BRPI0511372B1 - Produto para inibição do crescimento de bactérias de cárie dentária, e, método para fabricar um produto - Google Patents
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Abstract
seleção e uso de bactérias de ácido lático para redução de cárie dentária e de bactérias causadoras da cárie dentária. novas linhagens de lactobacilius que foram selecionadas por sua capacidade de redução aprimorada do número de streptococcus mutans na boca de mamíferos por meio da atividade de inibição, em combinação com ligação melhor às mucinas orais e à placa dentária, prevenindo, reduzindo ou tratando a cárie dentária, e produtos derivados dessas linhagens citadas, incluindo agentes para tratamento ou profilaxia de cárie para administração em humanos.
Description
[0001] Esta é uma continuação parcial do requerimento pendente da Patente Norte-americana de n° de série 10/353,407, preenchido em 29 de janeiro de 2003, cuja divulgação está incluída para referência.
[0002] Esta invenção está relacionada ao uso de grupos de bactérias de ácido lático anticariogênico e produtos e métodos que usam tais grupos, mutantes e metabólitos e seus componentes para tratamento e profilaxia de cárie dentária causada por bactérias orais como Estreptococos mutans e outras patogêneses causadoras da cárie.
[0003] A cavidade oral de humanos e outros mamíferos contém muitas espécies diferentes de bactérias, incluindo várias espécies de Lactobacillus.A cárie é uma doença causada por bactérias. Já em 1890, Miller em "Chemico- Parasitic Theory"apresentou a hipótese de a cárie ser causada por bactérias orais que produzem ácidos provenientes de carboidratos digestivos, que dissolverão a hidroxiapatita dos dentes. Posteriormente foi confirmado em ratos gnotobióticos, por exemplo, que a flora bacteriana oral normal, principalmente do grupo de estreptococos mutans e, em segundo lugar, o grupo de lactobacillus estão envolvidos na produção da cárie. Essas espécies “acidogênicas” residentes na cavidade oral estão associadas à presença e ao ataque de cárie dentária (Locsche WJ, Microbiolog Rev.,1986:50:353-380). Há sete espécies bacterianas dentro dos estreptococos mutans do grupo, em que Streptococci mutans(serotype c, e,f) são encontrados em 90% de todos os humanos isolados (Linder L. , Oral Mikrobiologi 1996, ISBN 91-7205-037- 3). Existe evidência numerosa de que o início da cárie requer uma proporção relativamente alta de S. mutans dentro da placa dentária. Essas bactérias aderem bem à superfície do dente, produzem quantidades elevadas de ácido de açúcares além de outros tipos bacterianos, podem sobreviver melhor do que outras bactérias em um ambiente ácido e produzir polissacarídeos extracelulares da sucrose.
[0004] Quando a proporção de S. mutans na placa é elevada (na faixa de 2-10%), um paciente tem alta probabilidade de desenvolver cárie. Quando a proporção é baixa (menos de 0,1%), o paciente tem baixa probabilidade. Como elas são mais tolerantes ao ácido do que outras bactérias, as condições de ácido na placa favorecem a sobrevivência e a reprodução de estreptococos mutans.
[0005] Dois outros tipos de bactérias também estão associados ao avanço da cárie através da dentina. Elas são várias espécies de Lactobacilluse Actinomyces viscosus.
[0006] Essas bactérias também são altamente acidogênicas e sobrevivem bem nas condições ácidas. O envolvimento dos Lactobacillusna cárie dentária foi determinado (Smith et al., Microbios 105: 77-85,2001). Na verdade, a estimativa de contagens de lactobacillus na saliva, além da estimativa de contagens de estreptococos mutans, usando diferentes meios seletivos ou outras técnicas, foi usada por muitos anos como um “teste de cárie” e como uma maneira de tentar identificar grupos com alto risco de cárie. Portanto, as linhagens de Lactobacillus,alguns isolados da placa dentária humana, podem ser altamente cariogênicos (Fitzgerald et al., J. Dent. Res. 60: 919-926,1981.
[0007] Para que uma bactéria seja uma patogênese primária na formação de cárie dentária, é necessário que haja uma combinação de várias características requeridas (Linder, 1996): capacidade de aderir e colonizar a superfície dos dentes; capacidade de acumular grandes quantidades em uma superfície limitada dos dentes; capacidade de produzir rapidamente o ácido de carboidratos encontrados nos alimentos; e capacidade de continuar a produção de ácido mesmo sob baixo pH na placa dentária.
[0008] A sucrose dietética altera a espessura e natureza química da placa. Os estreptococos mutans e algumas outras bactérias de placa usam os componentes monossacarídeos (glucose e frutose) e a energia da ligação de dissacarídeos de sucrose para montar os polissacarídeos extracelulares. Isso aumenta a espessura da placa consideravelmente e também altera a natureza química de sua área extracelular de líquido para gel. O gel limita o movimento de alguns íons. A placa de gel espessa permite o desenvolvimento de um ambiente ácido contra a superfície dos dentes, protegida contra o tamponamento salivar. A placa que não tem contato com a sucrose é mais fina e mais bem tamponada. Uma dieta com uma proporção elevada de sucrose aumenta o risco de cárie. A placa mais espessa ocorre em buracos e fissuras e, em pacientes com higiene oral precária, próxima à gengiva.
[0009] Em razão desse conceito da natureza da doença, fica claro que a prevenção e o tratamento da cárie dentária requer o impedimento dos efeitos do S. mutans, por exemplo, por intermédio de alteração dietética como meio de reduzir o substrato para as bactérias, para reforçar a estrutura da superfície dos dentes ou a redução do número de bactérias S. mutans. Portanto, os tratamentos experimentados incluem: esforços de alteração de microflora, usando agentes como clorohexina e fluoreto tropical; redução da quantidade de sucrose dietética, por alteração dietética e substituição dos adoçantes mais difíceis de metabolizar pela S. mutans, como Sorbitol, Aspartano, Xilitol; reduzindo a freqüência alimentar, por escolha dietética; acrescentando fluoreto, particularmente por meio de aplicação diária durante a escovação dos dentes; e aumentando o fluxo salivar, usando estimulação mecânica durante vigorosa mastigação para aprimorar o fluxo, alterando drogas que reduzem o fluxo ou usando drogas que aprimoram o fluxo.
[0010] Diferentes abordagens foram avaliadas para a prevenção de cárie dentária, por exemplo, uma composição usa uma enzima lítica produzida por um bacteriófago específico para Streptococcus mutans (Patente Norte- americana n° 6,399,098 de Fischetti et al). Além disso, uma linhagem de Lactobacillus zeae foi modificada por meio de engenharia genética para produzir um anticorpo em sua superfície a fim de neutralizar as bactérias estreptococos prejudiciais, (Hammarstrom L., edição de julho de 2002 da Nature Biotechnology); contudo, essa abordagem com organismos modificados geneticamente enfrenta uma situação de aprovação segura desconhecida.
[0011] Além disso, uma linhagem de Lactobacillus rhamnosus (ATCC 53013, linhagem GG) foi promovida como um método probiótico de redução de Streptococcus sabrinus e estreptococos mutans (Nase et al., Caries Res. 35: 412-420, 2001). O trabalho adicional mostrou que o uso dessa linhagem como um iniciador na fermentação do leite não influenciou o titer de anticorpos em relação às bactérias cariogênicas humanas que estavam presentes no leite (Wei et al., Oral Microbio. &Immunol. 17:9-15, 2002). L.rhamnosus GG difere de L. reuteri de várias maneiras, incluindo características de fermentação e a origem do isolamento. Outros microorganismos que apresentaram atividade inibitória contra a formação de placa dentária incluem Enterococcus, Lactobacillus acidophilusV20 e Lactobacillus lactis 1370 (Oh, Patente Norte-americana N°. 6,036,952). Para inibir a S.mutans, outro trabalho foi realizado usando os conceitos conhecidos como “exclusão competitiva”. Por exemplo, a linhagem ATCC 55730 de L.reuteri apresentou inibição da S. mutans (Nikawa H. et al, notícia divulgada pela Hiroshima University em 11 de julho de 2002). Um tablete, atualmente no mercado japonês, chamado LSI, contendo uma linhagem de Lactobacillus salivarius (LS 1) (produzido pela Frente Ltd.Japan) deve inibir a S. mutans.
[0012] As linhagens de uma ampla variedade de espécies de Lactobacillus,incluindo Lactobacillus reuteri, foi usada em formulações probióticas. O Lactobacillus reuteri é um dos habitantes naturais do trato gastrointestinal de animais e é rotineiramente encontrado nos intestinos e, ocasionalmente, no canal de nascimento, no leite materno e na boca de animais sadios, incluindo humanos. É conhecido pela existência de atividade antibacteriana. Consulte, por exemplo, as Patentes Norte-americanas N°s. 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238 e 5,849,289. Quando as células L. reuteri crescem sob condições anaeróbicas na presença de gliceróis, elas produzem a substância antimicrobiana conhecida como reuterina, (β-hidroxi- propionaldeído). Outras substâncias antimicrobianas além dos ácidos orgânicos tradicionais também foram relatadas como "Reutericiclina"(Holtzel, A. et al. Angewandte Chemie International Edition 39, 2766-2768, 2000) e "PCA (pyroglutamic acid) ’’ (Yang, Z. Dissertation, Univ, of Helsinki, March 2000) e "Reutericin 6" (Toba T, et al., Lett Appl Microbiol 13: 281-6. ). Os lactobacillus, incluindo de L. reuteri, também são bem conhecidos por ter a capacidade de inibir outros organismos como S. mutans por meio de competição local de nutrientes e outras interações metabólicas.
[0013] A mucina que liga as proteínas de L. reuteri foram isoladas e descritas. Consulte, por exemplo, a Patente Norte-americana N°. 6,100,388. As linhagens de Lactobacillusforam relatadas como aderentes às várias linhas de células e ao muco hospedeiro. Isso foi especulado como importante para a atividade probiótica e é derivado do conceito de fatores de virulência nas bactérias patogênicas, em que grandes variedades dessas interações foram descobertas durante as últimas décadas (Klemm, P. and Schembri, M. A. (2000) Bacterial adhesins: Contudo, não é de muito conhecimento que haja importantes diferenças entre as linhagens de um Lactobacillusdurante a aderência à mucina oral e à mucina de outras origens. Algumas linhagens são ideais na aderência da mucina oral e de outra mucina, por exemplo, mucina gástrica, outras são ideais na aderência da mucina gástrica, mas menos eficazes na mucina oral, outras não aderem bem a nenhum tipo de mucina. Portanto é parte do método de seleção desta invenção o uso de mucina oral para localizar as melhores linhagens.
[0014] Embora a possibilidade de atividade antibacteriana efetiva e de algumas características de ligação pelo L. reuteri seja conhecida, e os efeitos de inibição da S. mutans pela linhagem ATCC 55730 de L. reuteri e LactobacillusGG ATCC 53103 também sejam conhecidos, e algumas outras bactérias de ácido lático tenham sido consideradas anticariogênicas, não foi previamente constatada a existência de diferenças consideráveis entre as linhagens dos lactobacillus na sua capacidade de reduzir o número de estreptococos mutans na cavidade oral e, conseqüentemente, as cáries e essas linhagens não puderam ser selecionadas.
[0015] Portanto, é objeto da invenção fornecer melhores linhagens de Lactobacillusque foram selecionados por sua capacidade em reduzir o número de S. mutans na boca por intermédio da atividade antimicrobiana em combinação com as capacidades ideais de aderência à mucina oral e, portanto, prevenir, reduzir ou tratar a cárie dentária com êxito. É também objetivo da invenção fornecer produtos que contenham as linhagens citadas, mutantes, metabólitos ou seus componentes, incluindo agentes para administração em humanos.
[0016] Outros objetivos e vantagens serão mais completamente aparentes com base na seguinte divulgação e reivindicações anexas.
[0017] A invenção incluída aqui consiste em linhagens de Lactobacillus que foram selecionadas por sua capacidade de redução do número de Streptococcus mutans na boca de mamíferos por meio da atividade de inibição, incluindo mutantes, metabólitos e seus componentes, em combinação com ligação ideal do Lactobacillusà mucina oral e placa dentária para prevenção, redução ou tratamento da cárie dentária, e produtos derivados dessas linhagens citadas, incluindo agentes para tratamento ou profilaxia de cárie para administração em humanos.
[0018] Outros objetivos e recursos das invenções serão mais completamente aparentes com base na seguinte divulgação e reivindicações anexas.
[0019] A presente invenção fornece um produto para inibir o crescimento e a atividade das bactérias da cárie dentária, consistindo em células ou metabólitos ou componentes de pelo menos uma linhagem selecionada de Lactobacilluscom atividade antimicrobiana ideal contra Streptococcus mutans ecaracterísticas de ligação ideal à mucina oral e prevenir, reduzir ou tratar á cárie dental. Essas linhagens incluem L. reuteri CF2-7F (ATCC PTA-4965), L. reuteri MF2-3 (ATCC PTA-4964) e especialmente L. reuteri FJ1 "Prodentis" (ATCC PTA-5289) e E. reuteri FJ3 (ATCC PTA-5290). Essas linhagens estão disponíveis ao público no American Type Culture Collection (Rockville, MD), as duas mais recentes foram depositadas em 29 de julho de 2003.
[0020] No método de seleção usado aqui, os efeitos de inibição de Streptococci mutans são examinados por métodos microbiológicos tradicionais com as células bacterianas, bem como separadamente, analisando a inibição por metabólitos secretados e componentes no sobrenadante das linhagens de teste crescidas, medida por um método de determinação do nível de ATP (trifosfato de adenosina) de Streptococcus mutans que correlaciona bem o volume total de células de células S. mutans viáveis, (ref. Nikawa. H. et al. Journal of Dentistery, Vol 26, No 1, pp. 31-37,1998). As capacidades de aderência são medidas usando mucina oral coberta em poços de microtiter (ref. Jonsson et al. 2001 FEMS Microbiol, lett. 204: 19-22). O motivo para também se testar a inibição e a aderência pelos metabólitos secretados e os componentes da célula é que a presente invenção também poderia ser usada com células não viáveis ou partes de células mortas, realizando os critérios de seleção.
[0021] Os detalhes serão mais claramente compreendidos nos Exemplos.
[0022] O produto da invenção pode ser qualquer produto para colocação na boca como prevenção ou tratamento para cárie dentária ou para fins nutricionais ou de hálito, como produtos alimentícios, produtos de tratamento dentário como enxaguatórios bucais ou outros produtos de saúde especificados, goma de mascar, pastilhas expectorantes e similares. Produtos alimentícios particularmente para o uso na invenção incluem produtos contendo leite, como iogurte, e também sucos, bebidas e similares. Os produtos de tratamento dentário que podem ser usados na invenção incluem cremes dentais, limpadores líquidos para dente, enxaguatórios bucais, produtos anti-halitose e similares.
[0023] A concentração de células de Lactobacillus,metabólitos ou seus componentes selecionados necessários para a eficácia de um produto da invenção depende do tipo de alimento e da quantidade de alimento a ser ingerida (ou do tempo de uso na boca de um produto para tratamento dentário, não alimentício), mas, de preferência, é melhor ter o equivalente a aproximadamente 105-l O8 CFU (unidades formadoras de colônia) ou mais de acordo com a ingestão diária de um produto. Quantidades de aproximadamente 101010n CFU são possíveis e podem ser usadas para aumentar a eficácia sem afetar de maneira adversa as características organolépticas do produto (seu sabor ou aroma). Quando o produto é iogurte ou outro produto de fermentação lática, a(s) linhagem(ens) de fermentação de ácido lático usada para produzir o produto seria preferencialmente culturas padrão para essa finalidade específica, e a bactéria anticariogênica, ou os metabólitos ou seus componentes, da invenção pode ser acrescentada antes ou depois da fermentação do produto em um nível equivalente de aproximadamente 106-108 CFU por dia, servindo iogurte ou mais, conforme descrito anteriormente.
[0024] Preferencialmente, o produto da invenção não contém outros componentes antibacterianos, pelo menos nenhum que iniba ou mate a(s) linhagem(ens) de Lactobacillusselecionadas, metabolites ou seus componentes, ou interfira na atividade anticariogênica.
[0025] A(s) linhagem(ens) de Lactobacillus,ou metabolites ou seus componentes, pode(em) ser um aditivo misturado nos ingredientes ou amassado em ou cobrir o produto por meios conhecidos na arte para formulação de produtos desse tipo. Quando usar células e se a preparação do alimento selecionado ou outro produto da invenção requerer uma etapa de aquecimento, a(s) linhagem(ens) de Lactobacillusserá(ão) acrescentada(s) após o aquecimento. Depois que as células de Lactobacillusselecionadas estiverem no produto, será preferível não aquecer o produto a 60-70 °C ou mais por um período mais longo.
[0026] Os recursos da presente invenção serão mais claramente compreendidos ao consultar os exemplos a seguir, que não devem ser considerados como limitadores da invenção.
[0027] A seleção das linhagens de Lactobacillusa serem usadas de acordo com esta invenção pode ser feita das três maneiras a seguir:
[0028] Um exemplo de uma linhagem para uso na medição do efeito inibitório é o Streptococcus mutans, ATCC25175 (disponível pelo The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). O isolado cresce em caldo tripticase de soja (Difco, Detroit, USA) suplementado com 0,5% de extrato de levedura (Difco) (TSBY). As células são colhidas durante a fase de crescimento exponencial por centrifugação a 1000 x g, lavadas duas vezes com PBS e suspensas novamente no mesmo tampão. As suspensões de célula estão sujeitas a um dispositivo ultrassónico de baixa densidade para dispersar os agregados bacterianos.
[0029] A linhagem de Lactobacillusde teste é desenvolvida em caldo MRS (Difco), e colhida durante a fase de crescimento exponencial por centrifugação a 1000 x g, lavada duas vezes com salina tamponada de fosfato (PBS; pH 6,8) e suspensa novamente no mesmo tampão.
[0030] As densidades óticas das suspensões bacterianas são medidas em uma cubeta de 1,0 ml com 1 cm de light path (caminho de luz), e as suspensões são ajustadas a uma concentração final de 1,0 x 108 CFU (Colony Forming Unit, Unidade Formadora de Colônia)/ml.
[0031] O ensaio inibitório é conduzido como segue, a suspensão de S. mutans e a suspensão de Lactobacillus são misturadas nas proporções de 100- 0, 75-25, 50-50 e 25-75 no tubo de centrifugação estéril (volume total de 100 pL), o caldo BHI acrescentado em até 10 ml, o vórtice é misturado por dez segundos e incubado por 90 min a 37°C com agitação moderada. Como um controle, a suspensão de s. mutans é misturada com um volume igual de PBS nos tubos de controle (livre de Lactobacillus').Posteriormente, cada suspensão é lavada por centrifugação a 1000 x g, lavada duas vezes com PBS e colocada em lâmina no ágar MS para determinar a contagem de CFU de S. mutans. O percentual de sobrevivência de S. mutans é obtido pela fórmula a seguir. CFU de S. mutans incubada com Lactobacillus x 100 % sobrevivência de S. mutans =CFU de S. mutans incubada com PBS
[0032] O ensaio deve ser executado com o mínimo de amostras triplicadas. Todos os dados numéricos obtidos devem ser estatisticamente analisados.
[0033] Também usado aqui como um exemplo de uma linhagem para uso na medição do efeito inibitório é o Streptococcus mutans, ATCC25175 (disponível pelo The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). O isolado cresce em caldo tripticase de soja (Difco, Detroit, USA) suplementado com 0,5% de extrato de levedura (Difco) (TSBY). As células são colhidas durante a fase de crescimento exponencial por centrifugação a 1000 x g, lavadas duas vezes com PBS e suspensas novamente no mesmo tampão. As suspensões de célula estão sujeitas a um dispositivo ultra-sônico de baixa intensidade para dispersar os agregados bacterianos e ajustadas à concentração final de 108 CFU/mL.
[0034] A linhagem de Lactobacillusde teste é desenvolvida em caldo MRS (Difco), colhida durante a fase de crescimento exponencial por centrifugação a 1000 x g, lavada duas vezes com salina tamponada de fosfato (PBS; pH 6,8) e suspensa novamente no mesmo tampão.
[0035] As densidades óticas das suspensões bacterianas são medidas em uma cubeta de 1,0 ml com 1 cm de light path (caminho de luz), e as suspensões são ajustadas a uma concentração final de 1,0 x 108 CFU/ml. 100 pL da suspensão de lactobacillus foram acrescentados a 2,0 mL de caldo MRS e incubados a 37°C por 48h com agitação recíproca (120 rpm). Depois da incubação, as células de lactobacillus foram removidas por centrifugação, e o sobrenadante resultante foi filtrado (poro com o tamanho de 0,25 pm).
[0036] O ensaio inibitório foi conduzido como segue. 100 pL da suspensão de S. mutans foram acrescentados a 1,0 mL de TSBY e 1,0 mL dos sobrenadantes de cada linhagem testada de lactobacillus foi misturado e incubado por 24h a 37°C com agitação recíproca (120 rpm). Como um controle, a suspensão de S. mutans foi misturada com um volume igual de MRS nos tubos de controle (livre de sobrenadantes provenientes dos lactobacillus). Posteriormente, cada suspensão foi lavada por centrifugação a 1000 x g, lavada duas vezes com PBS, e a quantidade de trifosfato de adenosina de S. mutans crescida foi determinada usando o método descrito emNikawa. H. et al. Journal of Dentistery, Vol 26, Nol, pp. 31-37, 1998.
[0037] As linhagens de Lactobacillusa serem testadas são coletadas. As bactérias crescem a 37°C no caldo MRS (Difco) por 16h. As placas são incubadas em jarras anaeróbicas sob atmosfera CO2+N2 (GasPak System, BBL, Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA).
[0038] O muco oral, como a saliva humana, é coletado, centrifugado, esterilizado, filtrado e revestido nos poços de microtiter conforme descrito. O muco é coletado em 200 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) em gelo (8,0g NaCl, 0,2 g KC1, 1,44 g Na2HPO42H2O e 0,2 g KH2PO4 por 1000 ml de dl-LO) suplementado com 0,05% Tween 20 (PBST). A suspensão resultante é centrifugada primeiro a 11000g por 10 min e, em seguida, a 26000g por 15 minutos para remover as células e o material particulado. Uma mucina alternativa é a mucina gástrica (Sigma, Ml778) usada. A preparação do muco bruto é armazenada a 20°C. O material do muco é diluído em aproximadamente 100 pg ml-1 em 50 mM de tampão Na2CO3, pH 9,7 e incubado durante a noite em poços de microtiter (Greiner) (150 pl por poço) a 4°C com rotação lenta. Os poços são bloqueados com PBS com 1% Tween 20 por lh e, em seguida, lavados com PBST. Os poços revestidos com BSA são usados como controles.
[0039] As linhagens a serem testadas crescem conforme a informação acima, lavadas uma vez com salina tamponada com fosfato (PBS) (Ph 7,3), suplementadas com 0,05% Tween 20 (PBST) e diluída em 0,5 ODooo no mesmo tampão. A suspensão bacteriana com cem microlitros é acrescentada a cada poço e incubada durante a noite a 4°C. Os poços são lavados 4 vezes com PBST, e a ligação é examinada com um microscópio invertido. O tampão é decantado, depois de os poços terem secado, a ligação é medida em toda a superfície do poço em um instrumento BioRad Gel Doc 2000 (BioRad Laboratories, Herkules, CA, USA). Todas as medidas são feitas em triplicata.
[0040] São selecionadas as linhagens de Lactobacillusque mostram os melhores resultados na inibição de S. mutans, usando células de Lactobacillus e inibindo S. mutans, usando metabólitos e componentes do Lactobacillus citado, bem como melhores resultados na aderência à mucina oral, de acordo com os ensaios. Exemplo 2 - Seleção das linhagens 1. L. reuteri SD2112 (ATCC 55730) 2. L. reuteri DSM 20016 (DSM 20016) 3. L.reuteri MM2-3 (ATCC PTA-4659) 4. L. reuteri CF2-7F (ATCC PTA-4965) 5. L. reuteri MF2-3 (ATCC PTA-4964) 6. L. reuteri MF 14-C (Culture collection of Biogaia AB, Raleigh NC, USA) 7. L. reuteri MF52-1F (Culture collection of Biogaia AB, Raleigh NC, USA) 8. L. reuteri MM7 (Culture collection of Biogaia AB, Raleigh NC, USA) 9. L. reuteri FJI, "Prodentis" (ATCC PTA-5289) 10. L. reuteri FJ3 (ATCC PTA-5290). 11. L. salivarius LS 1 (isolada do tablete LS 1 pela Frente Ltd. Japan) 12. L. rhamnosus GG (ATCC 53103)
[0041] Nesse estudo, as linhagens de Lactobacillusrelacionadas acima são escolhidas para serem avaliadas usando os critérios de seleção da inibição de S. mutans e aderência à mucina oral, os métodos divulgados no Exemplo 1 são usados. São selecionadas as linhagens de Lactobacillusque mostram os melhores resultados na inibição de S. mutans, usando células de Lactobacillus e inibindo S. mutans, usando metabólitos e componentes do Lactobacillus citado, bem como melhores resultados na aderência à mucina oral, de acordo com os ensaios. Os resultados da inibição são mostrados na Tabela 1, e os resultados da aderência são mostrados na Tabela 2. Tabela 1: Inibição de S. mutans de linhagens de Lactobacillus como células, bem como com sobrenadantes dos Lactobacillus citados de acordo com os ensaios descritos. (S = selecionado) Tabela 2: Aderência de linhagens de Lactobacillus de acordo com os ensaios descritos. (S = selecionado) (FS = Finalmente selecionado)
[0042] Neste exemplo, a L. reuteri FJ1 "Prodentis" (ATCC PTA-5289) é selecionada geralmente com base nas características de crescimento ideais e nos resultados favoráveis na seleção mencionada anteriormente no Exemplo 2, usando os métodos anteriores para a inibição de S. mutans e ligação de mucina, para acrescentar a linhagem à goma de mascar. A linhagem de L. reuteri cresce e é liofilizada, usando métodos padrão para crescimento de Lactobacillus no setor.
[0043] A seguir, as etapas de um exemplo de um processo de fabricação de goma de mascar contendo a linhagem selecionada, em que excipientes, recheios, aromatizantes, encapsuladores, lubrificantes, agentes antiendurecimento, adoçantes e outros componentes de produtos de goma de mascar, conforme conhecido na arte, podem ser usados sem afetar a eficácia do produto: 1 Derretimento. Derreter Softisan 154 (SASOL GMBH, Bad Homburg, Alemanha) em um recipiente e aquecê-lo a 70°C para assegurar a completa a quebra da estrutura cristalina. Em seguida, resfriá-lo a 52-55°C (pouco acima do seu ponto de endurecimento). 2 Granulação. Transferir o pó seco e congelado de Lactobacillus reuteri para um triturador/granulador de alto corte Diosna ou equivalente. Adicionar lentamente durante aproximadamente 1 minuto o Softisan 154 derretido ao pó de Lactobacillus reuteri. Não é necessário nenhum período para constituição da massa. Use um cortador durante a adição. 3 Peneiração molhada. Imediatamente após a granulação, passe os grânulos através de uma peneira de 1 mm, usando um misturador Tornado. O granulado peneirado é embalado em sacos de alumínio, feitos de chapa de alumínio revestida de PVC, selados com selador térmico para criar um saco, juntamente com o saco de dessecante e armazenado em refrigeração até a mistura. O lote granulado é dividido por dois lotes de tabletes. 4 Mistura. Misture todos os ingredientes em um misturador para obter uma mistura homogênea. 5 Compressão. Transfira a mistura final para o depósito alimentador de uma prensa de tablete giratória e comprima os tabletes com um peso total de 765 mg, em um compressor Kilian. 6 Empacotamento de volume. As gomas de mascar são empacotadas em sacolas de alumínio com um saco de secagem de peneira molecular. O saco de alumínio é colocado em um balde plástico e armazenado em um local frio por pelo menos uma semana, antes da embalagem final.
[0045] Neste exemplo, a cultura de L. reuteri selecionada é adicionada conforme citado anteriormente em um nível de 107 CFU/grama de produto, e a goma de mascar usada por seres humanos como via de prevenir a cárie. O uso de SOFTISAN™, um óleo de palma hidrogenado, permite que as células de Lactobacillussejam encapsuladas na gordura e protegidas do ambiente e ainda é outro aspecto particularmente exclusivo da representação preferida desta invenção.
[0046] Conforme afirmado anteriormente, o produto da invenção pode estar em outras formas, além de goma de mascar, e os métodos padrão de preparação do produto básico como são conhecidos na arte são usados de maneira útil para preparar o produto da invenção, inclusive a cultura de L. reuteri.
[0047] Embora determinadas representações tenham sido estabelecidas aqui, os especialistas na arte perceberão de imediato que podem ser feitas modificações sem se afastar do princípio ou do escopo da invenção.
Claims (9)
1. Produto para inibição do crescimento de bactérias de cárie dentária, caracterizado pelo fato de que compreende células de pelo menos uma linhagem de Lactobacillus reuteri selecionadas para apresentar atividade inibitória contra a bactéria cariogênica em combinação com a ligação ideal às mucinas orais, na qual o produto é selecionado do grupo constituído por geleia, pudim, goma de mascar, pastilha, bala, chocolate, bolacha, biscoito, chá, produto que contem leite e um produto de tratamento dentário e em que pelo menos uma linhagem ser selecionada do grupo que consiste em: Linhagem de Lactobacillus reuteri FJ1 "Prodentis" (ATCC PTA-5289) e linhagem de Lactobacillus reuteri FJ3 (ATCC PTA-5290).
2. Produto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto contendo leite é iogurte ou queijo.
3. Produto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto de tratamento dentário é um enxaguatório bucal.
4. Método para fabricar um produto, caracterizado por consistir de: a) cultivar uma cultura biologicamente pura de linhagem de Lactobacillus reuteri FJ1 "Prodentis" (ATCC PTA-5289), e/ou linhagem de Lactobacillus reuteri FJ3 (ATCC PTA-5290); b) liofilizar as células da cultura biologicamente pura da linhagem de Lactobacillus reuteri FJ1 "Prodentis" (ATCC PTA-5289) e/ou linhagem de Lactobacillus reuteri Fj3 (ATCC PTA-5290) da etapa a; e c) adicionar o referido material liofilizado da etapa b) a um produto, em que o produto é selecionado do grupo constituído por iogurte, geleia, pudim, goma de mascar, pastilha, doce, chocolate, bolacha, biscoito, queijo, suco e chá.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o produto alimentar é um produto que contem leite.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o produto é um produto de tratamento dentário.
7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o produto é um enxaguatório bucal.
8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células de Lactobacillus são encapsuladas no produto.
9. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células de Lactobacillus são encapsuladas no óleo de palma hidrogenado, no produto.
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