeptídeos de Cpn10 isolados que apresentam atividade imunomodulado-ra, compreendendo os polipeptídeos uma ou mais substituições, supressõese/ou adições de aminoácidos em uma ou em ambas região em loop móvel eregião de cobertura em forma de grampo de cabelo β em comparação comum poíipeptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem. A supressãodo loop móvel e do loop de cobertura de Cpn10 é denominada poíipeptídeode Ala-Cpn10-barril β como descrito aqui.
A presente invenção também proporciona polipeptídeos deCpn10 isolados em que substancialmente falta uma ou ambas região emloop móvel e região de cobertura em forma de grampo de cabelo β do poíi-peptídeo de Cpn10 correspondente do tipo selvagem.
Como descrito aqui, os presentes inventores também demons-traram que GroES de Ε. colinão é capaz de induzir o efeito imunomoduladoratribuível a Cpn10 humana, como determinado por modulação de sinaliza-ção de TLR. Adicionalmente, a inatividade de um polipeptídeo de CpnIO emque os resíduos com término N de Cpn10 humana foram substituídos pelosresíduos com término N correspondentes de GroES de E. coli demonstraque o término N de Cpn10 é exigido para atividade imunomoduladora.
Como descrito adicionalmenteaqui, os presentes inventorestambém demonstraram que a adição de um resíduo de glicina ao término Nde Cpn10 aumenta a atividade imunomoduladora. Considera-se que a pre-sença de um grupo acetila ou um aminoácido que compartilha homologiaestrutural com um grupo acetila tal como um resíduo de alanina ou um resí-duo de glicina aumenta a atividade imunomoduladora de Cpn10.
Polipeptídeos
Como descrito aqui, a presente invenção contempla polipeptí-deos de Cpn10, tipicamente possuindo atividade imunomoduladora, os quaiscompreendem uma ou mais supressões, adições ou substituições de amino-ácidos em comparação com um polipeptídeo Cpn10 correspondente do tiposelvagem. Tipicamente, o Cpn10 do tipo selvagem é qualquer polipeptídeode Cpn10 de um organismo eucariótico. À guisa de exemplo, a Cpn10 pode-rá ser derivada de lêvedo (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), nema-tóide (por exemplo, Caenorhabbditis elegans), rã (por exemplo, Xenopustropicalis), frango (por exemplo, Gallus gallus), peixe-zebra (por exemplo,Danio rerio), mosca (por exemplo, mosca das frutas, tal como Drosophilamelanogaster), planta (por exemplo, Arabidopsis thaliana) ou um mamífero.A Cpn10 de mamífero poderá ser de primata, murino, ovina, bovina, canina,felina, porcina ou eqüina. Alternativamente, a Cpn10 poderá ser de origemarqueal. Em modalidades particulares, a Cpn10 é Cpn10 humana. A se-qüência de aminoácidos da Cpn10 humana do tipo selvagem poderá sercomo apresentado em IDs SEQS Nes: 1 ou 21. A seqüência de nucleotídeosque codifica a Cpn10 do tipo selvagem poderá ser como apresentado emIDs SEQS Ngs: 2 ou 22 ou mostrar identidade de seqüência suficiente comesta para hibridizar com a seqüência de IDs SEQS Nes: 2 ou 22.A presente invenção refere-se a modificações de polipeptídeosde Cpn10 do tipo selvagem conforme descrito neste relatório e abrangetambém moléculas do tipo selvagem modificadas no término N ou término Cpela adição, supressão ou substituição de um ou mais resíduos de aminoá-cidos. Por exemplo, adições de aminoácidos poderão resultar da fusão deum polipeptídeo de Cpn10 ou fragmento deste com um segundo polipeptí-deo ou peptídeo, tal como uma ponta de poliistidina, fusão de proteína quese liga a maltose, fusão de glutationa S transferase, fusão de proteína fluo-rescente verde ou a adição de uma ponta de epítopo tal como FLAG ou c-myc. Por exemplo, uma modificação de um polipeptídeo de Cpn10 humanado tipo selvagem poderá compreender um resíduo adicional de glicina (G). Opolipeptídeo de Cpn10 poderá ou não incluir a mationina de inicialização notérmino N.
No caso de polipeptídeos de Cpn10 imunomoduladores da in-venção baseados em ou substancialmente derivados de Cpn10 humana, taispolipeptídeos tipicamente compreendem a seqüênca MAGQAFRKFL comtérmino N, opcionalmente incluindo uma ou mais modificações como descritoacima.
Como descrito aqui, polipeptídeos de Cpn10 da invenção pode-rão compreender uma ou mais adições, supressões ou substituições de a-minoácidos em uma ou ambas região em Ioop móvel e região de coberturaem forma de grampo de cabelo β. Em uma modalidade, uma ou mais substi-tuições de aminoácidos poderão ser efetuadas na região em loop móvel, porexemplo na seqüência de tripeptídeos responsáveis por interação comCpn60, tal que o polipeptídeo modificado retenha atividade imunomodulado-ra mas não retenha atividade de enovelamento protéicõ. Em uma modalida-de alternativa, o polipeptídeo de Cpn10 carece substancialmente da regiãoem loop móvel, por exemplo como exemplificado pela seqüência apresenta-da em IDs SEQS Nes: 3 ou 24, ou a região de cobertura em forma de grampode cabelo β, por exemplo como exemplificado pela seqüência apresentadaem IDs SEQS Nes: 6 ou 26, ou ambas as regiões em loop móvel e de cober-tura em forma de grampo de cabelo β, por exemplo como exemplificado pelaseqüência apresentada em IDs SEQS N9S: 9 ou 28.
Como definido neste relatório, os aminoácidos que constituem oloop móvel ou a região de cobertura em forma de grampo de cabelo β sãodefinidos com base na seqüência e estrutura cristalina conhecida da Cpn10de E. coli, GroES. As localizações das regiões em loop móvel e de coberturaem forma de grampo de cabelo β em polipeptídeos de Cpn10 eucarióticasão previstas serem similares em vista da conservação de seqüências deCpn10 através de evolução e da conservação de estruturas protéicas tridi-mensionais previstas. Entretanto, os limites precisos das regiões em loopmóvel e de cobertura em forma de grampo de cabelo β em polipeptídeos deCpn10 eucariótica poderão diferir ligeiramente daqueles de GroES.
O termo "variante", como usado aqui, refere-se a seqüênciassubstancialmente similares. Geralmente, variantes de seqüências de poli-peptídeos possuem atividade biológica qualitativa em comum. Adicionalmen-te, essas variantes de seqüências de polipeptídeos poderão compartilharpelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,97%, 98% ou 99% de identidade de seqüências. Também incluídos no signi-ficado do termo "variante" são homólogos de polipeptídeos da invenção. Umhomólogo é tipicamente um polipeptídeo de uma espécie diferente, mas quecompartilha substancialmente a mesma função biológica ou atividade que opolipeptídeo correspondente descrito aqui.
Adicionalmente, o termo "variante" também inclui análogos dospolipeptídeos da invenção, em que o termo "análogo" significa um polipeptí-deo que é derivado de um polipeptídeo da invenção, derivado este que com-preende adição, supressão, substituição de um ou mais aminoácidos, tal queo polipeptídeo retenha substancialmente a mesma função. O termo "substi-tuição conservativa de aminoácidos" refere-se a uma substituição ou deslo-camento de um aminoácido por outro aminoácido com propriedades simila-res em uma cadeia de polipeptídeos (seqüência primária de uma proteína).
A presente invenção também contempla fragmentos dos polipep-tídeos descritos aqui. O termo "fragmento" refere-se a uma molécula de poli-peptídeo que codifica um constituinte ou é um constituinte de um polipeptí-deo da invenção ou variante deste. Tipicamente, o fragmento possui ativida-de biológica qualitativa em comum com o polipeptídeo de que é um constitu-inte. O fragmento peptídico poderá situar-se entre cerca de 5 e cerca de 150aminoácidos de comprimento, entre cerca de 5 e cerca de 100 aminoácidosde comprimento, entre cerca de 5 e cerca de 50 aminoácidos de comprimen-to ou entre cerca de 5 e cerca de 25 aminoácidos de comprimento. Alternati-vamente, o fragmento peptídico poderá situar-se entre cerca de 5 e cerca de15 aminoácidos de comprimento.
Polipeptídeos de Cpn10 modificados no término N e/ou C pelaadição, supressão ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidosconforme descrito acima também se enquadram no escopo da presente in-venção.
Produção de Cpn10
De acordo com a presente invenção, polipeptídeos de Cpn10poderão ser produzidos usando técnicas padrões de DNA recombinante ebiologia molecular que são bem-conhecidas daqueles versados no estado datécnica. Orientação poderá ser obtida, por exemplo, de textos padrões taiscomo Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clona-gem Molecular: Manual de Laboratório), Cold Spring Harbor, Nova Iorque,1989, e Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology (ProtocolosCorrentes em Biologia Molecular), Greene Pubi Assoc. e Wiley-Intersciences, 1992. Métodos descritos in Morton e outros, 2000 (ImmunolCell Biol 78:603-607), Ryan e outros, 1995 (J Biol Chem 270:22037-22043),e Johnson e outros, 2005 (J Biol Chem 280:4037-4047), são exemplos demétodos de purificação adequados de polipeptídeos de Cpn10, embora a-queles versados na técnica entenderão que a presente invenção não é limi-tada pelo método de purificação ou produção utilizado, e qualquer outro mé-todo poderá ser usado para produzir Cpn10 para uso de acordo com os mé-todos e composições da presente invenção. Peptídeos de Cpn10 poderãoser produzidos por digestão de um polipeptídeo com uma ou mais proteina-ses tais côo endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C e V8-protease de estafiloco-co. Os fragmentos peptídicos digeridos podem ser purificados por, por e-xemplo, técnicas cromatográficas líquidas de alta eficácia (HPLC).
A purificação de polipeptídeos de Cpn10 da invenção poderá serextrapolada para fins de produção em grande escala. Por exemplo, confor-me descrito aqui, os presentes inventores desenvolveram um bioprocessopara a produção de grandes quantidades (grama) de polipeptídeos deCpn10 de grau clínico altamente puros por fermentação em batelada em E.coli.
Polipeptídeos de Cpn10 da presente invenção, bem como frag-mentos e variantes destes, poderão também ser sintetizados por métodospadrões de química de fase líquida ou sólida bem-conhecidos daqueles ver-sados na técnica. Por exemplo, tais moléculas poderão ser sintetizadas se-guindo procedimentos de química de fase sólida de Steward e Young (Ste-ward, J.M. & Young, J.D, Solid Phase Peptide Synthesis (Síntese dé Peptí-deos em Fase Sólida). (2- Ed.) Pierce Chemical Co., Illinois, EUA (1984).
Em geral, tal método de síntese compreende a adição seqüenci-al de um ou mais aminoácidos ou aminoácidos adequadamente protegidos auma cadeia peptídíca em crescimento. Tipicamente, o grupo amino ou ogrupo carboxila do primeiro aminoácido é protegido por um grupo protetoradequado. O aminoácido protegido é então ligado a um suporte sólido inerteou utilizado em solução mediante adição do aminoácido seguinte na se-qüência que apresenta o grupo complementar (amino ou carboxila) adequa-damente protegido e sob condições adequadas para formar a ligação amida.O grupo protetor é então removido de seu resíduo de aminoácido recente-mente adicionado e o aminoácido seguinte (protegido) é adicionado, e assimpor diante. Após todos os aminoácidos desejados terem sido ligados, qual-quer grupo protetor remanescente, e se necessário qualquer suporte sólido,é removido seqüencial ou concorrentemente para produzir o polipeptídeofinal.
Alterações de aminoácidos em polipeptídeos de Cpn10 poderãoser efetuadas por meio de técnicas bem-conhecidas daqueles versados natécnica correspondente. Por exemplo, alterações de aminoácidos poderãoser efetuadas por meio de técnicas de substituição de nucleotídeos que in-cluem a adição, supressão ou substituição de nucleotídeos (conservativae/ou não-conservativa), sob a condição de que o quadro de leitura apropria-do seja mantido. Técnicas exemplares incluem mutagênese aleatória, muta-gênese orientada a sítios, mutagênese mediada por oligonucleotídeos oumediada por polipeptídeos, supressão de região(ões) selecionada(s) pelouso de sítios de enzimas de restrição existentes ou engenheirados e a rea-ção em cadeia de polimerase.
A geração de atividade imunomoduladora pelos polipeptídeos deCpn10 da invenção poderá envolver a formação de heptâmeros dos polipep-tídeos de Cpn10. Testes de atividade imunomoduladora para os fins da pre-sente invenção poderá se dar via qualquer uma de várias técnicas conheci-das daqueles versados na técnica. Como exemplificado aqui, atividade imu-nomoduladora de polipeptídeos de Cpn10 poderá ser determinada mediantemediação da capacidade do polipeptídeo em modular sinalização do TLR4de receptores semelhantes a Toll, por exemplo usando um bioenssaio deluciferase, e tipicamente na presença de um agonista de TLR4 tal como lipo-polissacarídeo. Alternativa ou adicionalmente, atividade imunomoduladorapoderá ser determinada usando outros ensaios in vitro, ex vivo ou in vivo,por exemplo via medição de produção de NF-κΒ ou da produção de citocinasem células tais como células mononucleares periféricas do sangue.
Polinucleotídeos
Modalidades da presente invenção proporcionam polinucleotí-deos isolados que codificam polipeptídeos de Cpn10, conforme descrito a-cima, e variantes e fragmentos desses polipeptídeos. As seqüências de nu-cleotídeos que codificam Cpn10 do tipo selvagem poderão ser como apre-sentado em IDs SEQS NQS: 2 ou 22 ou mostrar identidade de seqüência sufi-ciente com esta para hibridizar com a seqüência de IDs SEQS Ngs: 2 ou 22.
Especificamente, a seqüência de nucleotídeos que codifica opolipeptídeo de Cpn10-termNES da invenção poderá apresentar-se comoem ID SEQ Ne: 43 ou mostrar identidade de seqüência suficiente com estapara hibridizar com a seqüência de ID SEQ NQ: 43.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Ala-Cpn10 da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ N5: 22 ou mos-trar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar com a se-qüência de ID SEQ N9: 22.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Ala-Cpn10-Aml da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ Ns: 25 oumostrar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar com aseqüência de ID SEQ Ne: 25.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Ala-Cpn10-Ateto da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ Ne: 27 oumostrar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar com aseqüência de ID SEQ N9: 27.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo deCpn10-barril β da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ N9: 10ou mostrar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar coma seqüência de ID SEQ Ne: 10. A seqüência de nucleotídeos que codifica opolipeptídeo de Ala-Cpn10-barril β da invenção poderá apresentar-se comoem ID SEQ N9: 29 ou mostrar identidade de seqüência suficiente com estapara hibridizar com a seqüência de ID SEQ N9: 29.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Gly-Cpn10 da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ Ne: 31 ou mos-trar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar com a se-qüência de ID SEQ Ns: 31.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Ala-Cpn10-IFI da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ N9: 36 oumostrar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar com aseqüência de ID SEQ N9: 36.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Ala-Cpn10-III da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ Ns: 38 oumostrar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar com aseqüência de ID SEQ N9: 38.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Ala-Cpn10-EEE-cHis da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ N9: 40ou mostrar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar coma seqüência de ID SEQ Ng: 40.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Ala-Cpn10-cHis da invenção poderá apresentar-se como em ID SEQ N9: 42 oumostrar identidade de seqüência suficiente com esta para hibridizar com aseqüência de ID SEQ N9: 42.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo deCpn10-Aml é contemplada na presente invenção e poderá apresentar-secomo em IDs SEQS N9: 4 ou 5 ou mostrar identidade de seqüência suficien-te com esta para hibridizar com a seqüência de IDs SEQS Ngs: 4 ou 5.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo deCpn10-Ateto é contemplada na presente invenção e poderá apresentar-secomo em IDs SEQS Ns: 7 ou 8 ou mostrar identidade de seqüência suficien-te com esta para hibridizar com a seqüência de IDs SEQS Nss: 7 ou 8.
A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo deCpn10-barril β é contemplada na presente invenção e poderá apresentar-secomo em ID SEQ N9: 10 ou mostrar identidade de seqüência suficiente comesta para hibridizar com a seqüência de ID SEQ N9:10.
Como no caso dos polipeptídeos discutidos acima, o termo "va-riante", como usado aqui, refere-se a seqüências substancialmente simila-res. Geralmente, variantes de seqüências de polipeptídeos codificam poli-peptídeos que possuem atividade biológica qualitativa em comum. Adicio-nalmente, essas variantes de seqüências de polipeptídeos poderão compar-tilhar pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüências. Também incluídos nosignificado do termo "variante" são homólogos de polipeptídeos da invenção.Um homólogo é tipicamente um polipeptídeo de uma espécie diferente, masque compartilha substancialmente a mesma atividade.
Fragmentos de polipeptídeos da invenção são também contem-piados. O termo "fragmento" refere-se a uma molécula de ácido nucléico quecodifica um constituinte ou é um constituinte de um polipeptídeo da inven-ção. Fragmentos de um polinucleotídeo não precisam necessariamente codi-ficar polipeptídeos que retêm atividade biológica. Preferencialmente, o frag-mento poderá, por exemplo, ser útil como sonda de hibridização ou iniciado-re de RCP. O fragmento poderá ser derivado de um polinucleotídeo da in-venção ou alternativamente poderá ser sintetizado por algum outro meio, porexemplo síntese química. Polinucleotídeos da invenção e fragmentos destespoderão também ser usados na produção de moléculas anti-sentido utilizan-do técnicas conhecidas daqueles versados na técnica.
Conseqüentemente, a presente invenção contempla oligonucleo-tídeos e fragmentos baseados nas seqüências dos polipeptídeos da inven-ção para uso como iniciadores e sondas. Oligonucleotídeos são extensõescurtas de resíduos de nucleotídeos adequadas para uso em reações de am-plificação de ácidos nucléicos tal como RCP, tipicamente sendo de cerca denucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, mais tipica-mente de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 30 nucleotídeos de compri-mento. Sondas são seqüências de nucleotídeos de comprimento variável,por exemplo entre cerca de 10 nucleotídeos e diversos milhares de nucleotí-deos, para uso em detecção de seqüências homólogas, tipicamente por hi-bridização. O nível de homologia (identidade de seqüências) entre seqüên-cias será grandemente determinado pelo rigor de condições de hibridização.Em particular, a seqüência de nucleotídeos usada como sonda poderá hibri-dizar com um homólogo ou outra variante de um polinucleotídeo descritoaqui sob condições de baixo rigor, rigor médio ou alto rigor. Condições dehibridização de baixo rigor poderão corresponder a hibridização realizada a50°C em 2 χ SSC. Há numerosas condições e fatores, bem-conhecidos da-queles versados na técnica, que poderão ser empregados para alterar o ri-gor de hibridização. Por exemplo, o comprimento e a natureza (DNA, RNA,composição-base) do ácido nucléico a ser hibridizado com um ácido nucléicoespecificado; concentração de sais e outros componentes, tal como a pre-sença ou ausência de formamida, sulfato de dextrano, polietilenoglicol, etc.;e alteração da temperatura da hibridização e/ou etapas de lavagem. Por e-xemplo, um filtro de hibridização poderá ser lavado duas vezes por 30 minu-tos em 2 χ SSC, SDS 0,5% e pelo menos 55°C (baixo rigor), pelo menos60°C (rigor médio), pelo menos 65°C (médio/alto rigor), pelo menos 70°C(alto rigor) ou pelo menos 75°C (rigor muito alto).]
Em modalidades particulares, polinucleotídeos da invenção po-derão ser clonados em um vetor. O vetor poderá ser um vetor de plasmídeo,um vetor viral ou qualquer outro veículo adequado adaptado para a inserçãode seqüências estranhas, sua introdução em células eucarióticas e a ex-pressão das seqüências introduzidas. Tipicamente, o vetor é um vetor deexpressão eucariótica e poderá incluir seqüências de controle e processa-mento dé expressão tal como um promotor, um intensificador, sítios de Iiga-ção de ribossomos, sinais de poliadenilação e seqüências de terminação detranscrição.
Anticorpos
A presente invenção proporciona anticorpos que se ligam seleti-vamente aos polipeptídeos de CpnIO da presente invenção, bem comofragmentos e análogos desses polipeptídeos. Anticorpos adequados inclu-em, mas sem se limitar aos mesmos, anticorpos policlonais, monoclonais,quiméricos, humanizados, de cadeia simples, fragmentos de Fab e uma bi-blioteca de expressão de Fab. Anticorpos da presente invenção poderão a-tuar como agonistas ou antagonistas de polipeptídeos de Cpn10, ou frag-mentos ou análogos desses polipeptídeos.
Preferencialmente, anticorpos são preparados de regiões sepa-radas ou fragmentos dos polipeptídeos de CpnIO da invenção, em particularaqueles envolvidos em conferir atividade imunomoduladora e/ou ligação comparceiro ou substrato. Um polipeptídeo de CpnIO antigênico contém pelomenos 5, e preferencialmente pelo menos cerca de 10, aminoácidos.
Métodos para a geração de anticorpos adequados serão pron-tamente entendidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um anti-corpo monoclonal antiCpnIO, tipicamente contendo porções de Fab, poderáser preparado usando a tecnologia de hibridoma descrita in Antibodies-ALaboratory Manual (Anticorpos - Manual de Laboratório), Harlow e Lane,eds., CoIdSpring HarborLaboratory, Nova Iorque (1988).
Em essência, na preparação de anticorpos monoclonais dirigidosa polipeptídeos de Cpn10 da invenção, fragmentos ou análogos destes,qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpospor linhagens contínuas de células em cultura poderá ser usada. Estas in-cluem a técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e ou-tros, Nature, 256:495-497 (1975), bem como a técnica de trioma, a técnicade hibridoma de células B humanas [Kozbor e outros, Immunology Today,4:72 (1983)] e a técnica de EBV-hibridoma para produzir anticorpos mono-clonais humanos [Cole e outros, in Monoclonal Antibodies and Câncer The-rapy (Anticorpos Monoclonais e Terapia de Câncer), pp. 77-96, Alan R. LisslInc., (1985)]. Linhagens de células que produzem anticorpos imortais podemser criadas por meio de técnicas diferentes de fusão, tais como transforma-ção direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus deEpstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreber e outros, "Hybridoma Techni-qi/es" ("Técnicas de Hibridoma") (1980); Hammerling e outros, "MonoclonalAntibodies and T-cell Hydribomasn ("Anticorpos Monoclonais e Hibridomasde Células T") (1981); Kennett e outros, "Monoclonal Antibodies" ("Anticor-pos Monoclonais") (1980).
Em resumo, um meio de produzir um hibridoma de que o anti-corpo monoclonal é produzido é fundir um mieloma ou outra linhagem decélulas que se autoperpetuam com linfócitos obtidos do baço de um mamífe-ro hiperimunizado com uma porção que se liga a fator de reconhecimento,ou fator de reconhecimento ou uma porção dele que se liga a DNA de ori-gem específica. Hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal útil naprática desta invenção são identificados por sua capacidade de imunorreagircom o presente fator de reconhecimento e sua capacidade de inibir atividadetranscricional especificada em células-alvo.
Um anticorpo monoclonal útil na prática da presente invençãopode ser produzido iniciando uma cultura de hibridomas monoclonais quecompreendem um meio nutriente contendo um hibridoma que secreta molé-cuias de anticorpos da especificidade de antígenos apropriados. A cultura émantida sob condições e por um período de tempo suficiente para que o hi-bridoma secrete as moléculas de anticorpos no meio. O meio que contémanticorpos é então coletado. As moléculas de anticorpos podem por conse-guinte ser posteriormente isoladas por meio de técnicas bem-conhecidas.
Similarmente, há vários procedimentos conhecidos no estado datécnica que poderão ser usados para a produção de anticorpos policlonaisem polipeptídeos de CpnIO da invenção, ou fragmentos ou análogos destes.Para a produção de anticorpo policlonal de Cpn10, vários animais hospedei-ros podem ser imunizados por injeção com um polipeptídeo de Cpn10, ouum fragmento ou análogo deste, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos,coelhos, camundongos, ratos, carneiros, cabras, etc. Adicionalmente, o poli-peptídeo de CpnIO ou fragmento ou análogo deste pode ser conjugado comum veículo imunogênico, por exemplo soroalbumina bovina (BSA) ou hemo-cianina de caramujo (KLH). Também, vários adjuvantes poderão ser usadospara aumentar a resposta imunológica, incluindo, mas sem se limitar aosmesmos, adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais talcomo hidróxido de alumínio, substâncias de superfície ativa tal como Iisoleci-tina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemociani-nas de caramujo, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteistais como BCG (bacilo de Calmette-Guérin) e Corynebacterium parvum.
Seleção do anticorpo desejado pode também ser realizada pormeio de uma variedade de técnicas conhecidas na área. Ensaios em relaçãoa ligação imunoespecífica de anticorpos poderão incluir, mas sem se limitaraos mesmos, radioimunoensaios, ELISAs (ensaio imunossorvente ligado aenzima), imunoensaios em sanduíche, ensaios imunorradiométricos, rea-ções de precipitação com difusão em gel, ensaios de imunodifusão, imuno-ensaios in situ, Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutina-ção, ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência,ensaios de proteína A e ensaios de imunoeletroforese, e similares (ver, porexemplo, Ausubel e outros, eds., 1994, Current Protocols in Molecular Bio-logy (Protocolos Correntes em Biologia Molecular), Vol. 1, John Wiley &Sons, Inc., Nova Iorque). Ligação de anticorpos poderá ser detectada emvirtude de um marcador detectável no anticorpo primário antiCpnlO. Alterna-tivamente, o anticorpo antiCpnlO poderá ser detectado em virtude de sualigação com um anticorpo secundário ou reagente que é apropriadamentemarcado. Uma variedade de métodos é conhecida no estado da técnica paradetectar ligação em um imunoensaio e está dentro do escopo da presenteinvenção.
Anticorpos da presente invenção podem ser usados em métodose kits de diagnóstico que são bem-conhecidos daqueles versados na técnicapara detectar qualitativamente ou quantificar CpnIO em um fluido corporal outecido, ou alternativamente os anticorpos poderão ser usados em métodos ecomposições para o tratamento de várias doenças, distúrbios e condições.
O anticorpo (ou fragmentos deste) elevado contra um polipeptí-deo de CpnIO da invenção ou um fragmento ou análogo deste apresentaafinidade de ligação por Cpn 10. Preferencialmente, o anticorpo (ou fragmen-to deste) apresenta afinidade de ligação ou avidez maior que cerca de 105M'1', mais preferencialmente maior que cerca de 106 M"1·, ainda mais prefe-rencialmente maior que cerca de 107 M"1, e ainda bem mais preferencialmen-te maior que cerca de 10^8 M-1.
Em termos de obtenção de uma quantidade adequada de umanticorpo de acordo com a presente invenção, pode-se produzir o(s) anticor-po(s) usando fermentação em batelada com meio sem soro. Após fermenta-ção, o anticorpo poderá ser purificado via um procedimento multietapa queincorpora cromatografia e etapas de inativação/remoção viral. Por exemplo,o anticorpo poderá ser primeiro separado por cromatografia de afinidade porProteína A e em seguida tratado com solvente/detergente para inativarquaisquer vírus envolvidos por lipídeo. Purificação adicional, tipicamente porcromatografia de troca anônica e catiônica, poderá ser usada para removerproteínas, solventes/detergentes e ácidos nucléicos residuais. O anticorpopurificado poderá ser adicionalmente purificado e formulado em solução sa-lina a 0,9% usando colunas de filtração em gel. A preparação encorpadaformulada poderá então ser esterilizada e filtrada em relação a vírus e distribuída.
Agonistas e antagonistas
Além de anticorpos antiCpn10 específicos, os polipeptídeos dapresente invenção, e fragmentos e variantes dos mesmos, são particular-mente úteis para a seleção e identificação de compostos e agentes que inte-ragem com Cpn10. Em particular, compostos desejáveis são aqueles quemodulam a atividade imunomoduladora de Cpn10. Tais compostos poderãomodular por meio de ativação, aumento, inibição ou prevenção de atividadeimunomoduladora de Cpn10. Compostos adequados poderão exercer seuefeito sobre Cpn10 em virtude de uma interação direta (por exemplo, liga-ção) ou indireta.
Compostos que se ligam ou então interagem com polipeptídeosde Cpn10 da invenção, e especificamente compostos que modulam a ativi-dade de Cpn10, poderão ser identificados por meio de uma variedade demétodos adequados. Interação e/ou ligação poderão ser determinados u-sando ensaios padrões de ligação competitiva ou sistemas de ensaio de hí-dribo duplo.
Por exemplo, o ensaio de híbrido duplo é um sistema de ensaiogenético baseado em lêvedo (Fields e Song, 1989) tipicamente utilizado paradetectar interações proteína-proteína. Em resumo, esse ensaio tira vanta-gem da natureza multidomínio de ativadores transcricionais. Por exemplo, odomínio de ligação com DNA de um ativador transcricional conhecido poderáser fundido com um polipeptídeo de Cpn10 da invenção, ou fragmento ouvariante deste, e o domínio de ativação do ativador transcricional, fundidocom uma proteína candidata. Interação entre a proteína candidata e o poli-peptídeo de Cpn10, ou fragmento ou variante deste, colocará os domíniosde ligação com DNA e ativação do ativador transcricional em estreita proxi-midade. Interação pode, assim, ser detectada em virtude de transcrição deum gene repórter específico ativado pelo ativador transcricional.
Alternativamente, cromatografia de afinidade poderá ser usadapara identificar parceiros de ligação de Cpn10. Por exemplo, um polipeptídeode Cpn10 da invenção, ou fragmento ou variante deste, pode ser imobilizadoem um suporte (tal como sefarose) e lisados de células passados pela colu-na. Proteínas que se ligam ao polipeptídeo, fragmento ou variante de Cpn10imobilizado podem por conseguinte ser eluídas da coluna e identificadas.Inicialmente, tais proteínas poderão ser identificadas por seqüenciamento deaminoácidos com término N, por exemplo.
Alternativamente, em uma modificação da técnica acima, umaproteína de fusão poderá ser gerada fundindo um polipeptídeo, fragmento ouvariante de CpnIO com uma ponta detectável, tal como fosfatase alcalina, eusando uma forma modificada de imunoprecipitação, conforme descrito porFlanagan e Leder (1990).
Métodos para detecção de compostos que modulam atividadede CpnIO poderão envolver combinar um polipeptídeo de CpntO com umcomposto candidato e um substrato marcado adequado e monitorar o efeitodo composto sobre CpnIO por meio de alterações no substrato (poderão serdeterminadas como função do tempo). Substratos marcados adequados in-cluem aqueles marcados por métodos colorimétricos, radiométricos, fluori-métricos ou baseados em transferência de energia por ressonância fluores-cente (FRET), por exemplo.
Polipeptídeos de CpnIO da invenção e fragmentos e variantesapropriados podem ser usados em seleções de alta vazão para ensaiarcompostos candidatos em relação à capacidade de ligar-se ou interagir deoutro modo com Cpn10. Esses compostos candidatos podem ser adicional-mente selecionados contra CpnIO funcional para determinar o efeito docomposto sobre atividade de Cpn 10.
Entender-se-á que os métodos descritos acima são meramenteexemplos dos tipos de métodos que poderão ser empregados para identifi-car compostos que são capazes de interagir com ou modular a atividade dospolipeptídeos de Cpn 10, e fragmentos e variantes destes, da presente in-venção. Outros métodos adequados serão conhecidos daqueles versadosna técnica e estão dentro do escopo da presente invenção.Pelos métodos acima, podem ser identificados compostos que ativam (ago-nistas) ou inibem (antagonistas) atividade de Cpn10. Esses compostos po-dem ser, por exemplo, anticorpos, peptídeos de baixos pesos moleculares,ácidos nucléicos ou moléculas orgânicas não-proteináceas.
Moduladores potenciais de atividade de Cpn10, para seleçãopelos métodos acima, poderão ser gerados por meio de várias técnicas co-nhecidas daqueles versados na técnica. Por exemplo, várias formas de quí-mica combinatória poderão ser usadas para gerar moduladores não-peptídicos putativos. Adicionalmente, técnicas tais como ressonância mag-nética nuclear (RMN) e cristalografia de raios X poderão ser utilizadas paramodelar a estrutura de polipeptídeos, fragmentos ou variantes de CpnIO ecomputar previsões usadas para gerar possíveis moduladores.Composições e vias de administração
Polipeptídeos e polinucleotídéos de CpnIO da invenção poderãoser úteis como agentes terapêuticos. Essas moléculas encontram uso, porexemplo, no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em umindivíduo, mediante administração de uma quantidade terapeuticamente efi-caz dessa molécula ao indivíduo. Tipicamente, tais doenças e condições sãoreceptivas a tratamento por modulação da resposta imune no indivíduo. Àguisa de exemplo, tais doenças e condições podem incluir doenças inflama-tórias agudas ou crônicas, asma, alergia, esclerose múltipla, GVHD e doen-ças infecciosas. Conseqüentemente, são contempladas composições farma-ceuticamente úteis que compreendem polipeptídeos e polinucleotídeos deCpn 10 para uso no tratamento ou prevenção de doenças e condições.
Agonistas e antagonistas de polipeptídeos de CpnIO da inven-ção, incluindo anticorpos antiCpnIO, poderão também ser úteis como agen-tes terapêuticos. Conseqüentemente, a presente invenção também contem-pla métodos de tratamento que usam tais agonistas e antagonistas e com-posições farmacêuticas que compreendem os mesmos.
Em geral, composições adequadas para uso de acordo com osmétodos da presente invenção poderão ser preparadas de acordo com mé-todos e procedimentos que são conhecidos daqueles versados na técnica e,conseqüentemente, poderão incluir um veículo, diluente e/ou adjuvante far-maceuticamente aceitável.
As composições poderão ser administradas por vias padrões.Em geral, as composições poderão ser administradas por via parenteral (porexemplo, intravenosa, intra-raquidiãna, subcutânea ou intramuscular), oralou tópica. A administração poderá ser sistêmica, regional ou local. A via par-ticular de administração a ser usada em qualquer circunstância dada depen-derá de vários fatores, incluindo a natureza da condição a ser tratada, a gra-vidade e grau da condição, a dosagem exigida do composto particular a seradministrado e os efeitos colaterais potenciais do composto.
Em geral, composições adequadas poderão ser preparadas deacordo com métodos que são conhecidos daqueles versados na técnica epoderão incluir um diluente, adjuvante e/ou excipiente farmaceuticamenteaceitável. Os diluentes, adjuvantes e excipientes devem ser "aceitáveis" emtermos de serem compatíveis com os outros ingredientes da composição, enão-deletérios ao recipiente dos mesmos.
Exemplos de veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveissão água desmineralizada ou destilada; solução salina; óleos de origem ve-getal tais como óleo de amendoim, óleo de açafroa, óleo de oliva, óleo decaroço de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo, óleo de aráquide ou óleode coco; óleos de silicone, incluindo polissiloxanos, tais como metil polissilo-xano, fenil polissiloxano e metilfenil polissolpoxano; silicones voláteis; óleosminerais tal como parafina líquida, parafina mole ou esqualeno; derivados decelulose tais como metilcelulose, etilcelulose, carboximetilcelulosej carboxi-metilcelulose sódica ou hidroxipropilmetilcelulose; alcanóis inferiores, porexemplo etanol ou isopropanol; aralcanóis inferiores; polialquilenoglicóis infe-riores ou alquilenoglicóis inferiores, por exemplo polietilenoglicol, polipropile-noglicol, etilenoglicol, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol ou glicerina; ésteresde ácidos graxos tais como palmitato de isopropila, miristato de isopropila ouoleato de etila; polivinilpirridona; ágar; carragenana; goma tragacanta ougoma acácia, e vaselina. Tipicamente, o veículo ou veículos formarão de10% a 99,9% em peso das composições.
As composições da invenção poderão ser em uma forma ade-quada para administração por injeção, na forma de uma formulação adequa-da para ingestão oral (tais como cápsulas, comprimidos, comprimidos reves-tidos, elixires, por exemplo), na forma de uma pomada, creme ou loção ade-quada para administração tópica, em uma forma adequada para administra-ção como um colírio, em uma forma de aerossol adequada para administra-ção por inalação, tal como por inalação intranasal ou inalação oral, em umaforma adequada para administração parenteral, isto é, injeção subcutânea,intramuscular ou intravenosa.
Para administração como uma solução ou suspensão injetável,diluentes ou veículos parenteralmente aceitáveis não-tóxicos podem incluir,solução de Ringer, solução salina isotônica, solução salina tamponada comfosfato, etanol e 1,2-propilenoglicol.
Alguns exemplos de veículos, diluentes, excipientes e adjuvan-tes adequados para uso oral incluem óleo de amendoim, parafina líquida,carboximetilcelulose sódida, metilcelulose, alginato de sódio, goma acácia,goma tragacanta, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, gelatina e lecitina.Adicionalmente, essas formulações orais poderão conter agentes de aroma-tização e coloração adequados. Quando usado em forma de cápsula, ascápsulas poderão ser revestidas com compostos tais como monoestearatode glicerila ou diestearato de glicerila que retardam desintegração.
Adjuvantes tipicamente incluem emolientes, emulsificantes, a-gentes de espessamento, conservantes, bactericidas e agentes de tampo-namento.
Formas sólidas para administração oral poderão conter Iigantesaceitáveis em prática farmacêutica humana e veterinária, edulcorantes, a-gentes de desintegração, diluentes, aromatizantes, agentes de revestimento,conservantes, lubrificantes e/ou agentes de retardo de tempo. Ligantes ade-quados incluem goma acácia, gelatina, amido de milho, goma tragacanta,alginato de sódio, carboximetilcelulose ou polietilenoglicol. Edulcorantes a -dequados incluem sacarose, lactose, glicose, aspartame ou sacarina. Agen-tes de desintegração adequados incluem amido de milho, metilcelulose, poli-vinilpirrolidona, goma guar, goma xantana, bentonita, ácido algínico ou ágar.Diluentes adequados incluem lactose, sorbitol, manitol, dextrose, caulim,celulose, carbonato de cálcio, silicato de cálcio ou fosfato dicálcico. Agentesde aromatização adequados incluem óleo de hortelã-pimenta, óleo de gaul-téria, aromatizantes de cereja, laranja ou framboesa. Agentes de revestimen-to adequados incluem polímeros ou copolímeros de ácido acrílico e/ou ácidometacrílico e/ou seus ésteres, ceras, álcoois graxos, zeína, goma-laca ouglúten. Conservantes adequados incluem benzoato de sódio, vitamina E,alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metilparabeno, propilparabeno ou bissulfitode sódio. Lubrificantes adequados incluem estearato de magnésio, ácidoesteárico, oleato de sódio, cloreto de sódio ou talco. Agentes de retardo detempo adequados incluem monoestearato de glicerila ou diestearato de gli-cerila.
Formas líquidas para administração oral poderão conter, alémdos agentes acima, um veículo líquido. Veículos líquidos adequados incluemágua, óleos tais como óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de sésamo,óleo de girassol, óleo de açafroa, óleo de aráquide, óleo de coco, parafinalíquida, etilenoglicol, propilenoglicol, poletilenoglicol, etanol, propanol, iso-propanol, glicerol, álcoois graxos, triglicerídeos ou misturas dos mesmos.
Suspensões para administração oral poderão compreender adi-cionalmente agentes de dispersão e/ou agentes de suspensão. Agentes desuspensão adequados incluem carboximetilcelulose sódida, metilceluíose,hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, alginato de sódio ou álcoolacetílico. Agentes de dispersão adequados incluem lecitina, ésteres polioxie-tilênicos de ácidos graxos, tais como ácido esteárico, mono- ou dioleato depolioxietileno sorbitol, monoestearato ou dilaurato de polioxietileno sorbitol,mono ou dioleato de polioxietileno sorbitano, monoestearato ou dilaurato depolioxietileno sorbitano e similares.
As emulsões para administração oral poderão adicionalmentecompreender um ou mais agentes de emulsificação. Agentes de emulsifica-ção adequados incluem agentes de dispersão como exemplificado acima ougomas naturais tais como goma guar, goma acácia ou goma tragacanta.
Métodos para preparação de composições parenteralmente ad-ministráveis são evidentes àqueles habilitados no estado da técnica e sãodescritos mais pormenorizadamente in, por exemplo, Remington's Pharma-ceutical Science (Ciência Farmacêutica Remington), 15a ed., Mack Publi-shing Company, Easton, Pa., aqui incorporado como referência.As formulações tópicas da presente invenção compreendem umingrediente ativo juntamente com um ou mais veículos aceitáveis, e opcio-nalmente quaisquer outros ingredientes terapêuticos. Formulações adequa-das para administração tópica incluem preparações líquidas ou semi-sólidasadequadas para penetração através da pele no local onde tratamento é exi-gido, tais como linimentos, loções, cremes, pomadas ou pastas, e gotas a-dequadas para administração nos olhos, ouvidos ou nariz.
Gotas de acordo com a presente invenção poderão compreen-der soluções ou suspensões aquosas ou oleosas estéreis. Estas poderãoser preparadas dissolvendo o ingrediente ativo em uma solução aquosa deum agente bactericida e/ou fungicida e/ou qualquer outro conservante ade-quado, e opcionalmente incluindo um agente de superfície ativa. A soluçãoresultante poderá então ser clarificada por filtração, transferida para um reci-piente adequado e esterilizada. Esterilização poderá ser realizada por: auto-clave ou manutenção a 90°C-100°C por meia hora, ou por filtração, seguidade transferência para um recipiente por meio de uma técnica asséptica.Exemplos dê agentes bactericidas e fungicidas adequados para inclusão nasgotas são nitrato ou acetato fenilmercúrico (0,002%), cloreto de benzalcônio(0,01%) e acetato de clorexidina (0,01%). Solventes adequados para a pre-paração de uma solução oleosa incluem glicerol, álcool diluído e propileno-glicol.
Loções de acordo com a presente invenção incluem aquelas a -dequadas para aplicação à pele ou olhos. Uma loção oftálmica poderá com-preender uma solução aquosa estéril opcionalmente contendo um bacterici-da e poderá ser preparada por métodos similares àqueles descritos acimaem relação à preparação de gotas. Loções ou linimentos para aplicação àpele poderão também incluir um agente para acelerar secagem e resfriar apele, tal como um álcool ou acetona, e/ou um hidradante tal como glicerol,ou óleo tal como óleo de rícino ou óleo de aráquide.
Cremes, pomadas ou pastas de acordo com a presente inven-ção são formulações semi-sólidas do ingrediente ativo para aplicação exter-na. Eles poderão ser produzidos misturando o ingrediente ativo sob formafinamente dividida ou de pó, isoladamente ou em solução ou suspensão emum fluido aquoso ou não-aquoso, com uma base graxa ou não-graxa. A ba-se poderá compreender hidrocarbonetos tais como parafina dura, mole oulíquida, glicerol, cera de abelha, um sabão metálico; uma mucilagem; umóleo de origem natural tal como óleo de amêndoa, de milho, de aráquide, derícino ou de oliva; Ianolina ou seus derivados, ou um ácido graxo tal comoácido esteárico ou oléico juntamente com um álcool tal como propilenoglicolou macrogóis.
A composição poderá incorporar qualquer tensoativo adequadotal como um tensoativo aniônico, catiônico ou não-iônico, tais como ésteresde sorbitano ou derivados de polioxietileno destes. Agentes de suspensãotais como gomas naturais, derivados de celulose ou materiais inorgânicos,tais como sílicas silicáceas, e outros ingredientes tal como Ianolina poderãotambém ser incluídos.
As composições poderão também ser administradas na forma delipossomos. Lipossomos são geralmente derivados de fosfolipídeos ou ou-tras substâncias lipídicas e são formados por cristais líquidos hidratadosmono- ou multilamelares que são dispersos em um meio aquoso. Qualquerlipídeo fisiologicamente aceitável e metabolizável não-tóxico capaz de formarlipossomos pode ser usado. As composições em forma de Iipossomo pode-rão conter estabilizantes, conservantes, excipientes e similares. Os lipídeospreferidos são os fosfolipídeos e as fosfatidil colinas (lecitinas), tanto naturaisquanto sintéticos. Métodos para formar lipossomos são conhecidos no esta-do da técnica, e em relação a isso faz-se referência específica a: Prescott,Ed., Methods in Cell Biology (Métodos em Biologia Celular), Volume XIV,Academic Press, Nova Iorque, Nova Iorque (1976), p. 33 e seg., cujo conte-údo é incorporado aqui como referência.
As composições poderão ser conjugadas com um arranjo de de-rivados de polietilenoglicol (PEG). A adição de PEG a proteínas (PEGilação)é um método bem estabelecido para diminuir as taxas de depuração plasmá-tica de proteínas, aumentando desse modo sua eficácia (Nucci e outros,1991, Adv. Drug Del. Rev. 6:133). Benefícios adicionais de PEGilação pode-rão incluir maior estabilidade de proteínas, diminuição de imunogenicidade,aumento de solubilidade e redução de suscetibilidade a proteólise (SheffieldW., 2001, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 1:1-22). Molécu-las de PEG contêm a estrutura básica repetida de -(OCH3CH2)n-OH e sãoclassificadas em grupos de acordo com seu peso molecular. Derivados dePEG são conjugados com proteínas para aumentar seu raio hidrodinâmico e,em geral, seu aumento de meia-vida está diretamente relacionado com otamanho da cadeia de PEG ligada (Sheffield W., 2001, Curr Drug TargetsCardiovasc Haematol Disord. 1:1-22).
As composições poderão também ser administradas na forma demicropartículas. Micropartículas biodegradáveis formadas de polilactida(PLA), polilactida-co-glicolida (PLGA) e épsNon-caprolactona (ε-caprolactona) têm sido amplamente usadas como veículos para fármacos afim de aumentar a meia-vida plasmática e, desse modo, prolongar a eficácia(R. Kumar, M., 2000, J Pharm Pharmaceut Sei. 3(2) 234-258). Micropartícu-las foram formuladas para administração das mesmas em uma faixa de can-didatos a fármaco que incluem vacinas, antibióticos e DNA. Além disso, es-sas formulações foram desenvolvidas para várias vias de administração, in-cluindo injeção parenteral subeutânea, injeção intravenosa e inalação.
As composições poderão incorporar uma matriz de liberaçãocontrolada que é composta de acetato isobutirato de sacarose (SAIB) e sol-vente orgânico ou mistura de solventes orgânicos. Aditivos poliméricos pode-rão ser adicionados ao veículo como modificador de liberação para aumentaradicionalmente a viscosidade e desacelerar a taxa de liberação. SAIB é umaditivo alimentício bem-conhecido. É um derivado de sacarose totalmenteesterificado muito hidrofóbico, sob uma razão nominal de seis isobutiratospara dois grupos acetato. Como éster misto, SAIB não cristaliza, mas existecomo líquido viscoso transparente. Mistura de SAIB com um solvente orgâ-nico farmaceuticamente aceito tal como etanol ou álcool berizílico diminui aviscosidade da mistura suficientemente para permitir injeção. Um ingredientefarmacêutico ativo poderá ser adicionado ao veículo de administração deSAIB para formar formulações de solução ou suspensão de SAIB. Quando aformulação é injetada subcutaneamente, o solvente difunde-se da matrizpermitindo que as misturas SAIB-fármaco ou SAIB-fármaco-polímero confi-gure-se como um depósito de formação in situ.
Para os fins da presente invenção, moléculas e agentes poderãoser administrados a indivíduos como composições, seja terapeuticamente,seja preventivamente. Em uma aplicação terapêutica, as composições sãoadministradas a um paciente que já sofre de uma doença, em uma quanti-dade suficiente para curar ou pelo menos deter parcialmente a doença e su-as complicações. A composição deverá proporcionar uma quantidade damolécula ou agente suficiente para tratar eficazmente o paciente.
O nível de dose terapeuticamente eficaz para qualquer pacienteparticular dependerá de uma variedade de fatores que incluem: o distúrbioque é tratado e a gravidade do distúrbio; atividade da molécula ou agenteempregado; a composição empregada; a idade, peso corporal, saúde geral,sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a via de administração;a taxa de seqüestro da molécula ou agente; a duração do tratamento; fárma-cos usados em combinação ou coincidentemente com o tratamento, junta-mente com outros fatores relacionados bem-conhecidos em medicina.
Aquele versado na técnica seria capaz, mediante experimenta-ção de rotina, de determinar uma quantidade eficaz não-tóxica de agente oucomposto que seria exigida para tratar doenças e condições aplicáveis.
Geralmente, espera-se que uma dosagem eficaz situe-se na fai-xa de cerca de 0,0001 mg a cerca de 1.000 mg por kg de peso corporal por24 horas; tipicamente, cerca de 0,001 mg a cerca de 760 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 500 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 250 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 250 mg por kg de pesocorporal por 24 horas. Mais tipicamente, espera-se que uma faixa de doseseficaz situe-se na faixa de cerca de 1,0 mg a cerca de 200 mg por kg de pe-so corporal por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 100 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 500 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 25 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 50 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 20 mg por kg de pesocorporal por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 15 mg por kg de pesocorporal por 24 horas.
Alternativamente, uma dosagem eficaz poderá ser de até cerca .de 500 mg/m2. Geralmente, espera-se que uma dosagem eficaz situe-se nafaixa de cerca de 25 a cerca de 500 mg/m2, preferencialmente de cerca de25 a cerca de 350 mg/m2, mais preferencialmente de cerca de 25 a cerca de300 mg/m2, ainda mais preferencialmente de cerca de 25 a cerca de 250mg/m2, ainda mais preferencialmente de cerca de 50 a cerca de 250 mg/m2,e ainda bem mais preferencialmente de cerca de 75 a cerca de 150 mg/m2.
Tipicamente, em aplicações terapêuticas, o tratamento seria peladuração do estado de doença.
Adicionalmente, será evidente àquele versado na técnica que aquantidade ótima e o espaçamento de dosagens individuais venham a serdeterminados pela natureza e grau do estado de doença que é tratado, aforma, via e local de administração, e a natureza do indivíduo particular queé tratado. Também, tais condições ótimas podem ser determinadas por meiode técnicas convencionais.
Será também evidente àquele versado na técnica que o cursoótimo de tratamento, tal como o número de doses da composição dada pordia por um número de dias definidos, pode ser avaliado por aqueles versa-dos na técnica usando curso convencional de testes de determinação detratamento.
Modalidades da invenção também contemplam a administraçãode um polinucleotídeo que codifica Cpn 10. Em tais situações, o polinucleotí-deo é tipicamente ligado de modo operável a um promotor tal que a seqüên-cia apropriada de polipeptídeos seja. produzida após administração do poli-nucleotídeo ao indivíduo. O polinucleotídeo poderá ser administrado a indiví-duos em um vetor. O vetor poderá ser um vetor de plasmídeo, um vetor viralou qualquer outro veículo adequado adaptado para a inserção de seqüên-cias estranhas, sua introdução em células eucarióticas e a expressão dasseqüências introduzidas. Tipicamente, o vetor é um vetor de expressão eu-cariótica e poderá incluir seqüências de controle e processamento de ex-pressão tais como um promotor, um intensifiçador, sítios de ligação de ribos-somos, sinais de poliadenilação e seqüências de terminação de transcrição.O constructo de ácidos nucléicos a serem administrados poderão compre-ender DNA nu ou poderão ser na forma de uma composição, juntamentecom um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.
Aqueles versados na técnica entenderão que de acordo com osmétodos da presente invenção polipeptídeos de CpnIO da invenção poderãoser administrados isoladamente ou em conjunto com um ou mais agentesadicionais. Por exemplo, um polipeptídeo de CpnIO da invenção poderá seradministrado juntamente com um ou mais agonistas capazes de estimularum receptor de TLR tal como TLR4. Adicionalmente, a presente invençãocontempla terapia de combinação que utiliza polipeptídeos de CpnIO da in-venção em conjunto com outras abordagens terapêuticas para o tratamentode doenças e distúrbios. Por exemplo, polipeptídeos de CpnI O poderão serúteis no tratamento de doenças virais que são responsivas a terapia cominterferons do Tipo I tais como IFNp ou I FNa, e polipeptídeos de CpniO dainvenção poderão ser usados em conjunto com IFNp no tratamento de do-enças auto-imunes tal como esclerose múltipla.
Para essas terapias de combinação, cada componente da tera-pia de combinação poderá ser administrado ao mesmo tempo, ou seqüenci-almente em qualquer ordem, ou em tempos diferentes, de modo a propor-cionar o efeito desejado. Alternativamente, os componentes poderão serformulados juntamente em uma única dosagem unitária como um produto decombinação. Quando administrado separadamente, poderá ser preferido queos componentes sejam administrados pela mesma via de administração,embora não seja necessário que para isso se proceda dessa forma.
A presente invenção será agora descrita com referência a e-xemplos específicos, que não deverão ser considerados de maneira algumaser Iimitativos do escopo da invenção.Exemplos
Exemplo 1: Parâmetros genéticos usados para a produção de polipep-tídeos de Cpn10
A Tabela 2 descreve os parâmetros genéticos, especificamenteos sistemas de expressão (isto é, nomes dos plasmídeos, seleção de antibi-óticos e células hospedeiras) usados para a produção dos polipeptídeos deCpn10 listados abaixo.
Tabela 2: Descrição de parâmetros genéticos para a produçãode polipeptídeos de Cpn 10.
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Exemplo 2: Processo para produção de polipeptídeos de Cpn10
Para definir adicionalmente o processo de produção de Cpn 10,Ala-CpnIO é exemplificada abaixo com relação ao processo de produção.
Primeiramente, um plasmídeo de expressão induzível por calorque codifica CpnIO humana com um resíduo adicional de alanina com térmi-no N (Ala-Cpn10_pPL550) foi obtido de Somodevilla-Torres e outros (2003,Prot. Exp. Purif. 32:276-287). Em seguida, o vetor de plasmídeo foi transfor-mado na cepa XLI-AzuI de E.coli (Stratagene) e um banco de células-mestras foi estabelecido a partir de um único clone selecionado.
AIa-CpnIO foi então produzida em E. coli essencialmente comodescrito por Ryan e outros (1995, J Biol Chem 270:22037-22043), Adicio-nalmente, o material que não se ligou a Macro-Prep High Q (BioRad) foi adi-cionalmente purificado por S-Sepharose e em seguida por Gel-Filtration (Su-perdex200, Amersham Biosciences). CpnIO purificada em um tampão de 50mM de Tris-HCI (pH 7,6) e 150 mM de NaCI foi filtrada através de Acrodisccom uma membrana Mustang E de 0,2 mm de acordo com as instruções dofabricante (Pall Corporation, Ann Arbor, Ml. No. de Cat. MSTG5E3) para re-mover endotoxinas residuais e armazenada a -70°C. A pureza de CpnIO foideterminada como sendo >99% pòr SDS-PÀGE. Alíquotas foram desconge-ladas uma vez antes de usar.
A maior parte dos polipeptídeos de CpnIO humana mostrou amesma atividade molar que GroES de E. co//'em ensaios de enovelamentoprotéico de rodanese mediado por GroEL (Brinker e outros, 2001, Cell,107:223-233) (dados não mostrados). Contaminação de CpnIO com LPS foideterminada pelo ensaio de Lisado de Amebócitos de Limulus (BioWhittaker,Walkersville, MD) como sendo <0,03 EU/mg de proteína CpnIO purificada.
A autenticidade de polipeptídeos de CpnIO obtidos do processode produção conforme descrito acima foi avaliada com base em batelada porbatelada por espectrometria de massa. Como mostrado na Tabela 3, asmassas previstas e calculadas estão de acordo.Tabela 3: Dados de Espectrometria de Massa e pl Teórico Para Polipeptí-deos de Cpn10.
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Exemplo 3: Bioensaio de RAW264-HIV-LTR-LUC Para Determinar Ativi-dade Imunomoduladora de Polipeptídeos de CpnIO
Atividade imunomoduladora de polipeptídeos de Cpnl O foi tes-tada usando o bioensaio de RAW264-HIV-LTR Iuciferase essencialmentecomo descrito in Pedido Internacional de Patente Ne PCT/AU2005/000041.Esse ensaio, na presença de lipopolissacarídeo (LPS), mede a capacidadede CpnIO ou a variante, mutante ou derivado desta em modular sinalizaçãode TLR4 de receptores semelhantes a lTo//".
Células RAW264-HIV-LTR-LUC foram cultivadas na presença deG418 (200 mg/ml) por 5 dias após recuperação de nitrogênio líquido e cres-cidas como culturas em suspensão em frascos de 75 cm2 (Greiner Laborte-chnik, Frickenhausen, Alemanha). Células RAW264-HIV-LTR-LUC foramdesagregadas por pipetação repetida e plaqueadas em 2,5 χ 105 célu-las/cavidade em placas de 24 cavidades e incubadas da noite para o dia(37°C e 5% de C02). LPS bruto de E. coli (Ng de Cat. L-6529, Cepa 055:B6,Sigma) e LPS ultrapuro (No. de Cat. tirl-pelps, Cepa 0111:B4, Invivogerí)foram dissolvidos em água destilada estéril e armazenados a 4°C em frascosde vidro sob 1 mg/ml ou 5 mg/ml, respectivamente. Imediatamente antes deusar, a solução foi vigorosamente submetida a vórtice antes de alíquotasserem tomadas. Cpn10 foi pré-incubada com células por duas horas antesda adição de LPS nas concentrações indicadas. Após duas horas adicionaisde incubação, as células aderentes foram processadas para o ensaio de Iu-ciferâse (Luciferase Assay System (Sistema de Ensaio de Luciferase), Pro-mega, Madison, Wl). Atividade de luciferase foi medida usando um Luminô-metro da TD 20/20 Turner Designs (RLU) ou um Contador de MarcaçõesMúltiplas Wallace Victor2 da Perkin-Eimer (CPS).
Exemplo 4: Análise de atividade co-chaperona para polipeptídeos deCpn10 usando um ensaio de enovelamento protéico de rodanese medi-ado por GroEL in vitro
A capacidade de polipeptídeos de Cpn10 atuar como chapero-nas moleculares e enovelar proteínas em conjunto com GroEL foi determi-nada mediante ensaio em relação a enovelamento protéico de rodanese invitro utilizando um método adaptado de Weber F. e Hayer-Hartl M.K. (Cha-peronin Protocols (Protocolos de Chaperoninas), Ed. Schneider C., HumanaPress, Inc., 2000, pp. 117-126). Rodanese bovina nativa (30 μΜ, SIGMA) foidesnaturada em MOPS-KOH 20 mM (pH 7,5), KCI 100 mM e MgC2 20 mM(tampão A) contendo Guanidina HCI 5 M e DTT 8 mM, em seguida subse-qüentemente diluída (75 vezes) a partir de desnaturante em tampão A con-tendo GroEL (400 nM), tal que a concentração final de rodanese fosse de400 nM. GroEL liga-se rápida e estavelmente a rodanese desnaturada (D-Rho), considerando que em tampão isoladamente D-Rho enovela-se imper-feitamente e agrega-se (isto é, enovelamento protéico espontâneo ineficien-te). A adição de Cpn10 (ver abaixo) e ATP (20,6 mM) a complexos pré-formados estáveis de rodanese ligada a GroEL permite que enovelamentoprotéico eficiente ocorra. Na ausência de Cpn10, a adição de ATP leva R-Rho a circular sobre e fora de GroEL de uma maneira incompetente em ter-mos de enovelamento protéico que conduz eventualmente a enovelamentoprotéico imperfeito e agregação (essa reação funciona como um "blank" deensaio adequado). Cada reação de enovelamento protéico apresenta umvolume total de 290 μL, em pontos de tempo específicos (isto é, 0, 15, 30,45, 60, 75, 90 min), 30 μL alíquotas são removidas e combinadas com 70 μLde mistura para ensaio de atividade de rodanese (KH2PO4 57,1 mM (pH 7,5),EDTA 71,4 mM, tiossulfato de Na 71,4 mM e KCN 71,4 mM) por 6 min. An-tes do início de reações de enovelamento protéico com ATP, uma alíquotade 30 pL é tomada como T = O min de ponto de tempo de enovelamento pro-téico. EDTA na mistura de ensaio de atividade de rodanese quela íons Mg2+,que impede GroEL de ligar-se a ATP; o resultado é uma interrupção imedia-ta da reação de enovelamento protéico. Subseqüentemente, atividade derodanese é interrompida após 6 min pela adição de 50 μL de formaldeído a15% (v/v) (concentração final de 5% v/v).
Rodanese catalisa a formação de tiocianeto (tRhodanicf) a partirde tiossulfato e cianeto. Tiocianeto é facilmente detectado colorimetricamen-te (Absorbância de 450 nm) pela formação de seu complexo de ferro verme-lho na presença de Nitrato Férrico. Medições de atividade de rodanese (150μL) são desenvolvidas pela adição de 150 μL de reagente Nitrato Férrico(nitrato férrico 164,5 mM e ácido nítrico 9,2% v/v). Medições de atividade derodanese são lidas a A450nm em microplacas de 96 cavidades.
Reações típicas de enovelamento protéico de rodanese seguemuma inclinação exponencial na atividade de rodanese (isto é, rodanese eno-velada) com o tempo até um rendimento máximo de rodanese enovelada.Sob quantidades constantes de GroEL (400 nM) e rodanese (400 nM), ob-serva-se uma relação linear (entre atividade de rodanese e tempo) comquantidades crescentes de Cpn10 até uma concentração molar igual deCpn10 (7 meros) para GroEL (14 meros) ser atingida (isto é, 400 nM). Sobconcentrações de CpnIO acima de 400 nM, o aumento na atividade de roda-nese rapidamente atinge um máximo. O ensaio consiste em cinco padrões(em duplicata) e amostras de teste (em duplicata). As concentrações de pa-drões de Cpn10 são 0 nM, 140 nM, 250 nM, 280 nM e 350 nM. Medições deatividade de rodanese (isto é, atividade de Cpn10) a partir dos pontos detempo de 30, 45, 60, 75 e 90 min são estabelecidas pela média. O padrão deCpnIO de 0 nM serve como uma medição adequada da atividade de fundode ensaio; portanto, o valor de absorbância para o padrão de CpnIO de 0 nMé subtraído de todos os outros valores de absorbância calculados (ou valo-res de atividade). Após correção de fundo, o valor de absorbância para opadrão de CpnIO de 280 nM é indicado como 100% de atividade e todos osoutros valores de absorbância são convertidos em uma atividade percentualrelativa, com base no padrão de 100%. Pontos de dados fora da curva sãoremovidos por comparação de medições em duplicata; desvio >30% entreduplicatas é considerado inaceitável. Utilizando os dados aceitáveis, umacurva de calibração linear é gerada com cinco concentrações padrões,CpnIO 0 nM (0% de atividade), CpnIO 140 nM (50% de atividade), CpnIO250 nM (89,3% de atividade), CpnIO 280 nM (100% de atividade) e CpnIO350 nM (125% de atividade). Atividade de rodanese (isto é, atividade deCpn10) é traçada contra concentração de Cpn10. Para correção de distor-ções do ensaio, os valores de atividade em % das amostras de teste sãorecalculados usando a equação gerada a partir da curva de calibração linear.
Concentrações de châperoninãs são calculadas usando os pe-sos moleculares oligoméricos (MP) das proteínas enquanto rodanese é cal-culada usando o PM monomérico; isto é, 14 meros de GroEL de E. coli(SwissProt P06139) = 800.766,4 g /mol, 7 meros de CpnIO humana (Swiss-Prot Q04984) = 76.100,5 g /mol e 1 mero de rodanese bovina (SwissProtP00586) = 33.164,6 g /mol.
A Tabela 4 mostra a atividade de enovelamento protéico dospolipeptídeos de CpnIO com base em batelada por batelada e calculadacomo porcentagem de atividade de Ala-Cpnl0.Tabela 4: Atividade de Enovelamento Protéico de Polipeptídeos de Cpn10.
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Exemplo 5: GroES de E. coli não inibe ativação de HIV-LTR mediada porLPS
GroES de E. coli recombinante foi purificada e mostrada ser es-sencialmente livre de contaminação por endotoxina, 0,14 EU/mg (ver Figura3K). GroES purificada foi testada no ensaio de inibição de RAW264.7-HIV-LTR-LUC paralelamente com AIa-CpnIO conforme descrito acima. Comomostrado na Figura 2, GroES não inibiu ativação de HIV-LTR induzida porLPS sob qualquer das concentrações testadas (25 - 100 Mg/ml). Esses re-sultados confirmam que a atividade imunomoduladora observada paraCpnIO é um efeito biológico real e significativo.Exemplo 6 - Construção de mutantes de CpnIO humanaMutantes de IML23-25 específicos a sítios
A porção hidrofóbica de IML (resíduos 23-25) da região em Ioopmóvel foi submetida a mutação para alterar a resistência de interação entreCpnl 0 e Cpn60 (ver Tabela 1). IML foi substituído pelo tripeptídeo carregadoEEE que é previsto perturbar interação com Cpn60. IML foi também mutadonas porções Ill ou IFI , as quais são previstas aumentar hidrofobocidade e,desse modo, fortalecer potencialmente a interação de CpnIO com Cpn60.Um gel de SDS-PAGE que mostra purificação de Ala-Cpnl0-EEE-cHis, Ala-Cpn10-IFI, Ala-Cpn10-III e é apresentado nas Figuras 3C, EeF.
Ala-Cpnl0-111, Ala-Cpn10-IFI e Ala-Cpnl0-EEE-cHis foram gera-das por Mutagênese de Mudança Rápida Orientada a Sítios (Stratagene) deacordo com as instruções do fabricante utilizando os pares de iniciadorescomplementares como apresentado na Tabela 1. Para AIa-Cpn10-III e Ala-Cpn 10-IFl, o plasmídeo Ala-Cpn10-pPL550 foi usado como padrão de DNA.Para Ala-Cpnl0-EEE-cHis, o plasmídeo Ala-Cpnl0-cHis_pET23 foi usadocomo padrão de DNA (ver abaixo).
Ala-Cpn10
A seqüência de aminoácidos prevista compreender Ala-Cpn10 éapresentada em ID SEQ N9: 21. Uma seqüência sintética de DNA que codifi-ca Ala-Cpn10 (ID SEQ N9: 22) foi inserida no plasmídeo pPL550 nos sítiosNcol e EcoRI (Somodevilla-Torres e outros, 2003, Prot. Exp. Purif. 32:276-287). Um gel de SDS-PAGE que mostra purificação de Ala-Cpn10 em bate-ladas CH001 e CH003 é apresentado nas Figuras 3A e B1 respectivamente.
Ala-Cpnl 0-cHis
A seqüência de aminoácidos prevista compreender AIa-Cpn10-cHis é apresentada em ID SEQ N9: 41. Uma seqüência sintética de DNA quecodifica Ala-Cpnl0-cHis (ID SEQ N9: 42) foi preparada mediante inserção daseqüência de DNA de AIa-CpnIO (ID SEQ N9: 22) menos o códon de paradano plasmídeo pPET23 (Novageri) nos sítios Ndel e Xhol. A clonagem permiteque uma ponta de Hexaistidina com término C esteja presente em Ala-Cpn10. Um gel de SDS-PAGE que mostra purificação de Ala-Cpnl0-cHis éapresentado na Figura 3D.
Ala-Cpn10-Aml
16 Aminoácidos foram suprimidos da região em loop móvel (IDSEQ N9: 12) de CpnIO para gerar variante de 86 aminoácidos designadaAla-Cpn10-Aml (ID SEQ N9: 24). Uma seqüência sintética de DNA que codi-fica Ala-Cpn10-Aml (ID SEQ N9: 25) foi inserida no plasmídeo pPL550 nossítios Ncol e EcoRI (Somodevilla-Torres e outros, 2003, Prot. Exp. Purif.32:276-287). Como o Ioop móvel situa-se no meio da cadeia de polipeptí-deos de Cpn10, dois resíduos (um em cada extremidade) do Ioop móvel fo-ram retidos para ligar o fragmento com término N com o fragmento com tér-mino C e assegurar enovelamento protéico apropriado e montagem do hep-tâmero.
Um gel de SDS-PAGE que mostra purificação de AIa-CpnIO-AmIè apresentado na Figura 3G. Reticulação parcial de AIa-CpnIO-AmI com glu-taraldeído (Figura 3H, cavidade 2) mostra 7 bandas distintas sobre o gel deSDS-PAGE 4-12% corado com prata, confirmando a estrutura heptaméricada molécula. Uma quantidade de 580 pg de AIa-CpnIO-AmI em PBS (pH7,4) foi incubada com glutaraldeído (APS) 0,01% (p/p) em um volume totalde 300 μΙ a 25°C por 30 min. As reações foram interrompidas bruscamentepela adição de 15 μΙ de Tris-HCI 2 M (pH 9,0). Uma alíquota de 100 μΙ damistura reacional foi separada em uma coluna de exclusão por tamanhosSuperdex 200 HR 10/30 (GE Biosciences) em solução salina tamponadacom fosfato (PBS) sob uma vazão de 0,5 ml min"1. O pico de eluição nomesmo tempo de retenção do oligômero de CpnIO não-reticulado foi coleta-do em duas frações de 0,5 ml e subseqüentemente analisado por SDS-PAGE e coração com prata.
Ala-Cpnl O-Ateto
7 aminoácidos foram suprimidos da região em forma de grampode cabelo β (ID SEQ N9: 13) para gerar a variante de 95 aminoácidos desig-nada Ala-CpnlO-Ateto. Uma seqüência sintética de DNA que codifica Ala-CpnIO-Ateto (ID SEQ N9: 27) foi inserida no plasmídeo pPL550 nos sítiosNco\ e EcoRI (Somodevilla-Torres e outros, 2003, Prot. Exp. Purif. 32:276-287). A seqüência de aminoácidos de AIa-CpnIO-Ateto é apresentada em IDSEQ Ns: 26. Adicionalmente, o polinucleotídeo que codifica esse polipeptí-deo é apresentado em ID SEQ N9: 27. Um gel de SDS-PAGE que mostrapurificação de AIa-CpnIO-Ateto é apresentado na Figura 31.Ala-Cpnl 0-barril β
A seqüência de aminoácidos prevista compreender AIa-CpnIO-barril β é apresentada em ID SEQ N9: 28. Um gel de SDS-PAGE que mostrapurificação de Cpn10-barril β é apresentado na Figura 3D. Uma seqüênciasintética de DNA que codifica Ala-Cpnl0-barril β (ID SEQ Ne: 29) foi inseridano plasmídeo pPL550 nos sítios Nco\ e EcoRI (Somodevilla-Torres e outros,2003, Prot. Exp. Purif. 32:276-287). Um gel de SDS-PAGE que mostra purifi-cação de Ala-Cpnl0-barril β é apresentado na Figura 3J.GIy-CpnIO
A seqüência de aminoácidos prevista compreender GIy-CpnIO éapresentada em ID SEQ N9: 30. Uma seqüência sintética de DNA que codifi-ca GIy-CpnIO (ID SEQ N9: 31) foi inserida no plasmídeo pET30a. Um gel deSDS-PAGE que mostra purificação de GIy-CpnIO é apresentado na Figura3N.
X-CpnIO
A seqüência de aminoácidos prevista compreender X-CpnIO éapresentada em ID SEQ N9: 23. Uma seqüência sintética de DNA que codifi-ca X-CpnIO (ID SEQ N9: 44) foi inserida no plasmídeo pPL550 nos sítiosNco\ e EcoRI (Somodevilla-Torres e outros, 2003, Prot. Exp. Purif. 32:276-287). Urn gel dè SDS-PAGE que mostra purificação de X-CpnIO é apresen-tado na Figura 3M.GroES
A seqüência de aminoácidos prevista compreender GroES de E.coli (SwissProt P05380) é apresentada em ID SEQ N9: 11. Uma seqüênciasintética de DNA que codifica GroES (ID SEQ N9: 34) foi inserida no plasmí-deo pET11. Um gel de SDS-PAGE que mostra purificação de GroES é apre-sentado na Figura 3K.Cpn10-termNES
A seqüência de aminoácidos prevista compreender CpnIO-termNES é apresentada em ID SEQ N9: 14. A proteína Cpn10-termNES foiproduzida substituindo resíduos 1-AGQAFRKFL-9 de X-CpnIO humana (IDSEQ N9: 23) por resíduos 1-MNIR-4 de GroES de E. coli (ID SEQ N9: 11).Uma seqüência sintética de DNA que codifica Cpn10-termNES (ID SEQ N9:43) foi inserida no plasmídeo pET23a. Um gel de SDS-PAGE que mostrapurificação de Cpn10-termNES é apresentado na Figura 3L.Exemplo 7 - Atividade de mutantes do tripeptídeo IML de CpnIO
Mutantes do tripeptídeo IML do Ioop móvel (crucial para intera-ção com Cpn60 e, portanto, para enovelamento de proteína) foram geradospara perturbar ou fortalecer a interação do Ioop móvel com Cpn60 (ver E-xemplo 6).
A proteína mutante AIa-CpnIO de Ioop móvel EEE (Ala-CpnlO-EEE) aboliu a capacidade de CpnIO funcionar com GroEL (Cpn60 de E. coli)durante o processo de enovelamento protéico de rodanese in vitro, enquantoos mutantes Ill e IFI permaneciam ativos (ver Tabela 3).
Os resultados indicam que a afinidade de Ala-CpnlO-EEE-cHispor GroEL é na verdade significativamente reduzida. Em contraste com oensaio de enovelamento protéico, o ensaio de inibição de RAW264.7-HIV-LTR-LUC demonstra que todos os mutantes de tripeptídeo (incluindo Ala-CpnIO-His) são capazes de modular sinalização de TLR4, com atividadesimilar à de Ala-Cpnl O, indicando que o Ioop móvel (e portanto Cpn60) nãoé importante para essa atividade imunomoduladora de CpnIO (ver Figuras4B, D, Fe H).
Exemplo 8 - AIa-CpnIO-AmI não coopera com GroEL em enovelamentode rodanese
Para confirmar que a região em Ioop móvel (e portanto Cpn60)não é exigida para atividade imunomoduladora, 16 aminoácidos foram su-primidos da região em Ioop móvel (ID SEQ N9: 12) para gerar a variante de86 aminoácidos designada AIa-CpnIO-Ami (ver Exemplo 6. A seqüência deaminoácidos de AIa-CpnIO-AmI é apresentada em ID SEQ Ne: 24.
AIa-CpnIO-AmI foi testada em relação à sua capacidade de fun-cionar produtivamente com GroEL (Cpn60 de E. coli) no processo de enove-lamento de rodanese. Como controle positivo, AIa-CpnIO foi incluída nomesmo ensaio e resultou em uma atividade de -100% (ver Tabela 3). A ativi-dade de AIa-CpnIO-AmI foi medida como -0% de atividade, indicando queela não interage com GroEL e, portanto, não pode funcionar como uma co-chaperona durante o processo de enovelamento protéico. Tanto os polipep-tídeos de AIa-CpnIO quanto os de AIa-CpnIO-AmI foram testados em igualconcentração molar.
Exemplo 9 - Ala-Cpn10-Aml inibe ativação de HIV-LTR induzida porLPS
Ala-Cpn10-Aml foi testada usando o ensaio de inibição deRAW264.7-HIV-LTR-LUC paralelamente com Ala-Cpn10. Nesse ensaio,uma luciferase repórter é ligada indiretamente a transdução de sinal deNFkB. NFkB é o fator de transcrição primário induzido por LPS. Atividade deluciferase é medida como unidades de luz relativas (RLU) ou contagens porsegundo (CPS), dependendo da instrumentação utilizada. Como mostradonas Figuras 5A e 5B, Ala-Cpn10-Aml inibiu ativação de HIV-LTR induzidapor LPS entre as concentrações de 1 e 100 Mg/ml. Embora este seja um en-saio simples, dois experimentos em replicata foram configurados em placasde microtitulação separadas e demonstraram a mesma atividade. Nesseconjunto de dados, Ala-Cpn10-Aml pareceu possuir atividade inibidora con-sistentemente maior quando comparada com Ala-Cpn 10.
Conforme descrito acima no Exemplo 8, Ala-Cpn10-Aml não foicapaz de funcionar como uma co-chaperona para GroEL no processo deenovelamento de rodanese. Entretanto, quando usada no ensaio de inibiçãode RAW264.7-HIV-LTR-LUC na presença de LPS, níveis de atividade deAIa-Cpn10 de AIa-Cpn10-Aml foram observados. Isto é, AIa-Cpn10-Aml de-pendentemente de dose inibiu ativação de HIV-LTR repórter induzida porLPS. Esses resultados negam claramente um envolvimento de Cpn60 nacapacidade de Cpn10 modular sinalização de TLR4.
Exemplo 10 - Ala-Cpn10-Ateto inibe ativação de HIV-LTR induzida porLPS
A região em loop de cobertura em forma de grampo de cabelo β(ver Figura 1) de Cpn10 contém uma carga positiva líquida em mamíferos,mas predominantemente uma carga negativa líquida em bactérias (por e-xemplo, como representado por GroES de E. colí). Intrigantemente, bacterió-fago T4 também contém uma Cpn10 (Gp31) especializada que funciona jun-tamente com GroEL de E. coli para enovelar a importante proteína capsídeade T4 Gp23. Nem GroES nem Cpn10 pode preencher essa função. Umaimportante diferença entre Gp31 e Cpn10/GroES é que Gp31 carece com-pletamente do Ioop de cobertura em forma de grampo de cabelo β, possi-velmente sendo responsável pela função e capacidades incomuns de Gp31(Hunt e outros, 1997, Cell90:361 -371).
Para determinar a contribuição da região de cobertura em formade grampo de cabelo β à atividade imunomoduladora de Cpn10, 7 aminoáci-dos foram suprimidos da região de cobertura em forma de grampo de cabeloβ (ID SEQ NQ: 13) para gerar a variante de 95 aminoácidos designada Ala-CpnIO-Ateto (ver Exemplo 6). A seqüência de aminoácidos de Ala-Cpnl Ο-
Ateto é apresentada em ID SEQ Ng: 26.
AIa-CpnIO-Ateto foi testada no ensaio de inibição de RAW264.7-HIV-LTR-LUC na presença de LPS, paralelamente com AIa-CpnIO e GroESde E. coli. Como mostrado na Figura 6, AIa-CpnIO-Ateto inibiu ativação deHIV-LTR induzida por LPS entre as concentrações de 50 e 100 pg/ml. Em-bora este seja um ensaio simples, dois experimentos em replicata foramconfigurados em placas de microtitulação separadas e demonstraram amesma atividade. Nesse conjunto de dados, AIa-CpnIO-Ateto pareceu pos-suir consistentemente -80% da atividade de Ala-Cpnl 0. Esses resultadosdemonstram que modulação de sinalização de TLR4 por CpnIO pode ocor-rer na ausência de uma região de cobertura em forma de grampo de cabeloβ funcional da molécula.
Exemplo 11 - Mutante Ala-Cpnl0-barril β exibe atividade imunomodu-ladora
Como confirmação dos dados acima descritos nos Exemplos 9 e10, os inventores geraram um mutante de AIa-CpnIO humana que carecetanto dos Ioops móveis quanto dos Ioops de cobertura em forma de grampode cabelo β (denominado "Ala-Cpnl0-barril β"; ID SEQ Ne: 28; ver Exemplo6). Interessantemente, o mutante Ala-Cpnl 0-barril β apresenta-se como umaentidade ligeiramente maior em cromatografia de filtração em gel em compa-ração com AIa-CpnIO e o mutante Ala-CpnlO-Aml. Isso poderá implicar quea cobertura ajuda a manter as subunidades em uma conformação firmemen-te ligada. Em comparação, o Ioop móvel desestabiliza o heptâmero levandoa desmontagem mais eficiente, apesar de o heptâmero ser energeticamentemais favorecido do que os monômeros desmontados.
O polipeptídeo de Ala-Cpnl0-barril β foi testado no ensaio deinibição de RAW264.7-HIV-LTR-LUC na presença de LPS, paralelamentecom AIa-CpnIO e GroES de E. coli. Como mostrado na Figura 7, esse mu-tante apresentou aproximadamente 50% da atividade de AIa-CpnIO na mo-dulação de sinalização de TLR4, sugerindo que atividade imunomoduladorapoderá parcialmente contribuir para os Ioops de cobertura em forma degrampo de cabelo β ou poderia ser atribuída a estabilidade do heptâmero.Os resultados mostrados são reflexos de dois experimentos independentes.Exemplo 12 - Atividade imunomoduladora de um mutante de CpnIOcom término N
O término N de CpnIO é sabido auxiliar no direcionamento namatriz mitocondrial (após síntese no citossol). Entretanto, embora a maiorparte das proteínas da matriz mitocondrial transportem uma seqüência dedirecionamento com término N passível de clivagem, o término N de CpnIOnão é clivado, indicando que ele poderá apresentar uma função adicional.Os inventores investigaram a capacidade de um mutante de CpnIO humanacom término N em modular reatividade imune in vitro. O mutante testado(referido aqui como "Cpn10-termNES") transporta a seqüência "MNIR" comtérmino N de GroES de E. coli no lugar da seqüência "MAGQAFRKFL" hu-mana com término Ν. A seqüência de aminoácidos de Cpn10-termNÈS éproporcionada em ID SEQ N2: 14.
A Cpn10-termNES mostrou somente -12% de atividade deCpnIO em enovelamento de rodanese mediado por chaperona (com GroEL;ver Tabela 3). Confirmou-se, contudo, por cromatografia de filtração em gelque Cpn10-termNES é um heptâmero com Ioops móveis intactos para liga-ção com GroEL (Cpn60) (dados não mostrados).
Como mostrado nas Figuras 8A e 8B, o mutante CpnIO-termNES perdeu a capacidade de imunomodular ativação de HIV-TLR indu-zida por LPS em contraste com a atividade observada com Ala-Cpnl0. Issoindica que o término N de CpnIO é exigido para atividade imunomoduladorade CpnIO envolvendo TLR4. Portanto, ES-termNES-Cpn10, como E. coli(GroES)1 foi incapaz de suprimir NFkB induzida por LPS (isto é, modulaçãode TLR4) (ver Figura 8B).
Exemplo 13 - Capacidade reduzida de X-CpnIO em inibir ativação deHIV-LTR induzida por LPS
X-CpnIO foi testada usando o ensaio de inibição de RAW264.7-HIV-LTR-LUC paralelamente com Ala-Cpnl0. Como discutido no Exemplo 6,X-CpnIO carece do resíduo extra de alanina com término N e de um grupoacetila que está presente em CpnIO humana nativa. Nesse ensaio, uma Iuci-ferase repórter liga-se indiretamente a transdução de sinal de NFkB. NFkB éo fator de transcrição primário induzido por LPS. Atividade de Iuciferase émedida como unidades de luz relativas (RLU) ou contagens por segundo(CPS), dependendo da instrumentação utilizada. Como mostrado nas Figu-ras 9A e 5B, X-CpnIO inibiu parcialmente ativação de HIV-LTR induzida porLPS (aproximadamente 50% de atividade de Ala- ou Gly-Cpnl 0). Nesseconjunto de dados, parece que resíduos adicionais no término N de CpnIOtal como uma alanina poderão contribuir para a atividade imunomoduladorade sinalização de TLR4.
Exemplo 14 - GIy-CpnIO inibe ativação de HIV-LTR induzida por LPSGIy-CpnIO foi testada usando o ensaio de inibição deRAW264.7-HIV-LTR-LUC paralelamente com Ala-Cpnl 0. Como discutido noExemplo 6, GIy-CpnIO contém um resíduo de glicina que substituiu o resí-duo extra de alanina com término N de Ala-Cpnl0. Nesse ensaio, uma Iuci-ferase repórter liga-se indiretamente a transdução de sinal de NFkB. NFkB éo fator de transcrição primário induzido por LPS. Atividade de Iuciferase émedida como unidades de luz relativas (RLU) ou contagens por segundo(CPS), dependendo da instrumentação utilizada. Como mostrado nas Figu-ras 10A e 10B, GIy-CpnIO inibiu ativação de HIV-LTR induzida por LPS emum grau maior que Ala-Cpnl 0.
Como mostrado na Figura 16, um grupo acetila é estruturalmen-te mais similar a um resíduo de glicina do que um resíduo de alanina. Consi-dera-se, portanto, que a atividade do polipeptídeo de AcetiI-CpnIO (isto é,CpnIO nativa) é similar a Gly-Cpnl0.
Exemplo 15 - Uso de LPS Ultrapuro em ensaio de inibição deRAW264.7-HIV-LTR-LUC
Os dados tais como mostrados nas figuras 5-7 e 10 foram gera-dos usando LPS bruto no ensaio de inibição de RAW264.7-HIV-LTR-LUCacima mencionado. Nas figuras 11 a 14, foi usado LPS ultrapuro que é es-pecífico para TLR4. Os resultados das figuras 11 (AIa-CpnIOAmI), 12 (Ala-CpnIOAteto), 13 (Ala-Cpn10-barril β) e 14 (GIy-CpnIO) são muito similaresàs suas contrapartes como representado nas figuras 5-7 e 10. Isso mostraque os ensaios que são usados e apresentados aqui para a geração da ati-vidade imunomoduladora de CpnIO são específicos para TLR4.Exemplo 16 - Estudo de Endotoxemia em Camundongos
Um estudo de endotoxemia em camundongos foi realizado paradeterminar se a atividade imunomoduladora de vários polipeptídeos deCpnIO in vitro (isto é, Ala-CpnlO-Aml, AIa-CpnIO-Ateto e X-Cpnl0) reflete aatividade in vitro usando um modelo de septicemia em camundongos.Mudando ou suprimindo sistematicamente regiões ativas hipotéticas da mo-lécula de CpnIO e testando homólogos de CpnIO dos numerosos reinos bio-lógicos, podem ser descritas as regiões estruturais mínimas e/ou motivosbaseados em seqüências necessárias para atividade ótima, levando por fimà capacidade de projetar uma molécula mais potente para uso terapêutico.Até agora, diversas variações ou mutações em CpnIO foram efetuadas a fimde examinar a importância dessas regiões para atividade imunomoduladora(ver Figura 1).
A partir desses estudos in vitro, observa-se que em relação aAIa-CpnIO constructos com uma supressão na região em Ioop móvel ou decobertura em Ioop de CpnIO (isto é, AIa-CpnIO-AmI e Ala-CpnlO-Ateto, res-pectivamente) mostraram atividade compatível em termos de redução deativação de NFkB em resposta a ligação de TLR4 com LPS. Por outro lado,a CpnIO não-acetilada (X-CpnIO) mostrou capacidade significativamentereduzida de modular negativamente atividade de NFkB usando essa avalia-ção de atividade in vitro.No presente estudo, verificou-se que diversos variantes deCpnIO apresentam atividade similar a AIa-CpnIO em um modelo de inflama-ção in vivo (isto é, endotoxemia). O modelo de endotoxemia em camundon-gos mede a capacidade de CpnIO em reduzir produção de citocina inflama-tória induzida por LPS.
Exemplo 16a - Material e Métodos Para o Estudo de Endotoxemia emCamundongos
Os materiais e métodos seguintes usados no estudo de endoto-xemia em camundongos são descritos abaixo nos exemplos 17a(1) a 17a(2).
Exemplo 16a(1) - Camundongos Usados Para o Estudo de Endotoxe-mia
O estudo foi conduzido sobre 84 fêmeas de camundongosBalb/c. Todas eram adultas (>9 semanas de idade, peso médio de -20 g(0,02 kg)) e foram divididas em doze grupos com sete camundongos porgrupo (ver Tabela 5). Os camundongos foram alojados com um ciclo cla-ro/escuro 12/12 e com acesso a comida padrão de laboratório (Specialty Fe-eds, Glen Forrest, Austrália) e água à vontade. O peso de cada camundongofoi medido antes do início de injeções. Os grupos receberam as injeções se-guintes por via intravenosa (IV) na veia da cauda como mostrado abaixo (verTabela 5).
Exemplo 16a(2) - Fármacos/Soluções Para o Estudo de Endotoxemiaem Camundongos
Os fármacos/soluções usados no estudo de endotoxemia emcamundongos são os seguintes (listados de (A) a (H)).
(A) Tampão de formulação de proteína (TF): Esse tampão é ocontrole negativo no estudo e compreende Tris-HCI 50 mM (pH 7,6) + NaCI150 (<0,02 UE/ml). Esse tampão deve ser usado como um artigo de teste ediluente para controle positivo e amostras para teste.
(B) Ala-Cpnl 0: Esse polipeptídeo de CpnIO é o controle positivono estudo e apresenta uma concentração de estoque de 5 mg/ml (<0,01 U-E/mg). Uma solução de trabalho de 1 mg/ml preparada feita mediante dilui-ção de 400 μΙ da solução de proteína em 1,6 ml de tampão de formulação.(C) Ala-CpnlΟ-ΔιτιΙ: Esse polipeptídeo de CpnIO apresenta umaconcentração de estoque de 3,5 mg/ml (<0,03 UE/mg). Uma solução de tra-balho de 1 mg/ml foi preparada mediante diluição de 571 μΙ da solução deproteína em 1,429 ml de tampão de formulação.
(D) Ala-Cpnl O-Ateto: Esse polipeptídeo de CpnIO apresentauma concentração de estoque de 4,2 mg/ml (<0,1 UE/mg). Uma solução detrabalho de 1 mg/ml foi preparada mediante diluição de 477 μΙ da solução deproteína em 1,523 ml de tampão de formulação.
(F) X-Cpnl 0: Esse polipeptídeo de Cpn10 apresenta uma con-centração de estoque de 5 mg/ml (<0,04 UE/mg). Uma solução de trabalhode 1 mg/ml foi preparada mediante diluição de 400 μΙ da solução de proteínaem 1,6 ml de tampão de formulação.
(G) Endotoxina: Lipopolissacarídeo (LPS) foi obtido de SigmaChemical Company (No. de Cat. L6529). Imediatamente antes de uso, oconteúdo do frasco (1 mg) foi reconstituído em 1 ml de solução salina estéril.O conteúdo foi adicionalmente diluído (1/10) até 100 μg/ml em solução sali-na estérii antes de injeção de cada grupo.
(H) Controle de Endotoxina: Solução salina estéril para injeção foi obtida dePfizer, Asutrália (No. de Cat. DW-SC0010) sob uma concentração de 900mg/ml (0,9%) (<0,01 UE/ml).
Exemplo 16b - Administração de Fármaco e coleta de sangue para oEstudo de Endotoxemia em Camundongos
O protocolo para a administração de fármaco em diferentes gru-pos de camundongos é como mostrado na Tabela 5 (ver abaixo). Todas asadministrações foram realizadas via veia caudal por meio de injeções de vo-lumes de 100 μΙ em camundongos contidos concescientes. Todas as dosesde LPS foram de 10 μg/camundongo. Todas as variantes de CpnIO foraminjetadas sob 100 μg/camundongo (100 μί de voíume).
O protocolo para coletas de sangue é resumido abaixo na Tabe-la 5. Amostras de sangue foram coletadas via punção cardíaca sob aneste-sia com halotano (Zeneca Ltd., Macclesfield, Reino Unido) (SOP ET-011) ouvia sangria a coração aberto post-mortem. O sangue foi coletado em tubosde soro pediátrico sem anticoagulante (ativador de coágulo) (Greiner-bio-one, EUA, N5 de Cat. 450401). As amostras foram deixadas a temperaturaambiente por aproximadamente 5 min para aperfeiçoar coagulação antes decentrifugação a 12.000 rpm por 5 min (Biofuge 13, Heraeus Instruments) atemperatura ambiente. O soro foi transferido para um novo tubo e mantido a-20°C antes de transporte sobre gelo seco.
Todos os tempos de administração de fármaco e de coleta desangue foram registrados nas folhas de registro clínico (Formulário IMVS2061/A). As mesmas folhas de registro foram usadas para monitorar condi-ção geral por todo o Curso do experimento.
Tabela 5. Protocolo para estudo de Endotoxemia de Cpn10.
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Exemplo 16c - Análise Citométrica de Arranjo de Contas (CBA)
Análise CBA de inflamação em camundongos (N9 de Cat.552364, BD Biosciences) foi realizada em amostras de soro para avaliar al-terações no nível de citocinas associadas a inflamação (isto é, TNFa1 II-6, Il-10, MCP-1, IL12p70, IFN-γ). Soros de camundongos desafiados com LPS(Tabela 5, grupos 1, 3, 5, 7, 9 e 11) ou de camundongos de controle comsolução salina (Tabela 5, grupos 2, 4, 6, 8, 10 e 12) foram diluídos antes deanálise em diluente de ensaio conforme apropriado (1 em 5 para grupos tra-tados com LPS e 1 em 2 para controles com solução salina). Cada amostrafoi analisada em duplicata conforme instrução do fabricante utilizando ins-trumento BD FACS-Array com o software de CBA.
A fórmula seguinte foi usada para determinar o efeito de trata-mento com Cpn10 em camundongos desafiados com LPS. A redução per-centual de citocina induzida por LPS em camundongos pré-tratados comvariantes de Cpn10 (isto é, Experimento) em relação a camundongos não-tratados (isto é, Controle) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: %de redução = 100 - [(nível médio de citocinas de Experimento/citocina médiade Controle) χ 100].
Exemplo 16e - Análise ELISA
ELISA de TNFa em camundongos foi realizada usando kit ELISARnD Systems Duoset (No. de Cat. DY410) conforme instrução do fabricantepara confirmar a análise CBA. Diluições das amostras (1 em 3 diluições) epadrões foram realizadas usando PBS+FCS a 10% como diluente. Amostrasforam analisadas em duplicata.
Exemplo 16f - Observações Clínicas
O comportamento dos vários grupos de camundongos descritosna Tabela 5 foi examinado durante o período de 90 minutos após injeção deLPS ou Solução Salina e antes de sangria via punção cardíaca. Todas asobservações foram registradas e resumidas na Tabela 6. As observaçõesforam efetuadas imediatamente após injeção de LPS/solução salina e antesde sangria de camundongos por Punção Cardíaca (PC). Comparações deobservações clínicas foram efetuadas em relação aos grupos 1, 2 ou 3. Emgeral, camundongos tratados com LPS isoladamente (Grupo 1) mostraramos efeitos de septicemia induzida por LPS dentro de 15 minutos de injeção.Camundongos tratados com LPS demonstraram reduzida mobilidade e fo-ram menos responsivos a estímulos (por exemplo, barulho ou toque). Algunsefeitos adversos típicos devido a desafio com LPS tal como diarréia ou pêloeriçado não foram observados em qualquer dos camundongos neste estudo.Isso poderá refletir a potência relativa do número de lote de LPS usado nes-sa ocasião. Camundongos de controle tratados com solução salina (Grupo2) foram mais responsivos a estímulo, exibindo reações e mobilidade nor-mais.
Camundongos que foram pré-tratados com CpnIO e vários mu·tantes de Cpn10 apresentaram comportamento ligeiramente diferente emresposta a desafio com LPS, em relação ao grupo de controle de LPS não-tratádo. Camundongos pré-tratados com Ala-Cpn10 e Ala-Cpn10-Ateto(Grupos 3 e 7) pareceram menos subjugados, ligeiramente mais alertas eresponsivos a estímulo, mas continuaram amontoados pela maior parte doperíodo de observação. Interessantemente, camundongos pré-tratados comAla-Cpn10-Aml (Grupo 5) mostraram-se ligeiramente mais ativos e não seamontoaram tanto através do período de observação. O efeito de desafiocom LPS em camundongos pré-tratados com Acetil-Cpn10 (Grupo 9) tam-bém pareceu diferente daquele observado em outros grupos. Embora essescamundongos mostrassem comportamento similar ao Grupo 3 nos primeiros30-45 minutos após injeção de LPS, eles pareceram recuperar-se pelo finaldo período de observação e apresentaram aumento de mobilidade e vigilân-cia. Em contraste, camundongos pré-tratados com X-Cpn10 mostraramcomportamento muito similar com o Grupo 1. Esses camundongos mostra-ram-se muito inativos, menos responsivos a estímulo e amontoados pelamaior parte do período de observação. Os controles de solução salina paracada um dos grupos de mutantes de CpnIO (isto é, Grupos 4, 6, 8, 10 e 12)demonstraram uma ausência de sintomas clínicos adversos similares a ani-mais de controle no grupo de solução salina não-tratado (Grupo 2).
A sangria de camundongos desafiados com LPS foi tipicamentemais problemática na medida em que esses camundongos são geralmentehipotensivos (um sintoma associado a septicemia). Sangrias por punçãocardíaca nesses camundongos foram mais lentas com reduzida recuperaçãode volume de sangue em relação a camundongos que não receberam LPS.Para camundongos que não foram capazes de sofrer sangria por punçãocardíaca direta, uma sangria post-mortem a coração aberto foi realizada.Tratamento com CpnIO não pareceu afetar ou melhorar recuperação san-güínea em camundongos tratados com LPS; contudo, em comparação comos animais de controle de LPS, observou-se que sangue de camundongostratados com CpnIO podia geralmente ser recuperado por punção cardíacadireta sem recorrer a uma sangria a coração aberto. Pelo menos 400 μΙ desangue foram recuperados de cada camundongo neste estudo. Todos osdesvios de uma sangria e recuperação normais foram anotados na folha deregistro clínico correspondente.
Tabela 6. Observação clínica de camundongos pré-tratados com váriasCpnIOs seguida de injeção de LPS/Solução Salina.
<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>
Exemplo 16g - Redução de Citocinas em Camundongos
É mostrado o nível médio das citocinas TNFa, IL-6 e IL-10 em ca-mundongos desafiados com LPS (ver Figura 15). Grupos tratados com CpnIOque demonstram significância estatística na redução de citocinas pró-inflamatórias em relação a animais que não foram tratados com CpnIO são in-dicados por asterisco. A redução percentual nas várias citocinas analisadas emcamundongos pré-tratados com várias CpnIOs em relação a camundongosnão-pré-tratados (como mostrado na Tabela 5) é indicada entre parênteses.Tabela 7. Redução média e percentual de citocinas pró-inflamatórias induzi-das por LPS em camundongos desafiados com LPS tratados com vários mu-tantes de Cpn 10.
<table>table see original document page 70</column></row><table>Análise CBA para níveis séricos de citocinas
Amostras de soro de cada camundongo foram analisadas usan-do o ensaio CBA de inflamação em camundongos BD para a detecção decitocinas pró-inflamatórias circulantes. O ensaio detecta citocinas TNFal IL-6, IL-10, IL-12p70, MCP-1 e IFNy na amostra de teste. As análises foramrealizadas em amostras que foram diluídas em série (ver Exemplo 16a) paradetecção ótima nos limites do ensaio. Todas as amostras foram analisadasem duplicata.
Foi examinada a expressão relativa das citocinas TNFa, IL-6 eIL-10 em animais de controle versus animais tratados com CpnIO como índi-ces de inflamação nesse modelo de septicemia em camundongos foi. Noquadro de tempo deste estudo de endotoxemia (90 min de administração deLPS), os níveis de citocinas IFNy, MCP-1 e IL-12p70 estão geralmente forados limites de detecção desse ensaio e, portanto, os dados não são apre-sentados aqui. Como tal, essas citocinas não foram examinadas neste estu-do. Antes de análise dos resultados de CBA, foram avaliados a robustez dosdados com base em consistência entre replicatas e onde os pontos de dadoscaíram com relação à faixa linear da curva padrão. Pontos de dados extre-mos fora da curva foram excluídos da análise.
O valor absoluto e média de TNFa, IL-6 e IL-10 circulante nosvários grupos de camundongos neste estudo são mostrados na Figura 15.Como esperado, o nível médio de citocinas TNFa, IL-6 e IL-10 foi maior emsoros derivados de camundongos desafiados com LPS em relação a seuscontroles com solução salina (Figura 15A, C, E versus Β, E, F, respectiva-mente). Isso indica que a quantidade de LPS usada neste estudo induziuuma resposta inflamatória e que os níveis residuais dessas citocinas foramsuficientemente baixos nesses camundongos. Em algumas amostras decontrole com solução salina (Figura 15F, 'X-Cpn10 + Solução Salina') o nívelde IL-10 detectado foi tão alto quanto aquele que foi detectado em controledesafiado com LPS (isto é, Grupo 1 - 'FB + LPS'). Essas amostras foramanalisadas sob forma mais concentrada e, assim, fatores séricos endógenospoderão ter interferido na leitura do ensaio, contribuindo desse modo paraimprecisões nesses dados. Os dados também mostram que camundongosdesafiados com LPS reduziram os níveis séricos das citocinas TNFa, IL-6 eIL-10 quando pré-tratados com qualquer das proteínas CpnIO em compara-ção com camundongos pré-tratados não com CpnIO (Figura 15A, C e E,respectivamente). Para cada perfil de citocina, uma análise ANOVA de umavia (com teste post hoc de Tukey) foi realizada. A análise verificou que al-gumas das médias dos níveis de TNFa e IL-6, mas não da citocina IL-10,nos vários grupos são estatisticamente diferentes (Figura 16A, C e Ε). A faltade diferença estatística no nível de citocina IL-10, apesar da aparente redu-ção no nível médio de citocinas mostrada no gráfico, deve-se provavelmenteà grande variação da citocina IL-10 no grupo de controle isoladamente (Figu-ra 15E, 'FB + LPS'). Uma população de amostragem maior poderá aperfei-çoar a significância estatística dessas observações para estudos futuros.
Testes post hoc de Tukey mostraram que os níveis médios dascitocinas TNFa e IL-6 em grupos pré-tratados com Ala-Cpn10-Ateto ou X-Cpn10 (isto é, Grupos 7 e 11) foram considerados ser estatisticamente me-nores em relação ao grupo não-tratado (isto é, Grupo 1) (Tabela 7). Entre-tanto, em alguns grupos, uma redução estatisticamente significativa em cito-cinas pró-inflamatórias (em relação ao grupo não-tratado) foi somente ob-servada em um dos perfis de citocinas. Por exemplo, o grupo pré-tratadocom AIa-Cpn10-Aml apresentou um nível médio reduzido da citocina TNFa,mas não da citocina IL-6, em relação ao grupo não-tratado, e vice-versa parao grupo pré-tratado com Ala-Cpn10 (Tabela 7). Adicionalmente, análise esta-tística não verificou ser diferentes entre si os níveis médios de citocinas dosgrupos pré-tratados com variantes de Cpn 10.
Não obstante significativa redução estatística em somente al-guns dos grupos pré-tratados com variantes de Cpn 10, a tendência geralmostrou que todas as variantes de Cpn10 reduziram citocinas associadas ainflamação em camundongos desafiados com LPS. Em geral, aproximada-mente 30 a 50% de redução no nível das citocinas TNFa, IL-6 e IL-10 nes-ses camundongos foram observados (Tabela 7).
Discussão e Conclusões
Este estudo mostrou que pré-tratamento de camundongos comvários polipeptídeos de Cpn10 (isto é, Ala-Cpnl0, Ala-Cpn10-Aml, Ala-Cpn10Ateto e X-Cpnl0) pareceu reduzir efeitos clínicos de endotoxemia in-duzida por LPS. Camundongos que receberam LPS isoladamente apresen-taram sintomas típicos de endotoxemia (isto é, atividade, capacidade de res-posta e vigilância reduzidas). Por outro lado, camundongos pré-tratados comqualquer das proteínas Cpn10 pareceram menos afetados por desafio comLPS (isto é, mais responsivos e móveis a estímulo) (Tabela 6).
Análise CBA de citocinas associadas a inflamação mostraramque os soros de todos os camundongos pré-tratados com variantes deCpnIO antes de injeção de LPS apresentaram níveis reduzidos de citocinasTNFa, IL-6 e IL-10 em relação a soros de camundongos que receberam LPSisoladamente. Como esperado, camundongos pré-tratados com AIa-CpnIOmostraram níveis reduzidos de citocinas TNFa e IL-6, consistentes com nos-sos resultados anteriores (Johnson e outros, 2005). Os resultados correntessugerem que AIa-CpnIO poderá reduzir produção de IL-10 em resposta atodos os agonistas de TLR. Estabelecemos a seguir uma redução similarnos níveis dessas citocinas associadas a inflamação em camundongos pré-tratados com diversos variantes de CpnIO (Tabela 7). Embora análise esta-tística mostre que a redução de níveis das citocinas TNFa e IL-6 é somentesignificativa com alguns dos pré-tratamentos com variantes de CpnIO emrelação a grupo não-tratado (Figura 15A&C, Tabela 7), a tendência geralmostra que todas as proteínas CpnIO usadas neste estudo parecem modu-lar negativamente a resposta inflamatória a LPS.
Os resultados de endotoxemia in vivo revelam que todos os poli-peptídeos de CpnIO estudados (isto é, AIa-CpnI 0, Aia-CpnlΟ-ΔιπΙ, Ala-CpnIOAteto e X-Cpnl0) apresentam atividades similares a Ala-Cpnl0. Issoreconfirma que as regiões em Ioop móvel e de cobertura em Ioop de CpnIOnão necessárias para modulação da resposta a ligação TLR4-LPS. As varia-ções observadas nas atividades de X-CpnIO in vitro não poderiam ser avali-adas no estudo de endotoxemia na medida em que os níveis médios de cito-cinas entre grupos pré-tratados com variantes de CpnIO não são estatisti-camente diferentes.
Exemplo 17 - Purificação de CpnIO a partir de fermentação de E. coliem batelada
Foi desenvolvido um bioprocesso para a produção de polipeptí-deos de Cpn10. Como demonstrado abaixo, esse processo tem sido utiliza-do com êxito para a produção de -20 g de CpnIO recombinante humana apartir de 100 litros de fermentação de E. coli com >99% de pureza, ^0,03 EUmg"1 de endotoxina e <155,3 pg mg"1 de DNA. O processo é descrito em li-nhas gerais abaixo.Fermentação
Um frasco contendo a cepa de E. coli XL1 -Azul que abriga oplasmídeo AIaCpnI 0_pPL550 foi reavido do banco de células precursoras(ver 'Métodos Gerais' acima) e as células 'pré-cultivadas' da noite para o diaem Caldo de Soja sem suplementação com antibiótico a 30°C. Uma culturade inóculos foi subseqüentemente preparada para o biorreator de 100 L,mantendo o meio acima e os parâmetros de temperatura de crescimento.Uma alíquota desse inóculo foi colocada em um biorreator de 100 L em ummeio mínimo enriquecido com peptona à base de soja sem conter produtosde origem animal (BresaGen, SA, Austrália) e sem suplementação com anti-biótico. A cultura no biorreator não exigiu alimentação em batelada e a tem-peratura foi mantida através de toda a fase de crescimento a 30±0,1°C. OpH foi mantido em 7,0±0,2 pela adição de amônia. Indução de CpnIO foi ob-tida por meio de um deslocamento de temperatura para 42°C sob umaD0600 de 10 e incubação adicional a 42±0,1°C por 3 horas, em cujo tempoa fermentação atingiu uma D0600 entre 20-25.
Lise celular e preparação de um Sisado solúvel
Células bacterianas (peso molhado de -3,5 kg) foram peletiza-das por centrifugação (5.000 χ g), ressuspensas em Tris-HCI 25 mM (pH 8,0)e lisadas mediante 3 passagens através de um homogeneizador sob pres-são APV Gaulin Modelo 30CD a 48 MPa (7.000 psi) (APV, EUA) dentro detrês horas da completação de fermentação. A CpnIO solúvel contida no Iisa-do bacteriano foi colhida após peletização de fragmentos de células usandouma centrífuga de vazão Westfalia MSB-7. Aproximadamente 20 L de Iisadoclarificado foram armazenados da noite para o dia a 4°C.
Purificação de CpnIO
Um processo de três etapas a jusante foi desenvolvido para puri-ficação de Cpn10, incorporando troca catiônica em Sulfopropil-Sefarose emContas Grandes (BBSP), troca aniônica de Q-Sefarose Fluxo Rápido (QFF)e cromatografia de troca catiônica de Alta Eficácia em Sefarose. A cromato-grafia foi realizada usando uma Unidade de Bioprocesso K-prime 40-11 (Milli-pore).Despirogenação de colunas, recipientes e tampões de cromatografia
Todas as colunas de cromatografia de troca iônica foram despi-rogenadas mediante lavagem com NaOH 1 M e equilibradas com tampãoaté os eluados retornarem ao pH e condutividade dos tampões específicos.
Todos os recipientes usados para armazenamento de tampão e recepção deeluados da coluna nas várias etapas de purificação não continham pirogênio.Todos os tampões usados na purificação foram produzidos utilizando ÁguaPara Injeção (WFI).
Cromatografia em Sulfopropil-Sefarose em Contas Grandes
O Lisado foi carregado por 20-40 minutos em uma coluna de tro-ca catiônica BBSP (BPG 300/500 com 8,6 L de resina BBSP SP-Sefarose,GE Biosciences) pré-equilibrada com Tris-HCI 25 mM, pH 8,0 (Tampão A),sob vazão linear de 75 cm h"1 e uma taxa de carga de até 10 g de CpnIO porlitro de resina. Após lavagem com Tampão A, a CpnIO capturada foi eluídacom Tampão A contendo NaCI 150 mM e frações de 1 L foram coletadas.Análise SDS-PAGE mostrou ser o pool de BBSP >95% puro.
Cromatografia de Fiuxo Rápido em Q-Sefarose
O eluado de BBSP foi dessalgado contra duas alterações de 15volumes de Tampão A a temperatura ambiente. A primeira etapa de diálisefoi realizada por 2-3 h, seguida de transferência para um tanque de TampãoA novo no qual a diálise continuou da noite para o dia. A redistribuição deNaCl dos sacos de diálise para o tampão do tanque foi monitorada por meiode medição de condutividade do dialisado (Cyberscan 100, Eutech Instru-ments, Singapura) contra padrões calibrados. O pool de BBSP dialisado foicarregado em uma coluna de BPG 200/500 recheada com 4,7 L de resina detroca aniônica QFF (GE Bioscienees) pré-equilibrada em Tampão A sob umavazão linear de 75 cm h"1 e uma taxa de carga de até 15 g de CpnIO por litrode resina. A vazão de troca aniônica por QFF contendo a CpnIO foi coleta-da. Sob as condições de carga, a maior parte das proteínas, ácido nucléico eendotoxina de células de E. eoli permaneceu ligada à matriz.
Cromatografia de Alto Desempenho em Sulfopropil-Sefarose
A vazão de QFF foi aplicada a uma coluna de BPG 100/500 re-cheada com 1,67 L de resina SPHP {GE Biosciences), pré-equilibrada comTris-HCI 50 mM, pH 7,6 (Tampão B), sob 15-20 g de CpnIO por litro de resi-na. A Cpn10 ligada foi eluída com um gradiente linear de NaCI 0-120 mMsob 15 L e frações de 0,5 L foram coletadas. As frações foram divididas deacordo com cromatografia por exclusão de tamanhos (SEC), HPLC e análi-ses SDS-PAGE. As concentrações de proteína CpnIO e íons NaCI foramdeterminadas por Absorbância de UV a 280 nm e pelo método Eletrodo Se-letivo de íons (IDEXX, Austrália), respectivamente.
Formulação
Com base em medições de íons Na+ e Cl" combinadas com me-dições de condutividade das frações de SPHP divididas, o tampão foi ajus-tado em uma formulação final de Tris-HCI 50 mM, pH 7,6, contendo NaCI150 mM. A CpnIO formulada foi filtrada através de um filtro de 0,2 μιτι sobcondições assépticas. A solução filtrada foi ditribuída em garrafas plásticasde 500 ml sem pirogênio, com cada garrafa recebendo 500 ml para um totalde 2,5 g de CpnIO por garrafa.Análises SDS-PAGE
Análises SDS-PAGE em Iisados de células de E. coli e fraçõescromatográficas foram realizadas usando géis de gradiente Bis-Tris 4-12%NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo do fabrican-te. Os géis foram corados com Azul de Coomassie Brilhante e cada gel in-cluiu proteína CpnIO e padrões de pesos moleculares.Quantificação de CpnIO purificada por espectrofotometria
Concentrações de CpnIO purificada foram determinadas porabsorbância de UV (espetrofotômetro SmartEspec-3000 BioRad) a 280 nmusando um coeficiente de extinção de 0,353 mg"1 mL"1 cm"1. Deve-se obser-var que o SmartEspec-3000 BioRad tipicamente retorna a um valor A2eo nmde 0,59 para soroalbumina bovina (Pierce), enquanto o valor na literatura éde 0,67 (recurso técnico Pierce No. TR0006.0).
Resumo de pureza de CpnIO e rendimentos proporcionados pe-lo processo de purificação acima descrito são mostrados na Tabela 8. Em(A) concentrações totais de proteína foram determinadas pelo ensaio de pro-teína BCA (Sigma) e pureza de Cpn10 foi determinada por densitometria delisado de células e frações contendo Cpn10 após cada etapa de purificação.(B) Comparação da pureza final e rendimentos de três purificações deCpn10. Cada purificação foi preparada a partir de uma fermentação em bate-lada de 100 L de E. coli. Todas as preparações apresentaram uma purezafinal de Cpn10 >99% por SDS-PAGE corado com Coomassie. Unidades deendotoxina (EU) são expressas como EU por mg de Cpn10, enquanto níveisde DNA são expressos como pg por MG de Cpn 10.
Tabela 8A
<table>table see original document page 77</column></row><table>
Tabela 8B
<table>table see original document page 77</column></row><table>
Exemplo 18 - Composições
Moléculas e agentes da presente invenção, e aqueles identifica-dos por métodos da invenção, poderão ser usados para o tratamento ouprevenção de vários estados e condições de doenças. Tais moléculas e a-gentes poderão ser administrados isoladamente, embora seja mais típicoque eles sejam administrados como uma composição farmacêutica.
De acordo com a modalidade preferida de realização da inven-ção proporcionada aqui, composições específicas preferidas são descritasem linhas gerais abaixo. O que segue deve ser considerado exemplos me-ramente ilustrativos de composições e de maneira alguma uma limitação doescopo da presente invenção.
Exemplo 18(a) - Composição Para Administração Parenteral
Uma composição para injeção intramuscular poderia ser prepa-rada para conter 1 mL de água tamponada estéril e 1 mg de um agente oumolécula adequado.
Similarmente, uma composição para infusão intravenosa poderácompreender 250 ml de solução estéril de Ringer e 5 mg de um agente oumolécula adequado.
Exemplo 18(b) - Composição Parenteral Injetável
Uma composição adequada para administração por injeção po-derá ser preparada misturando 1 % em peso de um agente ou molécula ade-quado em 10% em volume de propilenoglicol e água. A solução é esteriliza-da por filtração.
Exemplo 18(c) - Composição em Cápsulas
Uma composição de um agente ou molécula adequado na formade uma cápsula poderá ser preparada enchendo uma cápsula padrão de ge-latina dura de duas partes com 50 mg do agente ou molécula, em forma depó, 100 mg de lactose, 35 mg de talco e 10 mg de estearato de magnésio.
Exemplo 18(d) - Composição de Colírio
Uma composição típica para administração como colírio é des-crita em linhas gerais abaixo:
Agente ou composto adequado 0,3 g
Hidroxibenzoato de metila 0,005 g
Hidroxibenzoato de propila 0,06 g
Água purificada até cerca de 100,00 mlOs hidroxibenzoatos de metila e de propila são dissolvidos em70 ml de água purificada a 75°C e a solução resultante é deixada resfriar. Oagente ou molécula adequado é então adicionado, e a solução esterilizadapor filtração através de um filtro de membrana (tamanho dos poros, 0,22 μιτι)e assepticamente enchida em recipientes estéreis.
Exemplo 18(e) - Composição Para Administração por Inalação
Para um recipiente de aerossol com uma capacidade de 20-30ml, uma mistura de 10 mg de um agente ou composto adequado com 0,5-0,8% em peso de um agente de lubrificação, tal como polissorbato 85 ouácido oléico, é dispersa em um propelente, tal como freon, e colocada emum recipiente de aerossol apropriado para administração por inalação intra-nasal ou oral.
Exemplo 18(f) - Composição de Pomada
Uma composição típica para administração como pomada inclui1,0 g de um agente ou molécula adequado, juntamente com parafina molebranca até 100,0 g, disperso para produzir um produto liso homogêneo.Exemplo 18(g) —Composição de Creme Tópico
Uma composição típica para administração como creme tópico édescrita em linhas gerais abaixo:
Agente ou molécula adequado 1,0 g
Polawax GP 200 25,0 g
Lanolina Anidra 3,0 g
Cera de Abelha Branca 4,5 g
HidroxibenzoatodeMetiIa 0,1 g
Água desionizada & esterilizada até 100,0 g
O polawax, cera de abelha e Ianolina são aquecidos juntamentea 60°C, uma solução de hidroxibenzoato de metila é adicionada e homoge-neização obtida usando agitação a alta velocidade. A temperatura é entãodeixada cair para 50°C. O agente ou molécula é por conseguinte adicionadoe disperso e a composição deixada resfriar com agitação a velocidade lenta.
Exemplo 18(h) - Composição de Loção Tópica
Uma composição típica para administração como loção tópica édescrita em linhas gerais abaixo:
Agente ou molécula adequado 1,2 gMonolaurato de Sorbitano 0,8 gPolissorbato 20 0,7 gÁlcool Cetoestearílico 1.5 gGlicerina 7,OgHidroxibenzoato de Metila 0,4 gÁgua Esterilizada até cerca de 100,00 ml
O hidroxibenzoato de metila e glicerina são dissolvidos em 70 ml da água a 75°C. O monolaurato de sorbitano, polissorbato 20 e álcool ceto-estearílico são fundidos juntamente a 75°C e adicionados à solução aquosa.A emulsão resultante é homogeneizada, deixada resfriar com agitação con-tínua e o agente ou molécula é adicionado como suspensão na água restan-te. Toda a suspensão é agitada até homogeneização.Listagem de Seqüência
<110> CBioLimited<120> CHAPERONINA 10 MODIFICADA<13 0> 718320
<160> 44
<170> Patrentln versicro 3.2
<210> 1<211> 102<212> KOT
<213> Homo BapiexiB<400> 1 .
Met Al» Gly Gln Ala Plia Arg Lye Phe Leu Pro leu Phe Asp ftrff Val1 5 10 15
Leu Val Glu Arg Ser Ala. Ala Glu Thr Val Thar fcys Gly Gly Xle Met20 25 30
Jl0w Pro Glu Ziye Ser Cfl·» Gly LyB Val Leu Gla Ala ®har Val Val Ala35 40 45
vai Gly Ser Gly Ser Lye Gly Vye Gly Gly Glu Ile Gln Vro Val Ser50 55 60
Val Lys V*·1 Gly *** Val 1^u 3^w Vxo Glu ^y* Gly Gly ^ir 1^b65 70 75 80
Val Vil Leu Asp Asp IflfS Asp Tyr Phe teu Phe Arg Asp Gly AHP He05 90 95
Lieu Gly Xgtb Val Asp
100<2Í0> 2
<211> 309
<212> ' DHA
<213> Hemâ α ópiona
<400> 2
atggeaggae aagcgtttag aaagfcfctQtfc ecactctttg atítíjjag-eatt ggttgaaagg 60agtgctgctg aaactgtaac eaaaggaggc afctatgctrc cagaaaaatc tcaaggaaaa 120CTtattgcaay eaaeastasrt cgctgttgga tçarggfctcfca aaggaaaggg tSffagagatt 180eaaoeagtta gcgtgaaagt tggagataaa grttcttctcc eagaatatgg aggeaeeaaa 240gtagttctag atgacaagga ttatttecta tttagagatg gfcgacattdt tggaaagbae 300gfcagaofcga
<210> 3
<211> 86
<212 > KUC
<213> HomO oapionc
<400> 3
Het Ala Gly Gln Ala Arg Lys Fbe Iiea Fro Leu Plia Asp Arg Vfel1 5 10 15
Iiew Val Glu Arg Ser Ala Gly Lys Val Lau Gla Ala Thr V^l Val Ala20 25 30
Vil Gly Ser Gly Ser Lyc Gly Lye Gly Gly Glu Ile Gln Pco Val Bos35 40 45
Val Kys Val GXy Aep I<ys Val Leu Leu Pro Clu Tyr Gly Gly Ihr Lye50 55 60
Vil Viil Lett Aap Aep Iys Asp Tyx Phe Leu. Phe Arg Asp Gly Ásp Ile65 70 75 80
Leu Gly tys Tyr vai Aep85<2105> 4
<2ll> 261
<212> DHA
<213> Hamo sapieUS
<400> 4
Btoyoaggao aagcgttttag aaagtttctb ccaetcbttg aeegagtabb ggbfcgaaagg 60
agtgctggaa aagtattgea agciaacagta gfcdgctgbtg gatcgggbbc taaaggaaag 120
ggtggagaga ttoaaecagb tagegtgaaa gttggagata aagbbcbbcb cdcagaabab 180
ggaggcacea aagbagbbct agabgacaag gatbabbtee babbbagaga tggtgacafct 240
Ctbggaaagb aogbagaübg a 261
<210> 5
<211> 264
<212> DNA
<220>
<213> Artificial
<223> Seqüência sintética
<400> 5
atggcggcgg gtcaggdgtb bcgtaaabtb ctgccgafcgb ttgafcegbgt tcbggbtgaa 60
ogfeagegegg gcaaagfctdfc gcaggcgaee gttgttgcgg ttggtagcgg cagcaaaggfc 120
aaaggcggtg aaatboagcc ggttagçgtg aaagtaggcg ataaagtcct gctgücggaa 180
tatggcggea ccaaagbtgt ectggatgat aaagattacb bccbgfctccg cgabggtgat 240
atcctgggca aatacgtgga fcfcaa 264<210> 6
<211> 95
<212> PRT
<213> Bcmo sapiens
<400> 6
Met Ala Gly Gln Ala Fhe Arg XyB Ehe Leu Pro Leu She Asp Axg Val1 5 10, 15
Léu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glti *hr Val Thr Lye Gly Gly Ile Met20 25 30
leu Pro Gln Lye Ser Gln Gly Lye Val Leu Gla Ala OTur Val Val Ala35 40 45
Val Gly Ser Gly Ser Gl» Pro Val Ser Val Hye'Val Gly Aep Lys Val50 55 60
Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly . Xhx Lys Val Val Xieu Asp Asp Lys Aep65 70 75 80
Tyr Phe Iieu Phe Arg Αβρ Gly Abp Ile Leu Gly Iflre Tyx Val Asp85 90 95
<210> 7
<211> 288
<212> DHS.
<213> Homo Sapiene<400> 7
atygcaggac aagcgfctfcag aaagtfctctt ccacccctrg accgagtatt ggttgaaagg SO
agtgctgctg aaactgtaac caaaggaggc attntgcttc cagaaaaatc tcaaggaaaa 120
gtatfcgcaag caacagrtag-t egctgtttgga tcgggtfccfce aaccagtt&g cgtgaaagtt 180
ggagataaag ttcfctctcca agaatatgga ggeaeeaaag tagttctaga tgacaaggat 240
tatttcctat fctngagatgg tgacattctt ggaaágtacg tagactga 288
<210> 8
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> Seqüência sintética
<400> 8
atggcggcgg gtcaggegfct: tcgtaaattt cfcgecgefcgfc ttgatcgfcgt tctggtfcgraa 60
cgtacgcgg oggaaaccgt taccaaaggc ggtattatgd tgccggaaaa aagccagggt 120
aaagttctgc aggcgaçcgt tgttgaggtt ggtagoggta getíagcosgfc tagcgtgaaa 180
gtaagcg^ta aagfctctget gocggaatat srgegsfcacea aagttgtget ggatgataaa 240
gattacttod tgttcegega tggtgatatc otgggoaaat acgttggafcta a 231
<210> 9
<21X> 79
<212> SRT
<213> Bomo eapiena
<400> 9
Met Ala Gly Glu Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Pha Asp Arg Val1 5 10 15Lieu Val Glu Argi Ser Ala Gly IVal Lgu Gln Ala Olbr Val Val Ala20 25 30
Val Gly Ser Gly Ses Gln Pro Val Ser Val Lye vai Gly Aep lys Val35 40 45
Lieu Iieii Pro Glu Hyr Gly Gly Ttar Iors Val Val Leu Aep Agp Iors Asp50 55 60
Tyr Phe Leu Blie Arg Asjj Gly Asp Xle Leu Gly Ivb Tyx Val Asp65 70 75
<210> 10
<211> 240
<212> MNA
<213> Hfflno eapiens
<400> 10
afcggeaggac aagcgtttag aaagttcccc ccaatctbtg accgagfcatt ggttsgaaagg 60
agcgctggaa aagfcafctgoa agaaaeagtta gbogctgfctg gatcgggtte ttíBaeeaítt 120
agegfcgaaag teggagafcaa agttctttcttc ccagaatatg g&ggc&ccaa agtagetscta 180
gatgacaagg attattfcaet atttagagafc ggbgacatttc ttggaaagta egeagaetga 240
<210> 11
<211> 97
<212> PKT
<213> Eeeherlcliia coli
<400> 11
Met Aen Ile Arg Pro Iieu His Aap Arg Val Xle Val Iys Arg Lys Glu1 5 10 15
Val Gln Xbr Iiys Ser Ala Gly Gly Zle Val &eu Tbr Oly Ser Ala Ala20 25 30
Ala Lys Ser Xhr Afff Gly Glu Val l>eu Ala Vál Gly Aen Gly Arg Ile35 40 45
Iien Glu Aen Gly Glu Val IiyB Pro I^u Aqi Val Lye Val Cly Asp Xle50 55. 60
Val lie Pke Aea Asp Gly Tyr Gly Val í<ye Bar Glu Iys Ile Asp Asn65 70 75 80
Glu Glu V*1 Z<eu lie Kat Ser Glu Sar Asp Ile Xieu Ala Ile VHl Glu85 90 95
Ala
<210> 12
<211> 16
<2l2> SKP
<213> Homo aapieae
<400> 12
Alá Glu Uir Val a7hr Iiya Gly Gly He Ktet Leu Pro Glu Lys Sor Gln1 5 10 15
<210> 13<211> 7
<212> PRT
<213 > Hamo gapiens
<400> 13
Lys Gly Iiys Glv Gly Glu Xle1 5
<210> 14
<211> 96
<212 > PRT
<213> Pomo sapiens
<400> 14
Met Ann II© Arg Pro teu Phe Aap arg Val Iieu Val Glu Arg Se» Ala1 5 10 15
Ala GlU Thr Val Tiwc Iare Gly Gly Ile Met I.ou Pro Glu Kye Ser Gln20 25 30
Gly Iiys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys35 40 45
Gly Ziys Gly Gly Glu Ile Glu Pro Val Ser Val I«ys Val Gly Aep Lys50 55 60
Val Leu Leu Ero Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val Val Lou Aap Asp Lys65 70 75 80
Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Aep Gly Aep Ile teu Gly LyS tyr Val Asp85 90 35<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética
<400> 15
ctgtaaccaa aggaggcgaa gaggaaccag aaaaatctca agg 43
<210> 16
<211 > 43
<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> Seqüência sintética
<400> 16
ccttgagatt tttctggttc ctcttcgcct cctttggtta cag 43
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética
<400> 17
ccaaaggagg cattttcatt ccagaaaaat ctc 33
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética
<400> 18
gagatttttc tggaatgaaa atgcctcctt tgg 33<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> Seqüência sintética
<400> 19
ctgtaaccaa aggaggcatt ataattccag aaaaatctca agg
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética<400> 20
ccttsasattt ttfcetggaat tataatgccfc cetttgstta cag
<210> 21
<211> 102
<212> FRT
<213> BomO BapieliO
<400> 21
Ala Αla Gly Gln Ala Phe Arg Iyfl Pho X.eu Pro Leu Phe Asp Arff Val1 5 10 15
Leu Val GlU Airg Sor Ala Ala Glu Shr Val Thr Lye Sly Gly Ile Met;20 25 30
Leu Paro Glu Icire Ser Gla Gly Iiys Val Leru Gla Ala Thr Val Val Ala35 40 45
vai Gly Ser Gly Ser Kys Gly lore Gly Gly Glu lie GXn Pro Val Ser50 55 60
Val I-ys vai Gly Asp X»ys vai l.au iou Pro Glu Tyr Gly ©Iv *h* 1^s65 70 75 80
Val Val Iieu ABP Aap Iys Aep ®yr Phe Leu Phe Arfif Aep Gly Asp ϊΐβ65 SO 95
fceu Gly Lys Tyx Val Aep100<210> 22
<211> 312
<212> DNA
<213> Bomo sapiens
<400> 22
atsgcagcag yaeaagcgtfc tagaaagfcfct ettccaattít fctgaccgagt attgattgaa 60
aggagtgcfcg etgaaactgt aaccaaagga ggcattatgc ttcoagaaaa atofcoaagga 120
aaagtafctge aagcaacaarfc agtcgctgtt ggafecgggttt ctaaaggaaa gggtggagag 180
attcaatíeag ttagcigfcgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata «ggaggciaüc 240
aaagtagfcte fcagategacea ggafcfcattfcc cfcatttagag atggfcgaeafc tettgrgaaag 300
tacgtagaot ffa 312
<210> 23
<2ll> 101
<212> J?KS?
<213> Hono sapiens
<400> 23
ala Gly ela, Ala Phe Arg Lys Phe LSU Pro.Leu Phe Aep Arg Val Leu1 5 10 15
vai Glu Arg Sex Ala Ala Glu Thr Val Thx Lys Gly Gly Ile Bet Leu20 25 30
Pro Glu Lys ser Gln Gly Icrs Val Law Gla Ala OShr Val Val Ala Val35 40 45
Gly Ser Gly Ber Lys Gly Lye Gly Gly Glw Ile Gla Pra vai Ser Val50 55 60Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Bro Glu Tyr OXy Gly Vbx Lye Val65 70 75 80
Val Xieu Abp Abp Lys Asp Tyr Plie Deu Phe Axg- λβρ Gly Asp Xle Leu85 30 95
Gly Iiys Tyr Val Asp100
<210> 24
<21l> 86
<212> PRT
<213 > Homo sapiens
<400> 24
Ala Ala Gly Gln Ala Plie Arg- Iiys pbe Leu .Pro Xieu Pbe Aep Arg Val
1 5 10 15
Leu Val Glu Aru Ser Ala Gly JUys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala20 25 30
Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lyo Gly Gly Glu Ile Gln Pro vai Ser35 40 45
Glu Tyr Gly Gly Tbr Lys Leu Gly Lys Tyr Val Asp50 55 60
Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Lau Ehe Ar? Asp Gly Asp Xle65 70 75 80
Val Lys Val Gly Asp Lyd Val Lau Leu Fro 85<210> 25
<211> 264
<212> DHA
<213> Homo sapiens
<400> 25
atggcggcgg gtcaggcgtt tcgtaaattt ctgccgctgt ttgatcgtgt tctggttgga 80cgtagcgcgg gcaaagttct goaagcgaco gttgttgagg ttggtagcgg cagcaaaggt 120aaaggcggtg aaattcagcc ggfctagcgtg aa&gtgggesr ataaagrfcfccb gcfcgccggaa 180tatggcggca. ccaaagttgfc gccggatgat aaagatt^ct tcctgfctccg cgatggtgat 240atcctgggca aatacgtgga ttaa 264
<210> 26
<2ll> 95
<212> PHT
<213> Hamo sapione
<400> 26
ala ala Gly Gln Ala PKq Arg Iys Plve Ιιβιι Pro Leu Slie Abp Aarg Val1 5 10 15
Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glw Thr Val tthr Lya Gly Gly Ile Ktet20 25 30
Leu Pro Glu Inyp Ser Gln Gly Lya Val Iieu Gln Ala Thr Val Val Ala35 40 4S
Val Gly Ser Gly Ser Gln Pro val Ser Val Lys Val Gly Aap Lys val50 55 60lieu IrfiU Pto GlW Tyr Gly Gly Tfar Lys Val Val leu Asp Asp Iya Asp65 70 75 80
Vtyr SHa Lett Phe Azg Asp Gly Asp Ile Χ<οιι Gly Z^s Tyr Val Asp85 90 95
<210> 27
<211> 291
<212> SNA
<213> Home sapieae
<400> 27
atggcggcgg gtcaggcgfct tcgtaaahtt; otgccgdtgt tfcgatcgtgt tcfcggttgaa 60
cgtasjegcgy cgsaaaedgc fcaecsaaggc gg-Cattatjrc taaeggaaaa aagrceaggrgt 120
aaagttotgo aggegaecgfc tgfcfcgcggfct ggtagcggta geàagacgnt tagegtgaaa 180
gfegggegata aag-tfccfcgofc geaggaatat ggcggcacca aagttgrfcgce ggatgataaa 240
gattaettctí tgtetccgega tggtgatattí ctgggcaaafc adgfcggatta a 291
<210> 28
<211> 79
<212 > VXB
<213> Hoico saplans
<100> 28
Ala Ala Gly Gln Ala Pie Axgr Vyb Pbe Leu Fro Zien Phe Asp Axg Val1 5 10 15
Leu Val Glu Arg Ser Ala Gly Lyo Val Leu Gln Ala !Chr Val Val Ala20 25 30
vai Gly Sar Gly ser Gla Pro Val Ser Val Ijyp Val Gly Asp I<ye Val35 40 45
Xeu Lau Pro Glu Tyar Gly Gly Thir Iys Val Val Leu Asp Aep Lys Aep50 55 60
Tyr Pbe Xiru Plie Arg Aep Gly Asp Ile jjeu Gly Iqt8 Tyr Val A Bp65 70 75
<210> 29
<211> 243
<212> DBA
<213> Homo Sapiens
<400> 29
Btggcagoasr gaeaagegtb tagaaagrttt ettee&efctífc fcfcgaecgagfc atfcggtfc$i»a 60
eggasrtgcfcg gaaaagt&bt gcaagcaaca gtagttcgrctff fctggatcsrsg ttctcaaeaa 120
gttagcgtg aagttggaga taaagttctt ctcceagaat atggaggcae caaagtagfct 180
Cteapatgaca aggattattt cctattfcag-a gatggtgaca ttcttggaaa gtacgfcag&e 240
tga 243
<210> 30
<211> 102
<212> ERT
<213> BOSBO Sapiens
<400> 30
Gily Ala Gly Gln Ala Pho Arg Lys Phe I>eu firo. Leu Pbe Asp Arg Val1 5 10 15
I»au Val Crlu Arg Ser Ala Ala Glu Tbr Val Th* Lye Gly Gly Ile Met20 25 30Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Iieu Gla Ala Thr Val Vel Ala
Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Glm Pro Vai Ser
Val LyB vai Gly Aep Iors Val Leu teu Pre GXu IByx Gly Gly Thr Lys
Val Val Leu Aep Aep Lye Asp Tyr Pha Leu Phe Axg Asp Gly Asp Ile
Leu Gly Lys Tyr vai Asp100
<210> 31
<211> 312
<212> SBA
<2l3> Bomo BSipienB
<400> 31
at Srggtgcgg geoaggcgt;t tcgtaaatfct ctgcogetgt ttgafccgtgt gctggbtgaa 60
cgbagogegg oggaaaoogb gaeeaaaggc ggeattatgc bgcc??aaaa aagccagggc 120
áaagbgctgc aggcgaCCgtt ggctgcggtfc ggcagcggca gcaa&ggcatt aggcggcgaa 180
attcagocgg fcgagcgtgaa agfcgggcgat aaagtgctgc Cgcoggaafca tggcggcacc 240
aaagbggbgd tstfatgataa. agattatttt ctgtfcüogcg atggcgabat tctgggcaaa 300
tatçjtggatt ga 312
<210> 32<400> 000<210> 33<400> 000
<310> 34
<211> 294<212> DNA
<213> Ε. coli
<400> 34
atgaafcattc! gfcccafctgo* fcgatcgcgtg attísrtcaagc gtaaagaagfc fcgasaetaaa 60
tctffcsfcggrca gOatcgtfcct gaccggatet geagcggata aatccacceg cggcgaagtg 120
CtgsiotRfccig gcaatgjroeg taxetít-tg».:». a&tggcgaag tgaagccgct g^atgtgaaa 180
gfcfcggcgatía tcgtfcatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgaga» gafccgaeaat 240
gaagaagfcgt tgaccatg-fcc egaaagegae afcteeggcaa ttgttgsago gtaa 294
<210> 35
<211> 102
<212> PK*
<213> Βίαπο sapien
<400> 35
Ala Ala Gly Qln Ala Fhe Arg Ciye Ptô Leu Pro Leu Phe Ahp Axgr VHl1 5 10 15
XiSIi Vftl elu Arg Sar Ala Ala 61a ato Val Vlur Lya Gly Gly Ile SLe20 25 30
Xle Bso Glu I»yb Ser GlH Gly Lys Val Ixsu GXa Ala Tki Val Val Ala35 40 45Vfel Gly Ser Gly Ser Lya Gly Lye Gly Gly Glu Lle GXa Pro Val Ser
Val Lys Val Oly Asp Lye vai Lau teu Pro Slu Tyx Gly Gly Thr Iya
Val Val Leu Asp Asp LyS Aep Vyx Plie Leu Sbe Arg Asp ely Aep Ile
leu Gly Lys Xyr Val Aep100
<Z10> 36
<211> 312
<212> BMA
<213> SComo sapion
<400> 36
atggcageag gacaagcgtt tagaaagtfct ottecactct ttgaccgagfc attggttgaa 90
atfSTaStoctg Ctffaaactgfc aaccaaagga ffffcatttfcca ttecagaaae afcctcaagga 120
aaagfcatetgc aascaacagt asrtcgcfcgtfc ggatügggct ctaaaggaaa gsgtçroag-ag 180
attcaaccag ttagcgrtg^a agttggagatt aaagttatfce fceceagraafca fcggaggcaoo 240
aaagfcagttc tagatgaeaa ggattattfce etatttagag afcggtgacafc tettggaaag 300
haogfcagacf: ga 322
<210> 37
<2ll> 102
<212> SRT
<213> Homo aapie»
<400> 37Ala AXa Gly SLn Ala Phe Arg Lye Phe ICieu Pro Lbu Phe Aep Arg vai1 5 10 15
leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly lie Lle20 25 30
Ile Pro Glu Lys gar Gln Gly Iys Val ieu Gla Ala Hhr Val Val Ala35 40 45
Val Gly Ser Gly Ser Xefa Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gla Pro Val Ser50 58 60
vai i&b vai Gly asp Iqo Val Iieu Leu Pro Glv Tyr Gly Gly Thr Lye65 70 75 80
Val Val Iieu Asp Asp Lye Asp Tyar Phe Zieu Phe Arg- Asp Gly Asp Xle85 90 95
Leu Gly Lyo Vyr Val Aap
100
<210> 36<211> 312<212> SNA<213> Komo sapien
<400> 38
afcggüagdag gaeaagcgtfc tagaaagett cctccaotct ttgaoogagt atxggttg&a 60
aggagtgctg etgaa&eegt aaccaaagga ggcattataa tfcccagaaaa afcefceaagga 120
aaagtafcfcgc aageaacagt agbcgctgtt ggategggtt etaaaagaaa gggtggragag 180
attcaaccag tfcagcgtgaa agfefcggagafc aaagfc-tatto bcceagaata fcggaggcacc 240
aaagbagtfcc tag&bgacaa ggattattfcc cbabbtagag abggbgaCat tOttggaaag 300taogtagact ea
<210> 39
<211> 110
<212> PRT
<213 > Homo sapien
<400> 39
Ala Ala Gly Gla Ala slie Arg1 Lya Slie Lau ρro Iieu Kbe Asp Arsr VU1 5 10 IS
Leu Val Gla Axg Ser Ala Ala Glu TItr Val Vhr Lys Gly Gly Glu Glu20 25 30
Glu Pxo Glu Liya Ser Gla Gly Lye Val Xieu Gla Ala Thr Val Val Ala35 40 45
Val Gly Ser Gly Ser Egra Gly Lys Gly Gly Glu Zle Gln Val Ser50 55 60
Val Lys Val Gly Asp Lys Val Lau Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lya65 70 75 00
Val Val Leu Asp Aap Lya Asp íryr Phe Lieu Phe Axg Aep Gly Aep Ile85 90 95Leu Gly Lys Tyr vai Aap Iieu Glu His His His His Bis His100 105 110
<210> 40<211> 336<212> DHR
<213 > Homo Sapien
<400> 40
atgyeagcag gaeaagcgtt tagaaagttt cttccactcC ttgacogagt attsgttgaa 60
npgagrtgctg ctgaaaetgt aaccaaagga ggcgaagagg aaccagaaaa afccteaaga 120
aaagtafctyc nagcaacagt agtçgcegtt ggatcgggfct etaaaggaaa gggtggagag 180
Bttcaaccag ttagcgtgaa agttggagat aaagttcttc tcccagaata tggaggcacc 240
aaagtagtfcc tagacgacaa. ggattatttd efcatttagag atggtgacat tcttggaaag 300
taogbagace tcgageacca cç&ccaccac cactga 336
<210> 41
<211> 110
<212> PRT
<213> Homosapien
<400> 41
Ala Ala Glar Gln Ala. ÍPhe Arg I#yB Phe Iieu Sxo Xieu Phe Asp Arg Val1 5 10 15
Leu Val Glw Arg Ser Ala Ala Glu «rhr Val »rhr Lys Gly Gly Zle Mat20 25 30
Xieu Pro Glu Lys Ser Gla Gly Jjys Val Leu Gln Ala BSn VJal Val Ala35 40 45
Val Gly Ser Gly Ser Jjys Gly Lys Gly Gly Glu Xle Gla Pro Val Ser50 55 €0
Val Jiiys Val Gly Asp Iiys Val Leu Xieu &Γ0 Glu ®yr Gly Gly Tfar Lys65 70 75 Θ0Val Val Jieu Asp Aap Lys Aep Tyr Phe leu Phe Arg Aep Gly Aep Xlo85 so 99
teu Gly Iqts Tyr Vil Aarp Leu Glu His His Kie His His Hie100 105 110
<210> 42<211> 336<212> DHA<213> Hooho Bapien
<400> 42
atggcagoag gacaagcgtt tagaaagttt cttcoaetot ttgaecgagt attggttgaa 60aggagtgctg ctgaaaccgt aaccaaajjga ggcattatgc ttccagaaaa atctaaagga 120aaagtattge aagcaacagt agtcgctgtt ggatcgggtt etaaaggaaa ggSTtggagag 180attcaaccasr ttagagbgaa agttggagat aaagtuotte toooagaata tggaggcaoc 240aaagtagtte tagatgaoaa ggattafctte ctatttagag atggtgacat CCbtggaaag 300tacg-tagacc tcgagcaoca abaooacteac eactga 336
<310> 43<211> 291
<212> - DHA
<213> Homo eapion
<400> 43
átgaatattc grfceeactctt tgaccgagfca ttgyttgaaa ggagtgctgc tgaaactgiia 60
accaaaggag gcattatgct tccagaaaa» totcaaggaa aagtattgca agcaacagta 120
gtogofcgttg gatçgggttc taaaggâaag ggtggagaga ttcaaacagt tagogtgaaa 180
STttggagata aagrttcttct cceagaatat ggaggcaoca aagtagttct agatgacaag 240
gattatttee tatttagaga tggegacatt cttggaaagb acgtagaceg a 291<210> 44
<211> 309
<212> DNA
<213> Homosapien
<400> 44
Bfcsscagfirác aagcgttfcasr aaagtttctt coactcfcttg acogagtatt eatfcgaaajyg 50ETtgctsrctg aaactfftaacs eaaagsragge attatgctto cag-aaaaatc tcaaggaaaa 120gtattsrcaag caaeagtagt Cffütgttgga tdgggttcta aaggaaagro tggagagatt 180eaaoca&tfea gcgtflraáagt tggaarataaa ^ttcfctctcc cagaatatgg aggcaccaaa 240Stagttctacr atgaeaagsra ttatttceta tfctagagat* gfcgacattct t Jwwgtao 300gttasraetsra 309

Claims (61)

1. Polipeptídeo isolado Cpn10 que possui atividade imunomodu-ladora, mas em que falta, ou substancialmente falta, atividade de enovela-mento de proteína.
2. Polipeptídeo isolado Cpn10 que apresenta atividade imuno-moduladora, compreendendo esse polipeptídeo uma ou mais substituições,supressões e/ou adições dè aminoácidos na região de Ioop móvel em com-paração com um polipeptídeo correspondente Cpn10 do tipo selvagem.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, o qual apre-senta atividade imunomoduladora pelo menos similar ao nível de atividadeimunomoduladora do polipeptídeo correspondente Cpn10 do tipo selvagem.
4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, no qual aregião de Ioop móvel compreende a seqüência de aminoácidos conformeapresentado em ID SEQ NQ: 12.
5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, no qual um ou mais resíduos do tripeptídeo IML da região de loop mó-vel são substituídos por resíduos carregados.
6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5, no qual o tri-peptídeo IML é substituído por um tripeptídeo que codifica os resíduos EEE1III ou IFI em que as seqüências de aminoácidos correspondentes de Cpn10são apresentadas em ID SEQS Nes: 39, 37 e 35.
7. Polipeptídeo isolado Cpn10 que apresenta atividade imuno-moduladora, polipeptídeo este em que substancialmente falta a região deloop móvel de um polipeptídeo correspondente Cpn10 do tipo selvagem.
8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, no qual a regi-ão de Ioop móvel compreende a seqüência de aminoácidos conforme apre-sentado em ID SEQ Ne: 12.
9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, no qual opolipeptídeo CnpIO em que substancialmente falta a região de Ioop móvelcompreende a seqüência de aminoácidos conforme apresentado em IDSEQS N9S: 3 ou 24.
10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, no qualo polipeptídeo CnpIO em que substancialmente falta a região de loop móvelé codificado pela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em IDSEQS Nes: 4 ou 5 ou 25.
11. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 7 a 10, no qual o polipeptídeo CpnIO apresenta atividade imunomodu-Ladora pelo menos similar ao nível de atividade imunomoduladora do poli-peptídeo correspondente Cpnl0 do tipo selvagem.
12. Polipeptídeo isolado Cpn 10 que apresenta atividade imuno-moduladora, compreendendo esse polipeptídeo uma ou mais substituições,supressões e/ou adições de aminoácidos na região de cobertura em formade grampo de cabelo β em comparação com um polipeptídeo corresponden-te CpnIO do tipo selvagem.
13. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 12, o qual apre-senta atividade imunomoduladora pelo menos similar ao nível de atividadeimunomoduladora do polipeptídeo correspondente Cpnl 0 do tipo selvagem.
14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, noqual a região de cobertura em forma de grampo de cabelo β compreende aseqüência de aminoácidos conforme apresentado em ID SEQ N2: 13.
15. Polipeptídeo isolado CpnIO que apresenta atividade imuno-moduladora, polipeptídeo este em que substancialmente falta a região decobertura em forma de grampo de cabelo β de um polipeptídeo correspon-dente Cpn 10 do tipo selvagem.
16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15, no qual aregião de cobertura em forma de grampo de cabelo β compreende a se-qüência de aminoácidos conforme apresentado em ID SEQ N9: 13.
17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, noqual o polipeptídeo CpnIO em que substancialmente falta a região de cober-tura em forma de grampo de cabelo β compreende a seqüência de aminoá-cidos conforme apresentado em ID SEQS Nss: 6 ou 26.
18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, noqual o polipeptídeo CpnIO em que substancialmente falta a região de cober-tura em forma de grampo de cabelo β é codificado pela seqüência de nucle-otídeos conforme apresentado em ID SEQS NsS: 7 ou 8 ou 27.
19. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 15 a 18, no qual o polipeptídeo CpnIO apresenta atividade imunomodu-ladora pelo menos similar ao nível de atividade imunomoduladora do poli-peptídeo correspondente Cpnl 0 do tipo selvagem.
20. Polipeptídeo isolado CpnlO que apresenta atividade imuno-moduladora, compreendendo esse polipeptídeo uma ou mais substituições,supressões e/ou adições de aminoácidos na região de Ioop móvel e na regi-ão de cobertura em forma de grampo de cabelo β em comparação com umpolipeptídeo correspondente CpnIO do tipo selvagem.
21. Polipeptídeo isolado Cpn10, polipeptídeo este em que subs-tancialmente falta tanto a região de Ioop móvel quanto a região de coberturaem forma de grampo de cabelo β do polipeptídeo correspondente CpnIO dotipo selvagem.
22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21, o qual com-preende a seqüência de aminoácidos conforme apresentado em ID SEQSNsS: 9 ou 28.
23. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21, codificadopela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em ID SEQS Ngs: 10ou 29.
24. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, o qualapresenta atividade imunomoduladora pelo menos similar ao nível de ativi-dade imunomoduladora do polipeptídeo correspondente CpnIO do tipo sel-vagem.
25. Polipeptídeo isolado CpnlO, polipeptídeo este que compre-ende uma supressão de um resíduo extra de alanina com término N emcomparação com um polipeptídeo correspondente CpnIO do tipo selvagem.
26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, o qual com-preende o aminoácido conforme apresentado em ID SEQ Ne: 23.
27. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, codificadopela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em ID SEQ N5: 44.
28. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, o qualapresenta um nível reduzido de atividade imunomoduladora em comparaçãocom o nível de atividade imunomoduladora do polipeptídeo correspondenteCpn10 do tipo selvagem.
29. Polipeptídeo isolado Cpn10, no qual o término N do polipep-tídeo é substancialmente substituído por um término N de Cpn10 bacteriano.
30. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 29, o qual com-preende o aminoácido conforme apresentado em ID SEQ NQ: 14.
31. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 29, codificadopela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em ID SEQ N5: 43.
32. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, o qualapresenta um nível reduzido de atividade imunomoduladora em comparaçãocom o nível de atividade imunomoduladora do polipeptídeo correspondenteCpn10 do tipo selvagem.
33. Polipeptídeo isolado Cpn10, no qual um resíduo de glicinasubstitui um resíduo extra de alanina com término N desse polipeptídeo emcomparação com um polipeptídeo correspondente Cpn10 do tipo selvagem.
34. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 33, o qual com-preende a seqüência de aminoácidos conforme apresentado em ID SEQ NQ: 30.
35. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 33, codificadopela seqüência de nucleotídeos conforme apresentado em ID SEQ N9: 31.
36. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, o qualapresenta atividade imunomoduladora pelo menos similar ao nível de ativi-dade imunomoduladora do polipeptídeo correspondente CpnIO do tipo sel-vagem.
37. Ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo CpnIOde acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
38. Constructo de expressão que compreende um ácido nucléicode acordo com a reivindicação 37, opcionalmente ligado de modo operável auma ou mais seqüências reguladoras.
39. Célula hospedeira que expressa um polipeptídeo de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 36, ou que compreende um ácidonucléico de acordo com a reivindicação 37 ou um constructo de expressãode acordo com a reivindicação 38.
40. Anticorpo que se liga seletivamente a um polipeptídeo deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36.
41. Composição farmacêutica que compreende um polipeptídeode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, um ácido nucléicode acordo com a reivindicação 37, um constructo de expressão de acordocom a reivindicação 38 ou um anticorpo de acordo com a reivindicação 40.
42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-41, a qual compreende um ou mais agentes adicionais.
43. Método de tratamento de um indivíduo, o qual inclui a etapade administrar a esse indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeoCpnIO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, ou um ácidonucléico de acordo com a reivindicação 37.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, no qual o trata-mento modula a resposta imune no indivíduo.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, no qual a respos-ta imune é modulada via modulação de sinalização de receptores semelhan-tes a Toll.
46. Método para tratamento ou prevenção de uma doença oucondição em um indivíduo, método este que compreende administrar ao in-divíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo CpnIO de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 36, ou um ácido nucléico de acordocom a reivindicação 37.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45, no qual a doen-ça, distúrbio ou condição é selecionada de doenças inflamatórias agudas oucrônicas, asma, alergia, esclerose múltipla, GVHD, outra doença auto-imuneou uma doença infecciosa.
48. Doença infecciosa, de acordo com a reivindicação 47, a qualé uma infecção bacteriana ou viral.
49. Infecção por bactéria, de acordo com a reivindicação 48, aqual é causada por uma bactéria gram-negativa.
50. Método para modulação de sinalização de TLR em um indi-víduo, ou em pelo menos uma célula, tecido ou órgão desse indivíduo, mé-todo este que compreende administrar uma quantidade eficaz de um poli-peptídeo CpnIO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, ouum ácido nucléico de acordo com a reivindicação 37.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, no qual o poli-peptídeo CpnIO regula sinalização de TLR induzida por agonista.
52. Método para modulação da produção e/ou secreção de umou mais imunomoduladores em um indivíduo, ou em pelo menos uma célula,tecido ou órgão desse indivíduo, método este que compreende administraruma quantidade eficaz de um polipeptídeo CpnIO de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 36, ou um ácido nucléico de acordo com a rei-vindicação 37.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, no qual o poli-peptídeo modula sinalização de TLR4.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, no qual umirhunomodüiador é uma citocina ou quimocina pró-inflamatória ou uma cito-cina ou quimocina antiinflamatória.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, no qual a citocinaou quimocina é selecionada de TNF-α, IL-6, RANTES, IL-10, TGF-β ou uminterferon tipo I.
56. Método de identificação de um composto que se liga a umpolipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, métodoeste que compreende as etapas de: (a) contatar um composto candidato com esse polipeptídeo;e(b) ensaiar a formação de um complexo entre o compostocandidato e esse polipeptídeo.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o ensaiopara a formação de um complexo é um ensaio de ligação competitiva ou umensaio de duplo híbrido.
58. Método de seleção de um composto que modula a atividadede um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36,método este que compreende as etapas de:(a) contatar esse polipeptídeo com um composto candidatosob condições adequadas para permitir interação desse composto candidatocom esse polipeptídeo; e(b) ensaiar em relação a atividade desse polipeptídeo.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, no qual o ensaioem relação a atividade do polipeptídeo compreende adicionar um substratomarcado e medir uma alteração no substrato marcado.
60. Polipeptídeo correspondente CpnIO do tipo selvagem, deacordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, o qual é um poli-peptídeo CpnIO humano e compreende a seqüência de aminoácidos con-forme apresentado em ID SEQS Nes: 1 ou 21.
61. Polipeptídeo correspondente CpnIO do tipo selvagem, deacordo com a reivindicação 60, o qual é codificado por uma seqüência denucleotídeos conforme apresentado em ID SEQS Nss: 2 ou 22.
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