BRPI0614578A2 - composto, composição farmacêutica como inibidores de proteìna cinases, bem como seu método e uso - Google Patents

Abstract

COMPOSTO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMO INIBIDORES DE PROTEìNA CINASES, BEM COMO SEU MéTODO E USO. A presente invenção refere-se a uma nova classe de compostos, composições farmacêuticas compreendendo tais compostos e métodos de uso de tais compostos para tratar ou prevenir doenças ou distúrbios associados à atividade anormal ou desregulada de cinases, particularmente doenças ou distúrbios que envolvem a ativação anormal das cinases AbI, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK, Tie-2, Trk-B, FGFR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e PDGFRO e PDGFRI3.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSTO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMO INIBIDORES DE PROTEÍNA Cl-NASES, BEM COMO SEU MÉTODO E USO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade nos termos de35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido de Patente Provisório US N0 60/708.915,depositado em 16 de agosto de 2005. A descrição do pedido de prioridadeestá aqui incorporado em sua integridade a título de referência e para todosos fins.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOCAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma nova classe de compostos,composições farmacêuticas compreendendo tais compostos e métodos deuso de tais compostos para tratar ou prevenir doenças ou distúrbios associ-ados à atividade anormal ou desregulada de cinases, particularmente doen-ças ou distúrbios que envolvem a ativação anormal das cinases Abi, Bcr-Abl,Aurora-A, SGK, Tie-2, Trk-B, FGFR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyne PDGFRa e PDGFRp.

ANTECEDENTES

As proteína cinases representam uma grande família de proteí-nas, que desempenham um papel central na regulação de uma grande vari-edade de processos celulares e mantêm o controle sobre a função celular.Uma lista parcial, não limitativa, dessas cinases incluem: tirosina cinasesreceptoras tais como a cinase receptora do fator de crescimento de deriva-dos plaquetáriòs (PDGF-R), o receptor do fator de crescimento nervosc^trkB, Met, e o receptor do fator de crescimento de fibroblastos, FGFR3; tiro-sina cinases não receptores tais como Abl e cinase de fusão BCR-Abl, Lck,Csk, Fes, Bmx e c-src; e serina/treonina cinases tais como as cinases b-RAF, c-RAF, sgk, MAP (por exemplo, MKK4, MKK6, etc.) e SAPK2oc,SAPK2P e SAPK3. Atividade aberrante de cinase foi observada em muitosestados patológicos que incluem distúrbios proliferativos benignos e malig-nos assim como doenças resultantes da ativação inadequada dos sistemaimunológico e nervoso.

Os novos compostos desta invenção inibem a atividade de umaou mais proteína cinases e espera-se, portanto, que sejam úteis no trata-mento de doenças associadas à cinases.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece compostos de fór-mula I:

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nos quais:

X1 é selecionado de CH e N;

Y é selecionado de S e NR5; onde R5 é selecionado de hidro-gênio e Ci-6alquila;

Z é selecionado de C e S(O);

R1 é selecionado de hidrogênio e Ci-6alquila;

R2 é selecionado de C6-i2arila e -NR3R4;

R3 é selecionado de hidrogênio e Ci-6alquila;

R4 é -XR5; onde X é selecionado de uma ligação, Ci-6alquilenoe CMoheterarileno; onde R5 é selecionado de C6--Ioarila e C-Moheteroarila;

onde o referido arila ou heteroarila de R5 é opcionalmente substi-tuído com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de Ci-6alquila, Ci-6alquila halo-substituído, C3.8heterocicloalquila, -C(O)NR6R7 e -NR6C(O)R7;onde R6 é selecionado de hidrogênio e Ci-6alquila; e R7 é selecionado de C6.10arila e Ci-ioheteroarila;

onde o referido arila ou heteroarila de R7 é opcionalmente substi-tuído com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de -R8 e -OR8;onde R8 é selecionado de Ci-6alquila, Ci.6alquil halo-substituído, C6-i2arila,C1-i0heteroarila e C3.8heterocicloalquil-C0-4alquila; onde os referidos substitu-intes arila, heteroarila e heterocicloalquila de R8 são opcionalmente substitu-ídos com Ci-6alquila;

ou R3 e R4, junto com os átomos aos quais R3 e R4 estão presos,formam C3.8heterocicloalquila opcionalmente substituído Com-C(O)NR6Rg;onde R6 é selecionado de hidrogênio e Ci-6alquila; e Rg é selecionado de C6.10arila e Ci-i0heteroarila; e os derivados do tipo N-óxido, derivados do tipopró-droga, derivados protegidos, isômeros individuais e mistura de isômerosdos mesmos; e os sais e solvatos (por exemplo hidratos) farmaceuticamenteaceitáveis de tais compostos.

Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica que contém um composto de fórmula I ou um deri-vado do tipo N-óxido, isômeros individuais e misturas de isômeros do mes-mo; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em mistura com umou mais excipientes adequados.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um méto-do para tratar uma doença em um animal no qual a inibição da atividade decinase, particularmente a inibição de Abi, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK, Tie-2, Trk-B, FGFR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e PDGFRa e/ou PDG-FRp, pode prevenir, inibir ou melhorar a patologia e/ou a sintomatologia dasdoenças, cujo método compreende administrar ao animal uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I ou deNjm derivado dotipo N-óxido, isômeros individuais e misturas de isômeros do mesmo, ou umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece o uso deum composto de fórmula I na produção de um medicamento para tratar umadoença em um animal no qual a atividade de cinase, particularmente a ativi-dade de Abi, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK1 Tie-2, Trk-B, FGFR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e PDGFRa e/014 PDGFRp, contribui para a patologiae/ou a sintomatologia da doença.

Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece um proces-so para preparar compostos de fórmula I e os derivados do tipo N-óxido, de-rivados do tipo pró-droga, derivados protegidos, isômeros individuais e mis-turas de isômeros dos mesmos, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dosmesmos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODEFINIÇÕES

"Alquila" como grupo e como elemento estrutural de outros gru-pos, por exemplo, alquila e alcóxi halo-substituídos, pode ser de cadeia retaou ramificada. Ci-4-alcóxi inclui metóxi, etóxi, e outros. Alquil halo-substituídoinclui trifluormetila, pentafluoretila, e similares.

"Arila" significa uma estrutura de anel aromático monocíclico oude anel aromático bicíclico fundido contendo seis a dez átomos de carbonono anel. Por exemplo, arila pode ser fenila ou naftila, de preferência fenila.

"Arileno" significa um radical divalente derivado de um grupo arila.

"Heteroarila" é como definido para arila acima onde um ou maismembros carbono do anel pode ser substituídos por um heteroátomo. Porexemplo, Ci-ioheteroarila inclui morfolina, piridila, indolila, indazolila, quino-xalinila, quinolinila, benzofuranila, benzopiranila, benzotiopiranila, ben-zo[1,3]dioxol, imidazolila, benzo-imidazolila, pirimidinila, furanila, oxazolila,isoxazolila, triazolila, tetrazolila, pirazolila, tienila, etc.

"Cicloalquila" significa uma estrutura de anel monocíclico, bicícli-co fundido ou policíclico ligado por ponte, saturado ou parcialmente insatu-rado, contendo o número de átomos indicados no anel. Por exemplo, C3-10cicloalquila inclui ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, etc.

"Heterocicloalquila" significa cicloalquila, como definido nestepedido, contanto que um ou mais dos carbonos de anel indicados, sejamsubstituídos por uma porção selecionada de -O-, -N=, -NR-, -C(O)-, -S-,-S(O) - ou -S(O)2-, onde R é hidrogênio, Ci^alquila ou um grupo de proteçãode nitrogênio. Por exemplo, C3-8heterocicloalquila conforme usado neste pe-dido parei descrever çpm postos da invenção inclui morfolino, pirrolidinil, pirro-lidinil-2-ona, piperazinila, piperidinila, piperidinilona, 1,4-dioxa-8-aza-espiro[4.5]dec-8-il, etc.

"Halogênio" (ou halo) de preferência representa cloro ou flúor,mas também pode ser bromo ou iodo.

"Lista de cinases" é uma relação de cinases compreendendoAbl(humana), Abl(T315l), JAK2, JAK3, ALK, JNK1a1, ALK4, KDR, Aurora-A,Lck, Blk, MAPK1, Bmx, MAPKAP-K2, BRK, MEK1, CaMKII(rat), Met,CDK1/cicilinaB, p70S6K, CHK2, PAK2, CK1, PDGFRa1 CK2, PDK1, c-kit,Pim-2, c-RAF, PKA(h), CSK, PKBa1 cSrc, PKCa1 DYRK2, Plk3, EGFR1ROCK-I, Fes, Ron1 FGFR3, Ros, Flt3, SAPK2a, Fms1 SGK, Fyn, SIK1GSK3b, Syk1 IGF-1R, Tie-2, ΙΚΚβ, TrKB, IR1 WNK3, IRAK4, ZAP-70, ITK,AMPK(rato), LIMK1, Rsk2, Axl1 LKB1, SAPK2b, BrSK2, Lyn (h), SAPK3,BTK, MAPKAP-K3, SAPK4, CaMKIV, MARK1, Snk1 CDK2/cyclinA, MINK1SRPK1, CDK3/ciclinaE, MKK4(m), TAK1, CDK5/p25, MKK6(h), TBK1,CDK6/ciclinaD3, MLCK, TrkA, CDK7/ciclinaH/MAT1, MRCKp1 TSSK1, CHK1,MSK1, Yes1 CKId1 MST2, ZIPK, C-Kit (D816V), MuSK, DAPK2, NEK2, D-DR2, NEK6, DMPK, PAK4, DRAK1, PAR-1 Ba, EphAI, PDGFRp, EphA2,Pim-1, EphA5, ΡΚΒβ, EphB2, PKCpl, EphB4, PKCÔ, FGFR1, PKCti, FGFR2,PKC6, FGFR4, PKD2, Fgr, PKG1p, Flt1, PRK2, Hck, PYK2, HIPK2, Ret1IKKa, RIPK2, IRR, ROCK-ll(humana), JNK2a2, Rse, JNK3, Rsk1(h), PI3 Κγ,PI3 Κδ e ΡΙ3-Κβ. Os compostos da invenção são avaliados com a lista decinases (tipo selvagem ou mutação da mesma) e inibem a atividade de pelomenos um dos membros da referida lista de cinases.

"Formas mutantes de BCR-Abl" significa alterações em um ouvários aminoácidos da seqüência do tipo selvagem. As mutações em BCR-ABL agem rompendo os pontos de contato críticos entre a proteína e o inibi-dor (por exemplo, Gleevec, e similares), com mais freqüência, induzindouma transição do estado inativo para o estado ativo, isto é, para uma con-formação na qual BCR-ABL e Gleevec sejam incapazes de se ligar. A partirda análise de amostras clínicas, o repertório de mutações encontradas emassociação ao fenótipo resistente vem aumentando lentamente porém inexo-raveímente ao longo do témpo. As mutações parecem se agrupar em quatroregiões principais. Um grupo de mutações (G250E, Q252R, Y253F/H,E255K/V) inclui aminoácidos que formam a alça fixadora de fosfato paraATP (também conhecida como a alça P). Um segundo grupo (V289A,F311L, T315I, F317L) pode ser encontrado no sítio fixador de Gleevec e in-terage diretamente com o inibidor via ligações de hidrogênio ou forças deVan der Waals. O terceiro grupo de mutações (M351T, E355G) se agrupabem próximo ao domínio cataiítico. O quarto grupo de mutações (H396R/P)fica localizado na alça de ativação, cuja conformação é a chave molecularque controla a ativação/inativação de cinase. As mutações pontuais de BCR-ABL associadas à resistência a Gleevec detectada em pacientes CML e ALLincluem: M224V, L248V, G250E, G250R, Q252R, Q252H, Y253H, Y253F,E255K, E255V, D276G, T277A, V289A, F311L, T315I, T315N, F317L,M343T, M315T, E355G, F359V, F359A, V379I, F382L, L387M, L387F,H396P, H396R, A397P, S417Y, E459K, e F486S (as posições dos aminoá-cidos, indicados pelo código de uma letra, são aquelas para a seqüência noGenBank, número de acesso AAB60394, e correspondem à ABL tipo 1a;Martinelli et al., HaematoIogicayThe Hematology Journal, 2005, April; 90-4).A menos que de outra forma especificado nesta invenção, Bcr-Abl refere-seao tipo selvagem e às formas mutantes da enzima.

"Tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um método paraaliviar ou mitigar uma doença e/ou seus conseqüentes sintomas.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS

A proteína de fusão BCR-AbI é resultado de uma translocaçãorecíproca que funde o proto-oncogene Abl com o gene Bcr. A BCR-AbI éentão,capaz de transformar as células B através do aumento da atividademitogênica. Este aumento resulta em uma redução de sensibilidade à apop-tose, assim como em alteração da adesão e alojamento de células progeni-toras CML. A presente invenção fornece compostos, composições e méto-dos para o tratamento de doenças associadas a cinases, particularmente dedoenças associadas às cinase Abi, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK, Tie-2, Trk-B,FGFR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e PDGFRa e PDGFRp. Porexemplo, leucemia e outros distúrbios proliferativos relácionados à>3CR-Ablpodem ser tratados através da inibição do tipo selvagem e de formas mutan-tes de Bcr-Abl.

Em uma modalidade, com referência aos compostos de fórmulaI, encontram-se os compostos de fórmula Ia:na qual:

X1 é selecionado de CH e N;

Y é selecionado de S e NR5; onde R5 é selecionado de hidrogê-nio e C1-6alquila;

η é selecionado de 0,1 e 2;

R1 é selecionado de hidrogênio e C1-6alquila; e

R12 é selecionado de hidrogênio, C1-6alquila, C1-6alquil halo-substituído, C3-8heterocicloalquila, -C(O)NR6R? e -NR6C(O)R7; onde R6 éselecionado de hidrogênio e Ci-6alquila; e R7 é selecionado de C6-i0arila eC1-ioheteroarila;

onde a referida arila ou heteroarila de R7 é opcionalmente substi-tuída com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de -Re e -OR8;onde R8 é selecionado de C1-6alquila, C1-6alquila halo-substituído, C6.12arila,C1-10heteroarila e C3-8heterocicloalquila-C0-4alquila; onde os referidos substi-tuintes arila, heteroarila e heterocicloalquila de R8 são opcionalmente substi-tuídas com Ci-6alquila.

Em uma outra modalidade, X ^ é selecionado de CH e Ν; Y éselecionado de S e N(CH3); e Ri é hidrogênio.

Em uma outra modalidade, Ri2 é hidrogênio, metila, -C(O)NHR7,-NHC(O)R7, -N(CH3)C(O)R7 e morfolino; onde R7 é selecionado de fenil eisoxazolil; onde a referida fenila ou oxazolila de R7 é opcionalmente substitu-ída com 1 a 2 radicais selecionados de iso-butila, trifluormetila, fenóxi, etil-piperazinil-metila, metil-piperazinil-metila, metil-imidazolila e morfolino-metila.

Os compostos preferidos da invenção são selecionados de: [3-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amída do áciçio 6H-1-Tia-5,6-diazá-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido1 -Metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; (4-morfolin-4-il-fenil)-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; fenil a-mida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; 3-trifluormetil-benzilamida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-çarboxílico; Morfolin-4-il-(6H-1 -tia-5,6-diaza-as-indacen-2-il)-metanona; 2-Benzenossulfonil-1 -metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amidado ácido 6H-1 -Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil-5-[metil-(3-trifluormetil-benzoil)-amino]-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {5-[4-(4-etil-piperazin-1 -ilmetil)-3-trifluormetil-fenilcarbamoil]-2-metil-fenil}-amida do ácido6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil-5-[3-(4-metil-imidazol-1 -il)-5-trifluormetil-benzoilamino]-fenil}-amida do ácido 6H-1 -Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-morfolin-4-ilmetil-5-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil-5-[4-(2-metil-imidazol-1-il)-3-trifluormetil-benzoilamino]-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil-5-[4-(4-metil-piperazin-1 -ilmetil)-3-trifluormetil-fenilcarbamoil]-fenil}-amida doácido 6H-1 -Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [5-(5-tert-butil-isoxazol-3-ilcarbamoil)-2-metil-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; (4-fenoxi-fenil)-amida do ácido (6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carbonil)-piperazina-1 -carboxílico; {1 -[3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-1H-imidazol-2-il}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amidado ácido l-Metil-l.e-dihidro-l.õ.e-triaza-as-indaceno^-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido 1 -Metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido l-Meíil-l.e-dihfçIro-I.S.e-triaza-as-indaceno^-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6,7-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amidado ácido 6H-1-Tia-5,6,7-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(4-morfolin-4-ilmetil-3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6,7-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-metoxi-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-metoxi-5-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido6Η-1 -Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-metoxi-5-(4-morfolin-4-ilmetil-3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {3-metoxi-5-[3-(4-metil-imidazol-1-il)-5-

trifluormetil-fenilcarbamoil]-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {3-[4-(4-etil-piperazín-1 -il)-3-trifluormetil-

fenilcarbamoil]-5-metoxi-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(5-trifluormetil-4 H-benzoimidazol-2-il)-fenil]-amida do ácido e 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico.

Outros compostos preferidos da invenção estão detalhados nosexemplos e na Tabela I, infra.FARMACOLOGIA E UTILIDADE

Os compostos da invenção modulam a atividade de cinases e,dessa forma, são úteis para tratar doenças ou distúrbios nos quais as cina-ses contribuem para a patologia e/ou a sintomatologia da doença. Exemplosde cinases que são inibidas pelos compostos e composições descritos nestainvenção e contra as quais os métodos descritos neste relatório são úteisincluem, porém sem limitação, Abi, Bcr-Abl (tipo selvagem e formas mutan-tes), Aurora-A, SGK, Tie-2, Trk-B, FGFR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2,Fms, Fyn e PDGFRa e PDGFRp.

As proteína cinases mitóticas Aurora (A, B e C) são seri-na/treonina cinases freqüentemente superexpressas em células de váriostipos de tumores. A Aurora-A regula a função do centrossomo durante a faseM através de suas interações com vários reguladores do ciclo celular inclusi-ve p53. Também, um polimorfismo da região codificadora comum na aurora-A üfeta o riscc^de câncer de mama óu de esôfago.

A tirosina cinase Abelson (isto é, Abi, c-Abl) está envolvida naregulação do ciclo celular, na resposta celular à tensão genotóxica, e natransmissão de informações sobre o meio celular através da sinalização deintegrina. De um modo geral, parece que a proteína Abl tem um papel com-plexo como um módulo celular que integra sinais de várias fontes extracelu-Iares e intracelulares e que influencia decisões referentes ao ciclo celular e àapoptose. A tirosina cinase Abelson inclui derivados de subtipos tais como afusão quimérica (oncoproteína) BCR-AbI com atividade desregulada de tiro-sina cinase ou a v-Abl. A BCR-AbI é crítica na patogênese de 95% das Ieu-cemias mielogênicas crônicas (CML) e 10% das Ieucemias linfocíticas agu-das. STI-571 (GIeevec) é um inibidor da tirosina cinase BCR-AbI oncogênicae é usado no tratamento de leucemia mielóide crônica (CML). No entanto,alguns pacientes no estágio de crise blástica da CML são resistentes ao STI-571 devido a mutações na cinase BCR-Abl. Mais de 22 mutações já foramreportadas até hoje com a mais comum sendo G250E, E255V, T315I, F317Le M351T.

Os compostos da presente invenção inibem a cinase abi, espe-cialmente a cinase v-abl. Os compostos da presente invenção também ini-bem a cinase BCR-AbI do tipo selvagem e mutações da cinase BCR-AbI esão portanto adequados para o tratamento de câncer positivo para Bcr-abl edoenças tumorais tais como Ieucemias (especialmente leucemia mielóidecrônica e leucemia linfoblástica aguda, onde são encontrados mecanismosde ação especialmente apoptóticos), e também apresentam efeitos no sub-grupo de células-tronco leucêmicas assim como potencial para a purificaçãodestas células in vitro depois da remoção das referidas células (por exemplo,remoção da medula óssea) e reimplantação das células depois de elas te-rem sido depuradas das células cancerosas (por exemplo, reimplantação decélulas purificadas da medula óssea).

A via de sinalização de Ras-Raf-MEK-ERK medeia a respostacelular aos sinais de crescimento. A Ras é alterada para uma forma oncogê-nica em -15% dos cânceres humanos. A família Raf pertence à seri-na/treonina cinase protéica e inclui três membros, A-Raf, B-Raf é c-Raf (ouRaf-1). O foco na Raf sendo um alvo medicamentoso foi centrado na relaçãoda Raf como um efetor descendente de Ras. No entanto, dados recentessugerem que B-Raf pode ter um papel proeminente na formação de certostumores sem necessidade de um alelo de Ras ativado (Nature 417, 949 -954 (01 Jul 2002). Em particular, mutações de B-Raf foram detectadas emuma grande percentagem de melanomas malignos.

Os tratamentos médicos existentes para melanoma são limita-dos em termos de sua eficácia, especialmente para melanomas em estágioavançado. Os compostos da presente invenção também inibem processoscelulares envolvendo a cinase b-Raf, oferecendo uma nova oportunidadeterapêutica para tratamento de cânceres humanos, especialmente para me-lanoma.

Os compostos da presente invenção também inibem processoscelulares envolvendo a cinase c-Raf. A c-Raf é ativado pelo oncogene ras,que sofre mutação em um grande número de cânceres humanos. Portanto ainibição da atividade de cinase de c-Raf pode oferecer uma maneira de pre-venir o crescimento tumoral mediado por ras [Campbell, S. L., Oncogene,17, 1395 (1998)].

PDGF (fator de crescimento de derivados plaquetários) é umfator de crescimento muito comum, que desempenha um papel importantetanto no crescimento normal como também na proliferação celular patológi-ca, tal como é visto na carcinogênese e em doenças das células do músculoliso de vasos sangüíneos, por exemplo, em aterosclerose e trombose. Oscompostos da invenção podem inibir o atividade do receptor de PDGF(PDGFR) e são, portanto, adequados para o tratamento de doenças tumoro-sas, tais como gliomas, sarcomas, tumores de próstata, e tumores do cólon,mama, e ovário.

Os compostos da presente invenção podem ser usados não a-penas como substância inibitória de tumor, por exemplo, em câncer de pul-mão de células pequenas, mas também como um agente para tratar distúr-bios proliferativos não malignos, tais como aterosclerose, trombose, psoría-se, escleroderma e fibrose, assim como para a '"proteção dc/?células-tronco,por exemplo para combater o efeito hemotóxico de agentes quimioterapêuti-cos, tais como 5-fluoruracila, e em asma. Os compostos da invenção podemser especialmente usados para o tratamento de doenças que respondem auma inibição da cinase receptora de PDGF.

Os compostos da presente invenção apresentam efeitos úteis notratamento de distúrbios que surgem como resultado de transplante, por e-xemplo, transplante alogênico, especialmente rejeição de tecidos, tal comoespecialmente bronquiolite obliterativa (OB), isto é, uma rejeição crônica detransplantes alogênicos de pulmão. Ao contrário dos pacientes sem OB, a-queles com OB freqüentemente apresentam uma concentração elevada dePDGF em fluidos de lavagem bronquioalveolar.

Os compostos da presente invenção também são eficazes emdoenças associadas à migração e proliferação de células do músculo lisovascular (onde PDGF e PDGF-R geralmente também têm um papel), taiscomo restenose e aterosclerose. Estes efeitos e suas conseqüências para aproliferação ou migração de células do músculo liso vascular in vitro e in vivopodem ser demonstrados pela administração dos compostos da presenteinvenção, e por investigação de seus efeitos no espessamento da íntimavascular subseqüente à lesão mecânica in vivo.

A família trk de receptores de neurotrofina (trkA, trkB, trkC) pro-move a sobrevivência, o crescimento e a diferenciação dos tecidos neuro-nais e não neuronais. A proteína TrkB é expressa em células do tipo neuro-endócrino no intestino delgado e no cólon, nas células alfa do pâncreas, nosmonócitos e macrófagos dos nódulos linfáticos e do baço, e nas camadasgranulares da epiderme (Shibayama & Koizumi1 1996). A expressão da pro-teína TrkB foi associada a uma progressão desfavorável de tumores deWilms e de neuroblastomas. A TkrB é, ademais, expressa em células cance-rosas da próstata, mas não em células normais. A via de sinalização a jusan-te dos receptores de trk envolve a cascata de ativação de MAPK através daShc, da Ras ativada, dos genes ERK-1 e ERK-2, e do caminho de transdu-ção de PLC-gamal (Sugimoto et al., 2001).

A cinase, c-Src transmite sináje oncogênicos de muitos recepto-res. Por exemplo, a superexpressão de EGFR ou HER2/neu em tumoresleva à ativação constitutiva de c-src, que é característica para a célula ma-ligna mas está ausente na célula normal. Por outro lado, camundongos defi-cientes na expressão de c-src apresentam um fenótipo osteopetrótico, indi-cando uma participação fundamental da c-src na função osteoclástica e umpossível envolvimento em distúrbios relacionados.

A cinase da família Tec, Bmx1 uma proteína tirosina cinase nãoreceptora, controla a proliferação de células cancerosas epiteliais mamárias.

Foi demonstrado que o receptor 3 do fator de crescimento defibroblastos exerce um efeito regulador negativo no crescimento óssea euma inibição da proliferação de condrócitos. A displasia tanatofórica é cau-sada por diferentes mutações no receptor 3 do fator de crescimento de fibro-blastos, e uma mutação, TDII FGFR3, possui uma atividade de tirosina cina-se constitutiva que ativa o fator de transcrição Statl, levando à expressão deum inibidor do ciclo celular, à interrupção do crescimento e ao desenvolvi-mento ósseo anormal (Su et al., Nature, 1997, 386, 288-292). FGFR3 geral-mente também é expresso em múltiplos cânceres do tipo mieloma. Inibido-res da atividade de FGFR3 são úteis no tratamento de doenças inflamatóriasou auto-imunes mediadas por células T que incluem porém sem limitaçãoartrite reumatóide (RA), artrite por colágeno II, esclerose múltipla (MS), lúpuseritematoso sistêmico (SLE), psoríase, diabetes de início na juventude, do-ença de Sjogren, doenças da tireóide, sarcoidose, uveíte auto-imune, doen-ça do intestino inflamado (doença de Crohn e colite ulcerativa), doenças ce-líacas e miastenia grave.

Tumores estromatosos gastrointestinais (GISTs) são os tumoresmesenquimatosos mais comuns do trato gastrointestinal humano. Kit, umatirosina cinase receptora codificada pelo proto-oncogene c-kit, é expressapor praticamente todos os GISTs.

A superexpressão de DYRK2 (cinase protéica 2 fosforilada eregulada por tirosina de especificidade dual) ocorre com mais freqüência quea amplificação gênica tanto em adenocarcinomas de esôfago quanto em a-denocarcinomas de pulmão.

A atividade da cinase regulada pelo soro e por glicocorticóides(SGK) está correlacionada a atividades do canal iônico perturbado, em parti-cular, as atividades dos canais de sódio e/ou potássio e os compostos dainvenção podem ser úteis para tratamento de hipertensão.

Lin et al. (1997) J. Clin. Invest. 100, 8: 2072-2078 e P. Lin (1998)PNAS 95, 8829-8834, mostraram uma inibição do crescimento e vasculari-zação tumoral e também uma diminuição em metástases pulmonares duran-te infecções adenovirais ou durante injeções do domínio extracelular de Tie-2 (Tek) em modelos de tumor de mama e de xenoenxerto de melanoma. Ini-bidores de Tie-2 podem ser usados em situações em que a neovasculariza-ção ocorre de forma inadequada (isto é, retinopatia diabética, inflamaçãocrônica, psoríase, sarcoma de Kaposi, neovascularização crônica devido àdegeneração macular, artrite reumatóide, hemangioma infantil e cânceres).

Lck desempenha um papel na sinalização de células T. camun-dongos que não possuem o gene Lck têm pouca probabilidade de desenvol-ver timócitos. A função da Lck como ativador positivo da sinalização de célu-las T sugere que inibidores de Lck podem ser úteis para tratar doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide.

Acredita-se que as JNKs, juntos com outras MAPKs, têm umpapel na mediação da resposta celular para o câncer, agregação plaquetáriainduzida por trombina, distúrbios de imunodeficiência, doenças auto-imunes,morte celular, alergias, osteoporose e doenças cardíacas. Os alvos terapêu-ticos associados à ativação da via de JNK incluem leucemia mielogênicacrônica (CML), artrite reumatóide, asma, osteoartrite, isquemia, câncer e do-enças neurodegenerativas. Como resultado da importância da ativação deJNK associada a doenças hepáticas ou a episódios de isquemia hepática, oscompostos da invenção também podem ser úteis para tratar vários distúrbioshepáticos. Um papel para a JNK em doenças cardiovasculares tais comoinfarto do míocárdio ou insuficiência cardíaca congestiva também foi repor-tado e foi demonstrado que a JNK medeia respostas hipertróficas para vá-rias formas de tensão cardíaca. Já foi demonstrado que a cascata de JNKtambé^n desempenha um papel na ativação de células T, incluindo a ativa-"ção do promotor de IL-2. Portanto, inibidores de JNK podem ter valor tera-pêutico na alteração de respostas imunes patológicas. Também já foi esta-belecido um papel para a ativação de JNK em vários cânceres, sugerindo ouso potencial de inibidores de JNK em câncer. Por exemplo, a JNK ativadaconstitutivamente está associada à tumorigênese mediada por HTLV-1 [On-cogene 13:135-42 (1996)]. A JNK podem desempenhar um papel no de sar-coma Kaposi (KS). Outros efeitos proliferativos de outras citocinas envolvi-das na proliferação de KS, tais como fatores de crescimento endotelial vas-cular (VEGF), IL-6 e TNFa1 também podem ser mediados por JNK. Alémdisso, a regulação do gene c-jun nas células transformadas p210 BCR-ABLcorresponde à atividade de JNK, sugerindo um papel para os inibidores deJNK no tratamento de leucemia mielogênica crônica (CML) [Blood 92:2450-60(1998)].

Acredita-se que certas condições proliferativas anormais estejamassociadas à expressão de raf e, portanto, acredita-se que sejam sensíveisà inibição da expressão de raf. Níveis anormalmente altos de expressão daproteína raf também estão envolvidos na transformação e na proliferaçãocelular anormal. Também se acredita que essas condições proliferativas a-normais sejam sensíveis à inibição da expressão de raf. Por exemplo, acre-dita-se que a expressão da proteína c-raf desempenhe um papel na prolife-ração celular anormal uma vez que foi reportado que 60% de todas as linha-gens celulares de carcinoma pulmonar expressam níveis normalmente altosde mRNA de c-raf e da proteína c-raf. Outros exemplos de condições prolife-rativas anormais são distúrbios hiperproliferativos tais como cânceres, tumo-res, hiperplasia, fibrose pulmonar, angiogênese, psoríase, aterosclerose eproliferação de células do músculo liso nos vasos sangüíneos, tais comoestenose ou restenose subseqüente à angioplastia. A via de sinalização ce-lular da qual a raf faz parte também está envolvido em distúrbios inflamató-rios caracterizados por proliferação de células T (ativação e crescimento decélulas T), tais como rejeição de enxerto de tecido, choque endotóxico, enefrite glomerular, por exemplo.

As proteína cinases ativadas por tensão (SAPKs) são uma famí-lia de proteína cinases que representam a penúltima etapa nas vias detransdução de sinais que resultam na ativação do fator de transcrição c-jun ena expressão de genes regulados por c-jun. Em particular, a c-jun está en-volvida na transcrição de genes que codificam proteínas envolvidas na res-tauração do DNA que é danificado devido a insultos genotóxicos. Por conse-guinte, agentes que inibem a atividade de SAPK em uma célula previnem arestauração de DNA e sensibilizam a célula a agentes que induzem danosao DNA ou inibem a síntese de DNA e induzem a apoptose de uma célula ouque inibem a proliferação celular.

As proteína cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) são mem-bros de vias de transdução de sinais conservadas que ativam fatores detranscrição, fatores de translação e outras moléculas alvo em resposta auma variedade de sinais extracelulares. As MAPKs são ativadas por fosfori-lação em um motivo de fosforilação dual tendo a seqüência Thr-X-Tyr porproteína cinases ativadas por mitógenos (MKKs). Em eucariotas superiores,o papel fisiológico da sinalização de MAPK foi correlacionado com eventoscelulares tais como proliferação, oncogênese, desenvolvimento e diferencia-ção. Por conseguinte, a capacidade de regular a transdução de sinais viaessas vias (particularmente via MKK4 e MKK6) conseguiu levar ao desen-volvimento de tratamentos e terapias preventivas para doenças humanasassociadas à sinalização de MAPK, tais como doenças inflamatórias, doen-ças auto-imunes e câncer.

A família das proteína cinases S6 ribossômicas humanas consis-te em pelo menos 8 membros (RSK1, RSK2, RSK3, RSK4, MSK1, MSK2,p70S6K e p70S6 Kb). As proteína cinases S6 de proteína ribossômica de-sempenham funções pleotrópicas importantes, entre elas encontra-se umpapel essencial na regulação da translação de mRNA durante a biossínteseprotéica (Eur. J. Biochem 2000 November; 267(21): 6321-30, Exp Cell Res.Nov. 25, 1999; 253 (1): 100-9, Mol Cell Endocrinol. May 25, 1999; 151(1-2):65-77). A fosforilação da proteína ribossômica S6 pelo p70S6 tambémestá envolvida na regulação da motilidade celular (Immunol. Cell Biol. 2000August;78(4):447-51) e do crescimento Celular (Prog^Nucleic Acid Res. Mol.Biol., 2000;65:101-27), e portanto, pode ser importante na metástase tumo-ral, na resposta imune e na restauração de tecidos assim como em outrosestados patológicos.

As SAPKs (também chamadas " cinases N-terminais jun" ou"JNK's") são uma família de proteína cinases que representam a penúltimaetapa nas vias de transdução de sinais que resultam na ativação do fator detranscrição de c-jun e na expressão de genes regulados por c-jun. Em parti-cular, a c-jun está envolvida na transcrição de genes que codificam proteínasenvolvidas na restauração do DNA que é danificado devido a insultos geno-tóxicos. Agentes que inibem a atividade de SAPK em uma célula previnem arestauração de DNA e sensibilizam as células às modalidades terapêuticasde câncer que agem induzindo danos no DNA.

A BTK desempenha um papel em doenças auto-imunes e/ouinflamatórias tais como lúpus eritematoso sistêmico-(jSLE), artrite reumatói-de, vasculite múltipla, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), miasteniagrave, e asma. Por causa do papel das BTKs na ativação de células B, inibi-dores de BTK são úteis como inibidores de atividade patogênica mediadapor células B, tais como produção de auto-anticorpos, e são úteis para o tra-tamento de Iinfoma e leucemia de células B.

A CHK2 é um membro da família de cinases fiscalizadoras dasserina/treonina proteína cinases e está envolvida em um mecanismo usadopara fiscalizar danos de DNA, tais como danos causados por mutágenosambientais e por espécies de oxigênio reativo endógeno. Como resultado,ela é considerada um supressor de tumor e um alvo para a terapia de cân-cer.

A CSK influencia o potencial metastático de células de câncer,particularmente câncer de cólon.

A Fes é uma tirosina cinase protéica não receptora que está en-volvida em uma variedade de vias de transdução de sinais de citocina, assimcomo na diferenciação de células mielóides. A Fes também é um componen-te essencial do mecanismo de diferenciação de granulócitos.

A atividade'da tirosina/pinase receptora de 'Flt3 está énvolvidaem Ieucemias e na síndrome mielodisplásica. Em aproximadamente 25%das AML as células leucêmicas expressam uma forma constitutivamente ati-va da tirosina cinase FLT3 autofosforilada (p) na superfície celular. A ativida-de de p-FLT3 confere a vantagem de crescimento e sobrevivência em célu-las leucêmicas. Pacientes com leucemia aguda, cujas células leucêmicasexpressam atividade de cinase p-FLT3, têm pobre conseqüência clínica ge-ral. A inibição da atividade da cinase p-FLT3 induz a apoptose (morte celularprogramada) das células leucêmicas.

Inibidores de IKKa e IKKb (1 & 2) são terápicos para doençasque incluem artrite reumatóide, rejeição de transplante, doença do intestinoinflamado, osteoartrite, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, ateroscle-rose, psoríase, esclerose múltipla, derrame, lúpus eritematoso sistêmico, malde Alzheimer, isquemia cerebral, lesão cerebral traumática, mal de Parkin-son, esclerose lateral amiotrófica, hemorragia subaracnóide ou outras doen-ças ou distúrbios associados à produção excessiva de mediadores inflama-tórios no cérebro e no sistema nervoso central).

A Met está associada à maioria dos tipos dos principais cânce-res humanos e sua expressão geralmente está correlacionada com umprognóstico pobre e com metástase. Inibidores de Met são terápicos paradoenças que incluem cânceres tais como câncer de pulmão, NSCLC (câncerde pulmão não-pequenas células), câncer ósseo, câncer de pâncreas, cân-cer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular,câncer de útero, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, cân-cer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, tumores ginecológicos(por exemplo, sarcomas uterinos, carsinoma das trompas de Falópio, carci-noma do endométrio, carcinoma do cérvice, carcinoma da vagina ou carci-noma da vulva), doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestinodelgado, câncer do sistema endócrino (por exemplo, câncer da tireóide, pa-ratireóide ou glândulas adrenais), sarcomas dos tecidos moles, câncer dauretra, câncer do pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, tu-mores sólidos da infância, Iinfomas linfocíticos, câncer de bexiga, câncer derim οΐι ureter (po^exemplo, carcinoma de células renais, carcinoma da pelverenal), malignidade pediátrica, neoplasmas do sistema nervoso central (porexemplo, Iinfoma primário do SNC, tumores do eixo espinhal, glioma dotronco cerebral ou adenomas pituitários), cânceres do sangue tais como leu-cemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica etc., esôfago de Barrett(síndrome pré-maligna), doenças cutâneas neoplásicas, psoríase, micosesfungóides e hipertrofia benigna da próstata, doenças relacionadas ao diabe-tes tais como retinopatia diabética, isquemia retinal e neovascularização re-tinal, cirrose hepática, doenças cardiovasculares tais como aterosclerose,doenças imunológicas tais como doenças auto-imunes e doenças renais. Depreferência, a doença é câncer tal como leucemia mielóide aguda e câncercolorretal.

A cinase 2 relacionada à Nima (Nek2) é uma cinase protéica re-gulada pelo ciclo celular com atividade máxima no início da mitose que ficalocalizada no centrossomo. Estudos funcionais envolveram a Nek2 na regu-lação da separação do centrossomo e na formação de fusos. A proteínaNek2 é 2 a 5 vezes maior em linhagens celulares derivadas de uma gama detumores humanos que incluem tumores cervicais, ovarianos, prostáticos, eparticularmente mamários.

Distúrbios ou condições mediados por p70S6K incluem, porémsem limitação, distúrbios proliferativos, tais como câncer e esclerose tubero-sa.

De acordo com o acima exposto, a presente invenção forneceainda um método para prevenir ou tratar qualquer uma das doenças ou dis-túrbios descritos acima em um indivíduo com necessidade de tal tratamento,método este que compreende administrar ao referido indivíduo uma quanti-dade terapeuticamente eficaz (vide "Administration and PharmaceuticaiCompositions", infra) de um composto de fórmula I ou de um sal farmaceuti-camente aceitável do mesmo. Para qualquer um dos usos acima, a dosagemnecessária vai variar dependendo do modo de administração, da condiçãoparticular a ser tratada e do efeito desejado.

ADMINISTRAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Em gerai, os compostos da invenção serão administrados emquantidades terapeuticamente eficazes por qualquer um dos modos usuais eaceitáveis conhecidos na literatura, seja isoladamente ou em combinaçãocom um ou mais agentes terapêuticos. Uma quantidade terapeuticamenteeficaz pode variar amplamente dependendo da severidade da doença, daidade e da saúde relativa do indivíduo, da potência do composto usado eoutros fatores. Em geral, está indicado que resultados satisfatórios são obti-dos sistemicamente a dosagens diárias de cerca de 0,03 a 2,5 mg/kg porpeso corporal. Uma dosagem diária indicada em mamíferos superiores, porexemplo humanos, varia na faixa de cerca de 0,5 mg a cerca de 100 mg,convenientemente administrada, por exemplo em doses fracionadas até qua-tro vezes ao dia ou de forma retardada. As formas de dosagem unitária ade-quadas para administração oral compreendem de cerca de 1 a cerca de 50mg do componente ativo.

Os compostos da invenção podem ser administrados comocomposições farmacêuticas por qualquer via convencional, em particular porvia entérica, por exemplo, por via oral, por exemplo, na forma de comprimi-dos ou cápsulas, ou por via parenteral, por exemplo, na forma de soluçõesou suspensões injetáveis, por via tópica, por exemplo, na forma de loções,géis, pomadas ou cremes, ou em uma forma nasal ou na forma de supositó-rio. Composições farmacêuticas compreendendo um composto da presenteinvenção na forma livre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitávelem associação com pelo menos um carreador ou diluente farmaceuticamen-te aceitável podem ser produzidas de maneira convencional por métodos demistura, granulação ou revestimento. Por exemplo, composições orais po-dem ser comprimidos ou cápsulas de gelatina compreendendo o componen-te ativo junto com a) diluentes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose,manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina; b) lubrificantes, por exemplo, sílica,talco, ácido esteárico, seus sal de magnésio ou cálcio e/ou polietilenoglicol;para comprimidos também c) aglutinantes, por exemplo, silicato misto demagnésio e alumínio, pasta de amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose,carboximetilcelulose sódica e/ou polivinilpirrolidona; se desejado d) desinte-grantes, por exemplo, amidos, ágar, ácido algínico ou seu sal/de sódio, oumisturas efervescentes; e/ou e) absorventes, corantes, flavorizantes e ado-çantes. As composições injetáveis podem ser soluções ou suspensões iso-tônicas aquosas, e os supositórios podem ser preparados a partir de emul-sões ou suspensões gordurosas. As composições podem ser esterilizadase/ou conter adjuvantes, tais como agentes preservativos, estabilizantes, u-mectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regular apressão osmótica e/ou tampões. Além disso, elas também podem conteroutras substâncias terapeuticamente valiosas. As formulações adequadaspara aplicações transdérmicas incluem uma quantidade eficaz de um com-posto da presente invenção com um carreador. Um carreador pode incluirsolventes absorvíveis farmacologicamente aceitáveis para auxiliar a passa-gem através da pele do hospedeiro. Por exemplo, os dispositivos transdér-micos estão na forma de uma bandagem compreendendo um membro deforro, um reservatório contendo o composto opcionalmente com carreadores,opcionalmente uma barreira controladora da taxa para distribuir o compostopara a pele do hospedeiro a uma taxa controlada e predeterminada duranteum período de tempo prolongado, e meios para prender o dispositivo à pele.Formulações transdérmicas matriciais também podem ser usadas. Formula-ções adequadas para aplicação tópica, por exemplo, à pele e aos olhos, sãode preferência soluções aquosas, pomadas, cremes ou géis bastante co-nhecidos na literatura. Estas podem conter solubilizantes, estabilizantes, a-gentes aumentadores de tonicidade, tampões e conservantes.

Os compostos da invenção podem ser administrados em quanti-dades terapeuticamente eficazes em combinação com um ou mais agentesterapêuticos (combinações farmacêuticas). Por exemplo, podem ocorrer efei-tos sinergísticos com outras substâncias imunomoduladoras ou antiinflama-tórias, por exemplo, quando usadas em combinação com ciclosporina, ra-pamicina, ou ascomicina, ou análogos imunossupressores das mesmas, porexemplo, ciclosporina A (CsA), ciclosporina G, FK-506, rapamicina, ou com-postos equiparáveis, corticosteróides, ciclofosfamida, azatioprina, metotrexa-to, brequinar, leflunomida, mizoribina, ácido micofenólico, micofenolato mofe-til, 15-desoxispergualina, anticorpos imunossupressores, especialmente an-ticorpos monoclonais para receptores de leucócitos, por exemplo MHC, CD2,CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, CD58 ou seus ligandos, ou outroscompostos imunomoduladores, tais como CTLA41g. Quando os compostosda invenção são administrados em conjunto com outras terapias, as dosa-gens dos compostos coadministrados naturalmente vão variar dependendodo tipo de co-droga empregada, da droga específica empregada, da condi-ção sendo tratada e assim por diante.A invenção também fornece combinações farmacêuticas, porexemplo um kit, compreendendo a) um primeiro agente que é um compostoda invenção descrito neste relatório, na forma livre ou na forma de um salfarmaceuticamente aceitável, e b) pelo menos um co-agente. O kit podecompreender instruções para sua administração.

Os termos "co-administração" ou "administração combinada" ououtros termos utilizados neste relatório abrangem a administração dos agen-tes terapêuticos selecionados a um único paciente, e incluem regimes detratamento nos quais os agentes não são necessariamente administradospela mesma via de administração nem ao mesmo tempo.

O termo "combinação farmacêutica" conforme usado neste rela-tório significa um produto que resulta da mistura ou combinação de mais deum componente ativo e inclui combinações tanto fixas quanto não fixas doscomponentes ativos. O termo "combinação fixa" significa que os componen-tes ativos, por exemplo um composto de fórmula I e um co-agente, são am-bos administrados a um paciente simultaneamente na forma de uma únicaentidade ou dosagem. O termo "combinação não fixa" significa que os com-ponentes ativos, por exemplo um composto de> fórmula I e um co-agente,são ambos administrados a um paciente como entidades separadas sejasimultaneamente, concorrentemente ou seqüencialmente sem limites detempo específicos, onde tal administração proporciona níveis terapeutica-mente eficazes dos 2 compostos no corpo do paciente. Esta última aplica-seà terapia com coquetel, por exemplo a administração de 3 ou mais compo-nentes ativos.

PROCESSOS PARA FAZEB OS COMPOSTOS DA INVENÇÃO

A presente invenção também inclui processos para a preparaçãodos compostos da invenção. Nas reações descritas, pode ser necessárioproteger grupos funcionais reativos, por exemplo grupos hidróxi, amino, imi-no, tio ou carbóxi, onde estes são desejados no produto final, para evitar suaparticipação indesejada nas reações. Grupos protetores convencionais po-dem ser usados de acordo com a prática tradicional, por exemplo, vide T.W.Greene & P. G. M. Wuts em "Protective Groups in Organic Chemistry", JohnWiley & Sons, 1991.

Os compostos de fórmula Ia podem ser preparados procedendo-se da maneira apresentada no esquema reacional I a seguir:

ESQUEMA REACIONAL I

<formula>formula see original document page 24</formula>

nos quais n, X1, R1 e R^ são como definidos na seção Sumário da Invenção.Um composto de fórmula I pode ser sintetizado por reação de um compostode fórmula 2 na presença de um solvente adequado (por exemplo, DMF, esimilares), um reagente de acoplamento adequado (por exemplo, HATU, eoutros) e uma base adequada (por exemplo, DlEA, e outros). A reação ocor-re em uma faixa de temperatura de cerca de O0C a cerca de 40°C e podelevar até cerca de 10 horas para terminar.

Exemplos detalhados da síntese de um composto de fórmula Ipodem ser encontrados nos Exemplos, infra.

PROCESSOS ADICIONAIS PARA FAZER OS COMPOSTOS DA INVEN-CÃO

Um composto da invenção pode ser preparado como um sal deadição de ácido farmaceuticamente aceitável por reação da forma de baselivre do composto com um ácido inorgânico ou orgânico farmaceuticamenteaceitável. Alternativamente, um sal de adição de base farmaceuticamenteaceitável ^e um composto da invenção pode ser preparado por reação daforma de ácido livre do composto com uma base inorgânica ou orgânica far-maceuticamente aceitável.

Alternativamente, as formas de sal dos compostos da invençãopodem ser preparadas usando sais dos materiais de partida ou dos interme-diários.

As formas de ácido livre ou de base livre dos compostos da in-venção podem ser preparadas a partir do sal de adição de base ou do sal deadição de ácido correspondente, respectivamente. Por exemplo, um com-posto da invenção na forma de um sal de adição de ácido pode ser converti-do na base livre correspondente por tratamento com uma base adequada(por exemplo, solução de hidróxido de amônio, hidróxido de sódio, e simila-res). Um composto da invenção na forma de um sal de adição de base podeser convertido no ácido livre correspondente por tratamento com um ácidoadequado (por exemplo, ácido clorídrico etc.).

Os compostos da invenção na forma não oxidada podem serpreparados a partir de N-óxidos dos compostos da invenção por tratamentocom um agente redutor (por exemplo, enxofre, dióxido de enxofre, trifenilfos-fina, borohidreto de lítio, borohidreto de sódio, tricloreto de fósforo, tribrome-to, ou outros) em um solvente orgânico inerte adequado (por exemplo aceto-nitrila, etanol, dioxano aquoso, ou outros) a uma temperatura de O a 80°C.

Derivados do tipo pró-droga dos compostos da invenção podemser preparados por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica (porexemplo, para maiores detalhes vide Saulnier et al., (1994), Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters, Vol. 4, pág. 1985). Por exemplo, pró-drogasapropriadas podem ser preparadas por reação de um composto não deriva-do da invenção com um agente carbamilantes adequado (por exemplo, clori-drato de 1,1-aciloxialquilcarbano, carbonato de para-nitrofenil, ou similares).

Derivados protegidos dos compostos da invenção podem serfeitos por meios conhecidos pelos especialistas na técnica. Uma descriçãodetalhada de técnicas aplicáveis à criação de grupos protetores e sua remo-ção pode ser encontrada em T. W. Greene, "Protecting Groups in OrganicChemistry", 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999.

Os compostos da presente invenção podem ser conveniente-mente preparados, ou formados durante o processo da invenção, como sol-vatos (por exemplo, hidratos). Hidratos dos compostos da presente invençãopodem ser convenientemente preparados por recristalização a partir de ummistura de solventes aquosos/orgânicos, usando solventes orgânicos taiscomo dioxina, tetrahidrofurano ou metanol.

Os compostos da invenção podem ser preparados como seusestereoisômeros individuais por reação de uma mistura racêmica do com-posto com um agente de resolução oticamente ativo para formar um par decompostos diastereoisoméricos, separar os diastereômeros e recuperar osenantiômeros oticamente puros. Embora a resolução de enantiômeros possaser efetuada usando derivados diastereoméricos covalentes dos compostosda invenção, complexos dissociáveis são preferidos (por exemplo, sais dias-tereoméricos cristalinos). Diastereômeros possuem propriedades físicas dis-tintas (por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, solubilidades, rea-tividade etc.) e podem ser facilmente separados tirando-se vantagem de su-as diferenças. Os diastereômeros podem ser separados por cromatografia,ou de preferência, por técnicas de separação/resolução baseadas em suasdiferenças de solubilidade. O enantiômero oticamente puro é então recupe-rado, junto com o agente de resolução, por qualquer meio prático que nãoresulte em racemização. Uma descrição mais detalhada das técnicas aplicá-veis à resolução de estereoisômeros dos compostos a partir de sua misturaracêmica pode ser encontrada em Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H.Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley & Sons, Inc.,1981.

Em resumo, os compostos de fórmula I podem ser feitos por umprocesso, que envolve:

(a) aquele do esquema reacional I; e

(b) opcionalmente conversão de um composto da invenção emum sal farmaceuticamente aceitável:

(c) opcionalmente conversão de uma forma de sal de um com-posto da invenção em uma forma não sal;

(d) opcionalmente conversão de uma forma não oxidada de umcomposto da invenção em um N-óxido farmaceuticamente aceitável;

(e) opcionalmente conversão de uma forma de N-óxido de umcomposto da invenção em sua forma não oxidada;

(f) opcionalmente conversão de um isômero individual de umcomposto da invenção a partir de uma mistura de isômeros;

(g) opcionalmente conversão de um composto não derivado dainvenção em um derivado do tipo pró-droga farmaceuticamente aceitável; e

(h) opcionalmente conversão de um derivado do tipo pró-drogade um composto da invenção em sua forma não derivada.

Onde a produção dos materiais de partida não está particular-mente descrita, os compostos são conhecidos ou podem ser preparados demaneira análoga a métodos conhecidos na literatura ou apresentados nosExemplos a seguir.

O versado na técnica vai perceber que as transformações acimasão apenas representativas de métodos para a preparação dos compostosda presente invenção, e que outros métodos bastante conhecidos podem serigualmente usados.

EXEMPLOS

A presente invenção é ainda exemplificada, porém não limitada,pelos exemplos a seguir que ilustram a preparação de compostos de fórmulaI de acordo com a invenção.

EXEMPLO 1

[3-(3-TRIFLUORMETIL-FENILCARBAMOIL)-FENIL1-AMIDA DO ÁCIDO 6H-1-TIA-5.6-DIAZA-AS-INDACENO-2-CARBOXÍLICO

<formula>formula see original document page 27</formula>

SÍNTESE DE 4-CL0R0-1 -TRIISOPROPILSILANIL-1 H-PIRROL[2.3-B]PIRIPINA:

<formula>formula see original document page 27</formula>

A uma solução de 4-cloro-1/-/-pirrol[2,3-£>]piridina (3,21 g, 21mmols) em THF (60 ml), resfriada a -78°C, é adicionado lentamente n-BuLi(1,6 M em hexano, 13,8 ml, 22 mmols). Depois de agitar por 30 minutos, oTIPSOTf (5,77 ml, 21,4 mmols) é adicionado. A temperatura da mistura édeixada aumentar até a temperatura ambiente e é resfriada bruscamentecom água. A mistura é distribuída entre hexanos (200 ml) e salmoura. Osextratos orgânicos são lavados com salmoura, secados em Na2SO4, filtradose concentrados. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna (sílica-gel, eluindo com hexanos) para dar o composto título: 1H RMN 600 MHz (A-cetona-oí6) δ 8,19 (d, 1H, J = 5,4 Hz), 7,57 (d, 1H, J = 3,0 Hz), 7,18 (d, 1H, J=5,4 Hz), 6,69 (d, 1H, J= 3,0 Hz), 1,92 (sept, 3H, J= 7,2 Hz ), 1,12 (d, 18H,J = 7,2 Hz); MS m/z 309,2 (M + 1).

SÍNTESE DE 4-CLORO-1 -TRIISOPROPILSIIi.ANIL-1 /-/-PIRROLÍ2,3-B]PIRIDINA-5-CARBALDEÍDO:

<formula>formula see original document page 28</formula>

A uma solucao de 4-cloro-1-triisopropilsilanil-1H-pirrol [2,3-b]piridina (0,90 g, 2,91 mmols) em THF (8 ml), resfriada a -78°C, é adiciona-do lentamente sec-BuLi (1,4 M em hexano, 4,16 ml, 5,82 mmols). Depois deagitar por 45 minutos, a DMF (0,68 ml, 8,74 mmols) é adicionada a -78°C. Amistura é agitada por 1 hora e resfriada bruscamente com HCI em soluçãode éter (1 M, 8,73 ml, 8,73 mmols). A mistura é deixada esquentar até atemperatura ambiente. A mistura reacional é basificada com solução satura-da de bicarbonato de sódio até um pH de 8 e extraída com etil acetato. Osextratos orgânicos são lavados com salmoura, secados em Na2SO4, filtradose concentrados até dar a mistura dos compostos título, que é usada na rea-ção seguinte sem purificação posterior: MS m/z 337,2 (M + 1).

SÍNTESE DE 4-METILAMINO-1H-PIRROLf2.3-B1PIRIDINA-5-CARBAL-DEÍDO:

<formula>formula see original document page 28</formula>

Uma mistura de 4-cloro-1H-pirrol[2,3-£>]piridina-5-carbaldeído e4-cloro-1-triisopropilsilanil-1/-/-pirrol[2,3-t»]piridina-5-carbaldeído (2,0 g, daetapa acima), metilamina (solução a 40 % em água, 16 ml, 100 mmols) emmetoxi-etanol (4 ml) é aquecida a 110°C em um tubo vedado por uma noite.A mistura reacional é resfriada para a temperatura ambiente e concentrada.O resíduo é dissolvido e concentrado. O resíduo é dissolvido em solução deHCI (1 N, 20 ml) e aquecido a 50°C. Depois de agitar por 1,5 hora a 50°C, amistura reacional é neutralizada com solução saturada de bicarbonato desódio até um pH de 8. O sólido é recolhido por filtração e lavado com água,em seguida com hexanos, e secado para dar o composto título como umsólido amarelo claro: MS m/z 176,1 (M + 1).

SÍNTESE DE ÉSTER METÍLICO DO ÁCIDO 6H-1-TIA-5.6-DIAZA-AS-INDACENO-2-CARBOXÍLICO:

4-cloro-1-triisopropilsilanil-1/-/-pirrol[2,3-ò]piridina (900 mg, 2,14mmols) é dissolvida em DMF. Depois da adição de K2CO3 (590 mg, 4,28mmols) seguido de tioglucidol (0,2 ml, 2,35 mmols) a mistura reacional é agi-tada a 65°C por 3,5 horas. A mistura reacional é então resfriada e despejadaem água gelada. O resíduo é recolhido por filtração e secado. O produto bru-to é então purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel para dar umcomposto amorfo esbranquiçado: 1H RMN 400 MHz (DMSO-Gf6) δ 12,21 (s,1H), 8,90 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,59 (d, 1H, J= 3,0 Hz), 6,79 (d, 1H, J = 3,1Hz), 3,91 (s, 3H); MS m/z 233,1 (M + 1).

SÍNTESE DE ÁCIDO 6H-1-TIA-5,6-DIAZA-AS-INDACENO-2-CARBO-XÍLICO:

Uma mistura de éster metílico do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-inÒaceno-2-carboxílico (100 mg, 0,43 mmol), LiOH (25,5 mg, 1,07 mmol) édissolvida em THF (4 ml) e H20 (1 ml). A mistura é agitada a 60°C por 3 ho-ras. Acidificação com ácido acético resulta em um sólido castanho que é re-colhido por filtração. Ele é então secado a vácuo e usado na etapa seguintesem purificação posterior.

SÍNTESE DE í3-(3-TRIFLUORMETIL-FENILCARBAMOIL)-FENILl-AMIDADO ÁCIDO 6H-1-TIA-5.6-DIAZA-AS-INDACENO-2-CARBOXÍLICO

Ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílÍco (30 mg,0,138 mmol) é misturado com DIEA (0,030 ml, 0,172 mmol) e HATU (57,71mg, 0,151 mmol) em 2 ml de DMF à temperatura ambiente. 3-Amino-N-(3-trifluormetil-fenil)-benzamida (38,6 mg, 0,138 mmol) é adicionada à misturareacional 0,5 hora depois. Depois de agitar à temperatura ambiente por 2horas, a mistura reacional é concentrada e purificada por Prep-HPLC paradar o composto título como um sal de TFA: 1H RMN 400 MHz (DMSO-Gf6) δ12,09 (s, 1H), 10,70, (s, 1H), 10,55 (s, 1H), 8,84 (s, 1 fcj), 8,29 (s, 1H), 8,19 (s,1H), 8,03-7,97 9 (m, 2H), 7,69 {d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,57-7,49 (m, 3H), 7,40 (d,1H, J= 7,6 Hz), 6,72 (dd, 1H, J =3,2, 1,6 Hz; MS m/z 481,1 (M + 1).

EXEMPLO 2

[3-(3-TRIFLUORMETIL-BENZOILAMINO)-FENILl-AMIDA DO ÁCIDO 1-M ETIL-1.6-DIHIDRO-1,5.6-TRIAZA-AS-INDACENO-2-CARBOXÍLICO

<formula>formula see original document page 30</formula>

SÍNTESE DE ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 1-METIL-1.6-DIHIDRO-1.5.6-TRIAZA-AS-INDACENO-2-CARBOXÍLICO:

<formula>formula see original document page 30</formula>

4-cloro-1-triisopropilsilanil-1/-/-pirrol[2,3-ò]piridina (700 mg, 2,08mmols) é dissolvida em DMF. Depois da adição de K2CO3 (573 mg, 4,16mmols) seguida de cloridrato de éster etílico de sarcosina (383,3 mg, 2,49mmoló) a mistura reacional é agitada a 65°C por 36 horas. A mistutfk reacio-nal é então resfriada e despejada em água gelada. O resíduo é recolhido porfiltração e é secado para dar o produto bruto que é purificado por cromato-grafia em coluna de sílica-gel para dar o composto desejado: 1H RMN 400MHz (DMSO-d6) δ 12,41 (s, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 7,75 (d, 1H, J =3,0 Hz), 6,73 (d, 1H, J= 3,1 Hz), 4,32 (q, 2H, J= 6,8 Hz), 4,28 (s, 3H), 1,35(f, 3H, J= 6,8 Hz); MS m/z 244,1 (M + 1).

SÍNTESE DE ÁCIDO 1-METIL-1.6-DIHIDRO-1.5.6-TRIAZA-AS-INDACENO-2-CARBOXILICO

<formula>formula see original document page 31</formula>

Uma mistura de éster metílico do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico (100 mg, 0,464 mmol), LiOH (25,5 mg, 1,07 mmol) édissolvida em THF (4 ml) e H20 (1 ml). A mistura é agitada a 60°C por 3 ho-ras. Acidificação com ácido acético resulta em um sólido castanho que é re-colhido por filtração. Ele é então a vácuo e usado na etapa seguinte sempurificação posterior.

SÍNTESE r3-(3-TRIFLUORMETIL-BENZOILAMINO)-FENIU-AMIDA DO Á-CIDO DE 1 -METIL-1,6-DIHIDRO-1,5.6-TRIAZA-AS-INDACENO-2-CAR-BOXÍLICO

<formula>formula see original document page 31</formula>

Ácido 1 -Metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno-2-carboxílico(35 mg, 0,162 mmol) é misturado com DIEA (0,030 ml, 0,172 mmol) e HATU(67,8 mg, 0,178 mmol) em 2 ml de DMF à temperatura ambiente. N-(3-Amino-fenil)-3-trifluormetil-benzamida (45,53 mg, 0,162 mmol) é adicionadaà mistura reacional 0,5 hora depois. Depois de agitar à temperatura ambien-te por 2 horas, a mistura reacional é concentrada e purificada por* Prep-HPLC para dar o composto título como um sal de TFA: 1H RMN 400 MHz(DMSO-Qi6) δ 12,37 (s, 1H), 10,56, (s, 2H), 8,87 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,33 (s,1H), 8,29 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,98 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,84 (t, 1H, J = 8,0Hz), 7,68 (s, 1H), 7,57-7,54 (m, 3H), 7,37 (t, 1H, J= 8,0 Hz), 7,09-7,07 (m,1H), 4,32 (s, 3H) Hz; MS m/z 481,1 (M + 1).

Repetindo os procedimentos descritos nos exemplos acima, u-sando materiais de partida apropriados, são obtidos os seguintes compostosde fórmula I1 definidos na Tabela 1.

TABELA 1

<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 0</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>

ENSAIOS

Os compostos da presente invenção são testados para medirsua capacidade de inibir seletivamente a proliferação celular de células 32Dexpressando BCR-AbI (32D-p210) em comparação com células 32D primiti-vas. Compostos que inibem seletivamente a proliferação destas célulastransformadas com BCR-AbI são testados quanto à atividade antiproliferativaem células Ba/F3 expressando o tipo selvagem ou as formas mutantes deBcr-abl. Além disso, os compostos são testados para medir sua capacidadede inibir as cinases Abi, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK1 Tie-2, Trk-B, FGFR3, c-kit,b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e PDGFRa e PDGFRp.INIBICÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR DEPENDENTE DE BCR-ABL(MÉTODO DE ALTO RENDIMENTO)

A linhagem celular murina usada é a linhagem celular progenito-ra hemopoiética 32D transformada com BCR-AbI cDNA (32D-p210). Estascélulas são mantidas em RPMI/10% de soro de bezerro fetal (RPMI/FCS)suplementado com penicilina 50 mg/ml, estreptomicina 50 mg/ml eL-glutamina 200 mM. Células 32D não transformadas são igualmente manti-das com a adição de de 15% de meio condicionado com WEHI como fontede IL3.

50 ml de uma suspensão de células 32D ou 32D-p210 são pla-queados em microplacas (pretas) de Greiner de 384 cavidades a uma densi-dade de 5000 células por cavidade. 50 nl de composto de teste (1 mM emsolução de estoque em DMSO) são adicionados a cada cavidade (STI571 éincluído como controle positivo). As células são incubadas por 72 horas a 37°C, 5% de CO2. 10 ml de uma solução de Alamar Blue a 60% (Tek diagnos-tics) são adicionados a cada cavidade e as células são incubadas por mais24 horas. A intensidade de fluorescência (excitação a 530 nm, emissão a580 nm) é quantificada usando o sistema Acquest® (Molecular Devices).INIBICÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR DEPENDENTE DE BCR-ABL '

Células 32D-p210 são plaqueadas em placas TC de 96 cavida-des a uma densidade de 15.000 células por cavidade. 50 ml de diluiçõesconsecutivas 1 para 2 do composto de teste (Cmax é 40 mM) são adicionadosa cada cavidade (STI571 é incluído como controle positivo). Depois de incu-bar as células por 48 horas a 37 °C, 5% de CO2, 15 ml de MTT (Promega)são adicionados a cada cavidade e as células são incubadas por mais 5 ho-ras. A densidade ótica a 570 nm é quantificada por espectrofotometria e osvalores de IC5o, a concentração de composto necessária para 50% de inibi-ção, são determinados a partir de uma curva dose resposta.

EFEITO NA DISTRIBUIÇÃO DO CICLO CELULAR

Células 32D e 32D-p210 são plaqueadas em placas TC de 6cavidades a 2,5 χ 106 células por cavidade em 5 ml de meio e o compostode teste a 1 ou 10 mM é adicionado (STI571 é incluído como controle). Ascélulas são então incubadas por 24 ou 48 horas a 37 0C, 5% de CO2. 2 mlde suspensão de células são lavados com PBS, fixados em 70% de EtOHpor 1 hora e tratados com PBS/EDTA/RNase A por 30 minutos. Iodeto depropídio (Cf= 10 mg/ml) é adicionado e a intensidade de fluorescência équantificada por citometria de fluxo no sistema FACScalibur® (BD Bioscien-ces). Os compostos de teste da presente invenção demonstram um efeitoapoptótico nas células 32D-p210, mas não induzem apoptose nas célulasprimitivas 32D.

EFEITO NA AUTOFOSFORILAÇÃO DE BCR-ABL CELULAR

A autofosforilação de BCR-AbI é quantificada com ELISA decaptura usando um anticorpo de captura específico para c-abl e um anticor-po antifosfotirosina. Células 32D-p210 são plaqueadas em placas TC de 96cavidades a 2 χ 105 células por cavidade em 50 ml de meio. 50 ml de dilui-ções consecutivas 1 para 2 do composto de teste (Cmax é 10 mM) são adi-cionados a cada cavidade (STI571 é incluído como controle positivo). Ascélulas são incubadas por 90 minutos a 37 °C, 5% de CO2. As células sãoentão tratadas por 1 hora em gelo com 150 ml de tampão de Iise (50 mM deTris-HCI, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 5 mM de EDTA1 1 mM de EGTA e 1% deNP-40) contendo inibidores de protease e fosfatase. 50 ml de Iisado/celularsão adicionados a optiplacas de 96 cavidades previamente revestidas comanticorpo específico anti-abl e bloqueadas. As placas são incubadas por 4horas a 4°C. Depois de lavagem com o tampão TBS-Tween 20, 50 ml deanticorpo antifosfotirosina conjugado com fosfatase alcalina são adicionadose a placa é ainda incubada por uma noite a 4°C. Depois de lavagem com otampão TBS-Tween 20, 90 ml de um substrato luminescente são adiciona-dos e a luminescência é quantificada usando o sistema Acquest® (MolecularDevices). Os compostos de teste da invenção que inibem a proliferação dascélulas expressando BCR-Abl, inibem a autofosforilação de BCR-Abl celularde maneira dependente da dose.

EFEITO NA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS EXPRESSANDO FORMASMUTANTES DE BCR-ABL

Os compostos da invenção são testados quanto ao seu efeitoantiproliferativo em células Ba/F3 expressando o tipo selvagem ou as formasmutantes de BCR-Abl (G250E, E255V, T315I, F317L, M351T) o que confereresistência ou sensibilidade diminuída a STI571. O efeito antiproliferativodesses compostos nas células mutantes expressando BCR-Abl e nas célulasnão transformadas foi testado a 10, 3,3, 1,1 e 0,37 mM da maneira descritaacima (em meio sem IL3). Os valores de IC50 dos compostos sem toxicidadenas células não transformadas foram determinados a partir das curvas doseresposta obtidas da maneira descrita acima.

FGFR3 (ENSAIO ENZIMÁTICO)

O ensaio de atividade de cinase com FGFR3 purificado (Upsta-te) é realizado em um volume final de 10 μl contendo 0,25 μg/ml de enzimaem tampão de cinase (30 mM de Tris-HCI pH7,5, 15 mM de MgCI2, 4,5 mMde MnCl2, 15 μΜ de Na3VO4 e 50 μg/ml de BSA), e substratos (5 μg/ml debiotina-poli-EY(Glu, Tyr) (CIS-US, Inc.) e 3 mM de ATP). São feitas duas so-luções: a primeira solução de 5 ml contém a enzima FGFR3 em tampão decinase primeiro foi dispensada em ProxiPlate® de 384 cavidades (Perkin-Elmer) seguida de 50 nl de compostos dissolvidos em DMSO, e em seguida5 ml da segunda solução contêm o substrato (poli-EY) e ATP no tampão decinase foram adicionados a cada cavidade. As reações são incubadas àtemperatura ambiente por uma hora, interrompidas pela adição de 10 μl demistura de detecção de HTRF, que contém 30 mM de Tris-HCl pH7,5, 0,5 Mde KF1 50 mM de ETDA, 0,2 mg/ml de BSA, 15 pg/ml de estreptavidina-XL665 (CIS-US, Inc.) e 150 ng/ml de anticorpo antifosfotirosina conjugado acriptato (CIS-US, Inc.). Depois de uma hora de incubação à temperaturaambiente para possibilitar a interação estreptavidina-biotina, os sinais fluo-rescentes resolvidos no tempo são ligados em um Analyst GT (MolecularDevices Corp.)· Os valores de IC5o são calculados por análise de regressãolinear da percentagem de inibição de cada composto em 12 concentrações(diluição 1:3 de 50 μΜ a 0,28 nM). Neste ensaio, os compostos da invençãotêm um IC50 na faixa de 10 nM a 2 μΜ.

FGFR3 (ENSAIO CELULAR)

Os compostos da invenção são testados quanto a sua capacida-de de inibir a proliferação de células Ba/F3-TEL-FGFR3 transformadas, quedepende da atividade da atividade da cinase celular FGFR3. Ba/F3-TEL-FGFR3 são cultivadas até 800.000 células/ml em suspensão, com RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal como o meio de cultura.

As células são dispensados em placas de 384 cavidades a 5000 célu-las/cavidade em 50 μΙ de meio de cultura. Os compostos da invenção sãodissolvidos e diluídos em dimetil sulfóxido (DMSO). Diluições consecutivas1:3 de doze pontos são feitas em DMSO para criar um gradiente de concen-trações variando tipicamente de 10 mM a 0,05 μΜ. As células são acrescen-tadas com 50 nl de compostos diluídos e incubadas por 48 horas em umaincubadora de cultura de células. AlamarBIue® (TREK Diagnostic Systems),que pode ser usado para monitor o ambiente redutor caiado por células proli-ferantes, é adicionado às células a uma concentração de 10%. Depois demais quatro horas de incubação em uma incubadora de cultura de células a37°C, os sinais de fluorescência do reduzido AlamarBIue® reduzido (excita-ção a 530 nm, emissão a 580 nm) são quantificados em um Analyst GT (Mo-lecular Devices Corp.). Os valores de IC5o são calculados por análise de re-gressão linear da percentagem de inibição de cada composto em 12 concen-trações.

FLT3 E PDGFRb (ENSAIO CELULAR)

Os efeitos dos compostos da invenção na atividade celular deFLT3 e PDGFRp são conduzidos usando métodos idênticos aos descritosacima para a atividade celular de FGFR3, exceto que em vez de usar Ba/F3-TEL-FGFR3, são usados Ba/F3-FLT3-ITD e Ba/F3-Tel-PDGFRp, respecti-vamente.

b-RAF - ENSAIO ENZIMÁTICOOs compostos da invenção são testados quanto a sua capacida-de de inibir a atividade de b-Raf. O ensaio é realizado em placas MaxiSorpde 384 cavidades (NUNC) com paredes pretas e fundo transparente. Osubstrato, IkBa é diluído em DPBS (1:750) e 15 ml são adicionados a cadacavidade. As placas são incubadas a 4°C por uma noite e lavadas 3 vezescom TBST (25 mM de Tris1 pH 8,0, 150 mM de NaCI e 0,05% de Tween-20)usando a lavadora de placas EMBLA. As placas são bloqueadas por Super-block (15 ml/cavidade) por 3 horas à temperatura ambiente, lavadas 3 vezescom TBST e secadas com tapinhas. Tampão de ensaio contendo 20 mM deATP (10 ml) é adicionado a cada cavidade seguido de 100 n, ou 500 nl decomposto. b-Raf é diluído no tampão de ensaio (1 ml em 25 ml) e 10 ml deb-Raf diluído é adicionado a cada cavidade (0,4 mg/cavidade). As placas sãoincubadas à temperatura ambiente por 2,5 horas. A reação com cinase éinterrompida por lavagem das placas 6 vezes. O anticorpo Phosph-IkBa(Ser32/36) é diluído em Superblock (1:10,000) e 15 ml são adicionados acada cavidade. As placas são incubadas a 4°C por uma noite e lavadas 6vezes com TBST. IgG anticamundongo de cabra conjugado a AP é diluídaem Superblock (1:1,500) e 15 ml são-adicionados a cada cavidade. As pla-cas são incubadas à temperatura ambiente por 1 hora e lavadas 6 vezescom TBST. 15 ml do substrato Attophos AP fluorescente (Promega) são adi-cionados a cada cavidade e as placas são incubadas à temperatura ambien-te por 15 minutos. As placas são lidas em um Acquest ou Analyst GT usandoum Programa de Intensidade de Fluorescência (excitação 455 nm, emissão-580 nm).

b-RAF - ENSAIO.CELULAR '

Os compostos da invenção são testados em células A375 quan-to a sua capacidade de inibir a fosforilação de MEK. A linhagem celular A375(ATCC) deriva de um paciente com melanoma humano e tem uma mutaçãoV599E no gene b-Raf. Os níveis de MEK fosforilado são elevados devido àmutação do b-Raf. Células A375 subconfluentes a confluentes são incuba-das com compostos por 2 horas a 37°C em meio livre de soro. As célulassão então lavadas uma vez com PBS frio e Iisadas com o tampão de Iisecontendo 1% de Triton X100. Depois de centrifugação, os sobrenadantessão submetidos à SDS-PAGE, e em seguida transferidos para membranasde nitrocelulose. As membranas são submetidas à análise da mancho dooeste com anticorpo anti-fosfo-MEK (ser217/221) (Cell Signaling). A quanti-dade de MEK fosforilado é monitorada pela densidade das faixas de fosfo-MEK nas membranas de nitrocelulose.

UPSTATE KINASEPROFILER® - ENSAIO RADIOENZIMÁTICO DE LIGA-ÇÃO EM FILTRO

Os compostos da invenção são avaliados quanto a sua capaci-dade de inibir membros individuais da lista de cinases. Os compostos sãotestados em duplicata a uma concentração final de 10 mM seguindo-se esteprotocolo genérico. Observe que a composição do tampão de cinase e ossubstratos variam para as diferentes cinases incluídas na lista do "UpstateKinaseProfiler®н. Tampão de cinase (2,5 ml, 10x - contendo MnCI2 quandonecessário), cinase ativa (0,001-0,01 Unidade; 2,5ml), peptídio específico ouPoli(Glu4-Tyr) (5-500 mM ou 0,01 mg/ml) em tampão de cinase e tampão decinase (50 mM; 5 ml) são misturados em um eppendorf em gelo. Uma mistu-ra Mg/ATP (10 ml; 67,5 (ou 33,75) mM de MgCI2, 450 (ou 225) mM de ATP e1 mCi/ml de [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (3000 Ci/mmol)) é adicionada e a reação é incubadaa cerca de 30°C por cerca de 10 minutos. A mistura reacional é colocada (20ml) em um bloco de papel de 2 cm χ 2 cm P81 (fosfocelulose, para substra-tos peptídicos positivamente carregados) ou Whatman N01 (para o substratopeptídico Poli (Glu4-Tyr). Os blocos do ensaio são lavados 4 vezes, por 5minutos cada, com 0,75% de ácido fosfórico e lavados uma vez com acetonapor 5 minutos. Os blocos do ehsaio são transferidos para um frasco de cinti-lação, 5 ml de coquetel de cintilação são adicionados e a incorporação de32P (cpm) ao substrato peptídico é quantificada com um contador de cintila-ção Beckman. A percentagem de inibição é calculada para cada reação.

Os compostos de fórmula I, na forma livre ou na forma de salfarmaceuticamente aceitável, apresentam propriedades farmacológicas vali-osas, por exemplo, como as indicadas pelas testes in vitro descritos nestepedido. Por exemplo, os compostos de fórmula I de preferência mostram umIC5O na faixa de 1 χ 10"10 a 1 χ 10"5 M, de preferência menor que 500 nM, 250nM, 100 nM e 50 nM para BCR-AbI do tipo selvagem e para os mutantesG250E, E255V, T315I, F317L e M351T BCR-Abl. Os compostos de fórmula Ide preferência, a uma concentração de 10 mM, de preferência apresentamuma percentagem de inibição maior que 50%, de preferência maior que cer-ca de 70%, contra as cinases Abi, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK, Tie-2, Trk-B, FG-FR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e PDGFRa e/ou PDGFRp.

Deve ficar entendido que os exemplos e as modalidades descri-tas nesta invenção são ilustrativas apenas e que várias modificações ou alte-rações à luz desta invenção serão sugeridas aos versado na técnica e estãoincluídas dentro do espírito e escopo das reivindicações anexas. Todas aspublicações, patentes, e pedidos de patentes citados nesta invenção estãoaqui incorporados a título de referência para todos os fins.

Claims (9)

1. Composto de fórmula I: <formula>formula see original document page 45</formula> no qual:Xi é selecionado de CH e N;Y é selecionado de S e NR5; onde R5 é selecionado de hidrogê-nio e Ci-6alquila;Z é selecionado de C e S(O);Ri é selecionado de hidrogênio e Ci-6alquila;R2 é selecionado de C6-i2arila e -NR3R4;R3 é selecionado de hidrogênio e Ci-6alquila;R4 é -XR5; onde X é selecionado de uma ligação, Ci-6alquileno eCi-ioheterarileno; onde R5 é selecionado de C6.i0arila e Ci-i0heteroarila;onde a referida arila ou heteroarila de R5 é opcionalmente substi-tuído com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de Ci-6alquila, Ci--6alquil halo-substituído, C3-8heterocicloalquila, -C(O)NR6R? e -NR6C(O)R7;onde R6 ê selecionado de hidrogênio e Ci.6alquila; e R7 é selecionado de C6.ioarila e Ci-ioheteroarila;onde a referida arila ou heteroarila de R7 é opcionalmente substi-tuído com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de -R6 e -ORe;onde R8 é selecionado de Ci-6alquila, Ci-6alquil halo-substituído, C6-^arila1Ci-ioheteroarila e C3-8heterocicloalquil-Co-4alquila; onde as referidas substitu-intes arila, heteroarila e heterocicloalquila d#R8 são opcionalmente substitu-ídas com Cveialquila;ou R3 e R4, junto com os átomos aos quais R3 e R4 estão presos,formam C3.8heterocicloalquila opcionalmente substituído Com-C(O)NR6R9;onde R6 é selecionado de hidrogênio e Ci.6alquila; e R9 é selecionado de C6.ioarila e Ci.-ioheteroarila; e os sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1 de fórmula Ia:<formula>formula see original document page 46</formula>no qualX1 é selecionado de CH e N;Y é selecionado de S e NR5; onde R5 é selecionado de hidrogê-nio e C1-6alquila;n é selecionado de 0, 1 e 2;R1 é selecionado de hidrogênio e Ct-ealquila; eR12 é selecionado de hidrogênio, C1-6alquila, C1-6alquila halo-substituído, C3-8heterocicloalquila, -C(O)NR6Ry e -NR6C(O)R7; onde R6 éselecionado de hidrogênio e Ci-6alquila; e R7 é selecionado de C6-Ioarila eC1-i0heteroarila;onde a referida arila ou heteroarila de R7 é opcionalmente substi-tuído com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de -R8 e -OR8;onde R8 é selecionado de Ci.6alquila, -Ci-6alquil halo-substituído, C6-^arila1C1-Ioheteroarila e C3.8heterocicloalquila-C0-4alquUa; onde as referidas substi-tuintes arila, heteroarila e heterocicloalquila de R8 são opcionalmente substi-tuídos com Ci-6alquila.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2 no qual: X 1 é se-lecionado de CH e Ν; Y é selecionado de S e N(CH3); e Ri é hidrogênio.

4. Composto de acordo com a reivindicação 3 no qual R12 é hi-drogênio, metila, -C(O)NHR7, -NHC(O)R7, -N(CH3)C(O)R7 e morfolino; ondeR7 é selecionado de fenila e isoxazolila; onde a referida fenila ou oxazolila deR7 é opcionalmente substituído com 1 a 2 radicais selecionados de iso-butila, trifluormetila, fenóxi, etil-piperazinil-metila, metil-piperazinil-metila, me-til-imidazolila e morfolino-metila.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1 selecionado de:[3-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido-1 -Metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; (4-morfolin-4-il-fenil)-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; fenilami-da do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; 3-trifluormetil-benzilamida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; Morfolin--4-il-(6H-1 -tia-5,6-diaza-as-indacen-2-il)-metanona; 2-Benzenesulfonil-1 -metil--1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amidado ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil-5-[metil-(3-trifluormetil-benzoil)-amino]-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {5-[4-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-3-trifluormetil-fenilcarbamoil]-2-metil-fenil}-ami do ácido-6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil-5-[3-(4-metil-imidazol--1 -il)-5-trifluormetil-benzoilamino]-fenil}-amida do ácido 6H-1 -Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-morfolin-4-ilmetil-5-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1 -Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil-5-[4-(2-metil-imidazol-1-il)-3-trifluormetil-benzoilamino]-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {2-metil--5-[4-(4-metil-piperazin-1 -ilmetil)-3-trifluormetil-fenilcarbamoil]-fenil}-amida doácido 6H-1 -Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [5-(5-tert-butil-isoxazol--3-ilcarbamoil)-2-metil-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno--2-carboxílico; (4-fenoxi-fenil)-amida do ácido 4-(6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carbonil)-piperazine-1 -carboxílico; {1 -[3-(3-trifluormetil-benzoilaraino)-fenil]-1H-imidazòl-2-il}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amidado ácido 1-Metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido 1 -Metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 1-Metil-1,6-dihidro-1,5,6-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6,7-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amidado ácido 6H-1-Tia-5,6,7-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [2-metil-5-(4-morfolin-4-ilmetil-3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6,7-triaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-metóxi-5-(3-trifluormetil-bem-zoilamino)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxíli-co; [3-metóxi-5-(3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia--5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; [3-metóxi-5-(4-morfolin-4-ilmetil-3-trifluormetil-fenilcarbamoil)-fenil]-amida do ácido i6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {3-metóxi-5-[3-(4-metil-imidazol-1 -il)-5-trifluorme-til-fenilcarbamoil]-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; {3-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-3-trifluormetil-fenilcarbamoil]-5-metóxi-fenil}-amida do ácido 6H-1-Tia-5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico; e [2-metil-5-(5-trifluormetil-1H-benzoimidazol-2-il)-fenil]-amida do ácido 6H-1-Tia--5,6-diaza-as-indaceno-2-carboxílico.

6. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um composto como definido na reivindicação 1,em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

7. Método para tratar uma doença em um animal na qual a inibi-ção da atividade de cinase pode prevenir, inibir ou melhora a patologia e/oua sintomatologia da doença, método este que compreende administrar aoanimal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como defi-nido na reivindicação 1.

8. Método de acordo com a reivindicação 7 onde a cinase é se-lecionada de Abi, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK, Tie-2, Trk-B, FGFR3, c-kit, b-RAF,c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e PDGFRae PDGFRp.

9. Uso de um composto como definido na reivindicação 1 /paprodução de um medicamento para tratar uma doença em um animal naqual a atividade de cinase de Abi, Bcr-Abl, Aurora-A, SGK1 Tie-2, Trk-B, FG-FR3, c-kit, b-RAF, c-RAF, DYRK2, Fms, Fyn e/ou PDGFRae PDGFRp con-tribui para a patologia e/ou a sintomatologia da doença.