BRPI0607107A2 - método para produzir uma planta superior tendo citocromo c6 no espaço tilacóide de cloroplasto, métodos para promover o crescimento de uma planta superior, a sìntese de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo do atp, nadph, amido, e proteìna de uma planta superior, e fixação de carbono por uma planta superior, proteìna de fusão, gene, vetor recombinante, transformante, e, planta superior transgênica - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA SUPERIOR TENDO CITOCROMO C~ 6~ NO ESPAçO TILACóIDE DE CLOROPLASTO, MéTODOS PARA PROMOVER O CRESCIMENTO DE UMA PLANTA SUPERIOR, A SìNTESE DE PELO MENOS UM SELECIONADO A PARTIR DO GRUPO CONSISTINDO DO ATP, NADPH, AMIDO, E PROTEìNA DE UMA PLANTA SUPERIOR, E FIXAçãO DE CARBONO POR UMA PLANTA SUPERIOR, PROTEìNA DE FUSãO, GENE, VETOR RECOMBINANTE, TRANSFORMANTE, E, PLANTA SUPERIOR TRANSGêNICA. A presente invenção fornece um método para produzir uma planta superior tendo citoeromo c6 no espaço tilacóide de cloroplasto, que é caracterizado por compreender introduzir um gene codificando uma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinal consistindo de 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo c6 no genoma de uma planta superior.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA SUPERIOR TENDOCITOCROMO C6 NO ESPAÇO TILACÓIDE DE CLOROPLASTO, MÉTODOSPARA PROMOVER O CRESCIMENTO DE UMA PLANTA SUPERIOR, ASÍNTESE DE PELO MENOS UM SELECIONADO A PARTIR DO GRUPOCONSISTINDO DO ATP, NADPH, AMIDO, E PROTEÍNA DE UMA PLANTASUPERIOR, E FIXAÇÃO DE CARBONO POR UMA PLANTA SUPERIOR,PROTEÍNA DE FUSÃO, GENE, VETOR RECOMBINANTE,TRANSFORMANTE, E, PLANTA SUPERIOR TRANSGÊNICA"CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere a um método para produzir umanova planta superior tendo citocromo c6 no espaço tilacóide de cloroplasto, eum método para promover o crescimento de uma planta superior permitindocitocromo no espaço tilacóide de cloroplasto mencionado acima ou ummétodo para promover a capacidade de uma planta superior para fixarcarbono.

ARTE ANTERIOR

Como uma técnica de promover o crescimento de uma assimchamada planta superior tal como uma planta terrestre, uma reaçãofotossintética escura (ciclo de Calvin-Benson), que envolve o realçamento daatividade de enzima tal como ribulosebisfosfato carboxilase, foi previamenterelatada. Especificamente, uma técnica de aumentar folhas introduzindo umgene de enzima relacionada em uma tal planta superior foi relatada (Shigeokaet al., Nature biotechnology, 19, 965-969 (2001)). Entretanto, foiextremamente difícil aplicar tais técnicas a vários tipos de plantas superiores.

Citocromo Ce é uma proteína de transferência de elétron emuma reação fotossintética clara, e em geral, ele existe apenas em vários tiposde algas (algas azul-verdes, etc). Foi conhecido que citocromo c6 temexcelente capacidade de transferência de elétron (isto é, seu potencial deoxidação-redução é alto) (Figura 1). Assim, foi fortemente desejado que sejadesenvolvida uma técnica de propósito geral de permitir que citocromo c6 sejaexpresso e funcione no cloroplasto (mais em detalhe, no espaço tilacóide) devários tipos de plantas superiores, de forma a melhorar capacidadefotossintética.

A propósito, exemplos de uma técnica de permitir quecitocromo c6 seja expresso em uma célula incluem aqueles descritos empublicações tal como F. P. Molina-Heredia et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 243, 302-306(1998); T. Satoh et al, FEBS lett, 531, 543-547(2002); R. Gupta et al, Nature, 417, 567-571(2002); e D. R. Hickey et al,Gene, 105, 73-81(1991). Entretanto, em todas estas técnicas, célulashospedeiras não foram aquelas de plantas superiores, e células de Escherichiacoli, levedura, ou algas azul-verdes, foram usadas apenas para propósitossimples, tal como produção em massa do citocromo mencionado acima oude uma proteína associada com este, ou a análise de função destes. Por isso,tais técnicas foram incluídas no método de expressão gênica, que foicomumente realizado por pessoas versadas na arte.

Não existem relatos considerando que citocromo c6 épermitido para funcionar como um carreador de elétron em uma reaçãofotossintética clara em plantas superiores, em outras palavras, considerandoque citocromo c6 é permitido existir com sucesso no espaço tilacóide docloroplasto de uma célula de planta superior. Assim, uma tal técnica foiconsiderada extremamente difícil.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

É um objeto da presente invenção fornecer um método paraproduzir uma nova planta superior tendo citocromo no espaço tilacóide decloroplasto, e eventualmente, fornecer um método para promover ocrescimento de uma planta superior, um método para promover a síntese depelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo de ATP, NADPH,um amido e uma proteína, e um método para promover fixação de carbono.O presente inventor conduziu estudos intensivos direcionadospara atingir o objeto mencionado acima. Como um resultado, o inventorencontrou que se um gene de proteína citocromo c6, ao qual um peptídeo sinalespecífico foi adicionado, é introduzido no DNA genômico de uma plantasuperior de forma a permitir que o gene seja expresso nessa, se torna possíveltransferir citocromo Ce para (permite que citocromo passe através) oenvelope de cloroplasto e membrana de tilacoide da planta superior acima, oque foi convencionalmente considerado impossível, com isso completando apresente invenção.

Isto quer dizer que, a presente invenção tem as seguintescaracterísticas (l)a(15).

(1) Um método para produzir uma planta superior tendocitocromo c$ no espaço tilacoide de cloroplasto, que é caracterizado porcompreender introduzir um gene codificando uma proteína de fusãoadicionando um peptídeo sinal consistindo de 50 a 80 resíduos deaminoácidos a uma proteína citocromo Ce no genoma de uma planta superior.

(2) Um método para promover o crescimento de uma plantasuperior, que é caracterizado por compreender introduzir um gene codificandouma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinal consistindo de 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo Ce no genoma de umaplanta superior, de forma a permitir que o gene seja expresso nessa, epermitindo que citocromo Ce exista no espaço tilacoide de cloroplasto.

(3) Um método para promover a síntese de pelo menos umselecionado a partir do grupo consistindo do ATP, NADPH, amido, e proteínade uma planta superior, que é caracterizado por compreender introduzir umgene codificando uma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinalconsistindo de 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo c6no genoma de uma planta superior, de forma a permitir que o gene sejaexpresso nessa, e permitindo que citocromo c§ exista no espaço tilacoide decloroplasto.

(4) Um método para promover fixação de carbono por umaplanta superior, que é caracterizado por compreender introduzir um genecodificando uma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinal consistindode 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo c6 no genomade uma planta superior, de forma a permitir que o gene seja expresso nessa, epermitindo que citocromo Ce exista no espaço tilacóide de cloroplasto.

No método de acordo com qualquer um de (1) a (4) acima, aproteína de fusão descrita acima pode ser a proteína descrita nos seguintes (a),(b), (c), ou (d):

(a) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO: 2;

(b) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo ao peptídeo sinal descrito acima na seqüência de aminoácidoscomo mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade de passar através doenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de uma planta superior;

(c) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo à proteína citocromo descrita acima na seqüência deaminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade detransferir elétrons; e

(d) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a cada uma de uma porção de seqüência deaminoácidos correspondendo ao peptídeo sinal descrito acima e uma porçãode seqüência de aminoácidos correspondendo à proteína citocromo descritaacima na seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e quetem capacidade de passar através do envelope de cloroplasto e membrana detilacóide de uma planta superior e capacidade de transferir elétrons.

Em adição, no método de acordo com qualquer um de (1) a (4) acima, o gene descrito acima pode ser um gene compreendendo o DNAdescrito nos seguintes (a) ou (b):

(a) DNA tendo a seqüência de nucleotídeos como mostrado emSEQ ID NO: 1; e

(b) DNA, que hibridiza com DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos complementar ao DNA tendo a seqüência de nucleotídeos comomostrado em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, e que codifica umaproteína tendo capacidade de passar através do envelope de cloroplasto emembrana de tilacóide de uma planta superior e capacidade de transferirelétrons.

(5) Uma proteína de fusão, que é formada adicionando umpeptídeo sinal consistindo de 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteínacitocromo c^.

A proteína de fusão de acordo com (5) acima pode ser aproteína descrita nos seguintes (a), (b), (c), ou (d):

(a) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO: 2;

(b) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidos correspondendo ao peptídeo sinal descrito acima na seqüência de aminoácidoscomo mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade de passar através doenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de uma planta superior;

(c) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo à proteína citocromo c6 descrita acima na seqüência deaminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade detransferir elétrons; e

(d) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a cada uma de uma porção de seqüência deaminoácidos correspondendo ao peptídeo sinal descrito acima e uma porçãode seqüência de aminoácidos correspondendo à proteína citocromo c6 descritaacima na seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e quetem capacidade de passar através do envelope de cloroplasto e membrana detilacóide de uma planta superior e capacidade de transferir elétrons.

(6) Um gene, que codifica a proteína de fusão de acordo com (5) acima.

(7) Um gene, que compreende o DNA descrito nos seguintes (a) ou(b):

(a) DNA tendo a seqüência de nucleotídeos como mostrado emSEQ IDNO: 1; e

(b) DNA, que hibridiza com DNA tendo uma seqüência denucleotídeos complementar ao DNA tendo a seqüência de nucleotídeos comomostrado em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, e que codifica umaproteína tendo capacidade de passar através do envelope de cloroplasto emembrana de tilacóide de uma planta superior e capacidade de transferirelétrons.

(8) Um vetor recombinante, que compreende o gene de acordocom (6) ou (7) acima.

(9) Um transformante, que é obtido introduzindo o vetorrecombinante de acordo com (8) acima em um hospedeiro.

O transformante de acordo com (9) acima pode ser umtransformante caracterizado pelo fato de que o hospedeiro é ummicroorganismo pertencendo ao gênero Agrobacterium.

(10) Uma planta superior transgênica, que é obtidaintroduzindo o gene de acordo com (6) ou (7) acima no genoma de plantadesta.

A planta superior transgênica de acordo com (10) acimapreferivelmente tem citocromo c6 no espaço tilacóide de cloroplasto em umacélula vegetal desta.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Figura 1 é uma perspectiva mostrando o sistema de transportede elétron em fotossíntese de uma membrana de tilacóide de cloroplasto.

Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando introdução deum gene de citocromo c6 em uma planta através de Agrobacterium e amaneira de expressão de citocromo c6 na planta na presente invenção.

Figura 3 é uma perspectiva mostrando uma diferença nosistema de transferência de elétron entre cianobactérias e algas, e plantassuperiores.

Figura 4 é uma perspectiva mostrando a seqüência denucleotídeos do cDNA de citocromo c$ de Porphyra yezoensis e umaseqüência de aminoácidos putativa.

Figura 5 é uma perspectiva mostrando os resultados obtidosamplificando a região de proteína madura de um gene de citocromo c6 dePorphyra yezoensis por PCR.

Figura 6 é uma perspectiva mostrando um vetor pBluescript IISK+/- usado em construção de um gene de citocromo c6 a ser introduzido emplantas.

Figura 7 é uma perspectiva mostrando a seqüência denucleotídeos de um gene que é formado fusionando um peptídeo sinal deplastocianina derivado de Arabidopsis thaliana com uma região de proteínamadura de citocromo c6 derivado de Porphyra yezoensis, e uma seqüência deaminoácidos putativa.

Figura 8 é um diagrama esquemático mostrando um método detransformar Agrobacterium tumefaciens por conjugação triparental.

Figura 9 é uma perspectiva mostrando os resultados obtidosrealizando eletroforese em um gene de citocromo c6 introduzido em umaplanta, que foi especificado por PCR. (A) mostra os resultados obtidos usandoDNA genômico como um modelo, e (B) mostra os resultados obtidos usandoRNA total como um modelo.

Figura 10 é uma perspectiva mostrando os resultados obtidosespecificando por eletroforese citocromo Ce que foi permitido ser expresso emuma planta. (A) mostra os resultados obtidos por coloração CBB, e (B) mostraos resultados de Western blotting, caracterizado pelo fato de que citocromo c6foi permitido para reagir com um anticorpo de citocromo c6.

Figura 11 é uma perspectiva mostrando uma mudança naaltura de um tipo selvagem (o) e na altura de A. thaliana transgênica (•), quefoi observada com o curso de dias de crescimento. Cada valor no gráficoindica média ± S.D. (desvio padrão) (n = 20). O asterisco (*) indica um valortendo uma diferença significante em nível de significância de 5%.

Figura 12 é uma perspectiva mostrando uma mudança nocomprimento de raiz de um tipo selvagem (o) e no comprimento de raiz de A.thaliana transgênica (•), que foi observada com o curso de dias decrescimento. Cada valor no gráfico indica média ± S.D. (desvio padrão) (n =20). O asterisco (*) indica um valor tendo uma diferença significante em nível de significância de 5%.

Figura 13 é uma perspectiva mostrando uma mudança notamanho de folha de um tipo selvagem (o) e no tamanho de folha de A.thaliana transgênica (•), que foi observada com o curso de dias decrescimento. Cada valor no gráfico indica média ± S.D. (desvio padrão) (n =20). O asterisco (*) indica um valor tendo uma diferença significante em nívelde significância de 5%.

Figura 14 é uma perspectiva mostrando uma mudança no teorde clorofila de um tipo selvagem e no teor de clorofila de A. thalianatransgênica, obtido 3 horas depois de irradiação luminosa, que foi observadacom o curso de dias de crescimento. Cada valor no gráfico indica média ±S.D. (desvio padrão) (n = 8). O asterisco (*) indica um valor tendo umadiferença significante em nível de significância de 5%.

Figura 15 é uma perspectiva mostrando uma mudança no teorde ATP de um tipo selvagem e no teor de ATP de A. thaliana transgênica,obtida 3 horas depois de irradiação luminosa, que foi observada com o cursode dias de crescimento. Cada valor no gráfico indica média ± S.D. (desviopadrão) (n = 8). O asterisco (*) indica um valor tendo uma diferençasignificante em nível de significância de 5%.

Figura 16 é uma perspectiva mostrando uma mudança no teorde NADPH de um tipo selvagem e no teor de NADPH de A. thalianatransgênica, obtida 3 horas depois de irradiação luminosa, que foi observadacom o curso de dias de crescimento. Cada valor no gráfico indica média ±S.D. (desvio padrão) (n = 8). O asterisco (*) indica um valor tendo umadiferença significante em nível de significância de 5%.

Figura 17 é uma perspectiva mostrando uma mudança nacapacidade de assimilar dióxido de carbono de um tipo selvagem e nacapacidade de assimilar dióxido de carbono de A. thaliana transgênica, obtida3 horas depois de irradiação luminosa, que foi observada com o curso de diasde crescimento. Cada valor no gráfico indica média ± S.D. (desvio padrão) (n= 10). O asterisco (*) indica um valor tendo uma diferença significante emnível de significância de 5%.

Figura 18 é uma perspectiva mostrando uma mudança naquantidade de amido contida em um tipo selvagem e na quantidade de amidocontida em A. thaliana transgênica, obtida 3 horas depois de irradiaçãoluminosa, que foi observada com o curso de dias de crescimento. Cada valorno gráfico indica média ± S.D. (desvio padrão) (n = 10). O asterisco (*) indicaum valor tendo uma diferença significante em nível de significância de 5%.

Figura 19 é uma perspectiva mostrando uma mudança naquantidade de proteína contida em um tipo selvagem e na quantidade deproteína contida em A. thaliana transgênica, obtida 3 horas depois deirradiação luminosa, que foi observada com o curso de dias de crescimento.Cada valor no gráfico indica média ± S.D. (desvio padrão) (n = 8). O asterisco(*) indica um valor tendo uma diferença significante em nível de significânciade 5%.

MELHOR MANEIRA DE REALIZAR A INVENÇÃO

A presente invenção será descrita em detalhe abaixo.Entretanto, as descrições seguintes não são pretendidas para limitar o escopoda presente invenção. Mesmo exceto para os exemplos seguintes, mudanças emodificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção.

O presente relatório inclui todos os teores como descritos norelatório e/ou ilustrações de Pedido de Patente Japonesa No. 2005-27012, queé um documento prioritário do presente pedido. Em adição, todas aspublicações da arte, publicações de patente, pedidos de patente, e outrosdocumentos de patente anteriores citados neste lugar são incorporados nestelugar por referência em sua totalidade.

1. Sumário da presente invenção

A presente invenção se refere a um método para promover ocrescimento de uma planta superior, que compreende introduzir um genecodificando uma proteína de fusão consistindo de citocromo c6 e um peptídeosinal em uma planta superior, de forma a permitir que citocromo c$ atue comoum carreador de elétron em uma reação fotossintética clara para expressar efuncionar no espaço tilacóide de cloroplasto de uma tal célula de plantasuperior (Figura 2). Pela presente invenção, a síntese de ATP, NADPH,amido, e proteína são promovidas em uma célula de planta superior, e umareação fotossintética escura (reação de fixação de carbono) de converterdióxido de carbono (C02) para carboidrato pode ser com isso promovida. Apresente invenção inclui um tal método para promover a síntese de ATP oufixação de carbono em uma planta superior, e também inclui um método paraproduzir uma planta superior, que envolve promoção do crescimento desta,promoção da síntese de ATP ou os semelhantes, e promoção de fixação decarbono.

Em geral, em uma reação fotossintética clara (reaçãofotossintética de transferência de elétron), elétrons de clorofila adquiremenergia de luz solar, e eles movem um ao outro através de uma cadeia detransporte de elétron no espaço tilacóide (na membrana de tilacóide). Nestemomento, clorofila adquire elétrons de água e libera oxigênio (02). Nomesmo momento, com tal reação de transferência de elétron, H+ é bombeadopara for a da membrana de tilacóide, e ATP é sintetizado no estroma decloroplasto devido ao potencial elétrico da membrana assim gerado. Depoisdisso, no estágio final de uma série de reações, NADP+ aceita elétrons de altaenergia (assim como H+), de forma que NADPH pode ser sintetizado.

Em contraste, em uma reação fotossintética escura (reação defixação de carbono), ATP e NADPH, que foram sintetizados por uma reaçãofotossintética clara, funcionam como uma fonte de energia e um poderredutor, respectivamente. Como um resultado, C02 é convertido emcarboidrato em estroma de cloroplasto e citoplasto. Por esta reação de fixaçãode carbono, sucrose é sintetizada em folhas de plantas e os semelhantes.Sucrose é transportada para outros tecidos, e ela é usada como um materialsintético para várias moléculas orgânicas, e em particular, ela é usada comouma fonte de energia para o crescimento da planta por si só.

Em geral, um carreador de elétron em uma reaçãofotossintética clara em uma planta superior (uma proteína carreadora deelétron) é considerado sendo plastocianina (PC). Entretanto, foi conhecidoque citocromo c6 atuando como um carreador de elétron em algas é superior aplastocianina (PC) em termos de capacidade de transferir elétrons (altopotencial de oxidação-redução) (Figura 3). Assim, várias tentativas forampreviamente feitas para permitir que tal citocromo expresse e funcione emuma planta superior, como também para promover uma reação fotossintéticaclara e uma reação fotossintética escura. Entretanto, o fato é que, tem sidoextremamente difícil realizar tais tentativas com sucesso. De fato, não houveram exemplos bem sucedidos até o momento.

A fim de que uma proteína que foi permitida expressar emuma célula de uma planta superior baseado na informação de genoma destaexiba uma função como um carreador de elétron em uma reação fotossintéticaclara, é essencial para a proteína existir no espaço tilacóide desta. A fim deque a proteína exista no espaço tilacóide, em geral, ela deve passar através dedois tipos de membranas, um "envelope de cloroplasto" e uma "membrana detilacóide." Este ponto foi considerado como sendo uma causa principal paraextrema dificuldade em expressão da função de citocromo c6 em uma plantasuperior. Por isso, quando um gene de citocromo Ce foi introduzido nogenoma de uma planta superior através de recombinação genética, o presenteinventor havia construído previamente um gene adicionado com seqüênciasinal, de forma que a proteína citocromo c6 pode ser expressa na forma deuma proteína de fusão obtida adicionando um peptídeo sinal específico (umpeptídeo sinal tendo um comprimento específico ou uma seqüência deaminoácidos específica) à proteína citocromo c6 acima. Depois disso, oinventor introduziu o gene na planta superior. Como um resultado, a presençada proteína citocromo Ce (sem o peptídeo sinal) foi observada no espaçotilacóide de um corpo vegetal produzido pela introdução de gene acima.Assim, foi demonstrado que a proteína de fusão expressa é capaz de passaratravés dos dois tipos de membranas mencionados acima devido à ação dopeptídeo sinal desta, com isso completando a presente invenção.

(1) Estudos considerando sistema de introdução de gene PYC6

Até o momento, foi conhecido que o potencial de oxidação-redução de PYC6 é alto. Em adição, a seqüência genética de PYC6 foiclarificada. Na presente invenção, o gene PYC6 foi primeiro ligado a umvetor binário, de forma a preparar Agrobacterium usada em transformação.Arabidopsis thaliana foi disseminada e foi então sujeita a um tratamento debaixa temperatura. Depois disso, ela foi permitida crescer sob condições dedia longo. No estágio de formação de botões florais, Arabidopsis thaliana foitransformada por infiltração sob pressão reduzida. Subseqüentemente, a fimde analisar introdução e expressão gênica no transformante obtido, usandoDNA genômico e RNA extraído do corpo vegetal como modelos, PCR e RT-PCR foram realizados, respectivamente. Como um resultado, amplificação dogene PYC6 foi observada, e ela foi confirmada usando um seqüenciador deDNA cuja seqüência de nucleotídeos deste é a mesma que aquela do genePYC6. Subseqüentemente, a fim de confirmar expressão do gene PYC6observada no transformante como uma proteína, uma fração protéica decloroplasto foi extraída do corpo vegetal, e ela foi então eletroforesada,seguido pela realização de Western blotting. Como um resultado, expressãoda proteína PYC6 foi confirmada. Em adição, a seqüência de aminoácidos N-terminal da proteína PYC6 no transformante obtido foi analisada. Como umresultado, foi encontrado que a seqüência de aminoácidos N-terminal obtidafoi idêntica à seqüência de aminoácidos do PYC6 introduzido (No. de acessoPIR JC5849). A partir destes resultados, foi encontrado que cyt c6 (PYC6)derivado de algas foi permitido com sucesso expressar em A. thaliana que foiuma planta superior.

(2) Influência de introdução de PYC6 em corpo vegetal

O crescimento de uma planta introduzida com PYC6 foiobservado. Como um resultado, como mostrado nos exemplos como dadosdepois, o tamanho de uma folha desta foi aproximadamente 1,2 a 1,3 vezesmaior do que aquele de um tipo selvagem (WT), e a altura desta foiaproximadamente 1,5 vezes maior do que aquela do tipo selvagem (WT). Noestágio de crescimento inicial, a planta introduzida com PYC6 teve uma taxade crescimento que foi maior do que aquela de WT. Além disso, como umresultado da mensuração da quantidade de clorofila contida na plantaintroduzida com PYC6, foi encontrado que a quantidade de clorofila contidana planta introduzida com PYC6 foi aproximadamente 1,1 a 1,2 vezes maior do que aquela de WT. É considerado que um tal fenômeno ocorrido no corpovegetal como um resultado da introdução de PYC6 foi ocasionado como umresultado de ativação da reação fotossintética inteira usando uma substânciaenergética como um produto final de uma reação clara. Assim, a quantidadede ATP contida na planta introduzida com PYC6 foi medida pelo método deluciferina-luciferase. Como um resultado, foi encontrado que a quantidade deATP contida na planta introduzida com PYC6 foi aproximadamente 1,7 vezesmaior do que aquela de WT. Foi considerado que isto se deu porquetransferência de elétron em uma reação clara foi ativada por cyt c6 de P.yezoensis que funcionou como um novo carreador de elétrons, assim comoplastocianina que funcionou em A. thaliana, e a quantidade de ATP como umproduto final foi com isso aumentada, e o crescimento da planta como umtodo foi também com isso ativado.

Quando a proteína de fusão acima passa através dos dois tiposde membranas mencionados acima, uma parte de um peptídeo sinal é usada quando a proteína passa através da primeira membrana (envelope decloroplasto), e a parte remanescente é usada quando ela passa através dasegunda membrana (membrana de tilacóide). Cada uma das duas partes foidissociada da proteína depois de uso, e finalmente, a proteína acima étransferida para o espaço tilacóide na forma de não ter um tal peptídeo sinal.É considerado que a proteína PYC6 assim transferida se liga a heme (heme c)no espaço tilacóide, seguido por enovelamento, de forma que ela se tornacitocromo c6 que é capaz de funcionar como um carreador de elétron.

2. Método para produzir nova planta superior

Como descrito acima, o método de produção da presenteinvenção é um método para produzir uma nova planta superior tendocitocromo no espaço tilacóide de cloroplasto, que é caracterizado porcompreender introduzir um gene codificando uma proteína de fusãoadicionando um peptídeo sinal consistindo de 50 a 80 resíduos deaminoácidos a uma proteína citocromo c$ no genoma de uma planta superior.(1) Planta superior a ser produzida

O tipo de uma planta superior que pode ser usado no métodode produção da presente invenção, em outras palavras, o tipo de uma plantasuperior que pode ser transformado de forma que ele tenha citocromo noespaço tilacóide de cloroplasto, não é limitado. Por exemplo, as seguintesplantas podem ser usadas.

A planta usada na presente invenção inclui todas de um corpovegetal como um todo, um órgão vegetal (por exemplo, uma folha, umapétala, um pedicelo, uma raiz, uma semente, etc), um tecido vegetal (porexemplo, epiderme, floema, parênquima, xilema, feixe vascular, tecidopaliçádico, tecido esponjoso, etc), e uma célula vegetal cultivada (incluindotecidos cultivados tal como calo). Plantas usadas em transformação incluemplantas C3, C4 e CAM, e todas as suas plantas intermediárias. Exemplos deuma tal planta incluem plantas pertencendo a Brassicaceae, Solanaceae,Gramineae, Leguminosae, Chenopodiaceae, Rosaceae, Asteraceae, Liliaceae,Caryophyllaceae, Cucurbitaceae, Convolvulaceae, Amaranthaceae,Bromeliaceae, Cactaceae, e Aloeaceae (incluindo frutas, hortaliças, flores eplantas ornamentais, e os semelhantes) (veja abaixo). Entretanto, exemplosnão são limitados a estes.[plantas C3]

• Brassicaceae: Arabidopsis thaliana, Raphanus, etc.

• Solanaceae: Nicotiana tabacum, Solanum, etc.

• Gramineae: Oryza sativa, Zea mays, Triticun, etc.

• Leguminosae: Glycine max, Pisum, etc.

• Chenopodiaceae: Spinacia, etc.

• Rosaceae: Prunus, Rosa, etc.

• Asteraceae: Erigeron, Taraxacun, etc.

• Cucurbitaceae: Cucurdida, Cucumis, etc.

• Convolvulaceae: Ipomea, etc.

• Orchidaceae: Poneorchis, etc.

[plantas C4]

• Gramineae: Zea mays, Saccharum officinarum, Setariaitarica, etc.

• Amaranthaceae: Amaranthaceae, etc.[plantas CAM]

• Bromeliaceae: Ananas comosus, etc.

• Cactaceae: Lophophora difusa, Opuntia spp., etc.

• Aloeaceae: Aloe arborescens, Aloe vera, etc.[plantas intermediárias C3-C4]

• Aizoaceae: Mollugo verticillata, etc.

• Gramineae: Panicum milioides, etc.

Entre outros, como um efeito do método de produção dapresente invenção, se levando em consideração a realização de uma plantatendo um grande efeito de promoção de crescimento, plantas altamentecomerciáveis são vantajosas para a presente invenção. Especificamente,exemplos preferidos de uma tal planta altamente comerciável incluem plantasde folhagem (espinafre, repolho, etc), plantas de flores (rosa, phalaenopsis,etc), plantas de pedicelo (batata, raiz de lótus, etc), plantas de raiz (bardana,rabanete japonês, etc), grãos (arroz, trigo, etc), frutas (abacaxi, uva, etc),plantas ornamentais (Pinus, bordo, etc), e madeira (Cryptomeria japonica,Chamaecyparis obtuse, etc).

(2) Proteína de fusão

É importante para o método de produção da presente invençãointroduzir um gene codificando uma proteína de fusão específica no genomade uma planta superior, ou usar uma proteína de fusão formada adicionandoum peptídeo sinal tendo um certo comprimento a uma proteína citocromo c6.

É importante que a proteína de fusão acima tenha um peptídeosinal tendo um comprimento de 50 a 80 resíduos de aminoácidos. Assim, aproteína de fusão tem um peptídeo sinal tendo um comprimento suficiente, deforma que ele faz a proteína citocromo c6 passar através tanto do envelope decloroplasto como da membrana de tilacóide. A seqüência de um tal peptídeosinal pode ser determinada por clonagem de gene através de plantassuperiores.

Em geral, o peptídeo sinal na proteína de fusão acima épreferivelmente adicionado ao término N da proteína citocromo c6.

Na presente invenção, a proteína de fusão acima épreferivelmente a proteína descrita nos seguintes (a), (b), (c), ou (d), porexemplo:

(a) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO: 2;

(b) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo ao peptídeo sinal descrito acima na seqüência de aminoácidoscomo mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade de passar através doenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de uma planta superior;

(c) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo à proteína citocromo c6 descrita acima na seqüência deaminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade detransferir elétrons; e

(d) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a cada uma de uma porção de seqüência deaminoácidos correspondendo ao peptídeo sinal descrito acima e uma porçãode seqüência de aminoácidos correspondendo à proteína citocromo c6 descritaacima na seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e quetem capacidade de passar através do envelope de cloroplasto e membrana detilacóide de uma planta superior e capacidade de transferir elétrons.

Como mostrado em SEQ ID NO: 2, a proteína descrita em (a)acima consiste de 157 aminoácidos totais, e ela é formada adicionando umaseqüência de peptídeo sinal consistindo de 72 aminoácidos (SEQ ID NO: 4)ao lado N-terminal de uma seqüência de proteína citocromo c6 consistindo de85 aminoácidos (SEQ ID NO: 6). Ela também pode ser uma proteína de fusãotendo a seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2.

Entretanto, um tal peptídeo sinal não é limitado ao peptídeo sinal acima tendo72 aminoácidos. A origem da proteína citocromo c6 não é particularmentelimitada neste lugar, e Porphyra yezoensis, algas azul-verdes, algas marrons,Bacillariophyta, Chlorophyceae, e os semelhantes podem ser usados. Aproteína citocromo c6 usada neste lugar é preferivelmente derivada de P.yezoensis. A seqüência de aminoácidos da proteína citocromo c6 derivada deP. yezoensis foi conhecida (No. de acesso PIR JC5849). Ela pode ser obtidapor busca em banco de dados.

O tipo da proteína descrita em (b) acima não é limitado,contanto que ela tenha uma seqüência de aminoácidos compreendendo umadeleção, substituição, ou adição de um ou diversos aminoácidos (por exemploaproximadamente 1 a 10 aminoácidos, e preferivelmente aproximadamente 1a 5 aminoácidos) com respeito à porção de seqüência de aminoácidosconsistindo de 72 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) correspondendo ao peptídeosinal descrito acima na seqüência de aminoácidos total que constitui aproteína descrita em (a) acima, e que tem capacidade de passar através doenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de uma planta superior.

É importante para a proteína descrita em (b) acima tercapacidade de passar através do envelope de cloroplasto e membrana detilacóide de uma planta superior, como com a proteína descrita em (a) acima.Por conseguinte, é preferível que uma porção de seqüência de aminoácidosque é considerada como sendo importante para passar através do envelope decloroplasto ou membrana de tilacóide acima, tal como aminoácidos deposição 53 a posição 72, não seja mutada ou substituída a partir da seqüênciade aminoácidos da proteína descrita em (a) acima.

O tipo da proteína descrita em (c) acima não é limitado,contanto que ela tenha uma seqüência de aminoácidos compreendendo umadeleção, substituição, ou adição de um ou diversos aminoácidos (por exemploaproximadamente 1 a 10 aminoácidos, e preferivelmente aproximadamente 1a 5 aminoácidos) com respeito à porção de seqüência de aminoácidosconsistindo de 85 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) correspondendo à proteínacitocromo c6 descrita acima na seqüência de aminoácidos total que constitui aproteína descrita em (a) acima, e que tem capacidade de transferir elétrons(em uma reação fotossintética clara).

Neste lugar, o termo acima "proteína tendo capacidade detransferir elétrons" é usado na presente invenção para significar uma proteínatendo uma porção de seqüência de aminoácidos obtida eliminando umaporção de seqüência de aminoácidos correspondendo ao peptídeo sinaldescrito acima da seqüência de aminoácidos total que constitui a proteínadescrita em (c) acima, caracterizado pelo fato de que a proteína descrita acimatem capacidade de transferir elétrons depois dela ter se ligado à heme (hemec).

Como no caso da proteína citocromo c$, é importante para aproteína descrita em (c) acima ter capacidade de transferir elétrons. Porconseguinte, é preferível que uma porção de seqüência de aminoacidos que éconsiderada como sendo importante para funcionar como um carreador deelétron na reação fotossintética clara de uma planta superior, tal comoaminoacidos de posição 14 a posição 18 e aminoacidos de posição 47 a 60,não seja mutada ou substituída a partir da seqüência de aminoacidos daproteína descrita em (a) acima.

O tipo da proteína descrita em (d) acima não é limitado,contanto que ela tenha uma seqüência de aminoacidos compreendendo umadeleção, substituição, ou adição de um ou diversos aminoacidos (por exemploaproximadamente 1 a 10 aminoacidos, e preferivelmente aproximadamente 1a 5 aminoacidos) com respeito à porção de seqüência de aminoacidosconsistindo de 72 aminoacidos correspondendo ao peptídeo sinal descritoacima (SEQ ID NO: 4) e também tenha uma seqüência de aminoacidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoacidos (por exemplo aproximadamente 1 a 10 aminoacidos, epreferivelmente aproximadamente 1 a 5 aminoacidos) com respeito à porçãode seqüência de aminoacidos consistindo de 85 aminoacidos correspondendoà proteína citocromo Cg descrita acima (SEQ ID NO: 6), na seqüência deaminoacidos total que constitui a proteína descrita em (a) acima, e que tenhacapacidade de passar através do envelope de cloroplasto e membrana detilacóide de uma planta superior e capacidade de transferir elétrons (em umareação fotossintética clara).

Neste lugar, o termo acima "proteína tendo capacidade detransferir elétrons" tem o mesmo significado que aquele no caso da proteínadescrita em (c) acima.

É importante para a proteína descrita em (d) acima tercapacidade de passar através do envelope de cloroplasto e membrana detilacoide de uma planta superior como com a proteína descrita em (a) acima, etambém ter capacidade de transferir elétrons como com a proteína citocromoc6. Por conseguinte, é preferível que uma porção de seqüência de aminoácidosque é considerada como sendo importante para passar através do envelope decloroplasto ou membrana de tilacoide acima, tal como aminoácidos deposição 53 a posição 72, ou uma porção de seqüência de aminoácidos que éconsiderada como sendo importante para funcionar como um carreador deelétron na reação fotossintética clara de uma planta superior, tal comoaminoácidos de posição 14 a posição 18 e aminoácidos de posição 47 a 60,não seja mutada ou substituída a partir da seqüência de aminoácidos daproteína descrita em (a) acima.

A presença ou ausência da capacidade de transferir elétronsdas proteínas descritas em (c) e (d) acima, ou tal capacidade de transferirelétrons se as proteínas acima têm tal capacidade, pode ser confirmada oumedida por análise de estrutura tridimensional e a mensuração de potencial deoxidação-redução. É para ser observado que o potencial de oxidação-reduçãode citocromo c6 é entre aproximadamente 350 e 370 mV.

Um polinucleotídeo codificando uma seqüência deaminoácidos compreendendo uma deleção, inserção, ou adição de um oudiversos aminoácidos com respeito à seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO: 2 pode ser preparado de acordo com métodos talcomo mutagênese sítio dirigida descrita em "Molecular Cloning, ALaboratory Manual 2nd ed." (Cold Spring Harbor Press (1989)); "CurrentProtocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997)); Kunkel(1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-92; e Kunkel (1988) Method.Enzymol. 85: 2763-6; etc. Um tal gene codificando uma seqüência deaminoácidos mutante, tal como uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, adição, etc. de aminoácidos, podeser produzido por métodos conhecidos tal como o método de Kunkel ou ométodo de duplex aberto, usando um kit de introdução de mutação que utilizamutagênese sítio dirigida, tal como Kit de Mutagênese sítio dirigidaQuikChange™ (fabricado por Stratagene), Sistema de Mutagênese sítiodirigida GeneTailor™ (fabricado por Invitrogen), ou Sistema de Mutagênesesítio dirigida TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc: fabricadopor TAKARA BIO INC.).

(3) Gene

No método de produção da presente invenção, é importanteque um gene a ser introduzido no genoma de uma planta superior seja umgene codificando a proteína de fusão mencionada acima.

Na presente invenção, o gene acima preferivelmentecompreende o DNA descrito nos seguintes (a) ou (b), por exemplo. É para serobservado que ambos DNAs descritos nos seguintes (a) e (b) são os genesestruturais da proteína de fusão mencionada acima (em outras palavras, umgene formado ligando um gene codificando um peptídeo sinal ao geneestrutural de citocromo ou uma proteína tendo capacidade de transferirelétrons equivalente àquela do citocromo Cô). Um gene compreendendo taisDNAs pode consistir de apenas tais DNAs. De outra maneira, ele podecompreender tais DNAs e outras seqüências de nucleotídeos conhecidasnecessárias para expressão do gene estrutural da proteína de fusão acima (umpromotor transcricional, uma seqüência SD, uma seqüência Kozak, umterminador, etc). Assim, o tipo de um gene compreendendo tais DNAs não élimitado. A seqüência de nucleotídeos codificando citocromo c6 foi tornadapública para DNA Data Bank of Japan (DDBJ), e assim ela foi conhecida(Número de acesso: AB40818).

(a) DNA tendo a seqüência de nucleotídeos como mostrado emSEQ ID NO: 1

(b) DNA, que hibridiza com DNA tendo uma seqüência denucleotídeos complementar ao DNA tendo a seqüência de nucleotídeos comomostrado em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, e que codifica umaproteína tendo capacidade de passar através do envelope de cloroplasto emembrana de tilacóide de uma planta superior e capacidade de transferirelétrons

O DNA descrito em (b) acima pode ser obtido realizando ummétodo de hibridização conhecido tal como hibridização de colônia,hibridização em placa, ou Southern blotting, usando o DNA descrito em (a)acima, DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos complementar a este, ouum fragmento deste, como uma sonda, e então utilizando uma biblioteca decDNA ou uma biblioteca genômica. Como uma tal biblioteca, uma bibliotecaproduzida por um método conhecido pode ser usada. De outra maneira, umabiblioteca de cDNA ou biblioteca genômica disponível comercialmentetambém pode ser usada. Assim, o tipo de uma biblioteca usado neste lugarnão é limitado.

Em adição, tanto a seqüência de nucleotídeos codificando aporção de peptídeo sinal (SEQ ID NO: 3) como a seqüência de nucleotídeoscodificando citocromo c6 (SEQ ID NO: 5), ou, ou a seqüência de nucleotídeoscomo mostrado em SEQ ID NO: 3 ou a seqüência de nucleotídeos comomostrado em SEQ ID NO: 5, podem compreender uma mutação.

Para procedimentos detalhados de métodos de hibridização,por favor se referir a Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)) ou outras publicações, comoapropriado.

O termo "condições estringentes" considerando métodos dehibridização é usado para significar condições que são aplicadas durantelavagem depois de hibridização. Tais condições estringentes são aquelas deque a concentração salina em um tampão é entre 15 e 750 mM, epreferivelmente entre 15 e 150 mM, e que a temperatura está entre 25°C e65°C, e preferivelmente entre 45°C e 55°C. Exemplos específicos sãocondições consistindo de 50 mM e 50°C. Além disso, em adição a condições tal como uma concentração salina e temperatura, levando em consideraçãovárias condições tal como uma concentração de sonda, um comprimento desonda, ou um tempo de reação, condições necessárias para obter o DNAdescrito em (b) acima podem ser determinadas, como apropriado.

Além disso, o DNA descrito em (b) acima pode ser obtido produzindo uma sonda usando um fragmento adequado de acordo com ummétodo conhecido para pessoas versadas na arte, realizando então um métodode hibridização conhecido tal como hibridização de colônia, hibridização emplaca, ou Southern blotting, usando a sonda acima, e então utilizando umabiblioteca de cDNA e uma biblioteca genômica. Exemplos de condições estringentes aplicadas na hibridização acima incluem 1 x SSC a 2 x SSC,0,1% a 0,5% de SDS, e 30°C a 80°C. Mais especificamente, depois deconclusão de pré-hibridização a 60°C a 68°C por 30 minutos ou mais, umasonda é adicionada ao produto de reação, e a mistura é retida a 68°C por 1hora ou mais, de maneira a formar um híbrido. Depois disso, o híbrido é lavado com 2 x SSC em 0,1% de SDS uma vez ou duas vezes em temperaturaambiente por 5 a 15 minutos.

DNA usado em hibridização tem uma seqüência denucleotídeos mostrando homologia de pelo menos 70%, mais preferivelmente80% ou mais, ainda mais preferivelmente 90% ou mais, e particularmentepreferivelmente 95% ou mais, com a seqüência de nucleotídeos do DNAdescrito em (a) acima.

É importante que o DNA descrito em (b) acima codifique umaproteína tendo capacidade de passar através do envelope de cloroplasto emembrana de tilacóide de uma planta superior e capacidade de transferirelétrons. Por conseguinte, levando em consideração a seqüência deaminoácidos obtida depois de tradução, o DNA acima preferivelmente temuma seqüência de nucleotídeos, considerando que uma porção de seqüênciade aminoácidos que é considerada como sendo importante para passar através5 do envelope de cloroplasto ou membrana de tilacóide acima, tal comoaminoácidos de posição 53 a posição 72, ou uma porção de seqüência deaminoácidos que é considerada como sendo importante para funcionar comoum carreador de elétron na reação fotossintética clara de uma planta superior,tal como aminoácidos de posição 14 a posição 18 e aminoácidos de posição 47 a 60, não seja mutada ou substituída a partir da seqüência de aminoácidosda proteína descrita em (a) acima.

Exemplos preferidos do DNA descrito em (b) acima incluem:DNA que foi mutado, de forma que o aminoácido obtido substituindo onucleotídeo em posição 103 "T (timina)" com "A (adenina)" do DNA descrito em (a) acima, seguido por tradução, é trocado de "Ser (serina)" para "Thr(treonina);" DNA que foi mutado, de forma que o aminoácido traduzido não étrocado embora o nucleotídeo em posição 216 "C (citosina)" tenha sidosubstituído com "T (timina);" e DNA que foi mutado pelo uso combinado detais substituições de nucleotídeos.

Na presente invenção, o gene acima é permitido para expressarem uma planta superior. Assim, é necessário que o gene acima compreendaDNA caracterizado pelo fato de que códons correspondendo a aminoácidossão aqueles comumente usados em plantas depois de transcrição(preferivelmente, códons freqüentemente usados).(4) Método de introdução de gene

O tipo de um método para produzir uma nova planta superior(uma planta superior transgênica) introduzindo um gene codificando aproteína de fusão mencionada acima (um gene de interesse) no genoma deuma planta superior sem mudar outras características não é limitado. Técnicasconhecidas de recombinação genética tal como o método de Agrobacterium, ométodo de eletroporação, ou o método de pistola de partícula, podem serarbitrariamente adotadas. Por exemplo, um método de infiltração a vácuousando bactérias de gênero Agrobacterium (bactérias da galha-de-coroa), noqual um vetor binário compreendendo um gene de interesse foi introduzido, épreferivelmente aplicado, mas exemplos não são limitados a este. Os detalhesserão descritos abaixo,

(i) Vetor recombinante

O tipo de um vetor recombinante compreendendo um genecodificando a proteína de fusão mencionada acima não é limitado. Um vetorque pode ser usado como o vetor binário mencionado acima é preferível.Especificamente, um vetor recombinante construído inserindo um gene deinteresse para ser incorporado em genoma de planta (ao invés de um geneGUS) em uma região de T-DNA de um vetor tendo a região de T-DNA que éremovida pela ação de um gene de região Vir, é preferível. Exemplospreferidos de um vetor tendo a região de T-DNA acima incluem um vetorpBI121 (fabricado por Clontech; o vetor tendo um gene de resistência acanamicina como um marcador seletivo e compreendendo um gene GUSposterior a um promotor 35S), e um vetor pBHOl (fabricado por Clontech; ovetor tendo um gene de resistência a canamicina como um marcador seletivoe compreendendo um gene GUS).

Em adição, um vetor recombinante que é construído inserindoum gene de interesse em um vetor de expressão conhecido adequado parauma célula hospedeira também é incluído no vetor recombinante da presenteinvenção. Entretanto, este vetor não pode ser usado para o método deinfiltração a vácuo. Se necessário, um promotor transcricional, uma seqüênciaSD (em um caso onde um hospedeiro é um procarioto), ou uma seqüênciaKozak (em um caso onde um hospedeiro é um eucarioto) podem seradicionados antes do gene acima por PCR ou os semelhantes. Em adição, umterminador pode ser adicionado depois deste por PCR ou os semelhantes.Vários elementos necessários para expressão de uma proteína de fusão, talcomo o promotor transcricional mencionado acima, podem estarcompreendidos em um gene de interesse. Se tais elementos estãooriginalmente compreendidos em um vetor de expressão, eles também podemser suados. Assim, as origens de tais elementos necessários não são limitadas.Um tal vetor recombinante pode ser usado em produção em massa da proteínade fusão mencionada acima, etc.

A fim de produzir vários tipos de vetores recombinantes,técnicas e condições conhecidas de recombinação genética, tal como ummétodo usando enzimas de restrição ou um método usando topoisomerase,podem ser adotadas e usadas, como apropriado,(ii) Transformante produzido por introdução de vetor recombinante

O tipo de um hospedeiro, no qual um vetor recombinante éintroduzido, não é limitado. Quando o método de infiltração a vácuo érealizado no estágio final, bactérias de gênero Agrobacterium (Agrobacíeriumíumefaciens, etc.) são usadas como um hospedeiro, no qual um vetor binário éintroduzido. Quando tais bactérias de gênero Agrobacterium são usadas, umamassa celular previamente transformada (um transformante de bactérias degênero Agrobacterium), que é produzida destruindo ou eliminando um genede câncer na região de T-DNA em um plasmídeo Ti, originalmente possuídopelas bactérias acima, é geralmente usada. Em outro caso, quando um vetorde expressão é introduzido como um vetor recombinante, hospedeirosconhecidos tal como Escherichia coli, Bacillus subtilis, levedura, bolor, ouvários tipos de células animais incluindo células humanas ou células decamundongo, podem ser usadas.

O tipo de um método de transformar um hospedeiro não élimitado. Ao levar em consideração a combinação de um hospedeiro e umvetor recombinante, um método adequado pode ser apropriadamenteselecionado a partir de métodos conhecidos, e ele pode ser aplicado.Exemplos preferidos de um tal método de transformação incluemeletroporação, lipofecção, o método de choque térmico, o método de PEG, ométodo de fosfato de cálcio, e o método de DEAE dextrano.

Com respeito ao transformante obtido, o hospedeiroatualmente usado pode ser ou idêntico a ou diferente de um hospedeiro com otipo de códon de um gene mutante EBNA1 contido no vetor recombinante.Assim, ele não é limitado.

(iii) Transformação de planta superior e planta superior transgênica

O tipo de um método de introduzir um gene de interesse nogenoma de uma planta superior para produzir uma planta superior transgênicanão é limitado. O método de infiltração a vácuo mencionado acima épreferível. Em adição, é preferível que um corpo vegetal a ser transformadoesteja na forma de uma planta adulta ou um calo.

Especificamente, um método de transformar uma plantasuperior através do método de infiltração a vácuo compreende: (a) infectar alâmina de uma planta superior com bactérias transgênicas (um transformantede bactérias de gênero Agrobactenum) que contêm um vetor recombinante(um vetor binário), no qual um gene codificando a proteína de fusão mencionada acima foi inserido; (b) cultivar a lâmina em um meio seletivo quecontém antibióticos tal como canamicina; e (c) formar um calo de gemaadventícia e então permitir que ele cresça, de forma a obter uma plantasuperior transgênica. Quando um tal método de infiltração a vácuo é aplicado,todos os meios e condições de tratamento aplicados em cada etapa de tratamento não são limitados, e eles podem ser apropriadamente selecionadosa partir de uma variação conhecida.

Um gene codificando a proteína de fusão mencionada acimafoi introduzido no genoma da planta superior transgênica assim obtida. Umaproteína de fusão permitida para expressar baseado no gene acima tem opeptídeo sinal mencionado acima, e ele tem capacidade de passar através doenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de uma célula vegetal. Porconseguinte, a planta superior transgênica obtida tem citocromo c6(preferivelmente citocromo c6 atuando como um carreador de elétron em umareação fotossintética clara) no espaço tilacóide desta.

É considerado que não apenas plastocianina (PC) mas tambémcitocromo c$ funcionam como um carreador de elétron em uma reaçãofotossintética clara na planta superior transgênica obtida, e promoção docrescimento da planta é com isso atingida efetivamente. Entretanto, otamanho (altura, comprimento de raiz, tamanho foliar, etc.) do corpo adultode uma tal planta superior transgênica não é limitado. O tamanho de uma talplanta superior transgênica é por exemplo 1,1 vezes ou mais, preferivelmente1,2 vezes ou mais, e mais preferivelmente 1,5 vezes ou mais (por exemplo,aproximadamente 1,9 vezes) maior do que aquele de uma planta superior tiposelvagem.

Em adição, uma tal planta superior transgênica tem o efeitode aumentar os números de vários tipos de moléculas em cada célula,assim como o efeito de promover o crescimento destas. Por exemplo, asquantidades de moléculas de clorofila não são limitadas, mas elas são porexemplo 1,1 vezes ou mais, preferivelmente 1,2 vezes ou mais, e maispreferivelmente 1,5 vezes ou mais (por exemplo, aproximadamente 1,6vezes) maiores do que aquelas de uma planta superior tipo selvagem.Assim, a planta superior transgênica tem capacidade fotossintética que foiadicionalmente melhorada.

Além disso, uma vez que a planta superior transgênica obtidatem uma eficiência fotossintética que foi melhorada, a quantidade sintética deATP como um produto desta é por exemplo 1,1 vezes ou mais,preferivelmente 1,2 vezes ou mais, e mais preferivelmente 1,5 vezes ou mais(por exemplo, aproximadamente 1,7 vezes) maior do que aquela de umaplanta superior tipo selvagem, mas uma tal quantidade sintética não é limitadaa estas. Da mesma maneira, a quantidade sintética de NADPH é por exemplo1,1 vezes ou mais, preferivelmente 1,2 vezes ou mais, e mais preferivelmente1,5 vezes ou mais (por exemplo, aproximadamente 1,7 vezes) maior do queaquela de uma planta superior tipo selvagem, mas uma tal quantidade sintéticanão é limitada a estas.

Além disso, na planta superior transgênica obtida, à medidaque a quantidade sintética de ATP e aquela de NADPH aumentam, aeficiência de uma reação fotossintética escura, na qual tais ATP e NADPH funcionam como uma fonte de energia ou um poder redutor, também émelhorada. Por exemplo, a planta superior transgênica tem capacidade defixação de carbono para converter dióxido de carbono (CO2) em carboidratoisto é por exemplo 1,1 vezes ou mais, preferivelmente 1,2 vezes ou mais, emais preferivelmente 1,4 vezes ou mais, maior do que aquele de uma planta superior tipo selvagem.

Ainda adicionalmente, como um resultado de que a eficiênciade uma reação fotossintética clara ou uma reação fotossintética escura foipromovida na planta superior transgênica obtida, a eficiência de sínteseprotéica também foi melhorada. Por exemplo, a planta superior transgênica tem um teor de proteína que é por exemplo 1,1 vezes ou mais,preferivelmente 1,2 vezes ou mais, e mais preferivelmente 1,5 vezes ou mais,maior do que aquele de uma planta superior tipo selvagem.

Ainda adicionalmente, metabolismo de ácido sulfurico e ácidonítrico, a síntese de vários tipos de aminoácidos, a quantidade sintética delipídio, e um aumento em pigmento e flores, etc. também podem serantecipados.

A planta superior transgênica obtida tem preferivelmente pelomenos um de, mais preferivelmente dois ou mais de, e ainda maispreferivelmente todos de, vários tipos dos efeitos mencionados acima.3. Método para promover crescimento de planta superior, método parapromover síntese de ATP, NADPH, amido e proteína, e método parapromover fixação de carbono

Como descrito acima, a planta superior transgênica obtida tem(i) o efeito de promover o crescimento desta, (ii) o efeito de promover asíntese de ATP, NADPH, um amido, e uma proteína, e (iii) o efeito depromover fixação de carbono. Por conseguinte, a presente invenção tambéminclui um método para promover o crescimento de uma planta superior, ummétodo para promover a síntese de pelo menos um selecionado a partir dogrupo consistindo de ATP, NADPH, um amido e uma proteína de uma plantasuperior, e um método para promover a fixação de carbono de uma plantasuperior.

Especificamente, estes métodos são caracterizados porcompreenderem: introduzir no genoma de uma planta superior um genecodificando uma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinal consistindode 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo c6, de forma apermitir que ele se expresse nela; e permitir que citocromo c6 exista no espaçotilacóide de cloroplasto. Nestes métodos, com respeito a uma proteína de fusão,um gene codificando a proteína acima, um método de introduzir o gene acimaem um genoma de planta superior, vários efeitos obtidos a partir da plantasuperior transgênica obtida, e os semelhantes, as descrições, exemplos, e outrosmencionados acima, que são dados considerando o método para produzir umaplanta superior da presente invenção, também podem ser aplicados.

A presente invenção será mais especificamente descrita nosexemplos seguintes. Entretanto, estes exemplos não são pretendidos paralimitar o escopo da presente invenção.

[Exemplo 1]

Construção de gene de citocromo c6 para ser introduzido e vetor de expressãousado para plantas(1) Preparação de gene de região de proteína madura citocromo Ce derivado dePorphyra yezoensis

No presente exemplo, um gene de citocromo c6 derivado de P.yezoensis foi adquirido por clonagem, e ele foi então ligado a um vetor, deforma a preparar um plasmídeo. Usando este plasmídeo como um modelo, umgene de região de proteína madura citocromo c6 derivado de P. yezoensis quefoi DNA de interesse neste exemplo foi amplificado. Depois disso,eletroforese foi realizada. Um gene de interesse foi extraído por extração emgel, e ele foi então digerido com enzimas de restrição (Saci e PstI), de forma a preparar um gene.

A solução de reação com a composição seguinte foi preparadaem um tubo de PCR de assistência de 0,5-ml.

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Volume total 25,0 ul

Iniciador (1): PYC6-C-term Saci (10 pmol/ul) (30 mer, GC-Cont.: 43,3%)

5'-GGA GCT CTT ACC AAC CTT TTT CAG ATT GAG - 3' (SEQ ID NO: 7)

Iniciador (2): Cyt-SD (10 pmol/ul) (29 mer, GC-Cont.: 48,2%)

5'-CCG CGG AGA CGT TAA ATT GAA GAA GAA GC- 3' (SEQ ID NO: 8)

15 ul de óleo mineral foram laminados na solução de reação acima. Depois disso, uma reação foi realizada usando Controlador TérmicoProgramável PTC-100™. Uma reação consistindo de 94°C-48 segundos,62°C-48 segundos, e 72°C-1 minuto 24 segundos foi definida como 1 ciclo.31 ciclos de reações foram realizados.Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 2% (w/v). 4 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 20 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTBE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid.

Uma banda que foi considerada como sendo DNA de interessefoi removida de gel de agarose a 2% (w/v), e ela foi então moída tãofinamente quanto possível. O gel foi colocado em Amicon Ultra free (marcacomercial registrada) DA, e ele foi então centrifugado a 7.300 rpm a 4°C por10 minutos. Depois de conclusão da centrifugação, Ultra free MC (umaporção de coluna no lado superior) foi removido, e à solução eluída, foiadicionada uma quantidade igual de Fenol saturado com TE. Depois disso, amistura foi completamente agitada usando um vórtice, seguido porcentrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada de água foitransferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20 vol. de 3M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanol foram então adicionados aeste. Depois da mistura ter sido completamente agitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foi centrifugado a 14.000 rpma 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. 500 ul de 75%etanol foram adicionados ao precipitado, e o precipitado foi entãocompletamente lavado. O resultante foi adicionalmente centrifugado a 14.000rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. Oprecipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 50ul de TE.Subseqüentemente, uma amostra tendo a composição seguintefoi preparada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A amostra foi entãoincubada a 37°C por 120 minutos, de forma que ela foi digerida com a enzimade restrição SacI.

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Para uma solução de amostra obtida depois de incubação, umaquantidade igual de Fenol saturado com TE foi adicionada. Depois disso, amistura foi completamente agitada usando um vórtice, seguido porcentrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada de água foitransferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20 vol. de 3M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanol foram então adicionados aeste. Depois da mistura ter sido completamente agitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foi centrifugado a 14.000 rpma 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. 500 ul de 75%de etanol foram adicionados ao precipitado, e o precipitado foi entãocompletamente lavado. O resultante foi adicionalmente centrifugado a 14.000rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. Oprecipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 20ul de TE.

Subseqüentemente, uma amostra tendo a composição seguintefoi preparada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A amostra foi entãoincubada a 37°C por 120 minutos, de forma que ela foi digerida com a enzimade restrição PstI.

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 2% (w/v). 4 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 20 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTBE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descobrido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descobrido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid. Depois disso, uma banda que foi considerada comosendo DNA de interesse foi removida de gel de agarose a 2% (w/v), e ela foientão moída tão finamente quanto possível. O gel foi colocado em AmiconUltra free (marca comercial registrada) DA, e ele foi então centrifugado a7.300 rpm a 4°C por 10 minutos. Depois de conclusão da centrifugação, Ultrafree MC (uma porção de coluna no lado superior) foi removido, e à soluçãoeluída, uma quantidade igual de Fenol saturado com TE foi adicionada.Depois disso, a mistura foi completamente agitada usando um vórtice,seguido por centrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada deágua foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20vol. de 3 M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanol foram entãoadicionados a este. Depois da mistura ter sido completamente agitada, ela foideixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foi centrifugado a14.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. 500ul de 75% etanol foram adicionados ao precipitado, e o precipitado foi entãocompletamente lavado. O resultante foi adicionalmente centrifugado a 14.000rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. Oprecipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 20ul de TE.

Os seguintes resultados foram obtidos.

Usando um plasmídeo, no qual um gene de citocromo c6derivado de P. yezoensis (comprimento geral) havia sido inserido, como ummodelo, um gene de região de proteína madura de citocromo Ce (PYC6) foiamplificado por PCR (Figura 4). Depois disso, o produto de PCR foi sujeito àeletroforese em gel de agarose (TBE) a 2% (w/v). Como um resultado, podeser confirmada uma banda única de cerca de 357 bp (Figura 5). Esta banda foiconsiderada como sendo um gene PYC6. Assim, este gene PYC6 foi digeridocom duas enzimas de restrição (Saci e PstI), e o resultante foi então sujeito àeletroforese em gel de agarose (TBE) a 2% (w/v). Uma banda de cerca de 265bp que foi considerada como sendo o gene PYC6 (tendo sítios Saci e PstI) foi extraída do gel, e ela foi então sujeita a extração em fenol e precipitação emetanol, de forma a obter um gene PYC6 tendo sítios Saci e PstI.(2) Adição de gene de peptídeo tendo capacidade de passar através deenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide para citocromo Ce

Nesta seção, um gene de peptídeo tendo capacidade de passar através de um envelope de cloroplasto e uma membrana de tilacóide, quehavia sido sujeito a um tratamento com as enzimas de restrição BamHI e PstIe desfosforilação (tratamento BAP), foi ligado a um gene de região deproteína madura de citocromo c6 derivado de P. yezoensis, que havia sidotratado com as enzimas de restrição Saci e PstI. Depois disso, o produtoligado foi adicionalmente ligado a um vetor de clonagem (pBluescript (marcacomercial registrada) II SK+), seguido por subclonagem. Depois disso, aseqüência de nucleotídeos de um citocromo c$ (sp+PYC6) a ser introduzidoem uma planta foi confirmada. Os seguintes iniciadores universais foramusados em seqüenciamento de DNA.

Iniciador Universal FITC Direto (iniciador Ml3 Fw) (2 pmol/ul)5'- CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC - 3' (SEQ ID NO: 9)Iniciador Universal FITC Reverso (iniciador Ml3 Rv) (2 pmol/ul)5'- GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG - 3' (SEQ ID NO: 10)(2-1) Preparação de gene de citocromo c6para ser introduzido em plantaUma solução de reação com a composição seguinte foipreparada.

Gene de peptídeo tendo capacidade de passar através de 4,0 ulenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide (BAP-tratado)

Gene de região de proteína madura de citocromo de P. 4,0 (0,1yezoensis

10 x Tampão de Ligação 2,0 ul

2 mg/ml de Solução BSA 2,5 ul

Solução de enzima (T4 DNA Ligase) 1,0 ul

Água destilada 6,5 ul

Volume total 20,0 ul

A solução de reação preparada foi incubada em um incubadorde baixa temperatura (16°C) durante toda a noite para uma reação de ligação.Subseqüentemente, fosfatase alcalina foi adicionada à solução, de forma arealizar desfosforilação. Uma amostra tendo a composição seguinte foipreparada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e ela foi então incubadaa 37°C por 3 horas, de forma a realizar desfosforilação usando FosfataseAlcalina Bacteriana.

Amostra obtida depois de ligação 10,0 ul

10 x Tampão BAP 10,0 ul

Fosfatase Alcalina Bacteriana (BAP) 2,5 ul

Água destilada 77,5 ul

Volume total 100,0 ul

Para a solução de amostra obtida depois de incubação, umaquantidade igual de Fenol saturado com TE foi adicionada. Depois disso, amistura foi completamente agitada usando um vórtice, seguido porcentrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada de água foitransferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20 vol. de 3M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanol foram então adicionados aeste. Depois da mistura ter sido completamente agitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foi centrifugado a 14.000 rpma 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. 500 ul de 75%de etanol foram adicionados ao precipitado, e o precipitado foi entãocompletamente lavado. O resultante foi adicionalmente centrifugado a 14.000rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. Oprecipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 20ul de TE.

(2-2) Preparação de vetor de clonagem pBluescript (marca comercialregistrada) II SK+

Uma amostra tendo a composição seguinte foi preparada emum tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e ela foi então incubada a 37°C por 5horas, de forma que ela foi digerida com a enzima de restrição SacI.

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Para a solução de amostra obtida depois de incubação, umaquantidade igual de Fenol saturado com TE foi adicionada. Depois disso, amistura foi completamente agitada usando um vórtice, seguido porcentrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada de água foitransferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20 vol. de 3M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanol foram então adicionados aeste. Depois da mistura ter sido completamente agitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foi centrifugado a 14.000 rpma 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. 500 ul de 75%de etanol foram adicionados ao precipitado, e o precipitado foi entãocompletamente lavado. O resultante foi adicionalmente centrifugado a 14.000rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. Oprecipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 20ul de TE.

Subseqüentemente, uma amostra tendo a composição seguintefoi preparada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e ela foi entãoincubada a 37°C por 5 horas, de forma que ela foi digerida com a enzima derestrição BamHI.

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Volume total 50 |_tl

Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 1,5% (w/v). 4 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 20 ul do produto de PCR obtido, e a mistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 x

TAE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid. Depois disso, uma banda que foi considerada comosendo DNA de interesse foi removida de gel de agarose a 1,5% (w/v), e 100ug do gel foram convertidos para 100 ul. 3 vol. de solução de NaI foiadicionado ao gel, e a mistura foi então completamente agitada. Depois disso, a mistura foi incubada a 55°C por 5 minutos, de forma a dissolver o gel. 10 ulde GLASSMILK foram adicionados ao resultante, e a mistura foiintensivamente agitada em temperatura ambiente por 15 minutos, seguido porcentrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 5 segundos, de forma a recuperar umprecipitado. 300 ul de NEW WASH foram adicionados ao precipitado, e a mistura foi então completamente agitada. O resultante foi centrifugado a14.000 rpm a 4°C por 5 segundos, de forma a recuperar um precipitado. Estaoperação foi repetida 3 vezes, e o precipitado obtido foi então seco. Oprecipitado seco foi dissolvido em 20 ul de água destilada. Depois disso, asolução obtida foi transferida para um tubo de PCR de assistência de 0,5-ml, eele foi então centrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 30 segundos. Osobrenadante obtido foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga de1,5 ml, e 1/20 vol. de 3 M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanolforam então adicionados a este. Depois da mistura ter sido completamenteagitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foicentrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi entãodescartado. 500 ul de 75% de etanol foram adicionados ao precipitado, e oprecipitado foi então completamente lavado. O resultante foi adicionalmentecentrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi entãodescartado. O precipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi entãodissolvido em 20 ul de TE.(2-3) Subclonagem de citocromo c6 gene para ser introduzido em plantas

O gene de citocromo c6 foi subclonado de acordo com ummétodo conhecido (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166(4), 557-580 (1983); eHiroki Nakayama et al., Bio Illustrated II, Idenshi Kaiseki no Kiso (BasicGene Analyses), Shujunsha Co., Ltd., 83-88 (1996)).

O gene a ser introduzido em plantas e um vetor de clonagemforam preparados de forma que eles tiveram a composição seguinte.

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A solução de reação preparada foi incubada em um incubadorde baixa temperatura (16°C) durante toda a noite para uma reação de ligação.Escherichia coli foi transformada como segue. Primeiro, 150 ul de célulascompetentes (DH5a) foram derretidas em gelo até um certo grau, e 4 ul dasolução de reação ligada foi então gentilmente adicionado a estas. A misturafoi suavemente agitada com a ponta de um circuito integrado, e ela foi entãodeixada em gelo por 30 minutos. Depois de ser deixada por 30 minutos, elasofreu choque térmico a 42°C por 20 segundos. Depois disso, o resultante foideixado em repouso em gelo por 3 minutos. Depois disso, cada de 100 ul de e50 ul de soluções de massa celular (Vetor: Inserto = 1: 1, e 1: 3) foi aplicadona superfície inteira de uma placa de LB- Ampicilina-X-Gal-IPTG, usandouma alça de inoculação de célula, e ela foi então cultivada a 37°C durante toda a noite.

(2-4) Preparação de plasmídeo por método de SDS alcalino

O método de SDS alcalino foi realizado de acordo com meiosconhecidos (Weiss. B, et al., J. Biol. Chem., 243, 4543-4555 (1968); eBirnboim, H. C, Methods Enzymol., 100, 243 (1983)). Isto quer dizer, umasolução de massa celular foi sujeita a uma cultura de agitação em 3 ml demeio líquido de LB-Amplicilina a 200 rpm a 37°C por 16 horas, e ela (1,5 mlcada) foi então dispensada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, seguidopor centrifugação a 6.000 rpm a 4°C por 10 minutos. Depois disso, osobrenadante foi eliminado por aspiração com um aspirador. 100 ul de

Solução I (50 mM de glicose-25 mM de Tris-HCl (pH 8,0)-10 mM de EDTA)foi adicionado ao precipitado (massa celular), e a mistura obtida foicompletamente agitada com um vórtice. Depois disso, 200 ul de Solução IIfoi adicionada a esta, e a solução obtida foi agitada virando ela suavemente. Asolução foi deixada em temperatura ambiente por 5 minutos, e 150 ul de

Solução III (0,2 N de NaOH-1% de SDS) foi posteriormente adicionada aesta. A mistura obtida foi deixada em gelo por 30 minutos, e 100 ul declorofórmio foi então adicionado a esta, seguido por centrifugação a 14.000rpm a 4°C por 10 minutos. Depois disso, o sobrenadante foi recuperado emum novo tubo, e um volume duplo de 99,5% de etanol foi então adicionado aesta. A mistura obtida foi agitada virando ela suavemente, e ela foi entãodeixada em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, 500 ul de70% de etanol foi adicionado à solução de reação, e a mistura obtida foi entãocentrifugada a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. O precipitado obtido foiseco com TOMY MICRO Vac por 3 a 5 minutos, e ele foi então dissolvidoem 20 ul de TE.

A fim de confirmar que DNA de interesse foi incorporado noplasmídeo obtido, uma amostra tendo a composição seguinte foi preparada emum tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Ela foi então incubada a 37°C por 120 minutos, de forma que ela foi digerida com as enzimas de restrição Saci eBamHI.

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Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 2% (w/v). 2 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 10 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTBE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid. Como um resultado, com respeito a apenas aamostra na qual o DNA de interesse foi incorporado, 100 ul da solução demassa celular remanescente (1,5 ml) obtida depois de conclusão da cultura em3 ml de meio líquido de LB-Ampicilina foi inoculado em 5 ml de meiolíquido de LB-Ampicilina, seguido por uma cultura de agitação a 200 rpm, a37°C por 16 horas.

(2-5) Preparação de plasmídeo com QIAGEN Spin Miniprep Kit

Uma solução de massa celular obtida pela cultura em 5 ml demeio líquido de LB-Ampicilina foi centrifugada a 6.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então eliminado por aspiração com umaspirador. 250 ul de Tampão PI incluído com o kit (QIAGEN Spin MiniprepKit(250) (QIAGEN)) foi adicionado ao precipitado (massa celular), e ele foicompletamente suspenso nesse.

É para ser observado que o QIAGEN Spin Miniprep Kit(250)(QIAGEN) compreende um tubo de Coleta, uma Coluna QIA prep Spin, TampãoPI, Tampão P2, Tampão N3, Tampão PB, Tampão PE, e Tampão EB.

250 ul de Tampão P2 foram adicionados à suspensão acima, ea mistura obtida foi agitada virando ela suavemente, até a solução se tornarhomogênea. Depois disso, 350 ul de Tampão N3 foi posteriormenteadicionado à solução, e a mistura obtida foi agitada virando ela suavemente,seguido por centrifugação a 13.000 rpm a 4°C por 10 minutos. Osobrenadante obtido foi transferido para uma coluna QIA prep spin, que haviasido previamente ajustada em um tubo de Coleta, e ele foi então centrifugadoa 13.000 rpm a 4°C por 1 minuto. O filtrado acumulado no tubo de Coleta foidescartado, e 500 ul de Tampão PB foi então adicionado à coluna QIA prepspin, seguido por centrifugação a 13.000 rpm a 4°C por 1 minuto. Depoisdisso, o filtrado foi descartado de novo. 750 ul de Tampão PE foiposteriormente adicionado à coluna QIA prep spin, seguido por centrifugaçãoa 13.000 rpm a 4°C por 1 minuto. Depois disso, o filtrado foi descartado.

Centrifugação foi realizada de novo a 13.000 rpm a 4°C por 1 minuto, eapenas a coluna QIA prep spin foi transferida para um novo tudo demicrocentrífuga de 1,5 ml. 50 ul de Tampão EB foi adicionado ao centro dacoluna QIA prep spin, e ela foi então deixada em temperatura ambiente por 1minuto, seguido por centrifugação a 13.000 rpm a 4°C por 1 minuto. Ofiltrado obtido foi definido como uma amostra de plasmídeo.

A fim de confirmar que DNA de interesse foi incorporado noplasmídeo obtido, uma amostra tendo a composição seguinte foi preparada emum tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e ela foi então incubada a 37°C por120 minutos, de forma que ela foi digerida com as enzimas de restrição Saci eBamHI.

DNA de plasmídeo 5,010 x L Tampão 2,0 ulSacI 0,5 ulBamHI 0,5 ulÁgua destilada 12,0 ulVolume total 20,0 ul

Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada por2% (w/v) de eletroforese em gel de agarose. 2 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 10 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTBE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid. Neste lugar, uma amostra, na qual o DNA deinteresse foi incorporado e caracterizado pelo fato de que unidade foiconfirmada, foi definida como uma amostra de seqüência.(2-6) Determinação de seqüência de nucleotídeos de acordo com método dedideóxi

Seqüências de nucleotídeos foram determinadas por ummétodo conhecido usando um autoseqüenciador (Sanger, F., Sanger, F.,Determination of nucleotide sequence in DNA., Science, 214, 1205-1210(1981)). Depois de determinação de tais seqüências de nucleotídeos, dadosforam analisados usando aplicativo computacional de análise, GENETYX-MAC.

(2-7) Resultados

Um gene sp, que havia sido sujeito à digestão com duasenzimas de restrição (BamHI e PstI) e desfosforilação (tratamento BAP), foiligado a um gene PYC6, que havia sido digerido com duas enzimas derestrição (Saci e PstI). O produto ligado foi tratado com BAP de novo, e oresultante foi então sujeito à extração em fenol e precipitação em etanol, deforma a produzir um gene de citocromo c6(sp+PYC6) para ser introduzido emplantas.

A fim de determinar a seqüência de nucleotídeos deste genesp+PYC6, o gene foi ligado a um vetor de clonagem (pBluescript II SK+(Figura 6)), que havia sido digerido com duas enzimas de restrição (BamHI eSaci), seguido por subclonagem. Depois disso, o resultante foi seqüenciadopelo método de dideóxi, de forma a determinar a seqüência de nucleotídeosinteira (474 bp) do gene sp+PYC6 (Figura 7).

Os resultados de seqüências do gene sp+PYC6 foramcomparados com aqueles do gene sp ou gene PYC6 conhecido. Como umresultado, foi revelado que a seqüência do gene sp+PYC6 foi completamenteidêntica àquela do gene sp ou gene PYC6 conhecido, com a exceção que T(timina) em posição 103 na seqüência de peptídeo sinal havia sido mutadapara A (adenina). Em adição, sítios de enzima de restrição adicionados aseqüências de iniciador também foram confirmados (Figura 7). Devido àmutação de nucleotídeo assim confirmada, o aminoácido codificado Ser foiconvertido em Thr. Entretanto, suas propriedades e pesos moleculares foramsimilares, e tal conversão não teve influência na estrutura secundária (ot-hélice, etc). Assim, uma vez que tal conversão não tem influência na funçãocomo um peptídeo sinal, tal como transferência de membrana, esta amostra(sp+PYC6) foi usada no experimento subseqüente.

(3) Produção de vetor de expressão para citocromo capara ser introduzido emplantas

No presente exemplo, um gene de citocromo c6(sp+PYC6)para ser introduzido em plantas, cuja seqüência de nucleotídeos foiconfirmada, foi inserido em um vetor de expressão pBI121, de forma aconstruir um vetor de expressão (pBI cyt c6) usado para citocromo c6 para serintroduzido em plantas.

(3-1) Preparação de vetor de expressão vegetal pBI121

Uma amostra tendo a composição seguinte foi preparada emtudo de microcentrífuga de 1,5 ml, e ela foi então incubada a 37°C por 5horas, de forma que ela foi digerida com a enzima de restrição SacI.

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Para a solução de amostra obtida depois da incubação, umaquantidade igual de Fenol saturado com TE foi adicionada. Depois disso, amistura foi completamente agitada usando um vórtice, seguido por centrifugaçãoa 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada de água foi transferida para umnovo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20 vol. de 3 M de NaOAc (pH 5,2)e 2 vol. de 99,5% de etanol foram então adicionados a este. Depois da misturater sido completamente agitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depoisdisso, o resultante foi centrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e osobrenadante foi então descartado. 500 ul de 75% de etanol foram adicionadosao precipitado, e o precipitado foi então completamente lavado. O resultante foiadicionalmente centrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 5 minutos, e osobrenadante foi então descartado. O precipitado foi seco ao ar até um certograu, e ele foi então dissolvido em 20 ul de TE.

Subseqüentemente, uma amostra tendo a composição seguintefoi preparada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A amostra foi entãoincubada a 37°C por 5 minutos, de forma que ela foi digerida com a enzimade restrição BamHI.

<table>table see original document page 47</column></row><table>Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 1,5% (w/v). 4 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 20 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTAE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquina fotográfica tipo Polaroid. Depois disso, uma banda que foi considerada comosendo DNA de interesse foi removida de gel de agarose a 1,5% (w/v), e 100u.g do gel foram convertidos para 100 ul. 3 vol. de solução de NaI foiadicionado ao gel, e a mistura foi então completamente agitada. Depois disso,a mistura foi incubada a 55°C por 5 minutos, de forma a dissolver o gel. 10 ul de GLASSMILK foram adicionados ao resultante, e a mistura foiintensivamente agitada em temperatura ambiente por 15 minutos, seguido porcentrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 5 segundos, de forma a recuperar umprecipitado. 300 ul de NEW WASH foram adicionados ao precipitado, e amistura foi então completamente agitada. O resultante foi centrifugado a14.000 rpm a 4°C por 5 segundos, de forma a recuperar um precipitado. Estaoperação foi repetida 3 vezes, e o precipitado obtido foi então seco. Oprecipitado seco foi dissolvido em 20 ul de água destilada. Depois disso, asolução obtida foi transferida para um tubo de PCR de assistência de 0,5 ml, eele foi então centrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 30 segundos. Osobrenadante obtido foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga de1,5 ml, e 1/20 vol. de 3 M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanolforam então adicionados a este. Depois da mistura ter sido completamenteagitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foicentrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi entãodescartado. 500 ul de 75% de etanol foram adicionados ao precipitado, e oprecipitado foi então completamente lavado. O resultante foi adicionalmentecentrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi entãodescartado. O precipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 20 ul de TE.

(3-2) Preparação de vetor de expressão de citocromo c6 (pBI cyt c6) usadopara expressão em plantas

O gene de citocromo c6(sp+PYC6) a ser introduzido, que haviasido produzido acima, foi usado para preparar uma solução de reação tendo acomposição seguinte.

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Volume total 20,0 ul

A solução de reação preparada foi incubada em um incubadorde baixa temperatura (16°C) durante toda a noite para uma reação de ligação.

Os resultados são mostrados abaixo.

O gene sp+PYC6 (que havia sido digerido com BamHI e Saci e havia sido tratado com BAP), cuja seqüência de nucleotídeos foiconfirmada, foi ligado a um vetor de expressão vegetal (pBI121), que haviasido digerido com duas enzimas de restrição (BamHI e Saci), de forma apreparar um vetor de expressão de citocromo c6 (pBI cyt c6) para serintroduzido em plantas.

[Exemplo 2]

Produção de planta transgênica (Arabidopsis thaliana introduzida comcitocromo c6)

(1) Preparação de Agrobacterium tumefadens usada em infecção de planta(1-1) Preparação de Escherichia coli introduzida com vetor de expressão decitocromo c6 (pBI cyt c6)

No presente exemplo, Escherichia coli HB101 usada como umhospedeiro foi transformada com um vetor de expressão vegetal (pBI cyt c6),no qual um gene de citocromo c6 para ser introduzido em plantas havia sidoinserido. Depois disso, diversas colônias foram selecionadas, e elas foramentão cultivadas em 3 ml de meio líquido de LB-Canamicina. Um plasmídeofoi preparado pelo método de SDS alcalino, de forma a confirmar construçãodo vetor e a presença ou ausência de transformação da Escherichia coliHB101 hospedeira.

Escherichia coli foi transformada como segue. Primeiro, 150fil de células competentes (HB101) foram derretidas em gelo até um certograu, e 4 ul da solução de reação ligada foi então gentilmente adicionado aestas. A mistura foi suavemente agitada com a ponta de um circuito integrado,e ela foi então deixada em gelo por 30 minutos. Depois de ser deixada por 30minutos, ela sofreu choque térmico a 42°C por 20 segundos. Depois disso, oresultante foi deixado em repouso em gelo por 3 minutos. Depois disso, cadade 100 ul de e 50 ul de soluções de massa celular foi aplicado na superfícieinteira de uma placa de LB-Canamicina, usando uma alça de inoculação decélula, e ela foi então cultivada a 37°C durante toda a noite.

Depois de conclusão da cultura, 20 clones foramaleatoriamente escolhidos a partir de transformantes (colônias), e as colôniasassim obtidas foram então inoculadas em 3 ml de meio de LB-Canamicina, eelas foram então sujeitas a uma cultura de agitação a 200 rpm a 37°C por 16horas. Depois disso, a solução de massa celular cultivada (1,5 ml cada) foientão dispensada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, seguido porcentrifugação a 6.000 rpm a 4°C por 10 minutos. Depois disso, osobrenadante foi eliminado por aspiração com um aspirador. 100 ul deSolução I (a mencionada acima) foram adicionados ao precipitado (massacelular), e a mistura obtida foi completamente agitada com um vórtice.Depois disso, 200 ul de Solução II (0,2 N de NaOH-1% de SDS) foiadicionado a esta, e a solução obtida foi agitada virando ela suavemente. Asolução foi deixada em temperatura ambiente por 5 minutos, e 150 ul deSolução III (a mencionada acima) foi posteriormente adicionada a esta. Amistura obtida foi deixada em gelo por 30 minutos, e 100 ul de clorofórmiofoi então adicionada a esta, seguido por centrifugação a 14.000 rpm a 4°C por10 minutos. Depois disso, o sobrenadante foi recuperado em um novo tubo, eum volume duplo de 99,5% de etanol foi então adicionada a esta. A misturaobtida foi agitada virando ela suavemente, e ela foi então deixada emtemperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, 500 ul de 70% de etanolfoi adicionado à solução de reação, e a mistura obtida foi então centrifugada a14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. O precipitado obtido foi seco com TOMYMICRO Vac por 3 a 5 minutos, e ele foi então dissolvido em 20 ul de TE.

A fim de confirmar que DNA de interesse foi incorporado noplasmídeo obtido, uma amostra tendo a composição seguinte foi preparada emum tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e ela foi então incubada a 37°C por120 minutos, de forma que ela foi digerida com as enzimas de restrição

BamHI e SacI.

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 1,5% (w/v). 2 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 10 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTAE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid.

Os resultados são mostrados abaixo.

Escherichia coli HB101 usada como um hospedeiro foitransformada com um vetor de expressão de citocromo c6 (pBI cyt c6) usadopara expressão em plantas (Figura 8). Depois disso, 20 clones foramaleatoriamente escolhidos a partir de transformantes (colônias). Como umresultado, em 3 dos 20 clones, pode ser confirmada uma banda única de cercado tamanho (474 bp) que foi considerada como sendo um gene sp+PYC6.Assim, foi revelado que o gene sp+PYC6 havia sido inserido neste plasmídeo.A Escherichia coli HB101 tendo este plasmídeo foi usada no experimentosubseqüente.

(1-2) Preparação e seleção de Agrobacterium tumefaciens transgênica Nesta seção, conjugação triparental foi realizada para preparar

Agrobacterium tumefaciens usada como um hospedeiro que foi necessáriapara introdução de um gene de interesse em uma planta superior A. thaliana.Depois disso, diversas colônias foram selecionadas a partir dos transformantesobtidos, e elas foram então cultivadas em 3 ml de meio líquido de LB-Canamicina, seguido por preparação de um plasmídeo pelo método de SDSalcalino, de forma a confirmar a presença ou ausência de transformação daAgrobacterium hospedeira.(1-2-1) Cultura de vários tipos de linhagens

(a) Agrobacterium tumefaciens (LBA4404)*pAL4404 Uma solução de carga de glicerol da linhagem acima foiaplicada em uma maneira de delineamento na superfície inteira de um meiode ágar YEP-Estreptomicina (placa) (30 ug/ml de Estreptomicina), usandouma alça de platina. Ela foi então cultivada a 30°C por aproximadamente 40horas. Depois de conclusão da cultura, uma colônia foi escolhida, e ela foientão sujeita a uma cultura de agitação em 5 ml de meio YEP-Estreptomicina(30 ug/ml de Estreptomicina) a 200 rpm a 30°C por 30 horas.

(b) Escherichia coli (HB101)*pRK2013

Uma solução de carga de glicerol da linhagem acima foiaplicada em uma maneira de delineamento na superfície inteira de um meiode ágar LB-Canamicina (placa) (40 ng/ml de Canamicina), usando uma alçade platina. Ela foi então cultivada a 37°C por 16 horas. Depois de conclusãoda cultura, uma colônia foi escolhida, e ela foi então sujeita a uma cultura deagitação em 5 ml de meio LB-Canamicina (40 ug/ml de Canamicina) a 200 rpm a 37°C por 16 horas.

(c) Escherichia coli (HB101)*pBI cyt c6

Uma solução de carga de glicerol da linhagem acima foiaplicada em uma maneira de delineamento na superfície inteira de um meiode ágar LB-Canamicina (placa) (40 |ng/ml de Canamicina), usando uma alça de platina. Ela foi então cultivada a 37°C por 16 horas. Depois de conclusãoda cultura, uma colônia foi escolhida, e ela foi então sujeita a uma cultura deagitação em 5 ml de meio LB-Canamicina (40 ug/ml de Canamicina) a 200rpm a 37°C por 16 horas.(1-2-2) Conjugação triparental

Conjugação triparental foi realizada de acordo com um métodoconhecido (Atsushi Komamine & Koji Nomura, "Seibutsu Kagaku Jikken Ho41 (Biochemical Experimental methods 41)," Syokubutsu Saibo KogakuNyumon (Introduction of Plant Cell Technology), Japan Scientific SocietiesPress, 298-302 (1998)). Isto é, cada um dos 3 tipos de soluções de linhagem (linhagens tendo A. tumefaciens (LBA4404)*pAL4404, E. coli (HB101)*pBIcyt c6, e E. coli (HB101)*pRK2013), que havia sido sujeito a uma cultura deagitação em 5 ml de meio líquido YEP-Sm. ou meio líquido LB-Km., foicentrifugado a 5.000 rpm a 4°C por 5 minutos. Depois disso, o sobrenadantefoi eliminado por aspiração com um aspirador. Para lavagem, o meio líquido(meio YEP ou meio LB) que havia sido usado na cultura foi adicionado aoprecipitado (massa celular), e a mistura obtida foi completamente agitada.Depois disso, o resultante foi centrifugado de novo a 5.000 rpm a 4°C por 5minutos. Depois de conclusão da centrifugação, a massa celular foi dissolvidaem 3 ml do meio líquido usado na cultura (meio YEP ou meio LB).Subseqüentemente, 30 ul de cada solução de massa celular foram despejadosem um meio de ágar Min A-Canamicina (placa) de forma que ela foilaminada nesse. Ele foi então deixado em repouso, de forma que ele foicultivado a 30°C por 3 dias. Depois de conclusão da cultura, a massa celularcrescendo a partir do meio de ágar Min A-Canamicina (placa) como um meiomínimo foi toda raspada usando uma alça de platina, e a massa celular assimobtida foi então dissolvida em 200 ul de 10 mM de MgS04. Depois disso, asolução de massa celular foi aplicada em uma maneira de delineamento nasuperfície inteira de um meio de ágar Min A-Canamicina (placa) de novousando uma alça de platina, e ela foi então cultivada a 30°C por 3 dias.Depois de conclusão da cultura, uma colônia foi escolhida, e ela foi entãosujeita a uma cultura de agitação em 5 ml de meio YEP-Canamicina (40ug/ml de Canamicina) a 200 rpm a 30°C por 40 horas.(1-2-3) Preparação de plasmídeo Ti por método de SDS alcalino

A solução de massa celular (1,5 ml cada), que havia sidosujeita a uma cultura de agitação em 5 ml de meio líquido YEP-Canamicina(40 ug/ml de Canamicina) a 200 rpm a 30°C por 40 horas, foi dispensada emum tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Depois disso, a solução de massacelular acima foi centrifugada a 5.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e osobrenadante foi então eliminado por aspiração com um aspirador. Depoisdisso, lml de S-tampão foi adicionado ao precipitado (massa celular), e amistura obtida foi completamente agitada usando um vórtice. A mistura foicentrifugada a 8.000 rpm at 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi entãoeliminado por aspiração com um aspirador.S-tampão foi preparado pesando 13,512 g de C6H1206 (glicose(M.W.: 180,16)), adicionando 12,5 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0) e 10 mlde 0,5M de EDTA (pH 8,0) a este, e ajustando o volume para 500 ml comágua extra pura, seguido por um tratamento em autoclave (121°C, 10minutos).

100 ul de S-tampão e 5 ul de 10 mg/ml de lisozima foramadicionados ao precipitado de novo, e a mistura obtida foi deixada emtemperatura ambiente por 10 minutos. Depois disso, 200 ul de Solução II e 30ul de Fenol saturado com TE foram adicionados a este, e a solução obtida foiagitada virando ela suavemente. A solução foi deixada em temperaturaambiente por 5 minutos, e 150 ul de Solução III foi posteriormente adicionadaa esta. A mistura obtida foi deixada a -20°C por 15 minutos, e o resultante foientão centrifugado a 12.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada de água foitransferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20 vol. de 3 M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanol foram então adicionados aeste. Depois da mistura ter sido completamente agitada, ela foi deixada a -20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foi centrifugado a 14.000 rpma 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. 500 ul de 75%de etanol foram adicionados ao precipitado, e o precipitado foi entãocompletamente lavado. O resultante foi adicionalmente centrifugado a 14.000rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. Oprecipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 20ul de TE.

1 ml de RNase A foi adicionado ao plasmídeo obtido, e a mistura obtida foi então incubada a 37°C por 90 minutos de forma a conduzirum tratamento com RNase. Depois de conclusão da reação, confirmação foirealizada por eletroforese em gel de agarose a 1,5% (w/v). 2 ul de um tampãode carregamento de gel foram adicionados a 10 ul do produto de PCR obtido,e a mistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTAE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid.

Os seguintes resultados foram obtidos. A. tumefaciens(LBA4404) foi cultivada em um meio YEP-Sm., e E. coli (HB101) foicultivada em um meio LB-Km.. Depois disso, pBI cyt c6 foi introduzido em A.tumefaciens (LBA4404) por conjugação triparental, de forma a transformar A.tumefaciens (LBA4404). Subseqüentemente, 10 clones foram aleatoriamenteescolhidos a partir das linhagens transgênicas de A. tumefaciens, nas quais oplasmideo Ti (pBI cyt c$) havia sido introduzido por conjugação triparental.Tais colônias foram cultivadas em 3 ml de meio YEP-Km.. Depois disso, umplasmideo foi preparado pelo método de SDS alcalino, e ele foi então sujeito àeletroforese em gel de agarose a 1% (w/v). Como um resultado, em 1 clone,pode ser confirmada uma banda em um tamanho (13,5 kbp) que foiconsiderado como sendo pBI cyt c6. Assim, foi revelado que o plasmideo Ti(pBI cyt c6) havia sido introduzido na A. tumefaciens transgênica.(2) Produção de planta transgênica (Arabidopsis thaliana introduzida comcitocromo c6)

(2-1) Cultivo de Arabidopsis thaliana

Vermiculita foi colocada em até cerca de 9 partes de um poteredondo 7,5 x 7,5, que foi bem lavado com água. Subseqüentemente, 500 mlda solução foram preparados diluindo 2.000 vezes uma solução de cargaHYPONex com água, e lãs de rocha, que haviam sido fatiadas em umaespessura de aproximadamente 1 cm com um cortador, foram colocados nasolução acima. 3 lãs de rocha, que haviam sido bem impregnadas com água,foram colocadas em cada um dos potes redondos 7,5 x 7,5. Uma rede usadapara a pia na cozinha foi cortada em um tamanho suficiente para cobrir a bocado pote, e ela foi então bem lavado com água. Depois disso, a boca do potefoi coberta com a malha, e ela foi então ligada com uma goma elástica.Depois disso, uma única semente foi inseminada em cada um dos tais potes.Depois de inseminação da semente, um tratamento de baixa temperatura foirealizado nesta a 4°C por 3 dias. Depois de conclusão do tratamento de baixatemperatura, o pote foi transferido para um incubador de irradiação luminosausado para o crescimento de plantas, seguido por cultivo sob 22°C paracondições de dia longo.

Depois de germinação, água foi dada aproximadamente umavez a cada 2 dias, e HYPONex que havia siso diluído 1.000 vezes foi dadocomo um fertilizante líquido aproximadamente uma vez por semana.Plântulas foram colhidas como apropriado. Aproximadamente 3 semanasdepois, quando corpos vegetais começaram a formar botões florais, poda do meristema apical foi realizada, e os corpos vegetais crescidos foramsustentados com espetos de bambu (suportes). Quando as sementes estavamcompletamente maduras, elas foram coletadas. As sementes coletadas forampreservadas em um estado seco.

(2-2) Infecção de corpo vegetal com Agrobacterium tumefaciens transgênicaSubseqüentemente, a fim de introduzir em uma planta superior

A. thaliana (col-0), citocromo c6 (gene sp+PYC6) para ser introduzido emplantas, uma planta transgênica foi produzida por um método de infiltração avácuo, um dos métodos de Agrobacterium (Bechtold, N., Pelletier, G.,Methods in Molecular Biology, 82 (1998)). Procedimentos específicos são como segue.

(2-2-1) Cultura de Agrobacterium tumefaciens

Uma solução de carga de glicerol da linhagem acima foiaplicada em uma maneira de delineamento na superfície inteira de um meiode ágar Min A-Km. (placa) (400 ug/ml de Canamicina), usando uma alça deplatina. Ela foi então cultivada a 30°C por 40 horas. Depois de conclusão dacultura, uma colônia foi escolhida, e ela foi sujeita a uma cultura de agitação(pré-cultura) em 10 ml de meio YEP-Km. (40 (ig/ml de Canamicina) a 200rpm a 30°C por 30 horas. Depois disso, a quantidade total da solução decultura foi adicionada a 100 ml de meio YEP-Km. (40 ug/ml de Canamicina)novo, e uma cultura de agitação (cultura principal) foi então realizada a 200rpm a 30°C por 30 horas.

(2-2-2) Cultivo de corpo vegetal, Arabidopsis thaliana (col-0)

As seguintes condições de cultivo foram aplicadas a partir deinseminação para coleção de sementes de A. thaliana (col-0) usada como uma.planta a ser transformada.

Tratamento de baixa temperatura: deixar em repouso a 4°C(lugar escuro) por 3 dias

Temperatura de crescimento de planta: 22°C

Irradiação luminosa: condições de dia longo (100 uE m"2 s"1)

Fertilizante líquido: HYPONeX (diluído 1/1.000 vezes)No caso de uma linhagem tipo selvagem, ela germinou 7 diasdepois de inseminação (incluindo 3 dias para o tratamento de baixatemperatura), e a planta formou botões florais aproximadamente 20 diasdepois de germinação. Depois disso, a planta foi sujeita a um tratamento depoda do meristema apical. 5 ou 6 dias depois, galhos laterais começaram a seestender, e no mesmo momento, a abertura de uma primeira flor e frutificaçãocomeçaram. Quando vagens verdes se tornaram marrom claro e começaram arachar na direção longitudinal, sementes foram coletadas. Aproximadamente50 sementes foram coletadas de uma única vagem. As sementes coletadasforam preservadas em um estado seco até o momento de inseminação.(2-2-3) Infecção de corpo vegetal

Um corpo vegetal Arabidopsis thaliana (col-0) usado para serinfectado, foi cultivado de acordo com o método descrito na seção (2-2-2)acima, e ele foi permitido para crescer até ele começar a formar botões florais.Depois disso, quando folhagem começou a ser derivada do caule, a planta foipodada no meristema apical, de forma a eliminar flores que já haviam aberto efrutificado. Neste experimento, preparação deste corpo vegetal e preparaçãoda solução de cultura de massa celular descrita na seção (2-2-1) foramsimultaneamente realizadas.

Primeiro, um Kimtowel foi colocado em uma bancada de testeno qual uma operação de infiltração era para ser realizada.

Subseqüentemente, uma solução de cultura de A. tumefaciensfoi diluída em uma magnificação de cerca de 2/3 com um meio de suspensãousado em infiltração, e a solução diluída foi então derramada em um béquerde 1-L. O béquer foi ajustado em uma jarra de aspiração. Depois disso, umcorpo vegetal de A. thaliana, que havia sido permitido para absorver umaquantidade suficiente de água imediatamente antes de inoculação de formaque ele não aspirou uma quantidade excessiva de suspensão de cultura, foientão inoculado em um pote. Depois disso, o pote foi imobilizado de cabeçapara baixo no béquer, de forma a imergir o corpo vegetal na suspensão decultura.

Uma solução de cultura de A. tumefaciens tendo OD60o = 1,2 a 1,5 foi diluída em uma magnificação de cerca de 2/3 com um meio desuspensão usado em infiltração, de forma a obter OD60o - 0,8, e a solução decultura de A. tumefaciens assim obtida foi usada no método de infiltração avácuo. Em adição, como um resultado de análise sobre o tempo de infiltraçãoa vácuo, tal como 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos, e 10 minutos, foi encontrado que 5 minutos foi o mais adequado como um tempo requeridopara infiltração a vácuo. Isto é, quanto maior tal tempo de infiltração a vácuo,mais pobre o crescimento subseqüente do corpo vegetal que pode ser obtido.No caso do tratamento por 5 minutos, deterioração do crescimento não foiobservada, e o número de flores e o número de vagens frutificadas (sementes)não foram significantemente diferentes daqueles de um corpo vegetal quehavia sido tratado por 1 minuto.

Subseqüentemente, o corpo vegetal que havia sido imerso nasuspensão de cultura foi colocado na jarra de aspiração, e a pressão foi então reduzida usando um aspirador. Depois de conclusão da despressurização, ocorpo vegetal foi removido da jarra de aspiração, e uma suspensão de culturaredundante foi retirada com um Kimtowel. O corpo vegetal foi colocado delado em uma bandeja de plástico, e água foi adicionada em gotas na margemdesta. Depois disso, a bandeja de plástico foi fechada, e ela foi então deixadaa 20°C por 2 ou 3 dias (durante este período, nenhuma água foi dada). Depoisdisso, o pote foi plantado, e ele foi então cultivado, como de costume, em umincubador de irradiação luminosa usado para o crescimento de plantas a 22°Csob condições de dia longo. Água foi dada aproximadamente uma vez a cada2 dias, e HYPONex que havia sido diluído 1.000 vezes foi dado como umfertilizante líquido aproximadamente uma vez por semana. Plântulas foramcolhidas como apropriado. Aproximadamente 3 semanas depois, quandocorpos vegetais começaram a formar botões florais, poda do meristema apicalfoi realizada, e os corpos vegetais crescidos foram sustentados com espetos debambu (suportes). Quando as sementes estavam completamente maduras, elasforam coletadas. As sementes coletadas foram preservadas em um estadoseco.

[Exemplo 3]

Análise de introdução de gene de citocromo c6 em corpo vegetal transgênicoe expressão deste

(1) Análise de gene introduzido em DNA genômico por método de PCR

No presente exemplo, DNA genômico foi extraído deArabidopsis thaliana transgênica. Usando o DNA genômico como ummodelo, PCR foi realizado. Introdução de um gene no corpo vegetal foiconfirmada baseado na presença ou ausência de amplificação do geneintroduzido.

(1-1) Extração de DNA genômico a partir de transformante

Aproximadamente 2 ou 3 folhas de Arabidopsis thalianatransgênica foram colocadas em um almofariz que havia sido previamenteresinado, e nitrogênio líquido foi rapidamente adicionado a este. Depoisdisso, o corpo vegetal foi homogeneizado até se tornar um estado em pó.Depois disso, a amostra de pó foi colocada em um tubo de microcentrífuga de1,5 ml, seguido por pesagem. 1 ml de uma solução obtida adicionando 2-mercaptoetanol a tampão Wash a uma concentração final de 0,5% foi adicionada à amostra pesada, e a mistura foi completamente misturada. Amistura foi centrifugada a 12.500 rpm a 4°C por 10 minutos, e o sobrenadantefoi então descartado. 300 ul de uma solução obtida adicionando 2-mercaptoetanol a Solução I a uma concentração final de 1% foi adicionada aesta, e a mistura obtida foi completamente misturada usando um vórtice.

Subseqüentemente, 30 ul de 1% de NaBH4 e 150 ul de Solução II foramadicionados ao resultante, e a mistura obtida foi agitada usando um vórticepor diversos segundos. A solução resultante foi incubada a 50°C por 10minutos, e 100 ul de Solução III-A e 120 ul de Solução III-B incluída comISOPLANT II (NIPPON GENE) foram então adicionados à solução. Asolução obtida foi deixada em gelo por 10 minutos.

O resultante foi centrifugado a 12.500 rpm a 4°C por 10minutos, e a fase aquosa foi recuperada. Depois disso, 2 vol. de 99,5% deetanol foram adicionados a esta, e a mistura foi imediatamente centrifugada a8.000 rpm em temperatura ambiente por 1 hora. Depois disso, o sobrenadante foi descartado. 1 ml de 70% de etanol foi posteriormente adicionada a esta, ea mistura foi então centrifugada a 8.000 rpm em temperatura ambiente por 1minuto. Depois disso, o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi secoao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 50 ul de TE. 1 ul de 1mg/ml de RNase A foi adicionado à solução, e a mistura foi então incubada a37°C por 30 minutos. Depois disso, a fim de confirmar extração de DNAgenômico, 1 ul de um tampão de carregamento de gel foi adicionado a 5 ul doDNA genômico obtido, e usando ÀHindIII como um marcador, eletroforeseem gel de agarose a 1,5% (w/v) foi realizada. A eletroforese foi realizadausando um tampão de eletroforese (1 x TAE) a 100 V por 30 minutos. Depoisde conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/ml de brometo deetídio por 7 minutos, e ele foi então descobrido com água extra pura por 10minutos. O gel descolorido foi colocado em um transiluminador de UV, e elefoi então fotografado com uma máquina fotográfica tipo Polaroid.

Depois da presença de DNA genômico ter sido confirmadapela eletroforese, a solução de DNA genômico foi diluída 100 vezes, e UV foientão medido com um espectrofotômetro, de forma a medir a concentração doDNA genômico. Baseado na concentração calculada, a concentração desolução de DNA genômico foi ajustada para 10 ng/ul, e ela foi usada noexperimento subseqüente.

(1-2) PCR

PCR foi realizado de acordo com um método conhecido(Sambrook, J. D., W. Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rdedn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Uma solução de reação tendo a composição seguinte foipreparada em um tubo de PCR de assistência de 0,5 ml.

<table>table see original document page 62</column></row><table>15 ul de óleo mineral foram laminados nesta solução dereação. Depois disso, a reação foi realizada usando Controlador TérmicoProgramável PTC-100™.

Os seguintes iniciadores foram usados.Iniciador (3) ATP-NA 1 Bam (10 pmol/ul) (3 lmer, GC-Cont.: 54,8%)

5'-GGA TCC ATG GCC GCA ATT ACA TCA GCT ACC G-3' (SEQ IDNO: 11)

Iniciador (1) PYC6-C-term Saci (10 pmol/ul) (30mer, GC-Cont.: 43,3%)5'-GGA GCT CTT ACC AAC CTT TTT CAG ATT GAG-3'(SEQ ID NO: 7)

Iniciador Universal FITC Direto (iniciador Ml3 Fw) (2 pmol/ul)

5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3' (SEQ ID NO: 9)Iniciador Universal FITC Reverso (iniciador Ml3 Rv) (2 pmol/ul)5'-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3' (SEQ ID NO: 10)

A reação foi realizada sob condições de (94°C-48 segundos, 64°C-48 segundos, e 72°C-1 minuto 24 segundos) x 31 ciclos.

Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 2% (w/v). 2 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 10 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 xTBE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/mlde brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquina fotográfica tipo Polaroid.

(1-3) Extração em gel de produto de PCR

Uma banda que foi considerada como sendo DNA de interessefoi removida de gel de agarose a 2% (w/v), e ele foi então moída tãofinamente quanto possível. O gel foi colocado em Amicon Ultra free (marcacomercial registrada) DA, e ele foi então centrifugado a 7.300 rpm a 4°C por10 minutos. Depois de conclusão da centrifugação, Ultra free MC (umaporção de coluna no lado superior) foi removido, e à solução eluída, umaquantidade igual de Fenol saturado com TE foi adicionada. Depois disso, amistura foi completamente agitada usando um vórtice, seguido porcentrifugação a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. A camada de água foitransferida para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 1/20 vol. de 3M de NaOAc (pH 5,2) e 2 vol. de 99,5% de etanol foram então adicionados aeste. Depois da mistura ter sido completamente agitada, ela foi deixada a - 20°C por 30 minutos. Depois disso, o resultante foi centrifugado a 14.000 rpma 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. 500 ul de 75%de etanol foram adicionados ao precipitado, e o precipitado foi entãocompletamente lavado. O resultante foi adicionalmente centrifugado a 14.000rpm a 4°C por 5 minutos, e o sobrenadante foi então descartado. O precipitado foi seco ao ar até um certo grau, e ele foi então dissolvido em 20ul de TE. A fim de confirmar que o DNA de interesse havia sidoexclusivamente extraído e purificado nesta solução, eletroforese em gel deagarose a 2% (w/v) foi realizada. 2 ul de um tampão de carregamento de gelforam adicionados a 10 ul da amostra obtida, e eletroforese foi realizadausando um tampão de eletroforese (1 x TBE) a 100 V por 30 minutos. Depoisde conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/ml de brometo deetídio por 7 minutos, e ele foi então descobrido com água extra pura por 10minutos. O gel descolorido foi colocado em um transiluminador de UV, e elefoi então fotografado com uma máquina fotográfica tipo Polaroid.(1-4) Subclonagem de produto de PCR

A subclonagem do produto de PCR foi realizada de acordocom um método conhecido (Hanahan, D., J. Mol. Biol, 166(4), 557-580(1983); e Hiroki Nakayama et al., Bio Illustrated II, Idenshi Kaiseki no Kiso(Basic Gene Analyses), Shujunsha Co., Ltd., 83-88 (1996)).O produto de PCR e outros componentes foram preparadospara ter a composição seguinte._

<table>table see original document page 65</column></row><table>

A solução de reação preparada foi incubada em um incubadorde baixa temperatura (16°C) durante toda a noite para uma reação de ligação.

Escherichia coli foi transformada como segue. Primeiro, 150 ul de célulascompetentes (DH5a) foram derretidas em gelo até um certo grau, e 4 ul dasolução de reação ligada foi então gentilmente adicionado a estas. A misturafoi suavemente agitada com a ponta de um circuito integrado, e ela foi entãodeixada em gelo por 30 minutos. Depois de ser deixada por 30 minutos, elasofreu choque térmico a 42°C por 20 segundos. Depois disso, o resultante foideixado em repouso em gelo por 3 minutos. Depois disso, cada uma de 100 ulde e 50 ul de soluções de massa celular (Vetor: Inserto = 1: 1, e 1: 3) foiaplicada na superfície inteira de uma placa LB- Ampicilina-X-Gal-IPTG,usando uma alça de inoculação de célula, e ela foi então cultivada a 37°C durante toda a noite.

(1-5) Preparação de plasmídeo de acordo com método de SDS alcalino

Nesta seção, um plasmídeo foi preparado da mesma maneiraque aquela descrita em Exemplo 1 (2-4).

(1-6) Preparação de plasmídeo usando QIAGEN Spin Miniprep Kit Nesta seção, um plasmídeo foi preparado da mesma maneiraque aquela descrita em Exemplo 1 (2-5).

(1-7) Determinação de seqüência de nucleotídeos de acordo com método dedideóxiNesta seção, uma seqüência de nucleotídeos foi determinadapelo mesmo método que aquele descrito em Exemplo 1 (2-6). Os seguintesresultados foram obtidos.

DNA genômico de alta pureza foi extraído de 2 ou 3 folhas deA. thaliana transgênica, usando ISOPLANT II. A fim de confirmar a presençaou ausência de introdução de um gene de citocromo c6 usado para serintroduzido em plantas, usando a solução de DNA genômico como ummodelo, um gene de interesse foi amplificado por PCR. Depois disso, oproduto de PCR foi sujeito à eletroforese em gel de agarose (TBE) a 2%(w/v). Como um resultado, foi confirmada uma única banda de cerca de 474bp (Figura 9). A fim de determinar a seqüência de nucleotídeos do geneamplificado, depois de extração em gel, subclonagem foi realizada. Depoisdisso, o gene amplificado foi seqüenciado pelo método de dideóxi, de forma adeterminar a seqüência de nucleotídeos inteira consistindo de 474 bp. Osresultados de seqüências foram comparados com a seqüência de gene sp eseqüência de gene PYC6 conhecidas, usando GENETYX-MAC. Como umresultado, como com o gene introduzido, a seqüência de nucleotídeosdeterminada foi completamente idêntica àquelas dos genes acima com aexceção que T (timina) em posição 103 na seqüência de gene de peptídeo foisubstituída com A (adenina). A partir dos resultados acima, foi revelado queum gene sp+PYC6 foi introduzido no corpo vegetal (A. thaliana).(2) Análise de gene de expressão em RNA total de acordo com método deRT-PCR

Na presente seção, RNA total foi extraído de Arabidopsisthaliana transgênica, e RT-PCR foi realizado usando o RNA total como ummodelo. Depois disso, baseado na presença ou ausência de amplificação dogene introduzido, expressão do gene no corpo vegetal foi confirmada.Iniciador (3) ATP-NA1 Bam (10 pmol/ul) (31 mer, GC-Cont: 54,8%)5'-GGA TCC ATG GCC GCA ATT ACA TCA GCT ACC G-3' (SEQ IDNO: 8)

Iniciador (1) PYC6-C-term Saci (10 pmol/ul) (30 mer, GC-Cont.: 43,3%)5'-GGA GCT CTT ACC AAC CTT TTT CAG ATT GAG-3' (SEQ ID NO:3)

Iniciador Universal FITC Direto (iniciador Ml3 Fw) (2 pmol/ul)5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3' (SEQ ID NO: 6)Iniciador Universal FITC Reverso (iniciador Ml3 Rv) (2 pmol/ul)5'-GAG CGG ATA AC A ATT TC A CAC AGG-3' (SEQ ID NO: 7)(2-1) Extração de RNA total a partir de transformante

RNA total foi extraído a partir de um transformante usando umkit disponível comercialmente (RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)) emconformidade com uma instrução incluída com este.(2-2) PCR

PCR foi realizado de acordo com um método conhecido(Sambrook, J. D., W. Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rdedn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Uma solução de reação tendo a composição seguinte foipreparada em um tubo de PCR de assistência de 0,5 ml.

<table>table see original document page 67</column></row><table>

15 ul de óleo mineral foram laminados na solução de reaçãoacima. Depois disso, uma reação foi realizada usando Controlador TérmicoProgramável PTC-100™.

Depois de conclusão da reação, confirmação foi realizada poreletroforese em gel de agarose a 2% (w/v). 2 ul de um tampão decarregamento de gel foram adicionados a 10 ul do produto de PCR obtido, e amistura obtida foi usada como uma amostra eletroforética. Eletroforese foirealizada a 100 V por 30 minutos usando um tampão de eletroforese (1 x

TBE). Depois de conclusão da eletroforese, o gel foi colorido com 0,1 mg/ml de brometo de etídio por 7 minutos, e ele foi então descolorido com águaextra pura por 10 minutos. O gel descolorido foi colocado em umtransiluminador de UV, e ele foi então fotografado com uma máquinafotográfica tipo Polaroid.

(2-3) Extração em gel de produto de PCR Nesta seção, extração em gel do produto de PCR foi realizadada mesma maneira que aquela descrita em Exemplo 3 (1-3).(2-4) Subclonagem de produto de PCR

Nesta seção, a subclonagem do produto de PCR foi realizadapelo mesmo método que aquele descrito em Exemplo 3 (1-4). (2-5) Preparação de plasmídeo de acordo com método de SDS alcalino

Nesta seção, o método de SDS alcalino foi realizado de acordocom maneiras conhecidas pelo mesmo método que aquele descrito em

Exemplo 1 (2-4) (Weiss. B, et al, J. Biol. Chem, 243, 4543-4555 (1968);

Birnboim, H. C, Methods Enzymol., 100, 243 (1983)).(2-6) Preparação de plasmídeo usando QIAGEN Spin Miniprep Kit

Nesta seção, um plasmídeo foi preparado usando QIAGEN

Spin Miniprep Kit pelo mesmo método que aquele descrito em Exemplo 1 (2-5).

(2-7) Determinação de seqüência de nucleotídeos de acordo com método dedideóxi

Nesta seção, uma seqüência de nucleotídeos foi determinadapelo mesmo método que aquele descrito em Exemplo 1 (2-6) (Sanger, F.,Sanger, F., Determination of nucleotide sequence in DNA., Science, 214,1205-1210 (1981)).(2-8) Resultados

O RNA total expresso foi extraído de 2 ou 3 folhas de umaplanta transgênica (planta introduzida com PYC6) caracterizado pelo fato deque introdução do gene havia sido confirmada, usando RNeasy Plant MiniKit. A fim de confirmar a presença ou ausência de expressão de um genesp+PYC6, usando a solução de RNA total como um modelo, um gene deinteresse foi amplificado por RT-PCR. Depois disso, o produto de PCR foisujeito à eletroforese em gel de agarose (TBE) a 2% (w/v). Como umresultado, foi confirmada uma única banda de cerca de 474 bp (Figura 9). Afim de determinar a seqüência de nucleotídeos do gene amplificado, depois deextração em gel, subclonagem foi realizada. Depois disso, o gene amplificadofoi seqüenciado pelo método de dideóxi, de forma a determinar a seqüênciade nucleotídeos inteira consistindo de 474 bp. Os resultados de seqüênciasforam comparados com a seqüência de gene sp e seqüência de gene PYC6conhecidas, usando GENETYX-MAC. Como um resultado, como com o geneintroduzido, a seqüência de nucleotídeos determinada foi completamenteidêntica àquela dos genes acima com a exceção que T (timina) em posição103 na seqüência de gene de peptídeo foi substituída com A (adenina). Apartir dos resultados acima, foi considerado que o gene sp+PYC6 foi expresso no corpo vegetal (A. thalianá).

(3) Análise de proteína expressa de acordo com método de Western blotting

Nesta seção, cloroplasto foi extraído de Arabidopsis thalianátransgênica. Depois disso, foi confirmado que o citocromo c6 introduzido foiexpresso em uma fração protéica de cloroplasto obtida a partir do cloroplastoextraído.

(3-1) Preparação de fração de cloroplasto

Uma fração de cloroplasto foi preparada de acordo commaneiras conhecidas (Kenzo Nakamura et ai, (edited), Shokubutsu noTanpakushitsu Jikken Protocol (Plant Protein Experimental Protocols), SaiboKogaku Series (Cell Technology Series), Vol. 9, Shujunsha Co., Ltd., 114-117 (1998)).

Aproximadamente 5 a 6 g de Arabidopsis thaliana transgênicafoi colocado em um almofariz que havia sido previamente resinado, enitrogênio líquido foi rapidamente adicionado a este. Depois disso, o corpovegetal foi homogeneizado até se tornar um estado de pó. Depois disso, 20 mlde tampão de desintegração que havia sido resinado em gelo foi adicionado àamostra de pó, e a mistura foi então completamente agitada. Depois disso, amistura foi filtrada com 4 camadas de Miracloth. O filtrado obtido foi transferido para um tubo de 15 ml (Corning), e ele foi então centrifugado a7.000 rpm a 4°C por 15 segundos. Depois disso, o sobrenadante foicuidadosamente eliminado. 5 vol. de tampão de desintegração foramadicionados ao precipitado, e eles foram misturados de maneira a formar umasolução homogênea. Depois disso, a solução obtida foi suavemente laminadaem um tubo de centrífuga de vidro, no qual 10 ml de 30% de Percoll haviamsido previamente colocados. Ele foi então centrifugado a 2.000 rpm a 4°C por3 minutos. Depois de conclusão da centrifugação, Percoll como umsobrenadante foi eliminado, e o precipitado foi misturado em 5 ml de tampãode desintegração, até a mistura obtida se tornar homogênea. A mistura foi centrifugada a 2.000 rpm, a 4°C por 3 minutos, de novo. (Esta operação foirepetida duas vezes). Finalmente, o precipitado foi dissolvido em 1 ml detampão de desintegração, e a solução foi definida como uma fração decloroplasto.(3-2) Western blotting1 ml de reagente de Lise/Extração de Célula Vegetal CelLytic

P foi adicionado à solução de fração de cloroplasto obtida em (3-1) acima, e amistura obtida foi então centrifugada a 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos. Osobrenadante obtido foi definido como uma solução de extração de proteínade cloroplasto. 5 ul de um marcador padrão de peso molecular de 1 |ig/ul, 5ul de água extra pura, e a solução de extração de proteína de cloroplastoforam adicionados a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A cada tubo, umaquantidade igual de tampão de amostra foi adicionada, e a mistura foi entãocompletamente agitada. O tubo preparado foi incubado a 40°C por 30 minutosem uma banheira de água quente, e ele foi então usado como uma amostraeletroforética.

Uma solução de eletrodo anodo, uma solução de eletrodocatodo, e gel SDS-PAGE foram ajustados em um tanque eletroforético, e 20jiil da amostra eletroforética foi cuidadosamente aplicado em um poço. Depois disso, a amostra eletroforética foi eletroforesada até a extremidade superior degel de separação em uma voltagem constante de 30 V, e o marcador foieletroforesado até aproximadamente 5 mm a partir da extremidade inferior dogel em uma voltagem constante de 100 V. Durante a eletroforese, dois filtrosforam imersos em cada um dos tampões de hibridização A, B, e C. A membrana PVDF foi imersa em uma pequena quantidade de metanol por 5segundos e foi então imersa na solução C de hibridização. Depois deconclusão da eletroforese, o gel foi removido da borda de vidro, e ele foientão imerso na solução C de hibridização C por aproximadamente 5 minutos.Dois filtros A, dois filtros B, a membrana PVDF, o gel, e dois filtros C foramlaminados nesta ordem a partir do fundo de um dispositivo de hibridizaçãosemi-seco. Depois deles terem sido laminados, transcrição foi conduzida emuma corrente constante de 60 mA por 90 minutos. Imediatamente depois deconclusão da hibridização, operações foram conduzidas nas seguintes ordens,de forma a realizar uma reação antígeno-anticorpo.

(i) A membrana PVDF é imersa em TBS e é então agitada por5 minutos (2 vezes);

(ii) Ela é imersa em 5% de BSA em TBS e é então agitada de 1hora a durante toda a noite;

(iii) Ela é imersa em TBS, e é então agitada por 5 minutos;(iv) Ela é imersa em lst-anticorpo, e é então agitada por 2horas;

(v) Ela é imersa em TTBS, e é então agitada por 5 minutos (2vezes);

(vi) Ela é imersa em 2nd-anticorpo, e é então agitada por 1 hora30 minutos;

(vii) Ela é imersa em TTBS, e é então agitada por 5 minutos (2vezes);

(viii) Ela é imersa em TBS, e é então agitada por 5 minutos (2vezes);

(ix) Ela é imersa em um 2nd-reagente de desenvolvimento deanticorpo, e é então agitada por 20 minutos (luz-bloqueada); e

(x) Ela é lavada com água extra pura.

(3-3) Resultados

Uma fração de cloroplasto foi separada de uma plantaintroduzida com PYC6 por centrifugação por gradiente de densidade dePercoll. As proteínas de cloroplasto obtidas foram eletroforeticamenteselecionadas por SDS-PAGE em termos de peso molecular.Subseqüentemente, todas as proteínas separadas foram transcritas em umamembrana PVDF, e uma reação antígeno-anticorpo foi realizada usando umanticorpo primário (anticorpo de coelho) e um anticorpo anti-coelho(anticorpo secundário) que reconheceu citocromo Ce derivado de P. yezoensis.Como um resultado, uma tal reação antígeno-anticorpo pode ser detectadaapenas na planta introduzida com PYC6 (Figura 10). A partir de taisresultados, foi revelado que PYC6 introduzido na planta introduzida comPYC6 foi expresso no cloroplasto.

(4) Análise de seqüência de aminoácidos N-terminal de proteína citocromo c6expressa

Nesta seção, a seqüência de aminoácidos N-terminal de umaproteína PYC6 que exibiu uma reação antígeno-anticorpo em (3) acima foianalisada, e a presença ou ausência da clivagem de um peptídeo sinal foientão confirmada.

1 ml de reagente de Lise/Extração de Célula Vegetal CelLyticP foi adicionado à solução de fração de cloroplasto obtida em (3-1) acima, e amistura obtida foi então centrifugada a 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos. Osobrenadante obtido foi definido como uma solução de extração de proteínade cloroplasto. 5 ul de um marcador padrão de peso molecular de 1 ug/ul, 5ul de água extra pura, e a solução de extração de proteína de cloroplasto10 foram adicionados a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A cada tubo, umaquantidade igual de tampão de amostra foi adicionada, e a mistura foi entãocompletamente agitada. O tubo preparado foi incubado a 40°C por 30 minutosem uma banheira de água quente, e ele foi então usado como uma amostraeletroforética.

Uma solução de eletrodo anodo, uma solução de eletrodocatodo, e gel SDS-PAGE foram colocados em um tanque eletroforético, e20 ul da amostra eletroforética foi cuidadosamente aplicado em um poço.Depois disso, a amostra eletroforética foi eletroforesada até a extremidadesuperior de gel de separação em uma voltagem constante de 30 V, e o marcador foi eletroforesado até aproximadamente 5 mm a partir daextremidade inferior do gel em uma voltagem constante de 100 V.Durante a eletroforese, dois filtros foram imersos em cada um dostampões de hibridização A, B, e C. A membrana PVDF foi imersa emuma pequena quantidade de metanol por 5 segundos e foi então imersa nasolução C de hibridização. Depois de conclusão da eletroforese, o gel foiremovido da placa de vidro, e ele foi então imerso na solução C dehibridização por aproximadamente 5 minutos. Dois filtros A, dois filtrosB, a membrana PVDF, o gel, e dois filtros C foram laminados nestaordem a partir do fundo de um dispositivo de hibridização semi-seco.Depois deles terem sido laminados, transcrição foi conduzida em umacorrente constante de 60 mA por 90 minutos. Depois de conclusão dahibridização, coloração com CBB e operação de descoloração foramconduzidas, e uma porção protéica de interesse foi cortada em umtamanho de 1 mm x 5 mm, e a porção protéica assim cortada foi entãotransferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta foi usadacomo uma amostra de seqüência, e a seqüência de aminoácidos desta foianalisada usando Applied Biosystems Protein Sequencer 492.

A seqüência de aminoácidos N-terminal de uma proteínacom um peso molecular de aproximadamente 9,1 kDa tendo uma reaçãoantígeno-anticorpo com um anticorpo de PYC6 obtida a partir da plantatransgênica foi analisada pelo método de Edman. Como um resultado, aseqüência foi encontrada como sendo ADLDNGEKVF (SEQ ID NO: 12)a partir do primeiro resíduo no término N (favor se referir à tabelaseguinte).

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Esta seqüência é completamente idêntica à seqüência deaminoácidos N-terminal da região de proteína madura de PYC6. A partirdestes resultados, foi revelado que o peptídeo sinal havia sido clivado nocorpo vegetal, e que PYC6 passou precisamente através da membrana detilacóide de cloroplasto e foi expresso no lado do lúmen. Isto quer dizer,como um resultado da análise da seqüência de aminoácidos N-terminalda proteína PYC6 no transformante obtido, foi encontrado que aseqüência acima foi idêntica à seqüência de aminoácidos da regiãomadura caracterizada pelo fato de que um sinal de transporte decloroplasto havia sido clivado. Assim, pode ser confirmado que o genesp+PYC6 foi transcrito e traduzido, e foi então transportado para ocloroplasto.[Exemplo 4]

Mensuracão de crescimento de planta transgênica e observação de fenótipo(1) Observação de crescimento (altura, comprimento de raiz, e tamanhofoliar)

Nesta seção, o crescimento de Arabidopsis thalianatransgênica depois de inseminação foi observado.

Depois da planta transgênica ter sido inseminada, a "altura,""comprimento de raiz," e "tamanho foliar" do corpo vegetal foramobservados e medidos a cada 10 dias. Como amostras vegetais, 20 linhagenstipo selvagem individuais e 20 plantas transgênicas individuais forampreparadas. O valor médio foi calculado, e uma diferença significante foientão obtida por processamento estatístico.

Como um resultado de observação do crescimento (fenótipo)das plantas introduzidas com PYC6, a altura de uma tal planta foi no máximo 1,9 vezes maior do que aquela da planta tipo selvagem (WT) (40 dias depoisde inseminação), e ela foi então 1,3 vezes maior do que aquela de WT no 60thdia aproximadamente (Figura 11). O comprimento de raiz de uma tal plantaintroduzida com PYC6 foi no máximo 1,35 vezes maior do que aquele de WT(40 dias depois de inseminação), e ele foi então 1,17 vezes maior do queaquele de WT no 60th dia aproximadamente (Figura 12). O tamanho foliar deuma tal planta introduzida com PYC6 foi no máximo 1,9 vezes maior do queaquele de WT (40 dias depois de inseminação), e ele foi então 1,3 vezes maiordo que aquele de WT no 60th dia aproximadamente (Figura 13). Foiconsiderado que tais fenômenos ocorridos em tais plantas introduzidas com PYC6 foram causados devido à ativação de uma reação fotossintéticaextremamente importante para o crescimento de plantas como um resultadode expressão de PYC6 nos corpos vegetais. Assim, foi considerado que a taxade crescimento rate dos corpos vegetais foi aumentada pela influência de talativação de uma reação fotossintética.(2) Mensuração de quantidade total de clorofila

Nesta seção, a quantidade total de clorofila foi extraída deArabidopsis thaliana transgênica usando acetona, e ela foi então quantificada.

Folhas de Arabidopsis thaliana transgênica foram coletadasusando um perfurador de folhas, e elas foram então pesadas. A amostra foicolocada em um almofariz que havia sido previamente resinado, e nitrogêniolíquido foi então rapidamente adicionado a esta. A mistura foi homogeneizadaaté que o corpo vegetal se tornasse um estado de pó. Depois disso, 80% deacetona foi adicionado à amostra de pó, de forma a ajustar o volume para 4ml. Os valores de absorbância a 663 nm e a 645 nm da solução acima forammedidos usando um espectrofotômetro UV-VISIBLESPECTROPHOTOMETER.

Os valores de absorbância obtidos a 663 nm e a 645 nm foramdeterminados na fórmula seguinte, de forma a calcular a quantidade declorofila.

Quantidade total de clorofila (ug/ml)

= 8,02 x ABS (663) + 20,21 x ABS (645)

Como um resultado da mensuração da quantidade de clorofilana planta introduzida com PYC6, foi encontrado que a quantidade de clorofilana planta introduzida com PYC6 foi 1,1 a 1,2 vezes maior do que aquela deWT durante o período de 40 a 70 dias depois de inseminação (Figura 14). Foiconsiderado que isto se deu porque uma reação luminosa foi ativada porintrodução de PYC6, e porque uma substância energética (ATP) que foi oproduto final assim aumentado da reação luminosa foi utilizada na síntese declorofila.

[Exemplo 5]

Mensuração de atividade fotossintética de planta transgênica

(1) Métodos e resultados

A fim de usar como indicadores de atividade fotossintética, umteor de nucleotídeo adenina (ATP), uma quantidade de NADPH, capacidadede assimilação de dióxido de carbono, uma quantidade de amido, e umaquantidade de proteína foram medidas pelos seguintes métodos.(1-1) Mensuração de teor total de ATP No presente exemplo, ATP total foi extraído de Arabidopsisthaliana transgênica, e ele foi então quantificado pelo método de luciferina-luciferase.

Folhas de Arabidopsis thaliana transgênica foram pesadasantecipadamente. Depois de pesagem, a amostra foi colocada em umalmofariz que havia sido previamente resinado, e nitrogênio líquido foi entãorapidamente adicionado a esta. A mistura foi homogeneizada usando um pilãoaté que o corpo vegetal se tornasse um estado de pó. Depois disso, 2 ml de0,25 M de ácido perclórico foi adicionado à amostra de pó, e a solução obtidafoi então recuperada em um tubo de 15 ml (Corning). A solução foi centrifugada a 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos. Depois disso, osobrenadante obtido foi transferido para outro tubo de 15 ml (Corning), e opH foi então ajustado para pH 7,0 com 1 N de KOH. Depois do pH ter sidoajustado, o volume foi ajustado para 5 ml com um tampão fosfato de 0,2 M(pH 7,2), e a solução assim obtida foi definida como um extrato de ATP.100 ul do extrato de ATP foram preparados em um tubo demicrocentrífuga de 1,5 ml, e 20 ul de Reagente de Luciferase/LuciferinaENLITEN foi adicionado a este. 90 segundos depois de adição do agenteacima, o integral da intensidade de luminescência da solução de reação foicalculado por 10 segundos usando um luminômetro (GENE LIGHT 55).

Depois disso, a concentração de ATP na solução foi calculada a partir dovalor de RLU obtido, e a quantidade de ATP por peso da planta foi obtida apartir da concentração de ATP obtida.

Como um resultado, a quantidade total de ATP contida naplanta introduzida com PYC6 foi aumentada por no máximo 1,93 vezes (60dias depois de inseminação) (Figura 15). Foi considerado que isto foi porquecyt c6(PYC6) de P. yezoensis funcionou como um novo carreador de elétrons,assim como plastocianina funcionando na planta introduzida com PYC6, deforma que transferência de elétron em uma reação luminosa pode ser ativada,e de forma que a quantidade de ATP como um produto final foi com issoaumentada.

(1-2) Mensuração de teor total de NADPH

No presente exemplo, NADPH total foi extraído deArabidopsis thaliana transgênica, e ele foi então quantificado.

Arabidopsis thaliana transgênica foi pesada antecipadamente.

Depois disso, 0,1 N de NaOH foi colocado na planta transgênica pesada, quehavia sido aquecida com um banho quente a aproximadamente 70°C, e amistura foi então desintegrada com um homogenizador Polytron. Depoisdisso, o resultante foi transferido para uma banheira de gelo, eaproximadamente 2 ml de 0,1 N de HC1 foi adicionado a este. A misturaobtida foi ajustada para pH 7,5 usando um papel de teste de pH.Subseqüentemente, 0,1 ml de tampão glicilglicina (pH 7,5) foi adicionado àmistura, e a mistura obtida foi então completamente agitada. Depois disso, asolução de reação foi transferida para um cilindro de mensuração, e aquantidade de líquido foi então medida. Depois de conclusão da mensuração,a solução foi transferida para um tubo de 15 ml (Corning), e ele foi entãocentrifugado a 10.000 rpm a 4°C por 20 minutos. Depois de conclusão dacentrifugação, o sobrenadante foi recuperado em um tubo de 15 ml (Corning),e ele foi então resinado a -80°C durante toda a noite. Depois do resultante tersido dissolvido, ele foi então centrifugado a 10.000 rpm a 4°C por 20minutos, e o resultante foi então usado em quantificação.

100,0 ul de um extrato de NADPH, 346,0 ul de um tampãoglicilglicina de 0,1 M (pH 7,4), 200,0 ul de 0,2 M de nicotinamida, 82,0 ul de3,2 mg/ml de metossulfato de fenazina (PMS), 67,0 ul de 5 mg/ml de tiazolazul, e 200 ul de glicose-6-dibásica hidrato fosfato de sódio, forammisturados. A mistura obtida foi colocada em um espectrofotômetro U3310.Mensuração foi realizada a 570 nm a 25°C. Uma unidade de controle detemperatura foi instalada em U3310, e a temperatura deste foi ajustada em25°C. Depois disso, uma mudança na absorbância a 570 nm foi medida a cada30 segundos por 2 minutos, e baseado em diferenças nos valores deabsorbância obtidos, a quantidade de NADPH foi calculada. Depois disso aquantidade de NADPH por peso da planta foi calculada a partir do valorobtido acima.

Como um resultado, a quantidade total de NADPH contida naplanta introduzida com PYC6 foi aumentada em 1,2 a 1,4 vezes em 40 a 70dias depois de inseminação (Figura 16). Foi considerado que isto foi porquequantidades maiores de elétrons foram transferidas para a planta superiorintroduzida com PYC6 do que para uma planta tipo selvagem como umresultado de introdução de PYC6 na planta superior, e porque a quantidade deNADPH como um produto final foi com isso aumentada.(1-3) Mensuração de capacidade de assimilação de dióxido de carbono

No presente exemplo, usando folhas de Arabidopsis thalianatransgênica, capacidade de assimilação de dióxido de carbono foi medida.

Tal capacidade de assimilação de dióxido de carbono foimedida usando um analisador de gás C02 CIRAS-1 (fabricado por KoitoIndustries, Ltd.). Em adição, a quantidade de dióxido de carbono fornecida foiajustada em 350 ppm, e a mensuração foi então realizada sob luminosidadesaturada.

Como um resultado, a capacidade de assimilação de dióxidode carbono da planta introduzida com PYC6 foi aumentada em no máximo2,2 vezes (50 dias depois de inseminação) (Figura 17). Foi considerado queisto foi porque a quantidade de ATP e a quantidade de NADPH foramaumentadas por introdução de PYC6 em uma planta superior, e uma reaçãoescura (Calvin-Benson ciclo) que utilizou energia foi com isso ativado, deforma que a capacidade de assimilação de dióxido de carbono foi aumentada.(1-4) Mensuração de quantidade de amido

No presente exemplo, amido foi extraído de Arabidopsisthaliana transgênica, e ele foi então quantificado.

Folhas de planta foram coletadas e foram então secas (70°C, 2dias). Aproximadamente 5 mg de folhas foram pesadas na quantidadedesejada, e elas foram então colocadas em um almofariz. Depois disso, 3 mlde 32% de ácido perclórico foi adicionado a estas, e a mistura obtida foi entãocompletamente desintegrada com um pilão. Depois disso, toda a amostraobtida foi colocada em um tubo de teste, e ela foi então deixada em repouso a20°C por 20 minutos. Subseqüentemente, o resultante foi filtrado com umdisco de fibra de vidro de 6,0-cm Whatman GF/A. Depois disso, 5 ml de umasolução de iodo foi então adicionado ao filtrado, e eles foram entãomisturados. A mistura obtida foi deixada em repouso a aproximadamente 4°Cpor 30 minutos. Depois disso, o resultante foi filtrado com um disco de fibrade vidro de 1,5 cm Whatman GF/A, e o filtro foi então seco.

O filtro seco foi colocado em um tubo de teste, e 4 ml de 0,75M de ácido sulfurico foram então adicionados a este. A mistura obtida foiincubada em uma banheira de água fervente por 30 minutos. Depois disso, osobrenadante foi recuperado, e cor foi desenvolvida a partir deste ponto deacordo com o método do fenol-ácido sulfurico. Depois disso, a absorbância a485 nm foi medida usando um espectrofotômetro.

Como um resultado, a quantidade de amido contida na plantaintroduzida com PYC6 foi aumentada em 1,15 a 1,25 vezes por 40 a 70 diasdepois de inseminação (Figura 18). Foi considerado que isto foi porque acapacidade de assimilação de CO2 da planta superior introduzida com PYC6foi aumentada por introdução de PYC6 na planta superior, e a síntese deamido também foi promovida com isso.(1-5) Mensuração de quantidade de proteína

No presente exemplo, proteína foi extraída de Arabidopsisthaliana transgênica, e ela foi então quantificada pelo método de Lowry.

O peso de um corpo vegetal foi medido e registrado. Umaquantidade adequada de corpo vegetal foi colocada em um almofariz, e ela foientão suficientemente triturada com um pilão na presença de nitrogêniolíquido. A temperatura foi retornada para temperatura ambiente, e 2 ml deCelLytic P (fabricado por Sigma) foram então adicionados a 1 g do corpovegetal. A mistura obtida foi suficientemente triturada com um pilão, e oresultante foi então transferido para um tubo de teste. O tubo de teste foivirado de cabeça para baixo em temperatura ambiente por 15 minutos, deforma que a mistura pode ser misturada, seguido por centriíugação. Osobrenadante obtido foi definido como uma proteína extraída.

Subseqüentemente, as seguintes soluções foram produzidas: solução A de Lowry preparada adicionando carbonato de sódio a uma soluçãode hidróxido de sódio 0,1 N resultando em 2%; solução B de Lowry contendo0,5% de sulfato de cobre pentaidratado e 1% de citrato de sódio; solução C deLowry consistindo de uma solução de fenol 1 N; e solução D de Lowryconsistindo de solução A de Lowry e solução B de Lowry. Depois disso, 1,0 ml da solução D de Lowry foi adicionado a 0,1 ml da solução de proteínaextraída, e a mistura obtida foi então agitada usando um misturador devórtice, seguido por incubação a 30°C por 15 minutos. Subseqüentemente, 0,1ml da solução C de Lowry foi adicionado à solução de reação, e a misturaobtida foi rapidamente agitada com um misturador de vórtice. O resultante foi incubado a 30°C por 30 minutos, e a absorbância a 770 nm foi então medida.

Como um resultado, a quantidade de proteína contida na plantaintroduzida com PYC6 foi aumentada em no máximo 1,3 vezes (50 diasdepois de inseminação) (Figura 19). Foi considerado que isto foi porque ATPe NADPH aumentados por introdução de PYC6 em uma planta superiorativaram a síntese da proteína.(2) Consideração

Pela presente invenção, foi encontrado que a plantaintroduzida com PYC6 teve uma taxa de crescimento que foi maior do queaquela de WT. Foi assumido que uma vez que ATP e NADPH contidos naplanta introduzida com PYC6 foram aumentados, cyt c6 de P. yezoensisatuando como um carreador de elétrons recentemente introduzido funcionoujunto com plastocianina funcionando em A. thaliana, resultando em doisciclos de transferência de elétron em uma reação luminosa. Por conseguinte,as quantidades de ATP e NADPH como produtos finais foram aumentadas, deforma que o crescimento da planta como um todo pode ser ativado. Até omomento, um aumento na quantidade de componente de uma planta terrestredevido ao reforço de enzimas associadas com uma reação escura (Calvin-Benson ciclo) foi estudado. Entretanto, não existem casos de ativar uma reação luminosa.

Além disso, até o momento, não existem casos de introduzircyt Cô em uma planta para permitir que lê funcione nesta. Assim, os teores dapresente invenção são suficientemente aplicáveis a outros tipos de plantas nofuturo. Por conseguinte, pode ser dito que a presente invenção temversatilidade e que ela se torna uma base para um método para promover ocrescimento de uma planta útil, uma técnica de produção de planta (plantasfrutíferas, plantas de folhagem, flores reais, etc), e os semelhantes. Alémdisso, outros tipos de metabolismo também são ativados utilizando ATP eNADPH aumentados em um corpo vegetal, e assim foi considerado que a presente invenção foi extremamente efetiva para o campo de um método deeliminar contaminantes (C02, etc).APLICABILIDADE INDUSTRIAL

A presente invenção fornece um método para produzir umanova planta superior tendo citocromo no espaço tilacóide de cloroplasto. Apresente invenção também fornece um método para promover o crescimentode uma planta superior, um método para promover a síntese de ATP,NADPH, um amido, e uma proteína, e um método para promover fixação decarbono.

Além disso, a presente invenção fornece adicionalmente umaproteína citocromo c6 adicionada com peptídeo sinal que pode sertransportada para o espaço tilacóide de cloroplasto, um gene codificando aproteína acima, um vetor recombinante compreendendo o gene acima, umtransformante compreendendo o vetor recombinante acima, e uma plantasuperior transgênica que é obtida introduzindo o gene acima no genomavegetal desta.

Texto Livre de Listagem de Seqüências

SEQ ID NO: 7 - Iniciador

SEQ ID NO: 8 - Iniciador

SEQ ID NO: 9 - Iniciador

SEQ ID NO: 10-Iniciador

SEQ ID NO: 11 - IniciadorLISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Nihon University<120> MÉTODO PARA CONSTRUIR NOVA PLANTA SUPERIOR E MÉTODO PARA PROMOVER OCRESCIMENTO DE PLANTA SUPERIOR

<130> G07-0044<140> PCT/JP2006/302104<141> 2006-02-01<150> JP 2005-027012<151> 2005-02-02<160> 12<170> Patentln versão 3.1<210> 1<211> 258<212> DNA<213> Porphyra yezoensis<220><221> CDS<222> (1)..(258)<223><400> 1 <table>table see original document page 84</column></row><table>

aaa gat gta ctt gaa gct aat agt atg aat act att gat gct att act 144Lys Asp Vai Leu Glu Ala Asn Ser Met Asn Thr lie Asp Ala lie Thr

35 40 45

tat caa gta caa aat ggt aaa aat gcc atg cct gct ttc gga ggt aga 192Tyr Gln Vai Gln Asn Gly Lys Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg

50 55 60

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<210> 2<211> 85<212> PRT<213> Porphyra yezoensis

<400> 2

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<210> 3

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<213> Porphyra yezoensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(216)

<223>

<400> 3

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35 40 45

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<212> DNA

<213> Porphyra yezoensis

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<223>

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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<213> Porphyra yezoensis<400> 6

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<210> 7<211> 30<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador<400> 7

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<212> DNA

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<223> Iniciador

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<210> 9

<211> 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 10

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<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 11

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<213> Porphyra yezoensis<400> 12

Ala Asp Leu Asp Asn Gly Glu Lys Vai1 5

24

24

31

Phe10

Claims (15)

1. Método para produzir uma planta superior tendo citocromoc6 no espaço tilacóide de cloroplasto, caracterizado pelo fato de compreenderintroduzir um gene codificando uma proteína de fusão adicionando umpeptídeo sinal consistindo de 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteínacitocromo c6 no genoma de uma planta superior.

2. Método para promover o crescimento de uma plantasuperior, caracterizado pelo fato de compreender introduzir um genecodificando uma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinal consistindode 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo no genomade uma planta superior, de forma a permitir que o gene seja expresso nessa, epermitindo que citocromo c6 exista no espaço tilacóide de cloroplasto.

3. Método para promover a síntese de pelo menos umselecionado a partir do grupo consistindo do ATP, NADPH, amido, e proteínade uma planta superior, caracterizado pelo fato de compreender introduzir umgene codificando uma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinalconsistindo de 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo c6no genoma de uma planta superior, de forma a permitir que o gene sejaexpresso nessa, e permitindo que citocromo exista no espaço tilacóide decloroplasto.

4. Método para promover fixação de carbono por uma plantasuperior, caracterizado pelo fato de compreender introduzir um genecodificando uma proteína de fusão adicionando um peptídeo sinal consistindode 50 a 80 resíduos de aminoácidos a uma proteína citocromo c6 no genomade uma planta superior, de forma a permitir que o gene seja expresso nessa, epermitindo que citocromo c6 exista no espaço tilacóide de cloroplasto.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que dita proteína de fusão é a proteína descritanos seguintes (a), (b), (c), ou (d):(a) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO: 2;(b) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo a dito peptídeo sinal na seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade de passar através doenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de uma planta superior;(c) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo à dita proteína citocromo c6 na seqüência de aminoácidoscomo mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade de transferirelétrons; e(d) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a cada uma de uma porção de seqüência deaminoácidos correspondendo a dito peptídeo sinal e uma porção de seqüênciade aminoácidos correspondendo à dita proteína citocromo c6 na seqüência deaminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade depassar através do envelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de umaplanta superior e capacidade de transferir elétrons.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dito gene é um gene compreendendo o DNAdescrito nos seguintes (a) ou (b):(a) DNA tendo a seqüência de nucleotídeos como mostrado emSEQIDNO:l;e(b) DNA, que hibridiza com DNA tendo uma seqüência denucleotídeos complementar ao DNA tendo a seqüência de nucleotídeos comomostrado em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, e que codifica umaproteína tendo capacidade de passar através do envelope de cloroplasto emembrana de tilacóide de uma planta superior e capacidade de transferirelétrons.

7. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de ser formadaadicionando um peptídeo sinal consistindo de 50 a 80 resíduos deaminoácidos a uma proteína citocromo c^.

8. Proteína de fusão de acordo com reivindicação 7,caracterizada pelo fato de ser a proteína descrita nos seguintes (a), (b), (c), ou(d):(a) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO:2;(b) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo a dito peptídeo sinal na seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade de passar através doenvelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de uma planta superior;(c) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a uma porção de seqüência de aminoácidoscorrespondendo à dita proteína citocromo c6 na seqüência de aminoácidoscomo mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade de transferirelétrons; e(d) uma proteína, que tem uma seqüência de aminoácidoscompreendendo uma deleção, substituição, ou adição de um ou diversosaminoácidos com respeito a cada uma de uma porção de seqüência deaminoácidos correspondendo a dito peptídeo sinal e uma porção de seqüênciade aminoácidos correspondendo à dita proteína citocromo cs na seqüência deaminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2, e que tem capacidade depassar através do envelope de cloroplasto e membrana de tilacóide de umaplanta superior e capacidade de transferir elétrons.

9. Gene, caracterizado pelo fato de codificar a proteína defusão como definida na reivindicação 7 ou 8.

10. Gene, caracterizado pelo fato de compreender o DNAdescrito nos seguintes (a) ou (b):(a) DNA tendo a seqüência de nucleotídeos como mostrado emSEQ ID NO: 1; e(b) DNA, que hibridiza com DNA tendo uma seqüência denucleotídeos complementar ao DNA tendo a seqüência de nucleotídeos comomostrado em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, e que codifica umaproteína tendo capacidade de passar através do envelope de cloroplasto emembrana de tilacóide de uma planta superior e capacidade de transferirelétrons.

11. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato decompreender o gene como definido na reivindicação 9 ou 10.

12. Transformante, caracterizado pelo fato de ser obtidointroduzindo o vetor recombinante como definido na reivindicação 11 em umhospedeiro.

13. Transformante de acordo com reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o hospedeiro é um microorganismopertencendo ao gênero Agrobacterium.

14. Planta superior transgênica, caracterizada pelo fato de serobtida introduzindo o gene como definido na reivindicação 9 ou 10 nogenoma vegetal desta.

15. Planta superior transgênica de acordo com reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ter citocromo no espaço tilacóide decloroplasto em uma célula vegetal desta.