BRPI0613115A2 - novas enzimas para utilização em branqueamento enzimático de produtos alimentìcios - Google Patents

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Ralf Guenter Berger
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Abstract

NOVAS ENZIMAS PARA UTILIZAçãO EM BRANQUEAMENTO ENZIMáTICO DE PRODUTOS ALIMENTìCIOS. A presente invenção se relaciona a novos peptídeos de acordo com caroase 01-05 de quaisquer equivalentes funcionais de qualquer deles, apropriados para utilização em um método para preparo de produtos alimentícios tendo brancura melhorada, a utilização de enzimas para melhora da brancura de, pelo menos, parte de produtos alimentícios, um processo para preparo de um produto alimentício onde a enzima é utilizada e o produto alimentício obtido.

Description

NOVAS ENZIMAS PARA UTILIZAÇÃO EM BRANQUEAMENTO ENZIMÁTICODE PRODUTOS ALIMENTÍCIOS
A presente invenção se relaciona a novas enzimasapropriadas para utilização em um método para prepararprodutos alimentícios possuindo brancura melhorada, autilização da enzima para aumentar brancura de, pelo menos,parte de um produto alimentício, um processo para preparode um produto alimentício onde a enzima é utilizada e oproduto alimentício é produzido.
Em alguns tipos de produtos alimentícios, uma corbranca de, pelo menos, parte do produto alimentício é vistocomo desejável, por exemplo, em produtos laticínios, porexemplo, queijos, soro, manteiga e leite em pó e produtosfeitos à base de farinha, por exemplo, pães e macarrões.
As matérias-prima ou produtos intermediários de taisprodutos alimentícios, entretanto, podem compreenderpigmentos, os quais podem causar coloração bege ou amarelano produto alimentício. Exemplos de tais pigmentos sãocarotenóides (carotenos e xantofilas) e flavonas.
Em pão branco, por exemplo, um farelo branco é vistocomo propriedade desejável. Um farelo mais branco pode serobtido pela utilização de enzimas tais como catalase,peroxidase, lípase e/ou lipoxigenase, veja, por exemplo,"Oxido-reductases and Lipases as Dough-Bleaching Agent" deP. Gélinas et al. , Cereal Chem, 75(6), 810-814 (1998).Todas enzimas mencionadas possuem um efeito branqueador nofarelo. Atualmente, as indústrias de pães em sua maioriautilizam enzima ativa de farinha de soja, a qual contémlipoxigenases. As lipoxigenases na farinha de soja sãocapazes de branquear pigmentos de farinha de trigo como umresultado da ação de radicas livres e outras espéciesativas de oxigênio que são formadas durante a oxidação deácidos graxos por lipoxigenase. Esta reação é chamada deco-oxidação. Em farinha de soja, três lipoxigenases estãopresentes, LI, L2 e L3 onde L2 e L3 possuem a melhoratividade branqueadora (W. Grosch, G. Laskawy e F. Weber7J. Agric. Food Chem 24 (1976), 456). Farinha de soja nãoapenas contém lipoxigenases, mas também contém os ácidosgraxos que são necessários para o efeito branqueador,resultando em um efeito branqueador melhorado.
Uma desvantagem associada com a utilização de grãos desoja como uma fonte de lipoxigenase é o fato que atualmentea maioria dos grãos de soja é geneticamente modificada(GMO). Uma vez que há uma preferência de consumo globalpela utilização de aditivos derivados de não-GMOmelhoradores de pão, uma alternativa para as lipoxigenasesde soja é altamente requerida. As enzimas conhecidas outrasalém de lipoxigenases L2 e L3 a partir de soja possuem adesvantagem que sua performance não é tão boa quanto aslipoxigenases de soja. Na prática, para obter a brancuradesejada, estas enzimas são para serem combinadas comcofatores ou outras enzimas para alcançar o nível desejadode brancura do farelo. Peroxidases catalisam nãoenzimaticamente a oxidação, por oxigênio molecular, decompostos insaturados, por exemplo, ácidos graxosinsaturados (C.E. Eriksson et al. JAOS 48 (1971) 442).Estes ácidos graxos oxidados geram radicais queprovavelmente reagem com pigmentos de farinha para produtosmenos coloridos de uma maneira semelhante aos produtos dareação com lipoxigenase.É o objeto da presente invenção fornecer novas enzimasapropriadas para preparo de um produto alimentíciopossuindo brancura melhorada de, pelo menos parte doproduto alimentício.
Surpreendentemente foi encontrado que as enzimas debranqueamento de acordo com a invenção são capazes dediretamente converter pigmento em uma forma que resulte embrancura melhorada. Estas enzimas podem de várias maneirasexercer seu efeito branqueador direto nos pigmentos. Porexemplo, elas podem diretamente converter os pigmentosatravés da saturação de ligações insaturadas nos pigmentosvia, por exemplo, hidrogenação ou eles podem diretamenteclivar os pigmentos, formando produtos de degradação. Com otermo direto é significado que estas enzimas atuam sobre opigmento como substrato por ele mesmo. Utilização decofatores para alcançar a conversão não estáespecificamente excluída.
Além disso, foi encontrado que o polipeptídeobranqueador de acordo com a invenção é capaz de diretamenteclivar pigmentos (também chamada enzima de clivagem).Enzimas de clivagem apropriadas de acordo com a invençãosão enzimas que são capazes de clivar carotenóides(carotenos e xantofilas) e flavonas. Carotenóides podem serclivados de duas maneiras diferentes, central e excêntrica.Clivagem central de carotenóides resulta na formação deretinóides (compostos C-20). Clivagem excêntrica podeproduzir um grupo mais diverso de compostos como, porexemplo, ácido abscísico. Uma enzima capaz de clivarcentralmente carotenóides é, por exemplo, β-caroteno15,15'-monoxigenase (EC 1.14.99.36) como descrito, porexemplo, na EP-A-1031623 e J. Lintig e K. Vogt (2000) J.Biol. Chem. 275, 11915. Esta enzima era formalmenteconhecida como beta-caroteno 15,15'-dioxigenase = EC1.13.11.21.
Uma vantagem adicional da utilização de enzimascapazes de clivar centralmente é a formação de retinóides.Estes são componentes essenciais para visão, β-caroteno éclivado em duas moléculas de retinal. Este retinal pode sermodificado para retinol, também conhecido como vitamina A.exemplos de enzimas capazes de clivagem excêntrica decarotenóides são 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase (porexemplo, X. Qin e J.A.D. Zeevaart (1999), Proc. Nat. Acad.Science, 96, 15354) e β-caroteno 9', 10'-dioxigenase (porexemplo, Kiefer et al. (2001), J. Biol. Chem. 287, 14110).
Este objetivo é alcançado pela nova enzima comodescrito na presente invenção.
Em um primeiro aspecto, a invenção se relaciona apolipeptídeos isolados possuindo atividade branqueadora euma ou mais características selecionadas a partir do grupoconsistindo de:
1) Um polipeptídeo isolado de acordo com qualquer umadas SEQ ID NO: 08-12 ou equivalentes funcionais dequalquer uma destas;
2) Um polipeptídeo isolado obtenível pela expressão deum polipeptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ IDNO: 01-07 ou equivalentes funcionais de qualquer umadelas ou um vetor compreendendo referidospolinucleotídeos ou equivalentes funcionais dequalquer uma delas em uma célula hospedeiraapropriada, por exemplo, Aspergillus niger, e3) Um polipeptídeo compreendendo, pelo menos, uma dasSEQ ID NO: 13-17.
O termo "polipeptídeos possuindo atividadebranqueadora" está aqui e daqui em diante definido como umpolipeptídeo que é capaz de degradar beta-caroteno ou umpolipeptídeo que é capaz de branquear produtosalimentícios. Degradação de beta-caroteno pode sermensurada, por exemplo, por pelo menos um dos métodos comodescrito na secção Materiais e Métodos desta aplicação depatente, por exemplo, o método de acordo com Zorn ou ométodo de acordo com Aziz. Preferencialmente, opolipeptídeo de acordo com a invenção mostra atividadebranqueadora em ambos os ensaios de Aziz e de Zorn. Acapacidade de branquear produtos alimentícios pode serdeterminada pela comparação da brancura de um produto A,onde o polipeptídeo investigado é utilizado em suapreparação, com a brancura de um produto B, que apenasdifere do produto A no sentido que o polipeptídeoinvestigado não foi utilizado neste produto, por exemplo,visualmente ou por medições de reflexão conhecidas, onde ofator-b de um produto A estará mais próximo a 0 do que ofator-b de um produto B, no caso o polipeptídeo investigadopossui atividade branqueadora.
Ainda mais preferencialmente, o polipeptídeo de acordocom a invenção é capaz de degradar beta-caroteno comodeterminado de acordo com Zorn e o qual é capaz debranquear produtos alimentícios como determinado pelamedição do fator-b por medição de reflexão. Maispreferencialmente, o polipeptídeo de acordo com a invençãoé capaz de degradar beta-caroteno como determinado deacordo com Zorn, no caso de produtos alimentícios que sãobranqueados possuem uma estrutura de superfície irregular,por exemplo, farelo de pão, uma vez que o método de mediçãode reflexão não é confiável.
Em uma modalidade preferida, a invenção fornece umpolipeptídeo purificado é fornecido. Os polipeptídeos deacordo com a invenção incluem os polipeptídeos codificadospelos polinucleotídeos de acordo com a invenção.Especialmente preferido é um polipeptídeo de acordo com aSEQ ID NO: 08-12 ou equivalentes funcionais de qualquer umdeles.
Proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo deacordo com a invenção estão também dentro do escopo dainvenção. A invenção também fornece métodos de produzir ospolipeptídeos de acordo com a invenção.
Para evitar dúvida; SEQ ID NO: 01-07 referem-se aogrupo de seqüências de DNA contendo SEQ ID NO: 01, SEQ IDNO: 02, SEQ ID NO: 03 SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ IDNO: 06 e SEQ ID NO: 07; SEQ ID NO: 08-12 referem-se aogrupo de seqüências de proteínas contendo SEQ ID NO: 08,SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12e SEQ ID NO: 13-18 referem-se ao grupo de seqüências deproteínas contendo SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18. Alémdisso, os termos caroase-01, caroase-02, caroase-03,caroase-04, caroase-05 (todo o grupo referido como"caroase-01-05") são utilizados para polipeptídeospossuindo respectivamente SEQ ID NO: 08-12.
Em um segundo aspecto, a invenção fornecepolinucleotídeos possuindo uma seqüência nucleotídica quehibridiza preferencialmente sob condições restringentes auma seqüência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO: 01-07. Conseqüentemente, a invenção fornece ácidos nucléicosque são aproximadamente 55%, preferencialmente 65%, maispreferencialmente 70%, ainda mais preferencialmente 75%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogos àsseqüências de acordo com as SEQ ID NO: 01-07.
Em uma modalidade mais preferida, a invenção fornecepara tal polinucleotideo isolado obtenivel a partir defungos, preferencialmente fungos filamentosos, emparticular Marasmius é preferido, por exemplo, M.scorodonius.
Em uma modalidade, a invenção fornece para umpolinucleotideo isolado compreendendo uma seqüência deácido nucléico codificando um polipeptideo com umaseqüência de aminoácido como mostrada na SEQ ID NO: 08-12ou equivalentes funcionais de qualquer uma delas.
Em uma modalidade adicionalmente preferida, a invençãofornece um polinucleotideo isolado codificando, pelo menos,um domínio funcional de um polipeptideo de acordo com SEQID NO: 08-12 ou equivalentes funcionais de qualquer umadelas.
Em uma modalidade preferida, a invenção fornece umgene de uma enzima branqueadora de acordo com as SEQ ID NO:01-07. Em outra modalidade preferida, a invenção fornece umpolinucleotideo codificando uma enzima branqueadora cujaseqüência de aminoácido está mostrada nas SEQ ID NO: 08-12ou variantes ou fragmentos de qualquer destespolipeptídeos.
Em uma modalidade adicionalmente preferida, a invençãofornece um polinucleotídeo compreendendo a seqüênciacodificante para os polipeptídeos de acordo com a invenção,preferida é a seqüência polinucleotídica das SEQ ID NO: 01-07.
Em um terceiro aspecto, a invenção também se relacionaa vetores compreendendo uma seqüência polinucleotídica deacordo com a invenção e iniciadores, sondas e fragmentosque podem ser utilizados para amplificar ou detectar o DNAde acordo com a invenção.
Em uma modalidade preferida, um vetor é fornecido ondea seqüência polinucleotídica de acordo com a invenção estáfuncionalmente ligada a seqüências regulatórias apropriadaspara expressão da seqüência de aminoácido codificada em umacélula hospedeira apropriada, tal como uma bactéria oufungo filamentoso, preferencialmente Marasmius, porexemplo, M. scorodonius, Aspergillus, por exemplo, A. nigerou A. oryzae. A invenção também fornece métodos parapreparo de polinucleotídeos e vetores de acordo com ainvenção.
Em um quarto aspecto, a invenção também se relacionacom células hospedeiras produzidas recombinantemente quecontém polinucleotídeos heterólogos ou homólogos de acordocom a invenção.
Em outra modalidade, a invenção fornece célulashospedeiras recombinantes onde a expressão de umaperoxidase de acordo com a invenção está significativamenteaumentada ou onde a atividade da peroxidase está aumentada.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma célulahospedeira produzida recombinantemente que contém DNAheterólogo ou homólogo de acordo com a invenção e onde acélula é capaz de produzir uma peroxidase funcional deacordo com a invenção, preferencialmente uma célula capazde super expressar a peroxidase de acordo com a invenção,por exemplo, uma linhagem Aspergillus compreendendo umnúmero de cópias aumentado de um gene de acordo com ainvenção.
Em um quinto aspecto, a invenção também se relaciona àutilização de polipeptídeo branqueador de acordo com ainvenção em qualquer processo industrial, preferencialmentecomo descrito aqui.
Polipeptídeos de acordo com a invenção
A invenção fornece um polipeptídeo isolado possuindouma seqüência de aminoácido de acordo com qualquer das SEQID NO: 08-12, assim como uma seqüência de aminoácidoobtenível pela expressão do polinucleotídeo das SEQ ID NO:01-07 em um hospedeiro apropriado. Além disso, um peptídeoou polipeptídeo compreendendo um equivalente funcional dospeptídeos acima está compreendido dentro da presenteinvenção. Os polipeptídeos acima estão coletivamentecompreendidos no termo "polipeptídeos de acordo com ainvenção".
Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo" são aqui edaqui em diante considerados sinônimos (assim como écomumente reconhecido) e cada termo pode ser utilizadointercambiavelmente como o contexto requer para indicar umacadeia de, pelo menos, dois aminoácidos acoplados porligações peptídicas. A palavra "polipeptídeo" é utilizadaaqui para cadeias contendo mais do que sete resíduos deaminoácidos. Todas as fórmulas ou seqüências deoligopeptídeos e polipeptídeos são escritas a partir daesquerda para a direita na direção do terminal araino para oterminal carboxi. O código de uma letra de aminoácidosutilizado aqui é comumente conhecido na arte e pode serencontrado em Sambrook, et al. (Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Editora Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY, 1989).
Por polipeptideo ou proteína "isolado" é entendido umpolipeptídeo ou proteína removido a partir de seu ambientenativo. Por exemplo, polipeptídeos produzidosrecombinantemente e proteínas expressas em célulashospedeiras são considerados isolados para o propósito dainvenção como são nativos ou polipeptídeos recombinantes osquais foram substancialmente purificados por qualquertécnica apropriada tal como, por exemplo, o método depurificação de etapa única divulgado em Smith e Johnson,Gene 6:31-40 (1988).
As enzimas de branqueamento caroase-01-05, de acordocom a invenção, ou equivalentes funcionais destas, podemser recuperadas e purificadas a partir de culturas decélulas recombinantes por métodos bem conhecidos incluindoprecipitação por sulfato de amônio ou etanol, extraçãoácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica,cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interaçãohidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia dehidroxiapatita e cromatografia de lectina. Maispreferencialmente, cromatografia líquida de altaperformance ("HPLC") é aplicada para purificação.
Polipeptídeos da presente invenção incluem produtosnaturalmente purificados, produtos de procedimentosquímicos sintéticos e produtos produzidos por técnicasrecombinantes a partir de um hospedeiro procarioto oueucarioto incluindo, por exemplo, células bacterianas, deleveduras, de plantas superiores, de insetos e demamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em umprocedimento de produção recombinante, os polipeptídeos dapresente invenção podem ser glicosilados ou podem ser nãoglicosilados. Além disso, polipeptídeos da invenção podemtambém incluir um resíduo de metionina inicial modificado,em alguns casos com um resultado de processos mediados pelohospedeiro.
Equivalentes funcionais
Os termos "equivalentes funcionais" e "variantesfuncionais" são utilizados intercambiavelmente aqui.
Equivalentes funcionais de DNA caroase 01-05 são fragmentosde DNA isolados que codificam um polipeptídeo que exibe,pelo menos, a mesma ou melhor atividade branqueadora de,pelo menos, uma das enzimas branqueadoras caroases 01-05 deMarasmius scorodonius como definido aqui. Um equivalentefuncional de um polipeptídeo caroase 01-05 de acordo com ainvenção é um polipeptídeo que exibe, pelo menos, a mesmaou melhor atividade branqueadora de, pelo menos, uma dasenzimas branqueadoras caroases 01-05 de Marasmiusscorodonius como definido aqui.
Proteína funcional ou polipeptídeo equivalentes podemconter apenas substituições conservativas de um ou maisaminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 08-12 ousubstituições, inserções ou deleções de aminoácidos nãoessenciais de qualquer destes. Por conseguinte, umaminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alteradoem qualquer uma das SEQ ID NO: 08-12 sem alterarsubstancialmente a função biológica. Por exemplo, resíduosde aminoácido que são conservados entre as proteínascaroase 01-05 da presente invenção são preditas como sendoparticularmente não susceptível a alteração. Além disso,aminoácidos conservados entre as proteínas caroase 01-05 deacordo com a presente invenção e outras peroxidases nãoparecem ser susceptíveis a alteração.
O termo "substituição conservativa" tem a intenção designificar que uma substituição na qual o resíduo deaminoácido é substituído por um resíduo de aminoácidopossuindo uma cadeia lateral similar. Estas famílias sãoconhecidas na arte e incluem aminoácidos com cadeialaterais básicas (por exemplo, lisina, arginina ehistidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácidoaspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares nãocarregadas (por exemplo, glicina, asparaginas, glutamina,serina, treonina, tirosina, cisteína) cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeiaslaterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina,isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo,tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Equivalentes funcionais de ácido nucléico podemtipicamente conter mutações silenciosas ou mutações que nãoalteram a função biológica do polipeptídeo codificado. Porconseguinte, a invenção fornece moléculas de ácido nucléicocodificando proteínas caroase 01-05 que contém modificaçõesem resíduos de aminoácidos que não são essenciais para umaatividade biológica específica. Tais proteínas caroase 01-05 diferem em seqüência de aminoácido de qualquer SEQ IDNO: 08-12, no entanto, retêm, pelo menos, uma atividadebiológica. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléicoisolada compreende uma seqüência nucleotidica codificandouma proteína, onde a proteína compreende uma seqüência deaminoácido substancialmente homóloga de, pelo menos,aproximadamente 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga a seqüência deaminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 08-12.
Por exemplo, orientação sobre como produzirsubstituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosas éfornecida em Bowie, J.U. et al. , Science 247:1306-1310(1990) onde os autores indicam que há duas abordagensprincipais para o estudo da tolerância de uma seqüência deaminoácido para trocar. O primeiro método consiste noprocesso de evolução, no qual mutações são tanto aceitas ourejeitadas pela seleção natural. A segunda abordagemutiliza engenharia genética para introduzir mudanças deaminoácidos em posições específicas de um gene clonado eseleciona ou realiza uma varredura para identificarseqüências que mantêm funcionalidade. Como os autoresafirmam, estes estudos revelaram que proteínas sãosurpreendentemente tolerantes a substituições deaminoácidos. Os autores adicionalmente indicam quaismudanças são permissivas em uma certa posição da proteína.
Por exemplo, a maioria dos resíduos de aminoácido nãoexpostos requer cadeias laterais não-polares, enquantopoucas características das cadeias laterais de superfíciesão geralmente conservadas. Outras tais substituiçõesfenotipicamente silenciosas estão descritas em Bowie etal., supra, e nas referências citadas neste.
Uma molécula de ácido nucléico isolada codificando umaproteína caroase 01-05 homóloga à proteína de acordo comqualquer uma das SEQ ID NO: 08-12 pode ser criada pelaintrodução de uma ou mais substituições, adições oudeleções nucleotídicas nas seqüências nucleotídicascodificantes de acordo com as SEQ ID NO: 01-07 tal que umaou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidossão introduzidas na proteína codificada. Tais mutaçõespodem ser introduzidas por técnicas padrão, tais comomutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR.
O termo "equivalentes funcionais" também compreendeortólogos da proteína caroase 01-05 de M. scorodonius.Ortólogos da proteína caroase 01-05 de M. scorodonius sãoproteínas que podem ser isoladas a partir de outraslinhagens ou espécies e possuem uma atividade biológicasimilar ou idêntica. Tais ortólogos podem prontamente seridentificados como compreendendo uma seqüência deaminoácido que é substancialmente homóloga a qualquer umadas SEQ ID NO: 08-12.
Como definido aqui, o termo "substancialmentehomóloga" se refere a uma primeira seqüência de aminoácidoou nucleotídica a qual contém um número suficiente oumínimo de aminoácidos (substituições, adições ou deleçõescom cadeia lateral similar) ou nucleotídeos idênticos ouequivalentes a uma segunda seqüência de aminoácido ounucleotídica tal que a primeira e a segunda seqüências deaminoácido ou nucleotídica possuem um domínio comum. Porexemplo, seqüências de aminoácido ou nucleotídica quepossuem um domínio comum possuem aproximadamente 55%,preferencialmente 65%, mais preferencialmente 70%, aindamais preferencialmente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,98% ou 99% de identidade ou mais estão definidas aqui comosuficientemente idênticas.
Além disso, ácidos nucléicos codificando outrosmembros da família caroase 01-05, os quais então possuemuma seqüência nucleotídica que difere das SEQ ID NO: 01-07,estão dentro do escopo da invenção. Além disso, ácidosnucléicos codificando proteínas caroase 01-05 a partir dediferentes espécies as quais então possuem uma seqüêncianucleotídica a qual difere das SEQ ID NO:01-07 estão dentrodo escopo da invenção.
Moléculas de ácido nucléico correspondente a variantes(por exemplo, variantes alélicas naturais) e homólogas aoDNA da caroase 01-05 da invenção pode ser baseada em suahomologia aos ácidos nucléicos da caroase 01-05 divulgadosaqui utilizando o DNA divulgado aqui ou um fragmentoapropriado deste, como uma sonda de hibridização de acordocom técnicas padrão de hibridização preferencialmente sobcondições restringentes de hibridização.
Em adição às variantes alélicas naturais da seqüênciada caroase 01-05, a pessoa habilitada reconhecerá quemudanças podem ser introduzidas por mutação nas snucleotídicas das SEQ ID NO: 01-07 assim levando a mudançasna seqüência de aminoácido da proteína caroase 01-05 semalterar substancialmente a função da proteína caroase 01-05.
Em outro aspecto da invenção, as proteínas caroase 01-05 melhoradas são fornecidas. Proteínas caroase 01-05melhoradas são proteínas onde, pelo menos, uma atividadebiológica está melhorada. Tais proteínas podem ser obtidaspela introdução aleatória de mutações ao longo de toda ouparte da seqüência codificante da caroase 01-05, tal comopor mutagênese por saturação e os mutantes resultantespodem ser expressos recombinantemente e varridos pelaatividade biológica. Por exemplo, a arte fornece ensaiospadronizados para medição da atividade enzimática deperoxidases e desta maneira proteínas melhoradas podem serfacilmente selecionadas.
Em uma modalidade preferida a proteína caroase 01-05possui uma seqüência de aminoácido de acordo com qualquerdas SEQ ID NO: 08-12 respectivamente. Em outra modalidade,o polipeptídeo caroase 01-05 é substancialmente homólogo aseqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 08-12respectivamente e retém, pelo menos, uma atividadebiológica de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 08-12 respectivamente, no entanto, difere em seqüência deaminoácido devido a variação natural ou mutagênese comodescrito acima.
Em uma modalidade adicionalmente preferida, a proteínacaroase 01-05 possui uma seqüência de aminoácido codificadapor um fragmento de ácido nucléico isolado capaz dehibridizar a um ácido nucléico de acordo com SEQ ID NO: 01-07, preferencialmente sob condições de hibridizaçãoaltamente restringentes.
Desta maneira, a proteína caroase 01-05 é uma proteínaa qual compreende uma seqüência de aminoácido, pelo menos,aproximadamente 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga a seqüência deaminoácido mostrada em uma das SEQ ID NO: 08-12 e retém,pelo menos, uma atividade funcional do polipeptídeo deacordo com qualquer uma das SEQ ID NO: 08-12.
Em outro aspecto da invenção o polipeptídeocompreende, pelo menos, uma das seqüências mostradas nasSEQ ID NO: 13-17. Preferencialmente, o polipeptídeo deacordo com a invenção compreende, pelo menos, duas dasseqüências mostradas nas SEQ ID NO: 13-17. Maispreferencialmente, o polipeptídeo compreende todas asseqüências mostradas nas SEQ ID NO: 13-17.
Equivalentes funcionais de uma proteína de acordo coma invenção podem também ser identificados, por exemplo,pela varredura combinatória de bibliotecas de mutantes, porexemplo, truncagem de mutantes, da proteína da invençãopara atividade peroxidase. Em uma modalidade, umabiblioteca diversificada de mutantes é gerada pormutagênese combinatória em nível de ácido nucléico. Umabiblioteca diversificada de variantes pode ser produzida,por exemplo, ligando enzimaticamente uma mistura deoligonucleotídeos sintéticos em seqüências gênicas tal queum conjunto degenerado de seqüências protéicas potenciais éexpressável como polipeptídeos individuais ou,alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusãoamplas (por exemplo, para apresentação de fagos). Há umavariedade de métodos que podem ser utilizados para produzirbibliotecas de variantes potenciais de polipeptídeos dainvenção a partir de uma seqüência oligonucleotídicadegenerada. Métodos para sintetizar oligonucleotídeosdegenerados são conhecidos na arte (veja, por exemplo,Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu.Ver. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid. Res. 11:477).
Além disso, bibliotecas de fragmentos da seqüênciacodificante de um polipeptídeo da invenção pode serutilizado para gerar uma população diversificada depolipeptídeos para varrer uma subseqüente seleção devariantes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos deseqüências codificantes pode ser gerada pelo tratamento deum fragmento de PCR dupla fita da seqüência codificante deinteresse com uma nuclease sob condições onde nicagemocorre apenas aproximadamente uma vez por molécula,desnaturando o DNA dupla fita, renaturando o DNA paraformar DNA dupla fita o qual pode incluir paressenso/antisenso a partir de produtos nicados, removendoporções de fita simples a partir de duplexes refeitos pelotratamento com nuclease Sl e ligando a biblioteca defragmentos resultante em um vetor de expressão. Por estemétodo, uma biblioteca de expressão pode ser derivada aqual codifica fragmentos N-terminal e internos de diversostamanhos da proteína de interesse.
Diversas técnicas são conhecidas na arte paravarredura de produtos gênicos de bibliotecas combinatóriasfeitas por mutações pontuais de truncagem e para varredurade bibliotecas de cDNA por produtos gênicos possuindo umapropriedade seletiva. As técnicas usadas mais amplamente,as quais são susceptíveis a análises de through-put, paravarredura de grandes bibliotecas gênicas tipicamenteincluem clonagem da biblioteca gênica em vetores deexpressão replicáveis, transformando células apropriadascom a biblioteca de vetores resultante e expressando osgenes combinatórios sob condições nas quais detecção de umaatividade desejada facilita isolamento do vetor codificandoo gene cujo produto foi detectado. Mutagênese de conjuntorecursivo (REM), uma técnica a qual aumenta a freqüência demutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser utilizada emcombinação com os ensaios de varredura para identificarvariantes de uma proteína da invenção (Arkin e Yourvan(1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7811-7815; Delgrave etal. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
Em adição às seqüências gênicas da caroase 01-05mostradas nas SEQ ID NO: 01 ou 02 para caroase-01; SEQ IDNO: 03 ou 04 para caroase-02; SEQ ID NO: 05 para caroase-03; SEQ ID NO: 06 para caroase-04 e SEQ ID NO: 07 paracaroase-05 respectivamente, será aparente para a pessoahabilitada na arte que polimorfismos na seqüência de DNAque podem levar a mudanças na seqüência de aminoácido dasproteínas caroase podem existir dentro de uma dadapopulação. Tais polimorfismos genéticos podem existir emcélulas de diferentes populações ou dentro de uma populaçãodevido a variação alélica natural. Variantes alélicas podemtambém incluir equivalentes funcionais.
Fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com ainvenção podem também compreender polinucleotídeos nãocodificantes de polipeptídeos funcionais. Taispolinucleotídeos podem funcionar como sondas ou iniciadorespara uma reação de PCR.
Ácidos nucléicos de acordo com a invenção,independentemente se codificam polipeptídeos funcionais ounão funcionais, podem ser utilizados como sondas dehibridização ou iniciadores para Reação em Cadeia daPolimerase (PCR). Utilizações das moléculas de ácidosnucléicos da presente invenção que não codificam umpolipeptídeo possuindo uma atividade caroase 01-05 incluem,entre outras coisas, (1) isolamento do gene codificante dasproteínas caroase 01-05 ou variantes alélicas destas apartir de uma biblioteca de cDNA, por exemplo, a partir deoutros organismos que não M. scorodonius; (2) hibridizaçãoin si tu (por exemplo, FISH) para espalhamento cromossomalem metáfase para promover localização cromossomal precisados genes caroase 01-05 como descrito em Verma et al.,Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, EditoraPergamon, Nova Iorque (1988); (3) análises de Northern blotpara detecção da expressão do mRNA de caroase 01-05 emtecidos e/ou células específicos e (4) sondas e iniciadoresque podem ser utilizados como uma ferramenta diagnosticapara análise da presença de um ácido nucléico hibridizávelà sonda caroase 01-05 em uma dada amostra biológica (porexemplo, tecido).
Também compreendido nesta invenção está um método deobter um equivalente funcional de um gene caroase 01-05.Tal método acarreta na obtenção de uma sonda marcada queinclui um ácido nucléico isolado o qual codifica toda ouuma porção da seqüência de acordo com qualquer uma das SEQID NO: 08-12 ou uma variante de qualquer uma delas;varredura de uma biblioteca de fragmento de ácido nucléicocom a sonda marcada sob condições que permitam hibridizaçãoda sonda aos fragmentos de ácido nucléico na biblioteca,desta maneira formando duplexes de ácido nucléico e preparode uma seqüência gênica completa a partir de fragmentos deácido nucléico em qualquer duplex marcado para obter umgene relacionado ao gene da caroase 01-05.Em uma modalidade, o ácido nucléico da caroase 01-05da invenção é, pelo menos, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogo a umaseqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 01 ou 02para caroase-01; SEQ ID NO: 03 ou 04 para caroase-02; SEQID NO: 05 para caroase-03; SEQ ID NO: 06 para caroase-04 eSEQ ID NO: 07 para caroase-05 respectivamente ou ocomplemento de qualquer uma delas.
Em outra modalidade preferida, um polipeptídeo caroase01-05 da invenção é, pelo menos, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogo a umaseqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ IDNO: 08-12, respectivamente.
Polinucleotídeos
A presente invenção fornece polinucleotídeoscodificando uma enzima branqueadora (peroxidase) ,tentativamente chamada de caroase 01-05, possuindo umaseqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 08-12 ouequivalentes funcionais de qualquer uma delas. A seqüênciado gene codificante da caroase 01-05 foi determinada pelaamplificação do cDNA obtido a partir de M. scorodonius. Aseqüência possuindo SEQ ID NO: 02 e SEQ ID NO: 04codificando caroase-01 e caroase-02 respectivamente sãoversões otimizadas dos genes conforme apanhadas, onde umaotimização de códon foi realizada. Otimização de códon podeser utilizada de acordo com métodos conhecidos pela pessoahabilitada na arte e é especialmente apropriada paraexpressão melhorada do gene em uma célula hospedeira. Ainvenção fornece seqüências polinucleotídicas compreendendoo gene codificando a peroxidase caroase 01-05. destamaneira, a invenção se relaciona a um polinucleotídeoisolado compreendendo a seqüência nucleotídica de acordocom SEQ ID NO: 01-07 ou equivalentes funcionais de qualqueruma delas. A descoberta das SEQ ID NO: 01-07 em Marasmiusscorodonius possuírem atividade branqueadora foi muitosurpreendente, especialmente uma vez que as seqüênciaspossuem homologia muito baixa com enzimas branqueadorasconhecidas.
Mais em particular, a invenção se relaciona a umpolinucleotídeo isolado hibridizável sob condiçõesrestringentes, preferencialmente sob condições altamenterestringentes, a um polinucleotídeo de acordo com as SEQ IDNO: 01-07. Vantajosamente, tais polinucleotídeos podem serobtidos a partir de fungos, preferencialmente fungosfilamentosos, em particular a partir de Marasmiusscorodonius. Mais especificamente, a invenção se relacionaa um polinucleotídeo isolado possuindo uma seqüêncianucleotídica de acordo com as SEQ ID NO: 01-07.
Como utilizado aqui e daqui em diante, os termos"gene" e "gene recombinante" se referem a moléculas deácido nucléico ao quais podem ser isoladas a partir de DNAcromossomal, o qual inclui um quadro aberto de leituracodificando uma proteína, por exemplo, uma enzimabranqueadora M. scorodonius. Um gene pode incluirseqüências codificantes, seqüências não-codificantes,íntrons e seqüências regulatórias. Além disso, um generefere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada comodefinido aqui.
Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção,tal como uma molécula de ácido nucléico possuindo aseqüência nucleotídica das SEQ ID NO: 01-07 ou umequivalente funcional destas, pode ser isolada utilizandotécnicas padrão de biologia molecular e a informação daseqüência fornecida aqui. Por exemplo, utilizando toda ouuma porção da seqüência de ácido nucléico das SEQ ID NO:01-07 como uma sonda para hibridização, moléculas de ácidonucléico de acordo com a invenção podem ser isoladasutilizando técnicas de hibridização e clonagem padrão(Sambrook, J., Fritsh, E. F., e Maniatis, T. MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Editora Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, NY, 1989).
Além disso, uma molécula de ácido nucléicocompreendendo toda ou uma porção das SEQ ID NO: 01-07 podeser isolada pela reação em cadeia da polimerase (PCR)utilizando iniciadores oligonucleotídeos sintéticosdesenhados baseados na informação da seqüência contida nasSEQ ID NO: 01-07.
Um ácido nucléico da invenção pode ser amplificadoutilizando cDNA, mRNA ou, alternativamente, DNA genômico,como um molde e iniciadores oligonucleotídeos apropriadosde acordo com técnicas padrão de amplificação por PCR. 0ácido nucléico então amplificado pode ser clonado em umvetor apropriado e caracterizado por análises de seqüênciade DNA.
Além disso, oligonucleotídeos correspondendo às ouhibridizáveis às seqüências nucleotídicas de acordo com ainvenção podem ser preparadas por técnicas sintéticaspadrão, por exemplo, utilizando um sintetizador automáticode DNA.Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácidonucléico isolada da invenção compreende a seqüêncianucleotidica mostrada nas SEQ ID NO: 01-07. Este DNAcompreende seqüências codificantes do polipeptídeo caroase01-05 de M. scorodonius de acordo com as SEQ ID NO: 08-12,respectivamente.
Em outra modalidade preferida, uma molécula de ácidonucléico isolada da invenção compreende uma molécula deácido nucléico a qual é um complemento da seqüêncianucleotidica mostrada nas SEQ ID NO: 01-07 ou umequivalente funcional destas seqüências nucleotídicas.
Uma molécula de ácido nucléico a qual é complementar aoutra seqüência nucleotidica é uma que é suficientementecomplementar a outra seqüência nucleotidica tal que estapode hibridizar a outra seqüência nucleotidica destamaneira formando um duplex estável.
Um aspecto da invenção pertence a moléculas de ácidonucléico isoladas que codificam um polipeptídeo da invençãoou um equivalente funcional deste tal como um fragmento oudomínio biologicamente ativo, assim como moléculas de ácidonucléico suficientes para utilizar como sondas dehibridização para identificar moléculas de ácido nucléicocodificando um polipeptídeo da invenção e fragmentos detais moléculas de ácido nucléico apropriadas parautilização como iniciadores de PCR para amplificação oumutação de moléculas de ácido nucléico.
Um "polinucleotídeo isolado" ou "ácido nucléicoisolado" é um DNA ou RNA que não é imediatamente contíguocom ambas as seqüências codif icadoras com a qual este éimediatamente contíguo (uma na extremidade 5' e uma naextremidade 3') no genoma de ocorrência natural doorganismo a partir do qual esta foi derivada. Destamaneira, em uma modalidade, uma molécula de ácido nucléicoinclui algumas ou todas as seqüências não-codificantes (porexemplo, promotor) que são imediatamente contíguas àseqüência codificante. 0 termo, além disso, inclui, porexemplo, um DNA recombinante que está incorporado a umvetor, em um plasmídeo replicando-se de forma autônoma ouvírus ou no DNA genômico de um procarionte ou eucarionte,ou o qual existe como uma molécula separada (por exemplo,um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCRou por tratamento com endonucleases de restrição)independente de outras seqüências. Isto também inclui umDNA recombinante que é parte de um gene híbrido codificandoum polipeptídeo adicional que está substancialmente livrede material celular, material viral ou meio de cultura(quando produzido por técnicas de DNA recombinante) ouprecursores químicos ou outros químicos (quandoquimicamente sintetizados). Além disso, um "fragmento deácido nucléico isolado" é um fragmento de ácido nucléicoque não é de ocorrência natural ocorrendo como um fragmentoe não sendo encontrado no estado natural.
Como utilizado aqui, os termos "polinucleotídeo" ou"molécula de ácido nucléico" têm a intenção de incluirmoléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) emoléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA eRNA gerados utilizando análogos nucleotídeos. A molécula deácido nucléico pode ser fita simples ou fita dupla, maspreferencialmente é DNA dupla fita. 0 ácido nucléico podeser sintetizado utilizando nucleotídeos análogos ouderivados (por exemplo, nucleotídeos fosforotioato). Taisoligonucleotídeos podem ser utilizados, por exemplo, parapreparar ácidos nucléicos que possuem habilidade de alteraro pareamento de bases ou aumentar resistência a nucleases.
Outra modalidade da invenção fornece uma molécula deácido nucléico isolada a qual é anti-senso a uma moléculade ácido nucléico de caroase 01-05, por exemplo, a fitacodificante de uma molécula de ácido nucléico de caroase01-05 respectivamente. Também incluída dentro do escopo dainvenção estão as fitas complementares das moléculas deácido nucléico descritas aqui.
Erros de seqüenciamento
A informação da seqüência como fornecida aqui não deveser estritamente construída como requerendo inclusão debases erroneamente identificadas. As seqüências específicasdivulgadas aqui podem ser prontamente utilizadas paraisolar o genoma completo a partir de fungos, em particularM. scorodonius o qual, por sua vez, pode facilmente sersubmetido a análises de seqüência adicionais desta maneiraidentificando erros de seqüenciamento.
A menos que indicado de outra forma, todas asseqüências nucleotídicas determinadas pelo seqüenciamentode uma molécula de DNA foram aqui determinadas utilizandoum seqüenciador automático de DNA e todas as seqüências deaminoácido de polipeptídeos codificados pelas moléculas deDNA determinadas aqui foram preditas pela tradução daseqüência de DNA determinada como referido acima. Porconseguinte, como é conhecido na arte para qualquerseqüência de DNA determinada por esta abordagemautomatizada, qualquer seqüência nucleotídica determinadaaqui pode conter alguns erros. Seqüências nucleotídicasdeterminadas por automação são tipicamente, pelo menos,aproximadamente 90% idênticas, mais tipicamente, pelo menosaproximadamente 95% a, pelo menos, aproximadamente 99,9%idênticas a seqüência nucleotidica atual da molécula de DNAseqüenciada. A seqüência atual pode ser mais precisamentedeterminada por outras abordagens incluindo métodos deseqüenciamento de DNA manual bem conhecidos na arte. Como étambém conhecido na arte, uma única inserção ou deleção emuma determinada seqüência nucleotidica comparada aseqüência atual irá causar uma mudança de quadro natradução da seqüência nucleotidica tal que a seqüência deaminoácido predita codificada por uma determinada seqüêncianucleotidica será completamente diferente da seqüência deaminoácido codificada atualmente pela molécula de DNAseqüenciada, iniciando no ponto de tal inserção ou deleção.
A pessoa habilitada na arte é capaz de identificartais bases identificadas erroneamente e conhece comocorrigir tais erros.
Fragmentos de ácido nucléico, sondas e iniciadores
Uma molécula de ácido nucléico de acordo com ainvenção pode compreender apenas uma porção ou um fragmentoda seqüência de ácido nucléico mostrada nas SEQ ID NO: 01-07, por exemplo, um fragmento o qual pode ser utilizadocomo uma sonda ou iniciador ou um fragmento codificando umaporção de uma proteína caroase 01-05. A seqüêncianucleotidica determinada a partir da clonagem do gene dacaroase 01-05 e cDNA permite a geração de sondas einiciadores desenhados para utilização em identificaçãoe/ou clonagem de outros membros da família caroase 01-05,assim como homólogos de caroase 01-05 de outras espécies. Asonda/iniciador tipicamente compreende oligonucleotídeossubstancialmente purificados os quais tipicamentecompreendem uma região de seqüência nucleotídica quehibridiza preferencialmente sob condições restringentes a,pelo menos, aproximadamente 12 ou 15, preferencialmenteaproximadamente 18 ou 20, preferencialmente aproximadamente22 ou 25, mais preferencialmente aproximadamente 30, 35,40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 75 ou mais nucleotídeosconsecutivos de uma seqüência nucleotídica mostrada nas SEQID NO: 01-07 ou um equivalente funcional de qualquer umdeles.
Sondas baseadas nas seqüências nucleotídicas dacaroase 01-05 podem ser utilizadas para detectartranscritos ou seqüências genômicas da caroase 01-05codificando a mesma proteína ou proteínas homólogas, porexemplo, em outros organismos. Em modalidades preferidas, asonda adicionalmente um grupo marcado anexado a esta, porexemplo, o grupo marcado pode ser um radioisótopo, umcomposto fluorescente, uma enzima ou um cofator de umaenzima. Tais sondas também podem ser utilizadas como partede um kit de teste diagnóstico para identificação decélulas as quais expressam uma proteína caroase 01-05.
Identidade e homologia
Os termos "homologia" ou "percentual de identidade"são utilizados intercambiavelmente aqui. Para o propósitodessa invenção, isto é definido aqui com objetivo dedeterminar o percentual de identidade de duas seqüências deaminoácido ou de duas seqüências de ácido nucléico, asseqüências são alinhadas para propósitos de comparaçãoótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos naseqüência de uma primeira seqüência de aminoácido ounucleotidica para alinhamento ótimo com uma segundaseqüência de aminoácido ou nucleotidica). Os resíduos deaminoácido ou nucleotideos nas posições de aminoácidos ouposições de nucleotideos correspondentes são entãocomparadas. Quando uma posição na primeira seqüência éocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo emrelação a posição correspondente na segunda seqüência,então as moléculas são idênticas em posição. 0 percentualde identidade entre as duas seqüências é uma função donúmero de posições idênticas compartilhadas pelasseqüências (ou seja, % de identidade = número de posiçõesidênticas/número total de posições (ou seja, posiçõessobrepostas) χ 100) . Preferencialmente, as duas seqüênciaspossuem o mesmo comprimento.
A pessoa habilitada estará ciente do fato de diversosprogramas de computador diferentes estarem disponíveis paradeterminar a homologia entre duas seqüências. Por exemplo,uma comparação de seqüências e determinação do percentualde identidade entre duas seqüências pode ser realizadautilizando um algoritmo matemático. Em uma modalidadepreferida, a porcentagem de identidade entre duasseqüências de aminoácido é determinada utilizando oalgoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453(1970)) o qual foi incorporado ao programa GAP no pacote dosoftware GCG (disponível emhttp://www.accelrys.com/solutions/bioinformatician/),utilizando tanto uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250e um peso do intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e umpeso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. a pessoahabilitada apreciará que todos estes parâmetros diferentesproduzam resultados ligeiramente diferentes, mas que a.porcentagem global de identidade de duas seqüências nãoseja significativamente alterada quando utilizandodiferentes algoritmos.
Ainda em outra modalidade, a porcentagem de identidadeentre duas seqüências nucleotidicas é determinadautilizando o programa GAP no pacote do software GCG,utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de intervalode 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2,3, 4, 5 ou 6. ainda em outra modalidade, a porcentagem deidentidade entre duas seqüências de aminoácido ounucleotídica é determinada utilizando o algoritmo de E.Meyers e W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989) o qual foiincorporado no programa ALIGN (versão 2.0) (disponível emhttp://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) utilizando umatabela de peso de resíduo PAM12 0, uma penalidade deintervalo de comprimento de 12 e uma penalidade deintervalo de 4.
As seqüências de ácido nucléico e proteína da presenteinvenção podem adicionalmente ser utilizadas como uma"seqüência em questão" para realizar uma busca contrabancos de dados públicos para, por exemplo, identificaroutros membros da família ou seqüências relacionadas. Taisbuscas podem ser realizadas utilizando os programas NBLASTe XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:403 - 10. Buscas nucleotidicas BLAST podem serrealizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100,comprimento da palavra = 12 para obter seqüênciasnucleotídicas homólogas a moléculas de ácido nucléico decaroase 01-05 da invenção. Buscas de proteína BLAST podemser realizadas com o programa XBLASTj pontuação = 50,comprimento da palavra = 3 para obter seqüências deaminoácidos homólogas a moléculas de proteína homólogas acaroase 01-05 da invenção. Para obter alinhamentos comintervalos para propósitos de comparação, BLAST comintervalos pode ser utilizado como descrito em Altschu etal., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402.
Quando utilizando programas BLAST e BLAST comintervalo, os parâmetros padrão dos respectivos programaspodem ser utilizados (por exemplo, XBLAST e NBLAST) . Vejahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Hibridização
Como utilizado aqui, o termo "hibridização" tem aintenção de descrever condições para hibridização e lavagemsob quais seqüências nucleotídicas a, pelo menos,aproximadamente 55%, pelo menos, aproximadamente 4 0%, pelomenos, aproximadamente 70% mais preferencialmente pelomenos, aproximadamente 80%, ainda mais preferencialmentepelo menos, aproximadamente 85% a 90%, maispreferencialmente pelo menos, 95% homólogas uma a outratipicamente continuam hibridizadas uma a outra.
Um exemplo não limitante preferido de tais condiçõesde hibridização é hibridização em cloreto de sódio/citratode sódio 6X (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uma oumais lavagens em SSC 1 X, 0,1% de SDS a 50 °C,preferencialmente a 55 °C, preferencialmente a 60°C e aindamais preferencialmente a 65°C.
Condições altamente restringentes incluem, porexemplo, hibridização a 680C em SSC 5X/solução deDenhardfs 5X / 1,0% SDS e lavagem em SSC 0,2 X/SDS 0,1% emtemperatura ambiente. Alternativamente, lavagem pode serrealizada a 42°C.
O artesão habilitado saberá que condições aplicar paracondições restringentes e altamente restringentes dehibridização. Orientação adicional com respeito a taiscondições está prontamente disponível na arte, por exemplo,em Sambrook, et al. , 1989, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Editora Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al.(Eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (JohnWiley e Sons, Ν.Y.).
É claro, um polinucleotídeo que hibridiza apenas a umaseqüência poli A (tal como a extremidade 3' cauda poli A demRNAs) ou a um trecho complementar de resíduo T (ou U), nãoserá incluído em um polinucleotídeo da invenção utilizadopara especificamente hibridizar a uma porção de umamolécula de ácido nucléico da invenção, uma vez que talpolinucleotídeo poderia hibridizar a qualquer molécula deácido nucléico contendo um trecho poli A ou o complementodeste (por exemplo, praticamente qualquer clone de cDNAdupla fita).
Obtendo DNA completo a partir de outros organismos
Em uma abordagem típica, bibliotecas de cDNAconstruídas a partir de outros organismos, por exemplo,fungos filamentosos, em particular a partir das espéciesMarasmius podem ser varridos.
Por exemplo, linhagens Marasmius podem ser varridaspor polinucleotídeos caroase 01-05 homólogos por análise deNorthern blot. Uma vez detectados os transcritos homólogosaos polinucleotídeos de acordo com a invenção, bibliotecasde cDNA podem ser construídos a partir de RNA isolados apartir de linhagem apropriada, utilizando técnicas padrãobem conhecidas daqueles de habilidade na arte.
Alternativamente, uma biblioteca de DNA genômico total podeser varrida utilizando uma sonda hibridizável a umpolinucleotídeo caroase 01-05 de acordo com a invenção.
Seqüências gênicas homólogas podem ser isoladas, porexemplo, pela realização de PCR utilizando dois conjuntosde iniciadores oligonucleotídeos degenerados desenhados combase nas seqüências nucleotídicas apresentadas aqui.
O molde para a reação pode ser cDNA obtido portranscrição reversa de mRNA preparado a partir de linhagensconhecidas ou suspeitas de expressar um polinucleotídeo deacordo com a invenção. 0 produto de PCR pode ser subclonadoe seqüenciado para garantir que as seqüências amplificadasrepresentam as seqüências de uma nova seqüência de ácidonucléico caroase 01-05 ou um equivalente funcional desta.
O fragmento de PCR pode então ser utilizado paraisolar um clone de cDNA completo por uma variedade demétodos conhecidos. Por exemplo, o fragmento amplificadopode ser marcado e utilizado para varrer uma biblioteca decDNA de bacteriófago ou de cosmídeo. Alternativamente, ofragmento marcado pode ser utilizado para varrer umabiblioteca genômica.
Tecnologia de PCR pode também ser utilizada paraisolar seqüências cDNA completas a partir de outrosorganismos. Por exemplo, RNA pode ser isolado, seguindoprocedimentos padrão, a partir de uma fonte celular outecidual apropriada. Uma reação de transcrição reversa podeser realizada no RNA utilizando um iniciadoroligonucleotideo para a maioria das extremidades 5' dosfragmentos amplificados para o início da síntese daprimeira fita.
O híbrido DNA/RNA resultante pode então sofrer "adiçãode uma cauda" (por exemplo, com guaninas) utilizando umareação padrão de transferase terminal, o híbrido pode serdigerido com RNase Hea síntese da segunda fita pode entãoser iniciada (por exemplo, com um iniciador poli-C). Destamaneira, seqüências cDNA à montante do fragmentoamplificado pode ser facilmente isolado. Para uma revisãode estratégias úteis de clonagem, veja, por exemplo,Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra.
Vetores
Outro aspecto da invenção pertence a vetores,preferencialmente vetores de expressão, contendo um ácidonucléico codificando uma proteína caroase 01-05 ou umequivalente funcional desta. Como utilizado aqui, o termo"vetor" se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz detransportar outro ácido nucléico ao qual este foi ligado.Um tipo de vetor é um "plasmídeo", o qual se refere a umaalça de DNA circular dupla fita na qual segmentos de DNApodem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral,onde segmentos adicionais de DNA podem ser ligados nogenoma viral. Certos vetores são capazes de replicaçãoautônoma em uma célula hospedeira na qual estes sãointroduzidos (por exemplo, vetores bacterianos possuindouma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais demamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores nãoepissomais de mamíferos) são integrados no genoma de umacélula hospedeira após introdução na célula hospedeira eentão são replicados juntamente com o genoma hospedeiro.Além disso, certos vetores são capazes de direcionar aexpressão de genes aos quais estes estão operacionalmenteligados. Tais vetores estão aqui referidos como "vetores deexpressão". Em geral, vetores de expressão de utilidade emtécnicas de DNA recombinante estão freqüentemente sob aforma de plasmideos. Os termos "plasmídeo" e "vetor" podemser utilizados intercambiavelmente aqui como o plasmídeo éa forma mais comumente utilizada de vetor. Entretanto, ainvenção tem a intenção de incluir tais outras formas devetores de expressão, tais como vetores virais (porexemplo, retrovírus, adenovírus e vírus associados a adenode replicação defeituosa), os quais possuem funçõesequivalentes.
Os vetores de expressão recombinantes da invençãocompreendem um ácido nucléico da invenção em uma formaapropriada para expressão do ácido nucléico em uma célulahospedeira, o que significa que a expressão do vetorrecombinante inclui uma ou mais seqüências regulatórias,selecionadas com base nas células hospedeiras para seremutilizadas para expressão, a qual está operacionalmenteligada a seqüência de ácido nucléico a ser expressa. Dentrode um vetor de expressão recombinante, "operacionalmenteligada" tem a intenção de significar que a seqüêncianucleotídica de interesse está ligada a seqüência(s)regulatória(s) em uma maneira a qual permite a expressão daseqüência nucleotídica (por exemplo, em um sistema in vitrode transcrição/tradução ou em uma célula hospedeira quandoo vetor é introduzido na célula hospedeira). 0 termo"seqüência regulatória" tem a intenção de incluirpromotores, acentuadores e outros elementos de controle deexpressão (por exemplo, sinal de poliadenilação). Taisseqüências regulatórias estão descritas, por exemplo, emGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzimology185, Editora Academic, São Diego, CA (1990). Seqüênciasregulatórias incluem aquelas a qual expressão constitutivadirecionam de uma seqüência nucleotidica em diversos tiposde células hospedeiras e aquelas as quais direcionamexpressão da seqüência nucleotidica apenas em uma certacélula hospedeira (por exemplo, seqüências regulatóriastecido específicas). Isto será apreciado por aqueles dehabilidade na arte que o desenho do vetor de expressão podedepender de tais fatores como escolha da célula hospedeiraa ser transformada, o nível de expressão da proteínadesejada, etc. os vetores de expressão da invenção podemser introduzidos em células hospedeiras para, dessa forma,produzirem proteínas ou polipeptídeos, codificados porácidos nucléicos como descrito aqui (por exemplo, proteínascaroase 01-05, formas mutantes das proteínas caroase 01-05,fragmentos, variantes ou equivalentes funcionais destas,proteínas de fusão, etc.).
Os vetores de expressão recombinantes da invençãopodem ser desenhados para expressão de proteínas caroase01-05 em células procariotas ou eucariotas. Por exemplo,proteínas caroase 01-05 podem ser expressas em células defungos, células bacterianas tais como E. coli, células deinsetos (utilizando vetores de expressão de baculovírus),células de levedura ou células de mamíferos. Célulashospedeiras apropriadas estão adicionalmente discutidas emGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzimology185, Editora Academic, São Diego, CA (1990).Alternativamente, o vetor de expressão recombinante podeser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo,utilizando seqüências promotoras regulatórias T7 epolimerase T7.
Vetores de expressão úteis na presente invençãoincluem vetores cromossomal, epissomal e derivados devírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeosbacterianos, bacteriófagos, epissoma de levedura, elementoscromossomais de levedura, vírus tais como baculovírus,vírus do papiloma, vírus vaccínia, adenovírus, pox vírus deave, vírus pseudo-raiva e retrovírus, e vetores derivadosde uma combinação destes, tais como aqueles derivados apartir de elementos genéticos de plasmídeo e bacteriófago,tais como cosmídeos e fagomídeos.
O inserto de DNA deve estar operacionalmente ligado aum promotor apropriado, tal como o promotor PL do fagolambda, o Iac de E. coli, promotores trp e TAC, ospromotores inicial e tardio de SV4 0 e promotores de LTRsretrovirais, para nomear alguns poucos. Outros promotoresapropriados serão conhecidos da pessoa de habilidade. Emuma modalidade específica, promotores são preferidos talque são capazes de dirigir um alto nível de expressão deperoxidases em procariotos ou fungos filamentosos. Taispromotores são conhecidos na arte. As construções deexpressão podem conter sítios de iniciação, terminação datranscrição e, na região transcrita, um sítio de ligação aoribossomo para tradução. A porção codante dos transcritosmaduros expressos pelas construções incluirá a tradução doAUG inicial no início e um códon de terminação posicionadoapropriadamente ao final do polipeptídeo a ser traduzido.
Vetor DNA pode ser introduzido em células procariotasou eucariotas via transformação convencional ou técnicas detransfecção. Como utilizado aqui, os termos "transformação"e "transfecção" têm a intenção de se referir a umavariedade de técnicas reconhecidas na arte para introduzirácido nucléico exógeno (por exemplo, DNA) em uma célulahospedeira, incluindo co-precipitação com fosfato de cálcioou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran,trandução, infecção, lipofecção, transformação mediada porlipídio catiônico ou eletroporação. Métodos apropriadospara transformar ou transfectar células hospedeiras podemser encontrados em Sambrook, et al. (Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Editora Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY, 1989),Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology (1986) eoutros manuais de laboratório.
Para transfecção estável em células de mamífero, ésabido que, dependendo do vetor de expressão e técnica detransfecção utilizada, apenas uma pequena fração dascélulas pode integrar o DNA exógeno em seu genoma. Com oobjetivo de identificar e selecionar estes integrantes, umgene que codifica um marcador seletivo (por exemplo,resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nascélulas hospedeiras juntamente com o gene de interesse.Marcadores de seleção preferidos incluem aqueles os quaisconferem resistência a drogas, tais como G418, higromicinae metatrexato. Ácido nucléico codificando um marcadorseletivo pode ser introduzido em uma célula hospedeira nomesmo vetor que codifica proteína caroase 01-05 ou pode serintroduzido em um vetor separado. Células estavelmentetransfectadas com o ácido nucléico introduzido podem seridentificadas através de seleção por droga (por exemplo,células que incorporaram o gene marcador seletivosobreviverão, enquanto as outras células morrerão).
Expressão de proteínas em procariotos é freqüentementerealizada em vetores E. coli com vetores contendopromotores constitutivos ou induzíveis direcionando aexpressão de tanto proteínas de fusão ou não de fusão.Vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a umaproteína codificada neste, por exemplo, ao amino terminalda proteína recombinante. Tais vetores de fusão tipicamenteservem a três propósitos: 1) para aumentar a expressão deproteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade daproteína recombinante e 3) para auxiliar na purificação daproteína recombinante pela atuação como um ligante napurificação por afinidade. Freqüentemente, em vetores deexpressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica éintroduzido na junção da porção de fusão e a proteínarecombinante para permitir separação da proteínarecombinante a partir da porção de fusão subseqüente apurificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suasseqüências de reconhecimento cognato, incluem Fator Xá,trombina e enteroquinase.
Como indicado, os vetores de expressão irãopreferencialmente conter marcadores selecionáveis. Taismarcadores incluem dihidrofolato redutase ou resistência àneomicina para cultura de células eucarióticas eresistência à tetraciclina ou ampicilina para cultivo em E.coli e outras bactérias. Exemplos representativos dehospedeiro apropriado inclui células bacterianas, tais comoE. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células defungo, tais como levedura; células de inseto tais como S2de Drosophila e Spodoptera SI9; células animais tais comoCHO, COS e melanoma de Bowes; e células vegetais. Meios decultura e condições apropriados para as células hospedeirasdescritas acima são conhecidas na arte.
Entre vetores preferidos para utilização em bactériasestão pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis a partir da Qiagen;vetores pBS, vetores Phagescript, vetores Bluescript,pNH8A, pNH16A, pNH18A, Pnh46A, disponíveis a partir daStratagene e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5disponíveis a partir da Pharmacia. Entre vetores eucariotospreferidos estão PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZTl e pSGdisponíveis a partir da Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG epSVL disponível a partir da Pharmacia. Outros vetoresapropriados serão prontamente aparentes para o artesãohabilitado.
Entre promotores bacterianos conhecidos parautilização na presente invenção estão incluídos promotoresIacI e IacZ de E. coli, os promotores T3 e T7, o promotorgpt, os promotores PR7 PL de lambda e o promotor trp, opromotor timidina quinase de HSV, os promotores inicial etardio de SV4 0, os promotores das LTRs retrovirais, taiscomo aqueles do vírus do sarcoma de Rous ("RSV") epromotores de metalotioneína, tal como o promotor demetalotioneína-I de rato.
Transcrição do DNA codificando os polipeptídeos dapresente invenção por eucariotos superiores pode seraumentada pela inserção de uma seqüência acentuadora novetor. Acentuadores são elementos que atuam em eis,usualmente de aproximadamente 10 a 3 00 pb que atuam paraaumentar atividade transcricional de um promotor em um dadotipo de célula. Exemplos de acentuadores incluem oacentuador SV4 0, o qual está localizado na parte tardia daorigem de replicação em 100 a 270 pb, o acentuador dopromotor inicial de citomegalovirus, o acentuador depolioma na parte tardia da origem de replicação eacentuadores de adenovírus.
Para secreção da proteína traduzida para o lúmem doretículo endoplasmático, para o espaço periplasmático oupara o ambiente extracelular, sinal de secreção apropriadopode ser incorporado no polipeptídeo expresso. Os sinaispodem ser endógenos para o polipeptídeo ou eles podem sersinais heterólogos.
0 polipeptídeo pode ser expresso em uma formamodificada, tal como uma proteína de fusão e pode incluirnão apenas sinais de secreção, mas também regiõesfuncionais heterólogas adicionais. Desta forma, porexemplo, uma região de aminoácidos adicionais,particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionadaao N-terminal do polipeptídeo para melhorar estabilidade epersistência na célula hospedeira, durante purificação oudurante subseqüente manuseio e estocagem. Além disso,porções peptídicas podem ser adicionadas ao polipeptídeopara facilitar purificação.
Células hospedeiras
Em outra modalidade, a invenção destaca células, porexemplo, células hospedeiras transformadas ou célulashospedeiras recorabinantes que contêm um ácido nucléicoabrangido pela invenção. Uma "célula transformada" ou"célula recombinante" é uma célula na qual (ou em umancestral no qual) foi introduzido, por meios de técnicasde DNA recombinante, um ácido nucléico de acordo com ainvenção. Ambas as células procariotas e eucariotas estãoincluídas, por exemplo, bactéria, fungo, levedura esimilares.
Exemplos de células hospedeiras apropriadas sãoMicrocystis, Lepista, por exemplo, L. irina, Cyathus, porexemplo, C. pallidus, Ganoderma, por exemplo, G.applanatum, Ischnoderma, por exemplo, I. benzoinum,Marasmius, por exemplo, M. scorodonius, Trametes, porexemplo, T. suaveolens de T. vesicolor, Cryptococcus, porexemplo, C. Iaurentii, por exemplo, H. odoratus ou Phaffia,por exemplo, P. rhodozyma, Phaneroehaetel por exemplo, P.ehrysosporium, Lentinula, por exemplo, L. edodes, Coprinus,por exemplo, C. einereus, Gloeophyllum, por exemplo, G.trabeum, Ophiostoma, por exemplo, O. piliferum,Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. oryzae, A. nidulans,Thermomyces, por exemplo, T. Iauginosa, Sporotrichum, porexemplo, S. thermophile, Aureobasidium, por exemplo, A.pullulans, Amorphotheea, por exemplo, A. resinae,Leucosporidium, por exemplo, L. seottii, Cunninghamella,por exemplo, C. elegans.
Especialmente preferidas são células de fungosfilamentosos, em particular Aspergillus - por exemploAspergillus oryzae ou Aspergillus niger - e Marasmius - porexemplo Marasmius scorodonius - ou células de levedurastais como Piehia - por exemplo Piehia Patoris - ou célulasde bactéria.
Uma célula hospedeira pode ser escolhida que modulam aexpressão das seqüências inseridas, ou modifica e processao produto gênico de uma maneira especifica, desejada. Taismodificações (por exemplo, glicosilação) e processamento(por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podemfacilitar funcionamento ótimo da proteína.
Diversas células hospedeiras possuem características emecanismos específicos para processamento e modificaçãopós-traducional de proteínas e produtos gênicos. Linhagenscelulares apropriadas ou sistemas hospedeiros familiaresdaqueles de habilidade na arte da biologia molecular e/oumicrobiologia podem ser escolhidas para garantir amodificação desejada e correta e processamento da proteínaexógena expressa. Para este fim, células hospedeiraseucariotas que possuem a maquinaria celular paraprocessamento próprio do transcrito primário, glicosilaçãoe fosforilação do produto gênico podem ser utilizadas. Taiscélulas hospedeiras são bem conhecidas na arte.
Células hospedeiras também incluem, mas não se limitama, linhagens de células de mamíferos tais como linhagenscelulares CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 edo plexo coróide.
Se desejado, os polipeptídeos de acordo com a invençãopodem ser produzidos por uma linhagem celular estavelmentetransfectada. M número de vetores apropriados paratransfecção estável de células de mamíferos está disponívelpara o público, métodos para construção de tais linhagenscelulares também são publicamente conhecidos, por exemplo,em Ausubel et al. (supra).Utilização dos polipeptídeos de acordo com a invençãoem processos industriais
Outro aspecto da invenção compreende a utilização dospolipeptídeos de acordo com a invenção ou equivalentesfuncionais destes (aqui e daqui em diante referido como aenzima branqueadora) em processos industriais como, porexemplo, detergentes, processos de lavagem enzimática depedras para produção alimentícia, por exemplo, produtoscomo pães ou produtos laticínios.
O polipeptídeo de acordo com a invenção pode serutilizado como uma preparação ou produzida in situ por ummicroorganismo capaz de produzir referida enzima. O preparode enzima pode ser derivado de diversas fontes, porexemplo, a partir de plantas, animais e microorganismos.
Preferencialmente a preparação da enzima é derivada apartir de um microorganismo, uma vez que microorganismostornam possível obter a enzima em uma escala industrial deuma maneira controlada. A preparação de enzima derivada apartir de um microorganismo pode ser obtida por processosde fermentação clássicos de uma linhagem microbianaselecionada ou por fermentação de um microorganismo quesuper expressa o polipeptídeo de acordo com a invenção. 0microorganismo pode ser uma bactéria, um fungo ou levedura.
Por exemplos de microorganismos apropriados como célulashospedeiras para fermentação não-clássica é referida apassagem acima com relação às células hospedeiras.
A preparação da enzima pode também compreender outrasenzimas apropriadas, tais como, por exemplo,oxidoredutases, amilases, enzimas lipolíticas, enzimashidrolisantes. Foi descoberto surpreendentemente queespecialmente a combinação de uma oxidoredutase, porexemplo, uma hexose redutase, piranose redutase, uma enzimaoxidante de maltose ou glicose oxidase possui um efeitosinergético na atividade da enzima da enzima branqueadorade acordo com a invenção. A oxidoredutase pode ser obtida apartir de diferentes fontes, incluindo microorganismos.Preferencialmente, uma oxidoredutase a partir de uma fontefúngica é utilizada, por exemplo, a partir de um fungofilamentoso. Uma oxidoredutase apropriada obtenivel apartir de, por exemplo, espécies Aspergillus, tais comoAspergillus niger. A presente invenção, desta maneira,também se relaciona a uma nova combiação enzimática dopolipeptideo de acordo com a invenção com umaoxidoredutase.
Este efeito é mesmo acentuado no caso da aplicação naqual a preparação enzimática de acordo com a invenção éutilizada, possui substrato presente no qual aoxidoredutase é ativa. No caso desta não estar presente,esta pode ser também adicionada ao processo. Um exemplo detal substrato é a adição de glicose após a utilização deuma hexose oxidase ou glicose oxidase. A presente invenção,por conseguinte, também se relaciona a uma nova composiçãocompreendendo a preparação enzimática compreendendo opolipeptideo de acordo com a invenção e uma oxidoredutaseassim como um substrato para a oxidoredutase.
A invenção adicionalmente se relaciona a utilização danova combinação enzimática e nova composição no processo deprodução de um produto alimentício de acordo com a invençãoo qual está descrito abaixo.
Surpreendentemente, foi descoberto que ospolipeptídeos de acordo com a invenção ou seus equivalentesfuncionais podem ser utilizados para aumentar brancura de,pelo menos, uma parte de um produto alimentício.
Preferencialmente, o polipeptídeo branqueador de acordo coma invenção é utilizado no processo de produção de alimentoa seguir. Um processo para a produção de um produtoalimentício no qual uma forma intermediária dos referidosprodutos alimentícios compreende um pigmento, o qualprocesso compreende adição de, pelo menos, um polipeptídeode acordo com a invenção em uma quantidade que é eficaz emaumentar a brancura de, pelo menos, uma parte do produtoalimentício comparado ao produto alimentício para o qual areferida enzima não foi adicionada durante sua produção.
Uma forma intermediária do produto alimentício estádefinida aqui como qualquer forma que ocorre durante oprocesso de produção antes da obtenção da forma final doproduto alimentício. A forma intermediária pode compreenderas matérias primas individuais utilizadas e/ou misturadestas com aditivos e/ou auxiliares de processamento ouforma subseqüentemente processada destas.
0 polipeptídeo de acordo com a invenção é adicionadoem quantidades eficazes. A pessoa habilitada podefacilmente determinar essa quantidade efetiva pela variaçãoda dosagem enzimática e medição da degradação dos pigmentose/ou o aumento da brancura do produto alimentício final. Nocaso da enzima ser capaz de converter beta-caroteno, aquantidade eficaz da enzima pode ser expressa em termos deunidades degradantes de beta-caroteno (por exemplo,unidades Aziz ou Zorn - veja Materiais e Métodos).
0 produto alimentício pode ser feito a partir de, pelomenos, uma matéria prima que é de origem vegetal, tal comofarinha de trigo. Este último é conhecido por conterpigmentos tais como carotenóides (carotenos e xantofilas) eflavonas, os quais são responsáveis por, por exemplo, a cordo farelo de pão assado. Alternativamente, estes pigmentospodem ser originados de outras fontes além de matériasprimas vegetais, por exemplo, do leite. Exemplos decarotenóides são substâncias adicionais com um esqueleto decarotenóide, em particular com um esqueleto de beta-caroteno ou capsantina, mais particularmente alfa- e beta-caroteno, luteina, licopeno, anteraxantina, capsantina,zeaxantina, violaxantina, astaxantina, cantaxantina,luteoxantina, neoxantina e os respectivos apo-carotenóides.
Um produto alimentício preferido para o processo deacordo com a invenção é pão assado e outros produtosassados de farinha de trigo e/ou farinhas de origem emoutros cereais.
Por exemplo, para o produto alimentício pão assado, asformas intermediárias compreendem, por exemplo, farinha detrigo, a mistura inicial desta com outros ingredientes dopão tais como, por exemplo, água, sal levedura ecomposições melhoradoras do pão, a massa misturada, a massaamassada, a massa descansada e a massa parcialmente assada.No caso da enzima ser capaz de converter beta-caroteno, aenzima é adicionada à farinha de trigo e/ou farinhas deorigem de outros cereais ou a qualquer mistura inicial comoutros ingredientes do pão, em uma quantidade tal pararesultar entre 1 e 5000 unidades Zorn por kg de farinha,preferencialmente entre 5 e 1000 unidades Zorn por kg defarinha, mais preferencialmente entre 10 e 500 unidadesZorn por kg de farinha e mais preferencialmente entre 25 e25 0 unidades Zorn por kg de farinha. A enzima pode tambémser adicionada junto com u como parte de uma misturamelhoradora do pão com outra massa e/ou auxiliaresmelhoradores do processo conhecidos na arte, tais como umaou mais enzimas conhecidas na arte (por exemplo, enzimasamilolíticas tais como alfa-amilase, beta-amilase,amiloglicosidase, alfa-amilase anti-mofo maltogênica,enzimas lipoliticas tais como lipase, fosfolipase,galactolipase, enzimas oxidantes tais como glicose oxidase,hexose oxidase, lacase, piranose oxidase, carboidratooxidase, enzimas hemicelulolíticas tais como xilanase,arabinofuranosidase, enzimas celulolíticas tais como endo-glicanases (tais como celulases), celobiohidrolases,proteases e/ou auxiliares processadores químicos conhecidosna arte tais como agentes redutores e oxidantes (porexemplo, ácido ascórbico, glutationa), emulsificantes (porexemplo, DATEM), etceteras.
Em alguns tipos de macarrão, um produto branco é vistocomo desejável. Por exemplo, para macarrões, as formasintermediárias compreendem, por exemplo, farinha de trigo,a mistura inicial desta com água, sal e outros ingredientesdos macarrões, a massa misturada e o produto macarrão finalque pode ser fresco, seco, cozido, cozido à vapor e/oufrito.
0 produto alimentício pode também ser um produto seco.
Por produto seco é significado produtos que contêm, pelomenos, 10 % em peso, preferencialmente, pelo menos, 30 % empeso, mais preferencialmente, pelo menos, 50 % em peso,ainda mais preferencialmente, pelo menos, 70 % em peso oumais preferencialmente, pelo menos 8 0 % em peso em basesólida seca de componentes originados a partir do leite,preferencialmente leite de vaca. Componentes originados apartir do leite são, por exemplo, gorduras, proteínas, porexemplo, soro de queijo coalho e caseína, etc. leite,especialmente leite de vaca, pode naturalmente contercomponentes coloridos tais como carotenóides, por exemplo,beta-caroteno.
Brancura exerce uma importante função em, por exemplo,queijo, óleo de manteiga, leite em pó ou produtos do soro.Por exemplo, para queijos como Feta, Mussarela, Ricota eGorgonzola, por exemplo, Danish Blue, Roquerfort ouGorgonzola, brancura é considerada desejável. Em queijosonde leite de cabra ou ovelha é, pelo menos, parcialmentesubstituído por leite de vaca, a brancura do queijo podeser um problema por causa do β-caroteno que está presenteno leite de vaca.
Para alguns agentes de ocorrência natural corantes dequeijos como anato ou beta-caroteno são utilizados comoagentes corantes de alimento. Entretanto, agente corantetambém estará presente no soro. Quando este soro éadicionalmente processado em, por exemplo, fórmula parabebê, a cor do produto do soro pode ser indesejada. Para oproduto alimentício queijo cremoso, os produtosintermediários compreendem, por exemplo, leite e queijocoalho.
Medição da brancura de um produto pode ser feitovisualmente ou uma medição de reflexão, por exemplo, porvarredura. Em medição de reflexão, as cores sãoquantificadas com três parâmetros: fator-L (preto =Oabranco = 100) , fator-a (verde = -60 a vermelho = +60) efator-b (azul = -60 a amarelo = +60) . No caso decarotenóides, o fator-b do produto produzido épreferencialmente tão próximo a 0 quanto possível,preferencialmente entre 10 e 0, mais preferencialmenteentre 5 e 0 e ainda mais preferencialmente mais baixo doque 1 e mais preferencialmente abaixo de 0,5. Em um aspectoadicional, a invenção fornece um produto alimentícioobtenível pelo processo da invenção como descritoanteriormente aqui. Estes produtos alimentícios sãocaracterizados por, pelo menos, partes possuindo brancurasignificativamente aumentada em comparação com produtosalimentícios obteníveis por processos de produção que nãocompreende adição de uma ou mais enzimas capazes deconverter pigmentos nos produtos intermediários.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece autilização de enzimas capazes de converter pigmentos parabranqueamento de produtos alimentícios, por exemplo,produtos com base em farinha ou derivados de leite.
Surpreendentemente, foi descoberto que estas enzimas podemvantajosamente ser utilizadas como um removedor de manchasem detergentes familiares. Em particular, as enzimas semostraram muito eficientes em remover manchas coloridas,por exemplo, manchas de grama, manchas de café e chá, apartir de ambas as fabricações de algodão e sintética (porexemplo, poliéster). Além disso, as enzimas podem tambémser utilizadas em processos de branqueamento enzimático depedra, por exemplo, pelo branqueamento de corante índigo emjeans azul a um nível desejado.
Materiais e MétodosMedição da conversão de beta-carotenoMedição da degradação de beta-caroteno de acordo com Aziz
Atividade da enzima pode ser determinada comoatividade da conversão de beta-caroteno de acordo com A.Bem Aziz (1971), Photochemistry 10, 1445. Uma unidade daenzima é definida aqui como uma quantidade de enzima queconverte 1 micrograma de beta-caroteno por minuto min(também referida como unidade Aziz).
Medição da degradação de beta-caroteno de acordo com Zorn
A atividade da enzima pode também ser determinada comoatividade da conversão de beta-caroteno de acordo com Zornet al (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:331-336. Umaunidade da enzima está aqui definida como a quantidade deenzima que converte 1 micromol de beta-caroteno por minuto(também referido como unidade Zorn). 0 ensaio é realizadocomo segue: 1,5 mL da enzima contendo amostra foi pré-incubado em uma cuveta a 27°C por 5 min antes de 100 pL dasolução estoque de beta-caroteno (veja posteriormenteabaixo) ser adicionado. Se necessário, o sobrenadanteconcentrado da cultura foi diluído com um tampão ácidocítrico/forfato pH 5,5 (esse tampão foi preparado pelamistura de soluções 43 mL de ácido cítrico 0,1 M com 56 mLde Na2PO4 0,2 Μ) . A diminuição da absorbância foimonitorada por 15 min a 450 nm e 27 0C utilizando umespectrofotômetro em uma mantedora de célula de temperaturacontrolada. A curva foi checada para linearidade e aatividade enzimática foi calculada com a parte linear dacurva de acordo com a seguinte equação:
Atividade da enzima [mU/mL] = (ΔΕ χ Vt) x IO6/(Vs χ d χ ε)
Onde U = unidade de atividade enzimática definidaacima; ΔΕ = diminuição de absorbância a 450 nm por minuto;Vt = volume total em cuveta (mL); Vs = volume de amostra emcuveta (mL); ε = coeficiente de extinção do beta-caroteno oqual é 95.ooo M-1Cm"1; d = espessura da cuveta (cm)] .
A unidade de enzima Aziz pode ser convertida para aunidade Zorn pela divisão das unidades Aziz pelo o pesomolecular do beta-caroteno = 536, 85.
Preparação da solução estoque de beta-caroteno
A solução estoque de beta-caroteno foi preparo comosegue: 5 mg de beta-caroteno e 500 mg de Tween-80 foramdissolvidos em 5 0 mL de diclorometano. 0 diclorometano foievaporado a 40°C e 80 kPa em um evaporador rotatório.Quando praticamente todo diclorometano foi evaporado, 3 0 mLde água foram adicionados e o diclorometano foi eliminadono evaporador rotatório e finalmente em uma corrente denitrogênio. A solução resultante foi filtrada e completadaaté 5 0 mL com água em um frasco graduado. A solução deveser estacada no frio (refrigerador) e é estável por unspoucos dias apenas.
Branqueamento de produtos alimentícios
Branqueamento foi determinado após extração decarotenóides a partir de farelo ou massa como indicado porGelinas, Creal Chem. 75, 810-184 (1998).
Brancura de um produto alimentício pode serdeterminado tanto visualmente assim como por medições dereflexão. Inspeção visual pode ser realizada por comparaçãode produtos alimentícios aos quais uma enzima branqueadoraé adicionada versus um controle sem enzima branqueadoraadicional. Medições de reflexão podem ser realizadas pelavarredura do produto alimentício em um scanner colorido(Hewlett Packard Scanjet ADF). Estes dados podem seranalisados utilizando o programa LabSMART (LabSMART, LLC,Logan Utah, EUA).
Exemplo 1
Cultivo e determinação da atividade da enzima conversora debeta-caroteno obtida a partir de Marasmius scorodoniusCultivo e determinação da atividade das enzimasconversoras de β-caroteno caroase-01 e caroase-02 obtidas apartir de Marasmius scorodonius foram realizados comodescrito em Zorn et al. (2003). Aqui, micélio a partir dacoleção de cultura de Marasmius scorodonius (obtenível apartir do Centraal Bureau voor Schimmelcultures - UtrechtfHolanda com número de depósito CBS 137.83) foi utilizadopara inocular placas de Agar suplementadas com beta-caroteno emulsifiçado. Incubação das placas foi realizada a24°C por 14 dias. 300 mL de frascos de agitação contendo100 mL de solução padrão de nutrição (SNL, contendo 3 0g/litro de glicose.H2O; 4,5 g/litro de asparagina; 1,5g/litro de KH2PO4; 0,5 g/litro de MgSO4; 3,0 g/litro deextrato de levedura; 1 mL/litro de uma solução de elementotraço esterilizada contendo 5 g/L CuS04*5aq, 8 0 mg/LFeCl3*6aq, 90 mg/L ZnS04*7aq, 30 mg/L MnS04*laq e 40 mg/LEDTA; o pH foi ajustado para 6,0 com NaOH 1 N antes daesterilização) foram inoculados com micélio e foramincubados a 24 °C por 7 dias em uma incubadora com agitaçãoa 150 rpm. As pré-culturas foram checadas para a ausênciade contaminações microbianas, homogeneizadas por UltraTurrax e utilizadas para inocular as culturas principais(250 mL em frascos Erlenmeyer de 500 mL) . A partir dosegundo dia, a cada dia 2 mL de amostras eram recolhidos,centrifugados para remover o micélio e a atividade eramedida em um ensaio de espectrofotometria. Após 4 dias decultivo, a atividade beta-degradante era de aproximadamente0,3 unidades Zorn por litro de sobrenadante livre decélula.
Exemplo 2
Efeito de H2O2 na atividade das enzimas conversoras de beta-caroteno caroase-1 e caroase-2 obtidas a partir de M.scorodonius
0 efeito de 10 microlitros de peróxido de hidrogênio(H2O2) é determinado no ensaio in vitro ensaio dedegradação de beta-caroteno como está descrito abaixo.
Sobrenadantes de cultura concentrados de M. scorodonius,contendo caroase-01 e caroase-02 foram utilizados. Aatividade de degradação de beta-caroteno aumentou de 4,3para 10,9 mU na presença de H2O2. Quando enzima ativada porcalor foi utilizada, nenhuma degradação de beta-carotenofoi observada. Isto demonstrou claramente que H2O2 estimulaatividade de degradação de beta-caroteno pela enzimadegradante de beta-caroteno.
Exemplo 3
Efeito da glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger naatividade da caroase-01 e caroase-02 de M. scorodoniusmicrolitro do sobrenadante de cultura concentradode M. scorodonius foram misturados com 1290 microlitros dotampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,5). 160 microlitros deuma solução de glicose 500 mM foram adicionados e a misturafoi temperada por 5 min a 27 graus Celsius. A glicoseoxidase de Aspergillus niger foi obtida a partir de Fluka.
A reação foi iniciada pela adição de 0-2 microlitros dasolução estoque da glicose oxidase (100 U/mL,correspondente a uma atividade de 0 - 200 mU de GOX) e 100microlitros da solução de beta-caroteno (preparação comoestá mencionada em "Material e Métodos"). A diminuição daabsorção foi lida a 450 nm por 10 min a 27 graus Celsius(Tabela 1).
Tabela 1: Degradação de beta-caroteno por sobrenadante decultura concentrado de M. scorodonius na presença de 50 mMde glicose e diversas doses de GOX.
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Em uma segunda série de experimentos, a concentraçãode glicose foi variada, enquanto a quantidade de atividadede glicose oxidase de M. scorodinius foi mantida constante.
Por conseguinte, 5 0 microlitros de sobrenadante de culturaconcentrado de M. scorodonius foram misturados com 1434 a1290 microlitros de tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,5)e 16 - 160 microlitros de solução de glicose 500 mM foramadicionados (tabela 2) . A mistura foi mantida por 5 min a27 graus Celsius e a reação foi iniciada pela adição de 0 -1 microlitro de GOX (correspondendo a uma atividade de 0 a100 mU) e 100 microlitros de solução de beta-caroteno.
Tabela 2: Degradação de beta-caroteno por sobrenadante decultura concentrado de M. scorodonius na presença dediversas concentrações de glicose e uma dosagem de glicoseoxida.se de 100 mU.
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Nos brancos (50 mM de glicose, 100 mU de GOX, semadição de sobrenadante da cultura) não foi observadadegradação de beta-caroteno.
A partir destes experimentos, é claro que a presençade GOX na presença de glicose fortemente estimuladegradação de beta-caroteno pelo sobrenadante concentradode M. scorodonius.
Exemplo 4 e exemplos comparativos A, B e C
Teste de pão pequeno assado
Em um processo de preparação de pequenos pães assados,foram preparados a partir de 200g de farinha de trigo (umamistura de 160 g de farinha de trigo (Kolibri® - Meneba,Holanda) e 4 0 gramas de farinha de trigo (íbis® - Meneba —Holanda)), 1,4 g de levedura seca Fermipan® (DSM BakeryIngredients, Deft, Holanda), 4 g de sal, 50 ppm de ácidoascórbico, 4 ppm de α-amilase fúngica Bakezyme® P500 (DSMFood Specialities, Delft, Holanda), 60 ppm de hemicelulasefúngica Bakezyme® HS2000 (DSM Food Specialities, Delft,Holanda) e a quantidade de enzima degradante de ETA-caroteno como indicada na Tabela 3 e 116 mL de água em umagitador por 6 minutos e 15 segundos. A temperatura damassa era de 28 °C. Diretamente após mistura, a massa foidividida em dois pedaços de 15° g cada, arredondada eprovada por 4 5 minutos em uma cabine de prova a 30 °C,colocada no formato e criticada. Após uma prova final de 7 0minutos a 30°C, a massa foi assada por 20 minutos a 225°C.
Após 24 horas de estocagem em uma caixa fechada àtemperatura ambiente a qualidade do farelo e cor do pãoassado foi avaliada pelo padeiro; a quantidade decarotenóides foi determinada após extração do farelo de pãocomo indicado na Tabela 4.
Tabela 3: Dosagem enzimática (expressa em unidades Zorn por200 gramas de farinha)
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Tabela 4: Conteúdo carotenóide dos pães e identificaçãovisual
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A partir da Tabela 4 pode ser concluído que pelaadição de enzimas branqueadoras de acordo com a invenção àmassa, carotenóides são degradados, resultando em um farelomais branco. A eficiência do processo de acordo com ainvenção é melhor do que a enzima de soja utilizadaLipoxigenase 2 e é, pelo menos, igual a ou melhor que autilização da enzima ativa da farinha de soja.
Exemplo 5
Preparação de mini queijos
Queijos miniaturas foram produzidos como descrito porShakeel-Ur-Rehman et al. (Protocol for the manufacture ofminiature cheeses in Lait, 78 (1998), 607-620). Leite devaca bruto foi pasteurizado por aquecimento por 3 0 minutosa 63°C. o leite pasteurizado foi transferido para garrafasplásticos de centrífuga de boca larga (200 mL por garrafa)e resfriados a 31°C. Subseqüentemente, 0,72 mL de culturasiniciais DS 5LT1 (DSM Gist B.V., Delft, Holanda) foiadicionado a cada dos 200 mL de leite pasteurizado nasgarrafas de centrífuga e o leite foi amadurecido por 20minutos. Após isto, CaCl2 (132 pL de uma solução 1 mol.L"1por 200 mL de leite amadurecido) foi adicionado, seguidopela adição do coagulante (0,04 IMCU por mL) . No caso doexperimento envolver a utilização de caroase-01 e caroase-02, esta enzima foi adicionada junto com o coagulante.
As soluções de leite foram mantidas por 40-50 minutosa 31°C até que um coágulo fosse formado. 0 coágulo foicortado manualmente por cortadores de arame estendido,espaçado 1 cm separado em um quadro. Cura foi permitida por2 minutos seguida de agitação gentil por 10 minutos. Apósisto, a temperatura foi aumentada gradualmente para 39°Cpor 30 minutos sob agitação constante da misturacoalho/soro. Até atingir um pH de 6,2 as misturascoalho/soro foram centrifugadas a temperatura ambiente por60 minutos a 1.700 g. o soro foi drenado e os coalhos forammantidos em um banho Maria a 36°C. Os queijos foraminvertidos a cada 15 minutos até que o pH tivesse descidopara 5,2 - 5,3 e foram então centrifugados a temperaturaambiente a 1.700 g por 20 minutos. Após drenagem adicionaldo soro, o branqueamento do queijo foi determinado porvarredura. Utilização de enzimas branqueadoras caroase-01 ecaroase-02 resultou em um queijo mais branco.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> DSM IP Assets B.V.
<120> NOVAS ENZIMAS PARA UTILIZAÇÃO EM BRANQUEAMENTO ENZIMÁTICO DE PRODUTOSALIMENTÍCIOS
<130> 24 866WO
<160> 17
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1536
<212 > DNA
<213 > Marasmius scorodonius
<400> 1
agtatgcggc tcacttacct tcccttgttt gcgggcatcg ccatccagtc tgcatgtgcc 60 tttccaaact tctccaagtc ttccatatta aagcctcgta ggacgaactc cctactaatc 120 aatcccgatg ctcagccaga cctcccgacc gcaaagcagg cttccactgc ggctgcttct 180 gtgggtttga accttaccga catccaagga gacatcttaa tcggtatgaa gaagaacaag 240 gaaatgttct tcttcttcag tattgcagat gccgctgcat tcaaatccca cttgggctcc 300 gctattctcc ctcttatcac ctcgacgcaa cagctgcttg ctgttgccag ccagcctacc 360 accgctgtca accttgcctt ctcccaaacc ggattgaatg cgctggggct tgctgctcaa 420 ggcttggggg actccctctt tgccagtggt cagttcagcg gtgcacagag tctcggcgac 480 ccgggaacct cgaactgggt ccaagcgttc gctggtacag gcatacatgg tgtcttcctt 540 ctcgcatcgg ataccgtcga caacgtgaat gccgagctgt cgcaaatcca gtccatcttg 600 ggaacctcca tcactgaggc gtaccgcctt cagggtgagg ctcgtcccgg cgatcagcaa 660 ggccacgaac atttcggatt catggacgga atcagcaacc ctgccatcga cggattctcc 720 actgcgctgc ctggtcaagc cgttctcagt cccggacttt tcctgctagg agaggacggc 780 gatggttcct cgtcttcgcg tccgtcttgg gcaaaggacg gctctttcct tgctttccgc 840 cagcttcaac agcgtgtccc agagttcaac aagttcctcg ctgacaacgc tgcgctaaca 900 cagggtaacg ctgatcttct cggtgcccga atgatgggac ggtggaaatc tggtgctccg 960 gtcgaccttg cccccaccgc ggatgatgtt gatctcgcta atgaccccca aaggaacaac 1020 aacttcaact ttacccacgc cggtttcacc gagaccactg acgaaactca ctgccccttc 1080 tccgctcaca tccgtaagac gaaccctcga tcggacttca acccccagaa caccaacaac 1140 cacatcatcc gtgctggtat tccttacgga cctgaagtca ctgacgctga agcctcatcc 1200 aacacgtcca gcacggacgc tagcctcgag cgtggcttgg ctttcgttgc ataccaatcg 1260aacattggca acggcttcgc attccttcaa caggcttggg ttgacaacgc aaacttcttc 1320
ttcgggaaga ccaccccacc tggtgttgac cccatcatcg gctcggttgc tgcgcagaac 13 80
aacttcgccc ccaacggtcc ccgtcctgtg tccggactcg accccacaga ttcgaccaag 1440
atcgtcacca taaacaccga cttcgtctct tctcgtggag gagaatactt cttctccccc 1500
tcgctctctg cgatccagaa cacgctttct gtttga 1536
<210> 2<211> 1534<212 > DNA
<213> Seqüência Artificial
<220 >
<223> Códon otimizado para hospedeiro A. niger<400> 2
atgcgcctca cttacctccc cctgttcgcc ggcatcgcca tccagtccgc ctgcgccttc 60
cctaacttct ccaagagctc catcctgaag cctcgccgca ccaactccct gctgattaac 120
cccgatgccc agcctgatct ccccaccgcc aagcaggcct ccactgccgc tgcttctgtg 180
ggtctgaact tgaccgatat ccagggcgat atcctcatcg gtatgaagaa gaacaaggag 24 0
atgttcttct tcttctccat tgctgacgcc gccgccttca agtcccacct gggctccgct 300
attctccccc tcatcacctc tacccagcag ctgttggctg tcgccagcca gcctaccacc 360
gctgtcaacc tcgccttctc ccagaccggt ctgaacgctc tgggtttggc ggctcagggc 420
ctgggtgatt ccctcttcgc ctccggtcag ttcagcggtg ctcagtccct cggcgacccc 480
ggtacctcca actgggtcca ggccttcgcg ggtaccggca tccacggtgt cttcctcctc 540
gctagcgaca ccgtcgataa cgtgaacgcc gagctgagcc agattcagag catcttgggt 600
acctccatca ctgaggccta ccgccttcag ggtgaggcgc gtcccggcga ccagcagggc 660
cacgagcact tcggcttcat ggatggtatc agcaaccctg ccatcgacgg cttctccact 720
gctctgcctg gtcaggccgt gctctccccc ggtcttttcc tgttgggtga agacggcgac 780
ggctcgtcct cgtctcgtcc tagctgggcg aaggatggat ctttccttgc cttccgccag 840
cttcagcagc gtgtccccga gttcaacaag ttcctcgctg acaacgctgc tcttacccag 900
ggtaacgccg acctcctggg tgcccgtatg atgggccgct ggaagtctgg tgctcccgtc 960
gatcttgccc ccaccgcgga cgacgtcgat ctcgccaacg atccccagcg caacaacaac 1020
ttcaacttca cccacgccgg tttcaccgag accactgacg agactcactg ccccttcagc 1080
gctcacatcc gcaagactaa cccccgctcg gacttcaacc cccagaacac caacaaccac 1140
atcatccgtg ctggtatccc ttacggacct gaagtcactg acgctgaagc ctcttccaac 1200
acttcctcga ctgacgctag cctcgaacgt ggacttgctt tcgttgcgta ccagtccaac 1260attggcaacg gcttcgcttt cattcagcag aactgggttg acaacgccaa cttcttcttc 1320
ggtaagacca cccctcccgg cattgacccc attatcggtt cgaacgccgc ccagaacaac 1380
ttcgctccca actctcctcg tcccgtttct ggactcgacc ctaccgactc gaccactatc 1440
gtcaccctga acaccgattt cgtggttagc cgtggaggag agtacttctt ctccccctcg 1500
ctttctgcca tccagaacac cttgtctgtt taaa 1534
<210> 3
<211> 1542
<212 > DNA
<213> Marasmius scorodonius
<400> 3
atgaagcttt tttctgcctc tgtttttgct gctatcgtcg ctagtcacta tgcgtcagcg 60actgcccaca tcagggctcc caatgtgaag ccaaggagga caagctcact tctgattact 120ccccctcaac agcctccgct tccatctgct caacaggctg caagtgcctc tagcagtgct 180ggcttgaatc tcaccgacat tcagggtgat attctgatcg gcatgaagaa gaacaaggaa 240ctattcttct tcttcagtgt caccgacgca gctactttca aggctaagct gggatccgac 300attcttggac taatcacatc caccgatcag ctacttgcta atgatactca gcctgtcacg 360gctgtcaacg tcgctttctc tagcactggc ctcaaggcat tgggtatcac agatggtctg 420aaggatcctg tcttcgaggc cggaatgctc agcaacgcag tgagcgactt gagcgatcca 480gggaccggca attgggtccc tgggtttgtc ggcaccagtg ttcatggcgt tttcctactt 540gcatcggaca ccattgacaa tgtaaacacc gagccggcca acatccaaac cattttgaat 600ggctcgatca cggagattca tcgtttacaa ggggaggctc gacccggtga ccagcaaggt 660cacgaacact ttggattcat ggatggaatc agtaacccgg ccgttgatgg atttacacct 720ccagcggaaa taagacctgg acaagcttta attccgcctg gtatcatgct tctcggagag 780gcaaacgaca cttttcagaa tgatcgtcct ccgtgggcca aagatggttc cttccttgtc 840ttccgtcaaa tgcaacagcg cgcgcccgag ttcaacaagt tcctgcaaga tcacgctctt 900aacatgccga atatgacatc cgagcaaggc gctgatctcc ttggtgccag gattgtagga 960cgatggaaaa gtggtgctcc tattgacctc actccgttgg tcgatgaccc agtgttggct 1020gctgacaatc agcgaaataa caacttcgac ttttctgacg ccacgaatca gacacgttgc 1080cctttctctg ctcatatccg caaggctaac ccgcgcggcg atcttggggg tattaataaa 1140ttcccaaacc aacacataat ccgagcggga attccgtatg gacccgaagt taccgacgct 1200gaaagagcgt caaatagctc tagcactgac cctagtctgg agcgtggtct ggcgtttgtg 1260gcctatcagt ctaatatcca gaacggattc gtattccttc aaaagaattg ggttgataat 1320acgaatttct tccgacccgg cactggtgca gatcctctca tcggtacaaa ttctcgtaac 1380
agtggcaccg atgcccccaa cacgcctcgt gtcgtcagcg gcttggatcc taataacgct 1440
acgagcacca tcgaaattga tatcgatttc gtagtttctc gtggaggaga atacttcttc 1500
tcgccctcac tttctgcgat caggactgtg ctttcagtct ag 1542
<210> 4<211> 1543<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Códon otimizado para hospedeiro A. niger<400> 4
atgaagctct tctccgcttc cgttttcgcc gcgatcgtcg cctcgcacta cgcctccgcg 60
actgcccaca tccgcgctcc caacgtgaag ccccgccgca ccaactccct tctgatcact 120
ccccctcagc agcctcccct tccctctgct cagcaggctg cctccgcctc cagctccgct 180
ggcctcaacc ttaccgacat tcagggtgac attctgatcg gcatgaagaa gaacaaggaa 24 0
ctcttcttct tcttctccgt caccgacgcc gctactttca aggctaagct cggatccgac 300
attctcggtc tgatcacctc caccgatcag ctgctcgcta acgacactca gcctgtcacc 360
gctgtcaacg tcgctttctc tagcactggc ctcaaggcct tgggtatcac cgacgatctg 420
aaggatcccg tcttcgaggc cggtatgctc agcaacgccg tgagcgactt gagcgatccc 4 80
ggtaccggca actgggtccc tggcttcgtc ggcacctccg ttcacggcgt tttcctgctc 540
gcctcggaca ccatcgacaa cgtcaacacc gagctggcca acatccagac cattttgaac 600
ggctcgatca ccgagattca ccgtctgcag ggtgaggctc gtcccggtga ccagcagggt 660
cacgagcact tcggattcat ggacggtatc tccaaccccg ccgttgacgg cttcacccct 720
cccgcggaaa tccgtcctgg acaggctctc attccccccg gtatcatgct tctcggtgag 780
gccaacgaca ctttccagaa cgatcgtcct ccctgggcca aggacggttc cttccttgtc 840
ttccgtcaga tgcagcagcg cgcgcccgag ttcaacaagt tcctgcagga tcacgccctc 900
aacatgccca acatgacctc cgagcagggc gctgatctcc ttggtgcccg cattgttgga 960
cgctggaagt ccggtgctcc tatcgacctc actcccttgg tcgatgaccc cgtgttggcc 1020
gccgacaacc agcgcaacaa caacttcgac ttctctgacg ccaccaacca gacccgttgc 1080
cctttctctg ctcacatccg caaggctaac ccccgcggcg atctcggtgg tatcaacaag 1140
ttccccaacc agcacatcat ccgcgccggt attccctacg gtcccgaagt taccgacgct 1200
gagaaggcgt ccaacagctc tagcactgac ccttcgctgg agcgtggtct ggcgttcgtg 1260gcctaccagt ctaacatcca gaacggattc gtgttccttc agaagaactg ggttgacaac 1320
accaacttct tccgtcccgg cactggtgtc gatcctctca tcggtaccaa ctctcgtaac 1380
tccggcaccg atgcccccaa cacccctcgt gtcgtcagcg gcttggatcc taacaacgct 1440
accagcacca tcgagatcga tatcgacttc gtcgtttctc gtggaggcga atacttcttc 1500
tcgccctcgc tctctgccat ccgcactgtg ctctccgtct aaa 1543
<210> 5<211> 1527<212 > DNA
<213> Marasmius scorodonius
<400> 5
atgaagcttt tttctgcctc cgtttttgct gctatcgtcg ctagtcacta tgtgtcaggg 60
actacccaca tcagggctcc caacgtgaag ccaaggagga caaactcact tctgattact 120
ccccctcaac agcctccgct cccatctgct caacaggctg caagtgcctc tagcagtgct 180
ggcttgaatc tcaccgacat tcagggtgat attctgatcg gcatgaagaa gaacaaggaa 24 0
ctatttttct tcttcagcat caccgacgcc gctactttca aggctaagct aggatccgac 3 00
attcttgaac taatcacatc gaccaatcag ttactcgccg tcgccactca gcctatcacg 360
gctgtcaacc tcgcgttctc tagcaccggc ctcaaggcat tgggtgttaa agatgatttg 420
aatgacaccg ttttcgacgc cgggatgctt agcaacgcag tgagcgattt gagcgatccc 480
ggaaccggca attgggtacc tggcttcgta ggtaccgctg ttcatggcgt tttcctactt 540
gcatcggaca ctcttgacaa cgtgaacgcg gaactggcca acattcaaac aatcttgaat 600
ggctcgatta cggagattca tcgtctgcag ggagaggctc gacccggtga tcaacaaggt 660
cacgaacact ttggattcat ggatgggatc agtaacccag ccatcgatgg attttcgacc 720
cggcttcccg gacaagcttt acttccgcct ggacttatgt ttctcggaga ggcaaacgac 780actgtttcgc gtcctccgtg ggccaaagat ggatccttcc ttgtcttccg gcaaatgcaa
cagcgtgtac ctgaattcga caaattcctg caagaccacg ctcttaacat gccgaatatg
acatctgaac aaggtgctga gctcctaggc tccaggatgg tggggcgatg gaaaagtggt 96 0
gctccaatcg atctcactcc gttggtcgat gacccggagt tggctgctga ccctcagcga 1020
aataacaact tcgacttttc tgacgccacg aatcagacac gttgcccttt ctctgctcat 1080
atccgtaaga ctaacccgcg cgctgatctt gggggtattg ataacttccc gacgcgtcac 1140
ataatccgag cgggaattcc atatggaccc gaagttaccg acgctgaaaa agcgtcaaat 1200
agctctagca cagaccctag tctggagcgt ggtctggcgt ttgtggccta tcagtctaat 1260
atcaagaacg cattcgtatt ccttcaacag acttgggttg ataatgcgaa cttctttagg 1320
840
900accaacactg gggcagatcc tatcataggt
aacacgcctc gtaatgttag cggtctggat
atcgaccttg actttgttgt ttctcgtggt
gcgatcagga ctgtgctttc agtctag
<210> 6
<211> 1542<212 > DNA
<213> Marasmius scorodonius
<400> 6
atgaagcttt tttctgcctc cgtttttgct
actgcccaca tcagggctcc caatgtgaag
ccccctcaac agcctccgct tccatctgct
ggcttgaatc tcaccgacat tcagggtgat
ctattcttct tcttcagtgt caccgacgca
attcttggac taatcacatc caccgatcag
gctgtcaacg tcactttctc tagcactggc
aaggatcctg tcttcgaggc cggaatgctc
gggaccggca attgggtccc tgggtttgtc
gcatcggaca ccattgacaa tgtaaacacc
ggctcgatca cggagattca tcgtttacaa
cacgaacact ttggattcat ggatggaatc
ccagcggaaa taagacctgg acaagcttta
gcaaacgaca cttttcagaa tgatcgtcct
ttccgtcaaa tgcaacagcg cgtgcccgag
aacatgccga atatgacatc cgagcaaggc
cgatggaaaa gtggtgctcc tattgacctc
gctgacaatc agcgaaataa caacttcgac
cctttctctg ctcatatccg caaggctaac
ttcccaaacc aacacataat ccgagcggga
gaaaaagcgt caaatagctc tagcactgac
gcctatcagt ctaatatcca gaacggattc
acgaatttct tccgacccgg cactggtgta
accctgtcga acaagaacgg caatctcccc 1380cctaacaatc ccaccggccc ccccaccgaa 1440ggagaatact tcttttcgcc ctccctttcc 1500
1527
gctatcgtcg ctagtcacta tgcgtcagcg 60
ccaaggagga caaactcact tctgattact 120
caacaggctg caagtgcctc tagcagtgct 180
attctgatcg gcatgaagaa gaacaaggaa 24 0
gctactttca aggctaagct gggatccgac 3 00
ctacttgcta atgatactca gcctgtcacg 360
ctcaaggcat tgggtatcac agatgatctg 420
agcaacgcag tgagcgactt gagcgatcca 480
ggcaccagtg ttcatggcgt tttcctactt 540
gagctggcca acatccaaac catttcgaat 600
ggggaggctc gacccggtga ccagcaaggt 660
agtaacccgg ccgttgatgg atttacacct 720
attccgcctg gtatcatgct tctcggagag 780
ccgtgggcca aagatggttc cttccttgtc 840
ttcaacaagt tcctgcaaga tcacgctctt 900
gctgatctcc ttggtgccag gattgtagga 960
actccgttgg tcgatgaccc agtgttggct 1020
ttttctgtcg ccacgaatca gacacgttgc 1080
ccgcgcggcg atcttggggg tattaataaa 1140
attccgtatg gacccgaagt taccgacgct 1200
cctagtctgg agcgtggtct ggcgtttgtg 1260
gtattccttc aaaagaattg ggttgataat 1320
gatcctctca tcggtacaaa ttctcgtaac 1380agtggcaccg atgcccccaa cacgcctcgt gtcgtcagcg gcttggatcc taataacgct 1440acgagcacca tcgaaattga tatcgatttc gtagtttctc gtggaggaga atacttcttc 1500tcgccctcac tttctgcgat caggactgtg ctttcagtct ag 1542
<210> 7
<211> 1536
<212> DNA
<213> Marasmius scorodonius
<400> 7
agtatgcggc tcacttacct tcccttgttt gcgggcatcg ccatccagtc tgcatgtgcc 60
tttccaaact tctctaagtc ttccatatta aagcctcgta ggacgaactc cctactaatc 120
aatcccgatg ctcagccaga cctcccgacc gcaaagcagg cttccactgc ggctgcttct 180
gtgggtttga accttaccga catccaagga gacatcttaa tcggtatgaa gaagaacaag 240
gaaatgttct tcttcttcag tattgcagat gccgctgcat tcaaatccca cttgggctcc 300
gctattctcc ctcttatcgc ctcgacgcaa cagctgcttg ctgttgccag ccagcctacc 360
accgctgtca accttgcctt ctcccaaacc ggattgaatg cgctggggct tgctgctcaa 420
ggcttggggg actccctctt tgccagtggt cagttcagcg gtgcacagag tctcggcgac 480
ccgggaacct cgaactgggt ccaagcgttc gctggtacag gcatacatgg tgtcttcctt 540
ctcgcatcgg ataccgtcga caacgtgaat gccgagctgt cgcaaatcca gtccatcttg 600
ggaacctcca tcactgaggc gtaccgcctt cagggtgagg ctcgtcccgg cgatcagcaa 660
ggccacgaac atttcggatt catggacgga atcagcaacc ctgccatcga cggattctcc 720
actgcgctgc ctggtcaagc cgttctcagt cccggacttt tcctgctagg agaggacggc 780
gatggttcct cgtcttcgcg tccgtcttgg gcaaaggacg gctctttcct tgctttccgc 840
cagcttcaac agcgtgtccc agagttcaac aagttcctcg ctgacaacgc tgcgctaaca 900
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gtcgaccttg cccccaccgc ggatgatgtt gatctcgcta atgaccccca aaggaacaac 1020
aacttcaact ttacccacgc cggtttcacc gagaccactg acgaaactca ctgccccttc 1080
tccgctcaca tccgtaagac gaaccctcga tcggacttca acccccagaa caccaacaac 1140
cacatcatcc gtgctggtat tccttacgga cctgaagtca ctgacgctga agcctcatcc 1200
aacacgtcca gcacggacgc tagcctcgag cgtggcttgg ctttcgttgc ataccaatcg 1260
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aacttcgccc ccaacggtcc ccgtcctgtg tccggacttg accccacaga ttcgaccaag 1440atcgtcacca taaacaccga cttcgtctct tctcgtggag gagaatactt cttctccccc 1500tcgctctctg cgatccagaa cacgctttct gtttga 1536
<210> 8<211> 510<212 > PRT
<213> Marasmius scorodonius
<400> 8
Met Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Leu Phe Ala Gly Ile Ala Ile Gln Ser1 5 10 15
Ala Cys Ala Phe Pro Asn Phe Ser Lys Ser Ser Ile Leu Lys Pro Arg20 25 30
Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Asn Pro Asp Ala Gln Pro Asp Leu Pro35 40 45
Thr Ala Lys Gln Ala Ser Thr Ala Ala Ala Ser Val Gly Leu Asn Leu50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu65 70 75 80
Met Phe Phe Phe Phe Ser Ile Ala Asp Ala Ala Ala Phe Lys Ser His85 90 95
Leu Gly Ser Ala Ile Leu Pro Leu Ile Thr Ser Thr Gln Gln Leu Leu100 105 110
Ala Val Ala Ser Gln Pro Thr Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Gln115 120 125
Thr Gly Leu Asn Ala Leu Gly Leu Ala Ala Gln Gly Leu Gly Asp Ser130 135 140
Leu Phe Ala Ser Gly Gln Phe Ser Gly Ala Gln Ser Leu Gly Asp Pro50 145 150 155 160
Gly Thr Ser Asn Trp Val Gln Ala Phe Ala Gly Thr Gly Ile His Gly165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Val Asp Asn Val Asn Ala Glu Leu180 185 190
Ser Gln Ile Gln Ser Ile Leu Gly Thr Ser Ile Thr Glu Ala Tyr Arg195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Ile Asp Gly Phe Ser Thr225 230 235 240
Ala Leu Pro Gly Gln Ala Val Leu Ser Pro Gly Leu Phe Leu Leu Gly245 250 255
Glu Asp Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Arg Pro Ser Trp Ala Lys Asp260 265 270
Gly Ser Phe Leu Ala Phe Arg Gln Leu Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe275 280 285
Asn Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ala Ala Leu Thr Gln Gly Asn Ala Asp290 295 300
Leu Leu Gly Ala Arg Met Met Gly Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Val305 310 315 320
30
Asp Leu Ala Pro Thr Ala Asp Asp Val Asp Leu Ala Asn Asp Pro Gln325 330 335
Arg Asn Asn Asn Phe Asn Phe Thr His Ala Gly Phe Thr Glu Thr Thr340 345 350
Asp Glu Thr His Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys Thr Asn Pro355 360 365
Arg Ser Asp Phe Asn Pro Gln Asn Thr Asn Asn His Ile Ile Arg Ala370 375 380
Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala Glu Ala Ser Ser Asn385 390 395 400
Thr Ser Ser Thr Asp Ala Ser Leu Glu Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala405 410 415
Tyr Gln Ser Asn Ile Gly Asn Gly Phe Ala Phe Leu Gln Gln Ala Trp420 425 430
Val Asp Asn Ala Asn Phe Phe Phe Gly Lys Thr Thr Pro Pro Gly Val435 440 445Asp Pro Ile Ile Gly Ser Val Ala Ala Gln Asn Asn Phe Ala Pro Asn450 455 460
Gly Pro Arg Pro Val Ser Gly Leu Asp Pro Thr Asp Ser Thr Lys Ile465 470 475 480
Val Thr Ile Asn Thr Asp Phe Val Ser Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe485 490 495
Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Gln Asn Thr Leu Ser Val500 505 510
<210> 9
<211> 513
<212> PRT
<213> Marasmius scorodonius<400> 9
Met Lys Leu Phe Ser Ala Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ala Ser His1 5 10 15
Tyr Ala Ser Ala Thr Ala His Ile Arg Ala Pro Asn Val Lys Pro Arg20 25 30
Arg Thr Ser Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro35 40 45
Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu65 70 75 80
Leu Phe Phe Phe Phe Ser Val Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys85 90 95
Leu Gly Ser Asp Ile Leu Gly Leu Ile Thr Ser Thr Asp Gln Leu Leu100 105 110
Ala Asn Asp Thr Gln Pro Val Thr Ala Val Asn Val Ala Phe Ser Ser115 120 125
Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Asp Gly Leu Lys Asp Pro Val130 135 140Phe Glu Ala145
Gly Thr Gly
Val Phe Leu
Ala Asn Ile195
Leu Gln Gly210
Gly Phe Met225
Pro Ala Glu
Leu Leu Gly
Ala Lys Asp275
Pro Glu Phe290
Met Thr Ser305
Arg Trp Lys
Pro Val Leu
Asp Ala Thr355
Ala Asn Pro370
His Ile Ile
Gly Met Leu Ser150
Asn Trp Val Pro165
Leu Ala Ser Asp180
Gln Thr Ile Leu
Glu Ala Arg Pro215
Asp Gly Ile Ser230
Ile Arg Pro Gly245
Glu Ala Asn Asp260
Gly Ser Phe Leu
Asn Lys Phe Leu295
Glu Gln Gly Ala310
Ser Gly Ala Pro325
Ala Ala Asp Asn340
Asn Gln Thr Arg
Arg Gly Asp Leu375
Arg Ala Gly Ile
Asn Ala Val Ser Asp155
Gly Phe Val Gly Thr170
Thr Ile Asp Asn Val185
Asn Gly Ser Ile Thr200
Gly Asp Gln Gln Gly220
Asn Pro Ala Val Asp235
Gln Ala Leu Ile Pro250
Thr Phe Gln Asn Asp265
Val Phe Arg Gln Met280
Gln Asp His Ala Leu300
Asp Leu Leu Gly Ala315
Ile Asp Leu Thr Pro330
Gln Arg Asn Asn Asn345
Cys Pro Phe Ser Ala360
Gly Gly Ile Asn Lys380
Pro Tyr Gly Pro Glu
Leu Ser Asp Pro160
Ser Val His Gly175
Asn Thr Glu Pro190
Glu Ile His Arg205
His Glu His Phe
Gly Phe Thr Pro240
Pro Gly Ile Met255
Arg Pro Pro Trp270
Gln Gln Arg Ala285
Asn Met Pro Asn
Arg Ile Val Gly320
Leu Val Asp Asp335
Phe Asp Phe Ser350
His Ile Arg Lys365
Phe Pro Asn Gln
Val Thr Asp Ala385 390 395 400
Glu Arg Ala Ser Asn Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly405 410 415
Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile Gln Asn Gly Phe Val Phe420 425 430
Leu Gln Lys Asn Trp Val Asp Asn Thr Asn Phe Phe Arg Pro Gly Thr435 440 445
Gly Ala Asp Pro Leu Ile Gly Thr Asn Ser Arg Asn Ser Gly Thr Asp450 455 460
Ala Pro Asn Thr Pro Arg Val Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Asn Ala455 470 475 480
Thr Ser Thr Ile Glu Ile Asp Ile Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly485 490 495
Glu Tyr Phe Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Arg Thr Val Leu Ser500 505 510
Val
<210> 10<211> 508<212 > PRT
<213> Marasmius scorodonius<400> 10
Met Lys Leu Phe Ser Ala Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ala Ser His1 5 10 15
Tyr Val Ser Gly Thr Thr His Ile Arg Ala Pro Asn Val Lys Pro Arg20 25 30
Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro35 40 45
55 Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu50 55 50
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu55 70 75 80Leu Phe Phe Phe Phe Ser Ile Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys85 90 95
Leu Gly Ser Asp Ile Leu Glu Leu Ile Thr Ser Thr Asn Gln Leu Leu100 105 110
Ala Val Ala Thr Gln Pro Ile Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Ser115 120 125
Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Val Lys Asp Asp Leu Asn Asp Thr Val130 135 140
Phe Asp Ala Gly Met Leu Ser Asn Ala Val Ser Asp Leu Ser Asp Pro145 150 155 160
Gly Thr Gly Asn Trp Val Pro Gly Phe Val Gly Thr Ala Val His Gly165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Leu Asp Asn Val Asn Ala Glu Leu180 185 190
Ala Asn Ile Gln Thr Ile Leu Asn Gly Ser Ile Thr Glu Ile His Arg195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Ile Asp Gly Phe Ser Thr225 230 235 240
Arg Leu Pro Gly Gln Ala Leu Leu Pro Pro Gly Leu Met Phe Leu Gly245 250 255
Glu Ala Asn Asp Thr Val Ser Arg Pro Pro Trp Ala Lys Asp Gly Ser260 265 270
Phe Leu Val Phe Arg Gln Met Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe Asp Lys275 280 285
Phe Leu Gln Asp His Ala Leu Asn Met Pro Asn Met Thr Ser Glu Gln290 295 300
Gly Ala Glu Leu Leu Gly Ser Arg Met Val Gly Arg Trp Lys Ser Gly305 310 315 320Ala Pro Ile Asp Leu Thr Pro Leu Val Asp Asp Pro Glu Leu Ala Ala325 330 335
Asp Pro Gln Arg Asn Asn Asn Phe Asp Phe Ser Asp Ala Thr Asn Gln340 345 350
Thr Arg Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys Thr Asn Pro Arg Ala355 360 365
Asp Leu Gly Gly Ile Asp Asn Phe Pro Thr Arg His Ile Ile Arg Ala370 375 380
Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala Glu Lys Ala Ser Asn385 390 395 400
Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala405 410 415
Tyr Gln Ser Asn Ile Lys Asn Ala Phe Val Phe Leu Gln Gln Thr Trp420 425 430
Val Asp Asn Ala Asn Phe Phe Arg Thr Asn Thr Gly Ala Asp Pro Ile435 440 445
Ile Gly Thr Leu Ser Asn Lys450 455
Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro465 470
Ile Asp Leu Asp Phe Val Val485
Pro Ser Leu Ser Ala Ile Arg500
Asn Gly Asn Leu Pro Asn Thr Pro Arg460
Asn Asn Pro Thr Gly Pro Pro Thr Glu475 480
Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe Phe Ser490 495
Thr Val Leu Ser Val505
<210> 11
<211> 513
<212> PRT
<213> Marasmius scorodonius
<400 > 11
Met Lys Leu Phe Ser Ala Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ala Ser His1 5 10 15
Tyr Ala Ser Ala Thr Ala His Ile Arg Ala Pro Asn Val Lys Pro Arg20 25 30Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro35 40 45
Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu65 70 75 80
Leu Phe Phe Phe Phe Ser Val Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Asp Ile Leu Gly Leu Ile Thr Ser Thr Asp Gln Leu Leu100 105 110
Ala Asn Asp Thr Gln Pro Val Thr Ala Val Asn Val Thr Phe Ser Ser115 120 125
Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Asp Asp Leu Lys Asp Pro Val130 135 140
Phe Glu Ala Gly Met Leu Ser Asn Ala Val Ser Asp Leu Ser Asp Pro145 150 155 160
Gly Thr Gly Asn Trp Val Pro Gly Phe Val Gly Thr Ser Val His Gly
165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Asn Thr Glu Leu180 185 190
Ala Asn Ile Gln Thr Ile Ser Asn Gly Ser Ile Thr Glu Ile His Arg195 200 205
Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Val Asp Gly Phe Thr Pro225 230 235 240
Pro Ala Glu Ile Arg Pro Gly Gln Ala Leu Ile Pro Pro Gly Ile Met
245 250 255
Leu Leu Gly Glu Ala Asn Asp Thr Phe Gln Asn Asp Arg Pro Pro Trp260 265 270Ala Lys Asp Gly Ser Phe Leu Val Phe Arg Gln Met Gln Gln Arg Val275 280 285
Pro Glu Phe Asn Lys Phe Leu Gln Asp His Ala Leu Asn Met Pro Asn290 295 300
Met Thr Ser Glu Gln Gly Ala Asp Leu Leu Gly Ala Arg Ile Val Gly305 310 315 320
Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Ile Asp Leu Thr Pro Leu Val Asp Asp325 330 335
Pro Val Leu Ala Ala Asp Asn Gln Arg Asn Asn Asn Phe Asp Phe Ser340 345 350
Val Ala Thr Asn Gln Thr Arg Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys355 360 365
Ala Asn Pro Arg Gly Asp Leu Gly Gly Ile Asn Lys Phe Pro Asn Gln370 375 380
His Ile Ile Arg Ala Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala385 390 395 400
Glu Lys Ala Ser Asn Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly405 410 415
Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile Gln Asn Gly Phe Val Phe420 425 430
Leu Gln Lys Asn Trp Val Asp Asn Thr Asn Phe Phe Arg Pro Gly Thr435 440 445
Gly Val Asp Pro Leu Ile Gly Thr Asn Ser Arg Asn Ser Gly Thr Asp450 455 460
Ala Pro Asn Thr Pro Arg Val Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Asn Ala465 470 475 480
Thr Ser Thr Ile Glu Ile Asp Ile Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly485 490 495
Glu Tyr Phe Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Arg Thr Val Leu Ser500 505 510Val
<210> 12<211> 510<212 > PRT
<213> Marasmius scorodonius<400> 12
Met Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Leu Phe Ala Gly Ile Ala Ile Gln Ser1 5 10 15
Ala Cys Ala Phe Pro Asn Phe Ser Lys Ser Ser Ile Leu Lys Pro Arg20 25 30
Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Asn Pro Asp Ala Gln Pro Asp Leu Pro35 40 45
Thr Ala Lys Gln Ala Ser Thr Ala Ala Ala Ser Val Gly Leu Asn Leu50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu65 70 75 80
Met Phe Phe Phe Phe Ser Ile Ala Asp Ala Ala Ala Phe Lys Ser His85 90 95
Leu Gly Ser Ala Ile Leu Pro Leu Ile Ala Ser Thr Gln Gln Leu Leu100 105 110
Ala Val Ala Ser Gln Pro Thr Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Gln115 120 125
Thr Gly Leu Asn Ala Leu Gly Leu Ala Ala Gln Gly Leu Gly Asp Ser130 135 140
Leu Phe Ala Ser Gly Gln Phe Ser Gly Ala Gln Ser Leu Gly Asp Pro145 150 155 160
Gly Thr Ser Asn Trp Val Gln Ala Phe Ala Gly Thr Gly Ile His Gly165 170 175
Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Val Asp Asn Val Asn Ala Glu Leu180 185 190
Ser Gln Ile Gln Ser Ile Leu Gly Thr Ser Ile Thr Glu Ala Tyr Arg195 200 205Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe210 215 220
Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Ile Asp Gly Phe Ser Thr225 230 235 240
Ala Leu Pro Gly Gln Ala Val Leu Ser Pro Gly Leu Phe Leu Leu Gly245 250 255
Glu Asp Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Arg Pro Ser Trp Ala Lys Asp260 265 270
Gly Ser Phe Leu Ala Phe Arg Gln Leu Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe275 280 285
Asn Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ala Ala Leu Thr Gln Gly Asn Ala Asp290 295 300
Leu Leu Gly Ala Arg Met Met Gly Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Val305 310 315 320
Asp Leu Ala Pro Thr Ala Asp Asp Val Asp Leu Ala. Asn Asp Piro Gln325 330 335
Arg Asn Asn Asn Phe Asn Phe Thr His Ala Gly Phe Thr Glu Thr Thr340 345 350
Asp Glu Thr His Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys Thr Asn Pro355 360 365
Arg Ser Asp Phe Asn Pro Gln Asn Thr Asn Asn His Ile Ile Arg Ala370 375 380
Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala Glu Ala Ser Ser Asn385 390 395 400
Thr Ser Ser Thr Asp Ala Ser Leu Glu Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala405 410 415
Tyr Gln Ser Asn Ile Gly Asn Gly Phe Ala Phe Leu Gln Gln Ala Trp420 425 430
Val Asp Asn Ala Asn Phe Phe Phe Gly Lys Thr Thr Pro Pro Gly Val435 440 445Asp Pro Ile Ile Gly Ser Val Ala Ala Gln Asn Asn Phe Ala Pro Asn450 455 460
Gly Pro Arg Pro Val Ser Gly Leu Asp Pro Thr Asp Ser Thr Lys Ile455 470 475 480
Val Thr Ile Asn Thr Asp Phe Val Ser Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe
485 490 495
Phe Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ile Gln Asn Thr Leu Ser Val500 505 510
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> Marasmius scorodonius
<400> 13
Gly ,Leu Asn Leu Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys1 5 10 15
Lys Asn Lys Glu20
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> Marasmius scorodonius
<400> 14
Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe Gly Phe Met Asp1 5 10 15
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<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Marasmius scorodonius
<400> 15
His Ile Ile Arg Ala Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala1 5 10 15
Glu<210> 16
<211> 12
<212 > PRT
<213> Marasmius scorodonius
<400> 16
Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile1 5 10
<210> 17
<211> 19
<212 > PRT
<213> Marasmius scorodonius
<400 > 17
Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe Phe Ser Pro Ser Leu1 5 10 15
Ser Ala Ile

Claims (33)

1. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato depossuir atividade branqueadora e uma ou maiscaracterísticas selecionadas a partir do grupo consistindode:a. polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasSEQ ID NO: 08-12 ou equivalentes funcionais dequalquer uma destas;b. polipeptídeo isolado obtenível pela expressão de umpolinucleotídeo de acordo com qualquer uma das SEQ IDNO: 01-07 ou equivalentes funcionais de qualquer umadestas ou um vetor compreendendo referidospolinucleotídeos ou equivalentes funcionais dequalquer uma deles em uma célula hospedeiraapropriada, por exemplo, Aspergillus niger, ec. polipeptídeo compreendendo, pelo menos, uma das SEQID NO: 13-17.
2. Polipeptídeo isolado, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser de acordocom as SEQ ID NO: 08-12 ou equivalentes funcionais dequalquer uma delas, onde as equivalentes funcionais são,pelo menos, 55% homólogos as SEQ ID NO: 08-12.
3. Polipeptídeo isolado, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser de acordocom as SEQ ID NO: 08-12 ou equivalentes funcionais dequalquer uma delas, onde as equivalentes funcionais são,pelo menos, 65% homólogos as SEQ ID NO: 08-12.
4. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato deser obtenível a partir de Marasmius scorodonius.
5. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de serhibridizável a um polinucleotideo de acordo com SEQ ID NO:-01-07 ou equivalentes funcionais destas.
6. Polipeptídeo isolado, de acordo com reivindicação-5, caracterizado pelo fato de ser hibridizável sobcondições de alta restringência a um polinucleotideo deacordo com SEQ ID NO: 01-07 ou equivalentes funcionaisdestas.
7. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer umadas reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de serobtenível a partir de um fungo, preferencialmente um fungofilamentoso.
8. Polipeptídeo isolado, de acordo com reivindicação-7, caracterizado pelo fato de ser obtenível a partir deMarasmius, preferencialmente M. scorodonius.
9. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato decodificar um polipeptídeo da reivindicação 1.
10. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato decodificar, pelo menos, um domínio funcional de umpolipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 08-12 ou equivalentesfuncionais destas.
11. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato decompreender uma seqüência nucleotídica de acordo com SEQ IDNO: 01-07 ou equivalentes funcionais destas.
12. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato deser de acordo com SEQ ID NO: 01-07.
13. Vetor caracterizado pelo fato de compreender umaseqüência polinucleotídica de acordo com as reivindicações-5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
14. Vetor, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato da referida seqüência nucleotidicade acordo com as reivindicações 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12estar operacionalmente ligada a seqüências regulatóriasapropriadas para expressão da referida seqüênciapolinucleotídica em uma célula hospedeira apropriada.
15. Vetor, de acordo com reivindicação 14,caracterizado pelo fato da referida célula hospedeira serum fungo filamentoso ou uma bactéria.
16. Método para fabricação de um polinucleotídeo dequalquer uma das reivindicações 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12ou um vetor de qualquer uma das reivindicações 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de compreender as etapas decultivo de uma célula hospedeira transformada com referidopolinucleotídeo ou referido vetor e isolado referidopolinucleotídeo ou referido vetor a partir da célulahospedeira.
17. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato deser obtenível pela expressão de um polinucleotídeo dequalquer uma das reivindicações 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12ou um vetor de qualquer uma das reivindicações 13, 14 ou 15em uma célula hospedeira apropriada.
18. Enzima branqueadora recombinante caracterizadapelo fato de compreender um domínio funcional de umpolipeptídeo caroase 01-05.
19. Método para fabricação de um polipeptídeo dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 17caracterizado pelo fato de compreender as etapas detransformação de uma célula com um polinucleotídeo isoladode acordo com as reivindicações 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12ou um vetor de acordo com reivindicações 13, 14 ou 15,cultivando referida célula sob condições permitindoexpressão do referido polinucleotideo e opcionalmentepurificando o polipeptídeo codificado a partir da referidacélula ou meio de cultura.
20. Célula hospedeira recombinante caracterizada pelofato de compreender um polinucleotideo de qualquer uma dasreivindicações 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou um vetor dede qualquer uma das reivindicações 13, 14 ou 15.
21. Célula hospedeira recombinante caracterizada pelofato de expressar um polinucleotideo de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 17.
22. Uso do polinucleotideo de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 17, caracterizada pelo fato deser para aumentar brancura de, pelo menos, parte de umproduto alimentício comparado a um produto alimentício noqual o polipeptídeo não foi utilizado.
23. Processo para produção de um produto alimentícioonde uma forma intermediária do referido produtoalimentício compreende um pigmento, o processocaracterizado pelo fato de que compreende adição de, pelomenos, um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 17 em uma quantidade que é eficaz emdiretamente converter referido pigmento em uma forma a qualresulta no aumento da brancura de, pelo menos, parte doproduto alimentício comparado ao produto alimentício para oqual referido polipeptídeo não foi adicionado durante suaprodução.
24. Processo, de acordo com reivindicação 23,caracterizado pelo fato do produto alimentício ser feito apartir de farinha, preferencialmente farinha de trigo.
25. Processo, de acordo com reivindicação 23,caracterizado pelo fato do produto alimentício ser umproduto laticínio.
26. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato dopigmento ser um carotenóide.
27. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 23, 24, 25 ou 26, caracterizado pelo fato daenzima ser adicionada como uma preparação enzimáticaderivada a partir de um microorganismo ou produzida in si tupor um microorganismo capaz de produzir referida enzima.
28. Processo, de acordo com reivindicação 27,caracterizado pelo fato da enzima ser adicionada como umapreparação enzimática derivada a partir ou produzida insi tu por uma bactéria, um fungo ou uma levedura.
29. Processo, de acordo com reivindicação 28,caracterizado pelo fato do fungo pertencer ao gêneroMarasmius, preferencialmente Marasmius scorodonius.
30. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, caracterizadopelo fato de, adicionalmente, uma oxidoredutase seradicionada durante produção do produto alimentício.
31. Produto alimentício caracterizado pelo fato deser obtenível pelo processo de qualquer uma dasreivindicações 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30.
32. Uso de um polipeptídeo de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 17, caracterizado pelo fato dediretamente converter pigmentos em uma forma que resulta emuma brancura aumentada de, pelo menos, uma parte de umproduto alimentício.
33. Uso de um polipeptídeo de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 17, caracterizado pelo fato deser para detergentes ou em processos de branqueamentoenzimático de pedra.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR047413A1 (es) * 2004-01-13 2006-01-18 Dsm Ip Assets Bv Proceso para el blanqueado enzimatico de productos alimenticios
US7674608B2 (en) 2007-02-23 2010-03-09 The University Of Toledo Saccharifying cellulose
CN101765663B (zh) 2007-03-14 2014-11-05 托莱多大学 生物质预处理
US7999355B2 (en) * 2008-07-11 2011-08-16 Air Products And Chemicals, Inc. Aminosilanes for shallow trench isolation films
AU2009277393A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 Dsm Ip Assets B.V. Method for modifying non-starch carbohydrate material using peroxidase enzyme
CA2760283A1 (en) * 2009-04-28 2010-11-04 Dsm Ip Assets B.V. A method for improving a bean-based product
US9168122B2 (en) 2012-04-26 2015-10-27 Rex Medical, L.P. Vascular device and method for valve leaflet apposition
CN108157758A (zh) * 2017-12-30 2018-06-15 常州市阿曼特化工有限公司 一种食品漂白剂的制备方法
CN112251289A (zh) * 2020-08-31 2021-01-22 菏泽中禾健元生物科技有限公司 一种食用植物油的高效酶法精制工艺

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1137760A1 (en) * 1998-12-11 2001-10-04 Unilever N.V. Bleaching enzymes and detergent compositions comprising them
JP2000245468A (ja) * 1999-02-26 2000-09-12 Meiji Seika Kaisha Ltd 脱色活性を有する新規酵素及びこれを用いた染料の脱色方法
ATE322569T1 (de) * 1999-12-23 2006-04-15 Genencor Int Enzymatisches bleichen natürlicher nicht- baumwolle enthaltender fasern
DE60234822D1 (de) * 2001-04-20 2010-02-04 Novozymes As Lipoxygenase-varianten und ihre verwendung
CN1816282A (zh) 2003-07-02 2006-08-09 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 漂白奶制品的方法
AR047413A1 (es) * 2004-01-13 2006-01-18 Dsm Ip Assets Bv Proceso para el blanqueado enzimatico de productos alimenticios

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