BRPI0609628A2 - método para produzir gorduras ou óleos - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR GORDURAS OU óLEOS. A presente invenção diz respeito à melhoria da produtividade de um método enzimático para produzir gorduras ou óleos esterificados, transesterificados ou interesterificados. Especificamente, é revelado um método que pode melhorar bastante a produtividade de esterificação, transesterificação ou interesterificação enzimática pela purificação do óleo substrato de forma a prolongar a vida útil da enzima.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR GORDURAS OU ÓLEOS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente abordagem diz respeito a métodos paraproduzir gorduras e óleos. Especificamente, a presente abor-dagem diz respeito ao prolongamento da atividade enzimáticade uma enzima usada para transesterificação ou esterificaçãode um substrato para a produção de gorduras e óleos por puri-ficação do substrato antes da transesterificação ou esterifcação.

Tecnologia relacionada

Lipases (triacilglicerol acilidrolases, EC 3.1.1.3)são capazes de catalisar uma variedade de reações. Tais enzi-mas são comercialmente disponíveis de uma ampla faixa de f a-bricantes e organismos, e são usadas em reações cataiiticascom óleos e gorduras de consumo. Ver , por exemplo, Xu, X. ,"Modification of oils and f ats by lipase-catalyzed inter-esterification: Aspects of process engineering", in Enzyms,in Lipid Modif ication, 190-215 (Bomscheuer, U. T., ed.,Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinbeirn, Germany, 2000).'Lipases sãousadas para hidrolisar glicerideos tais como triacilgiceróise fosfatideos. Eles também são usados na sintese de ésteresde ácidos graxos e álcoois industriais. Além do mais, lipasessão usadas para alcoólises (trocando álcoois ligados a éste-res) para produtos tais como bio diesel e glicerideos parci-ais . Lipases também podem ser usadas para catalisar reaçõesde troca de acila tal como interesterificação (também conhe-cido como transesterificação) de substratos de éster mistura-do para criar misturas únicas de triacilgiceróis com características funcionais desejadas.

Biocatalisadores, tais como lipases também são a-trativos por causa do seu uso sob condições de operação bran-das e seus altos graus de seletividade. Biocatalisadores tam-bém oferecem caminhos sintéticos que evitam a necessidade pa-ra produtos químicos ambientalmente prejudiciais.

Lipases são adicionalmente usadas para a fabricaçãode glicerideos exclusivos. Por exemplo, 1,3-lipases especifi-cas são usadas na fabricação de 1,3-diglicerideos, como des-crito, por exemplo, em Patente U.S. No. 6.004.611.

A reação de transesterificação tem também tornadouma solução importante para uma ameaça recentemente identifi-cada para saúde humana: ácidos graxos trans. Esses ácidosgraxos trans foram há muito desejados por suas característi-cas funcionais no uso de alimento e foram produzidos em esca-la de bens de consumo por hidrogenação parcial de óleos vege-tais . Assim, eles foram facilmente disponíveis e relativamen-te baratos por décadas. Atualmente, fornecedores de produtosalimentícios estão procurando gorduras para substituir óleovegetal parcialmente hidrogenado, preferivelmente a preçosequiparáveis ou mais altos. Transesterificação de gorduras eóleos propriamente selecionados podem fornecer gorduras parasubstituir óleo- vegetal parcialmente hidrogenado. Se taisgorduras são produzidas por transesterificação de gorduras eóleos livres de ácidos graxos trans, ácidos graxos trans se-rão substancialmente ausentes a partir de gordura transeste-rif içada . A seleção adequada de composições de ácido graxo degorduras e óleos de partida fornecerá funcionalidade adequadanas gorduras de substituição transesterificadas por óleo par-cialmente hidrogenado vantaj osamente sintetizados por inte-resterificação catalisada por lipase.

A estabilidade de biocatalisadores tal como lipasesé mais convenientemente expressa em termos de meia vida, queé o tempo após o qual a atividade do catalisador inicial temdiminuído pela metade o valor original. Diks, Rob M. M. ,"Lipase stability in oil", Lipid Technology, 14(1) : 10-14(2002) . Um outro meio de expressar estabilidade da enzima éa produtividade da enzima, que é medida pela quantidade doproduto por unidade de enzima (g óleo produzido/g enzima),durante a primeira meia vida. Meias vidas de lipase típicasem reações de interesterificação são sete dias. Ver, por ex-emplo, Huang, Fang-Cheng and Ju, Yi-Hsu, "Interesterifica-tion of palm midfraction and stearic acid with Rhizopus ar-rhízus lipase immobilized on polypropylene", Journal of theChinese Institute of Chemical Engineers, 28 (2): 73-78(1997); Van der Padt, A. et al., "Synthesis of triacylgly-crols. The crucial role of water ativity control", Progressin Biotechnologyr 8 (Biocatalysis in Non-Conventional Me-dia) : 557-62 (1992). Meias vidas variam muito dependendo daslipases entre si.

Entretanto, meias vidas também variam dependendo daqualidade dos substratos. Quando biocatalisadores, tais comoenzimas, são usados componentes na mistura do substrato podemdiminuir o tempo de vida efetivo do catalisador. Em operaçõescontinuas, a razão de substrato processado na enzima é muitoalto, dessa maneira, componentes menores de óleo podem ter umefeito deletério cumulativo na atividade da enzima. Diversoscompostos de oxidação em óleo, tais como hidroperóxidos eprodutos de oxidação secundários (por exemplo, aldeidos oucetonas), podem causar inativação significativa de lipase emóleos. Ver, por exemplo, Pirozzi, Domenico, "Improvement oflipase stability in the presence of commercial triglyc-erides", European Journal of Lipid Science and Technology105(10): 608-613 (2003); Gray, Jr. L, "Measurement of LipidOxidation: A Review", J. Azner. Oil Chem. Soe. 55: 539-546(1978); Patent U.S. Application Publication No. 200510014237Al, e publications cited therein. Produtos de oxidação inclu-em espécie oxidativa que inicia caminhos da reação radicalauto propagados, ou outra espécie de oxigênio reativa (taiscomo peróxidos, ozônio, super-óxido, etc.). Estes e outrosconstituintes que causam ou aparecem da degradação de gorduraou óleo podem resultam em degradação de enzima. A presença deágua e outras substâncias também pode influenciar fortementea atividade de lipases usada na transesterificação. Ver, porexemplo, Jung, H. J. And Bauer, W., ""Determination of proc-ess parameters and modeling of lipase-catalyzed transesteri-fication in a fixed bed reactor", Chemical Engineering & Te-chnology, 15(5): 341-8 (1992). Alguns ions metálicos (Mg 2+ eFe 2+ ) têm também sido citados como inibidores para algumaslipases. Entretanto, os processos e fatores causadores pelosquais lipases tornam-se inativas não são completamente enten-didos .

Observou-se que usando diferentes lotes da mesmamatéria prima em um catalisado por lipase óleo deu amplas va-riações em meia vida de lipase. Diks, Rob M. M., "Lipase sta-bility in oil", Lipid Technology, 14(1): 10-14 (2002). Nenhumrelacionamento foi encontrado entre meia vida de lipase e oPV do óleo ou o valor para-anisidina (PAV). Além do mais, ne-nhuma correlação entre os niveis metálicos (Fe e Cu) , glice-rideos polimerizados, ou fosfolipidios e meia vida de lipasepoderiam ser estabilizados.

Uma investigação a respeito da causa de perda deatividade de lipase imobilizada na acidólise de óleo de gi-rassol alto oléico com ácido esteárico determinou que produ-tos de oxidação aumentaram o taxa de desativação, mas a remo-ção de produtos de oxidação a partir de óleos impediu a perdada atividade. Nezu, T. et at. , "The effect of lipids oxida-tion on the ativity of interesterification of triglyicerideby immobilized lipase", in Dev. Food Eng., 6th Proc. Int.Congr. Eng. Food, 591-3 (Yano, T. et al. , eds., Blackie,Glasgow, 1994). Lipases imobilizadas incubadas com 2-aldeidosinsaturados (tipicamente formados como produtos de oxidaçãosecundários na quebra oxidativa de óleos) perdem sua ativida-de catalitica. Hidroperoxidos de ácido linoléico a niveis dePV >5 meq/kg causam perda de atividade da lipase, e o taxa deinativação de enzima aumenta à medida que PV aumenta; o meca-nismo de inativação de enzima foi a geração de radicais li-vres na enzima como os peróxidos decompostos. Wang, Y. AndGordon, M. H., "Effect of lipid products of oxidation on thetransesterification ativity of the immobilized lipase", Jour-nal of Agricultural and Food Chemistry, 39(9): 1693-5 (1991).Quando lipidios oxidados foram separados de uma amostra deóleo de palmeira e fracionados, eles demonstraram que fraçõesexibindo altos graus de inativação poderiam ser isoladas, masos compostos inibidores não foram identificados. Id.

É comum a atividade rápida da lipase diminuir du-rante reações catalisadas de lipase continua. Ver, por exem-plo, Ferreira-Dias, S. et al. "Recovery of the ativity of aimmobilized lipase after its use in fat transesterifition",Progress in Biotechnology, 15 (Stability and Stabilization ofBiocatalysis): 435-440 (1998); Diks, Rob M. M., "Lipase sta-bility in oil", Lipid Technology, 14(1):10-1 4 (2002).

Diversos métodos foram testados para eliminar perdade atividade ou recuperar a atividade de lipase inativada.

a) Recuperação de atividade da lipase perdida nasreações de transesterificação foi realizada lavando a prepa-ração da lipase com hexano e ajustando a atividade da água dapreparação até 0,22. Ferreira Dias, S. et al. "Recuperationof the ativity of a immobilized lipase after its use in fattrausesterification", Progress in Biotechnology, 15 (Stabil-ity and Stabilization of Biocatalysis): 435-440 (1998). Embo-ra o mecanismo seja desconhecido, este tipo de recuperação daatividade é consistente com a perda da atividade causada poracúmulo de compostos inibidores, tais como produtos de oxida-ção de lipidio. Jd.

Redução da atividade da água de um substrato detransesterificação (óleo de palmeira bruto/ óleo de sementede colza degomado) de 280 ppm para 60 ppm foi acompanhada porum aumento de meia vida de lipase imobilizada de 10 horas até100 horas. Huang, Fang-Cheng and Ju, Yi-Hsu, "Interesterifi-cation of palm midfraction and stearic acid with Rhizopus ar-rhizus lipase immobilized on polypropylene", Journal of theChinese Institute of Chemical Engineers, 28(2):73-78 (1997).

c) Meia vida de lipase foi aumentada imobilizandocertas composições com lipase. Por exemplo, a meia vida delipase imobilizada em silica de poro controlado aumentou cin-co vezes quando PEG-1500 foi co-imobilizada com a lipase.Soares, C. M. F. et al., "Selection of stabilizing additivefor lipase immobilization on controlled pore silica by facto-rial design", Applied Biochemistry e Biotechnology, 91-93(Symposium on Biotechnology for Fuels and Products Chemi-cals, 2000):703-718 (2001).

d) JP 11-103884 descreve que a adição de pequenasquantidades (0,01- 5 % em peso) de fosfolipidios a uma lipaseAlcaligenes imobilizada causou um aumento dez vezes em meiavida de lipase.

e) Outros têm meia vida de lipase prolongada pormeio de pré-tratamento do óleo do substrato. JP 08-140689 A2descreve o uso de resina de troca iônica Duolite A-7 paratratar uma mistura de óleo de palmeira com estearato de etilaantes da interesterificação usando uma lipase Rhizopus imo-bilizada para aumentar a meia vida de 3 dias até 8 dias. Duo-lite A-7 é uma resina de troca iônica contendo grupos amino.JP 08-140689 A2 também descreve pré-tratamento de óleos dosubstrato com proteínas ou peptideos contendo um grande núme-ro de residuos de aminoácido básicos tais como histona, pro-tainina, lisossomo ou polilisina. JP 08-140689 A2 estabeleceque grupos amino reagem com aIdeidos ou cetonas (produtos deoxidação secundários) para formar uma base de Schiff; e quetais produtos de oxidação secundários são um fator na inati-vação de lipase-

f) JP 02-203789 A2 descreve extensão da meia vidade lipase imobilizada por pré-tratamento do substrato com umasubstância alcalina. Quando um mistura igual de óleo de se-mente de colza e óleo de- palmeira foi interesterifiçada emuma coluna de lipase imobilizada em Celite 535, a meia vidada lipase foi 18 horas. Quando o substrato foi misturado comuma solução de hidróxido de potássio (substrato 5 mL/kg) ameia vida da atividade da enzima foi 96 horas. Uma abordagemalternativa é para tratar celite com hidróxido de sódio emisturar isto na mesma mistura de substrato. Usando esta a-bordagem, meia vida de lipase foi estendida até 33 horas. JP02 203790 M.

g) Demonstrou-se que, Novozima 4 35 é mais afetadapor produtos de oxidação secundários que por hidroperóxidos(Pirozzi, Domenico, "Improvement of lipase stability in thepresence of commercial triglycerides", European Journal ofLipid Science and Technology 105 (10) : 608-613 (2003) ) . Comesta lipase, mostrou-se que grupos sulfidrila de lipase inte-ragem com dois aldeidos do produto de oxidação secundários,4-hidroxinonenal (4-HNE) e malondialdeido (MDA). Neutralizan- do 4-HNE e MDA em óleo com albumina, a estabilidade da enzimafoi aumentada.

h) Pedido de patente U.S. No, 2003/0054509 descreveo uso de meio de purificação não modificado (por exemplo, si-li ca gel) para aumentar meia vida enzimatica. Pedido de pa-tente U.S. No. 2005/0014237 descreve o uso de processos dedesodorização para aumentar meia vida enzimatica.

Conseqüentemente, existe uma antiga necessidade natecnologia de catalise enzimatica para soluções desta perdade atividade. Ver também Diks, Rob M. M., "Lipase stabilityin oil", Lipid Technology, 14(1): 10-14 (2002); Wang, Y. AndGordon, M. H., "Effect pf lipid products of oxidatin on thetransesterification activity of the immobilized lipase",Journal of Agricultural and Food Chemistry, 39(9):1693-5(1991). O periodo de tempo sob o qual lipase retém sua ativi-dade enzimatica é uma importante consideração de custo na in-teresterificação catalisada por lipase. A perda de atividadeefetiva da enzima é prej udicial ao processo industrial porcausa do custo de substituir enzima e tempo de produção ne-cessário para trocar enzimas, trocar colunas, e estabilizaruma nova coluna. Assim, a extensão de meia vida da enzima éextremamente critica para o sucesso da comercialização de in-teresterificação enzimatica. Esta necessidade antiga é umabarreira primária para a expansão de reações catalisadas porenzima para produção de bens de consumo ou produtos químicos"em massa".

Embora mais dos mecanismos de inativação de lipasee sua prevenção sejam pouco entendidos atualmente, a presenteabordagem descreve um solução efetiva para prevenir degrada-ção de lipase e aumentar sua produtividade e meia vida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Modalidades da invenção são direcionadas a váriosmétodos para produzir gorduras ou óleos, fazendo contato comum substrato inicial compreendendo um ou mais glicerideos comum ou mais tipos de meio de purificação para gerar um subs-trato purificado, e fazer contato com o substrato purificadocom lipase para efetuar esterificação, interesterificação outransesterificação criando as gorduras ou óleos. Nas váriasmodalidades da invenção, o meio ou meios de purificação podeser um ou mais de aminoácidos, peptideos, polipeptideos, ouproteínas. Os aminoácidos, peptideos, polipeptideos, ou pro-teínas podem ser revestidos em um veiculo de suporte, forman-do dessa maneira um meio ou meios de purificação usados nosmétodos da invenção.

Em uma modalidade da invenção, proteína vegetal éusada como um meio de purificação. Assim, uma modalidade dainvenção é direcionada a um método para produzir gorduras ouóleos compreendendo: (a) fazer contato com um substrato ini-cial compreendendo um ou mais glicerideos com um ou mais ti-pos de proteína vegetal para gerar um substrato purificado; e(b) fazer contato com o substrato purificado com lipase paraefetuar esterificação, interesterificação ou transesterifica-ção criando as gorduras ou óleos. Em várias modalidades dainvenção, a proteína vegetal pode ser uma proteína de soja,ou uma proteína vegetal texturizada tais como uma proteína desoja texturizada.

Em uma outra modalidade da invenção, um ou mais dosácidos são revestidos em um ou mais tipos de meio de purifi-cação. Assim, uma modalidade da invenção é direcionada a ummétodo para produzir gorduras ou óleos compreendendo: (a) fa-zer contato com o substrato inicial compreendendo um ou maisglicerideos com um ou mais tipos de meio de purificação paragerar um substrato purificado; e (b) fazer contato com osubstrato purificado com lipase para efetuar esterificação,interesterificação ou transesterificação criando as gordurasou óleos; em que um ou mais dos ácidos são revestidos em umou mais tipos de meio de purificação. Em várias modalidadesda invenção, um ou mais aminoácidos pode ser qualquer um dearginina, lisina, histidina e/ou cisteina.

Ainda em uma outra modalidade da invenção, um oumais peptideos, polipeptideos, e/ou proteínas ("material deproteina") são revestidos em um ou mais tipos de meio de pu-rificação . Assim, uma modalidade da invenção é direcionada aum método para produzir gorduras ou óleos compreendendo: (a)fazer contato com um substrato inicial compreendendo um oumais glicerideos com um ou mais tipos de meio de purificaçãopara gerar um substrato purificado; e (b) fazer contato com osubstrato purificado com lipase para efetuar esterificação,interesterificação ou transesterificação criando as gordurasou óleos; em que um ou mais peptideos, polipeptideos, ou pro-teínas (um ou mais "materiais de proteina") são revestidos emum ou mais tipos de meio de purificação. A meia vida da ati-vidade enzimática da lipase pode ser mais que cerca de 2,5vezes maior que a meia vida da atividade enzimática resultan-te do contato com a lipase com o substrato inicial.

Ainda em uma outra modalidade, a invenção é dire-cionada ao uso de uma proteina como um meio de purificação.Assim, uma modalidade da invenção é direcionada a um métodopara produzir gorduras ou óleos compreendendo: (a) fazer con-tato com um substrato inicial compreendendo um ou mais glice-rideos com um ou mais proteínas para gerar um substrato puri-ficado; e (b) fazer contato com o substrato purificado comlipase para efetuar esterificação, interesterificação outransesterificação criando as gorduras ou óleos. A meia vidada atividade enzimática da lipase pode ser mais que cerca de2,5 vezes maior que a meia vida da atividade enzimática re-sultante do contato com a lipase com o substrato inicial.

Ainda em uma outra modalidade, a invenção é dire-cionada ao uso de uma proteina texturizada como um meio depurificação. Assim, uma modalidade da invenção é direcionadaa um método para produzir gorduras ou óleos compreendendo:(a) fazer contato com um substrato inicial compreendendo umou mais glicerideos com um ou mais tipos de proteina texturi-zada para gerar um substrato purificado; e (b) fazer contatocom o substrato purificado com lipase para efetuar esterifi-cação, interesterificação ou transesterificação criando asgorduras ou óleos.

Em várias modalidades da invenção, os métodos paraproduzir as gorduras ou óleos também podem incluir (c) moni-torar atividade enzimática medindo uma ou mais propriedadesfisicas das gorduras ou óleos após fazer contato com a lipa-se; (d) ajustar o tempo de duração para que o substrato puri-ficado faça contato com a lipase, ou ajustar a temperatura dosubstrato inicial, o substrato purificado; um ou mais tiposde meio de purificação ou a lipase em resposta a uma mudançana atividade enzimática para produzir gorduras ou óleos tendouma maior proporção substancialmente uniforme de esterifica-ção, interesterificação, ou transesterificação com relação aosubstrato inicial; e/ou (e) ajustar a quantidade e tipo de umou mais tipos de meio de purificação em resposta a mudançasnas propriedades fisicas das gorduras ou óleos para aumentarprodutividade enzimática do lipase. Uma ou mais propriedadesfísicas podem incluir a temperatura do ponto de gotejamentoMettler das gorduras ou óleos e/ou o perfil do teor de gordu-ra sólida das gorduras ou óleos.

Nos métodos inventivos, o substrato inicial podetambém incluir qualquer dos ácidos livres de gordura, álcooismonoidroxilicos, álcoois poliidroxilicos, ésteres e suas com-binações .

Um ou mais glicerideos usados nos métodos inventi-vos pode ser qualquer um de i) gordura de manteiga, manteigade cacau, substitutos de manteiga de cacau, manteiga de Illi-pê, manteiga de kokum, gordura de leite, gordura mowrah, man-teiga phulwara, gordura sal, manteiga de Shea, gordura deBorneo, banha de porco, lanolina, gordura de boi, gordura decarneiro, gordura de vela, gordura animal, óleo de canola,óleo de ricino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho,óleo de semente de algodão, óleo de avelã, óleo de cânhamo,óleo de jatropha, óleo de semente de linho, óleo de sementede manga, óleo de meadowfoam, óleo de mostarda, óleo de moco-tó, óleo de oliva, óleo de palmeira, óleo de palmiste, óleode amendoim, óleo de semente de colza, óleo de farelo de ar-roz, óleo de açafroa, óleo de Sasanqua, manteiga de Karité,óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de pinho, ó-leo de tsubaki, óleos vegetais, óleos marinhos que podem serconvertidos em gorduras plásticas, óleos marinhos que podemser convertidos em gorduras sólidas, óleo de peixe, óleo depeixe-carvão do Pacifico, óleo de figado de bacalhau, óleo depeixe olho-de-vidro laranja, óleo Pileherd, óleo de sardinha,óleos de baleia, óleos de arenque, 1,3-dipalmitoil-2-monooleina (POP), 1 (3) palmitoil-3(1)-estearoil-2-monooleina(POSt), 1,3-diestearoil-2-monooleina (StOSt), triglicerideo,diglicerideo, monoglicerideo, triglicerideo do ácido beênico,trioieina, tripalmitina, tristearina, óleo de palmeira, este-ar ina de palmeira, óleo de palmiste, estearina de semente depalmeira, glicerideos de ácidos graxos de cadeia média; ousuas combinações ii) óleos parcialmente hidrogenados proces-sados de (i) ; iii) óleos totalmente hidrogenados processadosde (i); ou iv) óleos fracionados de (i).

O substrato inicial usado nos métodos inventivospode também incluir ésteres. Os ésteres podem ser qualquerdos ésteres de cera, ésteres de alquila, ésteres de metila,ésteres de etila, ésteres de isopropila, ésteres de octadeci-la, ésteres de arila, ésteres de propileno glicol, ésteres deetileno glicol, ésteres de 1,2-propanodiol, ésteres de 1,3-propanodiol, e suas combinações. Os ésteres podem ser forma-dos a partir da esterificação ou transesterificação de álco-ois monoidroxilicos ou álcoois poliidroxilicos. Os álcooismonoidroxilicos ou os álcoois poliidroxilicos podem ser com-postos de álcoois primários, secundários ou terciarios de ca-deia anular, reta ou ramificada. Os álcoois monoidroxilicospode ser qualquer um de álcool metilico, álcool isopropilico,álcool alilico, etanol, propanol, n-butanol, iso-butanol,sec-butanol, terc-butanol, n-pentanol, iso-pentanol, n-hexanol ou álcool octadecilico. Os álcoois poliidroxilicospodem ser qualquer um de glicerol, propileno glicol, etilenoglicol, 1,2-propanodiol ou 1,3-propanodiol.

0 substrato inicial usado nos métodos inventivospode também ter álcoois monoidroxilicos primários, secundá-rios ou terciarios de compostos de cadeia anular, reta ou ra-mificada . Os álcoois monoidroxilicos podem ser qualquer um deálcool metilico, álcool isopropilico, álcool alilico, etanol,propanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol , terc-butanol , n-pentanol, iso-pentanol, n-hexanol ou álcool octa-decilico .

0 substrato inicial usado nos métodos inventivospode também ter álcoois poliidroxilicos primários, secundá-rios ou terciarios de compostos de cadeia anular, reta ou ra-mificada . Os álcoois poliidroxilicos podem ser qualquer um deglicerol, propileno glicol, etileno glicol, 1,2 propanodiolou 1,3-propanodiol.

0 substrato inicial usado nos métodos inventivospode também ter um ou mais ácidos graxos que são saturados,insaturados ou poliinsaturados. Um ou mais ácidos graxos po-dem ter cadeias de carbono de cerca de 4 a cerca de 22 carbo-nos de comprimento. Os ácidos graxos podem ser qualquer um deácido paImitico, ácido esteárico, ácido oléico, ácido lino-léico, ácido linilênico, ácido araquidônico, ácido erúcico,ácido capróico, ácido caprilico, ácido cáprico ácido láurico,ácido miristico, ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido ácidodocossaexaenóico(DHA), 5-eicossenóico ácido, ácido butirico,ácido y-linolênico ou ácido linoléico conj ugado.

Em modalidades usando os métodos inventivos, um oumais tipos de meio de purificação na lipase são empacotadosem uma ou mais colunas. As colunas podem ser colunas encami-sadas nas quais a temperatura do substrato inicial, o subs-trato purificado, um ou mais tipos de meio de purificação oua lipase é regulada.

Em outras modalidades usando os métodos inventivos,o substrato purificado pode ser preparado misturando o subs-trato inicial com um ou mais tipos de meio de purificação emum tanque para uma reação de purificação de lama em lotes oumisturando o substrato inicial em uma série de tanques parauma série de reações de purificação de lama em lotes. 0 subs-trato purificado pode ser separado a partir de um ou mais ti-pos de meio de purificação por meio de filtração, centrifuga-ção ou concentração antes de reagir o substrato purificadocom a lipase. 0 substrato purificado pode então ser misturadocom a lipase em um tanque para uma reação de lama em lotes,ou escoando o substrato purificado através de uma coluna con-tendo a lipase.

Ainda em outras modalidades dos métodos da inven-ção, um leito de um ou mais tipos de meio de purificação écolocado sob um leito da lipase dentro de uma coluna. A colu-na pode ser uma coluna encamisada na qual a temperatura dosubstrato inicial, o substrato purificado, um ou mais tiposde meio de purificação ou a lipase é regulada.

A lipase usada nos métodos da invenção pode ser ob-tida de uma linha celular eucariótica ou procariática culti-vada. A lipase pode ser uma lipase 1,3-seletiva ou um lipasenão seletiva. As gorduras ou óleos produzidos podem ser 1,3-diglicerideos.

Em modalidades da invenção, um ou mais glicerideosusados nos métodos da invenção podem ser parcialmente óleo desoja hidrogenado, óleo de milho parcialmente hidrogenado, ó-leo de semente de algodão parcialmente hidrogenado, óleo desoja totalmente hidrogenado, óleo de milho totalmente hidro-genado, e/ou óleo de semente de algodão totalmente hidrogenado.

Em outras modalidades da invenção, um ou mais gli-cerideos usados nos métodos da invenção podem ser óleo depalmeira parcialmente hidrogenado, óleo de palmiste parcial-mente hidrogenado, óleo de palmeira totalmente hidrogenado,óleo de palmiste totalmente hidrogenados, fracionados óleo depalmeira, óleo de palmiste fracionado, óleo de palmeira par-cialmente hidrogenado fracionado, e/ou óleo de palmiste fra-cionado parcialmente hidrogenado.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

Figura 1 mostra o ajuste da taxa de bombeamento emfunção do tempo de corrida para lipase exposta a substratonão tratado (círculos abertos), substrato tratado com argini-na granular (circulos fechados), ou substrato tratado com me-silica revestida com arginina (losangos fechados).

Figura 2 mostra o ajuste da taxa de bombeamento emfunção do tempo de corrida para lipase exposta a substratotratado com silica revestido com arginina (losangos fecha-dos) , silica revestida com lisina (circulos abertos), silicarevestida com histidina (triângiulos fechados), esilica revestida com cisteina (estrelas .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente abordagem diz respeito ao aumento daprodutividade ou meia vida enzimática de enzimas que catali-sam esterificação, interesterificação ou transesterifica-ção. De maneira particular, a presente abordagem diz respeitoà remoção de um substrato inicial de constituintes que causamdegradação da lipase. Tais constituintes podem causar ou apa-recer da degradação de gordura ou óleo, do tratamento ou pro-cessamento do substrato, ou a partir de outras causas. Taisconstituintes podem ser removidos pelo tratamento do substra-to inicial com um meio de purificação antes de fazer contatocom a lipase. O meio de purificação pode ser um ou mais ami-noácidos, peptideos, polipeptideos ou proteínas, que são man-tidos separados a partir de enzima. Os aminoácidos, pepti-deos, polipeptideos ou proteínas podem ser revestidos em umveiculo de suporte sólido por meio de absorção, adsorção, li-gações cova1entes, ligações iônicas ou ligações de hidrogênio .

Tratamento de substratos com aminoácidos é vantajo-so sob o uso de substâncias contendo grupo amino convencio-nais, tais como os descritos em JP 08-140689 A2A vantagemde usar aminoácidos é por causa da maior liberdade estéricade aminoácidos livres. Grupos amino de substâncias contendogrupo amino convencionais são ligados e menos facilmente dis-poníveis para reagir com produtos de oxidação secundários.

A presente abordagem também diz respeito a testaraminoácidos por sua capacidade para serem usados para purifi-car substrato inicial e aumentar a meia vida de enzimas. Umaminoácido que é crucial para a inativação de uma enzima podeser especificamente selecionado por experimentos para a pro-teção de uma enzima. Por exemplo, cisteina pode ser usada pa-ra a enzima cuja inativação está relacionada com a oxidação do grupo sulfidrila.

Acredita-se que a desnaturação das cadeias lateraisde enzimas, especialmente nos sitios ativos, seja uma causada perda de atividade da enzima. A desnaturação pode ser cau-sada por reações entre as cadeias laterais de aminoácido nasconstituintes de impureza da enzima e substrato que causamdegradação de enzima. Entretanto, diferentes enzimas têm di-ferentes cadeias laterais de aminoácido envolvidas em desna-turação de enzima. Conseqüentemente, a presente abordagemcontempla classificação de aminoácidos, peptideos, polipepti-deos ou proteínas por sua capacidade de reagir com constitu-intes de impureza do substrato isolados e conseqüentementeserve como um meio de purificação do substrato inicial paraaumentar meia vida enzimática. Tal classificação pode tambémser feita com substrato inicial que contém os constituintesde impureza do substrato. Alternativamente, a presente abor-dagem contempla usar aminoácidos ou peptideos ou polipepti-deos para purificação do substrato inicial onde sabe-se queum ou mais resíduos de aminoácido particulares são propensosa reagir com impurezas do substrato onde as reações resultamem enzima de inativação. Assim, aminoácidos, peptideos ou po-lipeptideos podem ter um efeito protetor para enzimas funcio-nando como uma "armadilha" para reagir e remover compostos deinativação nos substratos, impedir as enzimas de serem desna-turadas pelos compostos. Aprisionamento dos compostos de ina-tivação pode também fornecer um meio para concentrar os com-postos de inativação para recuperação e uso, tal como o usocomo inativadores de enzima seletivos.

Aminoácidos consistem de um grupo amino e um grupocarboxila, ambos ligados a um átomo de carbono, que é chamadocarbono alfa. 0 carbono alfa é tipicamente adicionalmente li-gado a um hidrogênio e um grupo R, referido como uma cadeialateral. Entretanto, o carbono alfa pode também ser ligado adois grupos R. Cadeias laterais variam de tamanho, forma,carga, capacidade de ligação de hidrogênio e reatividade quí-mica . Cadeias laterais podem ser apoiar, polar, carregadas ounão carregadas. Alguns aminoácidos têm cadeias laterais bási-cas com mais que um grupo amino. Exemplos de tais aminoácidosincluem lisina, arginina e histidina. Asparagina e glutaminatêm cadeias laterais amida. Cisteina e metionina têm cadeialateral contendo enxofre. O grupo amino (ligado ao carbonoalfa, ou parte da cadeia lateral do grupo R) pode ser um gru-po amino primário, secundário ou terciário. Any aminoácidopode ser usado de acordo com a presente abordagem, incluindoaminoácidos artificiais e isoméricos.

Exceto para o uso no contexto de um residuo que éparte de um peptideo, polipeptideo ou proteina, "aminoácido"da maneira aqui usada refere-se a um aminoácido não ligado aoutros aminoácidos por meio de uma ligação de peptideo (ou,por meio de uma ligação de amida) . Exceto para o uso no con-texto de resíduos que são parte de um peptídeo, polipeptideoou proteína, "um ou mais aminoácidos" da maneira aqui usadarefere-se a um ou mais tipos de aminoácidos, em que os amino-ácidos não são ligados um ao outro por meio de uma ligação depeptídeo (ou, por meio de uma ligação de amida) . Peptídeos,polipeptídeos e proteínas todos contêm mais que um aminoácidocovalentemente ligado um ao outro através de ligação de ami-das (-NH-C(0)CHR, onde R é o grupo R ligado ao carbono alfa).Peptídeos e polipeptídeos podem ser compreendidos dos mesmosou diferentes tipos de resíduos de aminoácido (isto é, amino-ácidos tendo os mesmos ou diferentes tipos de grupos R anexa-dos ao carbono alfa).

Exemplos não limitantes de aminoácidos usados deacordo com o presente incluem alanina, valina, leucina, iso-leucina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina, glici-na, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina, gluta-mina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina,histidina, ácido 2-aminoadiíco, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido6-aminocapróico, ácido 2-aminoeptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, aloidroxilsina,3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-

metilisina, N-metilvalina; norvalina, norleucina, e omitina.Aminoácidos podem ser do esteroisômero levulorotário conven-cional, ou do esteroisômero dextrorotário. Em uma modalidadepreferida, o aminoácido é arginina, lisina, histidina ou cis-teina.

Da forma aqui usada, o termo "material de proteína"é aqui usado para referir-se a e englobar peptideos, polipep-tideos e proteínas. Por exemplo, entende-se que o termo "umou mais materiais de proteína" seja para referir-se a um oumais peptideos, polipeptideos, e/ou proteínas.

Um outro aspecto da presente abordagem é aminoáci-dos, peptideos, polipeptideos ou proteínas revestidos em veí-culos de suporte para aumentar o contato da área da superfí-cie. Aminoácidos não são solúveis em óleo e não podem ser bemdispersos no substrato do óleo para reação com as impurezasde inativação no óleo do substrato. Aminoácidos não são qual-quer material poroso. Grande área da superfície é benéficapara um contato eficiente entre os aminoácidos e impurezas.Uma outra vantagem de usar veículos de suporte é o custo. Ve-ículos de suporte são normalmente mais baratos que aminoáci-dos . Da forma aqui usada, "revestido" refere-se a um revesti-mento que resulta de mistura, adsorção, absorção, ligação co-va lente, ligação de hidrogênio ou associação iônica de amino-ácidos, peptideos, polipeptideos ou proteínas aos veículos desuporte.

Exemplos não limitantes de veículos de suporte só-lidos incluem carbono ativado, carbono ativado de pedra, car-bono ativado de madeira, carbono ativado de turfa, carbonoativado de casca de coco, minerais naturais, minerais proces-sados , montmorilonita, atapulgita, bentonita, paligorsquita,terra de Fuiler, diatomita, esmectita, hormita, areia dequartzo, limestona, caulim, argila de bola, talco, pirofili-ta, perlita, sílica, silicato de sódio, silica hidrogel, sílica gel, sílica pirogênica, sílica precipitada, sílica co-loidal, sílica dialítica, materiais fibrosos, celulose, éste-res de celulose, éteres de celulose, celulose microcristali-na; alumina, zeolita, amidos, peneiras moleculares, lipaseimobilizada previamente usada, terra diatomácea, resina detroca iônica, resina de cromatografia exclusão de tamanho,resinas que1antes, resinas quirais, cinza de casca de arroz,sílica de fase reversa, e argilas de lixiviação.

0 meio de purificação pode ser resinoso, granulado,particulado, membranoso ou fibroso.

Preferivelmente, o suporte sólido é relativamentebarato e tem uma grande área da superfície. Exemplos não li-mitantes de tais suportes incluem carbonos ativados, mineraisnaturais (tais como argilas), minerais processados (tais comoargilas ativadas por ácido), diatomita, caulim, talo, perli-ta, vários produtos de sílica, alumina, zeolita, amidos, pe-neiras moleculares, areia de quartzo, limestona, materiaisfibrosos (tais como celulose, ou celulose microcristalina) ,terra diatomácea, cinza de casca de arroz e resinas de trocaiônica.

A presente abordagem também diz respeito ao uso deproteína como um meio de purificação do substrato. A proteínapode ser proteína vegetal (por exemplo, proteína de soja),proteína vegetal texturizada (por exemplo, proteína de sojatexturizada) e/ou outras proteínas, tal como proteína de so-ro. Em particular, a presente abordagem é direcionada ao usouma proteina com essa para purificar o substrato inicial an-tes de fazer contato do substrato com lipase. Em uma modali-dade da presente abordagem, proteina vegetal texturizada éusada. Proteina vegetal texturizada tem uma textura rigida euma estrutura aberta expandida, que fornece maior área da su-perfície para interagir com óleo, conferindo assim vantagenssubstanciais sob proteina convencional no seu uso para tratamento de óleo.

Ao contrário, grupos amino em peptideos convencio-nais ou proteínas (tais como os descritos em JP 08-140689 A2)são ligados e não facilmente disponíveis para reagir com pro-dutos de oxidação secundários. Em uma matriz não aquosa, for-ças iônicas mantêm proteínas agrupadas tendem a ser pelo me-nos uma ordem de grandeza maior que outras forças (por exem-plo, interações Van der Waals ou ligação de hidrogênio) . Pro-teínas convencionais em uma matriz não aquosa tende a se a-grupar e apresentar a menor área total da superficial possí-vel ao meio não aquoso. Assim, proteínas convencionais mini-mizam os grupos amino disponíveis para interação com os com-ponentes dos óleos que são considerados causadores de inati-vação da enzima. Conseqüentemente, aminoácidos de proteínasconvencionais são relativamente impenetráveis (e não disponí-veis) em óleos e outro meio não aquoso, e não reagem tão fa-cilmente com os componentes do óleo considerados causar ainativação da enzima.

As proteínas usadas de acordo com a presente abor-dagem fornecem vantagens sobre proteínas convencionais. Deacordo com uma modalidade da presente abordagem, proteína ve-getal texturizada da marca TVP® disponível de Archer-Daniels-Midland Company of Decatur, Illinois é usada. 0 teor de umi-dade deste produto é tipicamente cerca de 6 %. Vantagens con-feridas pelo processo de texturização incluem rigidez da par-tícula e aumento na área da superfície com relação à proteínanão texturizada. Outros tratamentos tais como expansores defava de soja tipica e dispositivos de formação de coleta tam-bém podem ser usados para conferir propriedades desejadas na proteína.

Um bom contato entre o substrato inicial e um meiode purificação do substrato da proteína pode ser facilitadousando uma proteína que é relativamente seca. Assim, em umamodalidade, o teor de umidade da proteína (por exemplo, umaproteína vegetal ou uma proteína vegetal texturizada) é menorque cerca de 5 %. Por exemplo, o teor de umidade da proteínapode ser de cerca de 0 % a cerca de 5 %, ou qualquer quanti-dade entre cerca de 0 % e cerca de 5 % (por exempo, cerca de0 %, cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 %,ou cerca de 5 %) , ou qualquer faixa entre cerca de 0 % e cer-ca de 5 % (por exemplo, cerca de 2 % a cerca de 4 %).

A faixa de umidade da proteína (por exemplo, umaproteína vegetal ou uma proteína vegetal texturizada) podeser controlada durante fabricação para dar o teor de umidadedesejado. Alternativamente, o teor de umidade da proteína po-de ser ajustado após fabricação, por exemplo, por forno desecagem ou contato com um solvente que remove alguma da umi-dade da proteína vegetal texturizada. Umidade pode ser remo-vida por outros métodos conhecidos, tal como lavando com sol-ventes anidros. Por exemplo, o teor de umidade de proteinavegetal texturizada contendo 6 % de umidade pode ser reduzidolavando com etanol anidro. Proteina vegetal texturizada lava-da com etanol pode ser rinsada com um solvente que tem boamiscibilidade com triacilgiceróis, tais como acetona, acetatode etila, ou hexano.

A composição tipica da fava de soja é cerca de 18 %de óleo, cerca de 38 % de proteina, cerca de 15 % de carboi-drato insolúvel (fibra dietética), cerca de 15 % de carboi-drato solúveis (sacarose, estaquiose, rafinose, outros) ecerca de 14 de % umidade, cinza e outros. Ver, por exemplo,Egbert, W. R. , "Isolated soy protein: Technology, properties,and applications", in soybeans as Functional Foods and Ingre-dients, 134-163 (KeShun L., ed., AOCS Press, Champaign, IL2004) . Proteina de soja texturizada é feita primeiramentetrincando as favas de soja para remover a casca e laminandoas favas em flocos totalmente gordurosos. O processo de lami-nação rompe a célula do óleo, facilitando a extração do sol-vente do óleo. Após o óleo ser extraido, o solvente é removi-do e os flocos são secos, criando flocos de soja desengordu-rados. Os flocos desengordurados podem em seguida ser moidopara produzir farinha de soj a, dimensionada para produzirgrãos de soja ou texturizada para produzir proteina de sojatexturizada tal como proteina vegetal texturizada da marcaTVP® Archer-Daniels-Midland Companyfs. Os flocos desengordu-rados podem ser adicionalmente processados para produzir con-centrados de proteina de soja e proteina de soja isolada. Is-to é acompanhado pela remoção dos componentes de carboidratode fava de soja seguido pela secagem.

Proteínas de soja são geralmente classificados emtrês grupos: farinha de sojas, concentrados de proteína desoja e proteínas de soja isoladas com teores proteína mínimosde cerca de 50 %, cerca de 65 % e cerca de 90 % (base seca) ,respectivamente. Farinhas de soja são vendidas tanto como pósfinos quanto grãos com um tamanho de partícula variando de -0,2 a 5 mm. Esses produtos podem ser fabricados usando aque-cimento mínimo para manter a atividade da enzima inerente dasoja, ou ligeiramente a altamente torrados para reduzir oueliminar a enzimas ativas. Farinhas de soja e grãos foramtradicionalmente usados como um ingrediente na indústria depadaria.

Concentrados de proteína de soja são tradicional-mente fabricados usando álcool aquoso para remover os açúca-res solúveis a partir de flocos de soja desengordurados (fa-rinha de soja). Este processo resulta em uma proteína combaixa solubilidade e um produto que pode absorver água, masnão tem a capacidade para gelificar ou emulsificar a gordura.

Concentrados lavados de álcool tradicional são usa-dos para fortificação de proteína de alimentos bem como nafabricação de concentrados de proteína de soja texturizada.Concentrados de proteína de soja funcionais ligam água, emul-si ficant es de gordura e formam um gel mediante aquecimento.Concentrados de proteína de soja funcionais podem ser produ-zidos de concentrado lavado de álcool usando aquecimento ehomogeneização seguido por secagem por aspersão; ou produzi-dos usando um processo de lavagem com água a um pH acídicopara remover os açúcares solúveis seguido por neutralização,processo térmico, homogeneização e secagem por aspersão. Con-centrados de proteína de soja funcionais são amplamente usa-dos na indústria de carne para ligar água e emulsificar gor-dura. Estas proteínas também são efetivas em estabilizar mo-lhos e sopas altamente gordurosos.

Proteínas de soja texturizadas ou estruturadas po-dem ser feitas de farinha de soja, concentrado de proteína desoja ou proteína de soja isolada. Proteína vegetal texturiza-da da marca TVP® é fabricada através de extrusão termoplásti-ca de farinha de soja sob calor úmido e alta pressão. Versa-dos na tecnologia são familiarizados com as variedades deproteína vegetal texturizada. Concentrado de proteína de so-ja texturizada é produzido de pós concentrados de proteína desoja usando tecnologia de fabricação similar a proteína vege-tal texturizada da marca TVP® Archer-Daniels-Midland Com-pany's. Produtos de proteína texturizada únicos podem serproduzidos usando combinações de proteína de soja ou outrosingredientes de proteína pulverizados tal como glúten de tri-go em combinação com várias fontes de carboidrato (por exem-plo, amidos). Versados na tecnologia são familiarizados comos produtos texturizados fabricados pela tecnologia de extru-são termoplástica. Tais produtos são distribuídos por todo omundo na forma seca. Estes produtos são hidratados em água ousoluções flavorizadas antes do uso em produtos de carne pro-cessados, vegetarianos análogos ou usados sozinhos em outrosprodutos alimentícios acabados para simular carne. Tecnologiade fibra formada por extrusão continua pode ser usada paraproduzir uma proteina texturizada fibrosa de proteina de sojaisolada com uma estrutura que se parece muito com fibras decarne.

Proteínas de soja isoladas podem ser fabricadas deflocos de soj a desengordurados por separação da proteina desoja tanto de carboidrato solúvel quanto insolúvel da fava desoja.

Proteina de soja adequada para o uso na presenteabordagem inclui proteina vegetal texturizada da marca TVP®Archer-Dauiels-Midland Company?s (Decatur, IL). Tal proteinade soja é um produto de comércio contendo nominalmente cercade 53 % de proteina, cerca de 3 % de gordura, cerca de 18 %de fibra dietética total, cerca de 30 % de carboidratos ecerca de 9 % de umidade máxima. Este material é disponível emuma variedade de texturas, tamanhos e cores e é usado na in-dústria de alimento como um substituto para carne moida embifes de carne moida, salsicha, alimentos vegetarianos, mis-tura de carne moida e outras aplicações de alimentos simila-res. Um produto preferido é Archer-Daniels-Midland Co. pro-duct code 165 840, que é fornecido na forma de grânulos ama-relo desbotado de cerca de diâmetro de 1/16 polegadas.

Proteina de soja fabricada de acordo com outrosprocessos é também usada na presente abordagem. Por exemplo,a proteina de soja pode também ser como proteínas vegetaistexturizadas descritas na patente U.S. 4.103.034 e 4.153.738, que são por meio destas incorporadas pela referência.

A presente abordagem também diz respeito a usar ummeio de purificação não modificado para reduzir dentro de umsubstrato de gordura ou óleo os constituintes que causam ouaparecem da degradação de gordura ou óleo. Dessa maneira, ométodo de fabricar um produto esterifiçado, transesterifiçadoou interesterificado pode compreender adicionalmente fazercontato com o substrato inicial (gorduras ou óleos sozinhos,ou misturados com componentes adicionais tais como ésteres,ácidos livres de gordura ou álcoois) com um ou mais tipos demeio de purificação não modificado produzindo dessa maneiraum substrato processado por meio de purificação. O meio depurificação pode fazer contato com o substrato em uma ou maiscolunas ou em uma ou mais reações do tipo lama em lotes. Omeio de purificação preferivelmente entra em contato com osubstrato antes de o substrato entrar em contato com a enzi-ma . Qualquer meio de purificação e métodos de uso descritosno pedido de publicação de patente U.S.2003/0054509 Al podemser usados j unto com a presente abordagem, e são por meiodestas incorporadas pela referência.

Desodorização pode ser usada j unto com as técnicasde purificação descritas pela presente abordagem. Exemplos deprocessos de desodorização incluem as técnicas de desodoriza-ção descritas por O. L. Brekke, Deodorizatíon, in Handbookof Soy Oil Processing and Utilization, Erickson, D. R. etal. eds., pp. 155-191 publicada pela American Soybean Asso-ciation and the American Oil Chemists' Society; or by Bai-ley's Industrial Oil and Fat Products, 5a ed., Vol. 2 (pp.537-540) and Vol. 4 (pp. 339-390), Hui, Y. H. ed., publicadopor John Wiley e Sons, Inc. Desodorização a temperatura ambi-ente pode também ser usada da forma como ela será removido doar do óleo, que causa oxidação de óleo. Outros processos dedesodorização são descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.172.248e 6.511.690; e no pedido de publicação de patente U.S.2005/0014237 Al. Todas essas técnicas de desodorização sãopor meio destas incorporadas pela referência. Em uma modali-dade preferida, os métodos de pré-tratamento da presente a-bordagem obviam a necessidade para desodorização de substratoantes de A presente abordagem também contempla prevenir oxi-dação do substrato do óleo mantendo o óleo sob gases inertes,tais como nitrogênio, dioxido de carbono ou hélio durante ouapós a purificação. Os produtos esterificados, transesterifi-cados ou interesterifiçados da presente abordagem também podem ser desodorizados após o tratamento com enzima.

Com o propósito aqui, o termo "substrato inicial"inclui gorduras ou óleos refinados ou não refinados, branque-ados ou não branqueados e/ou desodorizados ou não desodoriza-dos . As gorduras ou óleos podem compreender um gordura ou ó-leo simples ou combinações de várias gorduras ou óleos. Deacordo com a presente abordagem, um substrato pode ser reci-clado (isto é, desodorizados, colocados em contato com meiode purificação, esterificado, transesterificado ou intereste-rif içado mais que uma vez) . Conseqüentemente, versados natecnologia reconheceriam que "substrato inicial" inclui i)substratos que nunca foram desodorizados, ii) substratos queforam desodorizados uma ou mais vezes, iii) substratos quejamais entraram em contato com o meio de purificação, iv)substratos que tiveram contato com o meio de purificação umaou mais vezes, v) substratos que nunca foram esterifiçados,transesterificados ou interesterificados, e vi) substratosque foram esterificados, transesterificados ou interesterifi-cados uma ou mais vezes. 0 processo de esterificação, tran-sesteri ficação ou interesterificação pode ser catalisado en-zimaticamente, tal como com um lipase, ou quimicamente, talcomo com áleali ou catalisadores alcóxido.

Os termos "substrato processado por meio de purifi-cação" ou "substrato purificado referem-se a um substratoque entrou em contato com um ou mais meio de purificação pelomenos uma vez. Antes do seu contato com enzima, iam substratoinicial ou um substrato processado por meio de purificaçãopode ser misturado com componentes adicionais incluindo éste-res, ácidos livres de gordura ou álcoois. Estes ésteres, áci-dos livres de gordura ou álcoois que são adicionados ao subs-trato inicial ou substrato processado por meio de purificaçãopodem opcionalmente entrar em contato com o meio de purifica-ção antes de fazer contato com enzima.

Os termos "produto" e "produto esterifiçado, tran-sesteri ficado ou interesterificado" são usados intercambia-velmente e incluem gorduras esterifiçadas, transesterificadasou interesterifiçadas, óleos, triglicerideos, diglicerideos,monoglicerideos, álcoois mono ou poliidroxilicos, ou ésteresde álcoois mono ou poliidroxilicos produzidos por meio datransesterificação enzimatica ou processo de esterificação. 0termo "produto" da forma aqui usada tem entrado em contatopelo menos uma vez com uma enzima capaz de causar esterifica-ção, transesterificação ou interesterificação. Um produto po-de ser um fluido ou sólido a temperatura ambiente, e é aumen-tado em seu teor proporcional de gorduras esterificadas,transesterificadas ou interesterificadas, óleos, trigliceri-deos, diglicerideos, monoglicerideos, álcoois mono ou polii-droxilicos, ou ésteres de álcoois mono ou poliidroxilicos co-mo um resultado de seu contato com a enzima de transesterifi-cação ou esterificação. Produto esterificado, transesterifi-cado ou interesterificado é para ser distinguido a partirde teores de substrato inicial ou substrato processado pormeio de purificação, em que o produto tem submetido reação detransesterificação ou esterificação enzimática adicional. Apresente abordagem contempla o uso de qualquer combinação dosprocessos de desodorização, purificação e transesterificaçãoou de esterificação para a produção de gorduras esterifiça-das, transesterifiçadas ou interesterificadas, óleos, trigli-cerideos, diglicerideos, monoglicerideos, álcoois mono ou po-liidroxilicos , ou ésteres de álcoois mono ou poliidroxilicos.

0 termo "enzima" da forma usada no método da presente abordagem inclui, mas sem limitações, lipases da manei-ra aqui discutida, ou qualquer outra enzima capaz de causarmodificar gorduras ou óleos, tal como pela esterificação,transesterificação, ou interesterificação de substrato. Ou-tras enzimas capazes de modificar gorduras e óleos incluem,mas sem limitações, oxidoredutases, peroxidases, e esterases.

Gorduras e óleos são compostos principalmente detriglicerideos feitos de uma espinha dorsal de glicerol nasquais os grupos hidroxila são esterifiçados com ácidos carbo-xilicos. Ao passo que gorduras sólidas tendem a ser formadaspor triglicerideos tendo ácidos graxos saturados, trigliceri-deos com ácidos graxos insaturados tendem a ser líquidos (ó-leos) a temperatura ambiente. Monoglicerideos e digliceri-deos, tendo respectivamente um éster de ácido graxo e doisgrupos alcoólicos ou dois ésteres de ácido graxo e um grupoalcoólico, também são encontrados em gorduras e óleos em umamenor quantidade do que os triglicerideos.

Glicerideos usados na presente abordagem incluemmoléculas da fórmula quimica CH2RCHR' CH2R' ' em que R, R' eR' ' são álcools (OH) ou grupos de ácido graxo dados por -OC(=0)R' ' ' , em que R' ' ' é uma cadeia de carbono saturada, in-saturada ou poliinsaturada, reta ou ramificada com ou semsubstituintes. R, R' , R' ' e os grupos de ácido graxo em umglicerideo dado podem ser os mesmos ou diferentes. Os gruposdo ácido R, R' e R'' podem ser obtidos de qualquer um dos á-cidos livres de gordura aqui descritos. Glicerideos para apresente abordagem incluem triglicerideos nos quais R, Rf eR'' são todos os grupos de ácido graxo, diglicerideos nosquais dois de R, R' e R' ' são grupos de ácido graxo e umafuncionalidade do álcool é presente; monoglicerideos nosquais um de R, R' e R' ' é um grupo de ácido graxo e duas fun-cionalidades do álcool são presentes; e glicerol no qual cadaqual de R, R' e R'' é um grupo álcool. Glicerideos usados co-mo materiais de partida da presente abordagem incluem gordu-ras e óleos naturais, gorduras e óleos processados, gordurase óleos refinados, gorduras e óleos refinados e branqueados,gorduras e óleos refinados, branqueados e desodorizados, gor-duras e óleos expelidos, e gorduras e óleos sintéticos. 0processo pode também ser realizado na presença de um substra-to em contato com um solvente. Um exemplo é miscela de óleode fava de soja, que é o produto de extração do solvente deóleo de fava de soja e muitas vezes compreende óleo de favade soj a bruto em hexano. Exemplos de gorduras e óleos refina-dos são aqui descritos em Stauffer, C., fats and oils, EaganPress, St. Paul, Mims. (1996). Exemplos de gorduras e óleosprocessados são refinados, gorduras e óleos refinados e bran-queados, hidrogenados e fracionados.

Os termos "grupos de ácido graxo77 ou "grupos ácido" ambos referem-se a grupos quimicos dados por -0C(=0)R'77.Tais "grupos de ácido graxo77 ou "grupos ácido " são conecta-dos ao restante do glicerideo por meio de uma ligação cova-lente ao átomo de oxigênio que é unicamente ligado ao carbonoda carbonila. Ao contrário, os termos "ácido graxo" ou "ácidograxo livre" ambos referem-se a HOC (=0) R' ' 7 e não são cova-lentemente ligados a um glicerideo. Em "grupos de ácido gra-xo77, "grupos ácido77, "ácidos livres de gordura77, e "ácidosgraxos77, R' 7 7 é uma cadeia de carbono saturada, insaturada oupoliinsaturada, reta ou ramificada com ou sem substituintes,da forma aqui discutida. Versados na tecnologia reconhecerãoque R' ' ' dos "ácidos livres de gordura77 ou "ácidos graxos77(isto é, H0C(=0)R'7/) aqui descritos são usados como R77' nos"grupos de ácido graxo77 ou "grupos ácido77 anexados ao glice-rideos ou a outros ésteres usados como substratos na presenteabordagem. Isto é, um substrato da presente abordagem podecompreender gorduras, óleos ou outros ésteres tendo grupos deácido graxo formados a partir dos ácidos livres de gordura ouácidos graxos aqui discutidos.

Um ou mais gordura de manteiga, manteiga de cacau,substitutos de manteiga de cacau, manteiga de 111ipê, mantei-ga de kokum, gordura de leite, gordura mowrah, manteiga phul-wara, gordura sal, manteiga de Shea, gordura de Borneo, banhade porco, lanolina, gordura de boi, gordura de carneiro, gor-dura de vela, gordura animal, óleo de canola, óleo de ricino,óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de sementede algodão, óleo de avelã, óleo de cânhamo, óleo de jatropha,óleo de semente de linho, óleo de semente de manga, óleo demeadowfoam, óleo de mostarda, óleo de mocotó, óleo de oliva,óleo de palmeira, óleo de semente de palmeira, óleo de amen-doim, óleo de semente de colza, óleo de farelo de arroz, óleode açafroa, óleo de Sasanqua, manteiga de Karité, óleo de so-ja, óleo de semente de girassol, óleo de pinho, óleo de tsu-ba ki, óleos vegetais, óleos marinhos que podem ser converti-dos em gorduras plásticas, óleos marinhos que podem ser con-vertidos em gorduras sólidas, óleo de peixe, óleo de peixe-carvão do Pacifico, óleo de figado de bacalhau, óleo de peixeolho-de-vidro laranja, óleo Pileherd, óleo de sardinha, óleosde baleia, óleos de arenque, 1,3-dipalmitoil-2-monooleina(POP), 1 (3) palmitoil-3(1)-estearoil-2-monooleina (POSt),1,3-diestearoil-2-monooleina (StOSt), triglicerideo, diglice-rideo, monoglicerideo, triglicerideo do ácido beênico, trioi-eina, tripalmitina, tristearina, óleo de palmeira, estearinade palmeira, óleo de semente de palmeira, estearina de semen-te de palmeira, glicerideos de ácidos graxos de cadeia média, ou suas combinações.Gorduras e óleos processados tais como gorduras eóleos hidrogenados ou fracionados também podem ser usados.Exemplos de gorduras fracionadas incluem óleo de palmeira,estearina de palmeira, óleo de semente de palmeira, e estea-rina de semente de palmeira. Formas totalmente ou parcialmen-te hidrogenadas, saturadas, insaturadas ou poliinsaturadasdas gorduras supralistadas, óleos, triglicerideos ou diglice-rideos também são usados para a presente abordagem. Para ométodo desta abordagem, as gorduras descritas, óleos, trigli-cerideos ou diglicerideos são usáveis unicamente, ou pelo me-nos dois deles podem ser usados na mistura.

"Esterificação" ou "transesterificação são os pro-cessos pelos quais um grupo de ácido graxo é adicionado, re-posicionado ou substituído em um ou mais componentes do subs-trato. 0 grupo ácido pode ser derivado de uma gordura ou óleoque é parte do substrato inicial, ou de um ácido graxo livreou éster que foi adicionado ao substrato inicial ou substratoprocessado por meio de purificação.

0 termo "esterificação" inclui o processo no qualR, R' ou R'' em um glicerideo é convertido de um grupo alcoó-lico (OH) para um grupo de ácido graxo dado por -OC(=0)R'''.0 grupo de ácido graxo que substitui o grupo alcoólico podevir a partir do mesmo glicerideo ou diferente glicerideo, oude um ácido graxo livre ou éster que foi adicionado ao subs-trato inicial ou o substrato processado por meio de purifica-ção . A presente abordagem também contempla esterificação deálcoois que foram adicionados ao substrato inicial ou o subs-trato processado por meio de purificação. Por exemplo, um ál-cool assim adicionado pode ser esterificado por um ácido gra-xo livre adicionado ou por um grupo de ácido graxo presenteem um glicerideo que foi um componente do substrato inicial.Um exemplo não limitante de esterificação inclui reação de umácido graxo livre com um álcool.

Esterificação também inclui processos pertencendo àfabricação de biodiesel, tal como discutido nas Patentes U.S.Nos. 5.578.090; 5.713.965; e 6.398.707, que são por meio des-tas incorporadas pela referência. 0 termo "biodiesel" incluiésteres de alquila inferior de grupos de ácido graxo encon-trados em glicerideos animais ou vegetais. Ésteres de alquilainferior incluem éster de metila, éster de etila, éster de n-propila, e éster de isopropila. Na produção de biodiesel, osubstrato inicial compreende gorduras ou óleos. Um ou maisálcoois inferiores (por exemplo, metanol, etanol, n-propanole isopropanol) são adicionados a este substrato e a misturaem seguida entra em contato com enzima. A enzima faz com queos álcoois a serem esterifiçados com os grupos de ácido graxoque é parte dos glicerideos de gordura ou óleo. Por exemplo,R, R' ou R' ' em um glicerideo é um grupo de ácido graxo dadopor -OC(=0)R'''. Mediante esterificação de metanol, o produtodo biodiesel é CH30C(=0)R' ' ' . Produtos do biodiesel tambémincluem esterificação de álcoois inferiores com ácidos livresde gordura ou outros ésteres que são adicionados ao substratoinicial ou substrato processado por meio de purificação.

O termo "transesterificação" inclui o processo noqual R, W ou R' ' em um glicerideo é um primeiro grupo de áci-do graxo dado por -0C (=0) R' ' ' , e o primeiro grupo de ácidograxo é substituído por um segundo grupo de ácido graxo dife-rente . 0 segundo grupo de ácido graxo que substitui o primei-ro grupo de ácido graxo pode vir a partir da mesma ou dife-rente gordura ou óleo presente no substrato inicial. 0 segun-do ácido graxo pode também vir de um ácido graxo livre ou és-ter adicionado ao substrato inicial ou o substrato processadopor meio de purificação. A presente abordagem também contem-pla transesterificação ou interesterificação de álcoois ououtros ésteres esterificados que foram adicionados ao subs-trato inicial ou o substrato processado por meio de purifica-ção. Por exemplo, um álcool assim adicionado pode ser tran-sesterif içado ou interesterifiçado por um ácido graxo livreadicionado, por um grupo de ácido graxo em um éster adiciona-do, ou por um grupo de ácido graxo presente em um glicerideoque foi um componente do substrato inicial. Um exemplo nãolimitante de transesterificação inclui reação de uma gorduraou óleo com um álcool (por exemplo, metanol) ou com um éster.

0 termo "interesterificação" inclui, por exemplo, oprocesso de acidólise, alcoólise, glicerólise, e transesteri-ficação. Exemplos destes processos são aqui descritos, emFousseau, D. and Marangoni, A.G., "Chemical Interesterifica-tion of Food Lipids: Theory and Practice", in Food LipidsChemistry, Nutrition, and Biotechnology, Second Edition, Re-vised and Expanded, Akoh, C.C. and Min, D.B. eds., MareeiDekker, Inc. , New York, NY, Chapter 10, que é por meio destaincorporada pela referência. Acidólise inclui a reação de umácido graxo com um éster, tal como um triacilglicerol; alcoó-lise inclui a reação de um álcool com um éster, tal como umtriacilglicerol; e glicerólise inclui reações de alcoólisenas quais o álcool é glicerol. Um exemplo não limitante deinteresterificação ou transesterificação inclui reações dediferentes triglicerideos resultando em reorganização dosgrupos de ácido graxo nos glicerideos e triglicerideos resul-tantes .

Um produto esterifiçado, transesterifiçado ou inte-resterif içado foram respectivamente submetidos ao processo deesterificação, transesterificação ou interesterificação. Apresente abordagem diz respeito às enzimas capazes de efetuaro processo de esterificação, transesterificação ou de inte-resterif icação para gorduras, óleos, triglicerideos, diglice-rideos, monoglicerideos, ácidos livres de gordura, álcooismono ou poliidroxilicos, ou ésteres de álcoois mono ou polii-droxilicos.

Da forma aqui usada, a "meia vida" de uma enzima éo tempo no qual a atividade enzima ti ca de uma amostra de en-zima é diminuída pela metade. Se, por exemplo, uma amostra deenzima diminui sua atividade relativa de 100 unidades para 50unidades em 10 minutos, então a meia vida da amostra de enzi-ma é 10 minutos. Se a meia vida desta amostra é constante,então a atividade relativa será reduzida de 100 para 25 em 20minutos (duas meias vidas), a atividade relativa será reduzi-da de 100 para 12,5 em 30 minutos (três meias vidas) , a ati-vidade relativa será reduzida de 100 para 6,25 em 40 minutos(quatro meias vidas), etc. Da forma aqui usada, a expressão"meia vida de uma enzima" significa a meia vida de uma amos-tra enzimática.Uma meia vida "prolongada" refere-se a uma "meiavida" maior. Prolongar a meia vida de uma enzima resulta emaumentar a meia vida de uma enzima por cerca de 1 %, 2 %, 3 4 % f 5 % t & % f to. q 2-/ 'S , 0 "o , 9 %, 10 %, 15 %, 20 %/ 25 %/ 30 %,

35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 70 "5/ 75 80 %,

85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 105 %, 110 %, 115 %, 120 %, 125 %,

130 %,135 %, 140 % , 145 % , 150 %, 155 %, 160 %, 165 %, 170 %,

175 %, 180 %, 185 %, 190 %, 195 %, 200 %, 210 %, 220 %, 230

240 %, 250 %, 260 %, 270 %, 280 %, 290 %, 300 %, 320 %,

340 %, 360 %, 380 %, 400 %, 420 %, 440 % , 460 %, 480 %, 500 %

ou mais comparado à meia vida de uma enzima usada em um pro-cesso de produção de gordura ou óleo esterifiçado, transeste-rificado ou interesterifiçado que não emprega um meio de pu-rificação .

Exemplos não limitantes de "constituintes que cau-sam ou aparecem da degradação de gordura ou óleo" incluem es-pécie oxidativa ou de oxidação, espécie de oxigênio reativa,produtos de oxidação de gordura ou óleo, peróxidos, ozônio(03) , 02, superóxido, ácidos livres de gordura, compostos vo-láteis e orgânicos, radicais livres, metais traços, e pró-oxidantes naturais tal como clorofila. Tais constituintestambém incluem outros compostos caracterizados ou não carac-terizados reconhecidos pelos versados na tecnologia para cau-sar ou surgir da degradação de gordura ou óleo. Tais consti-tuintes podem surgir a partir de caminhos de oxidação, ou apartir de outros caminhos reconhecidos pelos versados na tec-nologia para resultar em degradação de gordura ou óleo. "Re-duzir" os constituintes que causam ou aparecem da degradaçãode gordura ou óleo em uma amostra do substrato refere-se abaixar a concentração, porcentagem ou tipos de tais constitu-intes na amostra.

0 método de fazer um produto esterifiçado, transes-terificado ou interesterificado pode compreender adicional-mente misturar o substrato inicial e/ou o substrato processa-do por meio de purificação com a enzima em um ou mais tanquespara uma reação de lama em lotes, ou escoar o substrato ini-cial e/ou o substrato processado por meio de purificação a-través de uma coluna contendo a enzima. Um leito de um oumais tipos de meio de purificação pode ser colocado sob umleito da enzima dentro de uma coluna à montante a partir de enzima.

0 substrato inicial, o substrato processado pormeio de purificação, o produto e a enzima esterifiçados,transesterifiçados ou interesterifiçados podem ser em um meioambiente de gás inerte. 0 gás inerte pode ser selecionado apartir de grupo que consiste em N2, C02, He, Ar, e Ne. Prefe-rivelmente, os métodos da presente abordagem compreendem adi-cionalmente prevenir degradação oxidativa do substrato ini-cial, o substrato processado por meio de purificação, o pro-duto esterifiçado, transesterifiçado ou interesterifiçado oua enzima. 0 método de fazer um produto esterifiçado, transes-terif içado ou interesterifiçado pode compreender adicional-mente prevenir degradação oxidativa ao substrato inicial, osubstrato processado por meio de purificação, o produto este-rificado, transesterifiçado ou interesterifiçado ou a enzima.

Versados na tecnologia reconhecerão que com relaçãoao método de fazer um produto esterifiçado, transesterifiçadoou interesterificado, qualquer combinação das particularida-des descritas anteriormente pertencentes a opções de desodo-rização (por exemplo, vazão, tempo de permanência ou residên-cia, temperatura, pressão, escolha de gás inerte), substratoinicial, componentes (por exemplo; ácidos livres de gordura,ésteres não glicerideos, álcoois) opcionalmente adicionadosao substrato inicial ou o substrato processado por meio depurificação, enzima, monitorar ou ajustar métodos, gordurasou óleos produzidos, uso de colunas ou reações de lama em lo-tes, e meio de purificação são usados na presente abordagem.

Transesterificação, esterificação ou interesterifi-cação de acordo com a presente abordagem é efetuada por umlipase. A lipase pode ser especifica ou não especifica comrelação a seu substrato. O substrato inicial pode ser compos-to de um ou mais tipos de gordura ou óleo e tem suas proprie-dades fisicas modificadas em um processo de esterificação,transesterificação ou de interesterificação. Enzimas não se-letivas causam reorganização por transesterificação em todasas três posições em um glicerideo e podem resultar em rando-mização em equilibrio termodinâmico; mas 1,3-lipases especi-ficas causam reorganizações preferivelmente nas posições sn-1e sn-3 em um glicerideo. Por exemplo, quando uma mistura deóleo de oliva e totalmente hidrogenada óleo de palmiste étratado com uma enzima não seletiva, os componentes do produ-to têm diferentes propriedades fisicas de qualquer dos subs-tratos iniciais. Tanto 1,3-lipases especificas quanto lipasesnão seletivas são capazes deste processo de reorganização.Preferivelmente, a lipase é uma lipase 1,3-seletiva, que preferivelmente catalisa esterificação ou tran-sesterificação dos ésteres terminais nas posições sn-1 e sn-3de um glicerídeo. A lipase pode também ser uma lipase não se-letiva, não específica. 0 processo pode produzir gorduras es-terificadas, transesterifiçadas ou interesterifiçadas sem ne-nhum ou poucos ácidos graxos trans para margarina, banha, eoutras gorduras de confeitaria tal como manteiga de cacausubstituta. 0 produto esterifiçado, transesterifiçado ou in-teresterif içado pode também ser um 1,3-diglicerídeo, tal comoo revelado em Patente U.S. No. 6.004.611.

A enzima usada de acordo com a presente abordagempode ser um lipase obtido de uma linha celular eucariótica ouprocariótica cultivada ou tecido animal. Tais lipases tipica-mente incorrem em uma das três categorias (Macrae, A. R.,J.A.O.C.S 60:243A 246A (1983)). A primeira categoria incluinão lipases específicas capazes de liberar ou ligar qualquergrupo de ácido graxo de ou para qualquer posição de glicerí-deo. Tais lipases foram obtidas de Cândida cilindracae, Coiy-nebacterium acnes and Stafilococcus aureus (Macrae, 1983;U.S. Pat. No. 5, 128,251). A segunda categoria de lipases so-mente adiciona ou remove grupos de ácido graxo específicospara ou de glicerideos específicos. Assim, estas lipases sãousadas em produzir ou modificar glicerideos específicos. Taislipases foram obtidas de Geotrichum candidium and Rhizopus,Aspergillus, and Mucor genera (Macrae, 1983; U.S. Pat. No.5, 128,251). A última categoria de lipases preferivelmente ca-talisa a remoção ou adição de grupos de ácido graxo a partirde carbonos de glicerídeo no final nas posições 1 e 3. Taislipases foram obtidas de Thermomyces lanuginosa, Rhizomucornaiehei, Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus dele-mar, acid Rhizopus arrhizus (Macrae, 1983). Enzimas de fontesanimais, tal como lipase pâncreas de porco, também podem ser usadas.

São muitos microorganismos a partir dos quais aslipases usadas na presente abordagem são obtidas. PatenteU.S. No. 5.219.733 lista exemplos de tais microorganismos in-cluindo os do gênero Achromobacter tal como A. iofurgus andlipoliticum; o gênero Chromobacterium tal como C. viscosumvar. para lipoliticum; o gênero Corynebacterium tal como C.Acnes; o gênero Stafilococcus tal como S. Aureus; o gêneroAspergillus tal como A. niger and A. Oryzae; o gênero Cândidatal como C. cilindracea, C. Antarctica b, C. rosa and C. ru-gosa; o gênero Humicora tal como ff. lanuginosa; o gênero Pe-nicillium tal como P. caseicolum, P. crustosumf P. ciclopiumand P. roqueforti; o gênero Torulopsis tal como T. ernobii; ogênero Mucor tal como M nziehei, M. japonicas and M. javani-cus; o gênero Bacillus tal como subtilis; o gênero Thermomy-ces tal como T. ibadanensis and T. lanuginosa (ver Zhang, H.et al. J.A.O. CS. 78: 57-64 (2001)); o gênero Rhizopus talcomo R. delemar, P. japonicasf P. Arrhizus and R. neveus; ogênero Pseudomonas tal como P. Aeruginosa, P. fragi, P. cepa-ciar P. mephitica var. lipolitica and P. fluorescens; o gêne-ro Alcaligenes; o gênero Rhizomucor tal como P. miehei; o ge-nus Humicolo tal como H. rosa; e o gênero Geotrichum tal comoG. candidum. Diversas lipases obtidas destes organismos sãocomercialmente disponíveis como enzimas purificadas. Versadosna tecnologia reconhecerão outras enzimas capazes de realizaresterificação, transesterificação ou interesterificação in-cluindo outras lipases usadas para a presente abordagem.

Lipases obtidas a partir dos organismos anterioressão imobilizadas para a presente abordagem em veículos ade-quados por um método usual conhecido pelos versados na tecno-logia. Patentes U.S 4.7 98.7 93; 5.166.064; 5.219.733;5.292.649; e 5.773.266 descrevem exemplos de lipase imobili-zada e métodos de preparação. Exemplos de métodos de prepara-ção incluem o método aprisionamento, veiculo inorgânico méto-do de ligação covalente, ligação de veiculo orgânico métodocova lente, e o método de adsorção. A lipase usada nos exem-plos a seguir foi obtida de Novozimas (Denmark) mas pode sersubstituída com lipase purificada e/ou imobilizada preparadapor outras. A presente abordagem também contempla o uso pre-parações de enzima bruta ou células de microorganismos capa-zes de sobre expressar lipase, uma cultura de tais células,uma solução de enzima do substrato obtida tratando a cultura,ou uma composição contendo a enzima. A presente abordagemtambém contempla o uso de mais que uma preparação de enzima,tal como mais que uma preparação de lipase.

Patentes U.S 4.940.845 e 5.219.733 descrevem as ca-racterísticas de diversos veículos usados. Veículos usadossão preferivelmente microporosos e têm uma superfície porosahidrofóbica. Normalmente, os poros têm uma proporção média decerca de 10 Â a cerca de 1.000 Â, e uma porosidade de cercade 20 a cerca de 80 % por volume, mais pref erivelmente, decerca de 4 O a cerca de 60 % por volume. Os poros deram ao ve-iculo uma área de ligação à enzima maior por partícula do ve-iculo . Exemplos de veiculos inorgânicos preferidos incluemvidro poroso, cerâmicas porosas, celite, partículas metálicasporosas tais como titânio oxido, aço inoxidável ou alumina,silica gel porosa, peneira molecular, carbono ativo, argila,caulimita, perlita, fibras de vidro, terra diatomácea, bento-nita, hidroxiapatita, gel de cálcio fosfato, e alquilaminaderivados de veiculos inorgânico. Exemplos de veiculos orgâ-nicos preferidos incluem Teflon microporoso, polimero olefi-nico alifático (por exemplo, polietilena, polipropileno, umhomo- ou copolimero de estireno ou uma mistura deste ou umsuporte inorgânico pré-tratado) náilon, poliamidas, policar-bonatos, nitrocelulose e acetilcelulose. Outros veiculos or-gânicos adequados incluem polisacarideos hidrofilicos taiscomo gel de agarose com um grupo hidrofóbico alquila, fenila,tritiala ou outro similar para fornecer uma superfície porosahidrofóbica (por exemplo, "Octil-Sefarose CL-4B", "Fenil-Sefarose CL-4B", ambos produtos de Pharmacia Fine Chemicals(Kalamazoo, Michigan). Resinas de adsorção microporosas in-cluem aquelas feitas de estireno ou polimero alquilamino, re-sina de quelato, resina de troca iônica "DOWER MWA-1" comoessa (fracamente básicas em resina de troca, fabricada peloDow Chemical Co., tendo uma amina terciária como o grupo detroca, compostos basicamente de cadeias de poliestireno reti-culadas com divinilbenzeno, 150 Â em raio de poro médio e ma-lha 20-50 em tamanho de partícula), e resina de celulose hi-drofilica, tal como um preparado mascarando o grupo hidrofi-lico de um veículo celulósico, por exemplo, "CellulofineGC700-m" (produto de Chisso Corporation (Tokyo, Japan), 45-105 \im em tamanho de partícula) .

A esterificação, transesterificação ou interesteri-ficação pode ser conduzida em uma coluna ou em reações do ti-po lama em lotes como descrito na seção dos exemplos a se-guir . Nas reações de lama em lotes, a enzima e substratos sãomisturados vigorosamente para assegurar um bom contato entreeles, tomando cuidado para não misturar sob alto cisalhamen-to, que causaria perda da atividade da enzima. Preferivelmen-te, a reação de transesterificação ou esterificação é reali-zada em um reator de leito fixado com lipases imobilizadas.

Os grupos de ácido graxo aqui descritos podem seradicionados ao substrato inicial ou o substrato processadopor meio de purificação para esterificar grupos alcoólicopresentes on glicerídeos do substrato inicial, ou grupo alco-ólicos de outros compostos (por exemplo, álcoois ou ésteres)adicionados ao substrato processado por meio de purificação.Glicerídeos tendo qualquer dos grupos de ácido graxo como a-qui descrito também podem ser usados no substrato inicial; eoutros ésteres tendo qualquer dos grupos de ácido graxo aquidescritos podem ser adicionados ao substrato inicial ou subs-trato processado por meio de purificação. Tais ácidos graxosincluem cadeia reta saturada ou grupos de ácido graxo ramifi-cados, cadeia reta insaturada ou grupos de ácido graxo rami-ficados , grupos de ácido graxo hidróxi, e grupos ácido poli-carboxílico, ou contêm substituintes não carbono incluindooxigênio, enxofre ou nitrogênio. Os grupos de ácido graxo po-dem ser de ocorrência natural, processados ou refinados deprodutos naturais ou sinteticamente produzidos. Embora nãohaja nenhum limite superior ou inferior para o comprimento dacadeia de carbono maior em ácidos graxos usados, é preferívelque seu comprimento sej a cerca de 6 a cerca de 34 carbonos decomprimento. Grupos de ácido graxo específicos usados para apresente abordagem podem ser formados a partir dos ácidosgraxos descritos nas patentes U.S 4.883.684; 5.124.166;5.149.642; 5.219.733; e 5.399.728.

Exemplos de grupos de ácido graxo de cadeia retasaturada usados tendo um número par de átomos de carbono po-dem ser formados a partir dos ácidos graxos descritos na Pa-tente U.S. No. 5.219.733 incluindo ácido acético, ácido buti-rico, ácido capróico, ácido caprilico, ácido cáprico ácidoláurico, ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico,ácido arácico, ácido beênico, ácido lignocérico, ácido hexa-cossanóico, ácido octacossanóico, ácido triacontanóico, ácidon-dotriacontanóico, e aqueles com um número impar de átomosde carbono, tais como ácido propiônico, ácido n-valerico, á-cido enântico, ácido pelargônico, ácido hendecanóico, ácidotridecanóico, ácido pentadecanóico, ácido heptadecanóico, á-cido nonadecanóico, ácido heneicossanóico, ácido tricôssanói-co, ácido pentacossanoico e ácido heptacossanoico.

Exemplos de grupos de ácido graxo ramificados satu-rados usados podem ser formados dos ácidos graxos descritosna Patente U.S. No. 5.219.733 incluindo ácido isobutirico,ácido isocapróico, ácido isocaprilico, ácido isocáprico ácidoisoláurico, ácido 11-metildodecanóico, ácido isomiristico,ácido 13-metil-tetradecanóico, ácido isopalmitico, ácido 15-metilexadecanóico, ácido isoesteárico, ácido 17-

metiloctadecanóico, ácido isoarácico, ácido 19-metil-eicossanóico, ácido a-etil-hexanóico, ácido a-hexildecanóico,ácido a-heptilundecanóico, ácido 2-deciltetradecanóico, 2-ácido undeciltetradecanóico, ácido 2-decilpentadecanócioic,ácido 2-undecilpentadecanócio, e ácido Fine oxocol 1800 (pro-duto de Nissan Chemical Industries, Ltd.)

Exemplos de grupos de ácido graxo ramificados decarbono impar saturados usados podem ser formados dos ácidosgraxos descritos na Patente U.S. 5.219.733 incluindo ácidosgraxos anteiso terminando com um grupo isobutila, tais comoácido 6-metil-octanóico, ácido 8 metildecanóico, ácido 10-metil-dodecenóico, ácido 12-metil-tetradecanóico, ácido 14-metilexadecanóico, ácido 16-metil-octadecenóico, ácido 18-metil-eicossanóico, ácido 20-metil-docossanóico, ácido 22-metil tetracossanóico, ácido 24-metil-hexacossanóico e 26-ácido metiloctacossanóico.

Exemplos de grupos de ácido graxo insaturados usa-dos podem ser formados de ácidos graxos descritos na PatenteU.S. 5.219.733 incluindo ácido 4-decenóico, ácido caproléi-co, ácido 4-dodecenóico, ácido 5-dodecenóico, ácido lauroléi-co, ácido 4-tetradecenóico, ácido 5-tetradecenóico, ácido 9-tetradecenóico, ácido panitoléico, ácido 6-octadecenóico, á-cido oléico, ácido 9-octadecenóico, ácido 11-octadecenóico,ácido 9-eicossenóico, ácido cis-11-eicossenóico, ácido ceto-léico, ácido 13-docossenóico, ácido 15-tetracossenóico, ácido17-hexacossenóico, ácido 6,9,12,15 hexadecatetraenóico, áci-do linoléico, ácido linilênico, ácido a-eleoesteárico, ácido(3eleoesteárico, ácido punicico, ácido 6, 9, 12,15-

octariecatetraenóico, ácido parinárico, ácido 5,8,11,14- ei-cossatetraenóico, ácido 5,8,11,14,17- eicossapentaenóico(EPA), ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenóico, ácido4,7,10,13,16,19- docossaexaenóico(DHA) e similares.

Exemplos de grupos de ácido graxo hidróxi usadospodem ser formados de ácidos graxos descritos na Patente U.S.5.219.733 incluindo ácido a-hidroxiláurico, ácido a-hidroximiristico, ácido a-hidroxipalmitico, ácido oí-hidroxiesteárico, ácido a-hidroxiláurico, ácido a-hidroxiarácico, ácido 9-hidróxi-12-octadecenóico, ácido rici-noléico, ácido a-hidroxibeênico, 9-hidróxi-trans-10,12- ácidooctadecadienico, ácido camolênico, ácido ipurólico, ácido9, 10-diidroxiesteárico, ácido 12 hidroxiesteárico e similares.

Exemplos de grupos do ácido graxo de ácido policar-boxilico usados podem ser formados de ácidos graxos descritosna Patente U.S. 5.219,733 incluindo ácido oxálico, ácido ci-trico, ácido malônico, ácido succinico, ácido glutárico, áci-do adipico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azeláico,ácido sebácico, ácido D,L-málico e similares.

Preferivelmente, os grupos de ácido graxo têm ca-deias de carbono de cerca de 4 a cerca de 34 carbonos de com-primento. Mais preferivelmente, os grupos de ácido graxo têmcadeias de carbono de cerca de 4 a cerca de 26 carbonos decomprimento. Mais preferivelmente, os grupos de ácido graxotêm cadeias de carbono de cerca de 4 a cerca de 22 carbonosde comprimento. Preferivelmente os grupos de ácido graxo sãoformados a partir do grupo seguinte de ácidos livres de gor-dura : ácido paImitico, ácido esteárico, ácido oléico, ácidolinoléico, ácido linolênico, ácido araquidônico, ácido erúci-co, ácido capróico, ácido caprilico, ácido cáprico, ácido ei-cossapentanóico (EPA), ácido docossaexaenóico(DHA) , ácidoláurico, ácido miristico, ácido 5-eicossenóico, ácido butiri-co, ácido Y"lin°lênico e ácido linoléico conjugado. Grupos deácido graxo formados de ácidos graxos derivado de váriasplantas e gorduras animais e óleos (tais como ácidos graxosde óleo de peixe) e ácidos graxos processados ou refinados deplanta e gorduras animais e óleos (tal como ácidos graxos deóleo de peixe fracionados nos quais EPA e DHA são concentra-dos) também podem ser adicionados. Grupos de ácido graxo tam-bém podem ser formados de ácidos graxos de cadeia média (comodescrito por Merolli, A. et al., M F O , 8:597-603 (1997)).Também preferivelmente, os grupos de ácido graxo são formadosde ácidos livres de gordura tendo cadeias de carbono de cercade 4 a cerca de 36, cerca de 4 a cerca de 24, ou cerca de 4 acerca de 22 carbonos de comprimento.

Álcoois ou ésteres de álcoois também podem ser adi-cionados ao substrato inicial ou o substrato processado pormeio de purificação. Estes álcoois e ésteres podem ser este-rificados, transesterificados ou interesterificados por gru-pos do ácido presentes nos glicerideos do substrato inicial.Alternativamente, estes álcoois ou ésteres destes podem seresterificados, transesterificados ou interesterificados porácidos livres de gordura ou ésteres adicionados ao substratoprocessado por meio de purificação. "Ésteres" incluem qual-quer um dos álcoois aqui descritos esterifiçados por qualquerum dos ácidos graxos aqui descritos.

Exemplos de ésteres usados sem ser glicerideos in-cluem ésteres de cera, ésteres de alquila tais como metila,etila, isopropila, hexadecila ou ésteres de octadecila, éste-res de arila, ésteres de propileno glicol, ésteres de etilenoglicol, ésteres de 1,2-propanodiol e ésteres de 1,3-propanodiol. Ésteres podem ser formados a partir de esterifi-cação, transesterificação ou interesterificação de álcooismonoidroxilicos ou álcoois poliidroxilicos pelos ácidos li-vres de gordura, gorduras ou óleos da forma aqui descrita.

0 substrato inicial ou substrato processado pormeio de purificação pode ser misturado com álcoois monoidro-xilicos ou álcoois poliidroxilicos antes do contato com omeio de purificação ou a enzima. 0 produto esterifiçado,transesterifiçado ou interesterificado pode ser formado apartir de esterificação, transesterificação ou interesterifi-cação dos álcoois monoidroxilicos ou álcoois poliidroxilicos.Os álcoois monoidroxilicos ou os álcoois poliidroxilicos po-dem ser primários, secundários ou terciários álcoois de com-postos de cadeia anular, reta ou ramificada. Os álcoois mo-noidroxilicos podem ser selecionados a partir de grupo queconsiste em álcool metilico, álcool isopropilico, álcool ali-lico, etanol, propanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol,terc-butanol, n-pentanol, isopentanol, n-hexanol, álcool he-xadecilco ou álcool octadecilico. Os álcoois poliidroxilicospodem ser selecionados a partir de grupo que consiste em gli-cerol, propileno glicol, etileno glicol, 1,2-propanodiol e1,3-propanodiol.

Exemplos de álcoois usados na presente abordagemincluem álcoois monoidroxilicos ou álcoois poliidroxilicos.Os álcoois monoidroxilicos podem ser primários, secundáriosou tereiários álcoois de compostos de cadeia anular, reta ouramificada com um ou mais carbonos tais como álcool metílico,álcool isopropilico, álcool alilico, etanol, propanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol, tert-butanol, n-pentanol,iso-pentanol, n-hexanol, álcool hexadecilico ou álcool octa-decilico. 0 grupo hidroxila pode ser anexado a um anel aromá-tico, tal como fenol. Exemplos de álcoois poliidroxilicos in-cluem glicerol, propileno glicol, etileno glicol, 1,2-propanodiol e 1,3-propanodiol.

Patente U.S. 5.219.733 indica outros álcoois usa-dos para a presente abordagem. Estes álcoois incluem, mas semlimitações, 14-metilexadecanol-l, 16-metiloctadecanol-l, 18-metilnonadecanol, 18-metileicossanol, 20-metileneicossanol,2 0-metildocossanol, 22-metiltricossanol, 22-

metiltetracossanol, 24-metilpentacossanol-l e 24-metilexacossanol.

Um ou mais tipos de meio de purificação e a enzimapodem ser empacotados juntos ou separadamente em uma ou maiscolunas através das quais o substrato inicial, o substratoprocessado por meio de purificação ou o produto esterificado,transesterificado ou interesterificado escoa. As colunas po-dem ser colunas encamisadas nas quais a temperatura de umou mais do substrato inicial, o substrato processado por meiode purificação, um ou mais tipos de meio de purificação, aenzima ou o produto esterificado, transesterificado ou inte-resterifcado pode ser regulado. 0 substrato processado pormeio de purificação pode ser preparado misturando o substratoinicial com um ou mais tipos de meio de purificação em umtanque para uma reação de purificação de lama em lotes oumisturando o substrato inicial em uma série de tanques parauma série de reações de purificação de lama em lotes. 0 subs-trato processado por meio de purificação pode ser separado apartir de um ou mais tipos de meio de purificação por meio defiltração, centrifugação ou concentração antes de reagir osubstrato processado por meio de purificação com a enzima.Preferivelmente, o meio de purificação é mantido separado daenzima. Mantendo. o meio de purificação separado da enzima, osconstituintes de impureza do substrato inicial que degradamlipase não entram em contato com a lipase.

No método da presente abordagem, um ou mais tiposde meio de purificação e a lipase são empacotados em uma oumais colunas. Em todas as modalidades, o meio de purificaçãoé mantido separado de (isto é, não intermisturou com) a lipa-se ativa. Se tipos múltiplos de meio de purificação são usa-dos, eles podem ser misturados juntamente e empacotados emuma coluna simples ou mantidos separados em diferentes colu-nas. Em uma modalidade alternativa, um ou mais tipos de meiode purificação são colocados sob um leito de lipase empacota-das dentro de uma coluna. Alternativamente, a lipase ativapode ser mantida separada a partir de meio de purificação em-pacotando-a em sua própria coluna. Mais que um tipo de meiode purificação pode ser usado com propósitos de remover dife-rentes tipos de impurezas no substrato inicial. As colunas eoutros condutos de fluido podem ser encamisados de maneira aregular a temperatura do substrato inicial, o substrato pro-cessado por meio de purificação, o meio de purificação ou aenzima. O meio de purificação pode ser regenerado para usorepetido.

Também no método da presente abordagem, o substratoprocessado por meio de purificação é preparado misturando osubstrato inicial com um ou mais tipos de meio de purificaçãoem um tanque para um lama em lotes tipo purificação reação oumisturando o substrato inicial em uma série de tanques parauma série de reações do tipo lama em lotes de purificação.Nestas reações do tipo lama em lotes de purificação, os dife-rentes tipos de meio de purificação podem ser mantidos sepa-rados ou podem ser combinados. Após reagir com um tipo demeio de purificação (ou mistura especifica de meio de purifi-cação) , o substrato inicial é separado a partir de meio depurificação (ou meios) por meio de filtração, centrifugaçãoou concentração. Após esta etapa de separação, o substratoinicial é adicionalmente purificado com outro meio de purifi-cação ou serve como substrato processado por meio de purifi-cação e reage com lipase. 0 substrato processado por meio depurificação preparado por este método de reação de purifica-ção tipo lama em lotes pode reagir com lipase em um tanquepara transesterificação ou esterificação tipo lama em lotes.Alternativamente, o substrato processado por meio de purifi-cação pode ser forçado a escoar através de uma coluna de li-pase . Os tanques de reação, colunas e outros condutos defluido podem ser encamisados de maneira a regular a tempera-tura do substrato inicial, o substrato processado por meio depurificação, o meio de purificação ou a enzima. Outras manei-ras de regulagem da temperatura, tais como serpentinas de a-quecimento/resfriamento ou ambientes controlados pela tempe-ratura, são contemplados e bem conhecidos na tecnologia. 0meio de purificação pode ser regenerado pelo uso repetido.

Atividade da lipase enzimatica é também afetada porfatores tais como temperatura, luz e teor de umidade. Tempe-ratura é controlada como descrito anteriormente. Luz pode sermantida fora usando vários meios de bloquear ou filtrar a luzconhecidos na tecnologia. Teor de umidade, que inclui umidadeatmosférica ambiente, é controlado operando o processo comoum sistema fechado. Onde o processo inclui desodorização u-sando vapor como um agente removedor, o processo de desodori-zação pode ser mantido isolado a partir de enzima. Em funçãoda desodorização ser realizada a alta temperatura e sob vá-cuo, teor de umidade no óleo desodorizado é muito baixo. Ondeo processo de desodorização usa um gás inerte como o agenteremovedor, o processo de desodorização é opcionalmente manti-do isolado a partir de enzima. Alternativamente, um leito degás nitrogênio (ou outro gás inerte) pode ser colocado no to-po do leito ou coluna contendo tanto meio de purificaçãoquanto enzima. Estas técnicas têm o beneficio adicionado demanter espécie oxidativa atmosférica (incluindo oxigênio) fo-ra do substrato, produto ou enzima.

Lipase imobilizada pode ser misturada com substratoinicial ou substrato processado por meio de purificação paraformar uma lama que é empacotada em uma coluna adequada. Al-ternativamente, substrato ou substrato purificado pode escoaratravés de uma coluna de enzima pré-empacotada. A temperaturado substrato é regulada de maneira que ela possa escoar con-tinuamente através da coluna para contato com a enzima detransesterificação ou esterificação. Se gorduras, óleos, tri-glicerideos ou diglicerideos sólidos ou muito viscosos sãousados, o substrato é aquecido em um estado fluido ou menosviscoso. 0 substrato pode ser forçado a escoar através da co-luna (s) sob a força de gravidade, usando uma bomba peristál-tica ou pistão, sob a influência de uma bomba de sucção ou avácuo, ou usando uma bomba centrifuga. As gorduras e óleostransesterifiçados produzidos são coletados e os glicerideosdesejados são separados a partir de mistura de reação produ-tos por métodos bem conhecidos na tecnologia. Este métodocontinuo envolve uma probabilidade reduzida de permitir expo-sição dos substratos ao ar durante reação e tem então a van-tagem de que os substratos não serão expostos a umidade ouespécie oxidativa. Alternativamente, tanques de reação paraprodução tipo lama em lotes como descrito anteriormente tam-bém podem ser usados. Preferivelmente, estes tanques de rea-ção também são selados do ar de maneira a prevenir exposiçãoao oxigênio, umidade, ou outra espécie oxidante do ambiente.

0 método da presente abordagem também compreendemonitorar atividade enzimática medindo uma ou mais proprieda-des fisicas do produto esterifiçado, transesterifiçado ou in-teresterificado; e opcionalmente ajustar o tempo de duraçãopara que o substrato purificado faça contato com a lipase, ouajustar a temperatura do substrato inicial, o substrato puri-ficado, um ou mais tipos do meio de purificação ou a lipaseem resposta a uma mudança na atividade enzimática, para pro-duzir gorduras ou óleos tendo uma maior proporção substanci-almente uniforme de esterificação, interesterificação, outransesterificação com relação ao substrato inicial como me-dido pelas propriedades fisicas. 0 tempo de duração para queo substrato purificado faça contato com a lipase pode ser a-justado ajustando a vazão de substrato purificado fornecidopara contato com a lipase. Também, a quantidade e tipo de umou mais tipos de meio de purificação pode ser ajustado emresposta a mudanças nas propriedades fisicas das gorduras ouóleos para aumentar ou melhorar produtividade enzimática do lipase.

Pela frase "maior proporção substancialmente uni-forme de esterificação, interesterificação, ou transesterifi-cação com relação ao substrato inicial", deve-se entender quea quantidade ou grau de esterificação, interesterificação, outransesterificação do óleo ou gordura produzidos de um subs-trato inicial particular pelos métodos da invenção varia nãomais que cerca de 10 %, preferivelmente não mais que cerca de5 % com medido por uma mudança em uma das medidas de proprie-dades fisicas, a seguir.

Na presente abordagem, mudanças na atividade enzi-mática são monitoradas pelas seguintes mudanças nas proprie-dades fisicas do produto. Como a atividade enzimática dimi-nui , o taxa de conversão do substrato diminui de maneira quemenos do substrato é convertido no produto por meio de este-rificação, transesterificação ou interesterificação a uma va-zão dada a quantidade inicial de conversão. Conseqüentemente,como a atividade enzimática decai, as propriedades fisicas doproduto progressivamente se parecem com as propriedades físi-cas dos componentes do substrato. Versados na tecnologia re-conhecem que pelas seguintes mudanças nas propriedades físi-cas, os parâmetros do processo de produção esterifiçado,transesterificado ou interesterifiçado podem ser ajustados,aumentando assim a proporção do produto esterifiçado, tran-sesteri ficado ou interesterifiçado com relação ao substrato,de maneira que gorduras e óleos com um grau de esterificação,interesterificação, ou transesterificação desejado possam serproduzidos enquanto melhora a produtividade enzimática do li-pase.

Uma ou mais propriedades físicas do produto de gor-duras ou óleos que pode ser medida durante os métodos da in-venção incluem o ponto de gotejamento temperatura do produto,o perfil do teor de gordura sólida do produto, e mudanças emespectro ótico.

O ponto de gotejamento de Mettler (MDP) é um exem-plo de uma propriedade fisica que pode ser medida para seguirmudanças na atividade enzimática. 0 MDP é determinado usandoinstrumentos de análise térmica de Mettler Toledo, Inc. (Co-lumbus, OH) de acordo com o American Oil Chemists Society Of-ficial Method #Cc 18-80. O MDP é a temperatura na qual umamistura de gorduras ou óleos torna-se fluido.

O perfil do teor de gordura sólida do produto (SFC)(em função de temperatura) é uma outra propriedade fisica u-sada para rastrear mudanças na atividade enzimática. SFC podeser medido de acordo com American Oil Chemists Society Offi-cial Method #Cd 16b-93.

Acompanhar as mudanças no espectro ótico é um outromeio de monitorar mudanças na atividade enzimática. 0 subs-trato e produto cada qual tem um espectro ótico característi-co. Como a atividade da lipase decai, a quantidade de produtoque deu origem aos sinais de espectroscópicos que podem seratribuídos ao produto esterificado, transesterifiçado ou in-teresterifiçado (e que não podem ser atribuídos ao substrato)diminui.

Todas essas propriedades são medidas usando técni-cas bem conhecidas na tecnologia, e são usadas nas acompanharas mudanças na atividade enzimática e para determinar a uni-formidade de esterificação, interesterificação, ou transeste-rif icação dos óleos ou gorduras produzidos.

Por exemplo, como a atividade da lipase enzimáticadecai, menos substrato é convertido no produto resultando emum razão em peso maior substratorproduto. Esta razão em pesomaior é manifestada em uma mudança de propriedades fisicas doproduto que escoa para fora tendendo em direção às proprieda-des fisicas do substrato não esterificado ou não interesteri-fiçado. Para minimizar esta mudança, a vazão do substrato éreduzida de maneira que ela seja exposta por um longo periodode tempo à lipase empacotada. A redução da vazão aumenta orazão em peso do produto: substrato e conseqüentemente aspropriedades fisicas das gorduras ou óleos que escoam parafora refletem a do o produto esterificado, transesterifiçadoou interesterificado desejado. Outros parâmetros do processoque podem ser alterados incluem a vazão, temperatura oupressão do substrato inicial ou o substrato processado pormeio de purificação.

Onde substrato processado por meio de purificaçãoreage com lipase em um tanque para produção tipo lama em lo-tes, mudanças nas propriedades fisicas do produto também po-dem ser monitoradas como descrito anteriormente. Em um pro-cesso tipo lama em lotes, um tempo de duração otimizado é de-terminado para fazer contato com o substrato inicial com omeio de purificação (ou meios). Um tempo otimizado é tambémdeterminado para fazer contato com o substrato processado pormeio de purificação com enzima.

Assim, modalidades da invenção envolvem monitoraratividade enzimatica medindo uma ou mais propriedades fisicasdo produto após ter escoado através da lipase, ajustar vazão,tempo de residência da coluna, ou temperatura do substratoinicial, ou substrato processado por meio de purificação, eajustar os parâmetros do processo ou a quantidade e tipo domeio de purificação em resposta a mudanças nas propriedadesfisicas a fim de aumentar ou melhorar a produtividade enzimá-tica da lipase e/ou para aumentar a proporção de gorduras es-terificadas, transesterificadas ou interesterificadas ou ó-leos no produto me maneira que gorduras e óleos com um graude esterificação, interesterificação, ou transesterificaçãodesejado possas ser produzidos, particularmente aqueles tendouma maior proporção substancialmente uniforme de esterifica-ção, interesterificação, ou transesterificação com relação aosubstrato inicial.

0 produto esterificado, transesterificado ou inte-resterificado pode ser submetido a processos de refinamentodo óleo usual incluindo processo de refinamento, branqueamen-to, fracionamento, separação ou purificação, ou processo dedesodorização adicional. 0 produto do processo presente podeser separado de qualquer ácido graxo livre ou outros subpro-dutos refinando técnicas bem conhecidas na tecnologia. No ca-so de métodos tipo lama em lotes, o produto desejado pode serseparado usando um solvente adequado tal como hexano, remo-vendo o material do ácido graxo com um álcali, desidratando esecando a camada do solvente, e removendo o solvente a partirda camada. 0 produto desejado pode ser purificado, por exem-plo, por cromatografia de coluna. Os produtos desejados assimobtidos são usáveis para uma ampla variedade de aplicaçõesculinárias.

Os exemplos seguintes mostram o efeito do pré-tratamento do substrato na produtividade da enzima.EXEMPLOS

Os exemplos descritos a seguir mostram que a produ-tividade da transesterificação ou esterificação enzimática ébastante melhorada por purificação do óleo substrato. Os e-xemplos seguintes são somente ilustrativos e não devem limi-tar o escopo da invenção da forma definida pela reivindicaçãoanexa.

EXEMPLO 1

0 exemplo seguinte mostra o efeito do pré-tratamento de arginina do substrato na meia vida de lipase.Os três experimentos seguintes foram realizados neste exem-plo: i) a atividade de lipase foi monitorada mediante exposi-ção ao substrato que não foi submetido ao pré-tratamento dearginina ("controle"); ii) a atividade de lipase foi monito-rada mediante exposição ao substrato que foi pré-tratado comarginina granular; e iii) a atividade de lipase foi monitora-da mediante exposição ao substrato que foi pré-tratado comsilica revestida com arginina.

9,4 g de enzima (TL IM de Novozimas A/S, Denmark)foram empacotadas em um coluna encamisada de 1,5 cm de diâme-tro (30 cm comprimento) a uma altura de 11,8 cm, que deu 20,8mL de volume do leito da enzima. A água circulante através dacamisa de coluna foi mantida a 70 °C. A bomba do pistão e li-nhas de alimentação foram envoltas com fita de aquecimento ecoberta com insolação para impedir qualquer solidificação dosubstrato.

Os materiais de pré-tratamento (isto é, meio de pu-rificação) foram testados como pré-colunas de óleo adicionado1,5 vezes o volume do leito de material de pré-tratamento pa-ra a coluna no topo da lipase imobilizada. Para o controle,somente enzima foi empacotada na coluna sem nenhuma pré-coluna no topo. Arginina granular foi adquirida de Sigma Che-mical (St Louis, Mo), e usada sem nenhuma modificação adicio-nal para testar o efeito de arginina granular. Silica reves-tida de arginina foi preparada dissolvendo arginina granularem água deionizada a 50 'C antes da adição de silica gel (Da-visil grau 636 da Aldrich Chemical) . Após misturar a soluçãode silica gel-arginina por 15 minutos, o liquido foi separadoa partir de sílica gel filtrando através de um papel de fil-tro de grau médio sob baixa pressão. A silica gel úmida co-berta foi seca em um forno a 70 0C por toda a noite.

Substrato do óleo foi feito com óleo de fava de so-ja refinado, branqueado (RB), que formou a porção liquida deóleo no substrato, e óleo de fava de soja totalmente hidroge-nado, que fez a gordura sólida no substrato. Uma mistura desubstrato de óleo de fava soja RB e óleo de fava de soja to-talmente hidrogenado (80/20 por peso) foi preparada e intro-duzida no topo da coluna usando uma bomba de pistão to subs-trato de alimento.

A extensão de reação da enzima foi monitorada pelamudança de propriedades de fusão do substrato e produtos, me-dida por ponto de gota de Mettler (MDP) como revelado no pe-dido de patente U.S.. 2003/0054509 Al. A mistura de substratofoi bombeada para a coluna a uma taxa que deu o ponto de gotade Mettler desejado (105-107 °F) do óleo produto saindo dacoluna de lipase, e a taxa de bombeamento foi ajustada duran-te testes para compensar a perda de atividade da lipase. Fi-gura I mostra o ajuste da taxa de bombeamentos para substratonão tratado (circulos abertos), substrato tratado com argini-na granular (circulos fechados), ou substrato tratado com si-lica revestida de arginina (losangos fechados).

Os resultados na Figura 1 são sumarizados na Tabela1 que mostra as meias vidas e produtividades da lipase expos-tas a substrato não tratado ou tratado com arginina. A pri-meira meia vida for cada caso foi determinada quando a taxade bombeamento foi reduzida pela metade da taxa de bombeamen-to inicial. Produtividade foi determinada dividindo as quan-tidades totais do produto feito durante a primeira meia vidapela quantidade de enzima (9,4 g).

Tabela 1. efeito do pré-tratamento de Arginina nameia vida produtividade da enzima TL IM e

<table>table see original document page 67</column></row><table> A primeira meia vida do controle foi 13 dias, dandouma produtividade de 1220 g de óleo/g enzima. Esta perda daatividade inicial é muito tipica para lipases imobilizadasusadas desta maneira. Controle não mostra o efeito de prote-ção inicial, que os tratamentos de arginina demonstram. A ar-ginina granular preservou a atividade da enzima inicial pelosprimeiros 8 dias, e então sucedeu-se uma queda rápida. Meiavida e produtividade foram melhoradas pelo tratamento de ar-ginina granular. Substrato pré-tratamento com silica revesti-da de arginina impediu a perda de atividade da enzima pelosprimeiros 20 dias antes de mostrar um sinal de declinio daatividade da lipase. A meia vida e produtividade de pré-tratamento com silica revestida de arginina é maior que qua-tro vezes que a do controle.

Estes experimentos mostram que arginina granularmelhora significativamente a meia vida de lipase TL IM. Umamelhora ainda maior na meia vida de lipase TL IM é demonstra-da quando silica revestida de arginina gel é usada como omeio de purificação. Acredita-se que esta melhora maior nameia vida é pelo fato de que silica revestida de arginina termaior área da superfície do que arginina granular.

EXEMPLO 2

Outros aminoácidos foram testados por sua capacida-de para aumentar a meia vida de lipase. Preparações da silicarevestida de aminoácido e condições para operação da colunaforam as mesmas descritas no Exemplo 1. A extensão de reaçãoda enzima foi monitorada pela mudança de propriedades de fu-são do substrato e produtos, medidas por ponto de gota deMettler (MDP) como revelado na Pedido de publicação U.S. No.200310054509 Al. A mistura de substrato foi bombeada para acoluna em uma taxa que deu o ponto de gota de Mettler deseja-do (105 - 4 07 °F) de óleo do produto saindo a coluna de lipa-se, e a taxa de bombeamento foi ajustada durante testes paracompensar a perda de atividade da lipase.

Figura 2 mostra o ajuste da taxa de bombeamento pa-ra substrato tratado com silica revestida de arginina (losan-gos fechados), silica revestida com lisina (círculos aber-tos) , silica revestida com histidina (triângulos fechados), esilica revestida com cisteina (estrelas "*"). Os dados deFigura 2 são sumarizados na Tabela 2.

Tabela 2: Efeito do pré-tratamento de arginina, Lisina, Histidina ou Cisteina na meia vida eprodutividade da enzima TL IM rrr

<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table>

Efeito de proteção significativo foi obtido com li-sina e histina em silica. Cisteina forneceu um pequeno efeitode proteção na meia vida de lipase (15 dias) com relação aocontrole (13 dias)

EXEMPLO 3

9,4 g de enzima (TL IM de Novozimas) foi empacotadoem uma coluna encamisada de 1,5 cm de diâmetro (30 cm de com-primento) a uma altura de 11,8 cm, que deu um volume de leitoda enzima de 20,8. A água circulante através da camisa de co-luna foi mantida a 7 0 °C. A mistura do substrato de óleo defava de soja e óleo de fava de soja hidrogenado (80/20 porpeso) foi preparada e introduzida no topo da coluna usandouma bomba HPLC no substrato de alimento. A bomba HPLC e aslinhas de alimento foram envoltas com fita de aquecimento ecobertas com isolante para impedir qualquer solidificação dosubstrato.

A extensão de reação da enzima foi monitorada pelamudança de propriedades de fusão do substrato e produtos, me-didas por ponto de gota de Mettler (MDP) como revelado no Pe-dido de publicação U.S. No. 2003/0054509 Al. A mistura desubstrato foi bombeada para a coluna em uma taxa que deu oponto de gota de Mettler desejado (105 - 107 °F) de óleo sa-indo da coluna, e a taxa de bombeamento foi ajustada durantetestes para compensar a perda de atividade da lipase.

Substrato do óleo foi feito em alguns casos com ó-leo de fava de soja refinado, branqueado, desodorizado (RBD),que é equivalente ao produto de comércio. Em alguns casos,substrato do óleo foi feito com óleo que foi somente submeti-do a refinamento e branqueamento do óleo (RB). 0 último óleoforma um substrato preferido a partir de ponto de vista decusto do processo. Estes óleos formam a porção liquida do ó-leo no substrato na Tabela 3.

Tabela 3. Exemplos comparativos. Todos óleos subs-trato contiveram 20 % do óleo de fava de soja totalmente hi-drogenado e 80 % do óleo indicado na tabela.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

Meia vida da enzima usando substrato feito com óleoRBD na média de 8 dias, e foi somente 6 dias usando substratofeito com soja RB. Ré-desodorizando a mistura de soja RBD eóleo de soj a totalmente hidrogenado a meia vida foi estendidapara 10 dias.

EXEMPLO 4

Os testes da Tabela 4 foram conduzidos como no E-xemplo 3 a 70 °C, e materiais foram testados como pré-colunasde óleo adicionando um volume igual do leito de material àcoluna no topo da lipase imobilizada. A extensão de reação daenzima foi monitorada pela mudança de propriedades de fusãodo substrato e produtos, medida pelo ponto de gota de Mettler(MDP) como revelado no Pedido de Publicação U.S. No.2003/0054509 Al. A mistura de substrato foi bombeada para acoluna em uma taxa que deu o ponto de gota de Mettler deseja-do (105-107 °F) do óleo do produto saindo da coluna de lipa-se, e a taxa de bombeamento foi ajustada durante testes paracompensar a perda de atividade da lipase.

Tabela 4

<table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table>

* Lipase TL IM usada é a enzima que foi previamente usada emreações de interesterificação idênticas até a atividade seresgotada.

EXEMPLO 5

Resinas de troca iônica foram testadas como pré-colunas (Tabela 5); os testes foram conduzidos de outra formaa 70 °C como no Exemplo 3. Para fazer uma mistura re-de sodorizado, óleo de fava de soj a totalmente hidrogenado foifundido no óleo RBD de soj a e a mistura fundida foi desodori-zada sob condições padrões de refinamento de óleo comestível.A extensão de reação da enzima foi monitorada pela mudança depropriedades de fusão do substrato e produtos, medida peloponto de gota de Mettler (MDP) como revelado em Pedido de pu-blicação U.S. No. 2003/0054509 Al. A mistura de substrato foibombeada para a coluna em uma taxa que deu o ponto de gota deMettler desejado (105-107 °F) de óleo do produto saindo dacoluna de lipase, e a taxa de bombeamento foi ajustada duran-te testes para compensar a perda de atividade da lipase.

Tabela 5

<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>

* A resina de troca iônica foi seca a 110 °C por 2 horas.**A resina de troca iônica foi seca em etanol e o etanol foiremovido antes do uso.

Quando resina Rohm & Haas A-7 foi seca com etanolantes do uso, um aumento na meia vida de lipase e produtivi-dade foi notado.

EXEMPLO 6

Materiais contendo proteína e um aminoácido foramtestados como pré-colunas (Tabela 6); os testes foram condu-zidos de outra forma a 70°C como no Exemplo 3. A proteína ve-getal texturizada particular usada foi proteína vegetal tex-turizada da marca TVP® de Archer Daniels-Midland Company, có-digo do produto 165 840 (grânulos de 1/16 polegadas), com umteor de umidade da forma recebida de 6 %. A extensão de rea-ção da enzima foi monitorada pela mudança de propriedades defusão do substrato e produtos, medida pelo ponto de gota deMettler (NIDP) como revelado em Pedido de publicação U.S.No. 200310054509 Al. A mistura de substrato foi bombeada paraa coluna em uma taxa que deu o ponto de gota de Mettler de-sejado (105-107 °F) de óleo do produto saindo da coluna delipase, e a taxa de bombeamento foi ajustado durante testespara compensar a perda de atividade da lipase.

Tabela 6

<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>

Quando secos por toda a noite a 70-80 °C antes douso, um aumento da meia vida de lipase e produtividade foinotado.

EXEMPLO 7

Uma reação de interesterificação na escala de pro-dução foi realizada usando proteina vegetal texturizada damarca TVP® de Archer-Daniels-Midland Company como meio de pu-rificação. Um lote de TVP® tendo código do produto 165 840(grânulos de 1/16 polegadas) foi seco em um secador de cor-reias a 275 °F durante a fabricação para um teor de umidadefinal de 2 %. O TVP® seco foi empacotado em duas colunas domeio de purificação (12 polegadas de diâmetro e 46 polegadasde altura, 87,5 lb TVP® por coluna). Lipase (TL IM Novozima,240 lb) foi empacotada em uma coluna de reator aquecido (2-ftde diâmetro e 5-ft de altura).

óleo de alimentação (uma mistura compreende 80 par-tes óleo de fava de soja desodorizado refinadas, branqueadas,de e 2 0 partes de óleo de fava de soj a totalmente hidrogena-do) foi misturado e aquecido a 7 0 °C para assegurar fusão to-tal do óleo de fava de soj a hidrogenado e completa misturados componentes do óleo de alimentação. O óleo de alimentaçãofoi bombeado através do meio de colunas de purificação da ba-se do topo em série antes de entrar na base da coluna do rea-tor aquecida a um vazão inicial de cerca de 4 gal/min. óleointeresterifiçado saiu do topo da coluna de reator aquecidacomo produto. A vazão do óleo de alimentação foi reduzida co-mo a atividade da enzima diminuiu lentamente para fornecer oproduto tendo propriedades de fusão consistentes. A extensãode reação da enzima foi monitorada pela mudança de proprieda-des de fusão do substrato e produtos, medida pelo ponto degota de Mettler (MDP) como revelado no Pedido de publicaçãoU.S. No. 2003/0054509 Al. A mistura de substrato foi bombeadapara a coluna em uma taxa que deu o ponto de gota de Mettlerdesejado (105-107 °F) de óleo do produto saindo da coluna delipase, e a taxa de bombeamento foi ajustada durante testespara compensar a perda de atividade da lipase. A temperaturada coluna de reator aquecida foi mantida a 70°C.

A lipase produziu 994,800 libras de óleo intereste-rificado tendo propriedades de fusão satisfatórias (ponto degota de Mettler 105-107 °F) , de maneira que a produtividadeda lipase foi 4,145 g de óleo/g de enzima.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita comcerto detalhe com o propósito de esclarecimento e entendimen-to, versados na tecnologia perceberão na leitura desta reve-lação que várias mudanças na forma e detalhe podem ser fei-tas sem fugir do escopo da invenção e reivindicação anexa.Todos os pedidos de patente supramencionados são por meiodesta incorporados na sua integra pela referência.

Claims (77)

1. Método para produzir gorduras ou óleos,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:colocar um substrato inicial compreendendo um oumais glicerideos em contato com um ou mais tipos de proteínavegetal para gerar um substrato purificado; ecolocar o substrato purificado em contato com li-pase para efetuar esterificação, interesterificação ou tran-sesterificação, criando as gorduras ou óleos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína vegetal é uma pro-teína de soj a.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína vegetal é uma pro- teina vegetal texturizada.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína vegetal texturiza-da é uma proteína de soja texturizada.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína vegetal tem um te-or de umidade menor que cerca de 5 %.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que o teor de umidade da proteínavegetal é de cerca de 2 % a cerca de 4 %.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente qualquer dos ácidos sem gordura, álcooismonoidroxilicos, álcoois poliidroxilicos, ésteres ou suascombinações.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais glicerideos com-preendem qualquer um de:(i) gordura de manteiga, manteiga de cacau, subs-titutos de manteiga de cacau, manteiga de Illipê, manteigade kokum, gordura de leite, gordura mowrah, manteiga phulwa-ra, gordura sal, manteiga de Shea, gordura de Borneo, banhade porco, lanolina, gordura de boi, gordura de carneiro,gordura de vela, gordura animal, óleo de canola, óleo de ri-cino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo desemente de algodão, óleo de avelã, óleo de cânhamo, óleo dejatropha, óleo de semente de linho, óleo de semente de man-ga, óleo de meadowfoam, óleo de mostarda, óleo de mocotó,óleo de oliva, óleo de palmeira, óleo de semente de palmei-ra, óleo de amendoim, óleo de semente de colza, óleo de fa-relo de arroz, óleo de açafroa, óleo de Sasanqua, manteigade Karité, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleode pinho, óleo de tsubaki, óleos vegetais, óleos marinhosque podem ser convertidos em gorduras plásticas, óleos mari-nhos que podem ser convertidos em gorduras sólidas, óleo depeixe, óleo de peixe-carvão do Pacifico, óleo de figado debacalhau, óleo de peixe olho-de-vidro laranja, pile herd ó-leo, óleo de sardinha, óleos de baleia, óleos de arenque, 1, 3-dipalmitoil-2-monooleina (POP), 1(3) palmitoil-3(1) -estearoil-2-monooleina (POSt), 1,3-diestearoil-2-monooleina(StOSt), triglicerideo, diglicerideo, monoglicerideo, tri-glicerideo do ácido beênico, trioieina, tripalmitina, tris-tearina, óleo de palmeira, estearina de palmeira, óleo desemente de palmeira, estearina de semente de palmeira, gli-cerideos de ácidos graxos de cadeia média;(ii) óleos parcialmente hidrogenados processados de (i);(iii) óleos totalmente hidrogenados processados de(i); ou(iv) óleos fracionados de (i) .

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente ésteres.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que os ésteres compreendem qual-quer dos ésteres de cera, ésteres de alquila, ésteres de me-tila, ésteres de etila, ésteres de isopropila, ésteres deoctadecila, ésteres de arila, ésteres de propileno glicol,ésteres de etileno glicol, ésteres de 1,2 propanediol ou és-teres de 1,3-propanediol.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que os ésteres são formados apartir da esterificação ou transesterificação de álcoois mo-noidroxilicos ou álcoois poliidroxilicos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois monoidroxilicos ouos álcoois poliidroxilicos são álcoois primários, secundá-rios ou terciarios de compostos de cadeia anular, reta ouramificada.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois monoidroxilicoscompreendem qualquer de álcool metilico, álcool isopoipili-co, álcool alilico, etanol, propanol, n butanol, iso-butanol, sec-butanol, terc-butanol, n-pentanol, iso-pentanol, n-hexanol ou álcool octadecilico.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois poliidroxilicoscompreendem qualquer de glicerol, propileno glicol, etilenoglicol, 1,2-propanediol ou 1,3-propanediol.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente álcoois monoidroxilicos primários, secun-dários ou terciários de compostos de cadeia anular, reta ouramificada.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois monoidroxilicoscompreendem qualquer de álcool metilico, álcool isopoipili-co, álcool alilico, etanol, propanol, n butanol, iso-butanol, sec-butanol, terc-butanol, n pentanol, iso-pentanol, n hexanol ou álcool octadecilico.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente álcoois poliidroxilicos primários, secun-dários ou terciários de compostos de cadeia anular, reta ouramificada.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois poliidroxilicoscompreendem qualquer de glicerol, propileno glicol, etilenoglicol, 1,2-propanediol ou 1,3-propanediol.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente um ou mais ácidos graxos.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais ácidos graxos com-preendem cadeias de carbono de cerca de 4 a cerca de 22 car-bonos de comprimento.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que os ácidos graxos compreendemqualquer de ácido palmitico, ácido esteárico, ácido oléico,ácido linoléico, ácido linilênico, ácido araquidônico, ácidoerúcico, ácido capróico, ácido caprilico, ácido cáprico áci-do láurico, ácido miristico, ácido eicossapentaenóico (EPA),ácido docosaexaenóico(DHA), ácido 5-eicossenóico, ácido bu-tirico, ácido ylin°lênico ou ácido linoléico conjugado .

22. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais tipos de proteinavegetal e a lipase são empacotados em uma ou mais colunas.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que as colunas são colunas enca-misadas nas quais a temperatura do substrato inicial, dosubstrato purificado, de um ou mais tipos de proteina vege-tal, ou de lipase é regulada.

24. Método, de acordo com a, reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato purificado é pre-parado misturando o substrato inicial com um ou mais tiposde proteina vegetal em um tanque para uma reação de purifi-cação de lama em lotes ou misturando o substrato inicial emuma série de tanques para uma série de reações de purifica-ção de lama em lotes.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato purificado é se-parado a partir de um ou mais tipos de proteína vegetal pormeio de filtração, centrifugação, ou principal concentraçãopara reagir o substrato purificado com a lipase.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende misturar adicio-nalmente o substrato purificado com a lipase em um tanquepara uma reação de lama em lotes, ou escoando o substratopurificado através de uma coluna contendo a lipase-

27. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que um leito de um ou mais tiposde proteina vegetal é colocado sob um leito da lipase dentrode uma coluna.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que a coluna é uma coluna encami-sada na qual a temperatura do substrato inicial, do substra-to purificado, de um ou mais tipos de proteina vegetal, oude lipase é regulada.

29. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a lipase é obtido de uma li-nha celular eucariótica ou procariótica cultivada.

30. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a lipase é uma lipase 1,3-seletivo.

31. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a lipase não é uma lipase se-letiva .

32. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente:monitorar a atividade enzimática medindo uma oumais propriedades fisicas das gorduras ou óleos após ter en-trado em contato com a lipase; eajustar o tempo de duração para que o substratopurificado faça contato com a lipase, ou ajustar a tempera-tura do substrato inicial, do substrato purificado, de um oumais tipos de proteína vegetal ou a lipase em resposta a umamudança na atividade enzimática para produzir gorduras ouóleos com uma maior proporção substancialmente uniforme deesterificação, interesterificação, ou transesterificação comrelação ao substrato inicial.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente:ajustar a quantidade e tipo de um ou mais tipos deproteina vegetal em resposta a mudanças nas propriedades fi-sicas das gorduras ou óleos para aumentar a produtividadeenzimática da lipase.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que uma ou mais propriedades fi-sicas incluem a temperatura do ponto de gotej amento Mettlerdas gorduras ou óleos.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADO pelo fato de que uma ou mais propriedades fi-sicas incluem o perfil do teor de gordura sólida das gorduras ou óleos.

36. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que as gorduras ou óleos produzi-dos são 1,3-diglicerideos.

37. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais glicerideos com-preendem parcialmente óleo de soja hidrogenado, óleo de mi-lho parcialmente hidrogenado, óleo de semente de algodãoparcialmente hidrogenado, óleo de soja totalmente hidrogena-do, óleo de milho totalmente hidrogenado, ou óleo de sementede algodão totalmente hidrogenado.

38. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais glicerideos com-preendem óleo de palmeira parcialmente hidrogenado, óleo desemente de palmeira parcialmente hidrogenado, óleo de pal-meira totalmente hidrogenado, óleo de semente de palmeiratotalmente hidrogenado, óleo de palmeira fracionado, óleo desemente de palmeira fracionado, óleo de palmeira parcialmen-te hidrogenado fracionado, ou óleo de semente de palmeiraparcialmente hidrogenado fracionado.

39. Método para produzir gorduras ou óleos,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:colocar um substrato inicial compreendendo um oumais glicerideos em contato com um ou mais tipos de meio depurificação para gerar um substrato purificado;e colocar o substrato purificado em contato comlipase para efetuar esterificação, interesterificação outransesterificação, criando as gorduras ou óleos;em que um ou mais aminoácidos são revestidos em umou mais tipos de meio de purificação.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente qualquer dos ácidos sem gordura, álcooismonoidroxilicos, álcoois poliidroxilicos, ésteres ou suascombinações.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais glicerideos com-preendem qualquer de:(i) gordura de manteiga, manteiga de cacau, subs-titutos de manteiga de cacau, manteiga de Illipê, manteigade kokum, gordura de leite, gordura mowrah, manteiga phulwa-ra, gordura sal, manteiga de Shea, gordura de Borneo, banhade porco, lanolina, gordura de boi, gordura de carneiro,gordura de vela, gordura animal, óleo de canola, óleo de ri-cino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo desemente de algodão, óleo de avelã, óleo de cânhamo, óleo dejatropha, óleo de semente de linho, óleo de semente de man-ga, óleo de meadowfoam, óleo de mostarda, óleo de mocotó,óleo de oliva, óleo de palmeira, óleo de semente de palmei-ra, óleo de amendoim, óleo de semente de colza, óleo de fa-relo de arroz, óleo de açafroa, óleo de Sasanqua, manteigade Karité, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleode pinho, óleo de tsubaki, óleos vegetais, óleos marinhosque podem ser convertidos em gorduras plásticas, óleos mari-nhos que podem ser convertidos em gorduras sólidas, óleo depeixe, óleo de peixe-carvão do Pacifico, óleo de f igado debacalhau, óleo de peixe olho-de-vidro laranja, pile herd ó-leo, óleo de sardinha, óleos de baleia, óleos de arenque, 1,3-dipalmitoil-2-monooleina (POP), 1 (3) palmitoil-3(1) -estearoil-2-monooleina (POSt), 1,3-diestearoil-2-monooleina(StOSt), triglicerideo, diglicerideo, monoglicerideo, tri-glicerideo do ácido beênico, trioieina, tripalmitina, tris-tearina, óleo de palmeira, estearina de palmeira, óleo desemente de palmeira, estearina de semente de palmeira, gli-cerideos de ácidos graxos de cadeia média;(ii) óleos parcialmente hidrogenados processadosde (i);(iii) óleos totalmente hidrogenados processados de (i); ou(iv) óleos fracionados de (i).

42. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente ésteres.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que os ésteres compreendem qual-quer dos ésteres de cera, ésteres de alquila, ésteres de me-ti la, ésteres de etila, ésteres de isopropila, ésteres deoctadecila, ésteres de arila, ésteres de propileno glicol,ésteres de etileno glicol, ésteres de 1,2-propanediol ou és-teres de 1,3-propanediol.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que os ésteres são formados apartir de esterificação ou transesterificação de álcoois mo-noidroxilicos ou álcools poliidroxilicos.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois monoidroxilicos ouos álcoois poliidroxilicos são álcoois primários, secundá-rios ou terciários de compostos de cadeia anular, reta ouramificada.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois monoidroxilicoscompreendem qualquer de, álcool metilico, álcool isopoipili-co, álcool alilico, etanol, propanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol, text-butanol, n-pentanol, iso-pentanol, n-hexanol ou álcool octadecilico.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois poliidroxilicoscompreendem qualquer de glicerol, propileno glicol, etilenoglicol, 1,2-propanediol ou 1,3-propanediol.

48. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente álcoois monoidroxilicos primários, secun-dários ou terciários de compostos de cadeia anular, reta ouramificada.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois monoidroxilicoscompreendem qualquer de álcool metilico, álcool isopoipili-co, álcool alilico, etanol, propanol, n butanol, iso-butanol, sec-butanol, terc-butanol, n-pentanol, iso-pentanol, n-hexanol ou álcool octadecilico.

50. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente álcoois poliidroxilicos primários, secun-dários ou terciários de compostos de cadeia reta ou linearanular.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50,CARACTERIZADO pelo fato de que os álcoois poliidroxilicoscompreendem qualquer de glicerol, propileno glicol, etilenoglicol, 1,2-propanediol ou 1,3-propanediol.

52. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato inicial compreen-de adicionalmente um ou mais ácidos graxos.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais ácidos graxos com-preendem cadeias de carbono de cerca de 4 a cerca de 22 car-bonos de comprimento.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53,CARACTERIZADO pelo fato de que os ácidos graxos compreendemqualquer de ácido palmitico, ácido esteárico, ácido oléico,ácido linoléico, ácido linilênico, ácido araquidônico, ácidoerácico, ácido capróico, ácido caprilico, ácido cáprico áci-do láurico, ácido miristico, ácido eicosapentaenóico (EPA),ácido erácico {DHA}, ácido 5-eicossenóico, ácido butirico,ácido Y~lin°lênico ou ácido linoléico conjugado .

55. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais tipos de meio depurificação e a lipase são empacotados em uma ou mais colu-nas .

56. Método, de acordo com a reivindicação 55,CARACTERIZADO pelo fato de que as colunas são colunas enca-misadas nas quais a temperatura do substrato inicial, dosubstrato purificado, de um ou mais tipos de meio de purifi-cação, ou de lipase é regulada.

57. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato purificado é pre-parado misturando o substrato inicial com um ou mais tiposde meio de purificação em um tanque para uma reação de puri-ficação de lama em lotes ou misturando o substrato inicialem uma série de tanques para uma série de reações de purifi-cação de lama em lotes.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato purificado é se-parado a partir de um ou mais tipos de meio de purificaçãopor filtração, centrifugação, ou concentração antes de rea-gir o substrato purificado com a lipase.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende misturar adicio-nalmente o substrato purificado com a lipase em um tanquepara uma reação de lama em lotes, ou escoando o substratopurificado através de uma coluna contendo a lipase.

60. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que um leito de um ou mais tiposde meio de purificação é colocado sob um leito da lipasedentro de uma coluna.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60,CARACTERIZADO pelo fato de que a coluna é uma coluna encami-sada na qual a temperatura do substrato inicial, do substra-to purificado, de um ou mais tipos de meio de purificação,ou de lipase é regulada.

62. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que a lipase é obtido de uma li-nha celular eucariótica ou procariótica cultivada.

63. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que a lipase é um 1,3-lipase se-letiva .

64. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que a lipase não é uma lipase se-letiva .

65. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente:monitorar a atividade enzimática medindo uma oumais propriedades fisicas das gorduras ou óleos após ter en-trado em contato com a lipase; eajustar o tempo de duração para que o substratopurificado faça contato com a lipase, ou ajustar a tempera-tura do substrato inicial, do substrato purificado, de um oumais tipos de meio de purificação ou da lipase em resposta auma mudança na atividade enzimática para produzir gordurasou óleos com uma maior proporção substancialmente uniformede esterificação, interesterificação, ou transesterificaçãocom relação ao substrato inicial.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente:ajustar a quantidade e tipo de um ou mais tipos demeio de purificação em resposta a mudanças nas propriedadesfisicas das gorduras ou óleos para aumentar a produtividadeenzimatica da lipase.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66,CARACTERIZADO pelo fato de que uma ou mais propriedades f i-sicas incluem a temperatura do ponto de gotejamento Mettlerdas gorduras ou óleos.

68. Método, de acordo com a reivindicação 66,CARACTERIZADO pelo fato de que uma ou mais propriedades fi-sicas incluem o perfil do teor de gordura sólida das gordu-ras ou óleos.

69. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que as gorduras ou óleos produzi-dos são 1,3-diglicerideos.

70. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais glicerideos com-preendem parcialmente óleo de soja hidrogenado, óleo de mi-lho parcialmente hidrogenado, óleo de semente de algodãoparcialmente hidrogenado, óleo de soja totalmente hidrogena-do, óleo de milho totalmente hidrogenado, ou óleo de sementede algodão totalmente hidrogenado.

71. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais glicerideos com-preendem óleo de palmeira parcialmente hidrogenado, óleo desemente de palmeira parcialmente hidrogenado, óleo de pal-meira totalmente hidrogenado, óleo de semente de palmeiratotalmente hidrogenado, óleo de palmeira fracionado, óleo desemente de palmeira fracionado, óleo de palmeira parcialmen-te hidrogenado fracionado, ou óleo de semente de palmeiraparcialmente hidrogenado fracionado.

72. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais aminoácidos com-preendem qualquer de arginina, lisina, histidina ou cisteina.

73. Método para produzir gorduras ou óleos,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:colocar um substrato inicial compreendendo um oumais glicerideos em contato com um ou mais tipos de meio depurificação para gerar um substrato purificado; ecolocar o substrato purificado em contato com li-pase para efetuar esterificação, interesterificação ou tran-sesterificação, criando as gorduras ou óleos;em que um ou mais peptideos ou polipeptideos sãorevestidos em um ou mais tipos de meio de purificação.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73,CARACTERIZADO pelo fato de que a meia-vida da atividade en-zimática da lipase é cerca de 2,5 vezes maior que a meia-vida da atividade enzimática resultante do contato com a li-pase com o substrato inicial.

75. Método para produzir gorduras ou óleos,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:colocar um substrato inicial compreendendo um oumais glicerideos em contato com uma ou mais proteínas paragerar um substrato purificado; ecolocar o substrato purificado em contato com li-pase para efetuar esterificação, interesterificação ou tran-sesterificação, criando as gorduras ou óleos.

76. Método, de acordo com a reivindicação 7 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a meia-vida da atividade en-zimática da lipase é cerca de 2,5 vezes maior que a meia-vida da atividade enzimatica resultante do contato com a li-pase com o substrato inicial.

77. Método para produzir gorduras ou óleos,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:colocar um substrato inicial compreendendo um oumais glicerideos em contato com um ou mais tipos de proteinatexturizada para gerar um substrato purificado; ecolocar o substrato purificado em contato com li-pase para efetuar esterificação, interesterificação ou tran-sesterificação, criando as gorduras ou óleos.