KR20080098579A - 변형된 샤페로닌 10 - Google Patents

변형된 샤페로닌 10 Download PDF

Info

Publication number
KR20080098579A
KR20080098579A KR1020087007836A KR20087007836A KR20080098579A KR 20080098579 A KR20080098579 A KR 20080098579A KR 1020087007836 A KR1020087007836 A KR 1020087007836A KR 20087007836 A KR20087007836 A KR 20087007836A KR 20080098579 A KR20080098579 A KR 20080098579A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cpn10
polypeptide
seq
ala
set forth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020087007836A
Other languages
English (en)
Inventor
딘 제이슨 네일러
바바라 제인 존슨
캐롤라인 아만다 도빈
크리스토퍼 브루스 하워드
린다 앨리슨 워드
Original Assignee
씨바이오 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2005904765A external-priority patent/AU2005904765A0/en
Application filed by 씨바이오 리미티드 filed Critical 씨바이오 리미티드
Publication of KR20080098579A publication Critical patent/KR20080098579A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 면역조절 활성은 보유하지만, 단백질 폴딩 활성은 없거나 실질적으로 없는, 단리된 샤페로닌 10 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

변형된 샤페로닌 10{MODIFIED CHAPERONIN 10}
본 발명은 샤페로닌 10 폴리펩티드 및 이것을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 면역조절 활성을 나타내는 샤페로닌 10 폴리펩티드, 이것의 사용 방법 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
열 충격 단백질 10(Hsp10: heat shock 단백질 10) 및 조기 임신 인자(EPF: early pregnancy factor)로도 공지되어 있는, 포유동물 샤페로닌 10(Cpn10: chaperonin 10)은 전형적으로 샤페로닌 60(Cpn60; Hsp60)과 함께 단백질 폴딩에 관여하는 미토콘드리아 '분자 샤페론' 단백질로서 특징화된다. Cpn10 및 Cpn60은 각각 박테리아 단백질 GroES 및 GroEL의 상동체이다. 각각의 GroEs 및 Cpn10은 각각 14개의 GroEL 또는 7개의 Hsp60 분자를 포함하는 원통 유사 구조에 뚜껑과 같이 결합하는 7원환으로 올리고머화하여, 변성된 단백질을 복합체로 묶는다([Bukau and Horwich, 1998, Cell 92:351-366]; [Harti and Hayer-Hartl, 2002, Science 295:1852-1858]).
Cpn10 단백질은 종들 간에 고도로 보존되며, 인간 Cpn10은 소 Cpn10과는 100% 일치하고, 래트 Cpn10과는 오직 하나의 아미노산 위치에서만 상이하다. E. 콜라이(E. coli) GroES의 헵타머 결정 구조로 도시된 바와 같이(도 1A; [Xu et si, 1997, Nature 388:741-750]를 참조할 수 있음), 인간 Cpn10은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 GroES와 30% 서열 일치성(60% 유사성)을 공유한다. Cpn10/GroES 단백질은 본질적으로 3개의 상이한 구조 영역으로 구성되며, 역-평행 β-배럴 영역은 "상부(roof)" β-헤어핀 루프 영역 및 "이동성 루프" 영역 측면에 위치한다. 이동성 루프 영역은 Cpn60/GroEL의 상호작용을 매개하고, 이로써, Cpn60/GroEL과의 복합체 형성, 및 '분자 샤페론', 단백질 폴딩 활성에 중요하다.
그러나, 분자 샤페론으로서 세포내 역할 이외에도, Cpn10은 또한 세포 표면([Belles et al., 1999, Infect Immun 67:4191-4200]을 참조할 수 있음) 및 세포외액([Shin et al., 2003, J Biol Chem 278:7607-7616]을 참조할 수 있음)에서 빈번하게 발견되고, 점차적으로 면역 반응의 조절제로서 인식되고 있다. 예를 들면, Cpn10은 실험상의 자가면역 뇌척수염, 지연형 과민 반응, 및 동종이식 거부 모델에서 면역억제 활성을 갖는다고 입증되었다([Zhang et al., 2003, J Neurol Sci 212:3746]; [Morton et al, 2000, Immunol Cell Biol 78:603-607]). 본 발명자들은 또한 최근에 Cpn10이 다수의 상이한 인간 및 뮤린의 시험관내 시스템 및 뮤린의 질환 모델에서 NF-κB의 LPS 유도 활성을 저해할 수 있고, IL-10 생산을 증진시킬 수 있다는 것을 입증하였고([Johnson et al., 2005, J Biol Chem 280:4037-4047] 및 국제 특허 출원 번호 PCT/AU2005/000041(그의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용됨)), 이로써, Cpn10이 자가면역 및 염증 질환 치료용의 면역-치료제로서의 상당한 효능을 갖고 있다고 제안하였다.
그러나, 면역조절 활성(들)을 매개하는 역할을 하는 Cpn10 분자 내의 부위 (들)은 파악되지 않은 상태이다.
본 발명은 Cpn10 분자의 변형, 및 이러한 변형이 면역조절 활성에 미치는 효과에 관한 것이다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 야생형 Cpn10과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는 Cpn10 폴리펩티드로서, 면역조절 활성을 나타내는 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 제1 측면에 따라, 면역조절 활성은 보유하지만, 단백질 폴딩 활성은 없거나 실질적으로 없는 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 제2 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 이동성 루프 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타낼 수 있다.
하나의 실시태양에서, Cpn10 폴리펩티드의 이동성 루프 영역의 IML 트리펩티드중 하나 이상의 잔기는 전하를 띤 잔기로 대체될 수 있다.
또다른 실시태양에서, IML 트리펩티드를 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 트리펩티드 EEE로 대체될 수 있다. EEE 트리펩티드를 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 39에 기재될 수 있다. Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 40에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
추가의 또다른 실시태양에서, IML 트리펩티드를 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 트리펩티드 III로 대체될 수 있다. III 트리펩티드를 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 37에 기재될 수 있다. Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 38에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
또한 추가의 또다른 실시태양에서, IML 트리펩티드를 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 트리펩티드 IFI로 대체될 수 있다. IFI 트리펩티드를 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 35에 기재될 수 있다. Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 36에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 제3 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 이동성 루프 영역이 실질적으로 없는 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 이동성 루프 영역이 실질적으로 없는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 3 또는 24에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 이동성 루프 영역이 실질적으로 없는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 4, 5 또는 25에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 상부 β-헤어핀 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 제5 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 상부 β-헤어핀 영역이 실질적으로 없는 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상부 β-헤어핀 영역(서열번호:13)이 실질적으로 없는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 6 또는 26에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 상부 β-헤어핀 영역이 실질적으로 없는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 7, 8 또는 27에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 제6 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 이동성 루프 영역 및 상부 β-헤어핀 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 제7 측면에 따라, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 이동성 루프 영역과 상부 β-헤어핀 영역 둘 다가 실질적으로 없는 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타낼 수 있다.
하나의 실시태양에서, Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 9 또는 28에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 상부 β-헤어핀 영역이 실질적으로 없는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 10 또는 29에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 가외(extra) N-말단 알라닌 잔기의 결실을 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 Cpn10 폴리펩티드에는 N 말단에 아세틸기가 존재하지 않을 수 있다. Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 비교할 때 감수된 면역조절 활성 수준을 나타낼 수 있다.
하나의 실시태양에서, 가외 N-말단 알라닌 잔기의 결실을 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가외 N-말단 알라닌 잔기의 결실을 포함하는 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 44에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 제9 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, Cpn10 폴리펩티드의 N 말단이 실질적으로 박테리아 Cpn10 N 말단으로 대체된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
박테리아 Cpn10은 GroES일 수 있다.
Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 비교할 때 감소된 면역조절 활성 수준을 나타낼 수 있다.
하나의 실시태양에서, Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 43에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 제10 측면에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 글리신 잔기가 Cpn10 폴리펩티드의 가외 N 말단 알라닌 잔기를 대체한, 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 비교할 때 감소된 면역조절 활성 수준을 나타낼 수 있다.
하나의 실시태양에서, Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 31에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따라, 제1 측면 내지 제11 측면중 어느 하나에 따른 Cpn10 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 제12 측면에 따라, 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 제11 측면에 따른 핵산을 포함하는 발현 작제물을 제공한다.
본 발명의 제13 측면에 따라, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 발현시키거나, 제11 측면의 핵산, 또는 제9 측면의 발현 작제물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 제14 측면에 따라, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나에 따른 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 제15 측면에 따라, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 제11 측면의 핵산, 제12 측면의 발현 작제물 또는 제14 측면의 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 다발경화증 치료용 조성물은 추가로 유효량의 IFNβ를 포함할 수 있다.
본 발명의 제16 측면에 따라, 유효량의, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 Cpn10 폴리펩티드, 또는 제11 측면의 핵산을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상자를 치료하는 방법을 제공한다.
치료는 대상자의 면역 반응을 조절할 수 있다. 면역 반응은 Toll 유사 수용체 신호 전달의 조절을 통해 조절될 수 있다.
본 발명의 제17 측면에 따라, 유효량의, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 Cpn10 폴리펩티드, 또는 제11 측면의 핵산을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
질환, 질병 또는 병태는 급성 또는 만성 염증 질환, 천식, 알레르기, 다발경화증, GVHD, 또는 감염 질환으로부터 선택될 수 있다. 감염 질환은 박테리아 또는 바이러스 감염으로부터 유발될 수 있다. 박테리아는 그램 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 제18 측면에 따라, 유효량의, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 Cpn10 폴리펩티드, 또는 제11 측면의 핵산을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서, 또는 그의 1개 이상의 세포, 조직 또는 장기에서 TLR4 신호 전달을 조절하는 방법을 제공한다.
전형적으로, Cpn10은 효현제 유도 TLR4 신호 전달을 조절한다.
본 발명의 제19 측면에 따라, 유효량의, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 Cpn10 폴리펩티드, 또는 제11 측면의 핵산을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서, 또는 그의 1개 이상의 세포, 조직 또는 장기에서 하나 이상의 면역조절제의 생산 및/또는 분비를 조절하는 방법을 제공한다.
Cpn10이 TLR4로부터의 신호 전달을 조절할 수 있다.
면역조절제는 향염증성 사이토카인 또는 케모카인 또는 항염증 사이토카인 또는 케모카인일 수 있다. 사이토카인 또는 케모카인은 TNF-α, IL-6, RANTES, IL-10, TGF-β 또는 I형 인터페론로부터 선택될 수 있다. I형 인터페론은 IFNα 또는 IFNβ일 수 있다.
본 발명의 제20 측면에 따라,
(a) 후보 화합물을 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 후보 화합물과 상기 폴리펩티드와의 복합체 형성을 검정하는 단계를 포함하는, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
복합체 형성에 대한 검정법은 경쟁 결합 검정법 또는 이중-하이브리드 검정법일 수 있다.
본 발명의 제21 측면에 따라,
(a) 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 폴리펩티드를, 후보 화합물이 각 폴리펩티드에 상호작용할 수 있기에 적합한 조건 하에 후보 화합물에 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 폴리펩티드의 활성을 검정하는 단계를 포함하는, 제1 측면 내지 제10 측면중 어느 하나의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
폴리펩티드의 활성을 검정하는 것은 표지된 기질을 첨가하고, 표지된 기질 내 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 측면들 및 실시태양에 따른 변형된 Cpn10 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 변이체, 유도체, 상동체, 유사체 및 단편도 고려한다.
상기 측면들 및 실시태양에 따라, Cpn10 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 임의의 동물로부터 유래될 수 있거나, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있거나, 합성적으로 생산될 수 있다. 전형적으로, Cpn10은 진핵생물 Cpn10이다.
상기 측면들에 따라서, 야생형 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 1 또는 21에 기재된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 Cpn10 폴리펩티드일 수 있다.
상기 측면들에 따라서, 야생형 Cpn10 폴리펩티드는 서열 번호 2 또는 22에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 측면들 및 실시태양에 따라, Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성은 폴리펩티드의 헵타머 생성을 포함할 수 있다.
정의
본 명세서를 통해, "포함하는"이라는 용어는 "반드시 단독으로만 포괄한다기 보다는 대체로 포괄한다는 것"을 의미한다. 추가로, "포함하는"이라는 단어의 어미 변형, 예로서, "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"는 상응하게 변화된 의미를 갖는다.
Cpn10 폴리펩티드와 관련하여, 본원에서 사용되는 "야생형"이라는 용어는 그의 본래 형태 또는 비-본래 형태의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 본래의 인간 Cpn10은 그의 N-말단에서 아세틸화되어 있을 경우; 본 발명은 야생형이라는 용어의 범주내에서 아세틸화되거나 비-아세틸화된 폴리펩티드를 고려한다. 또한, 야생형 Cpn10 폴리펩티드는 N-말단에 추가의 알라닌(A) 잔기를 포함할 수 있다(WO 2004/041300, 그의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용됨)).
"폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성된 중합체를 의미한다. "폴리펩티드" 및 "단백질"라는 용어는, 본 발명의 목적을 위해서는 "폴리펩티드"가 전장의 단백질중 일부를 구성할 수 있지만, 본원에서는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드"이라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 염기 또는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체, 또는 그의 혼합물의 싱글- 또는 더블-스트랜드 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 달리 명시하지 않는 한, 특정 서열 뿐만 아니라, 그에 상보적인 서열에 관한 언급도 포함한다. "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"단리된"이라는 용어는 해당 분자가 그의 천연 환경 또는 숙주로부터 분리되고, 관련된 불순물은 감소되거나 제거됨으로써 해당 분자가 가장 많이 존재하는 것(즉, 몰에 기초하여 조성물/샘플중 임의의 다른 개체 종들보다 더욱 풍부한 것)이 되도록 한 것을 의미한다. 전형적으로, 실질적으로 정제된 분획은 목적하는 종이 존재하는 모든 거대분자 종들의 약 30%(몰에 기초하여)를 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물내 존재하는 모든 거대분자 종들의 약 80 내지 90% 이상을 포함할 것이다. 가장 전형적으로, 목적하는 종은 본질적으로 균질하게 정제되고(오염물질 종은 조성물내에서는 종래의 검출 방법에 의해 검출될 수 없다), 여기에서, 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로만 구성된다.
본원에서 사용되는 "실질적으로"라는 용어는 대다수이지, 반드시 모두를 의미하는 것은 아니며, 상응하는 야생형 폴리펩티드의 성분 영역이 "실질적으로" 없는 변형된 폴리펩티드와 관련하여, 변형된 폴리펩티드는 상기 성분 영역의 일부를 보유할 수 있다. 전형적으로는 성분 영역이 본 영역의 서열중 일부가 생략됨으로써 구조적으로 및/또는 작용에 있어서 불활성이지만, 상응하는 야생형 폴리펩티드의 성분 영역이 "실질적으로" 없는 변형된 폴리펩티드는 성분 영역의 서열의 대략 50% 이하를 보유할 수 있다.
본원에서 사용되는 "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 폴리펩티드 쇄(단백질의 1차 서열)내에서 하나의 아미노산이 유사한 성질을 갖는 또다른 아미노산으로 치환 또는 대체되는 것을 지칭한다. 예를 들면, 유사하게 전하를 띤 아미노산 아스파르트산(Asp)이 전하를 띤 아미노산 글루탐산(Glu)으로 치환되는 것이 보존적 아미노산 치환이 될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료," "치료하는," 및 그의 어미 변형은 질환 상태 또는 증상을 치유하거나, 질환의 확립을 방지하거나, 다르게는, 질환 또는 다른 바람직하지 못한 증상의 진행을 어떤 식으로든지 방지하거나, 저지하거나, 지연시키거나, 역전시키는 임의의 용도 및 모든 용도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는 그 의미 안에서 비독성이면서도 원하는 치료학적 또는 예방학적 효과를 제공하는데 충분한 물질 또는 화합물의 양을 포함한다. 정확한 필요량은 인자, 예로서, 치료하는 종, 대상자의 연령 및 일반적인 증상, 치료하고자 하는 병태의 중증도, 투여받는 특정 제제 및 투여 방식 등에 따라 대상자마다 달라질 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 언급할 수는 없다. 그러나, 임의의 소정의 경우에 있어서, 적절한 "유효량"은 오직 통상의 실험을 사용해서는 당업계의 기술자에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "조절하는," "조절하다" 및 그의 어미 변형은 본 발명의 특정 분자 또는 물질 부재하에서의 분자의 활성, 생산, 분비 또는 다른 작용상의 수준과 비교할 때, 본 발명의 특정 분자 또는 물질의 존재하에서 분자의 활성, 생산, 분비 또는 다른 작용상의 수준을 증가시키거나 감소시키는 것을 지칭한다. 이러한 용어는 증가 또는 감소의 정량화를 암시하는 것은 아니다. 조절이 원하는 결과를 초래하기에 충분할 만큼 중요할 수 있고, 이는 직접적이거나 간접적일 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1. A. 역-평행 β-배럴, "상부" β-헤어핀 루프 및 이동성 루프 영역을 나타내는, E. 콜라이 Cpn10(GroES)의 결정 구조. Cpn10은 7개의 동일한 10 kDa 서브유니트로 구성된다. B. 야생형 인간 Cpn10 단량체의 아미노산 서열. 추정되는 18개의 아미노산 이동성 루프를 굵은 이탤릭체로 표시한다. 추정되는 14개의 아미노산 상부 β-헤어핀을 굵은 밑줄체로 표시한다.
도 2. 인간 Ala-Cpn10 및 E. 콜라이 GroES가 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. E. 콜라이 GroES를 제외한 인간 Ala-Cpn10(배치 CH001)에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화(NFκB 활성의 간접적인 측정치)의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 4개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. RLU = 상대 광 유니트. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS: Lipopolysaccharide)로 유도되었다.
도 3. SDS-PAGE 겔. H를 제외한 겔 A 내지 O에 대한 레인 지정: 레인 1, 분자량 마커(kDa); 레인 2 내지 6은 각각, 60 ㎍, 6 ㎍, 3 ㎍, 1.2 ㎍ 및 0.3 ㎍의 Cpn10. A. 정제된 Ala-Cpn10(CH001)의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; B. 정제된 Ala-Cpn10(CH003)의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; C. 정제된 Ala-Cpn10-EEE-cHis의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; D. 정제된 Ala-Cpn1Q-cHis의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; E. 정제된 Ala-Cpn1O-IFI의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; F. 정제된 Ala-Cpn10-III의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; G. Ala-Cpn10-Δml의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; H. Cpn10-ΔmL(레인 2)의 부분적인 글루타르알데히드 교차-결합은 은 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔상에 7개의 상이한 밴드를 나타내고, 이는 분자가 헵타머 구조라는 것을 나타낸다. 레인 1, 분자량 마커(kDa). I. 정제된 Ala-Cpn10-Δ상부의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔. J. 정제된 Ala-Cpn10-β-배럴의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔. K. 정제된 E. 콜라이 GroES의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; L. 정제된 Cpn10-NtermES의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; M. 정제된 E. 콜라이 GroES의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔; N: 정제된 Gly-Cpn10의, 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔.
도 4. Ala-Cpn10, Ala-Cpn10-III, Ala-Cpn10-IFI, Ala-Cpn10-EEE-cHis 및 Ala-Cpn10-cHis가 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH001), Ala-Cpn10 C-말단 헥사히스티딘 태그(Ala-Cpn10-cHis) 및 다수의 이동성 루프 돌연변이체에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B, D, F, H는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A, C, E, G로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 4개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. RLU = 상대 광 유니트. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 5. Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-Δml이 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH001) 및 Ala-Cpn10-Δml에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 4개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. RLU = 상대 광 유니트. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 6. Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-Δ상부 및 E. 콜라이 GroES가 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH001) 및 Ala-Cpn10-Δ상부에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 4개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. RLU = 상대 광 유니트. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 7. Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-β-배럴이 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH001) 및 Ala-Cpn10-β-배럴에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 8. Ala-Cpn10 및 Cpn10-NtermES가 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. Cpn10-NtermES를 제외한 인간 야생형 Cpn10(배치 CH001)에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수; SD = 표준 편차. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 9. Ala-Cpn10 및 X-Cpn10이 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH003) 및 X-Cpn10에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 10. Ala-Cpn10 및 Gty-Cpn10이 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH003) 및 Gly-Cpn10에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수. NFκB 활성은 5 ng/ml 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 11. Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-Δml이 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH003) 및 Ala-Cpn10-Δml에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수. NFκB 활성은 5 ng/ml 초-순도(Ultra-Pure) 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 12. Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-Δ상부가 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH003) 및 Ala-Cpn10-Δ상부에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수. NFκB 활성은 5 ng/ml 초-순도 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 13. Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-β-배럴이 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH003) 및 Ala-Cpn10-β-배럴에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수. NFκB 활성은 5 ng/ml 초-순도(Ultra-Pure) 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 14. Ala-Cpn10 및 Gly-Cpn10이 TLR4 신호 전달에 미치는 효과. 인간 Ala-Cpn10(배치 CH003) 및 Gly-Cpn10에 의한 LPS 유도 HIV-LTR 활성화의 용량-반응성 저해. 패널 B는 오직 LPS만으로 생성된 루시퍼라제 수준과 비교한 루시퍼라제 활성(NFκB 활성)의 저해율(%)로서 패널 A로부터의 결과를 나타낸다. 오직 LPS만을 사용한 샘플을 평균 6개의 복사본을 갖고, 그외 모든 다른 샘플은 평균 2개의 복사본을 갖는다. CPS = 초당 상대계수. NFκB 활성은 5 ng/ml 초-순도(Ultra-Pure) 지질다당질(LPS)로 유도되었다.
도 15. 내독혈증의 뮤린 염증 모델에서의 Cpn10 활성. Cpn10 및 Cpn10 변이체는 LPS 유도 혈청 TNF-α, IL-10 및 IL-6 생산을 감소시켰다. 'LPS 시험감염된' 마우스(표 1을 참조할 수 있음, 1군, 3군, 5군, 7군, 9군 및 11군) 또는 '염수 대조군' 마우스(표 1을 참조할 수 있음, 2군, 4군, 6군, 8군, 10군 및 12군)로부터의 혈청은 CBA를 사용하여 염증-관련 사이토카인에 대하여 분석하였다(방법란을 참조할 수 있다). A, B) TNF-α, C, D) IL-6, 및 E, F) IL-10 사이토카인의 수준은 각 군에 대하여 나타낸 평균(가로축)으로 플롯팅하였다. 각 데이타 세트에 대하여 터키의 사후검정 시험(Tukey's post-hoc test)을 포함하는 1-원 ANOVA 분석을 실시하였다. 데이타에서 통계학적 유의수준은 괄호로 표시한다(p<0.05)(상세한 설명에 관한 텍스트를 참조할 수 있음)
도 17. 아세틸-Cpn10, Ala-Cpn10 및 Gly-Cpn10의 N 말단에 관한 도해.
서열 참조
표 1. 하기의 참조표는 본 명세서 전역에서 사용된 Cpn10 폴리펩티드의 명칭을 제공한다. 이 표에는 본원에서 개시된 Cpn10 폴리펩티드에 관한 설명, 및 그에 상응하는 아미노산 및 핵산 서열의 번호가 포함되어 있다.
Cpn10 명칭 특징 추가의 특징 아미노산 서열번호 핵산 서열번호
X-Cpn10 (즉, 비-아세틸화된 Cpn10) N 말단에 아세틸기를 포함하지 않음 개시 메티오닌을 포함하지 않음 23 44
Cpn10(야생형) 아세틸기를 포함하지 않음 개시 메티오닌을 포함 1 2
Ala-Cpn10-Δml 이동성 루프 결실 개시 메티오닌을 포함 3 4, 5
Ala-Cpn10-Δ상부 상부 루프 결실 개시 메티오닌을 포함 6 7, 8
Ala-Cpn10-β-배럴 상부 루프 및 이동성 루프 결실 개시 메티오닌을 포함 9 10
E. 콜라이 Cpn10 (GroES) Cpn10의 박테리아 상동체 개시 메티오닌을 포함 11 34
오직 이동성 루프만 인간 Cpn10중 이동성 루프 서열의 일례 12
오직 베타 헤어핀 상부("상부") 루프만 인간 Cpn10중 상부 루프 서열의 일례 13
Cpn10-NtermES E. 콜라이 N 말단을 제외한 인간 Cpn10 개시 메티오닌을 포함 14 43
EEE 트리펩티드에 대한 정방향 프라이머 EEE 트리펩티드는 이동성 루프에 위치함 15
EEE 트리펩티드에 대한 역방향 프라이머 EEE 트리펩티드는 이동성 루프에 위치함 16
IFI 트리펩티드 생성을 위한 정방향 프라이머 IFI 트립펩티드는 이동성 루프에 위치함 17
IFI 트리펩티드 생성을 위한 역방향 프라이머 IFI 트립펩티드는 이동성 루프에 위치함 18
III 트리펩티드 생성을 위한 정방향 프라이머 III 트립펩티드는 이동성 루프에 위치함 19
III 트리펩티드 생성을 위한 역방향 프라이머 III 트립펩티드는 이동성 루프에 위치함 20
Ala-Cpn10 (야생형 Cpn10) 가외 N 말단 알라닌 잔기 개시 메티오닌을 포함하지 않음 21 22
Ala-Cpn10-Δml 이동성 루프 결실 개시 메티오닌을 포함하지 않지만, 가외 N 말단 알라닌 잔기를 포함함 24 25
Ala-Cpn10-Δ상부 상부 루프 결실 개시 메티오닌을 포함하지 않지만, 가외 N 말단 알라닌 잔기를 포함함 26 27
Ala-Cpn10-β-배럴 상부 루프 및 이동성 루프 결실 개시 메티오닌을 포함하지 않지만, 가외 N 말단 알라닌 잔기를 포함함 28 29
Gly-Cpn10 글리신이 가외 N 말단 알라닌 잔기 대체 30 31
Ala-Cpn10-IFI IFI 트리펩티드가 이동성 루프에서 IML 트리펩티드 대체 가외 N 말단 알라닌 잔기 35 36
Ala-Cpn10-III III 트리펩티드가 이동성 루프에서 IML 트리펩티드 대체 가외 N 말단 알라닌 잔기 37 38
Ala-Cpn10-EEE-cHis EEE 트리펩티드가 이동성 루프에서 IML 트리펩티드 대체 가외 N 말단 알라닌 잔기 및 C 말단의 His 태그 39 40
Ala-Cpn10-cHis 가외 N 말단 알라닌 잔기 C 말단의 His 태그 41 42
본 발명을 실시하기 위한 최상의 양태
Cpn10은 동일한 10 kDa 서브유니트들의 돔-모양의 헵타머 환이다(도 1을 참조할 수 있음). 돔의 내부 표면은 친수성이고, 고전하를 띤다. 각각의 Cpn10 서브유니트는 불규칙적인 β-배럴 토폴로지를 형성하는데, 이로부터 2개의 거대 신장부가 돌출되어 있다. 첫번째 신장부는 헵타머의 중심부쪽으로 신장되어 있고, 돔 유사 구조를 형성하는 β-헤어핀 루프이다. 흥미롭게도, GroES(E. 콜라이 Cpn10)의 상부는 생리학적 조건 하에 음성 전하를 띠는 반면, 포유동물 Cpn10의 상부는 양성 전하를 띠고; 상부의 대부분은 박테리오파지 Cpn10(Gp31)으로부터 완전하게 결손되어 있다. 분자는 또한, 돔의 기반으로부터 신장되어 있고, Cpn60과의 상호작용을 매개하는 가용성의 18개의 아미노산 이동성 루프인, 또하나의 신장부를 갖는다. 부위-지정 돌연변이 유발을 통해 Cpn60과의 상호작용에 중요한, 이동성 루프내의 수개의 잔기, 즉, 실제 Cpn60-결합 부위를 구성하는 이동성 루프 기반의 3개의 소수성 잔기(30-IML-32)와 이동성 루프의 가용성을 제한하는 2개의 잔기(26-T 및 33-P)를 동정하게 되었다[Richardson et al,. 2001, J Biol Chem 276:4981-4987]. 그러므로, Cpn10과 Cpn60의 결합은 Cpn10중 18 아미노산 이동성 루프에 의해 매개된다(도 1D를 참조할 수 있음). E. 콜라이 GroES에서, Cpn60/GroEL-결합 부위 트리펩티드는 덜 소수성이고(25-IVL-27), 이동성 루프는 포유동물 Cpn10보다 더 가용성을 띤다. 이러한 변화가 Cpn60/GroEL에 대한 GroES의 친화성을 감소시키고, 그 결과, GroES는 생성되는 Cpn60과의 상호작용은 형성할 수 없지만, Cpn10과 GroES 둘 다가 GroEL과 작용을 한다.
세포외 Cpn10이 그의 면역조절 효과를 초래하는 기전은 Cpn10을 포함한다는 가설[Johnson et al, 2005, J Biol Chem 280:4037-4047]로부터 출발하여, 본 발명자들은 이동성 루프 영역을 표적하는 Cpn10의 부위-특이적 돌연변이체를 생성하였고, 본원에서는 Cpn60과의 상호작용을 HIV시키는 돌연변이가 면역조절 활성을 보유하고 있음을 입증하였다.
따라서, 하나의 측면에서 본 발명은 면역조절 활성을 나타내지만, 실질적으로 단백질 폴딩 능력은 없는 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
Cpn10의 이동성 루프 영역 및/또는 상부 β-헤어핀 영역중 상당부가 결실되어도 Toll 유사 수용체 TLR4로부터의 신호 전달을 조절할 수 있는 Cpn10의 능력은 제거되지 않는다는 것을 본원에서 입증한다.
따라서, 본 발명은 또한 면역조절 활성을 갖는 단리된 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 이동성 루프 영역 및 상부 β-헤어핀 영역중 하나, 또는 2개 모두에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다. Cpn10의 이동성 루프 및 상부 루프의 결실은 본원에 개시된 바와 같이 Ala-Cpn10-β-배럴 폴리펩티드로서 명명한다.
본 발명은 또한 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 이동성 루프 영역 및 상부 β-헤어핀 영역중 하나, 또는 2개 모두가 실질적으로 없는 단리된 Cpn10 폴리펩티드를 제공한다.
본원에서 기술하는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 TLR 신호 전달 변화에 의해 측정된 바, E. 콜라이는 인간 Cpn10에 기인하는 면역조절 효과를 유도할 수 없다는 것을 입증하였다. 또한, 인간 Cpn10의 N-말단 잔기가 E. 콜라이 GroES로부터의 상응하는 N-말단 잔기로 대체되었을 때 Cpn10 폴리펩티드가 불활성이라는 것은 Cpn10의 N-말단이 면역조절 활성에 필요하다는 것을 입증한다.
본원에서 기술하는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 Cpn10의 N-말단에 글리신 잔기를 첨가할 경우 면역조절 활성이 증강된다는 것을 입증하였다. 아세틸기, 또는 아세틸기와 구조적 상동성을 공유하는 아미노산, 예로서, 알라닌 잔기 또는 글리신 잔기가 존재할 경우 면역조절 활성이 증강된다는 것을 고려한다.
폴리펩티드
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명은 전형적으로 면역조절 활성을 갖는 Cpn10 폴리펩티드로서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 결실, 첨가 또는 치환을 포함하는, Cpn10 폴리펩티드를 고려한다. 전형적으로, 야생형 Cpn10은 진핵생물 유기체로부터의 임의의 Cpn10 폴리펩티드이다. 일례로, Cpn10은 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 선충류(예컨대, 캐노하디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans)), 개구리(예컨대, 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)), 닭(예컨대, 갈루스 갈루스(Gallus gallus)), 제브라피쉬(예컨대, 다니오 테리오(Danio terio)), 파리(예컨대, 초파리, 예로서, 드로소필라 멜라노가스터(Drosphila melanogaster), 식물(예컨대, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)) 또는 포유동물로부터 유래될 수 있다. 포유동물 Cpn10은 영장류, 뮤린, 양, 소, 개, 고양이, 돼지 또는 말일 수 있다. 별법으로, Cpn10은 원시생물 기원일 수 있다. 특정 실시태양에서, Cpn10은 인간 Cpn10이다. 야생형 인간 Cpn10의 아미노산 서열은 서열 번호 1 또는 21에 기재된 바와 같을 수 있다. 야생형 Cpn10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 또는 22에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 2 또는 22의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 변형에 관한 것이며, 다르게는, 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 결실, 또는 치환에 의해 N-말단 또는 C-말단에서 변형된 야생형 분자를 포함한다. 예를 들면, 아미노산 첨가는 Cpn10 폴리펩티드 또는 그의 단편과 제2 폴리펩티드 또는 펩티드, 예로서, 폴리히스티딘 태그와의 융합, 말토스 결합 단백질 융합, 글루타티온 S 전이효소 융합, 녹색 형광 단백질 융합, 또는 에피토프 태그, 예로서, FLAG 또는 c-myc 첨가로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 야생형 인간 Cpn10 폴리펩티드의 변형은 추가의 글리신(G) 잔기를 포함할 수 있다. Cpn10 폴리펩티드은 N 말단에 개시 메티오닌을 함유할 수 있거나, 함유하지 않을 수 있다.
인간 Cpn10에 기초하거나, 실질적으로부터 그로부터 유래된, 본 발명의 면역조절 Cpn10 폴리펩티드의 경우에 있어서, 상기의 폴리펩티드는 전형적으로, 임의로는 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형을 포함하는, N-말단 서열 MAGQAFRKFL을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드는 이동성 루프 영역 및 상부 β-헤어핀 영역중 하나 또는 2개 모두에 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 변형된 폴리펩티드가 면역조절 활성을 보유하지만, 단백질 폴딩 활성은 보유하지 않도록, 이동성 루프 영역, 예를 들면, Cpn60과의 상호작용을 초래하는 트리펩티드 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 치환될 수 있다. 대체 실시태양에서, Cpn10 폴리펩티드에는 실질적으로 예를 들면, 서열 번호 3 또는 24에 기재된 서열로 예시된 바와 같은, 이동성 루프 영역, 또는, 예를 들면, 서열 번호 6 또는 26에 기재된 서열로 예시된 바와 같은, 상부 β-헤어핀 영역, 또는 예를 들면, 서열 번호 9 또는 28에 기재된 서열로 예시된 바와 같은, 이동성 루프와 상부 β-헤어핀 영역 둘 다가 없다.
본원에서 정의된 바와 같이, 이동성 루프 또는 상부 β-헤어핀을 구성하는 아미노산은 E. 콜라이 Cpn10 GroES의 서열 및 공지된 결정 구조에 기초하여 정의된다. 진핵생물 Cpn10 폴리펩티드에서 이동성 루프 및 상부 β-헤어핀 영역의 위치는 예측된 3차원 단백질 구조의 진화와 보존을 통해 Cpn10 서열의 보존성과 관련하여 유사하다고 예측된다. 그러나, 진핵생물에서 이동성 루프와 상부 β-헤어핀 영역의 정확환 경계는 GroES의 것과 미세하게 상이할 수 있다.
본원에서 사용되는 "변이체"라는 용어는 실질적으로 유사한 서열을 지칭한다. 일반적으로, 폴리펩티드 서열 변이체는 공통되는 질적인 생물학적 활성을 갖는다. 또한, 이러한 폴리펩티드 서열 변이체는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 공유할 수 있다. "변이체"라는 용어의 의미에는 본 발명의 폴리펩티드의 상동체 또한 포함된다. 상동체는 전형적으로, 상이한 종으로부터 유래되었지만, 본원에 개시된 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 작용 또는 활성을 공유하는 폴리펩티드이다.
또한, "변이체"라는 용어는 본 발명의 폴리페티드의 유사체 또한 포함하는데, 여기에서, "유사체"라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드의 유도체로서, 그러한 유도체는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환을 포함하며, 실질적으로 동일한 작용을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 폴리펩티드 쇄(단백질의 1차 서열)내에서 하나의 아미노산이 유사한 성질을 갖는 또다른 아미노산으로 치환 또는 대체되는 것을 지칭한다.
본 발명은 또한 본원에서 개시하는 폴리펩티드의 단편을 고려한다. "단편"이라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 구성요소를 코딩하거나, 그러한 구성요소인 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 전형적으로, 단편은 구성요소인 그의 폴리펩티드와 공통되는 질적인 생물학적 활성을 갖는다. 펩티드 단편의 길이는 약 5 내지 약 150 아미노산, 길이는 약 5 내지 약 100 아미노산, 약 5 내지 약 50 아미노산, 또는 약 5 내지 약 25 아미노산일 수 있다. 별법으로, 펩티드 단편의 길이는 약 5 내지 약 15 아미노산일 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 변형된 Cpn10 폴리펩티드 또한 본 발명의 범주내에 포함된다.
Cpn10 생산
본 발명에 따라, Cpn10 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있는 재조합 DNA 및 분자 생물학의 표준 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 가이던스는 예를 들면, 표준 텍스트, 예로서, ([Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc, and Wiley-Intersciences, 1992])로부터 입수할 수 있다. 숙련된 수령인은 본 발명이 사용되는 정제 또는 생산 방법으로 제한되지 않고, 임의의 다른 방법을 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 사용하여 사용하기 위한 Cpn10을 생산할 수는 있지만, ([Morton et al., 2000 (Immunol Cell 5/0/78:603-607)], [Ryan et al, 1995 (J Biol Chem 270:22037-22043)] 및 [Johnson et al., 2005 (J Biol Chem 280:4037-4047)]에 기재되어 있는 방법이 Cpn10 폴리펩티드에 대하여 적합한 정제 방법의 일례이다. Cpn10 펩티드는 하나 이상의 단백질분해효소, 예로서, 엔도Lys-C, 엔도Arg-C, 엔도Glu-C 및 스타필로코쿠스 V8-단백질분해효소로 폴리펩티드를 분해함으로써 생산될 수 있다. 분해된 펩티드 단편을 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래픽 (HPLC) 기법에 의해 정제할 수 있다.
대량 생산 목적으로 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드의 정제는 규모가 확대될 수 이다. 예를 들면, 본원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 E. 콜라이에서 배치식 발효에 의해 대량(g)의 고도로 순수한, 임상 등급의 Cpn10 폴리펩티드를 생산하는 바이오공정을 개발하였다.
본 발명의 Cpn10 폴리펩티드 뿐만 아니라, 그의 단편 및 변이체 또한 당업계의 숙련인에게 잘 공지되어 있는 액체 또는 고체상 화학의 표준 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 그러한 분자는 [Steward and Young (Steward, J. M. &. Young, J. D, Solid Phase Peptide Synthesis. (2nd Edn.) Pierce Chemical Co., Illinois, USA (1984)]의 고체상 화학 방법에 따라 합성될 수 있다.
일반적으로 그러한 합성 방법은 하나 이상의 아미노산 또는 적합하게 보호된 아미노산을 성장하는 펩티드 쇄에 순차적으로 첨가하는 것을 포함하고, 전형적으로, 제1 아미노산의 아미노 또는 카복실기는 적합한 보호기로 보호된다. 이어서, 아미드 결합을 형성하기 적합한 조건 하에, 상보성(아미노 또는 카복실) 기가 적합하게 보호된 서열에 그 다음 아미노산을 첨가함으로써 보호된 아미노산은 불활성 고체 지지체에 부착되거나 용액내에서 이용된다. 이어서, 새로 첨가된 아미노산 잔기로부터 보호기는 제거되고, 다음(보호된) 아미노산이 같은 방식으로 첨가된다. 원하는 아미노산 모두 결합된 후, 임의의 남아있는 보호기, 및 필요하다면, 임의의 고체 지지체는 순차적으로 또는 동시에 제거하고, 이로써 최종 폴리펩티드를 수득하게 된다.
관련 분야의 기술자에게 잘 알려져 있는 기법에 의해 Cpn10 폴리펩티드 아미노산을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 적절한 리딩 프레임이 유지된다는 조건하에, 뉴클레오티드(보존적 및/또는 비-보존적)의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하는 뉴클레오티드 대체 기법에 의해 아미노산을 변화시킬 수 있다. 예시적인 기법으로는 무작위 돌연변이 유발, 부위-특이적 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드-매개 또는 폴리뉴클레오티드-매개 돌연변이 유발, 현존 또는 조작된 제한 효소 부위의 사용을 통한 선택된 영역(들)의 결실, 및 중합효소 연쇄 반응을 포함한다.
본 발명의 Cpn10 폴리펩티드에 의한 면역조절 활성의 생성은 Cpn10 폴리펩티드의 헵타머 형성을 포함할 수 있다. 본 발명을 위해 면역조절 활성을 시험하는 것은 당업자에게 알려져 있는 다수의 기법들중 어느 하나를 통해 이루어질 수 있다. 본원에 예시되어 있는 바와 같이, 예를 들면, 루시퍼라제 생물학적 검정법을 사용하여, 전형적으로는 TLR4 효현제, 예로서, 지질다당질의 존재하에서 Toll 유사 수용체 TLR4로부터의 신호 전달을 조절할 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성을 측정할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 시험관내, 생체외, 또는 생체내의 다른 검정법을 사용하여, 예를 들면, 세포, 예로서, 말초혈액 단핵세포에서의 NF-κB 생산 또는 사이토카인 생산 측정을 통해 면역조절 활성을 측정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 실시태양은 상기 기술된 바와 같은 Cpn10 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 그러한 폴리뉴클레오티드의 변이체 및 단편을 제공한다. 야생형 Cpn10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 또는 22에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 2 또는 22의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
특히, 본 발명의 Cpn10-NtermES 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 43에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 43의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 22에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 22의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10-Δml 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 25에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 25의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10-Δ상부 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 27의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Cpn10 β-배럴 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 10의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10 β-배럴 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 29의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Gly-Cpn10 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 31에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 31의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10-IFI 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 36에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 36의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10-III 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 38에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 38의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10-EEE-cHis 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 40에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 40의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Ala-Cpn10-cHis 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 42에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 42의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Cpn10-Δml 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 4 또는 5에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 4 또는 5의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 Cpn10-Δ상부 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 또는 8에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 7 또는 8의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
Cpn10 β-배럴 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에서 고려하고 있고, 이는 서열 번호 10에 기재된 바와 같을 수 있거나, 그에 대하여 서열 번호 10의 서열에 혼성화하는 충분한 서열 일치성을 나타낼 수 있다.
상기 논의된 폴리펩티드에 관한 한, 본원에서 사용되는 "변이체"라는 용어는 실질적으로 유사한 서열을 지칭한다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 공통되는 질적인 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 공유할 수 있다. "변이체"라는 용어의 의미에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 상동체 또한 포함된다. 상동체는 전형적으로, 상이한 종으로부터 유래되었지만, 실질적으로 동일한 활성을 공유하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또한 고려한다. "단편"이라는 용어는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 구성요소를 코딩하거나, 그러한 구성요소인 핵산 분자를 지칭한다. 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는데 폴리뉴클레오티드의 단편이 반드시 필요한 것은 아니다. 오히려 단편은, 예를 들면, 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 유용할 수 있다. 단편은 본 발명의 폴리뉴클레오티드로부터 유래될 수 있거나, 별법으로, 몇몇의 다른 수단, 예를 들면, 화학적 합성에 의해 합성될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편은 또한 당업자에게 알려져 있는 기법을 사용하는 안티센스 분자의 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 프라이머 및 프로브로서 사용하기 위한 것으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드 및 단편을 고려한다. 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 반응 예로서, PCR에 사용하기 적합한, 짧은 뉴클레오티드 잔기 스트레치이며, 그 길이는 전형적으로 적어도 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 프로브는 전형적으로는 혼성화에 의해 상동성인 서열을 검출하는데 사용하기 위한 것으로서, 다양한 길이의, 예를 들면, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 수천개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다. 서열간의 상동성(서열 일치성) 수준은 대개 엄격한 혼성화 조건에 의해 측정될 것이다. 특히, 프로브로서 사용되는 뉴클레오티드 서열은 엄격성이 낮은 조건, 중간 정도로 엄격한 조건, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 상동체 또는 다른 변이체에 혼성화될 수 있다. 엄격성이 낮은 혼성화 조건은 2 x SSC중 50℃에서 실시되는 혼성화에 상응하는 것일 수 있다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 여러 조건과 인자가 존재하는데, 이들을 사용하여 혼성화의 엄격성을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 특정 핵산에 혼성화되는 핵산의 길이 및 성질(DNA, RNA, 염기 조성); 염 및 다른 성분들의 농도, 예로서, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜 등의 존재 또는 부재; 혼성화 및/또는 세척 단계의 온도. 예를 들면, 혼성화 필터를 2 X SSC, 0.5% SDS중 30분 동안 55℃ 이상(엄격성이 낮은 조건), 60℃ 이상(중간 정도로 엄격한 조건), 65℃ 이상(중간 정도/고도로 엄격한 조건), 70℃ 이상(고도로 엄격한 조건), 또는 75℃ 이상(매우 고도로 엄격한 조건)에서 2회에 걸쳐 세척할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 벡터내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 또는 외부 서열의 삽입, 그의 진핵 세포로의 도입 및 도입된 서열의 발현에 적합화된 임의의 다른 적합한 비히클일 수 있다. 전형적으로, 벡터는 진핵생물의 발현 벡터이고, 발현 조절 및 프로세싱 서열, 예로서, 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
항체
본 발명은 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드 뿐만 아니라, 그의 단편 및 유사체에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 적합한 항체로는 다클론, 단클론, 키메라, 인간화된, 단일 쇄, Fab 단편, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 Cpn 10 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 유사체의 효현제 또는 길항제로서 작용할 수 있다.
바람직하게, 항체는 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드의 별도의 영역 또는 단편, 특히, 면역조절 활성 및/또는 파트너 또는 기질 결합을 부여하는데 관여하는 것으로부터 제조되고, 항원 Cpn10 폴리펩티드는 약 5개 이상, 및 바람직하게 약 10개 이상의 아미노산을 함유한다.
적합한 항체를 생성하는 방법을 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, 전형적으로 Fab 부분을 함유하는 항-Cpn10 단클론 항체는 [Antibodies-A Laboratory Manual Harlow and Lane, eds, Cold Spring Harbor Laboratory, N,Y. (1988)]에 기재되어 있는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본질적으로, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드, 그의 단편 또는 유사체에 대한 단클론 항체 제조시, 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산시키는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 이는 원래 (Kohler) 등에 의해 개발된 하이브리도마 기술[Kohler et al., Nature, 256:495497 (1975)] 뿐만 아니라, 트리오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법[Kozbor et al, Immunology Today, 4;72 (1983)], 및 인간 단클론 항체을 생산하는 EBV-하이브리도마 기법[Cole et al, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R, Liss, Inc., (1985)]을 포함한다. 무한증식의, 항체-생산 세포주는 융합 이외의 기법, 예로서, 발암성 DNA를 사용한 B 림프구의 직접적인 형질전환, 또는 엡스타인 바 바이러스를 사용한 형질감염에 의해 생산될 수 있다. 예컨대, ([M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980)]; [Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981)]; [Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980)])을 참조할 수 있다.
요약컨대, 그로부터 단클론 항체가 생산되는 하이브리도마를 생산하는 수단으로서, 골수종 또는 다른 무한-증식성 세포주를 포유동물의 인식 인자-결합 부분, 또는 인식 인자, 또는 그의 기원-특이 DNA-결합 부분으로 고면역화된 포유동물의 지라로부터 수득한 림프구로 융합시킨다. 본 발명의 실시에 유용한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 본 인식 인자와의 면역반응할 수 있는 그의 능력 또는 표적 세포내 특정 전사 활성을 저해할 수 있는 그의 능력에 의해 동정된다.
본 발명의 실시에 유용한 단클론 항체는 적절한 항원 특이성의 항체 분자를 분비하는 하이브리도마를 함유하는 영양 배지를 포함하는 단클론 하이브리도마 배양을 개시함으로써 생산될 수 있다. 하이브리도마가 항체 분자를 배지로 분비하기에 충분한 시간 동안, 그러한 조건 하에 배양물을 유지시킨다. 이어서, 항체-함유 배지를 수집한다. 이어서, 잘-알려진 기법에 의해 항체 분자를 단리시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 유사체에 대한 다클론 항체를 생산하기 위하여 사용될 수 있는 다양한 방법들이 당업계에 알려져 있다. CpntO 다클론 항체를 생산하기 위하여, 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 숙주 동물은 Cpn10 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 유사체를 주사함으로써 면역화시킬 수 있다. 또한, Cpn10 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 유사체는 면역원성 담체, 예컨대, 소 혈청 알부민(BSA: bovine 혈청 albumin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: keyhole limpet hemocyanin)에 접합될 수 있다. 또한, 면역 반응을 증가시키기 위하여, 다양한 애주번트가 사용될 수 있는데, 그러한 애주번트로는 프로인트(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예로서, 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예로서, 리졸레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 유제, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애주번트 예로서, BCG(칼메트-게랑 간균: bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 당업계에 공지된 다양한 기법에 의해 원하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 항체의 면역특이적 결합에 대한 검정법으로는 방사면역 검정법, ELSA(효소 -결합 면역 검정법: enzyme-linked immunosorbent assay), 샌드위치 면역 검정법, 면역방사 검정법, 겔 확산 침전 반응법, 면역확산 검정법, 동소 면역 검정법, 웨스턴 블롯법, 침전 반응, 응집 검정법, 보체 결합 검정법, 면역형광 검정법, 단백질 A 검정법, 및 면역전기영동 검정법 등을 포함하나, 이에 한정하지 않는다(예를 들면, [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]을 참조할 수 있음). 항체 결합은 1차 항-Cpn10 항체상의 검출가능한 표지에 의해 검출될 수 있다. 별법으로, 항-Cpn10 항체는 적절한게 표지된 2차 항체 또는 시약과 그의 결합에 의해 검출될 수 있다. 면역 검정법으로 결합을 검출하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 범주내 포함된다.
본 발명의 항체는 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있는 진단학적 방법과 키트로서, 체액 또는 조직내 Cpn10을 질적으로 검출하거나 정량화하기 위한 진단학적 방법과 키트에 사용될 수 있거나, 별법으로, 항체는 다양한 질환, 질병 및 병태의 치료 방법 및 치료용 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명의 Cpn10 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 유사체에 대항 상승된 항체(또는 그의 단편)은 Cpn10에 대한 결합 친화성을 갖는다. 바람직하게, 항체(또는 그의 단편)는 약 105M-1 초과의, 더욱 바람직하게, 약 106M-1 초과의, 더욱 바람직하게, 약 107M-1 보다 초과의, 및 가장 바람직하게, 약 106M-1 초과의 결합 친화성 또는 결합성을 갖는다.
본 발명에 따라 적합한 양의 항체를 수득함에 의해 무혈청 배지를 사용하는 배치식 발효를 사용하여 항체(들)를 제조할 수 있다. 발효 후, 크로마토그래피 및 바이러스 불활성화/제거 단계를 통합한 다단계 방법을 통해 항체를 정제할 수 있다. 예를 들면, 항체를 먼저 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하고, 용매/세제로 처리하여 임의의 지질 외피 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 전형적으로 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 추가의 정제를 사용하여 잔류 단백질, 용매/세제 및 핵산을 제거할 수 있다. 정제된 항체를 추가로 정제하고, 겔 여과 칼럼을 사용하여 0.9% 염수로 제형화할 수 있다. 이어서, 제형화된 벌크 제제를 멸균시키고, 바이러스 여과하고, 분배하였다.
효현제 및 길항제
특이 항-Cpn10 항체 이외에도, 본 발명의 폴리펩티드, 및 그의 단편 및 변이체 또한 Cpn10과 상호작용하는 화합물 및 물질을 스크리닝 및 동정하는데 특히 유용하다. 특히, 바람직한 화합물은 Cpn10의 면역조절 활성을 조절하는 것이다. 그러한 화합물은 Cpn10 면역조절 활성을 활성화시키거나, 증가시키거나, 저해하거나, 방지함으로써 조절할 수 있다. 적합한 화합물은 직접(예를 들면, 결합) 또는 간접적인 상호작용에 의해 Cpn10에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 Cpn10 폴리펩티드에 결합하거나, 다르게는, 그와 상호작용하는 화하물, 및 특히, Cpn10의 활성을 조절하는 화합물은 여러 적합한 방법에 의해 동정될 수 있다. 상호작용 및/또는 결합은 표준 경쟁 결합 검정법 또는 이중-하이브리드 검정법 시스템을 사용하여 측정할 수 있다.
예를 들면, 이중-하이브리드 검정법은 전형적으로 단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 사용되는 효모-기반 유전자 검정법 시스템이다[Fields and Song, 1989]. 간단하게, 이러한 검정법은 전사 활성화제의 다중-도메닝 성질을 이용한다. 예를 들면, 공지된 전사 활성화제의 DNA-결합 도메인을 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체에 융합시키고, 전사 활성화제의 활성화 도메인을 후보 단백질에 융합시킬 수 있다. 후보 단백질과 Cpn10 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체 사이의 상호작용은 전사 활성화제의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 아주 근접하도록 할 것이다. 따라서, 상호작용은 전사 활성화제에 의해 활성화된 특이 리포터 유전자의 전사에 의해 검출될 수 있다.
별법으로, 친화성 크로마토그래피를 사용하여 Cpn10의 결합 파트너를 동정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체를 지지체(예로서, 세파로스) 상에 고정시키고, 세포 용해물을 칼럼 상에 통과시켰다. 이어서, 고정된 Cpn10 폴리펩티드, 단편 또는 변이체에 대한 단백질 결합을 칼럼으로부터 용출시키고, 동정할 수 있다. 먼저, 그러한 단백질은 예를 들면, N-말단 아미노산 서열화에 의해 동정될 수 있다.
별법으로, 상기 기법의 변형에 있어서, 융합 단백질은 Cpn10 폴리펩티드, 단편 또는 변이체를 검출가능한 태그, 예로서, 알칼리성 인산분해효소에 융합시키고, [Flanagan and Leder (1990)]에 기재된 바와 같은 변형된 형태의 면역침전법을 사용함으로써 생성될 수 있다.
Cpn10 활성을 조절하는 화합물을 검출하는 방법은 Cpn10 폴리펩티드를 후보 화합물 및 적합하게 표지된 기질을 배합하고, 기질의 변화에 의해 화합물이 Cpn10에 미치는 효과를 모니터하는 것을 포함할 수 있다(이는 시간에 따른 함수로서 측정될 수 있다). 적합한 표지된 기질로는 예를 들면, 비색, 방사측정, 형광측정 또는 형광 공명 에너지 전이(FRET: fluorescent resonance energy transfer) 기반 방법을 위해 표지된 것을 포함한다.
본 발명의 Cpn10 폴리펩티드 및 적절한 단편 및 변이체는 Cpn10에 결합하거나, 다르게는 그와 상호작용할 수 있는 후보 화합물을 검정하는 고성능 스크린에서 사용될 수 있다. 이들 후보 화합물은 또한 화합물이 Cpn10에 미치는 효과를 측정하기 위하여 작용성 Cpn10에 대하여 스크리닝될 수 있다.
상기 기술한 방법들은 단지, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드, 및 그의 단편 및 변이체와 상호작용할 수 있거나, 그의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 동정하기 위하여 사용될 수 있는 방법 유형의 일례일 뿐이라는 것을 이해할 것이다. 다른 적합한 방법은 당업자에게 알려져 있을 것이고, 이는 본 발명의 범주내 포함된다.
상기 방법들에 의해, Cpn10 활성을 활성화시키거나(효현제), 저해하는(길항제) 화합물을 동정할 수 있다. 그러한 화합물은 예를 들면, 항체, 저분자 펩티드, 핵산 또는 비-단백질성 유기 분자일 수 있다.
상기 방법들에 의해 스크리닝하기 위한 Cpn10 활성의 잠재적인 조절제는 당업자에게 알려져 있는 다수의 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 다양한 형태의 조합 화학 물질을 사용하여 추정의 비-펩티드 조절제를 생성할 수 있다. 추가로, 기법, 예로서, 핵 자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance ) 및 X선 결정법을 사용하여 Cpn10 폴리펩티드, 단편 및 변이체의 구조를 모델링하고, 컴퓨터 예측을 사용하여 가능한 조절제를 생성할 수 있다.
조성물 및 투여 경로
본 발명의 Cpn10 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 치료제로서 유용할 수 있다. 이들 분자는 예를 들면, 상기 분자를 치료학적 유효량으로 대상자에게 투여함으로써 대상자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방할 때의 유용성이 발견되었다. 전형적으로 그러한 질환 및 병태는 대상자에서 면역 반응의 조절에 의해 치료될 수 있다. 일례로, 그러한 질환 및 병태로는 급성 또는 만성 염증 질환, 천식, 알레르기, 다발경화증, GVHD, 및 감염성 질환을 포함할 수 있다. 감염 질환은 박테리아 또는 바이러스 감염으로부터 유발될 수 있다. 따라서, 질환 및 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, Cpn10 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티를 포함하는 약제학적으로 유용한 조성물이 고려된다.
항-Cpn10 항체를 포함하는, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드의 효현제 및 길항제 또한 치료제로서 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 그러한 효현제 및 길항제를 사용하는 치료 방법, 및 상기를 포함하는 약제학적 조성물도 고려한다.
일반적으로, 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 적합한 조성물은 당업계의 숙련이에게 알려져 있는 방법 및 절차에 따라 제조될 수 있고, 따라서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 애주번트를 포함할 수 있다.
조성물은 표준 경로에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 비경구(예컨대, 정맥, 척수내, 피하 또는 근육내), 경구 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신, 국부 또는 국소일 수 있다. 임의의 소정의 환경하에서 사용되는 특정의 투여 경로는 치료하고자 하는 병태의 성질, 병태의 중증도 및 범위, 투여하고자 하는 특정 화합물의 필요 용량 및 화합물의 잠재적인 부작용을 비롯한, 다수의 인자에 따라 달라질 것이다.
일반적으로, 적합한 조성물은 당업계의 숙련인에게 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있고, 약제학적으로 허용가능한 희석제, 애주번트 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 희석제, 애주번트 및 부형제는 조성물의 다른 성분들과 상용성이라는 점에서 "허용가능"하여야 하고, 그의 수혜자에게는 유해하지 않아야 한다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 일례는 탈염수 또는 증류수; 생리 식염수; 식물 기반 오일, 예로서, 낙화생유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 예로서, 낙화생유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 아라키스 오일 또는 코코넛 오일; 폴리실록산, 예로서, 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리설폭산을 비롯한 실리콘 오일; 광유, 예로서, 액상 파라핀, 연성 파라핀, 또는 스쿠알렌; 셀룰로스 유도체 예로서, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스; 저급 알카놀, 예를 들면, 에탄올 또는 이소-프로판올; 저급 아르알카놀; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르, 예로서, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레이트; 폴리비닐피리돈; 아가; 카라기닌; 트라가칸스 검 또는 아카시아 검, 및 페트롤륨 젤리이다. 전형적으로, 담체 또는 담체들은 조성물의 10중량% 내지 99.9중량%를 형성할 것이다.
본 발명의 조성물은 주사로 투여하기에 적합한 형태, 경구 섭취에 제형 형태(예로서, 캡슐제, 정제, 캐플렛, 엘릭시르제), 국소 투여에 적합한 연고제, 크림제, 또는 로션 형태, 점안제로서 투여하기 적합한 형태, 흡인, 예로서, 비강내 투여 또는 경구 흡입에 의해 투여하기 적합한 에어로졸 형태, 피하, 근육내, 또는 정맥 주사인 비경구 투여에 적합한 형태일 수 있다.
주사액 또는 현탁액으로서 투여하기 위해서 비-독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 담체는 링거액, 등장성 염수, 인산염 완충처리된 염수, 에탄올 및 1,2 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.
경구용 적합한 담체, 희석제, 부형제 및 애주번트의 몇몇 일례로는 낙화생유, 액상 파라핀, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 아카시아 검, 트라가칸스 검, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만닛톨, 젤라틴 및 레시틴을 포함한다. 추가로, 이들 경구용 제형은 적합한 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 캡슐제 형태로 사용될 때, 캡슐제는 붕해를 지연시키는, 예로서, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 화합물로 피복될 수 있다.
애주번트는 전형적으로 연화제, 유화제, 증점제, 방부제, 살균제 및 완충제를 포함한다.
경구 투여용의 고체 제형은 인간 및 수의학의 약제학적 실시에 허용가능한 결합제, 감미제, 붕해제, 희석제, 향미제, 피복제, 방부제, 윤활제 및 시간 지연제를 함유할 수 있다. 적합한 결합제로는 아카시아 검, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸스 검, 알긴산나트륨, 카복시메틸셀룰로스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 감미제로는 수크로스, 락토스, 글루코스, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕해제는 옥수수 전분, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 크산탄검, 벤토나이트, 알긴산 또는 아가를 포함한다. 적합한 희석제로는 락토스, 소르비톨, 만닛톨, 덱스트로스, 카올린, 셀룰로스, 탄산칼슘, 규산칼슘 또는 인산이칼슘을 포함한다. 적합한 향미제로는 페퍼민트 오일, 윈터그린 오일, 체리, 오렌지 또는 라스베리 향미제를 포함한다. 적합한 피복제로는 중합체, 또는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 그의 에스테르의 공중합체, 왁스, 지방산 알코올, 제인, 셀락 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 방부제로는 나트륨 벤조에이트, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 아황산수소나트륨을 포함한다. 적합한 윤활제로는 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 나트륨 올레이트, 염화나트륨 또는 활석을 포함한다. 적합한 시간 지연제로는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.
경구 투여용의 액상 제형은 상기 제제 이외에도, 액상 담체를 함유할 수 있다. 적합한 액상 담체로는 물, 오일, 예로서, 올리브 오일, 낙화생유, 참깨유, 해바라기 오일, 홍화유, 땅콩 오일, 코코넛 오일, 액상 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방산 알코올, 트리글리세리드 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다.
경구 투여용의 현탁액은 분산제 및/또는 현탁제를 포함한다. 적합한 현탁제로는 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 알긴산나트륨 또는 아세틸 알코올을 포함한다. 적합한 분산제로는 레시틴, 지방산, 예로서, 스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 디-올레이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 디-올레이트, -스테아레이트 스테아레이트 -라우레이트 등을 포함한다.
경구 투여용의 에멀젼은 또한 하나 이상의 유화제를 포함할 수 있다. 적합한 유화제로는 상기 예시된 분산제 또는 천연 검, 예로서, 구아 검, 아카시아 검 또는 트라가칸스 검을 포함한다.
비경구적으로 투여가능한 조성물의 제조 방법은 당업자에게는 자명하며, 이는 예를 들면, [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company. Easton, Pa.](본원에서 참고로 인용됨)에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 국소용 제제는 하나 이상의 허용가능한 담체, 및 임의로 임의의 다른 치료 성분들과 함께 활성 성분을 포함한다. 국소 투여에 적합한 제제는 피부로를 통해 치료가 필요한 부위로 침투되기에 적합한, 액상 또는 반-액상 제제, 예로서, 외용제, 로션, 크림제, 연고제, 또는 페이스트, 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 드롭제를 포함한다.
본 발명에 따른 드롭제는 멸균된 수성 또는 오일성 액제 또는 현탁제를 포함할 수 있다. 살균제 및/또는 진균제, 및/또는 임의의 다른 적합한 방부제, 및 임의의로는 계면활성제를 포함하는, 수용액에 활성 성분을 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 생성된 용액을 여과에 의해 정화시키고, 적합한 용기로 옮기고, 멸균시킬 수 있다. 90℃-100℃에서 반시간 동안 유지시키거나 오토클레이빙하여, 또는 여과에 의해 멸균시킨 후, 무균 기법에 의해 용기로 옮길 수 있다. 드롭제에 포함시키기에 적합한 살균제 및 진균제의 일례는 질산 또는 아세트산 페닐수은(0.002%), 염화벤즈알코늄(0.01%) 및 아세트산 클로르헥시딘(0.01%)이다. 오일 용액 제조에 적합한 용매는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 발명에 따른 로션제는 피부 또는 눈에 적용시키기에 적합한 것을 포함한다. 점안액은 임의로 살균제를 함유하는, 멸균 수용액일 수 있고, 점안제와 관련하여 상기 기술된 것과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부에 적용시키기 위한 로션 또는 외용제는 또한 건조 촉진제, 및 피부 냉각제, 예로서, 예로서, 알코올 또는 아세톤, 및/또는 보습제, 예로서, 글리세롤 또는 오일, 예로서, 카스토르 오일 또는 아라키스 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림제, 연고제, 또는 페이스트는 외용으로 적용시키기 위한 활성 성분의 반-고체 제제이다. 미세-분할되거나 분말형의 활성 성분은 지방성 또는 비-지방성 주성분에서 단독으로, 또는 수성 또는 비-비수성 유체중의 용액 또는 현탁액에서 혼합하여 제조할 수 있다. 주성분은 탄화수소, 예로서, 경질, 연질 또는 액상 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속 비누; 점액; 천연 기원의 오일, 예로서, 아몬드, 옥수수, 아라키스, 카스토르 또는 올리브 오일; 양모지 또는 그의 유도체, 또는 알코올, 예로서, 프로필렌 글리콜 또는 마크로골과 함께 지방산, 예로서, 스테아른산 또는 올레산을 포함할 수 있다.
조성물은 임의의 적합한 계면활성제 예로서, 음이온, 양이온 또는 비-등장성 계면활성제 예로서, 소르비탄 에스테르 또는 그의 폴리옥시에틸렌 유도체를 혼입할 수 있다. 현탁화제, 예로서, 천연 검, 셀룰로스 유도체 또는 무기 물질, 예로서, 규산성 규산, 및 다른 성분들, 예로서, 라놀린 또한 포함될 수 있다.
본 조성물은 또한 리포좀 제형으로 투여될 수 있다. 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 지질 물질로부터 유도되고, 수성 매질중 분산되는 모노- 또는 다중층 수화된 지질 결정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는, 임의의 비-독성의 생리학적으로 허용가능하고, 대사가능한 지질이 사용될 수 있다. 리포좀 제형내 조성물은 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은, 2개 모두가 천연 및 합성인, 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)이다. 리포좀 형성 방법은 당업계에 알려져 있고, 이와 관련하여 [Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq.](그의 내용은 본원에서 참고로 인용된다)를 구체적으로 참조한다.
조성물을 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol) 유도체 어레이에 접합시킬 수 있다. PEG를 단백질에 첨가하는 것(페길화(PEGylation))은 잘 확립되어 있는, 단백질의 혈장 제거율을 감소킴으로써 그의 효능을 증가시키는 방법이다[Nucci et al, 1991, Adv. Drug Del. Rev. 6:133]. 페길화의 추가의 잇점으로는 단백질 안정성의 증가, 면역원성 감소, 용해도 증진, 및 단백질 분해에 대한 감수성 감소를 포함한다[Sheffield W. 2001, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord, 1:1-22]. PEG 분자는 (OCH3CH2)n-OH의 반복 구조를 함유하고, 그의 분자량에 따른 군으로 분류된다. PEG 유도체가 단백질에 접합됨으로써 그의 수력 반경은 증가하고, 일반적으로 그의 반감기 증가는 부착된 PEG 쇄의 크기와 직접적으로 관련이 있다[Sheffield W.2001, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord.1:1-22].
조성물은 또한 미세입자의 형태로 투여될 수 있다. 폴리락티드(PLA: polylactide), 폴리락티드-코-글리콜리드(PLGA: polylactide-co-glycolide), 및 엡실론-카프로락톤(ε-카프로락톤)으로부터 형성된 생체분해가능한 미세입자는 혈장 반감기를 증가시킴으로써 효능을 연장시키는 약물 담체로서 괌범위하게 사용되어 왔다[R. Kumar, M., 2000, J Phrm Pharmaceut Sci. 3(2) 234-258]. 미세입자는 백신, 항생제, 및 DNA를 비롯한 다양한 약물 후보물질의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 또한, 이들 제제는 비경구피하 주사, 정맥 주사 및 흡입을 비롯한 다양한 전달 경로를 위해 개발되었다.
조성물은 수크로스 아세테이트 이소부티레이트(SAIB: sucrose acetate isobutyrate) 및 유기 용매 또는 유기 용매 혼합물로 구성된 방출 조절형 매트릭스를 혼입할 수 있다. 추가로 점성을 증가시키고 방출 속도를 저속화시키기 위한 방출 조절제로서 중합체 첨가제가 비히클에 첨가될 수 있다. SAIB는 잘 알려져 있는 식품 첨가제이다. 이는 이소부티레이트 대 아세테이트기의 명목상의 비가 6 대 2인, 매수 소수성이며 전체적으로 에스테르화된 수크로스 유도체이다. 혼합 에스테르로서 SAIB는 결정화되지 않고, 투명한 점성 액체로서 존재한다. SAIB를 약제학적으로 허용가능한 용매, 예로서, 에탄올 또는 벤질 알코올과 혼합함으로써 충분히 주사가능할 정도로 혼합물의 점성을 감소시킨다. 활성인 약제학적 성분을 SAIB 전달 비히클에 첨가하여 SAIB 액제 또는 현탁액 제제를 형성할 수 있다. 제제를 피하로 주사할 때, 용매가 매트릭스로부터 확산됨으로써 SAIB-약물 또는 SAIB-약물-중합체 혼합물은 계내 형성 데포로서 제공할 수 있다.
본 발명의 목적으로 분자 및 물질을 조성물로서 치료학적 또는 예방학적으로 대상자에게 투여할 수 있다. 치료학적 적용에 있어서, 질환 및 그의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키는데 충분한 양으로 조성물을, 이미 질환을 앓고 있는 환자에게 투여한다. 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양으로 분자 또는 물질을 제공하여야 한다.
임의의 특정 환자에 대한 치료학적 유효량은 치료하는 질병 및 질병의 중증도; 사용하는 분자 또는 물질의 활성; 사용하는 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 섭식; 투여 시간; 투여 경로; 분자 또는 물질 제거 속도; 치료 기간; 치료와 병용하여, 또는 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약에 있어 잘 알려져 있는 다른 관련 인자에 따라 달라질 것이다.
당업자는 적용가능한 질환 및 병태에 필요한 물질 또는 화합물의 비독성인 유효량을 통상의 실험을 통해 측정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 유효 투여량은 24시간에 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 약 1000 mg 범위; 전형적으로, 24시간에 체중 1 kg당 약 0.001 mg 내지 약 750 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 0.01 mg 내지 약 500 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 0.1 mg 내지 약 500 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 0.1 mg 내지 약 250 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 1.Omg 내지 약 250 mg 범위인 것으로 추정된다. 더욱 전형적으로, 유효량 범위는 24시간에 체중 1 kg당 약 1.0 mg 내지 약 200 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 1.0 mg 내지 약 100 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 1.0 mg 내지 약 50 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 1.0 mg 내지 약 25 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 5.0 mg 내지 약 50 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 5.0 mg 내지 약 20 mg 범위; 24시간에 체중 1 kg당 약 5.0 mg 내지 약 15 mg 범위인 것으로 추정된다.
별법으로, 유효 투여량은 약 500 mg/㎡ 이하일 수 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 약 25 내지 약 500 mg/㎡ 범위, 바람직하게 약 25 내지 약 350 mg/㎡ 범위, 더욱 바람직하게 약 25 내지 약 300 mg/㎡ 범위, 더욱더 바람직하게 약 25 내지 약 250 mg/㎡ 범위, 더더욱 바람직하게 약 50 내지 약 250 mg/㎡ 범위, 및 추가로 더욱더 바람직하게 약 75 내지 약 150 mg/㎡ 범위인 것으로 추정된다.
전형적으로, 치료 적용시 치료는 질환 상태의 지속 기간동안 이루어질 것이다.
또한, 최적량과 개별적인 투여 간격은 치료하는 질환 상태의 성질 및 범위, 투여 형태, 경로, 및 부위, 및 치료받는 특정 개인의 성질에 의해 결정될 것이라는 것은 당업계의 숙련인에게 자명할 것이다. 또한, 그러한 최적의 조건은 종래 기법에 의해 측정될 수 있다.
최적의 투여 과정, 예로서, 지정 일수 동안 매일 제공되는 조성물 투여 횟수는 종래의 치료 결정 시험 과정을 사용함으로써 당업자는 확인할 수 있다는 것 또한 당업계의 숙련인에게 자명할 것이다.
본 발명의 실시태양은 또한 Cpn10을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 고려한다. 이러한 상황하에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있고, 이로써 폴리뉴클레오티드가 대상자에 투여된 이후, 적절한 폴리펩티드 서열이 생산된다. 폴리뉴클레오티드는 벡터로 대상자에게 투여될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 또는 외래 서열의 삽입, 진핵 세포내로 그의 도입, 및 도입된 서열의 발현에 적합화된 임의의 다른 적합한 비히클일 수 있다. 전형적으로 벡터는 진핵세포 발현 벡터이고, 발현 조절 및 프로세싱 서열, 예로서, 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 투여되는 핵산 작제물은 나형(naked) DNA를 포함할 수 있고, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 조성물 형태로 존재할 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드를 단독으로, 또는 하나 이상의 첨가제와 함께 투여할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드는 TLR 수용체 예로서, TLR4를 자극시킬 수 있는 하나 이상의 효현제와 함께 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명은 질환 및 질병을 치료하는 다른 치료학적 접근법을 함께 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드를 사용하여 병용 요법을 고려한다. 예를 들면, Cpn10 폴리펩티드는 I형 인터페론, 예로서, IFNβ 또는 IFNα를 사용하는 요법에 반응성인 바이러스 질환 치료에 유용할 수 있고, 본 발명의 Cpn10 폴리펩티드는 자가면역 질환 예로서, 다발경화증 치료에 IFNβ와 함께 사용될 수 있다.
그러한 병용 요법을 위해 병용 요법의 각 성분을 동시에, 또는 임의 순서로 순차적으로, 또는 다른 시점에 투여함으로써 원하는 효과를 제공할 수 있다. 별법으로, 성분을 복합 제품으로서 단일 투여 단위로 함께 제형화할 수 있다. 따로따로 투여되는 경우, 동일한 투여 경로를 통해 성분을 투여하는 것이 바람직할 수는 있지만, 그렇게 할 필요는 없다.
이에, 본 발명은 특적 실시예를 참고로 하여 기술되지만, 이는 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다.
실시예 1: Cpn10 폴리펩티드 생산을 위해 사용되는 유전적 파라미터
표 2에 하기 열거되는 Cpn10 폴리펩티드 생산을 위해 사용되는 유전적 파라 미터, 특히, 발현 시스템(즉, 플라스미드 명칭, 항생제 선별 및 숙주 세포)을 기재한다.
표 2. Cpn10의 생산을 위한 유전적 파라미터의 기재
Cpn10 폴리펩티드 플라스미드 명칭 생산 시스템
Ala-Cpn10 Ala-Cpn10_pPL550 pPL550 AmpR을 포함하는 XL1-블루 세포
X-Cpn10 X-Cpn10_pPL550 pPL550 AmpR을 포함하는 XL1-블루 세포
Ala-Cpn10-Δml Ala-Cpn10-Δml_pPL550 pPL550 AmpR을 포함하는 XL1-블루 세포
Ala-Cpn10-Δ상부 Ala-Cpn10-Δ상부_pPL550 pPL550 AmpR을 포함하는 XL1-블루 세포
Ala-Cpn10-β-배럴 Ala-Cpn10-β-배럴_pET23a pET23a AmpR을 포함하는 BL21(DE3)STAR 세포
Gly-Cpn10 Gly-Cpn10_pET30a pET30a KanR을 포함하는 BL21(DE3)STAR 세포
GroES GroES_pET11a pET11a AmpR을 포함하는 BL21(DE3)STAR 세포
Ala-Cpn10-IFI Ala-Cpn10-IFI_pPL550 pPL550 AmpR을 포함하는 XL1-블루 세포
Ala-Cpn10-III Ala-Cpn10-III_pPL550 pPL550 AmpR을 포함하는 XL1-블루 세포
Ala-Cpn10-EEE-cHis Ala-Cpn10-EEE-cHis_pET23a pET23a AmpR을 포함하는 BL21(DE3)STAR 세포
Ala-Cpn10-cHis Ala-Cpn10-cHis_pET23a pET23a AmpR을 포함하는 BL21(DE3)STAR 세포
Cpn10-NtermES Cpn10-NtermES_pET23a pET23a AmpR을 포함하는 BL21(DE3)STAR 세포
실시예 2: Cpn10 폴리펩티드 생산 공정
Cpn10의 생산 공정을 추가로 정의하기 위하여 생산 공정과 관련하여 하기에 Ala-Cpn10을 예시한다.
먼저, 추가의 N-말단 알라닌 잔기(Ala-Cpn10_pPL550)를 포함하는 인간 Cpn10을 코딩하는 열 유도 발현 플라스미드를 (Somodevilla-Torres et al. [2003, Prot. Exp, Purl 32: 276-287])로부터 입수하였다. 이어서, 플라스미드 벡터를 E. 콜라이 균주 XL1-블루(Stratagene)내로 형질전환시키고, 마스터 셀 뱅크를 단일 선별된 클론으로부터 확립시켰다.
이어서, 본질적으로 (Ryan et al.[1995, J Biol Chem 270: 22037-22043])에 기재된 바와 같이, Ala-Cpn10을 E. 콜라이에서 생산하였다. 추가로, Macro-Prep High Q(BioRad)와 결합하지 않은 물질 또한 S-세파로스에 이어 겔-여과(Superdex 200, Amersham Biosciences)에 의해 정제하였다. 50 mM 트리스-HCl(pH 7.6) 및 150 mM NaCl 완충제중 정제된 Cpn10은 제조사의 설명서에 따라 0.2 mm 머스탱(Mustang) E 막을 포함하는 아크로디스크(Acrodisc)(미시간주 앤아버에 소재하는 Pall Corporation, 카탈로그 번호 MSTG5E3)를 사용하여 여과하여 잔류 내독소를 제거하고, -70℃에서 저장하였다. SDS-PAQE에 의해 Cpn10의 순도는 >99%으로 측정되었다. 분취량을 사용 전에 한번 해동시켰다.
대부분의 인간 Cpn10 폴리펩티드는 GroEL-매개 로다네제 재폴딩 검정법[Brinker et al, 2001, Cell, 107 223-233](데이타를 나타내지 않음)에서 E. 콜라이 GroES와 동일한 몰 활성을 나타내었다. 리물루스 아메바세포 용해물(Limulus Amebocyte Lysate) 검정법(메릴랜드주 워커스빌에 소재하는 BioWhittaker)에 의해 Cpn10의 LPS 오염은 <0.03 EU/mg의 정제된 Cpn10 단백질인 것으로 측정되었다.
상기 기술된 바와 같은 생산 공정으로부터 수득한 Cpn10 폴리펩티드의 신뢰성을 질량 분석법에 의해 배치 기반에 의한 배치식으로 평가하였다. 하기의 표 3에 나타낸 바와 같이, 추정된 질량과 계산된 질량은 동일하다.
표 3: Cpn10 폴리펩티드에 대한 질량 분석법 데이타 및 이론상의 pI
Figure 112008023336290-PCT00001
실시예 3: Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성을 측정하는 RAW264-HIV-LTR-LUC 생물학적 검정법
본질적으로 국제 특허 출원 번호 PCT/AU2005/000041에 기재되어 있는 것과 같은 HAW264-HIV-LTR 루시퍼라제 생물학적 검정법을 사용하여 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성을 시험하였다. 본 검정법은 지질다당질(LPS)의 존재하에서 Cpn10, 또는 그의 변이체, 돌연변이체 또는 유도체가 Toll 유사 수용체 TLR4로부터 신호 전달을 조절할 수 있는 능력에 대하여 측정한다.
RAW264-HIV-LTR-LUC 세포는 액상 질소로부터 회수한 후, 5일 동안 G418(200 mg/ml) 존재하에서 배양하고, 75 ㎠ 플라스크(독일 프릭켄하우젠에 소재하는 Greiner Labortechnik)중 현탁 배양물로서 배양하였다. 피펫팅을 반복하여 RAW264- HIV-LTR-LUC 세포를 분해하고, 24-웰 플레이트에 2.5 x 105 세포/웰로 플레이팅하고, 밤새도록(37℃ 및 5% C02) 인큐베이션시켰다. E. 콜라이(카탈로그 번호 L-6529, 균주 055:B5, Sigma)로부터의 조 LPS 및 E. 콜라이(카탈로그 번호 tlrl-pelps, 균주 0111:B4, Invivogen)로부터의 초고순도의 LPS를 무균 증류수중에 용해시키고, 각각 1 mg/ml 또는 5 mg/ml로 유리 바이알중 4℃에 저장하였다. 사용하기 직전, 분취량을 취하기 전에 용액을 왕성하게 와동시켰다. 지정된 농도로 LPS를 첨가하기 전에 2시간 동안 Cpn10을 세포와 함께 사전-인큐베이션시켰다. 추가의 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 부착성 세포를 루시퍼라제 검정법(위스콘신주 매디슨에 소재하는 Luciferase Assay System)을 위해 처리하였다. 루시퍼라제 활성은 투너 디자인 루미노미터 TD 20/20(Turner Designs Luminometer TD 20/20)(RLU) 또는 퍼킨-엘머 왈라스 빅토르 2 멀티라벨 카운터(Perkin-Bmer Wallace Victor 2 Multilabel Counter)(CPS)를 사용하여 측정하였다.
실시예 4: 시험관내 GroEL-매개 로다네제 재폴딩 검정법을 사용한 Cpn10 폴리펩티드에 대한 공-샤페론 활성 분석
(Weber F, and Hayer-Hartl M.K. [Chaperonin Protocols, Ed Schneider C, Humana Press Inc., 2000, p117-126])로부터 적합화된 방법을 사용하여 시험관내 로다네제 재폴딩에 대하여 검정함으로써 GroEL와 함께 분자 샤페론 및 폴드 단백질로서 작용할 수 있는 Cpn10 폴리펩티드의 능력을 측정하였다. 본래의 소 로다네제 (30 μM, SIGMA)를 20 mM MOPS-KOH (pH7.5)에서 변성시키고, 이어서, 100 mM KCl 및 5M 구아니딘 HCl 및 8 mM DTT를 함유하는 20 mM MgCl2(완충제 A)를 변성제로부터 GroEL(400 nM)를 함유하는 완충제 A로 순차적으로 희석시켜 로다네제의 최종 농도가 400 nM이 되도록 하였다. GroEL은 변성된 로다네제(D-Rho)에 신속하고 안정되게 결합하는 반면, 완충제만이 있는 경우에서 D-Rho는 미슬-폴딩되고, 응집되었다(즉, 비효과적으로 자발적인 재폴딩). Cpn10(하기를 참조할 수 있음)과 ATP (20.6 mM)를 미리형성된, 안정적인 GroEL-결합 로다네제 복합체에 첨가하는 것은 재폴딩이 효과적으로 진행될 수 있도록 한다. Cpn10의 부재하에서 ATP를 첨가하는 것은 D-Rho가 폴딩에는 무력한 방식으로 GroEL을 간헐적으로 순환하고, 이로써 결과적으로는 미스폴딩되고 응집되도록 한다(이러한 반응이 적합한 검정 블랭크로서의 역할을 한다). 각 폴딩 반응은 특정 시점(즉, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90분)에서 290 ㎕의 총 용량을 갖고, 30 ㎕의 분취량을 제거하고, 6분 동안 70 ㎕의 로다네제 활성 검정 혼합물(57.1 mM KH2PO4 (pH 7.5), 71.4 mM EDTA, 71.4 mM Na 티오설페이트 및 71.4 mM KCN)과 배합하였다. ATP로 재폴딩 반응을 개시하기 이전에, 재폴딩 시점 T=O분에 30 ㎕의 분취량을 취한다. 로다네제 활성 검정 혼합물내 EDTA는, GroEL 결합 ATP을 방지하는 Mg2+ 이온을 킬레이트화하고, 그 결과 폴딩 반응은 즉시 중단된다. 이어서, 50 ㎕의 15% (v/v) 포름알데히드(최종 농도 5% v/v)를 첨가함으로써 6분 후에 로다네제 활성은 중단된다.
로다네제는 티오설페이트 및 시아나이드로부터의 티오시아나이드(Rhodanid) 형성을 촉매화한다. 티오시아나이드는 질산철의 존재하에서 그의 레드 아이론(red iron) 복합체 형성에 의해 비색적으로(흡광도 450nm) 용이하게 검출된다. 150 ㎕의 질산철 시약(164.5 mM 질산철 및 9.2% v/v 질산) 첨가에 의해 로다네제 활성 측량(150 ㎕)을 전개시킨다. 로다네제 활성 측량을 96 웰 마이크로 플레이트중 A450nm에서 판독한다.
전형적인 로다네제 폴딩 반응은 로다네제 활성(즉, 폴딩된 로다네제)에서 기하급수적 기울기를 따르고, 시간이 흐름에 따라 최대 수율의 폴딩된 로다네제에 이른다. 일정량의 GroEL(40OnM) 및 로다네제(40OnM)에서는, GroEL(14mer)에 대한 동 몰농도의 Cpn10(7mer)가 도달할 때까지(즉, 400 nM), Cpn10의 양이 증가함에 따라 (로다네제 활성과 시간 사이의) 선형 관계가 관찰되었다. Cpn10의 농도가 400 nM 초과일 때 로다네제 활성의 증가는 신속하게 최대에 도달하였다. 검정법은 5개의 기준(이중으로)과 시험 샘플(이중으로)으로 구성되었다. Cpn10 기준의 농도는 0 nM, 140 nM, 250 nM, 280 nM 및 350 nM이었다. 시점 30, 45, 60, 75 및 90분으로부터의 로다네제 활성(즉, Cpn10 활성) 측량을 평균화하였다. 0 nM의 Cpn10 기준은 검정법의 배경 활성의 적합한 측량치로서의 역할을 하였고; 이로써, O nM Cpn10 기준의 흡광도 값을 다른 모든 계산된 흡광도 값(또는 활성치)로부터 감산하였다. 배경 보정 후, 280 nM Cpn10 기준에 대한 흡광도 값을 100% 활성으로서 지정하고, 다른 모든 흡광도 값을 100% 기준에 기초하여 상대 활성(%)로 전환하였다. 원외 데이타 점은 부본 측량 비교에 의해 제거하고, 부본간의 편차가 >30%인 것은 허용하지 않는 것으로 간주하였다. 허용가능한 데이타를 사용하여 5개의 기준 농도 0 nM Cpn10(0% 활성), 140 nM Cpn10(50% 활성), 250 nM Cpn10(89.3% 활성), 280 nM Cpn10(100% 활성) 및 350 nM Cpn10(125% 활성)를 갖는 선형 보정 곡선을 작성하였다. 로다네제 활성(즉, Cpn10 활성)을 Cpn10 농도에 대하여 플로팅하였다. 검정 편향을 보정하기 위해 선형 보정 곡선으로부터 작성된 방정식을 사용하여 시험 샘플로부터의 활성치(%)를 재계산하였다.
샤페로닌의 농도는 단백질의 올리고머 분자량(MW)을 사용하여 계산한 반면, 로다네제는 단량체 MW을 사용하여 계산하였다; 즉, E. 콜라이 GroEL 14 mer(SwissProt P06139) - 800,766.4 g/mol, 인간 Cpn10 7 mer(SwissProt Q04984) = 76,100.5 g/mol 및 소 로다네제 1 mer(SwisProt P00586) = 33,164.6 g/mol.
표 4는 배치 기반에 의한 배치식의 Cpn10 폴리펩티드의 재폴딩 활성으로서, Ala-Cpn10 활성의 백분율(%)로서 계산된 것을 나타낸다.
표 4: Cpn10 폴리펩티드의 재폴딩 활성
Figure 112008023336290-PCT00002
실시예 5 - E. 콜라이 GroES 는 LPS -매개 HIV - LTR 활성화를 저해하지 못한다.
재조합 E. 콜라이 GroES를 정제하였고, 본질적으로 내독소 오염은 0.14 EU/mg으로서 없는 것으로 나타났다(도 3K를 참조할 수 있음). 상기 기술된 바와 같이 정제된 GroES는 Ala-Cpn10과 병행하여 RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법에서 시험하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, GroES는 어느 시험 농도(25 - 100 ㎍/ml)에서도 HIV-LTR의 LPS 유도 활성화를 저해하지는 못했다. 이러한 결과는 Cpn10에 대하여 관찰된 면역조절 활성이 실제 상당한 생물학적 효과라는 점을 확인시켜 준다.
실시예 6 - 인간 Cpn10 돌연변이체의 작제
IML 23-25 의 부위-특이적 돌연변이체
Cpn10과 Cpn60 사이의 상호작용 강도를 변경시켜 이동성 루프 영역중 소수성 IML 부분(23번-25번 잔기)을 돌연변이화시켰다(표 1을 참조할 수 있음). Cpn60과의 상호작용을 교란시킬 것으로 예측되는 전하를 띤 트리펩티드 EEE로 IML을 대체하였다. 2개 모두가 소수성을 증가시킴으로써 잠재적으로 Cpn10과 Cpn60과의 상호작용을 강화시킬 것으로 예측되는 III 또는 IFI로 IML을 돌연변이화시켰다. Ala-Cpn10-EEE-cHis, Ala-Cpn10-IFI, Ala-Cpn10-III의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔은 도 3C, E 및 F에 제시한다. 표 1에 기재된 상보성인 프라이머 쌍을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 퀵 체인지 사이트-디렉티드 뮤타제네시스(Quick Change Site-Directed Mutagenesis)(Stratagene)에 의해 Ala-Cpn10-III, Ala-Cpn10-IFI 및 Ala-Cpn10-EEE-cHis를 생성하였다. Ala-Cpn10-III 및 Ala-Cpn10-IFI를 위해, Ala-Cpn10_pPL550 플라스미드를 DNA 주형으로서 사용하였다. Ala-Cpn10-EEE-cHis를 위해, Ala-Cpn10-cHis_p ET23 플라스미드를 DNA 주형으로서 사용하였다(하기를 참조할 수 있음).
Ala-Cpn10
Ala-Cpn10을 포함할 것으로 예측되는 아미노산 서열은 서열 번호 21에 기재되어 있다. Ala-Cpn10을 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 22)을 pPL550 플라스미드 내로 NcoI 및 EcoRI 부위에 삽입하였다[Somodevilla-Torres et al. 2003, Prot. Exp. Purif. 32: 276-287]. 배치 CH001 및 CH003으로 Ala-Cpn10의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3A 및 B에 제시한다.
Ala-Cpn10-cHis
Ala-Cpn10-cHis를 포함할 것으로 예측되는 아미노산 서열은 서열 번호 41에 기재되어 있다. Ala-Cpn10-cHis를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 42)은 종결 코돈이 없는 Ala-Cpn10 DNA 서열(서열 번호 22)을 pET23a 플라스미드(Novagen) 내로 NdeI 및 XhoI 부위에 삽입하여 제조하였다. 클로닝함으로써 C-말단 헥사히스티딘 태그가 Ala-Cpn10 상에 존재하도록 할 수 있다. Ala-Cpn10-cHis의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3D에 제시한다.
Ala-Cpn10-Δml
16개의 아미노산을 Cpn10의 이동성 루프 영역(서열 번호 12)으로부터 결실시켜 Ala-Cpn10-Δml(서열 번호 24)로 명시된 86개의 아미노산 변이체를 생성하였다. Ala-Cpn10-Δml을 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 25)을 pPL550 플라스미드 내로 NcoI 및 EcoRI 부위에 삽입하였다[Somodevilla-Torres et al., 2003, Prot Exp. Purif. 32: 276-287]. 이동성 루프는 Cpn10 폴리펩티드 쇄의 한가운데 위치하고 있기 때문에 N-말단 단편을 C-말단 단편과 연결시켜 확실히 헵타머가 적절히 폴딩되고 조립될 수 있도록 하기 위하여 이동성 루프의 2개의 잔기(어느쪽 종단이든 한 쪽)는 유지되었다.
Ala-Cpn10-Δml의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3G에 제시한다. Ala-Cpn10-Δml의 부분적인 글루타르알데히드 교차-결합은 염색된 4-12% SDS-PAGE 겔상에서 구별되는 7개의 밴드를 나타내고, 이는 분자의 헵타머 구조를 확인시켜 준다. PBS(pH 7.4)중 580 ㎍ 양의 Ala-Cpn10-Δml를 30분 동안 25℃에서 총량 300 ㎕중의 0.01% (w/w) 글루타르알데히드(APS)와 함께 인큐베이션시켰다. 15 ㎕의 2M 트리스-HCl(pH 8.0)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 100 ㎕ 분취량의 반응 혼합물을 0.5 ml/분의 유속으로 인산염 완충처리된 염수(PBS)중 수퍼덱스(Superdex) 200 HR 10/30(GE Biosciences) 크기 배제 칼럼 상에서 분해하였다. 비-가교-결합된 Cpn10 올리고머과 동일한 정체 시간에 용출된 피크를 2개의 0.5 ml 분획으로 수집한 후, SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 분석하였다.
Ala-Cpn10-Δ상부
7개의 아미노산을 β-헤어핀 영역(서열 번호 13)으로부터 결실시켜 Ala-Cpn10-Δ상부로 명시된 95개의 아미노산 변이체를 생성하였다. Ala-Cpn10-Δ상부를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 27)을 pPL550 플라스미드 내로 NcoI 및 EcoRI 부위에 삽입하였다[Somodevilla-Torres et al., 2003, Prot Exp. Purif. 32: 276-287]. Ala-Cpn10-Δ상부의 아미노산 서열은 서열 번호 26에 기재되어 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 27에 기재되어 있다. Ala-Cpn10-Δ상부의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3I에 제시한다.
Ala-Cpn10-β-배럴을 포함할 것으로 예측되는 Ala-Cpn10-β-배럴 아미노산 서열은 서열 번호 28에 기재되어 있다. Cpn10-β-배럴의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3D에 제시한다. Ala-Cpn10-β-배럴을 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 29)을 pPL550 플라스미드 내로 NcoI 및 EcoRI 부위에 삽입하였다[Somodevilla-Torres et al., 2003, Prot Exp. Purif. 32: 276-287]. Ala-Cpn10-β-배럴의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3J에 제시한다.
Gly-Cpn10
Gly-Cpn10을 포함할 것으로 예측되는 아미노산 서열은 서열 번호 30에 기재되어 있다. Gly-Cpn10을 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 31)을 pET30a 플라스미드 내로 삽입하였다. Gly-Cpn10의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3N에 제시한다.
X-Cpn10
X-Cpn10을 포함할 것으로 예측되는 아미노산 서열은 서열 번호 23에 기재되어 있다. X-Cpn10을 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 44)을 pPL550 플라스미드 내로 NcoI 및 EcoRI 부위에 삽입하였다[Somodevilla-Torres et al., 2003, Prot Exp. Purif. 32: 276-287]. X-Cpn10의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3M에 제시한다.
GroES
E. 콜라이 GroES(SwissProt P05380)을 포함할 것으로 예측되는 아미노산 서열은 서열 번호 11에 기재되어 있다. GroES를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 34)을 pET11a 플라스미드 내로 삽입하였다. GroES의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔 을 각각 도 3K에 제시한다.
Cpn10-NtermES
Cpn10-NtermES를 포함할 것으로 예측되는 아미노산 서열은 서열 번호 14에 기재되어 있다. 인간 X-Cpn10(서열 번호 23)의 잔기 1-AGQAFRKFL-9를 E. 콜라이 GroES(서열 번호 11)의 잔기 1-MNIR-4로 대체하여 Cpn10-NtermES 단백질을 제조하였다. Cpn10-NtermES를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열 번호 43)을 pET23a 플라스미드 내로 삽입하였다. Cpn10-NtermES의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔을 각각 도 3L에 제시한다.
실시예 7 - Cpn10의 IML 트리펩티드 돌연변이체의 활성
(Cpn60과의 상호작용에 중요하며, 이로써, 단백질 폴딩에도 중요한) 이동성 루프의 IML 트리펩티드의 돌연변이체를 생성하여 이동성 루프와 Cpn60과의 상호작용을 교란시키거나 강화시켰다(실시예 6을 참조할 수 있음).
EEE 이동성 루프 Ala-Cpn10 돌연변이체 단백질(Ala-Cpn10-EEE-cHis)은 시험관내 로다네제 재폴딩 과정 동안 Cpn10이 GroEL(E. 콜라이 Cpn60)과 작용할 수 있는 능력을 파괴하는 반면, III 및 IFI 돌연변이체는 활성인 상태로 남아있었다(표 3을 참조할 수 있음).
본 결과는, GroEL에 대한 Ala-Cpn10-EEE-cHis의 친화성이 실제로 현저히 감소되었음을 시사한다. 단백질 폴딩 검정법과는 대조적으로, RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법을 통해 트리펩티드 돌연변이체 모두(Ala-Cpn10-cHis 포함)가 TLR4 신호 전달을 조절할 수 있으며, 활성은 Ala-Cpn10과 유사하다는 것을 입증하였고, 이 는 이동성 루프(및 따라서, Cpn60)가 Cpn10의 이러한 면역조절 활성에는 중요치 않다는 것을 시사한다(도 4B, D, F 및 H를 참조할 수 있음).
실시예 8- Ala-Cpn10-Δml은 로다네제 재폴딩에서 GroEL과 협력하지 않는다
이동성 루프 영역(및 따라서, Cpn60)이 면역조절 활성을 위해 필요한지 여부를 확인하기 위하여 이동성 루프 영역(서열 번호 12)으로부터 16개의 아미노산을 결실시켜 Ala-Cpn10-Δml로 명시된 86개의 아미노산 변이체를 생성하였다(실시예 6을 참조할 수 있음). Ala-Cpn10-Δml의 아미노산 서열은 서열 번호 24에 기재되어 있다. Ala-Cpn10-Δml이 로다네제 재폴딩 과정에서 GroEL(E. 콜라이 Cpn60)과 생산적으로 작용할 수 있는 그의 작용에 대하여 시험하였다. 양성 대조군으로서, Ala-Cpn10이 동일한 검정법에 포함되었고, 결과 ~100%의 활성을 얻었다(표 3을 참조할 수 있음). Ala-Cpn10-Δml의 활성은 ~0% 활성으로 측정되었는데, 이는 상기가 GroEL과는 상호작용하지 않으며, 따라서, 단백질 폴딩 과정 동안 공-샤페론으로서 작용할 수 없음을 시사한다. Ala-Cpn10과 Ala-Cpn10-Δml 폴리펩티드 둘 다를 같은 몰농도에서 시험하였다.
실시예 9 - Ala-Cpn10-Δml은 HIV LTR의 LPS 유도 활성화를 저해한다:
RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법을 사용하여 Ala-Cpn10과 병행하여 Ala-Cpn10-Δml을 시험하였다. 이러한 검정법에서 루시퍼라제 리포터를 NFκB 신호 전달에 간접적으로 연결된다. NFκB는 LPS에 의해 유도되는 1차 전사 인자이다. 루시퍼라제 활성은 사용 수단에 따라 상대 광 유니트(RLU: relative light units) 또는 초당 계수(CPS: counts per second)로서 측정된다. 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같 이, Ala-Cpn10-Δml은 1 내지 100 ㎍/ml 사이의 농도에서 HIV-LTR의 LPS 유도 활성화를 저해하였다. 이는 단일 검정법이기는 하나, 분리된 마이크로타이터 플레이트 상에서 2회에 걸친 반복 실험을 하고, 동일한 활성을 입증하였다. 이러한 데이타 세트에서 Ala-Cpn10-Δml은 Ala-Cpn10과 비교하여 일관되게 보다 큰 저해 활성을 소지하는 것으로 보였다.
상기 실시예 8에 기술한 바와 같이, Ala-Cpn10-Δml은 로다네제 재폴딩 과정에서 GroEL에 대한 공-샤페론으로서 작용할 수 없었다. 그러나, LPS 존재하에서 RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법에 사용되었을 때에는 Ala-Cpn10-Δml 활성이 Ala-Cpn10 수준인 것으로 관찰되었다. 즉, Ala-Cpn10-Δml은 용량에 의존하여 HIV-LTR 리포터의 LPS 유도 활성화를 저해하였다. 이러한 결과는 TLR4 신호 전달을 조절할 수 있는 Cpn10의 능력에 Cpn60이 관여한다는 것을 명확하게 배제시킨다.
실시예 10- Ala-Cpn10-Δ상부는 HIV LTR의 LPS 유도 활성화를 저해한다:
Cpn10의 β-헤어핀 상부 루프 영역(도 1을 참조할 수 있음)은 포유동물에서 순 양전하를 함유하지만, 박테리아에서는 지배적으로 순 음전하를 함유한다(예를 들면, 대표적으로 E. 콜라이 GroES). 흥미롭게도, 박테리오파지 T4 또한, E. 콜라이 GroEL과 함께 작용하여 T4 주요 캡시드 단백질 Gp23을 폴딩하는 특정 Cpn10(Gp31)을 함유한다. GroES도 Cpn10도 이러한 작용을 이해할 수 없다. Gp31과 Cpn10/GroES 사이의 주요 차이점은 Gp31에 상부 β-헤어핀 루프가 전혀 없다는 점이고, 가능하게는 이러한 점이 Gp31의 특이한 작용과 능력의 원인이 될 수 있다[Hunt et al., 1997, Cell 90: 361- 371].
상부 β-헤어핀 영역이 Cpn10 면역조절 활성에 기여하는지 여부를 측정하기 위하여 7개의 아미노산을 β-헤어핀 영역(서열 번호 13)으로부터 결실시켜 Ala-Cpn10-Δ상부로 명시된 95개의 아미노산 변이체를 생성하였다(실시예 6을 참조할 수 있음). Ala-Cpn10-Δ상부의 아미노산 서열은 서열 번호 26에 기재되어 있다.
LPS 존재하에 RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법을 사용하여 Ala-Cpn10 및 E. 콜라이 GroES와 병행하여 Ala-Cpn10-Δ상부를 시험하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, Ala-Cpn10-Δ상부는 50 내지 100 ㎍/ml 사이의 농도에서 HIV-LTR의 LPS 유도 활성화를 저해하였다. 이는 단일 검정법이기는 하나, 분리된 마이크로타이터 플레이트 상에서 2회에 걸친 반복 실험을 하고, 동일한 활성을 입증하였다. 이러한 데이타 세트에서 Ala-Cpn10-Δ상부는 일관되게 Ala-Cpn10 활성의 ~80%를 소지하는 것으로 보였다. 이러한 결과는, 분자중 작용성 상부 β-헤어핀 영역의 부재하에서 Cpn10에 의해 TLR4 신호 전달이 조절될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 11 - Ala-Cpn10-β-배럴 돌연변이체는 면역조절 활성을 나타낸다
실시예 9 및 10에 기술된 상기 데이타에 대한 확인으로서, 본 발명자들은 이동성 루프와 β-헤어핀 상부 루프 둘 다가 없는 인간 Ala-Cpn10 돌연변이체("Ala-Cpn10-β-배럴"로 명명됨; 서열 번호 28; 실시예 6을 참조할 수 있음)를 생성하였다. 흥미롭게도, Ala-Cpn10-β-배럴 돌연변이체는 Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-Δml 돌연변이체과 비교할 때 겔 여과 크로마토그래피상에서 조금 더 큰 실체로서 이동한다. 이는 단단히 결합된 구조로 서브유니트를 유지하는데 상부가 도움이 된다는 것을 암시할 수 있다. 비교하면, 헵타머가 분해된 단량체보다 강력하게 보다 바람직 하지만; 이동성 루프는 헵타머를 불안정화시킴으로써 보다 효과적으로 분해될 수 있도록 한다.
LPS1의 존재하에 RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법을 사용하여 Ala-Cpn10 및 E. 콜라이 GroES와 병행하여 Ala-Cpn10-β-배럴 폴리펩티드를 시험하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 이러한 돌연변이체는 TLR4 신호 전달을 조절할 때 Ala-Cpn10 활성의 대략 50%를 나타내었고, 이는 면역조절 활성이 부분적으로는 β-헤어핀 상부 루프 때문일 수 있거나, 헵타머의 안정성 때문일 수 있다는 것을 제안한다. 나타낸 결과는 2개의 독립된 실험을 반영한다.
실시예 12- N-말단 Cpn10 돌연변이체의 면역조절 활성
Cpn10 N-말단은 미토콘드리아 기질을 표적하는 것을 돕는 것으로 알려져 있다(세포질에서의 합성 이후). 그러나, 대부분의 미토콘드리아 기질 단백질이 절단가능한 N-말단 표적 서열을 갖고 있는 반면, Cpn10 N-말단은 절단되지 않고, 이는 추가의 작용을 가질 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 인간 Cpn10의 N-말단 돌연변이체가 시험관내에서 면역 반응성을 조절할 수 있는 능력에 대하여 조사하였다. 시험된 돌연변이체(본원에서 "Cpn10-NtermES"로서 지칭됨)는 인간 N-말단 서열 "MAGQAFRKFL" 대신 E. 콜라이 GroES로부터의 N-말단 서열 "MNIR"을 갖고 있다. Cpn10-NtermES의 아미노산 서열을 서열 번호 14에 제공한다.
Cpn10-NtermES는 샤페론 매개 로다네제 재폴딩에서 Ala-Cpn10 활성의 오직 ~12%만을 나타내었다(GroEL과 함께; 표 3을 참조할 수 있음). 그러나, 겔 여과 크 로마토그래피를 통해 Cpn10-NtermES가 GraEL(Cpn60) 결합을 위한 본래의 이동성 루프를 갖는 헵타머라는 것을 확인하였다(데이타는 나타내지 않음).
도 8A 및 8B에 나타낸 바와 같이, Cpn10-NtermES 돌연변이체는 Ala-Cpn10으로 관찰되는 활성과는 대조적으로 HIV-TLR의 LPS 유도 활성화를 면역조절할 수 있는 능력을 상실하였다. 이는 Cpn10의 N-말단이 TLR4을 포함하는 Cpn10 면역조절 활성에 필요하다는 것을 시사한다. 그러므로, E. 콜라이(GroES)와 같은 ES-Nterm-Cpn10은 LPS에 의해 유도되는 NF-κB(즉, TLR4 조절)을 억제시킬 수 없었다(도 8B를 참조할 수 있음).
실시예 13 - HIV LTR의 LPS 유도 활성화를 저해할 수 있는 X-Cpn10의 능력의 감소
RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법을 사용하여 Ala-Cpn10과 병행하여 X-Cpn10 시험하였다. 실시에 6에서 논의된 바와 같이, X-Cpn10에는 본래의 인간 Cpn10에 존재하는 가외 N 말단 알라닌 잔기 및 아세틸기가 없다. 이러한 검정법에서 루시퍼라제 리포터를 NFκB 신호 전달에 간접적으로 연결된다. NFκB는 LPS에 의해 유도되는 1차 전사 인자이다. 루시퍼라제 활성은 사용 수단에 따라 상대 광 유니트(RLU) 또는 초당 계수(CPS)로서 측정된다. 도 9A 및 9B에 나타낸 바와 같이, X-Cpn10은 HIV-LTR의 LPS 유도 활성화를 저해하였다(Ala- 또는 Gly-Cpn10 활성의 대략 50%). 이러한 데이타 세트에서 Cpn10의 말단상의 추가의 잔기, 예로서, 알라닌이 TLR4 신호 전달의 면역조절 활성에 기여할 수 있는 것으로 보인다.
실시예 14 - Gly-Cpn10이 HIV-LTR의 LPS 유도 활성화를 저해한다
RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법을 사용하여 Ala-Cpn10과 병행하여 Gly-Cpn10을 시험하였다. 실시예 6에서 논의된 바와 같이, Gly-Cpn10은 Ala-Cpn10의 가외 N 말단 알라닌 잔기를 대체하는 글리신 잔기를 함유한다. NFκB는 LPS에 의해 유도되는 1차 전사 인자이다. 루시퍼라제 활성은 사용 수단에 따라 상대 광 유니트(RLU) 또는 초당 계수(CPS)로서 측정된다. 도 10A 및 10B에 나타낸 바와 같이, Gly-Cpn10은 Ala-Cpn10보다 더욱 크게 HIV-LTR의 LPS 유도 활성화를 저해하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 구조적으로 아세틸기는 알라닌 잔기보다는 글리신 잔기와 더 유사한다. 그러므로, 아세틸-Cpn10 폴리펩티드(즉, 본래의 Cpn10)의활성은 Gly-Cpn10과 유사하다고 사료된다.
실시예 15 - RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법에서 초 순도 LPS 의 사용
상기 언급된 RAW264.7-HIV-LTR-LUC 저해 검정법에서 조 LPS를 사용함으로써 도 5-7 및 10에 나타낸 바와 같은 데이타를 작성하였다. 도 11 내지 14에서, TLR4에 특이적인 초 순도 LPS를 사용하였다. 도 11(Ala-Cpn10 Δml), 12(Ala-Cpn10-Δ상부), 13(Ala-Cpn10-β-배럴) 및 14(Gly-Cpn10)로부터의 결과는 도 5-7 및 10에에 나타낸 그들의 대조물과 매우 유사한다. 이는 본원에서 Cpn10의 면역조절 활성을 생성하기 위하여 사용되고 개시된 검정법이 TLR4에 대하여 특이적이라는 것을 나타낸다.
실시예 16 - 마우스 내독혈증 연구
마우스 패혈증 모델을 사용하여 다양한 Cpn10 폴리펩티드(즉, Ala-Cpn10-Δml, Ala-Cpn10-Δ상부, 및 X-Cpn10)의 시험관내 면역조절 활성이 생체내 활성을 반 영하는지 여부를 측정하기 위하여 마우스 내독혈증 연구에 착수하였다.
추정되는 Cpn10 분자의 활성 영역을 계통적으로 변화시키거나 결실시킴으로써, 또는 다수의 생물계로부터 유래된 Cpn10 상동체를 시험함으로써 최적의 활성을 위해 필요한, 최소의 구조 영역 및/또는 서열-기반 모티프를 기술할 수 있고, 이로써 최종적으로는 치료용으로서 효능이 더욱 뛰어난 분자를 디자인할 수 있는 능력에 이르게 된다. 현재까지, 면역조절 활성에 대한 이들 영역의 중요성을 조사하기 위하여 Cpn10에서 여러가지로 변이화하거나 돌연변이화하였다(도 1을 참조할 수 있음).
이러한 시험관내 연구로부터, Cpn10의 이동성 루프 또는 상부 루프 영역이 결실된 작제물(즉, 각각 Ala-Cpn10-Δml 및 Ala-Cpn10-Δ상부)이 LPS로 TLR4를 결찰시키는 반응에 있어서 NFκB 활성화를 감소시킨다는 점에서 Ala-Cpn10과 비교할 때 상당한 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이에 반해서, 이러한 시험관내의 활성 평가를 사용함으로써 비-아세틸화된 Cpn10(X-Cpn10)은 NFκB 활성을 하향-조절할 수 있는 능력이 현저히 감소된 것으로 나타났다. 생체 염증 모델(즉, 내독혈증)에서 본 연구에서 다수의 Cpn10 변이체는 Ala-Cpn10과 유사한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 마우스 내독혈증 모델은 Cpn10이 LPS 유도 염증 사이토카인 생산을 감소시킬 수 있는 능력을 평가한다.
실시예 16a - 마우스 내독혈증 연구에 대한 물질 및 방법
마우스 내독혈증 연구에서 사용되는 하기의 물질 및 방법은 실시예 17a(1) 내지 17(a)2에 기술한다.
실시예 16a(1) - 내독혈증 연구에 사용된 마우스
84마리의 암컷 Balb/c 마우스에서 연구를 수행하였다. 모두 성체였고(>9 주령, 평균 체중 ~20g (0.02kg)), 12군으로 나누었는데, 각 군당 7마리를 포함하였다(표 5를 참조할 수 있다). 마우스를 12/12 명/암 주기로 하우징하고, 일반 실험실용 사료(호주 글렌 포레스트에 소재하는 Specialty Feeds) 및 식용 급수에 접근할 수 있었다. 주사하기 전, 각 마우스의 체중을 측정하였다. 각 군들은 하기 나타낸 바와 같이 정맥(IV) 경로를 통해 꼬리 정맥으로 하기의 주사량을 받았다(표 5를 참조할 수 있음).
실시예 16a(2) - 마우스 내독혈증 연구를 위한 약물/용액
마우스 내독혈증 연구에서 사용된 약물/용액은 하기와 같다((A) 내지 (H)로 열거함).
(A) 단백질 제제 완충제 (FB)-: 이러한 완충제는 본 연구에서 음성 대조군이며, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.6) + 15O mM NaCl(<0.02 EU/ml)을 포함한다. 이러한 완충제는 시험 항목으로서 사용하고자 하였고, 희석제는 양성 대조군 및 시험용 샘플로 사용하고자 하였다.
(B) Ala-Cpn10: 이러한 Cpn10 폴리펩티드는 본 연구에서 양성 대조군이며, 스톡의 농도는 5 mg/ml(<0.01 EU/mg)이다. 400 ㎕의 단백질 용액을 1.6 ml의 제제 완충제에 희석시켜 1mg/ml의 실험용 용액을 제조하였다.
(C) Ala-Cpn10-Δml: 이러한 Cpn10 폴리펩티드의 스톡 농도는 3.5mg/ml(<0.03 EU/mg)이다. 571 ㎕의 단백질 용액을 1.429 ml의 제제 완충제에 희 석시켜 1mg/ml의 실험용 용액을 제조하였다.
(D) Ala-Cpn10-Δ상부: 이러한 Cpn10 폴리펩티드의 스톡 농도는 4.2 mg/ml(<0.1 EU/mg)이다. 477 ㎕의 단백질 용액을 1.523 ml의 제제 완충제에 희석시켜 1mg/ml의 실험용 용액을 제조하였다.
(F) X-Cpn10: 이러한 Cpn10 폴리펩티드의 스톡 농도는 5 mg/ml(<0.04 EU/mg)이다. 400 ㎕의 단백질 용액을 1.6 ml의 제제 완충제에 희석시켜 1mg/ml의 실험용 용액을 제조하였다.
(G) 내독소: 지질다당질(LPS)을 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company)(카탈로그 번호 L6529)로부터 입수하였다. 사용 직전에, 바이알의 내용물 (1 mg)을 1ml 멸균 염수에서 재구성하였다. 각 군에 주사하기 전에 내용물을 추가로 멸균 염수에 100 ㎍/ml로 희석(1/10)하였다.
(H) 내독소 대조군: 900 mg/mL(0.9%) (<0.01 EU/ml) 농도의 주사용 멸균 염수는 호주에 소재하는 화이자(카탈로그 번호 DW-SC0010)로부터 입수하였다.
실시예 16b - 마우스 내독혈증 연구를 위한 약물 투여 및 채혈
상이한 마우스 군에 약물 투여하기 위한 프로토콜은 표 5(하기를 참조할 수 있음)에 나타낸 바와 같다. 의식이 있는, 감금되어진 마우스에 100 ㎕의 용량으로 꼬리 정맥에 주사함으로서 모든 투여를 수행하였다. 모든 LPS의 투여량은 10 ㎍/마우스였다. 모드 Cpn10 변이체는 100 ㎍/마우스(100㎕의 용량)으로 주사하였다.
채혈을 위한 프로토콜은 하기 표 5에 요약한다. 할로세인 마취제(영국 메이클즈필드에 소재하는 Zeneca Ltd.)(SOP ET-011)하에 심장 천자를 통해, 또는 사후 개방 심장 채혈을 통해 혈액 샘플을 수집하였다. 항응고제를 포함하지 않는(응고 활성화제 포함) 소아 혈청 튜브(미국에 소재하는 Greiner-bio-one, 카탈로그 번호 450401)로 혈액을 수집하였다. 실온에서 5분간 12000 rpm으로 원심분리(Biofuge 13, Heraeus Instruments)하기 전에 샘플을 대략 5분간 실온에 방치하여 응고가 잘 일어나도록 하였다. 혈청을 새 튜브로 옮기고, 드라이아이스상에서 운송하기 전에 -20℃에 놓았다. 모든 약물 투여 및 채혈 시간을 임상 기록 시트(Form IMVS 2061/A)상에 기록하였다. 실험 전과정 동안 일반적인 병태를 모니터하기 위하여 동일한 기록 시트를 사용하였다.
표 5. Cpn10 내독혈증 연구에 대한 프로토콜
Figure 112008023336290-PCT00003
실시예 16c - 세포측정 비드 검정법(CBA: Cytometric Bead Array ) 분석
염증 관련 사이토카인(즉, TNFα, IL6, IL-10, MCP-1, IL12p70, IFN-γ)의 수준에 있어서의 변화를 평가하기 위하여 혈청 샘플상에서 마우스 염증 CBA 분석(카탈로그 번호 552364, BD Biosdences)을 실시하였다. 적절하게(LPS 처리군 5개중 하나, 및 염수 대조군 2개중 하나) 검정 희석제중에서 분석하기 전에 LPS-시험감염된 마우스(표 5, 1군, 3군, 5군, 7군, 9군 및 11군) 또는 염수 대조군 마우스(표 5, 2군, 4군, 6군, 8군, 10군 및 12군)로부터 유래된 혈청을 희석하였다. CBA 소프트웨어를 포함하는 BD FACS-검정 기기를 사용하여 제조사의 설명에 따라 각 샘플을 2중으로 분석하였다.
실시예 16d - 사이토카인 수준 감소율(%) 측정
Cpn10이 LPS 시험감염된 마우스에 미치는 효과를 측정하기 위하여 하기 식을 사용하였다. 사전-처리되지 않은 마우스(즉, 대조군)와 비교하여, Cpn10 변이체로 사전-처리된 마우스(즉, 실험군)에서 LPS 유도 사이토카인의 감소율(%)은 하기 식에 따라 산출하였다: 감소율(%) = 100 -(실험군의 평균 사이토카인 수준/대조군의 평균 사이토카인) x 100]
실시예 16e - ELISA 분석
CBA 분석을 확인하기 위하여 제조사의 설명에 따라 RnD 시스템 튜오세트 ELISA 키트(카탈로그 번호 DY41G)를 사용함으로써 마우스 TNF-α ELISA를 수행하였다. 희석제로서 PBS + 10% FCS를 사용하여 샘플(3개의 희석액중 하나) 및 기준을 희석하였다. 샘플은 2중으로 분석하였다.
실시예 16f - 임상적 관찰
LPS 또는 염수 주사 후 90분 동안, 및 심장 천자를 통한 채혈 전 90분 동안에 표 5에 기술된 다양한 마우스 군의 행동을 조사하였다. 모든 관찰 사항을 기록하고, 표 6에 요약하였다. LPS/염수 주사후 즉시, 및 심장 천자(C.P.: Cardiac Puncture)를 통한 마우스 채혈 직전에 관찰하였다. 1군, 2군, 또는 3군에 대하여 임상적인 관찰 사항을 비교하였다. 일반적으로, LPS만으로 처리된 마우스(1군)는 주사 후 15분 이내에 LPS 유도 패혈증 효과를 나타내었다. LPS-처리된 마우스는 운동성이 감소하였고, 자극(예컨대, 소음 또는 접촉)에 대한 반응도 저하된 것이 입증되었다. LPS 시험감염에 기인한 몇몇의 전형적인 부작용, 예로서, 설사 또는 주름진 백태는 본 연구의 어느 마우스에서도 관찰되지 않았다. 이는 금번에 사용된 LPS 로트 번호의 상대적인 효능을 반영할 수 있다. 염수 처리된 대조군 마우스 (2군)은 자극에 대해서는 더 반응성을 띠었고, 일반적인 반응과 운동성을 나타내었다.
Cpn10 및 다양한 Cpn10 돌연변이체로 사전-처리된 마우스는 비처리된 LPS 대조군과 비교하여, LPS 시험감염에 대한 반응에서 약간 다른 행동을 나타내었다. Ala-Cpn10 및 Ala-Cpn10-Δ상부로 사전-처리된 마우스(3군 및 7군)는 자극에 대하여 덜 완화되고, 조금 더 각성적이고, 반응성인 것으로 나타났지만, 대부분의 관찰 기간 동안에는 계속하여 무리지어 있었다. 흥미롭게도, Ala-Cpn10-Δml로 사전-처리된 마우스(5군)는 약간 더 활성적이었지만, 전 관찰 기간 내내로 무리지어 있지는 않았다. 아세틸-Cpn10로 사전-처리된 마우스(9군)에서의 LPS 시험감염 효과 또한 다른 군들에서 관찰된 것과는 상이하게 나타났다. LPS 주사 후 최초 30-45분 동안에 이들 마우스는 3군과 유사한 행동을 나타냈지만, 이들 마우스는 관찰 기간의 종결 무렵에는 회복되는 것으로 보였고, 운동성과 각성도가 증가한 것으로 나타났다. 대조적으로, X-Cpn10으로 사전-처리된 마우스는 1군과 매우 유사한 행동을 보 였다. 이들 마우스는 아주 매우 비활성 상태이고, 자극에 대하여 반응성이 덜하며, 대부분의 관찰 기간 동안 무리지어 있었다. 각 Cpn10 돌연변이체군(즉, 4군, 6군, 8군, 10군 및 12군)에 대한 염수 대조군에는 비처리된 염수군(2군)내 대조군 동물과 유사한 임상적 부작용이 존재하지 않는다는 것이 입증되었다.
LPS로 시험감염된 마우스가 일반적으로는 저혈압(패혈증-관련 증상)이기 때문에 이러한 마우스의 채혈은 전형적으로 더욱 문제가 된다. 이러한 마우스에서의 심장 천자 채혈은, LPS를 받지 않은 마우스와 비교할 때 보다 느리고, 회수되는 혈류량도 보다 적었다. 직접적인 심장 천자에 의해 채혈될 수 없는 마우스의 경우, 사후 개방 심장 채혈을 실시하였다. Cpn10 처리군이 LPS 처리된 마우스에서의 혈액 회수에 영향을 주거나 개선시키거나 하지는 않는 것으로 나타났다. 그러나, LPS 대조군 동물과 비교하여 Cpn10 처리된 마우스로부터의 혈액이 일반적으로는 개방 심장 채혈의 도움없이도 직접적인 심장 천자에 의해 회수될 수 있다는 것이 고려되었다. 본 연구에서는 각 마우스로부터 400 ㎕ 이상의 혈액을 회수하였다. 정상적인 채혈및 회수로부터의 모든 편차도 관련된 임상 기록 시트에 기록하였다.
표 6. LPS/염수로 주사한 후의, 다양한 Cpn10으로 사전-처리된 마우스에서의 임상적인 관찰
처리군 번호 행동 임상적 징후
1. FB + LPS 비활성, 자극에 대한 무반응, 무리지어 있음 설사 또는 주름진 백태를 나타내지 않음 채혈이 저속화되거나/어려움
2. FB + 염수 활성 및 각성, 자극에 대한 반응 정상적인 채혈
3. Ala-Cpn10 + LPS 활성 감소, 자극에 대한 반응 감소, 무리지어 있음 정상적인 채혈
4. Ala-Cpn10 + 염수 활성 및 각성, 자극에 대한 반응 정상적인 채혈
5. Ala-Cpn10-Δml + LPS 활성 감소, 자극에 대한 반응 감소, 무리지어 있음이 감소 정상적인 채혈
6. Ala-Cpn10-Δml + 염수 활성 및 각성, 자극에 대한 반응 정상적인 채혈
7. Ala-Cpn10-Δ상부 + LPS 활성 감소, 자극에 대한 반응 감소, 무리지어 있음 일부는 채혈이 어려움
8. Ala-Cpn10-Δ상부 + 염수 활성 및 각성, 자극에 대한 반응 정상적인 채혈
11. X-Cpn10 + LPS 비활성, 자극에 대한 반응 감소, 무리지어 있음 설사 또는 주름진 백태를 나타내지 않음 채혈이 저속화되거나/어려움
12. X-Cpn10 + 염수 활성 및 각성, 자극에 대한 반응 정상적인 채혈
실시예 16g - 마우스에서 사이토카인의 감소
LPS-시험감염된 마우스에서 TNF-α, IL-6 및 IL-10 사이토카인의 평균 수준(도 15를 참조할 수 있음)을 나타낸다. Cpn10으로 처리되지 않은 동물과 비교하여 향염증성 사이토카인의 감소에 있어 통계학적 유의수준을 입증하는 Cpn10-처리군을 별표로 표시한다. 사전-처리되지 않은 마우스와 비교하여 다양한 Cpn10으로 사전-처리된 마우스에서 분석된 다양한 사이토카인의 감소율(%)(표 5에 나타냄)은 괄호로 표시한다.
표 7. 다양한 Cpn10 돌연변이체로 처리된 LPS-시험감염된 마우스에서 LPS 유도 향염증성 사이토카인의 평균 및 감소율(%)
Figure 112008023336290-PCT00004
혈청 사이토카인 수준에 대한 CBA 분석
순환 향염증성 사이토카인 검출을 위한 BD 마우스 염증 CBA 검정법을 사용하여 각 마우스로부터의 혈청 샘플을 분석하였다. 검정법은 시험 샘플내의 TNFα1, IL-6, IL-10, IL-12p70, MCP-1 및 IFN-γ 사이토카인을 검출한다. 검정 한계 내에서 최적의 검출을 위해 일련으로 희석된(실시예 16a를 참조할 수 있음) 샘플상에서 분석을 실시하였다. 모든 샘플은 2중으로 분석하였다.
대조군 대 Cpn10-처리된 동물에서 이러한 마우스 패혈증 모델의 염증에 대한 지표로서 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 상대적인 발현을 조사하였다. 이러한 내독혈증 연구 시간 틀 내에서(90분 LPS 투여), IFNγ, MCP-1 및 IL-12p70 사이토카인의 수준은 일반적으로 이러한 검정법의 검출 한계 밖에 있고, 그러므로, 본원에서 데이타는 제시하지 않는다. 그 자체로서, 이들 사이토카인은 이러한 연구에서 조사하지 않았다. CBA 결과를 분석하기 앞서, 본 발명자들은 복사본 간의 일관성에 기초하여 데이타의 강인성을 평가하고, 표준 곡선의 선형 범위에 관하여 어느 데이타 점에서 하락하는지를 평가하였다. 극단 이상점은 분석에서 배제시켰다.
본 연구의 다양한 마우스군에서의 순환 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 절대치와 평균을 도 15에 나타낸다. 예측된 바와 같이, TNF-α, IL-6 and IL-10 사이토카인의 평균 수준은 염수 대조군과 비교하여, LPS로 시험감염된 마우스로부터 유래된 혈청에서 더욱 높았다(각각, 도 15A, C, E vs B, E, F). 이는 본 연구에서 사용된 LPS 양이 염증 반응을 유도하였고, 이들 사이토카인의 배경 수준은 이들 마우스에서 충분히 낮았다는 것을 시사한다. 몇몇 염수 대조군 샘플에서(도 15 F, 'X-Cpn10 + 염수'), 검출된 IL-10 수준은 LPS-시험감염된 대조군(즉, 1군 - 'FB + LPS')에서 검출된 것만큼 높았다. 이들 샘플을 보다 농축된 형태로 분석하고, 이로써, 내인성 혈청 인자가 검정법의 판독을 방해할 수 있고, 이것이 데이타 오류의 원인이 될 수 있다. 또한, 비-Cpn10 사전-처리된 마우스와 비교하여, 임의의 Cpn10 단백질로 사전-처리되었을 때, LPS로 시험감염된 마우스는 혈청 TNF-α, IL-6 및 IL-10 사이토카인을 감소시켰다는 것이 데이타를 통해 제시된다(각각, 도 15A, C 및 E). 각 사이토카인 프로파일을 위해 1-원 ANOVA 분석(터키의 사후검정 시험 포함)을 실시하였다. 다양한 군에서 IL-10 사이토카인 수준을 제외한, TNF-α 및 IL-6 수준의 평균중 몇몇은 통계학적으로 상이하다는 것이 분석을 통해 밝혀졌다(도 15A, C 및 E). 플롯 상에 제시된 평균 사이토카인의 수준이 뚜렷이 감소하였음에도 불구하고, IL-10 사이토카인 수준에 있어서 통계학적 차이가 부족하다는 것은 오직 대조군에서만 큰 IL-10 사이토카인 변이가 존재하기 때문이다(도 15E, 'FB + LPS'). 보다 큰 샘플링 군집이 추가 연구를 위한 이들 관찰상의 통계학적 차이를 개선시킬 수 있을 것이다.
터키의 사후검정 시험은, Ala-Cpn10-Δ상부 또는 X-Cpn10으로 사전-처리된 군(즉, 7군 및 11군)에서의 평균 TNF-α 및 IL-6 사이토카인 수준이 비처리군(즉, 1군)과 비교하여 통계학적으로 더 낮은 것으로 사료됨을 나타내었다(표 7). 그러나, 일부 군에서 향염증성 사이토카인의 통계학적으로 유의적인 감소(비처리군과 비교하여)는 사이토카인 프로파일중 오직 하나에서만 관찰되었다. 예를 들면, Ala-Cpn10-Δml 사전-처리군은 비처리군 및 역으로 Ala-Cpn10과 비교하여, IL-6 사이토카인 수준을 제외한 평균 TNF-α를 감소시켰다(표 7). 추가로, 서로서로와 비교하여 Cpn10 변이체 사전-처리군의 평균 사이토카인 수준이 상이하다는 것은 통계학적 분석을 통해서 발견하지 못했다.
Cpn10 변이체 사전-처리군중 오직 일부에서만 통계학적으로 유의적인 감소를 나타내었음에도 불구하고, 전반적인 성향은 Cpn10 변이체 모두가 LPS-시험감염된 마우스에서 염증 관련 사이토카인을 감소시킨 것으로 나타났다. 전반적으로, 이들 마우스에서 대략 30 내지 50%가 감소된 것으로 관찰되었다(표 7).
논의 및 결론
이러한 연구는 다양한 Cpn10 폴리펩티드(즉, Ala-Cpn10, Ala-Cpn10-Δml, Ala-Cpn10-Δ상부, 및 X-Cpn10)로 마우스를 사전-처리하는 것이 LPS 유도 내독혈증의 임상적인 효과를 감소시킨다고 나타내었다. LPS 만을 받은 마우스는 전형적인 내독혈증 증상(즉, 활성, 반응성 및 각성도의 감소)을 보였다. 이에 반해, 임의의 Cpn10 단백질로 사전-처리된 마우스는 LPS 시험감염에 의해 영향을 덜 받은 것으로 보였다(즉, 자극에 대하여 반응성이 더욱 크고, 이동성이 컸다)(표 6).
염증 관련 사이토카인에 대한 CBA 분석은, LPS 주사 이전에 모든 Cpn10 변이체로 사전-처리되 마우스의 혈청에서는 LPS 만을 받은 마우스의 혈청과 비교하여 TNF-α, IL-6 및 IL-10 사이토카인 수준이 감소된 것으로 나타내었다. 예측된 바와 같이, Ala-Cpn10으로 사전-처리되 마우스에서는 TNF-α 및 L-6 사이토카인 수준이 감소된 것으로 나타났는데, 이는 본 발명자의 이전 결과와 일치하는 것이다[Johnson et al, 2005]. 현 결과는 Ala-Cpn10이 모든 TLR 효현제에 대한 반응으로 IL-10 생산을 감소시킬 수 있다는 것을 제안한다. 본 발명자들은 다수의 Cpn10 변이체로 사전-처리된 마우스에서 이들 염증 관련 사이토카인의 수준이 유사하게 감소되었음을 입증하였다(표 7). 비처리군과 비교하여 Cpn10 변이체 사전-처리군중 일부에서 TNF-α 및 IL-6 사이토카인 수준의 감소는 다만 현저하다고 통계학적 분석을 통해 나타났지만(도 15A&C, 표 7), 전반적인 성향은 본 연구에서 사용된 Cpn10 단백질 모두가 LPS-염증 반응을 하향 조절하는 것으로 나타났다.
생체내 내독혈증 결과를 통해 연구된 모든 Cpn10 폴리펩티드(즉, Ala-Cpn10, Ala-Cpn10-Δml, Ala-Cpn10-Δ상부, 및 X-Cpn10)가 Ala-Cpn10과 유사한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 Cpn10의 이동성 루프 또는 상부 루프 영역이 TLR4-LPS 결찰에 대한 반응을 조절하는데 반드시 필요한 것은 아니라는 것을 재확인시켜준다. X-Cpn10의 시험관내 활성에서 관찰된 변이는, Cpn10 변이체 사전-처리군들 사이의 평균 사이토카인 수준이 통계학적으로 상이하지 않기 때문에 내독혈증 연구에서는 평가될 수 있다.
실시예 17 - E. 콜라이 배치 발효로부터의 Cpn10 정제
Cpn10 폴리펩티드를 생산하기 위하여 바이오공정이 개발되었다. 하기에서 입증되는 바와 같이, >99%의 순도, ≤0.03 EU mg-1의 내독소 및 ≤155.3 pg mg-1의 DNA로, 100 ℓ의 E. 콜라이 발효로부터 ~20 g의 재조합 인간 Cpn10을 생산하는데에는 본 공정이 성공적으로 사용되었다. 본 공정은 하기에 요약한다.
발효
AlaCpn10_pPL550 플라스미드를 포함하는 E. 콜라이 균주 XL1-블루를 함유하는 바이알을 마스터 세포 은행(상기 '일반 방법"을 참조할 수 있음)으로부터 검색하고, 30℃에서 밤새도록 항생제로 보충되지 않은 대두 브로쓰(Soya Broth)에서 '사전-배양'하였다. 이어서, 상기 배지 및 성장 온도 파라미터를 유지하는 100 ℓ의 생체반응기에 접종 배양물을 준비하였다. 어떤 동물-유래 산물(호주 SA에 소재하는 BresaGen)도 함유하지 않고, 항생제도 보충되어 있지 않은, 대두-기반의 펩톤이 풍부한 최소 배지중 100 ℓ의 생체반응기내로 접종물의 분취량을 분배하였다. 생체반응기 배양에서는 배치 공급할 필요가 없고, 온도는 성장기 동안 30 ± 0.1℃로 유지시켰다. 암모니아를 첨가하여 pH를 7.0 ± 0.2로 유지시켰다. OD600 = 10에서 42℃로 온도를 변위시키고, 42 ± 0.1℃에서 3시간 동안 추가로 인큐베이션시켰는데, 상기 시간에 발효는 OD600 = 20-25 사이에 도달하였다.
세포 용해 및 가용성 용해물의 제조
박테리아 세포(~3.5 kg 습식 중량)를 원심분리(5,000 x g)에 의해 펠릿화하고, 25 mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 재현탁시키고, 발효가 종결되는 3시간 이내에 7000 psi(미국에 소재하는 APV)로 APV 가울린 모델 30CD(APV Gaulin Model 30CD) 압력 균질기를 통해 3회에 걸쳐 계대접종함으로써 용해시켰다. 유동식 웨스트팔리아(Westfalia) MSB-7 원심분리기를 사용하여 세포 파편을 펠릿화한 후, 박테리아 용해물에 함유되어 있는 가용성 Cpn10을 수거하였다. 대략 20 ℓ의 정화된 용해물을 4℃에서 밤새도록 저장하였다.
Cpn10 정제
빅 비드 설포프로필-세파로스(BBSP: Big Bead Sulfopropyl-Sepharose) 양이온 교환, Q-세파로스 고유속(QFF: Q-Sepharose Fast Flow) 음이온 교환 및 고성능 세파로스 SP(HPSP: High Performance Sepharose SP) 양이온 교환 크로마토그래피를 통합한, 3-단계 하류 공정이 개발되었다. K-프라임 40-II 바이오공정 유니트(Millipore)를 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다.
크로마토그래피 칼럼, 용기 및 완충제의 발열물질 제거( de - pyrogenation )
1 M NaOH로 세척하여 모든 이온-교환 크로마토그래피 칼럼에서 발열물질을 제거하고, 용출물이 특정 완충제의 pH와 전도도로 회복될 때까지 완충제로 평형화시켰다. 다양한 정제 단계에서 완충제 저장 및 칼럼 용출물 수령에 사용된 모든 용기에 발열물질이 함유되어 있지 않았다. 정제에 사용된 모든 완충제는 주사용수(WFI: Water For Injection)를 사용하여 생산하였다.
빅 비드 설포프로필-세파로스 크로마토그래피
용해물을 25 mM 트리스-HCl, pH 8.0(완충제 A)으로 사전-평형화된 BBSP 양이온 교환 칼럼(8.6 ℓ의 BBSP SP-세파로스 수지를 포함하는 BPG 300/500, GE Biosciences)상에 20-40분에 걸쳐서 75 cm hr-1의 선형 유속으로, 그리고, 수지 1 ℓ당 10 g이하의 Cpn10의 로딩율로 로딩하였다. 완충제 A로 세척한 후, 150 mM NaCl을 함유하는 완충제 A로 포획된 Cpn10을 용출시키고, 1 ℓ의 분획을 수집하였다. SDS-PAGE 분석을 통해 BBSP 풀이 >95% 순수한 것으로 나타났다.
Q-세파로스 고유속 크로마토그래피
실온에서 15 용량의 완충제 A 2개의 변경에 대하여 BBSP 용출물을 탈염시켰다. 첫번째 투석 단계를 2-3시간 동안 실시한 후, 새로운 완충제 A 탱크로 옮겨 밤새도록 연속하여 투석시켰다. 보정된 기준에 대한 투석액의 전도도(Cyberscan 100, 싱가폴에 소재하는 Eutech Instruments)를 측정함으로써 투석백으로부터 탱크 완충제로의 NaCl 재분포를 모니터하였다. 투석된 BBSP 풀을 완충제 A에서 사전-평형화된 47 ℓ의 QFF 음이온 교환 수지(GE Biosciences)로 충전된 BPG 200/500 상에 75 cm hr-1의 선형 유속으로, 그리고, 수지 1 ℓ당 15 g이하의 Cpn10의 로딩율로 로딩하였다. Cpn10을 함유하는 QFF 음이온 교환 유통물(flowthrough)을 수집하였다. 로딩 조건 하에 대다수의 E. 콜라이 세포 단백질, 핵산 및 내독소는 기질에 결합된 상태로 남아있었다.
설포프로필-세파로스 고성능 크로마토그래피
QFF 유통물을 50 mM 트리스-HCl pH 7.6(완충제 B)로 사전-평형화된, 1.67 ℓ의 SPHP 수지(GE Biosciences)로 충전된 BPG 100/500 칼럼에 수지 1 ℓ당 15-20 g의 Cpn10으로 적용시켰다. 결합된 Cpn10은 15 ℓ상에서 0 - 12OmM NaCl의 선형 구 배로 용출되었고, 0.5 ℓ의 분획을 수집하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromatography), HPLC 및 SDS-PAGE 분석에 따라 분획을 풀링하였다. 각각, 280nm에서의 UV 흡광도, 및 이온 선택성 전극 방법(호주에 소재하는 IDEXX)에 의해 Cpn10 단백질 및 NaCl 이온 농도를 측정하였다.
제제
풀링된 SPHP 분획의 전도도 측정과 복합된 Na+ 및 Cl- 이온 측정에 기초하여, 150 mM NaCl을 함유하는 50 mM 트리스-HCl pH 7.6의 최종 제제로 완충제를 조정하였다. 무균 조건하에 0.2 ㎛ 필터를 통해 제조된 Cpn10을 여과하였다. 500 ml의, 발열성 물질 무함유 플라스틱 병으로 여액을 분배하는데, 각 병당 총 2.5 g의 Cpn10이 되도록 하기 위하여 각 병에는 500 ml를 담았다.
SDS-PAGE 분석
제조사의 프로토콜에 따라 비스-트리스(Bis-Tris) 구배 겔(캘리포니아주 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen)을 사용하여 E. 콜라이 세포 용해물 및 크로마토그래피 분획에 관한 SDS PAGE 분석을 실시하였다. 겔을 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색하고, 각각의 겔은 Cpn10 단백질 및 분자량 기준을 포함하였다.
분광광도법에 의한 정제된 Cpn 10 정량화
0.353 mg1 mL-1 cm-1의 흡광 계수를 사용한 280 nm에서 UV 흡광도(BioRad SmartSpec-3000 분광광도계)에 의해 정제된 Cpn10 농도를 측정하였다. 소 혈청 알부민(Pierce)에 관하여 바이오래드 스마트스펙-3000(BioRad SmartSpec-3000)은 전 형적으로 0.59의 A280 nm 값으로 회복되는 반면, 문헌상의 값은 0.67(Pierce 기술 자원 번호 TR0006.0)이다.
상기 기술된 전 정제 과정을 통한 Cpn10 순도 및 수율을 요약한 것으로 표 8에 나타낸다. (A)에서, BCA 단백질 검정법(Sigma)에 의해 총 단백질의 농도를 측정하고, 각 정제 단계 후 세포 용해물 및 Cpn10-함유 분획의 농도계측법에 의해 Cpn10 순도를 측정하였다. (B) 3개의 Cpn10 정제물로부터의 최종 순도 및 수율 비교. 100 ℓ의 E. 콜라이 배치 발효로부터 각 정제물을 제조하였다. 쿠마쉬 염색된 SDS-PAGE에 의한 모든 시료의 최종 Cpn10 순도는 >99%였다. 내독소 유니트(EU)를 Cpn10 1 mg당 EU로서 표시하는 반면, DNA 수준은 Cpn10 1 mg당 pg으로서 표시한다.
표 8A
Figure 112008023336290-PCT00005
표 8B
Figure 112008023336290-PCT00006
실시예 18 - 조성물
본 발명의 분자 및 물질, 및 본 발명의 방법에 의해 동정된 것들을 사용하여 다양한 질환 상태 및 병태를 치료 또는 예방할 수 있다. 그러한 분자 및 물질은, 비록 약제학적 조성물로서 투여되는 것이 더욱 전형적이기는 하나, 단독으로도 투여될 수 있다.
본원에서 제공되는 본 발명을 실시하는 최선의 모드에 따라, 특히 바람직한 조성물을 하기에 요약한다. 하기는 단지 예식적인 조성물의 일례로서 해석되어야 하며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 18(a) -비경구투여용 조성물
근육내 주사용 조성물은 1 mL 멸균 완충수, 및 1 mg의 적합한 물질 또는 분자를 함유하도록 제조될 수 있다.
유사하게, 정맥 주입용 조성물은 250 ml의 링커액, 및 5 mg의 적합한 물질 또는 분자를 포함할 수 있다.
실시예 18(b) - 주사가능한 비경구용 조성물
10부피%의 프로필렌 글리콜 및 물중 1중량%의 적합한 물질 또는 분자를 혼합하여 주사에 의해 투여하기 적합한 조성물을 제조할 수 있다. 용액을 여과에 의해 멸균시킨다.
실시예 18(c) - 캡슐 조성물
표준 2-피스의 경질 젤라틴 캡슐을 분말형의 50 mg 물질 또는 분자, 100 mg의 락토스, 35 mg의 활석 및 10 mg의 스테아린산마그네슘으로 충진시켜 적합한 물질 또는 분자의 조성물을 캡슐형으로 제조할 수 있다.
실시예 18(d) - 점안제 조성물
점안제로서 전달하기 위한 전형적인 조성물은 하기와 같이 요약한다:
적합한 물질 또는 화합물 0.3 g
메틸 하이드록시벤조에이트 0.005 g
프로필 하이드록시벤조에이트 0.06 g
정제수 약 100.00 ml까지
메틸 및 프로필 하이드록시벤조에이트를 75℃에서 70 ml 정제수에 용해시키고, 생성된 용액을 냉각시킨다. 이어서, 적합한 물질 또는 분자를 가하고, 막 필터(공극 크기 0.22 μm)를 통해 여과하여 용액을 멸균시키고, 멸균 용기에 무균적으로 충전시켰다.
실시예 18(e) - 흡입 투여용 조성물
수용량이 20-30 ml인 에어로졸 용기의 경우: 10 mg의 적합한 물질 또는 화합물과, 0.5-0.8중량%의 윤활제, 예로서, 폴리소르베이트 85 또는 올레산의 혼합물을 예로서, 프레온과 같은 추진제에 분산시키고, 비내 또는 경구 흡입식 투여에 적합한 에어로졸 용기내로 넣었다.
실시예 18(f) - 연고제 조성물
연고제로서 전달하기 위한 전형적인 조성물은 매끄러운 균질 제품을 생산하기 위하여 분산되어 있는, 1.0 g의 적합한 물질 또는 분자와, 100.0 g이 되도록 백색 연성 파라핀을 함께 포함한다.
실시예 18(g) - 국소용 크림제 조성물
국소 크림제로서 전달하기 위한 전형적인 조성물은 하기에 요약한다:
적합한 물질 또는 분자 1.0 g
폴라왁스(Polawax) GP 200 25.0 g
무수 라놀린 3.0 g
백색 밀랍 4.5 g
메틸 하이드록시벤조에이트 0.1 g
탈이온수 & 멸균수 100.0 g까지
폴라왁스, 밀랍, 및 라놀린을 함께 60℃에서 가열하고, 메틸 하이드록시벤조에이트 용액을 가하고, 고속 교반을 사용하여 균질화한다. 이어서, 온도를 50℃로 강하시켰다. 이어서, 물질 또는 분자를 가하고, 전역에 분산시키고, 조성물은 저속으로 교반시키면서 냉각시켰다.
실시예 18(h) - 국소 로션 조성물
국소 로션으로서 전달하기 위한 전형적인 조성물은 하기에 요약한다:
적합한 제제 또는 분자 1.2 g
솔비탄 모노라우레이트 0.8 g
폴리소르베이트 20 0.7 g
세토스테아릴 알코올 1.5 g
글리세린 7.0g
메틸 하이드록시벤조에이트 0.4 g
멸균수 약 100.00 ml까지
메틸 하이드록시벤조에이트 및 글리세린을 75℃에서 70 ml의 물에 용해시킨 다. 솔비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트 20 및 세토스테아릴 알코올을 75℃에서 함께 용융시키고, 수용액에 가한다. 생성된 에멀젼을 균질화하고, 계속 교반하면서 냉각시키고, 물질 또는 분자를 잔류수에 현탁제로서 가한다. 전체 현탁액이 균질화될 때까지 교반하다.
[서열목록]
Figure 112008023336290-PCT00007
Figure 112008023336290-PCT00008
Figure 112008023336290-PCT00009
Figure 112008023336290-PCT00010
Figure 112008023336290-PCT00011
Figure 112008023336290-PCT00012
Figure 112008023336290-PCT00013
Figure 112008023336290-PCT00014
Figure 112008023336290-PCT00015
Figure 112008023336290-PCT00016
Figure 112008023336290-PCT00017
Figure 112008023336290-PCT00018
Figure 112008023336290-PCT00019
Figure 112008023336290-PCT00020
Figure 112008023336290-PCT00021
Figure 112008023336290-PCT00022
Figure 112008023336290-PCT00023
Figure 112008023336290-PCT00024
Figure 112008023336290-PCT00025
Figure 112008023336290-PCT00026
Figure 112008023336290-PCT00027
Figure 112008023336290-PCT00028
Figure 112008023336290-PCT00029
Figure 112008023336290-PCT00030

Claims (61)

  1. 면역조절 활성은 보유하지만, 단백질 폴딩 활성이 없거나 실질적으로 없는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  2. 면역조절 활성을 보유하고, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 이동성 루프 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타내는 폴리펩티드.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 이동성 루프 영역이 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이동성 루프 영역의 IML 트리펩티드 중 하나 이상의 잔기가 전하를 띤 잔기로 대체된 것인 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 IML 트리펩티드가 잔기 EEE, III 또는 IFI를 코딩하는 트리펩티드로 대체되고, 여기에서, 상응하는 아미노산 Cpn10 서열은 서열 번호 39, 37 및 35에 기재되어 있는 것인 폴리펩티드.
  7. 면역조절 활성을 보유하고, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 이동성 루프 영역이 실질적으로 없는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이동성 루프 영역이 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이동성 루프 영역이 실질적으로 없는 상기 Cpn10 폴리펩티드가 서열 번호 3 또는 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이동성 루프 영역이 실질적으로 없는 상기 Cpn10 폴리펩티드가 서열 번호 4 또는 5 또는 25에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타내는 것인 폴리펩티드.
  12. 면역조절 활성을 보유하고, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 상부(roof) β-헤어핀 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타내는 폴리펩티드.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 상부 β-헤어핀 영역이 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  15. 면역조절 활성을 보유하고, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 상부 β-헤어핀 영역이 실질적으로 없는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 상부 β-헤어핀 영역이 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상부 β-헤어핀 영역이 실질적으로 없는 상기 Cpn10 폴리펩티드가 서열 번호 6 또는 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상부 β-헤어핀 영역이 실질적으로 없는 상기 Cpn10 폴리펩티드가 서열 번호 7 또는 8 또는 27에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cpn10 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타내는 것인 폴리펩티드.
  20. 면역조절 활성을 보유하고, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 이동성 루프 영역 및 상부 β-헤어핀 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  21. 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 이동성 루프 영역과 상부 β-헤어핀 영역 둘 다가 실질적으로 없는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 서열 번호 9 또는 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  23. 제21항에 있어서, 서열 번호 10 또는 29에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타내는 폴리펩티드.
  25. 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 가외(extra) N-말단 알라닌 잔기의 결실을 포함하는, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 서열 번호 23에 기재된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
  27. 제25항에 있어서, 서열 번호 44에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 비교할 때 감소된 면역조절 활성 수준을 나타내는 폴리펩티드.
  29. Cpn10 폴리펩티드의 N 말단이 실질적으로 박테리아 Cpn10 N 말단으로 대체된, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서, 서열 번호 14에 기재된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
  31. 제29항에 있어서, 서열 번호 43에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 비교할 때 감소된 면역조절 활성 수준을 나타내는 폴리펩티드.
  33. 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드와 비교하여 글리신 잔기가 Cpn10 폴리펩티드의 가외 N 말단 알라닌 잔기를 대체한, 단리된 Cpn10 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  35. 제33항에 있어서, 서열 번호 31에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  36. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드의 면역조절 활성 수준과 적어도 유사한 면역조절 활성을 나타내는 폴리펩티드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 Cpn10 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  38. 경우에 따라 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 제37항의 핵산을 포함하는 발현 작제물.
  39. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 발현시키거나, 제37항의 핵산 또는 제38항의 발현 작제물을 포함하는 숙주 세포.
  40. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체.
  41. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제37항의 핵산, 제38항의 발현 작제물 또는 제40항의 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물.
  43. 유효량의, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 Cpn10 폴리펩티드 또는 제37항의 핵산을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상자를 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 치료가 대상자에서 면역 반응을 조절하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 면역 반응이 Toll 유사 수용체 신호 전달의 조절을 통해 조절되는 것인 방법.
  46. 유효량의, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제37항의 핵산을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 질환, 질병 또는 병태가 급성 또는 만성 염증 질환, 천식, 알레르기, 다발경화증, GVHD, 기타 자가면역 질환 또는 감염 질환으로부터 선택되는 것인 방법.
  48. 박테리아 또는 바이러스 감염인, 제47항에 따른 감염 질환.
  49. 그램 음성 박테리아에 의해 유발되는, 제48항에 따른 박테리아 감염.
  50. 유효량의, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 Cpn10 폴리펩티드 또는 제37항의 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서, 또는 그의 1개 이상의 세포, 조직 또는 장기에서 TLR4 신호 전달을 조절하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 Cpn10 폴리펩티드가 효현제 유도 TLR 신호 전달을 조 절하는 것인 방법.
  52. 유효량의, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 Cpn10 폴리펩티드 또는 제37항의 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서, 또는 그의 1개 이상의 세포, 조직 또는 장기에서 하나 이상의 면역조절제의 생산 및/또는 분비를 조절하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 TLR4 신호 전달을 조절하는 것인 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 면역조절제가 향염증성 사이토카인 또는 케모카인 또는 항염증성 사이토카인 또는 케모카인인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 케모카인이 TNF-α, IL-6, RANTES, IL-10, TGF-β 또는 I형 인터페론으로부터 선택되는 것인 방법.
  56. (a) 후보 화합물을 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 후보 화합물과 상기 폴리펩티드와의 복합체 형성을 검정하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 동정하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 복합체 형성에 대한 검정법이 경쟁 결합 검정법 또는 이중-하이브리드 검정법인 방법.
  58. (a) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를, 후보 화합물이 상기 폴리펩티드에 상호작용할 수 있기에 적합한 조건 하에 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 폴리펩티드의 활성을 검정하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 스크리닝하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 활성을 검정하는 단계가 표지된 기질을 첨가하고 표지된 기질 내 변화를 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  60. 폴리펩티드가 인간 Cpn10 폴리펩티드이고, 서열 번호 1 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드.
  61. 제60항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 2 또는 22에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 상응하는 야생형 Cpn10 폴리펩티드.
KR1020087007836A 2005-08-31 2006-08-31 변형된 샤페로닌 10 Ceased KR20080098579A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2005904765A AU2005904765A0 (en) 2005-08-31 Modified chaperonin 10
AU2005904765 2005-08-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080098579A true KR20080098579A (ko) 2008-11-11

Family

ID=37808414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087007836A Ceased KR20080098579A (ko) 2005-08-31 2006-08-31 변형된 샤페로닌 10

Country Status (10)

Country Link
US (3) US7977458B2 (ko)
EP (3) EP2463307A1 (ko)
JP (2) JP5341515B2 (ko)
KR (1) KR20080098579A (ko)
CN (1) CN101309934B (ko)
BR (1) BRPI0615284A2 (ko)
CA (1) CA2620729A1 (ko)
DK (1) DK1937723T3 (ko)
NZ (1) NZ566817A (ko)
WO (1) WO2007025343A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0615284A2 (pt) * 2005-08-31 2011-05-17 Cbio Ltd chaperonina 10 modificada
WO2009124333A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Cbio Limited Modified chaperonin 10 and prr signaling
NZ588467A (en) * 2008-04-11 2012-11-30 Cbio Ltd Modified chaperonin 10 (CPN10) polypeptides and pattern recognition receptor (PRR) signalling
NZ599666A (en) * 2009-10-09 2014-11-28 Cbio Ltd Chaperonin 10 variants
US10575716B2 (en) * 2012-05-11 2020-03-03 Ethicon Llc Applicator instruments with imaging systems for dispensing surgical fasteners during open repair procedures
US20180222958A1 (en) * 2016-12-20 2018-08-09 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Lymphotoxin-beta receptor-binding agents, targeting antibodies, and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE282634T1 (de) * 1993-11-30 2004-12-15 Univ Queensland Chaperonin 10
DK1066380T3 (da) * 1998-05-19 2002-01-28 Avidex Ltd Opløselig T-cellereceptor
AUPP823999A0 (en) 1999-01-20 1999-02-11 University Of Queensland, The A treatment
GB9912852D0 (en) * 1999-06-02 1999-08-04 Regen Therapeutics Plc Peptides
AU2002317013B2 (en) * 2001-06-27 2007-11-01 Janssen Pharmaceutica N.V. EPF receptor assays, compounds and therapeutic compositions
AU2002952492A0 (en) 2002-11-06 2002-11-21 Cbio Limited Chaperonin 10 immunosuppression
WO2004076639A2 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Wyeth Use of gene expression profiling in the diagnosis and treatment of lupus nephritis and systemic lupus erythematosus
WO2005067959A1 (en) * 2004-01-16 2005-07-28 Cbio Limited Chaperonin 10 modulation of toll-like receptor-inducible cytokine and chemokine secretion
BRPI0613515A2 (pt) 2005-07-11 2011-01-11 Cbio Ltd imunomodulação induzida por chaperonina 10
BRPI0615284A2 (pt) * 2005-08-31 2011-05-17 Cbio Ltd chaperonina 10 modificada

Also Published As

Publication number Publication date
US20120014998A1 (en) 2012-01-19
WO2007025343A1 (en) 2007-03-08
CN101309934A (zh) 2008-11-19
US20140093524A1 (en) 2014-04-03
CN101309934B (zh) 2014-02-12
BRPI0615284A2 (pt) 2011-05-17
JP5819767B2 (ja) 2015-11-24
DK1937723T3 (en) 2014-02-24
EP1937723A1 (en) 2008-07-02
US20090305400A1 (en) 2009-12-10
JP2009505667A (ja) 2009-02-12
EP2463307A1 (en) 2012-06-13
CA2620729A1 (en) 2007-03-08
EP1937723A4 (en) 2009-12-16
EP1937723B1 (en) 2013-11-13
JP2012196210A (ja) 2012-10-18
JP5341515B2 (ja) 2013-11-13
NZ566817A (en) 2012-02-24
US8513201B2 (en) 2013-08-20
US7977458B2 (en) 2011-07-12
EP2457930A1 (en) 2012-05-30
US9079967B2 (en) 2015-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6262721B2 (ja) 敗血症の予防用または治療用の組成物
MXPA06010364A (es) Identificacion de antigenos puros y no puros implicados en enfermedades autoinmunes.
US9079967B2 (en) Modified chaperonin 10
US20050074758A1 (en) Prokineticin polypeptides, related compositions and methods
US20100144642A1 (en) Peptides and apl-type derivatives of hsp60 and pharmaceutical compositions
JP2004501061A (ja) 熱ショックタンパク質６０のフラグメントおよびアンタゴニスト
CZ303409B6 (cs) Zkrácený a mutovaný lidský chemokin
AU2004309111B2 (en) CC-chemokine-binding tick proteins
JP2001186887A (ja) サソリ毒由来の抗菌ペプチド
AU2006287120B2 (en) Modified chaperonin 10
KR20110005710A (ko) 변형된 Ｃｐｎ10 및 ＰＲＲ 시그널링
JPH07508763A (ja) ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト
US10738095B2 (en) Engineered CCL20 locked dimer polypeptide
Linial et al. The effect of calcium levels on synaptic proteins. A study on VAT-1 from Torpedo
US11571462B2 (en) Engineered CCL20 locked dimer polypeptide
US7153947B2 (en) Ixodes salivary anticomplement protein
US20110014218A1 (en) Ixodes scapularis salivary proteins and methods of use for modulation of the alternative complement pathway
WO2012095684A1 (en) Methods for the screening of substances useful for the prevention and treatment of neisseria infections

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20080331

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20110830

Comment text: Request for Examination of Application

PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20121220

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20131015

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20121220

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I