BRPI0510269B1 - Composições de dalbavancina para o tratamento de infecções bacterianas - Google Patents

Abstract

composições de dalbavancina para o tratamento de infecções bacterianas a invenção proporciona métodos e composições para o tratamento de infecções bacterianas. a composição pode ser uma combinação de fatores, os quais incluem a~ 0~, a~ 1~, b~ 1~, b~ 2~, c~ 0~, c~ 1~, isob~ 0~, e mag, na presença de solvente em baixo nível. os métodos da invenção incluem a administração de formulações de dalbavancina para o tratamento de uma infecção bacteriana, em particular uma infecção por bactérias gram-positivas da pele e do tecido mole, os regimes de dosagem incluem a administração de doses múltiplas de dalbavancina, a qual freqüentemente permanece em níveis terapêuticos na corrente sanguínea por pelo menos uma semana, proporcionando ação terapêutica prolongada contra una infecção bacteriana. os regimes de dosagem para pacientes renais estão também incluídos.

Description

COMPOSIÇÕES DE DALBAVANCINA PARA

O TRATAMENTO DE

INFECÇÕES,BACTERIANAS

CAMPO DA INVENÇÃO

Este pedido relaciona-se às composições de dalba5 vancina e aos métodos de uso de tais composições em métodos de tratamento de infecções bacterianas.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS • Este pedido é um pedido internacional baseado no

Pedido U.S. N- de Série [Arquivo do Procurador N- 892.28010 225] , depositado em 26 de abril de 2005, que é uma continuação em parte do Pedido U.S. N- de Série 10/834.395, depositado em 27 de abril de 2004, que é uma continuação em parte do Pedido U.S. N² de Série 10/714.261, depositado em í 14 de novembro de 2003, que reivindica o beneficio dos

I 15 Pedidos de Patentes Provisórios U.S. N— de Série

60/427.654, depositado em 18 de novembro de 2002,

60/485.694, depositado em 8 de julho de 2003, 60/495.048, depositado em 13 de agosto de 2003, e 60/496.483, depositado em 19 de agosto de 2003, as divulgações de todos os quais sendo incorporadas aqui por referência em suas totalidades.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

De acordo com o Centro Americano para o Controle e a Prevenção de Doenças (U.S. Center for Disease Control and Prevention) , as infecções nas correntes sanguíneas nosocomiais são uma causa principal de morte nos Estados Unidos. Aproximadamente cinco por cento dos sete milhões de cateteres venosos centrais (CVCs) inseridos anualmente nos Estados Unidos estão associados com pelo menos um episódio

de infecção na corrente sanguínea (aproximadamente 350.000 por ano). As infecções nas correntes sanguíneas relacionadas aos cateteres ocorrem quando as bactérias entram na corrente sanguínea através de um cateter intravenoso e podem colocar 5 a vida em risco.

As infecções da pele e do tecido mole (SSTIs) (também conhecidas como infecções da pele e da estrutura da pele (SSSIs) complicadas e/ou não complicadas) são uma condição médica comum e, com frequência, a consequência de trauma ou procedimentos cirúrgicos. O Staphylococcus aureus e o Streptococcus pyogenes são os patógenos mais frequentemente isolados dos pacientes com infecções profundas no tecido, embora qualquer organismo patogênico, incluindo aqueles encontrados sobre a pele saudável, possa causar • 15 infecção. Muitas SSTIs são de gravidade branda a moderada, permitindo o tratamento bem-sucedido com agentes antimicrobianos orais e anti-sépticos locais. Em contraste, as infecções mais graves ou complicadas, que ocorrem frequentemente em pacientes com fatores de risco básicos (comprometimento vascular, diabetes) , e/ou as infecções causadas por bactérias difíceis de tratar ou resistentes que se proliferam, podem requerer terapia antimicrobiana intravenosa potente e debridamento cirúrgico agressivo.

Os Estafilococos são um problema clínico e tera25 pêutico e têm sido associados cada vez mais com as infecções nosocomiais, deste o início dos anos 60. A espécie positiva para coagulase, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), por muito tempo tem sido problemática nas infecções /£7 tanto adquiridas na comunidade quanto nosocomiais, e diversos estafilococos negativos para coagulase têm sido reconhecidos como patógenos humanos oportunistas, especialmente no tratamento de pacientes clinicamente doentes em unidades de 5 cuidado intensivo. Uma outra causa principal para o problema clínico é o isolamento crescente das cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes à penicilina em muitas partes do mundo.

Os antibióticos de glicopeptídeos vancomicina e teicoplanina têm sido usados contra infecções nosocomiais sérias, causadas por patógenos Gram-positivos resistentes a múltiplas drogas, particularmente o MRSA, os estafilococos negativos para coagulase (CoNS), e os enterococos. A vancomicina e a teicoplanina são usadas para infecções causadas » 15 por MRSA e, até recentemente, todos os isolados eram uniformemente suscetíveis. Entretanto, tem sido agora descrito com frequência crescente o isolamento das cepas de

Staphylococcus aureus com suscetibilidade intermediária ou resistência à teicoplanina, bem como à vancomicina. Têm sido descritas diversas cepas resistentes à vancomicina, classificadas VanA, VanB, ou VanC, com base no mecanismo de resistência. Assim, são necessitadas opções alternativas de tratamento.

A teicoplanina é ao menos tão ativa quanto a vancomicina contra a maior parte das bactérias Gram-positivas e parece causar menos eventos adversos. Ambas as formas de tratamento requerem pelo menos uma dosagem uma vez ao dia para efetuar a recuperação completa. Atualmente, são bem /SS . 15 limitadas as opções terapêuticas para as infecções graves causadas por alguns destes patógenos. A resistência emergente dos patógenos Gram-positivos à vancomicina torna altamente desejável a disponibilidade de novos antibióticos com potencial por eficácia aumentada.

Além disso, seriam desejáveis regimes de dosagem menos frequentes do que as terapias atualmente disponíveis para aumentar o conforto do paciente, especialmente para a administração de antibióticos parenteral, p.ex., intravenosa ou intramuscular. As estadas nos hospitais são, algumas vezes, exigidas pela necessidade por administração de antibióticos múltiplas vezes ao dia, por meios parenterais, e a dosagem menos freqüente seria vantajosa para permitir que tal tratamento fosse feito em uma base ambulatorial.

Embora a dosagem menos freqüente seja uma característica desejável de um regime de administração de antibióticos, a janela farmacêutica, i.e., o perfil de toxicidade, do antibiótico administrado deve ser suficientemente aceitável para permitir que uma dose única grande seja administrada sem prejudicar o tratamento por causar reações adversas graves no paciente tratado. Além disso, mesmo quando um antibiótico exibir uma janela farmacêutica adequada, a dosagem menos freqüente é possível somente se o antibiótico exibir uma meia-vida em soro adequada, para manter a eficácia terapêutica durante o intervalo de dosagem desejado. A meiavida em soro de um antibiótico dita tanto a longevidade de uma droga in vivo quanto a duração de tempo após a administração quando o nível de soro atingirá um nível de

depressão mínimo que ainda seja bactericidamente efetivo. O nível de depressão do soro com o tempo, após a administração de uma primeira dose de antibiótico, dita quando uma dose adicional deve ser administrada para manter um nível bacte5 ricida mínimo do antibiótico in vivo.

Recentemente, foram sintetizados racionalmente antibióticos de glicopeptídeos bem-sucedidos a partir de glicopeptídeos naturais. Por exemplo, o glicopeptídeo semisintético dalbavancina foi sintetizado a partir do anti10 biótico natural A 40926, originalmente isolado de uma cultura de Actinomadura (Malabarba e col., 1998, Patente U.S. N5.750.509). A dalbavancina tem mostrado maior eficácia contra diversas cepas bacterianas do que a vancomicina ou o antibiótico linezolida e representa um novo tratamento promissor • 15 para as infecções da pele e do tecido mole (ver, p.ex., Jabés e col., 2004, Antimicrob. Agents Chemother. 48:1118-1123).

De acordo com a Patente U.S. N- 5.750.509, a dalbavancina é um antibiótico de glicopeptídeo com uma porção de monometila em seu bl¹⁵ amino (ver a FIGURA 1 quanto à numeração), e este

N^í5-monometil amino podería estar livre (i.e., -NHCH3) ou protegido com um grupo protetor de amino, tal como a tbutoxicarbonila, o carbobenzilóxi, a arilalquila ou a benzila. 0 método para preparar certos dos componentes da dalbavancina descritos na patente '509 também produziu análogos de N¹⁵,

N¹⁵-dialquila da dalbavancina em quantidades menores, porém estas moléculas não foram caracterizadas.

Em vista dos patógenos acima mencionados, antibióticos adicionais, que possuíssem atividade contra um ou mais /7ο . 15 micróbios, incluindo as bactérias resistentes a antibióticos, seriam de valor comercial e satisfariam uma necessidade há muito tempo sentida na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção proporciona composições, métodos e kits para o tratamento ou a prevenção de uma infecção bacteriana com a dalbavancina. Surpreendentemente, as formulações de dalbavancina estabilizadas foram verificadas exibir tanto uma janela farmacêutica quanto uma meia-vida em soro prolongada, para permitir os regimes de tratamento de cerca de uma vez a cada 5-7 dias ou mais, ao mesmo tempo mantendo as propriedades antibacterianas in vivo.

Desse modo, em um aspecto, é proporcionada uma composição farmacêutica que inclui uma dose unitária de dalbavancina, em uma quantidade suficiente para proporcionar um nivel terapêutica ou profilaticamente efetivo de dalbavancina no plasma em um indivíduo, por pelo menos cinco dias, um estabilizador, e um veiculo farmaceuticamente aceitável .

As composições farmacêuticas da invenção são geralmente formuladas em uma forma farmaceuticamente aceitável, para a administração a um indivíduo, tal como uma formulação aquosa farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas são preferivelmente administradas por rotas parenterais, p.ex., intravenosas ou intramusculares. Desse modo, nesta modalidade preferida, estas composições farmacêuticas são tipicamente estéreis.

/9/

Em algumas modalidades, uma dose unitária de dalbavancina é proporcionada na forma de pó seco (p.ex., liofilizada) e reconstituída em um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma formulação aquosa estéril, antes da 5 administração a um indivíduo. Em uma modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável inclui 5% de dextrose em água. Uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada a um mamífero que necessite de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana, tal como um ser humano. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode incluir pelo menos um antibiótico que não seja a dalbavancina, tal como um antibiótico que seja efetivo (p.ex., bactericida) contra uma bactéria Gram-negativa e/ou um antibiótico que seja efetivo contra espécies Gram-positivas contra as quais , 15 a dabavancina não seja efetiva, tais como as cepas bacterianas resistentes à vancomicina VanA.

A invenção proporciona composições, métodos de preparação, e métodos para o tratamento ou a prevenção de uma infecção bacteriana com uma composição farmacêutica de 20 dalbavancina estável na temperatura ambiente.

Em algumas modalidades, uma ou mais substâncias estabilizantes são empregadas para inibir a degradação de um ou mais componentes da dalbavancina, durante a armazenagem, como uma formulação de pó seco (p.ex., liofilizada) e/ou 25 como uma formulação aquosa, antes da administração a um indivíduo. Ao longo do tempo, a degradação pode resultar na formação indesejável de componentes menos ativos e/ou inativos, que poderíam causar potencialmente efeitos adversos in vivo. Os estabilizadores preferidos incluem os componentes não-iônicos, tais como os açúcares ou os álcoois de açúcares, p.ex., um mono-, di-, ou polissacarideo, ou os seus derivados, tais como, por exemplo, o manitol, a lactose, a sacarose, o sorbitol, o glicerol, a celulose, a trealose, a maltose, ou a dextrose, ou as suas misturas.

Em uma modalidade, a invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo a dalbavancina estável.

Em uma outra modalidade, a invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo a dalbavancina e um estabilizador.

Em mais uma outra modalidade, a invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo a dalbavancina e um estabilizador, em um pH de cerca de 1-7, mais preferivel• 15 mente 2-6. Em uma outra modalidade, a composição está em um pH de cerca de 3-5. 0 estabilizador pode compreender um carboidrato ou um aminoácido. 0 carboidrato pode ser o manitol, a lactose, ou uma combinação de manitol e lactose. 0 manitol e a lactose podem ser adicionados em quantidades iguais ou diferentes. Em uma modalidade, são adicionadas quantidades iguais de manitol e lactose e o pH é ajustado para aproximadamente pH 4,5.

Em uma outra modalidade, a invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo a dalbavancina e o manitol em um pH de cerca de 3. Em uma modalidade, o pH da composição é cerca de 3,3. Em uma outra modalidade, esta composição pode adicionalmente compreender a lactose. A /93 lactose e o manitol podem ser adicionados em quantidades iguais ou diferentes.

Em uma outra modalidade, a invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo a dalbavancina e um estabilizador, onde o estabilizador compreende o manitol e a lactose. 0 manitol e a lactose podem ser adicionados em quantidades iguais. O pH desta composição pode opcionalmente variar de 1-7, mais preferivelmente 2-6, mais preferivelmente 3-5, mais preferivelmente 4-5, mais preferivelmente aproximadamente 4,5.

Os glicopeptideos, e a dalbavancina em particular, são muito instáveis devido à ligação glicosidica. Pode haver alguma degradação na temperatura ambiente e mais degradação a 40°C. Algumas das formulações descritas acima podem neces. 15 sitar de condições especiais de armazenagem. Em particular, a refrigeração pode ser desejável (p.ex., -40 a 10°C, alternativamente -20 a 9°C, mais preferivelmente 2 a 8°C) . As formulações podem adicionalmente ser esterilizadas. Elas formarão uma solução sem partículas, clara, estável, quando administradas. A solução deve ser estável e não conter um precipitado.

As composições farmacêuticas descritas acima preferivelmente degradam-se em não mais do que cerca de 4%, em torno de 25°C, após aproximadamente 2 anos, mais preferivel25 mente em não mais do que cerca de 3%, mais preferivelmente em não mais do que cerca de 2%, mais preferivelmente em não mais do que cerca de 1%, mais preferivelmente em não mais do que cerca de 0,5%. Alternativamente, as composições farma10 cêuticas descritas acima têm não mais do que cerca de 4% de

MAG, em torno de 25°C, após aproximadamente 2 anos, mais

preferivelmente	têm	não	mais	do	que	cerca	de	3%	de	MAG,	mais
preferivelmente	têm	não	mais	do	que	cerca	de	2%	de	MAG,	mais
preferivelmente	têm	não	mais	do	que	cerca	de	1%	de	MAG,	mais
preferivelmente	têm	não	mais	do	que	cerca	de	0/	5% de MAG

Em uma outra modalidade, as composições farmacêuticas descritas acima preferivelmente degradam-se em não mais do que cerca de 6%, em torno de 40°C, após aproximadamente 3-6 meses, mais preferivelmente em não mais do que cerca de 5%, preferivelmente em não mais do que cerca de 4%, preferivelmente em não mais do que cerca de 3%, preferivelmente em não mais do que cerca de 2%, preferivelmente em não mais do que cerca de 1%. Alternativamente, as composições farmacêuticas descritas acima preferivelmente têm não mais do que cerca de 6% de MAG, em torno de 40°C, após aproximadamente 3-6 meses, mais preferivelmente têm não mais do que cerca de 5% de MAG, preferivelmente têm não mais do que cerca de 4% de MAG, preferivelmente têm não mais do que cerca de 3% de MAG, preferivelmente têm não mais do que cerca de 2% de MAG, e ainda mais preferivelmente têm não mais do que cerca de 1% de MAG. Seria desejável um composto estável a 40°C, especialmente em locais que não são capazes de armazenar os compostos em um refrigerador ou na temperatura ambiente (p.ex., os países do terceiro mundo e as reservas da índia).

Em mais uma outra modalidade, as composições farmacêuticas degradam-se em não mais do que 3%, em torno de /55

2-8°C, após aproximadamente 2 anos, mais preferivelmente em não mais do que cerca de 2%; mais preferivelmente em não mais do que cerca de 1%; mais preferivelmente em não mais do que cerca de 0,5%. Alternativamente, as composições farmacêuticas têm não mais do que 3% de MAG, em torno de 2-8°C,

após	aproximadamente	2	anos, mais preferivelmente	têm	não
mais	do	que	cerca	de	2%	de MAG; mais preferivelmente	têm	não
mais	do	que	cerca	de	1%	de MAG; mais preferivelmente	têm	não
mais	do	que	cerca	de	0,	5% de MAG.
		A	invenção	inclui as composições de dalbavancina

que podem compreender uma combinação de quaisquer dos fatores de dalbavancina. Estes fatores incluem o fator de dalbavancina Ao, Ai, Bi, B2, Co, Ci, isoB₀, e MAG.

A invenção também inclui um processo de secagem para reduzir o nível de solvente na composição de dalbavancina. 0 método inclui as etapas de proporcionar a dalbavancina úmida compreendendo a dalbavancina, a água, e um solvente, secar a dalbavancina úmida em uma temperatura de cerca de 30°C ou menos e em uma pressão de vácuo de cerca de 50 χ 10⁵ mPa (50 mbar) ou menos, até que o nível de água da dalbavancina úmida seja menos do que cerca de 20% (p/p) . A água é então adicionada à dalbavancina úmida e a etapa de secar é repetida. Estas etapas de adicionar água e secar a dalbavancina úmida são repetidas até que o nivel de solvente seja menos do que cerca de 3,0% (p/p) . Estas etapas podem ser repetidas uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco, vezes, seis vezes, ou tantas quanto necessárias para atingir o teor de solvente desejado. Similarmente, a invenção

também	inclui	uma	composição	de	dalbavancina que tem	um
nível	baixo de	i so	lvente.	Em	uma	modalidade, o nível	de
solvente pode	ser	abaixo	de	3, 0%	(p/p), alternativamente

abaixo de 2,5% (p/p), alternativamente abaixo de 2,0 % (p/p), alternativamente abaixo de 1,5% (p/p), alternativamente abaixo de 1,0 % (p/p), alternativamente abaixo de 0,5 % (p/p), alternativamente abaixo de 0, 1% (p/p) . O solvente pode ser a acetona. Alternativamente, o solvente pode ser qualquer de etanol, metanol, propanol, butanol, éter, cloreto 10 de metileno, tetraidrofurano, clorofórmio, 1,4-dioxana, tricloroetileno, benzeno, tetracloreto de carbono, 1,2-dicloroetano, 1,1-dicloroetano, 1,1,1-tricloroetano, acetonitrila, clorobenzeno, cicloexano, diclorometano, 1,2-dimetoxietano, N,N-dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida, 1,4-dioxana, 215 etoxietanol, etileno glicol, formamida, hexano, 2-metoxietanol, metilbutil cetona, metilcicloexano, N-metilpirrolidona, nitrometano, piridina, sulfolano, tetralina, tolueno,

1,1,2-tricloroetano, xileno, ácido acético, anisol, 1-butanol, 2-butanol, acetato de butila, éter terc-butilmetílico, cume20 no, sulfóxido de dimetila, acetato de etila, éter etílico, formato de etila, ácido fórmico, heptano, acetato de isobutila, acetato de isopropila, 3-metil-l-butanol, metiletil cetona, metilisobutil cetona, 2-metil-l-propanol, pentano, 1-pentanol, 1-propanol, 2-propanol, acetato de propila, 1,125 dietoxipropano, 1,1-dimetoximetano, 2,2-dimetioxipropano, isooctano, éter isopropilico, metilisopropil cetona, metiltetraidrofurano, éter de petróleo, ácido tricloroacético, e ácido trifluoracético. Adicionalmente, o processo de secagem

197 pode ser conduzido em uma temperatura de cerca de 28 °C ou menos, alternativamente em uma temperatura de cerca de 2 6°C ou menos, alternativamente em uma temperatura de cerca de 24°C ou menos, alternativamente em uma temperatura de cerca 5 de 22 °C ou menos, alternativamente em uma temperatura de cerca de 20°C ou menos, alternativamente em uma temperatura de cerca de 15°C ou menos, alternativamente em uma tempe-

	ratura	de cerca	de 10°C ou menos. A	pressão	de vácuo	do
	procedimento de	secagem pode ser	cerca	de	50	X	105	mPa	(50
10	mbar)	ou	menos,	alternativamente	cerca	de	45	X	105	mPa	(45
	mbar)	ou	menos,	alternativamente	cerca	de	40	X	105	mPa	(40
	mbar)	ou	menos,	alternativamente	cerca	de	35	X	105	mPa	(35
	mbar)	ou	menos,	alternativamente	cerca	de	30	X	105	mPa	(30
	mbar)	ou	menos,	a11 e rnat i vament e	cerca	de	25	X	105	mPa	(25
15	mbar)	ou	menos,	alternativamente	cerca	de	20	X	105	mPa	(20
	mbar)	ou	menos,	alternativamente	cerca	de	15	X	105	mPa	(15
	mbar)	ou	menos,	altemativamente	cerca	de	10	X	105	mPa	(10
	mbar)	ou	menos,	alternativamente	cerca de 5	X	. 105	mPa	(5
	mbar)	ou	menos.	Adicionalmente,	o nivel	de	água pode	ser

menos do que cerca de 25% (p/p) , alternativamente menos do que cerca de 20% (p/p), alternativamente menos do que cerca de 15 % (p/p).

Além do baixo teor de solvente, o processo de secagem pode também reduzir a quantidade de MAG presente na 25 composição de dalbavancina. A quantidade de MAG presente pode ser abaixo de cerca de 5% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 4,5% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 4,0% de distri14 buição de HPLC, altemativamente abaixo de cerca de 3,5% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de

3,0% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 2,5% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 2,0% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 1,5% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 1,0% de distribuição de

HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 0,8% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 0, 6% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de

0,5% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 0,4% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 0,3% de distribuição de HPLC, alternativamente abaixo de cerca de 0,2% de distribuição de HPLC, . 15 alternativamente abaixo de cerca de 0, 1% de distribuição de

HPLC.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo os fatores de dalbavancina B₂ e isoB₀. O teor de cada um de B? e isoBo pode independentemente não exceder cerca de 3, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de

2,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 2,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independente25 mente não exceder cerca de 1,5 por cento de distribuição de

HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 1,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 0,5 por

cento de distribuição de HPLC, ou alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 0,1 por cento de distribuição de HPLC.

AdieionaImente, a invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo os fatores de dalbavancina B₂, isoBo, e MAG. 0 teor de cada um de B₂, isoBo/ e MAG pode independentemente não exceder cerca de 3,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 2,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 2, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 1,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 1,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 0,5 por cento de distribuição de HPLC, ou alternativamente pode independentemente não exceder cerca de 0,1 por cento de distribuição de HPLC.

A invenção também inclui os métodos para tratar uma infecção bacteriana compreendendo proporcionar pelo menos uma das composições farmacêuticas descritas acima ao paciente que está necessitado da mesma e administrar uma dose terapeuticamente efetiva de dalbavancina clara, sem partículas, estável, estéril, ao paciente. O método pode adicionalmente incluir administrar uma dose única terapeuticamente efetiva subsequente. A dose única terapeuticamente efetiva subsequente pode ser administrada aproximadamente cinco a dez dias, ou aproximadamente uma semana, após a dose /20) inicial. A dose única terapeuticamente efetiva subsequente também pode ser administrada aproximadamente cinco a dez dias, ou aproximadamente uma semana, após a dose inicial, sem nenhuma dose intermediária de dalbavancina. Em uma outra modalidade, o método pode incluir administrar doses subsequentes múltiplas. As doses subsequentes múltiplas podem ser administradas em intervalos de aproximadamente cinco a dez dias, ou intervalos de uma semana. As doses subsequentes múltiplas podem também ser administradas em intervalos de aproximadamente cinco a dez dias, ou intervalos de uma semana, sem nenhuma dose intermediária de dalbavancina. O método também pode incluir a etapa adicional de monitorar a infecção após administrar a primeira dose e, opcionalmente, ajustar a(s) dose(s) subseqüente(s) conformemente.

» 15 A invenção também inclui métodos para tratar uma infecção bacteriana em um paciente com distúrbio renal, compreendendo administrar uma dose terapeuticamente efetiva de dalbavancina clara, sem partículas, estável, estéril, ao paciente. O distúrbio pode variar de brando a grave. Em uma modalidade, a dose terapeuticamente efetiva atinge uma concentração de pico no paciente (C_má_X) de pelo menos 100 mg/L. Em uma outra modalidade, a dose terapeuticamente efetiva atinge uma exposição do paciente (área sob a curva) de pelo menos 13.000 mg*h/L. 0 método pode incluir a administração de uma única dose de dalbavancina de cerca de 300-1200 mg, alternativamente cerca de 400 mg, alternativamente cerca de 500 mg, alternativamente cerca de 600 mg, alternativamente cerca de 700 mg, alternativamente cerca de

800 mg, alternativamente cerca de 900 mg, alternativamente cerca de 1000 mg, alternativamente cerca de 1100 mg, alternativamente cerca de 1200 mg.

O método para tratar uma infecção bacteriana em um paciente com distúrbio renal pode também incluir a administração de múltiplas doses de dalbavancina. Em uma modalidade, duas doses podem ser administradas aproximadamente cinco até aproximadamente dez dias separadamente, tal como cerca de uma semana separadamente, ou alternativamente cerca de dez a cerca de dezoito dias separadamente, tal como cerca de duas semanas (ou 14 dias separadamente) . Alternativamente, a frequência das doses pode ser, por exemplo, doses duas vezes semanalmente, doses três vezes semanalmente, ou doses múltiplas semanalmente. Alternativamente, o intervalo de dosagem pode ser, por exemplo, qualquer de cerca de 2, 3,

4, 5, 6, 7, 8,	9, 10,	11,	12,	13, 14, 15, 16,	17, 18, 19,
20, 21, 22, 23,	24, 25	, ou	mais	dias separadamente. 0	número
de doses dadas	pode	ser,	por	exemplo, uma,	duas,	três,

quatro, cinco, seis, ou mais doses, cada dose após a dose inicial sendo dada após o intervalo de dosagem selecionado.

Em uma modalidade, a primeira dose pode ser cerca de 750 mg e a segunda dose (ou subseqüente) pode ser cerca de 250 mg. Em uma outra modalidade, a primeira dose pode ser cerca de 7 50 mg e a segunda dose (subseqüente) pode ser cerca de 150 mg. Em uma outra modalidade, a primeira dose pode ser cerca de 750 mg e a segunda dose (subseqüente) pode ser cerca de 125 mg. Em uma outra modalidade, a primeira dose pode ser cerca de 1000 mg e a segunda dose (subseqüente) pode ser cerca de 500 mg.

Em uma outra modalidade, a primeira dose pode ser cerca de 200 mg a cerca de 1500 mg, alternativamente cerca 5 de 200 mg a cerca de 1300 mg, alternativamente cerca de 100 mg a cerca de 1500 mg, alternativamente cerca de 200 mg a cerca de 1400 mg, alternativamente cerca de 300 mg a cerca de 1300 mg, alternativamente cerca de 400 mg a cerca de 1200 mg, alternativamente cerca de 500 mg a cerca de 1100 mg, 10 alternativamente cerca de 600 mg a cerca de 1000 mg, alternativamente cerca de 1000 mg, alternativamente cerca de 950 mg, alternativamente cerca de 900 mg, alternativamente cerca de 850 mg, alternativamente cerca de 800 mg, alternativamente cerca de 750 mg, alternativamente cerca de 700 mg, 15 alternativamente cerca de 650 mg, alternativamente cerca de 600 mg, alternativamente cerca de 550 mg, ou alternativamente cerca de 50 0 mg. A segunda dose ou dose subseqüente pode ser cerca de 2 00 mg a cerca de 1500 mg, alternativamente cerca de 200 mg a cerca de 1300 mg, alternativamente 20 cerca de 100 mg a cerca de 1500 mg, alternativamente cerca de 200 mg a cerca de 1400 mg, alternativamente cerca de 300 mg a cerca de 1300 mg, alternativamente cerca de 400 mg a cerca de 1200 mg, alternativamente cerca de 500 mg a cerca de 1100 mg, ou alternativamente cerca de 600 mg a cerca de 25 1000 mg, alternativamente cerca de 600 mg, alternativamente cerca de 550 mg, alternativamente cerca de 500 mg, alternativamente cerca de 450 mg, alternativamente cerca de 400 mg, alternativamente cerca de 350 mg, alternativamente cerca de

_.Ρλ?

300 mg, alternativamente cerca de 250 mg, alternativamente cerca de 200 mg, alternativamente cerca de 150 mg, ou alternativamente cerca de 100 mg. É para ser entendido que quaisquer das primeiras doses acima mencionadas podem ser 5 combinadas com quaisquer das segundas doses ou doses subseqüentes acima mencionadas em um regime de dosagem.

Em um regime de dosagem múltipla para pacientes renais ou normais, a razão entre a primeira dose e a segunda dose (subseqüente) pode ser definida por um fator. A quanti10 dade da primeira dose pode ser maior do que cerca de 1 vez a quantidade da segunda dose. Alternativamente, a primeira dose pode ser maior do que cerca de 1,5 vez, maior do que cerca de 2 vezes, maior do que cerca de 2,5 vezes, maior do que cerca de 3 vezes, maior do que cerca de 3,5 vezes, maior 15 do que cerca de 4 vezes, maior do que cerca de 4,5 vezes, maior do que cerca de 5 vezes, maior do que cerca de 5,5 vezes, ou maior do que cerca de 6 vezes a quantidade da segunda dose (subseqüente).

. Similarmente, a quantidade da segunda dose (ou dose subseqüente) pode ser cerca de 6 vezes menor do que a quantidade da primeira dose. Alternativamente, a quantidade da segunda dose (ou dose subseqüente) pode ser cerca de 5,5 vezes, alternativamente menor do que cerca de 5,0 vezes, alternativamente menor do que cerca de 4,5 vezes, alterna25 tivamente menor do que cerca de 4,0 vezes, alternativamente menor do que cerca de 3,5 vezes, alternativamente menor do que cerca de 3,0 vezes, alternativamente menor do que cerca de 2,5 vezes, alternativamente menor do que cerca de 2,0 vezes, altemativamente menor do que cerca de 1,5 vez, alternativamente menor do que cerca de 1,0 vez a quantidade da primeira dose.

O método para tratar uma infecção bacteriana em um paciente com distúrbio renal pode incluir a administração de uma única dose de dalbavancina. 0 paciente pode ter distúrbio renal brando, moderado, grave ou de estágio final. A quantidade desta dose única pode ser cerca de 1200 mg, alternativamente cerca de 1150 mg, alternativamente cerca de 1100 mg, alternativamente cerca de 1050 mg, alternativamente cerca de 1000 mg, alternativamente cerca de 950 mg, alternativamente cerca de 900 mg, alternativamente cerca de 850 mg, alternativamente cerca de 800 mg, alternativamente cerca de 750 mg, alternativamente cerca de 700 mg, alternativamente . 15 cerca de 650 mg, alternativamente cerca de 600 mg, alternativamente cerca de 550 mg, alternativamente cerca de 500 mg.

A quantidade da dose única pode também ser entre cerca de 250 mg a cerca de 1300 mg, alternativamente entre cerca de 300 mg a cerca de 1200 mg, altemativamente entre cerca de 350 mg a

20	cerca	de	1100	mg, alternativamente	entre	cerca	de	400	mg	a
	cerca	de	1000	mg, alternativamente	entre	cerca	de	450	mg	a
	cerca	de	1000	mg, alternativamente	entre	cerca	de	500	mg	a
	cerca	de	1000	mg, altemativamente	entre	cerca	de	550	mg	a
	cerca	de	950	mg, alternativamente	entre	cerca	de	600	mg	a
25	cerca	de	900	mg, alternativamente	entre	cerca	de	650	mg	a

cerca de 850 mg.

A invenção também inclui métodos de preparar as composições farmacêuticas descritas acima, compreendendo ,χ proporcionar a dalbavancina e adicionar um estabilizador. Em uma modalidade, o estabilizador é um carboidrato ou um açúcar. Em uma outra modalidade, o estabilizador é o manitol, a lactose, ou uma combinação destes.

Em mais uma outra modalidade, o método adicionalmente inclui a etapa de ajustar o pH da composição, se necessário. Em uma modalidade, o pH é ajustado para cerca de 1-7, mais preferivelmente cerca de 2-6, mais preferivelmente cerca de 3-5. 0 pH pode ser ajustado com um modificador do 10 pH. Os modificadores do pH incluem as bases inorgânicas de metais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como NaOH, Ca(OH)2, KOH, e Mg(OH)₂· Os óxidos inorgânicos, os carbonatos, os bicarbonatos de metais alcalinos e alcalino-terrosos também podem ser usados como modificadores do pH. Os sais de 15 álcali e alcalinos de ácidos inorgânicos fracos e ácidos anfotéricos, tais como o ácido fosfórico, o ácido bórico, o ácido sulfúrico, e todos os outros ácidos contendo enxofre, podem também ser usados como modificadores do pH. Os aminoácidos, tais como a lisina, a meglumaina, a arginina, a n20 metil glucosamina, também podem ser usados para modificar o pH. As bases orgânicas, incluindo todas as aminas, os fenóis, os ácidos carboxilicos fracos, os ácidos dicarboxílicos, os ácidos hidróxi carboxilicos, e os seus sais, também podem ser utilizados para modificar o pH da composição.

Em um outro aspecto, são proporcionados métodos para tratar uma infecção bacteriana em um indivíduo estando necessitado dos mesmos, incluindo administrar pelo menos uma dose unitária de dalbavancina, em uma quantidade suficiente £oC para proporcionar um nível terapeuticamente efetivo de dalbavancina no plasma no indivíduo por pelo menos cinco dias, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Um nível terapeuticamente efetivo de dalbavancina no plasma é geral5 mente pelo menos cerca de 4 mg de dalbavancina por litro de plasma. Em uma modalidade, a quantidade de dosagem de dalbavancina administrada é uma quantidade que seja clinicamente efetiva e também tenha reduzido os efeitos colaterais adversos em comparação com o padrão de cuidado com drogas 10 tais como a teicoplanina e a vancomicina.

A dalbavancina pode ser administrada como uma dose única ou como doses múltiplas. Em algumas modalidades, é administrada uma dose única de cerca de 100 mg a cerca de 4000 mg, por exemplo, 3000 mg, de dalbavancina. Em diversas 15 modalidades, uma única dose de dalbavancina pode incluir pelo menos cerca de qualquer de 0,1, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, ou 3 gramas.

Em outras modalidades, duas doses são administradas cerca de cinco a cerca de dez dias separadamente, tal como 20 cerca de uma semana separadamente. A primeira dose pode ser cerca de 500 a cerca de 5000 mg de dalbavancina e a segunda dose pode ser cerca de 250 mg a cerca de 2500 mg de dalbavancina. Frequentemente, a primeira dose inclui cerca de 1,5 a cerca de 3 vezes, frequentemente pelo menos cerca 25 de duas vezes tanto da quantidade de dalbavancina contida na segunda dose. Por exemplo, a primeira dose pode ser cerca de 1000 mg e a segunda dose pode ser cerca de 500 mg de dalbavancina. Em uma outra modalidade, a primeira dose pode

ser cerca de 1200 mg e a segunda dose pode ser cerca de 600 mg. Nos métodos nos quais são administradas duas doses, o nível de depressão no plasma de dalbavancina em um indivíduo, antes da administração da segunda dose, é geralmente pelo 5 menos cerca de 4 mg, frequentemente pelo menos cerca de 10 mg, frequentemente pelo menos cerca de 20 mg, mais frequentemente pelo menos cerca de 30 mg de dalbavancina por litro de plasma, e ainda mais frequentemente pelo menos cerca de 40 mg de dalbavancina por litro de plasma.

Frequentemente, os métodos da invenção incluem a administração parenteral, por exemplo, a administração intravenosa. Em algumas modalidades, a administração é intravenosa, com a taxa de administração controlada de modo tal que a administração ocorra durante pelo menos cerca de 30 15 minutos ou mais.

Os métodos da invenção podem ser usados para tratar uma infecção por bactérias Gram-positivas, tal como, por exemplo, uma infecção da pele e do tecido mole por Staphylococcus aureus ou Streptococcus pyogenes. Em algumas 20 modalidades, a infecção é resistente à penicilina e/ou resistente a múltiplas drogas.

Em um outro aspecto, é proporcionado um método para prevenir uma infecção bacteriana, o qual inclui administrar pelo menos uma dose unitária de dalbavancina, em uma 25 quantidade suficiente para proporcionar um nível profilaticamente efetivo de dalbavancina no plasma, no indivíduo, por pelo menos cerca de um dia, três dias, cinco dias, uma semana, ou dez dias ou mais, e um veículo farmaceuticamente

Pd?

aceitável. A dosagem de dalbavancina pode ser, por exemplo, cerca de 100 mg a cerca de 1000 mg. Em algumas modalidades, a dalbavancina é administrada antes, durante, ou subseqüente a um procedimento médico ou uma estada no hospital.

Os métodos terapêuticos ou profiláticos da invenção podem incluir a administração de pelo menos um antibiótico que não seja a dalbavancina, preferivelmente um antibiótico que seja efetivo contra uma bactéria Gram-negativa e/ou um antibiótico que seja efetivo contra cepas Gram-positivas que 10 a dalbavancina não é efetiva contra, tais como as cepas de VanA.

Em um outro aspecto, são proporcionados kits que incluem pelo menos uma dose unitária de dalbavancina, em uma quantidade suficiente para proporcionar um nivel terapeuti15 camente efetivo no plasma por pelo menos cerca de cinco dias ou um nível profilaticamente efetivo de dalbavancina no plasma por pelo menos cerca de um dia, em um indivíduo, e instruções para uso em um método de tratamento ou profilaxia de uma infecção bacteriana. Um kit pode conter duas dosagens 20 unitárias, com uma primeira dosagem incluindo 1,5 a 3 vezes, frequentemente pelo menos cerca de duas vezes tanto da quantidade de dal7bavancina incluída em uma segunda dosagem. Os kits podem também incluir um antibiótico que não seja a dalbavancina, preferivelmente efetivo contra uma bactéria 25 Gram-negativa.

Em uma modalidade, são proporcionados kits que incluem um primeiro recipiente contendo uma composição de dalbavancina de pó seco (p.ex., liofilizada) e um segundo

AT?

recipiente contendo uma quantidade predeterminada de uma solução aquosa fisiologicamente aceitável para misturar com a composição de dalbavancina. Tais soluções são preferivelmente soluções aquosas estéreis. Em uma modalidade, os kits incluem um dispositivo de distribuição para administrar a composição de dalbavancina a um indivíduo, por exemplo, um dispositivo de seringa ou administração intravenosa.

A presente invenção também proporciona compostos antibióticos de N¹⁵, W⁷⁵-dialquila com utilidade contra micróbios infecciosos. Os compostos da invenção são úteis para tratar e/ou prevenir infecções microbianas, tais como as SSTIs e outras infecções bacterianas.

A presente invenção é baseada, em parte, na descoberta de compostos antibióticos de N¹⁵, W²⁵-dialquila tendo atividade antimicrobiana pelo menos comparável aos, ou mesmo maior do que os, compostos antibióticos de /F^monoalquila conhecidos, tais como os compostos de dalbavancina. Além disso, conforme descrito nos exemplos abaixo, certos compostos antibióticos de N¹⁵, N¹⁵-dialquila da invenção mostram atividade contra um espectro mais amplo de micróbios, quando comparados aos compostos antibióticos de N^I5-monoalquila anteriormente conhecidos, tais como os compostos de N^J5-monometil dalbavancina.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona compostos antibióticos de N¹⁵, W^I5-dialquila de acordo com a fórmula (I):

Os compostos antibióticos de N¹⁵, N¹⁵-dialquila da invenção (tendo os átomos numerados de acordo com a Figura 26) compreendem dois substituintes de alquila sobre o nitrogênio terminal de amino. Em outras palavras, na fórmula (I), R¹ e R¹' são alquila. Nas modalidades mais preferidas da invenção, R¹ e R¹' são metila. Os outros substituintes da fórmula (I) são descritos em detalhe abaixo. Os substituintes preferidos incluem aqueles verificados nos compostos antibióticos A 40926 e/ou nos compostos de dalbavancina conhecidos para aqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, nas modalidades preferidas, G e M são porções de glicosila, tais como as porções de aminoglicuronila e manopiranosila descritas nas seções abaixo. Em certas modalidades, a porção de aminoglicuronila é acilada, por exemplo, com um ácido graxo, e em certas modalidades, a porção de manopiranosila é acetilada.

Em certas modalidades, X é OH, enquanto que nas modalidades adicionais, X é aminoalquilamino. O grupo aminoalquilamino pode ser qualquer grupo aminoalquilamino conhecido para aqueles de habilidade na técnica, incluindo aqueles

descritos na Patente U.S. N- 5.750.509. Nas modalidades preferidas, X é N_zN-dimetilaminopropilamino. Conforme descrito em detalhe nos exemplos abaixo, os compostos de acordo com a fórmula (I), onde X é um aminoalquilamino, mostram atividade antibiótica comparável aos, ou maior do que os, compostos de dalbavancina correspondentes, tais como aqueles descritos na Patente U.S. N- 5.750.509. Embora os compostos onde X e aminoalquilamino sejam preferidos, os compostos onde X é OH são úteis, por exemplo, para a preparação dos compostos da invenção onde X podem também ser úteis, eles prevenir infecções microbianas.

Em um outro aspecto, é aminoalquilamino, e eles próprios, para tratar e/ou a presente invenção proporciona composições compreendendo um composto antibiótico de N^J5, N^-di alquil a da invenção e um segundo composto. 0 segundo composto pode ser qualquer composto conhecido para aqueles de habilidade na técnica. Nas modalidades particulares, o segundo composto é um composto antibiótico, por exemplo, um composto antibiótico A 40926 ou um composto de dalbavancina.

Nas modalidades adicionais, o segundo composto é também um composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dialquila da invenção. As composições ilustrativas da invenção incluem as misturas dos compostos antibióticos A 40926 e/ou os compostos de dalbavancina que adicionalmente compreendem um composto de acordo com a fórmula (I). Nas modalidades particulares, as composições estão enriquecidas no composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵dialquila da invenção. O enriquecimento pode ser relativo aos compostos antibióticos A 40926 e/ou aos compostos de dalbavancina da composição, ou relativo aos outros compostos da composição, ou ambos. Em certas modalidades, a presente invenção proporciona composições compreendendo um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila purificado da invenção, um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila isolado da invenção ou um composto antibiótico de N¹⁵, iM-dialquila purificado e isolado da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um composto antibiótico de N¹⁵, íM-dialquila da invenção. As composições preferidas compreendem os compostos de acordo com a fórmula (I) onde X é aminoalquilamino. As composições podem adicionalmente compreender outros ingredientes ativos, incluindo os compostos antibióticos A 40926 e/ou os compostos de dalbavancina conhecidos para aqueles de habilidade na técnica. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas adicionalmente compreendem um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. Nas modalidades particulares, a presente invenção proporciona dosagens unitárias farmacêuticas de um composto da invenção para uso, por exemplo, no tratamento e/ou na prevenção de infecções microbianas.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma forma de dosagem compreendendo um pó de dalbavancina sem partículas, estável, estéril, adequado para reconstituição com um veículo farmaceuticamente aceitável compreendendo os fatores de dalbavancina B_o e B2. Os nomes B₂, C2, e N¹⁵,N¹⁵-dimetil dalbavancina Bo foram usados de modo intercambiável. Em uma modalidade, o teor do fator B_o é não menos do que cerca de 75 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 85 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 90 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 95 por cento de distribuição de HPLC. O teor de B₂ é não menos do que cerca de 4,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que 5,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 6,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 7,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 8,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 9, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 10,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 15, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 20,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 25,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 30,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 40,0 por cento de distribuição de HPLC. A porcentagem de distribuição de HPLC dos componentes particulares pode ser calculada comparando a área de cada componente individual com a área total da cromatografia. A forma de dosagem pode também incluir pelo menos um fator adicional, tal como o fator de dalbavancina A_o, Ai, Bi, Co, ou Ci.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo os fatores de dalbavancina B_o e B₂. Em uma modalidade, o teor do fator B_o é não menos do que cerca de 7 5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 80 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 85 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 90 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 95 por cento de distribuição de HPLC. O teor de B₂ é não menos do que cerca de 3, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 4,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que 5,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 6,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 7,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 8,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 9, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 10,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 15,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 20,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 25, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 30, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não menos do que cerca de 40,0 por cento de distribuição de . 15

HPLC. Conforme definido acima, a porcentagem de distribuição de HPLC dos componentes particulares pode ser calculada comparando a área de cada componente individual com a área total da cromatografia. A composição farmacêutica pode também incluir pelo menos um fator adicional, tal como o fator de dalbavancina A_o, Aj, B_lz Co, ou Ci.

Em um outro aspecto, a presente invenção também proporciona o desenriquecimento do componente B₂. Em uma modalidade, o teor do fator B₂ é não mais do que cerca de 5,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 4,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 4,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 3,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 3, 0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 2,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 2,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 1,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 1,0 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca de 0,5 por cento de distribuição de HPLC, alternativamente não mais do que cerca do 0, 1 por cento de distribuição de HPLC.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratar e/ou prevenir infecções microbianas em um paciente que está necessitado dos mesmos. Os métodos podem compreender a administração de uma quantidade efetiva

de um composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dialquila ou composição da invenção ao paciente. A invenção inclui a prevenção ou o tratamento de infecções por bactérias gram-positivas ou resistentes aos antibióticos, tais como uma infecção pelo 5 gênero Bacillus, Corynebacteria, Listeria, Enterococcus,

Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, ou Clostridium, em particular Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus_f Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Estreptococo dos Grupos A e 0, 10 Enterococcus faecalis_r Bacillus subtilis, Neisseria gonorrhoeae, ou Clostridium difficile. As outras infecções que podem ser prevenidas ou tratadas usando os compostos antibióticos de N¹⁵, N^I5-dialquila, as composições, e os métodos da invenção incluem as infecções por bactérias gram15 negativas, tais como a infecção pelo gênero Bartonella,

Brucella, Campylobacter, Enterobacter, Escherichia (bem como outras Proteobactérias) , Francisella, Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Leptospira, Morganella, Moraxella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, 20 Shigella, Stenotrophomonas, Vibrio, e Yersinia, em particular as infecções por Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosas, e leveduras, tais como Candida albicans.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura IA representa a quantidade de componente de dalbavancina B_o versus o tempo em diversas composições farmacêuticas, com e sem manitol, a 25°C.

A Figura IB representa a quantidade de MAG versus o tempo em diversas composições farmacêuticas, com e sem manitol, a 25°C.

A Figura 2A representa a quantidade de componente de dalbavancina Bo versus o tempo em diversas composições

farmacêuticas, com A Figura	e sem manitol,	a 40°C.
2B	representa	a quantidade	de	MAG	versus
o tempo	em diversas	composições	farmacêuticas,	com	e sem
manitol,	a 40°C.
	A Figura	3A	representa	a quantidade	de	componente

de dalbavancina Bo versus o tempo em diversas composições farmacêuticas, contendo manitol e/ou lactose, a 25°C.

A Figura 3B representa a quantidade de MAG versus o tempo em diversas composições farmacêuticas, contendo manitol e/ou lactose, a 25°C.

A Figura 4A representa a quantidade de componente de dalbavancina B_o versus o tempo em diversas composições farmacêuticas, contendo manitol e/ou lactose, a 40°C.

A Figura 4B representa a quantidade de MAG versus o tempo em diversas composições farmacêuticas, contendo manitol e/ou lactose, a 40°C.

A Figura 5 representa a concentração de dalbavancina no plasma versus o tempo, seguindo uma infusão intravenosa de 1000 mg única de dalbavancina.

A Figura 6 representa os dados de calorimetria isotérmica por titulação para a ligação da dalbavancina à soro albumina humana (topo) e uma representação gráfica dos

dados adaptada a uma curva determinada a partir de um modelo de ligação de dalbavancina:proteína a 2:1 (fundo).

A Figura 7 representa um espectro de massa de ionização de eletropulverização da dalbavancina.

A Figura 8 representa um gráfico da concentração de dalbavancina vs. razão de população de multímero para monômero de dalbavancina e representa um aumento na razão de população de multímero para monômero de dalbavancina com a concentração crescente da dalbavancina.

A Figura 9 é um gráfico do pH vs. razão de população de multímero para monômero de dalbavancina e representa um aumento na razão de população de multímero para monômero de dalbavancina com o pH crescente.

	A Figura 10 representa	um	espectro	de	ma s s a	de
ionização	por eletropulverização	da	dalbavancina	em	uma
solução de pH 5 a 5 mM de formato	de amônio.
	A Figura 11 representa	um	espectro	de	massa	de
ionização	por eletropulverização	da	dalbavancina	em	uma
solução de pH 5 a 50 mM de formato	de	amônio.
	A Figura 12 representa	um	espectro	de	massa	de
ionização	por eletropulverização	da	dalbavancina	em	uma
solução de pH 5 a 100 mM de formato de	amônio.
	A Figura 13 representa	um	espectro	de	massa	de
ionizaçao	por eletropulverização <	da teicoplanina (50 pg/mL)
em água.
	A Figura 14 representa	um	espectro	de	massa	de
ionização	por eletropulverização da teicoplanina (100 pg/mL)
em água.

A Figura 15 representa o efeito da HSA sobre a constante de dissociação aparente para a ligação entre dalbavancina/tri-peptideo a 25°C (pH 7,4).

A Figura 16 representa uma comparação dos dados de calorimetria isotérmica (ITC) para a ligação do tri-peptideo à vancomicina e à dalbavancina sob condições idênticas, usando a mesma solução de tri-peptideo.

As Figuras 17A e 17B representam a interação possível dos monômeros e multímeros (incluindo os dímeros) 10 de dalbavancina com o ligante de tri-peptideo e a HSA. A

Figura 17A representa a dalbavancina em equilíbrio de monômero-dimero em solução, ligando-se como monômero a dois locais separados sobre a HSA. A Figura 17B representa a ligação do ligante ao dímero de dalbavancina em solução e 15 mais fracamente aos monômeros de dalbavancina ligados à HAS.

A Figura 18 proporciona os perfis médios de concentração da dalbavancina em plasma-tempo.

A Figura 19 proporciona os perfis médios de concentração de dalbavancina em plasma-tempo.

A Figura 20 proporciona perfis médios adicionais de concentração de dalbavancina em plasma-tempo.

A Figura 21 proporciona um gráfico da exposição à dalbavancina pelo período de tratamento relativo vs. depuração de creatinina.

A Figura 22 proporciona uma comparação da exposição durante o período de tratamento relativo vs. exposição global.

A Figura 23 proporciona os perfis de concentração da dalbavancina-tempo para pacientes com função renal normal e pacientes com distúrbio renal grave.

A Figura 24 proporciona os perfis da concentração da dalbavancina em plasma tempo.

A Figura 25 proporciona uma comparação da exposição à dalbavancina pelo período de tratamento.

A Figura 26 proporciona a estrutura dos compostos antibióticos A 40926 e dos compostos de dalbavancina, incluindo a numeração dos átomos selecionados;

A Figura 27 proporciona a estrutura da dalbavancina Bo;

A Figura 28 proporciona a estrutura de um composto antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dimetila da invenção;

As Figuras 29-31 proporcionam esquemas ilustrando os exemplos da invenção que verificam a estrutura de um composto antibiótico de N¹⁵, jX-dimetila da invenção;

As Figuras 32-33 proporcionam cromatogramas de ESI e HPLC verificando a estrutura do composto antibiótico de Nⁱ⁵, N^I5-dimetila;

A Figura 34 proporciona a estrutura da dalbavancina B₂;

A Figura 35 proporciona um espectro de infravermelho da dalbavancina B₂ (N¹⁵, tX-dimetil dalbavancina B_o) ;

A Figura 36 proporciona um espectro de ESI-EM da dalbavancina B₂ (N¹⁵, N^I5-dimetil dalbavancina B_o) ; e

A Figura 37 ilustra um traço de HPLC de uma composição da invenção.

A Figura 38 proporciona um espectro de massa de ísoBq.

A Figura 39 ilustra um traço de HPLC de isoB₀.

As Figuras 40A-C proporcionam espectros de massa de isoB₀.

	A	Figura	41	proporciona um espectro de RMN-1H de
isoB0.
	A	Figura	42	proporciona	um espectro de	RMN-13C de
isoBo.
	A	Figura	43	proporciona	a identificação	da locali-

zaçâo dos prótons para a dalbavancina.

A Figura 44 proporciona a farmacocinética da dalbavancina em plasma em camundongos infectados na coxa.

A Figura 45 proporciona o efeito de doses únicas de dalbavancina sobre a morte in vivo de S. pneumoniae ao longo do tempo.

A Figura 46 proporciona o efeito de doses únicas de dalbavancina sobre a morte in vivo de S. aureus ao longo do tempo.

A Figura 47 proporciona a relação entre o intervalo de dosagem da dalbavancina e a eficácia contra S. pneumoniae .

A Figura 48 proporciona a relação entre o intervalo de dosagem da dalbavancina e a eficácia contra S. aureus.

A Figura 49 proporciona a relação entre os parâmetros de PK/PD da dalbavancina e a eficácia contra S. pneumoniae.

A Figura 50 proporciona a relação entre os parâmetros de PK/PD da dalbavancina e a eficácia contra S. aureus.

A Figura 51 proporciona as curvas de respostas às doses para a dalbavancina contra diversas cepas.

A Figura 52 proporciona as curvas de respostas às doses para a dalbavancina contra S. pneumoniae e S. aureus.

A Figura 53 proporciona as curvas de respostas às doses para a dalbavancina em camundongos tanto normais quanto neutropênicos infectados com S. pneumoniae.

A Figura 54 proporciona as curvas de respostas às doses para a dalbavancina em ambos os modelos de infecção do pulmão e da coxa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Quando descrevendo os compostos da invenção, as composições farmacêuticas contendo tais compostos e os métodos de utilizar tais compostos e composições, os termos que seguem têm os seguintes significados, salvo indicação em contrário.

O composto antibiótico A 40926 refere-se a um antibiótico de glicopeptídeo conhecido para aqueles de habilidade na técnica. Os compostos antibióticos A 40926 são descritos nas Patentes U.S. N-³ 4.935.238, 4.868.171 e 4.782.042, cujos conteúdos são, pelo presente, incorporados por referência em suas totalidades.

O composto de dalbavancina refere-se a um antibiótico de glicopeptídeo descrito na Patente U.S. N² 5.750.509 e na Publicação de Pedido de Patente U.S. N39 £Zò

2004/0142883, cujos conteúdos são, pelo presente, incorporados por referência em suas totalidades. O nome sistemático de um composto de dalbavancina ilustrativo, conhecido para aqueles de habilidade na técnica, é ristomicina A aglicona, 5,31-dicloro-38-de(metoxicarbonil)-7-demetil-l9-desóxi-56-O(2-desóxi-2-((10-metil-l-oxoundecil)amino)-beta-D-glucopiranuronosil)-38-(((3-(dimetilamino)propil)amino)-carbonil)-42O-alf a-D-manopiranosil-N^I5-metil-. Os exemplos incluem aqueles representados nas Figuras 26 e 27. Os compostos de dalbavancina incluem aqueles compostos com porções de açúcares opcionais nas posições 56 e 42 e grupos acila opcionais, tais como ácidos graxos, sobre os açúcares. Os compostos de dalbavancina podem ser derivados do antibiótico natural A40926, conhecido para aqueles de habilidade na técnica. Os compostos de dalbavancina ilustrativos incluem aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2004/ 0142883, tais como dalbavancina A_o, Ai, Bo, Bi, Co e C_x.

composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dialquila, descrito em detalhe nas seções abaixo, refere-se a um composto da invenção, i.e., um composto antibiótico tendo dois grupos alquila sobre o seu nitrogênio N¹⁵. Um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila da invenção pode ser derivado a partir de um composto antibiótico A 4092 6 ou de um composto de dalbavancina, tal como a dalbavancina A_o, Ai, Bo, Bi, Co e Ci.

O composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dimetila, descrito em detalhe nas seções abaixo, refere-se a um composto da invenção, i.e., um composto antibiótico tendo dois grupos metila sobre o seu nitrogênio N¹⁵.

w

A acila refere-se a um radical -C(O)R, onde R é alquila.

A alquila refere-se aos grupos de hidrocarbila alifáticos, saturados, monovalentes, preferivelmente tendo de 1 a cerca de 11 átomos de carbono, mais preferivelmente de 1 a 8 átomos de carbono, e ainda mais preferivelmente de 1 a 6 átomos de carbono. A cadeia de hidrocarboneto pode ser linear ou ramificada. Este termo é exemplificado por grupos tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, rso-butila, terc-butila, n-hexila, n-octila, terc-octila e similares. O termo alquila inferior refere-se aos grupos alquila tendo de 1 a 6 átomos de carbono.

O alquileno refere-se aos grupos de hidrocarbila alifáticos, saturados, divalentes, preferivelmente tendo de 1 a 11 átomos de carbono e mais preferivelmente 1 a 6 átomos de carbono, que podem ser lineares ou ramificados. Este termo é exemplificado por grupos tais como metileno (—CH₂—) , etileno (-CH₂CH₂-) , os isômeros de propileno (p.ex., CH₂CH₂CH₂- e -CH(CH₃)CH₂-) e similares.

amino refere-se ao radical -NH₂.

O alquilamino refere-se ao radical -NH-alquila ou -N(alquila)₂ .

O aminoalquilamino refere-se a um radical da forma -NR-(alquil)-NR'R, onde cada R, R' e R independentemente representa grupo hidrogênio, alquila, alquila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloeteroalquila, cicloeteroalquila substituída, heteroarila ou heteroarila substituída. Os grupos R, R' vx e R preferidos incluem o hidrogênio e a alquila. Os grupos aminoalquilamino ilustrativos são descritos na Patente U.S. N^£ 5.750.509, cujos conteúdos são, pelo presente, incorporados por referência em sua totalidade.

O carbóxi refere-se ao radical -C(O)OH.

dialquilamino significa um radical -NRR', onde Re R' , cada um independentemente, representam um grupo alquila, alquila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, cicloeteroalquila, cicloeteroalquila substituída, heteroarila ou heteroarila substituída, como definido aqui.

halo ou o halogênio refere-se ao flúor, cloro, bromo e iodo. Os grupos halo preferidos são o flúor ou o cloro.

A porcentagem de distribuição de HPLC de um componente particular é calculada comparando-se a área do pico correspondendo ao componente particular com a área cromatográfica total.

Farmaceuticamente aceitável significa aprovado (por uma agência reguladora para uso investigatório ou comercial do governo federal ou de um estado) ou listado na U.S. Pharmacopoeia ou outra farmacopéia em geral reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos.

O sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um sal de um composto da invenção que seja farmaceuticamente aceitável e que possua a atividade farmacológica desejada do composto de origem. Tais sais incluem: (1) os sais de adição de ácidos formados com ácidos orgânicos ou inorgânicos, tais como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, acético, trifluoracético, tricloroacético, propiônico, hexanóico, ciclopentilpropiônico, glicólico, glutárico, pirúvico, láctico, malônico, succínico, sórbico, ascórbico, málico, maléico, fumárico, tartárico, cítrico, benzóico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, pícrico, cinâmico, mandélico, ftálico, láurico, metanossulfônico, etanossulfônico, 1,2-etano-dissulfônico, 2-hidroxietanossulfônico, benzenossulfônico, 4-clorobenzenossulfônico, 2-naftalenossulfônico, 4-toluenossulfônico, canfórico, canforassulfônico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-l-carboxílico, glicoeptônico, 3-fenilpropiônico, trimetilacético, terc-butilacético, lauril sulfúrico, glicônico, benzóico, glutâmico, hidroxinaftóico, salicílico, esteárico, mucônico e ácidos similares; ou (2) os sais formados quando um próton acídico, presente no composto de origem, (a) é substituído por um íon de metal, p.ex., um íon de metal alcalino, um íon alcalino-terroso ou um íon de alumínio, ou hidróxidos de metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos, tais como hidróxido de sódio, potássio, cálcio, magnésio, e bário, amônia, ou (b) coordena-se com uma base orgânica, tal como as aminas orgânicas alifáticas, alicíclicas, ou aromáticas, tais como metilamina, dimetilamina, dietilamina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina e similares (ver, p.ex., a Patente U.S. N^£ 5.606.036).

Os sais adicionalmente incluem, como forma de exemplo somente, o sódio, o potássio, o cálcio, o magnésio, o amônio, ο tetraalquilamônio e similares, e quando o composto contiver uma funcionalidade básica, os sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos não-tóxicos, tais como o cloridrato, o bromidrato, o tartarato, o mesilato, o acetato, o maleato, o oxalato e similares. O termo cátion farmaceuticamente aceitável refere-se a um contra-íon catiônico farmaceuticamente aceitável, não-tóxico, de um grupo funcional acídico. Tais cátions são exemplificados pelos cátions de sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônio e tetraalquilamônio e similares.

O veículo farmaceuticamente aceitável refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual é administrado um composto da invenção.

0 solvato	refere-se a um composto da presente
invenção, ou seu sal,	que adicionalmente inclui uma quant.i-
dade estequiométrica	ou não-estequiométrica de solvente

ligado por forças intermoleculares não-covalentes. Onde o solvente for a água, o solvato é um hidrato.

O prevenir ou a prevenção refere-se a uma redução no risco de adquirir uma doença ou distúrbio (i.e., fazer com que pelo menos um dos sintomas clínicos da doença não se desenvolva em um paciente que possa ser exposto ou estar predisposto à doença, porém que ainda não sente ou mostra os sintomas da doença). De preferência, a prevenção refere-se ao uso de um composto ou composição em um paciente ainda não afetado pela doença ou pelo distúrbio, ou ainda não exibindo um sintoma da doença ou do distúrbio, por

AIS exemplo, um paciente ainda não infectado ou ainda não exibindo os sintomas de infecção.

O paciente inclui os seres humanos. Os termos ser humano e paciente são usados de modo intercambiável aqui.

A quantidade terapeuticamente efetiva significa uma quantidade de um composto ou composição que, quando administrada a um paciente para o tratamento de uma doença, seja suficiente para efetuar tal tratamento para a doença. Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode variar dependendo, inter alia, do composto, da doença e de sua gravidade, e da idade, peso, etc., do paciente a ser tratado.

O tratar ou o tratamento de qualquer doença ou distúrbio refere-se, em uma modalidade, à melhora da doença ou do distúrbio (i.e., a interrupção ou a redução do desenvolvimento da doença ou, pelo menos, um dos seus sintomas clínicos) que existe em um paciente. Em uma outra modalidade, o tratar ou o tratamento refere-se à melhora de pelo menos um parâmetro físico, o qual pode ser indiscernível pelo paciente. Em mais uma outra modalidade, o tratar ou o tratamento refere-se a modular a doença ou o distúrbio, física (p.ex., a estabilização de um sintoma discernível) ou fisiologicamente (p.ex., a estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Em mais uma outra modalidade, o tratar ou o tratamento refere-se ao retardo do início da doença ou do distúrbio.

Os estereoisômeros que não são imagens especulares um do outro são chamados diastereoisômeros e aqueles que são imagens especulares não sobrepostas um do outro são chamados enantiômeros. Quando um composto tiver um centro assimétrico, por exemplo, quando ele estiver ligado a quatro grupos diferentes, é possível um par de enantiômeros. Um enantiômero pode ser caracterizado pela configuração absoluta de seu centro assimétrico e é designado (A) ou (S) de acordo com as regras de Cahn e Prelog, ou pode ser caracterizado pela maneira na qual a molécula gira o plano de luz polarizada e é designado dextrorrotatório ou levorrotatório (i.ex., como isômeros ( + ) ou (-) , respectivamente) . Um composto quiral pode existir como enantiômero individual ou como uma mistura deste. Uma mistura contendo proporções iguais de enantiômeros é chamada uma mistura racêmica.

Em certas modalidades, os compostos desta invenção podem possuir um ou mais centros assimétricos; tais compostos podem, portanto, ser produzidos como o enantiômero individual (K) ou (S) ou como uma mistura deste. Salvo indicação em contrário, por exemplo, pela designação da estereoquímica em qualquer posição de uma fórmula, a descrição ou a nomenclatura de um composto particular no relatório descrito ou nas reivindicações é pretendida incluir tanto os enantiômeros individuais quanto as misturas, racêmicas ou de outro forma, destes. Os métodos para a determinação da estereoquímica e a separação de estereoisômeros são bastante conhecidos na técnica. Nas modalidades particulares, a presente invenção proporciona os estereoisômeros dos compostos representados aqui no tratamento com base.

A presente invenção proporciona novas composições farmacêuticas de dalbavancina, métodos de preparar as composições farmacêuticas, e métodos de tratamento de infecções bacterianas usando estas novas composições. Em particular, a invenção proporciona composições de dalbavancina estáveis tendo atividade bactericida, que podem ser refrigeradas ou armazenadas na temperatura ambiente por um período de tempo prolongado, mais preferivelmente pelo menos um ano na temperatura ambiente, mais preferivelmente pelo menos dois anos na temperatura ambiente, sem degradação significativa do componente de dalbavancina ativo.

A presente invenção também proporciona regimes de dosagem aperfeiçoados e novas composições de dalbavancina, e métodos aperfeiçoados de tratamento de infecções bacterianas resistentes aos antibióticos. Em particular, a invenção proporciona composições de dalbavancina tendo atividade contra uma ou mais cepas de bactérias resistentes a antibióticos, tais como MRSA, que podem ser administradas em um regime de dosagem de uma vez a cada 5-7 dias ou mais.

A dalbavancina, que é também referida na literatura cientifica como BI 397 ou VER001, é uma mistura de glicopeptídeos semi-sintética, cujas propriedades foram descritas nas Pats. U.S. N— 5.606.036, 5.750.509, 5.843.679, e 5.935.238.

Conforme usado aqui, o termo dalbavancina refere-se às composições compreendendo um ou mais, preferivelmente dois ou mais, em alguns casos três ou mais, em alguns casos quatro ou mais, em alguns casos cinco ou mais,

Põ!

homólogos intimamente relacionados, chamados Ao, Ai,

B_o, B_{x z} Co, Cj, B₂ ou C₂, Do e D/', como descritos abaixo, ou monômeros, multimeros (i.e., dimero ou multimero de ordem superior), tautômeros, ésteres, solvatos, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Conforme usado aqui, o dimero ou o multimero refere-se a um homodimero ou homomultimero, i.e., um dimero ou multimero composto de monômeros do mesmo homólogo de dalbavancina, ou a um heterodímero ou heteromultímero, i.e., um dimero ou multimero composto de monômeros de pelo menos dois homólogos de dalbavancina diferentes. Os fatores diferem nas estruturas das cadeias laterais de ácidos graxos da porção de ácido Nacilaminoglicurônico, com a exceção de C₂ (também conhecido como B₂) . A espectrometria de massa do componente C₂ indicou a presença de um grupo metileno adicional sobre o grupo amino terminal. A dalbavancina frequentemente inclui a MAG, uma variante não-homóloga descrita abaixo que não tem a porção de acilglicuronamina. Individualmente, a dalbavancina e a MAG são, algumas vezes, referidas aqui como componentes de dalbavancina.

A dalbavancina é preparada por modificação química do complexo de glicopeptídeo natural A-40.926, como descrito em Malabarba e Donadio (1999) Druqs of the Future 24 (8) :839846. 0 componente predominante da dalbavancina é o Fator B_o, que é responsável por >75% do complexo inteiro.

A quantidade de cada um dos componentes presentes em uma composição de dalbavancina é ditada por uma variedade de fatores, incluindo, por exemplo, as condições de fermen48 tação empregadas na preparação do complexo de glicopeptideo natural A-40926, que é o precursor para a dalbavancina (ver, p.ex., a Pat. U.S. N- 5.843.679), as condições empregadas para recuperar o A-40926 do caldo de fermentação, as reações químicas empregadas para esterificar seletivamente o grupo carboxila da porção de açúcar de A-40926, as condições empregadas para amidar o grupo peptidil carboxila, as condições empregadas para saponificar o éster do grupo carboxila da função de ácido N-acilaminoglicurônico, as 10 condições empregadas para recuperar a dalbavancina da mistura sintética, e similares.

Nas modalidades preferidas, as composições de dalbavancina compreendem pelo menos cerca de 80 a cerca de 98% em peso do componente Bo- Nas modalidades particular15 mente preferidas, a dalbavancina compreende as seguintes quantidades de Bo:

TABELA 1

Quantidades Preferidas de Componente B_o na

Composição de Dalbavancina

Preferidas	Mais Preferidas1	Ainda Mais Preferidas1
80-98	80-97	80-96
81-98	81-97	81-96
82-98	82-97	82-96
83-98	83-97	83-96
84-98	84-97	84-96
85-98	85-97	85-96
86-98	86-97	86-96
87-98	87-97	87-96
88-98	88-97	88-96

Preferidas	Mais Preferidas1	Ainda Mais Preferidas1
89-98	89-97	89-96
90-98	90-97	90-96

= cada faixa representa a mol % de B_o em relação aos componentes de dalbavancina totais presentes na composição de dalbavancina, incluindo a MAG )

Em uma modalidade, a composição ou a formulação de dalbavancina contém uma quantidade mínima, se alguma, dos Componentes C_Oz Ci, e C₂ (B₂) . Em uma outra modalidade, a composição ou a formulação de dalbavancina não contém nenhum dos Componentes Co, Ci, e C₂ (B₂) .

Os fatores de dalbavancina individuais foram anteriormente purificados por HPLC e caracterizados por RMN. Na Patente U.S. N- 5.7 50.509, Malabarba. e col. descreveram o derivado de antibiótico A 40926, que foi caracterizado como tendo um substituinte de carbóxi, alcóxi de (Cj-C^)carbonila, aminocarbonila, alquilaminocarbonila de (Ci-CJ ou hidroximetila sobre a porção de N-acilaminoglicuronila e um substituinte de hidroxila ou um de poliamina na posição 63 da molécula. Os compostos da invenção foram verificados terem alta atividade in vitro contra os Enterococos e os Estafilococos resistentes a glicopeptideos. Malabarba e col., entretanto, nem reconheceram as combinações de fatores que eram farmaceuticamente benéficas, nem identificaram ou caracterizaram o produto de degradação que não tem a porção de acilglicuronamina. Malabarba e col. nunca monitoraram a MAG ou produziram uma forma estéril. Malabarba e col. somente purificaram uma quantidade pequena por HPLC e não efetuaram a análise de massa quantitativa.

A estrutura química de diversos dos componentes de dalbavancina é representada na Fórmula II abaixo:

OH

ÓH ÕH

II

Componente de Dalbavancina	R	R1	Peso Molecular
Ao	-CH(CH3)2	H	1802,7
Ai	-ch2ch2ch3	H	1802,7
Bo	-CH2CH(CH3)2	H	1816,7
Bi	-ch2ch2ch2ch3	H	1816,7
B2 ou C2	-CH2CH(CH3)2	ch3	1830,74
Co	-CH2CH2CH (CH3) 2	H	1830,7
Ci	-ch2ch2ch2ch2ch3	H	1830,7
Do	-(CH3)z	H	1788,66
Di	-CH2CH3	H	1788,66
MAG	—	H	1459,27

Todos os componentes da dalbavancina acima mencionados são bactericidamente ativos contra diversas bactérias

Gram-positivas. Entretanto, um componente de dalbavancina

335 não-homólogo, chamado MAG, que não tem uma porção de acilglicoronamina presente nos outros componentes, é menos bactericidamente efetivo, tanto in vivo quanto in vitro, do que os outros componentes de dalbavancina. (Ver as Tabelas 2 e 3) .

A MAG é acreditada ser um produto de decomposição de um ou mais dos outros componentes de dalbavancina. Desse modo, em uma modalidade preferida, a quantidade de MAG na dalbavancina é menos do que cerca de 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 mol por cento de todos os componentes de dalbavancina presentes, incluindo a MAG.

TABELA 2

ED₅₀s da MAG em comparação com a dalbavancina e a vancomicina contra septicemias de murinos por Staph. Aureus

Microorganismo	Composto	MIO (gg/mL)	ed50 (mg/kg)
MSSA	Stph.aureus Smith 819	MAG	0,5	0,3
		Dalbavancina	0, 06	0,05
		Vancomicina	0,5	1,7
		MAG	0,5	1,6
MRSA	Stph.aureus 3817	Dalbavancina	<0,03	0,7
		Vancomicina	0,5	1,0

** Tratamento: uma vez dentro de 10 min de infecção, por rota sc

TABELA 3

Atividade Microbiológica

Microorganismo	MIC μς/ιηΐ
MAG	Dalbavancina
L 819 S aureus Smith	0,5-0,5-0,25	£0,13-0,06-<0,03
L 819 S aureus Smith 50%	1-1-1	1-2-2
L 613 S aureus isolado clín.	1-0,5-0,5	0,5-0,6-<0,03
3797 S aureus isolado clín. GISA	0,5-0,5	2-2
3817 S aureus isolado clín.	0, 5	<0, 03
L 147 Ξ epidermidis	0,25-0,13-0,13	<0,13-<0,03-<0,03
L 49 S pyogenes C203	0,5-0,5-0,25	<0,13-<0,03-<0,03
L 44 S pneumoniae UC41	1-0,5-0,5	0,24-<0,03-<0,03
L 602 S haemolyticus isolado clín.	>32-32	>32->32
L 149 E faecalis	0,24-0,5-0,5	0,06-0,06
L 562 E faecalis isolado clín.	32->32->32	>32->32->32
L 1666 E faecium Van-A	>32->32->32	>32->32->32
L 102 B subtilis ATCC	0,13-0,13	>0,03->0,03
L 47 E coli SKF12140	>32->32->32	>32->32->32
G 16440 E coli iperperm	8-8-16	16-8-16
L 79 P vulgaris	>32->32->32	>32->32->32
L 4 P aeruginosas ATCC10145	>32->32-32	>32->32->32
L 145 C albicans SKF2270	>32->32->32	>32->32->32

As modificações adicionais na substância de droga final originam-se do processo de fermentação, das etapas químicas subsequentes, ou da secagem. O IsoB₀ (RRT 0.76) é um diastereoisômero de dalbavancina B_o resultante da epimerização de um próton instável na estrutura de núcleo da dalbavancina. Ele origina-se durante a desacetilação do precursor A-40926 com base, formando o diastereoisômero de 10 A-40.926. Este diastereoisômero é subsequentemente convertido no IsoBq nas etapas de modificações químicas que seguem. O £37

IsoBo é bem resolvido no método de liberação por HPLC e é o único estereoisômero detectado no API. Os dados de laboratório têm demonstrado que o IsoB₀ não é formado durante o procedimento de hidrólise básico que converte a forma de éster (MA-A-1) na dalbavancina. O IsoB₀ foi caracterizado por RMN e EM e tem demonstrado atividade biológica in vivo que é comparável àquela da dalbavancina Bo.

nível de IsoB₀ em uma composição de dalbavancina é menos do que cerca de 3,5%, alternativamente menos do que cerca de 3,0%, alternativamente menos do que cerca de 2,5%, alternativamente menos do que cerca de 2,0%, alternativamente menos do que cerca de 1,5%, alternativamente menos do que cerca de 1,0%, alternativamente menos do que cerca de 0,5%, alternativamente menos do que cerca de 0,4%, alternativamente menos do que cerca de 0,3%, alternativamente menos do que cerca de 0,2%, ou alternativamente menos do que cerca de 0,1%.

O nível de IsoB₀ em uma composição de dalbavancina pode alternativamente ser entre cerca de 0,5% a cerca de 3,0%, alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 2,8%, alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 2,5%, alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 2,3%, alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 2,0%, alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 1,8%, alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 1,5%, alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 1,3%, ou alternativamente entre cerca de 0,5% a cerca de 1,0%, ou altemativamente entre cerca de 0,1% a cerca de 0,5%.

O nível de IsoB₀ em uma composição de dalbavancina é alternativamente não menos do que cerca de 1,0%, alternativamente não menos do que cerca de 1,5%, alternativamente não menos do que cerca de 2,0%, alternativamente não menos do que cerca de 2,5%, alternativamente não menos do que cerca de 3,0%, alternativamente não menos do que cerca de 3,5%, alternativamente não menos do que cerca de 4,0%, alternativamente não menos do que cerca de 4,5%, ou alternativamente não menos do que cerca de 5,0%.

A dalbavancina é acreditada inibir a biossíntese da parede celular bacteriana por ligação aos precursores que terminam em D-alanil-D-alanina de peptidoglicanos. Os multimeros diméricos ou de ordem superior da dalbavancina podem possuir propriedades das cadeias laterais das bactérias. Ver, antibacterianas adicionais por interação lipofílicas com a membrana citoplásmica por exemplo, Malabarba e Ciabatti, e col. (2001)

Current

Medicinal

Chemistry 8:1759-1773. Uma elaboração adicional sobre os multimeros de dalbavancina pode ser encontrada na US.

N² de

Série 10/714.166, intitulada

DALBAVANCIN COMPOSITIONS

FOR TREATMENT OF

BACTERIAL INFECTIONS, depositada em 14 de novembro de 2003, como Arquivo do Procurador N² 34231-20052.00, cuja divulgação é, pelo presente, incorporada por referência em sua totali da de.

Os dados in vitxo, não-clínicos, e clínicos indicam que a dalbavancina é de benefício para o tratamento de

RSfí infecções sérias de Gram-positivos, causadas por MRSA e CoNS, e todas as espécies estreptocócicas e enterocócicas que não sejam a VanA, incluindo os fenótipos de VanB e VanC insatisfatoriamente suscetíveis ou resistentes à vancomicina.

A dalbavancina é mais ativa in vitro contra os estafilococos (incluindo algumas cepas resistentes à teicoplanina) do que a teicoplanina e a vancomicina. A dalbavancina tem melhor atividade contra os estreptococos, incluindo as cepas resistentes à penicilina, do que a teicoplanina ou a vancomicina. A dalbavancina é ativa in vitno e in vivo contra diversas bactérias Gram-positivas, incluindo a maior parte das cepas resistentes a drogas.

A dalbavancina é tipicamente administrada a um indivíduo como uma composição de dalbavancina. Conforme usado aqui, o termo composição de dalbavancina ou formulação de dalbavancina refere-se a uma composição, tipicamente uma composição farmacêutica, compreendendo a dalbavancina, como acima definido, e um ou mais outros componentes que não sejam a dalbavancina, tais como, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável, um estabilizador, tampões, ou outros componentes similares.

Conforme mostrado no Exemplo 1, a dalbavancina é efetiva em intervalos de doses de uma semana. Assim, uma vantagem da dalbavancina contra as outras opções de tratamento é a capacidade de administrar este antibiótico em uma base de uma vez por semana, desse modo maximizando o cumprimento pelo paciente e minimizando potencialmente a necessidade por, ou diminuindo a duração de, uma estada em hospital para a administração parenteral do antibiótico. A dosagem menos frequente muitas vezes permite o tratamento em uma base ambulatorial, assim diminuindo os custos do tratamento. Conforme também mostrado no Exemplo 1, uma segunda dose de dalbavancina aproximadamente uma semana após a administração da primeira dosagem, onde a segunda dose é aproximadamente metade da primeira dose, proporciona inesperadamente um aperfeiçoamento significativo na eficácia do tratamento.

Métodos de uso

Tinham sido descritos anteriormente diversos regimes de dosagem, incluindo os regimes de dose única e de múltiplas doses, para a dalbavancina. Leighton e col. descreveram uma administração de múltiplas doses com uma razão de dose ótima (dose de carga (LD)/dose de manutenção (MD)) de 10:1. Neste estudo, o escalonamento da dose processou-se para 1120 mg de dose única (SD) e um regime de doses múltiplas até 500 mg BID no Dia 1, seguidos por 100 mg diariamente por 6 dias sucessivos. Leighton e col. Dalbavancin: Phase I Single and Multiple-Dose Placebo Controlled Intravenous Safety, Pharmacokinetic Study in Healthy Volunteers, 41^st ICAAC Abstracts, Chicago, IL, 2225 de setembro de 2001, Abstract N^£ 951, pág. 25.

Leighton e col. também descreveram outras administrações de doses únicas e múltiplas. Nos estudos de doses únicas, o escalonamento da dose descrito processou-se via uma série de 140 mg, 220 mg, 350 mg, 500 mg, 630 mg, 840 mg, e 1120 mg. Na fase de múltiplas doses, a dosagem consistia

em. uma dose de carga, administrada como duas doses iguais dadas 12 horas separadamente, seguida por doses de manutenção. O regime de partida foi uma dose de carga de 150 mg BID, seguida por uma dose de manutenção de 30 mg por dia, por 6 dias. O escalonamento da dose processou-se como se segue: 200 mg BID/40 mg, 300 mg BID/60 mg; 400 mg BID/80 mg, e 500 mg BID/100 mg. Leighton e col. Dalbavancin: Phase I Single and Multiple-dose Placebo Controlled Intravenous Safety Pharmacokinetic Study in Healthy Volunteers, 41^st ICAAC Abstracts, Chicago, IL, dezembro de 2001, Pôster N951.

White e col. descreveram regimes de dosagem de infusão intravenosa única por 0,5 hora de 70 mg, 140 mg, 220 mg, ou 360 mg. O regime de múltiplas doses consistia em 70 mg administrados diariamente por 7 dias. White e col. VGlycopeptide: Phase I Single and Multíple-Dose Placebo Controlled Intravenous Safety, Pharmacokinetic, and Pharmacodynamic Study in Healthy Volunteers, 40^th ICAAC, Toronto, Canadá, 17-20 de setembro de 2000, Pôster N^?- 2196 e Abstract N- 2196. Todas as referências acima mencionadas são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade.

São proporcionados métodos novos para a administração de dalbavancina a um indivíduo estando necessitado de tratamento para uma infecção bacteriana. O tratamento pode incluir a profilaxia, a terapia, ou a cura. Os métodos incluem a administração de uma ou mais doses unitárias de dalbavancina, em uma quantidade terapêutica ou profilaticamente efetiva.

Conforme usado aqui, a quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de dalbavancina que proporcionará um resultado terapêutico desejado (p.ex., a redução ou a eliminação de uma infecção bacteriana). Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode ser administrada em uma ou mais doses. Uma quantidade profilaticamente efetiva refere-se a uma quantidade de dalbavancina suficiente para prevenir ou reduzir a gravidade de uma infecção bacteriana futura, quando administrada a um indivíduo que seja suscetível a, e/ou que possa contrair, uma infecção bacteriana, p.ex., em virtude de um procedimento médico ou estada no hospital, ou exposição a um indivíduo com uma infecção bacteriana. A dalbavancina é geralmente administrada em um veículo farmaceuticamente aceitável.

A dalbavancina é frequentemente proporcionada como um sal de cloridrato, que está livremente solúvel em água.

Tipicamente, a dalbavancina é administrada como uma dose unitária em uma formulação de dalbavancina que inclui uma quantidade de dalbavancina suficiente para proporcionar um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo de dalbavancina no plasma por diversos dias, frequentemente pelo menos cerca de 5 dias, uma semana, ou 10 dias, quando administrada a um indivíduo.

Conforme usado aqui, o indivíduo refere-se a um vertebrado, tipicamente um mamífero, frequentemente um ser humano.

31à

Todos os homólogos da dalbavancina descritos acima exibem uma meia-vida no plasma prolongada, frequentemente 9 dias ou mais, embora a MAG seja acreditada ter uma meia-vida mais curta do que os outros homólogos. A meia-vida longa permite intervalos mais longos entre as dosagens do que a vancomicina ou a teicoplanina. Conforme descrito no Exemplo 1, a dosagem semanal de dalbavancina é efetiva para o controle de infecções bacterianas, em contraste com o programa de dosagem duas vezes diariamente, que é frequentemente usado para a vancomicina, ou o programa uma vez diariamente, geralmente usado para a teicoplanina. A dosagem de dalbavancina menos frequente oferece vantagens significativas de tratamento sobre a vancomicina e a teicoplanina, particularmente com relação à conveniência aperfeiçoada e o cumprimento com o regime de tratamento pelo paciente. Surpreendentemente, podem ser administradas doses elevadas (i.e., resultando em níveis no soro surpreendentes altos e de longa duração), e com menos frequência do que as outras opções de tratamento disponíveis. O novo regime de dosagem disponível para a dalbavancina resulta em eficácia aperfeiçoada porque, nas concentrações requeridas para efetuar a dosagem menos frequente, a dalbavancina exibe efeitos adversos mínimos in vivo, evidenciando uma grande janela farmacêutica, e também porque os níveis sanguíneos de dalbavancina são mantidos acima dos níveis bactericidas mínimos para o protocolo inteiro de tratamento, evidenciando uma meia-vida em soro prolongada para a dalbavancina. A combinação da grande janela farmacêutica acoplada com a meia-vida em soro prolongada permite a dosagem de dalbavancina menos frequente.

Além disso, a dalbavancina é preferivelmente formulada com um estabilizador que inibe a degradação de um ou mais dos componentes de dalbavancina. Em uma modalidade preferida, a dalbavancina é formulada com uma razão em peso de manitol:dalbavancina de 1:2. Em uma outra modalidade preferida, a dalbavancina é formulada com uma razão em peso de manitol:lactoserdalbavancina de 1:1:4.

Em algumas modalidades, a formulação de dalbavancina é administrada em uma dosagem que resulta em níveis terapeuticamente efetivos (i.e., bactericidas) plasmáticos da droga por diversos dias, frequentemente pelo menos cerca de 5 a cerca de 10 dias, frequentemente pelo menos cerca de uma semana. Geralmente, a dalbavancina é mantida no plasma na, ou acima da, concentração bactericida mínima de cerca de 4 mg/1 por pelo menos 5 dias. Frequentemente, a dalbavancina é mantida em um nível plasmático de pelo menos cerca de 5 mg/1, frequentemente pelo menos cerca de 10 mg/1, frequentemente pelo menos cerca de 20 mg/1, frequentemente pelo menos cerca de 30 mg/1, frequentemente pelo menos cerca de 40 mg/1, por pelo menos 5 dias, frequentemente pelo menos cerca de uma semana ou mais. Os níveis plasmáticos de dalbavancina podem ser medidos por métodos que são bastante conhecidos na técnica, tais como a cromatografia líquida, a espectrometria de massa, ou o bioensaio microbiológico. Um exemplo de um método para quantificar a dalbavancina no plasma é proporcionado no Exemplo 5.

Os limites superiores para os níveis da concentração de dalbavancina no plasma são geralmente ditados pelas dosagens que inibem os efeitos adversos inaceitáveis na população de pacientes tratada.

As composições de dalbavancina podem ser administradas em uma dose única ou em múltiplas doses. Quando administrada como uma dose única, a composição de dalbavancina é preferivelmente formulada para conter quantidades suficientes de dalbavancina para efetuar as propriedades antibacterianas in vivo por pelo menos 5 dias, preferivelmente pelo menos 7 dias, e mais preferivelmente pelo menos 10 dias.

Quando forem empregadas as doses múltiplas, a dalbavancina pode ser administrada semanalmente por duas ou mais semanas. Em uma modalidade, a dalbavancina é administrada em pelo menos duas doses, frequentemente em duas doses aproximadamente 5 até aproximadamente 10 dias separadamente, mais frequentemente uma vez por semana durante duas semanas. Conforme mostrado no Exemplo 1, tal regime de dosagem proporciona vantagens significativas sobre os protocolos de tratamento com antibióticos convencionais.

As composições de dalbavancina também podem ser administradas em doses múltiplas, dois ou mais dias, ou pelo menos uma semana separadamente ou em uma ou mais doses bisemanalmente. Em algumas modalidades, uma composição de dalbavancina é administrada semanalmente, seguida por bisemanalmente, ou administração mensal. Em algumas modalidades, a dalbavancina é administrada em intervalos semanais por 2, 3, 4, 5, 6, ou mais semanas.

Mais vantajosamente, a dosagem diária não é requerida porque são usadas doses menos frequentes, maiores. As 5 doses únicas ou múltiplas podem variar, por exemplo, de cerca de 0,1 a cerca de 5 gramas. Uma dose única de cerca de 0,1 a cerca de 4 gramas, p.ex., cerca de 3 gramas, pode ser administrada para diversos tratamentos de infecção. Onde forem administradas doses múltiplas, por exemplo, semanal10 mente, cada dose pode variar, por exemplo, de cerca de 0,25 a cerca de 5,0 gramas.

Para as modalidades nas quais é administrada uma dose única para tratar uma infecção, a quantidade da dose pode ser, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 5 gramas, ou 15 cerca de 0,5 a cerca de 4 gramas, ou cerca de 1 a cerca de 3,5 gramas, ou cerca de 2 a cerca de 3 gramas, p.ex., cerca de 3 gramas. Em algumas modalidades, uma dose única de cerca de 1, 1,5, 2, 2,5, ou 3 gramas é administrada para o tratamento de uma infecção bacteriana. Para as modalidades 20 nas quais é administrada uma dose única para profilaxia, a quantidade da dose pode ser, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 3 gramas, ou cerca de 0,1 a cerca de 1 grama, p.ex., cerca de 0,5 ou cerca de 0,25 grama.

Nos esquemas de dosagem que incluem as dosagens 25 múltiplas, as dosagens individuais podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, é administrada uma primeira dose mais elevada, que é, por exemplo, cerca de 1,5 a 10 vezes maior, em certos casos 9 vezes maior, em outros

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casos 8 vezes maior, em outros casos 7 vezes maior, em outros casos 6 vezes maior, em outros casos 5 vezes maior, em outros casos 4 vezes maior, em outros casos 3 vezes maior, em outros casos 2 vezes maior, do que uma ou mais

5	doses	subseqíientes.	Por exemplo, a primeira dose pode ser
	cerca	de	0,5	grama	a cerca de 5 gramas e a segunda	dose
	cerca	de	0,25	grama	a cerca de 2,5 gramas, a primeira	dose
	pode	ser	cerca	de 0,	.8 a cerca de 2 g e a segunda dose	cerca
	de 0,	4 a	cerca	de 1	grama, ou a primeira dose pode ser	cerca
10	de 0,	4 a	cerca	de 3	g e a segunda dose cerca de 0,2 a 1	, 5 g.

Em algumas modalidades, são administradas pelo menos duas dosagens, onde a primeira dosagem inclui cerca de duas vezes tanta dalbavancina quanto às dosagens subseqüentes. Em uma modalidade, uma primeira dosagem inclui 15 cerca de 1 grama de dalbavancina e uma dosagem subsequente inclui cerca de 0,5 grama. Em uma outra modalidade, uma primeira dosagem inclui cerca de 0,5 grama de dalbavancina e uma dosagem subseqüente inclui cerca de 0,25 grama.

Em algumas modalidades, a composição de dalbavan20 cina é administrada em duas doses de quantidade igual ou diferente, dois ou mais dias ou pelo menos cerca de uma semana separadamente. Freqüentemente, são administradas duas doses de cerca de 0,2 a cerca de 1,5 grama de dalbavancina, cerca de 5 a cerca de 10 dias separadamente, mais 25 freqüentemente cerca de 1 semana separadamente. Em uma modalidade, uma primeira dosagem de cerca de 1 grama de dalbavancina e uma segunda dosagem de cerca de 0,5 grama de i

dalbavancina são administradas em torno de 1 semana separadamente .

Em um regime de dosagem múltipla, o tempo entre as doses pode variar, por exemplo, de cerca de 5 a cerca de 10 dias, fregüentemente cerca de uma semana, alternativamente cerca de duas semanas. A frequência da dose pode ser, por exemplo, duas doses semanalmente, ou doses múltiplas semanalmente. 0 intervalo de dosagem, ou o tempo entre as doses, pode ser, por exemplo, qualquer de cerca de 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 25, ou mais dias. O número de doses dadas pode ser, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais doses, cada dose após a dose inicial ser dada, depois do intervalo de dosagem selecionado.

Em um esquema de dosagem múltipla, frequentemente o nível de depressão, ou o nível de dalbavancina no plasma após uma primeira dose de dalbavancina e exatamente antes da administração de uma segunda dose, é pelo menos cerca de 4 mg/1. De preferência, o nível de depressão no final de um intervalo de dosagem, tal como cerca de uma semana, é pelo menos cerca de 20 mg/1, mais preferivelmente pelo menos cerca de 30 mg/1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 40 mg/1.

A dalbavancina pode ser administrada parenteral25 mente, p.ex., de modo intramuscular (i.m.), intravenoso (i.v.) (bolo ou infusão lenta), subcutâneo (s.c.), intraperitoneal (i.p.), ou intratecal (i.t.). O programa de dosagem e a dosagem real administrada podem variar dependendo de

tais fatores como a natureza e a gravidade da infecção, a idade, o peso, e a saúde geral do paciente e a tolerância de um paciente particular a dalbavancina, porém serão averiguáveis para os profissionais da saúde. Em uma modalidade, uma dose intravenosa de um grama de dalbavancina é seguida por uma dose intravenosa de 0,5 grama uma semana mais tarde.

A administração e a distribuição da droga para o paciente, p.ex., intravenosamente, podem ser feitas em uma taxa controlada, de modo que a concentração no sangue não aumente muito rapidamente ou faça com que ocorra a precipitação. Em algumas modalidades, a dalbavancina é administrada em uma taxa apropriada, de modo tal que a droga forme um complexo com a(s) proteína(s) endógena(s) na corrente sanguínea. Sem pretender estar ligado a uma teoria particular, acredita-se que a proteína endógena, tal como a soro albumina humana, possa formar um complexo in vivo com uma ou duas moléculas de monômeros homólogos de dalbavancina. Quando estiver presente uma quantidade suficiente de dalbavancina, acredita-se que até duas moléculas de homólogo de dalbavancina ligar-se-ão à proteína endógena e acreditase também que este complexo seja formado por ligação de moléculas homólogas separadas de dalbavancina em dois locais diferentes de ligação. Alternativamente, é possível que a dalbavancina dimérica esteja se ligando a um local de ligação único sobre a proteína endógena. Uma elaboração adicional sobre os complexos de dalbavancina-proteína endógena discutidos acima pode ser encontrada na U.S. N^£ de Série 10/713.924, intitulada COMPOSITIONS AND METHODS FOR

26υ

TREATING BACTERIAL INFECTIONS WITH PROTEIN-DALBAVANCIN COMPLEXES, depositada em 14 de novembro de 2003, como Arquivo do Procurador N^£ 34231-20053.00, cuja divulgação é, pelo presente, incorporada por referência em sua totalidade.

A duração da infusão pode ser, por exemplo, cerca de 1 minuto a cerca de 2 horas, ou alternativamente, de cerca de 15 minutos a cerca de 2 horas. Por exemplo, uma duração de infusão de cerca de 3 0 minutos pode ser usada onde a dose for cerca de 0,5 a cerca de 1 grama. A 10 administração intravenosa sob condições de taxas controladas pode gerar concentrações de dalbavancina no corpo que estão em grande excesso do que pode ser atingido na fase de solução em pH fisiológico in vitro. Embora não desejando estar limitado por teoria, isto pode ser devido à formação 15 de um complexo de dalbavancina com a(s) proteína (s) endógena(s), tal (is) como a soro albumina, que pode aumentar a solubilidade da dalbavancina no plasma em comparação com os estudos in vitro.

A formação de um complexo de dalbavancina in vitro ou ex vivo pode permitir a administração mais rápida, tal como pelo menos cerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 10 minutos ou pelo menos cerca de 20 minutos. Tal complexo pode ser obtido misturando a soro albumina humana e/ou uma outra proteína endógena com a dalbavancina, desse modo formando o 25 complexo in vitro ou ex vivo, e então administrando este complexo ao paciente tratado. Alternativamente, a soro albumina humana ou outra proteína endógena pode ser obtida a *

partir de fontes autólogas ou por expressão a partir de um microorganismo modificado para conter o gene para a proteína.

A quantidade de dalbavancina administrada pode ser quaisquer das dosagens divulgadas aqui. A dose de dalbavancina é geralmente escolhida de modo tal que a droga permaneça em um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo (i.e., bactericida) no plasma por um período de tempo prolongado, frequentemente pelo menos 5 dias, mais frequentemente cerca de uma semana ou mais. É preferida a administração de uma dose de dalbavancina que produza e mantenha as concentrações bactericidas por pelo menos cerca de uma semana (ou cerca de 5 a cerca de 10 dias). Uma concentração bactericida é definida como a concentração de dalbavancina requerida para matar pelo menos 99% das bactérias presentes no início de um experimento in vitro, durante um período de 24 horas. Uma concentração bactericida mínima de dalbavancina no plasma é tipicamente cerca de 4 mg/1.

Os exemplos de indicações que podem ser tratadas incluem as infecções da pele e do tecido mole (SSTI) tanto complicadas quanto não complicadas (também conhecidas como infecções da pele e da estrutura da pele (SSSI) complicadas e não complicadas) , as infecções nas correntes sanguíneas (BSI), as infecções nas correntes sanguíneas relacionadas aos cateteres (CRBSI), a osteomielite, as infecções das articulações proféticas, a profilaxia cirúrgica, a endocardite, a pneumonia adquirida em hospital ou na comunidade, a pneumonia pneumocócica, o tratamento empírico de neutropenia febril, as infecções dos espaços das articulações, e as infecções por dispositivos (p.ex., os marca-passos e os desfibriladores cardíacos internos). As infecções por bactérias Gram-positivas ou resistentes a antibióticos podem ser tratadas, tais como uma infecção pelo gênero Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, ou Clostridium, em particular Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolytícus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus dos Grupos A e C, Neisseria gonorrhoeae, ou Clostridium difficile.

A invenção proporciona métodos para o tratamento de infecções da pele e do tecido mole (SSTIS) . Os pacientes que podem beneficiar-se deste tratamento podem ter infecções profundas ou superficiais. A SSTI pode envolver o tecido mole mais profundo e/ou requerer intervenção cirúrgica significativa, tal como, por exemplo, um abscesso grande, úlcera infectada, queimadura grande, ou celulite profunda e extensa. As feridas cirúrgicas infectadas também podem ser tratadas. A eficácia da dalbavancina tratando a pele é um resultado inesperado e surpreendente porque a dalbavancina forma complexo com as proteínas in vivo (ver o Exemplo 5).

A apresentação clínica da infecção da pele e da estrutura da pele pode variar de foliculite branda até fasciite necrotizante grave. 0 modo de aquisição também pode variar com as infecções da pele e da estrutura da pele adquiridas na comunidade, que são frequentemente precedidas por lesões resultantes da exposição ocupacional ou de atividades recreativas, e estão normalmente associadas com uma diversidade maior de patógenos. As infecções da pele e da estrutura da pele adquiridas em hospital estão geralmente associadas com os procedimentos cirúrgicos, o desenvolvimento de úlceras de pressão, e a cateterização. As infecções póscirúrgicas são a terceira infecção nosocomial mais frequente 5 e são responsáveis por 17% de todas as infecções nosocomiais descritas no National Nosocomial Infection Surveillance System (Sistema de Vigilância de Infecção Nosocomial Nacional) (NNIS). A fonte mais freqüente de infecção é a flora endógena do paciente. 0 Staphylococcus aureus, os estafilococos negativos para coagulase, e o Enterococcus spp. são os patógenos mais freqüentemente isolados das SSTIs.

Os	sintomas das	infecções	SSTI podem	incluir o
eritema, a	sensibilidade	ou a dor	, o ardor térmico ou
localizado,	a drenagem ou	o pus, o	inchaço ou o	enrijeci-
15 mento, a vermelhidão, ou a	ondulação.	Os pacientes	que podem

beneficiar-se do tratamento com os métodos da invenção incluem aqueles com infecções profundas ou complicadas ou infecções que requeiram intervenção cirúrgica, ou os pacientes com diabete melito latente ou doença vascular 20 periférica. Estas infecções são freqíientemente causadas por bactérias Gram-positivas, tais como as espécies Staphylococcus ou Streptococcus, tais como o Staphylococcus aureus ou o Streptococcus pyogenes. Os métodos para o tratamento de uma infecção bacteriana da pele ou do tecido 25 mole incluem administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de dalbavancina a um indivíduo que está necessitado do tratamento, em uma quantidade e de acordo com um regime de dosagem como discutido acima. Em algumas modalidades, uma ¹⁵ composição de dalbavancina é administrada intravenosamente em duas doses, frequentemente cerca de 5 a cerca de 10 dias separadamente, mais frequentemente cerca de 1 semana separadamente. Em algumas modalidades, a primeira dosagem inclui pelo menos duas vezes tanta dalbavancina quanto a segunda dosagem. Em uma modalidade, a primeira dosagem é cerca de 1000 mg e a segunda dosagem é cerca de 500 mg. Em uma outra modalidade, a primeira dose pode ser cerca de 1200 mg e a segunda dose pode ser cerca de 600 mg.

A invenção também proporciona métodos para a prevenção profilática do inicio de uma infecção bacteriana, por exemplo, uma infecção causada por Staphylococcus aureus, ou por uma bactéria do gênero Neisseria ou Clostrldium. Em um método profilático da invenção, é administrada uma quantidade profilaticamente efetiva de dalbavancina a um indivíduo que pode estar suscetível à contração de uma infecção bacteriana, por exemplo, através de um procedimento médico. Frequentemente, a dalbavancina é administrada em uma quantidade suficiente para proporcionar um nível profilaticamente efetivo no plasma por pelo menos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 5 dias, ou pelo menos cerca de uma semana ou mais. As composições de dalbavancina podem ser administradas, por exemplo, parenteralmente, p.ex., via injeção intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), intraperitoneal (í.p.), subcutânea (s.c.), ou intratecal (i.t.), antes ou subsequente a cirurgia, como uma etapa preventiva contra a infecção. As composições de dalbavancina podem ser administradas imedia25

tamente antes de, ou subsequentemente a, 1 ou mais dias, ou cerca de uma semanas antes de, ou subsequentemente a, ou durante um, procedimento médico invasivo, tal como uma cirurgia ou uma estada em uma área para cuidado médico, tal 5 como um hospital, para prevenir a infecção. Um método profilático pode ser usado em qualquer situação na qual seja possível ou provável que um indivíduo possa contrair uma infecção bacteriana, incluindo as situações nas quais um indivíduo tenha sido exposto, ou é provável de ser exposto, 10 a um indivíduo infectado de modo bacteriano. Para os métodos profiláticos, as composições de dalbavancina podem ser administradas como uma dose única ou como duas ou mais doses de quantidade igual ou diferente, que são administradas diversos dias até cerca de uma semana separadamente. Em uma 15 modalidade, uma composição de dalbavancina pode ser administrada antes da, ou simultaneamente com a, inserção de um cateter intravenoso, para prevenir uma infecção relacionada à corrente sanguínea.

Para os métodos profiláticos, as composições de 20 dalbavancina podem ser administradas em uma dose única ou em múltiplas doses, de acordo com quaisquer dos esquemas de dosagem descritos acima. Frequentemente, uma composição de dalbavancina é administrada como uma dose única compreendendo cerca de 0,1 a cerca de 3 gramas, ou cerca de 25 0,1 a cerca de 1 grama, p.ex., cerca de 0,25 grama ou cerca de 0,5 grama. Em uma modalidade, uma dose única de cerca de 0,25 grama é administrada intravenosamente durante um período de tempo de cerca de 2 minutos a cerca de 1 hora, ^56

p.ex., cerca de 30 minutos. Em uma outra modalidade, a composição de dalbavancina é administrada de modo intravenoso, simultaneamente com a administração de um outro tratamento farmacêutico (p.ex., antibiótico).

Em quaisquer dos métodos terapêuticos ou profiláticos descritos acima, a composição de dalbavancina pode ser administrada simultânea ou seqüencialmente com pelo menos um outro antibiótico. Em algumas modalidades, é administrado além da dalbavancina pelo menos um outro antibiótico que 10 seja efetivo (p.ex., bactericida) contra uma ou mais espécies bacterianas Gram-negativas e/ou uma cepa bacteriana Gram-positiva contra a qual a dalbavancina não seja efetiva.

Em algumas modalidades, a dalbavancina e pelo menos um antibiótico que seja efetivo (p.ex., bactericida) contra 15 pelo menos uma espécie bacteriana Gram-negativa são administrados como uma mistura na composição de dalbavancina.

Farmacocinètica

Os estudos da dalbavancina com animais foram conduzidos usando camundongos, ratos, coelhos, cães, e 20 miniporcos.

Diversos métodos confirmados foram usados para quantificar a dalbavancina. 0 API da dalbavancina consiste em 5 homólogos (A_o, A_lf B_o, B_x, e B₂) . Os métodos baseados na atividade antibacteriana mediram todos os componentes de 25 dalbavancina microbiologicamente ativos. Com os métodos cromatograficos, o componente principal Bo foi medido em combinação com o componente Bi (juntos, 90% a 95% da dalbavancina) e o resultado descrito em termos de dalbavancina

total. A contagem por cintilação líquida (LSC) e a cromatografia líquida com detecção radioquímica (LC/RC) permitiram a medição da dalbavancina e dos metabólitos no plasma, urina, e fezes dos animais que receberam a droga radiomarcada. Quando tanto a dalbavancina quanto a radioatividade derivada da droga foram quantificadas no plasma dos animais que receberam doses clinicamente relevantes, as curvas de concentração-tempo para a droga e a radioatividade estavam sobrepostas. Isto indica que virtualmente toda a radioatividade derivada da droga no plasma era droga intacta.

A droga esta amplamente distribuída por todo o corpo, em todos os órgãos e tecidos testados, após a administração da dose IV. A dalbavancina penetrou na pele dos ratos e dos miniporcos. A cinética da dalbavancina comportou-se em um modo previsível através das espécies. A depuração plasmática (CL) foi verificada ser proporcional ao peso do corpo das espécies. Adicionalmente, a dalbavancina atravessou a placenta da rata e foi encontrada no plasma fetal de rato.

A dalbavancina não é um substrato, inibidor, ou indutor das isoenzimas de citocromo P450 hepáticas. A droga não é metabolizada in vítro por microssomos hepáticos de ratos, cães, ou humanos; hepatócitos de ratos, cães, ou humanos; ou microssomos de rins humanos. A dalbavancina não afetou o metabolismo de substratos marcadores por microssomos hepáticos humanos isolados. A administração de

dalbavancina aos ratos não induziu nenhuma atividade de P450.

São observados perfis similares de metabólitos de dalbavancina através das espécies. Dois (2) metabólitos (0H5 dalbavancina e MAG) foram observados na urina de ratos, cães, e seres humanos. Ambos os metabólitos não são detectáveis ou estão próximos ao limite de detecção (<0,4 mg/L) no plasma humano, têm menos atividade antibacteriana do que a dalbavancina, e contribuem pouco (se alguma coisa) 10 para a atividade in vivo. Com as doses clinicamente relevantes, foram em geral observados resultados similares no plasma de animal.

A droga tem rotas duplas (renal e fecal) de excreção e é excretada como droga intacta e metabólitos. A _ 15 dalbavancina é excretada na urina e nas fezes de ratos, cães, e seres humanos. A maior parte da dose é excretada como droga intacta na urina. A OH-dalbavancina e a MAG são encontradas na urina também. Alguma droga intacta é encontrada nas fezes dos animais, juntamente com quantidades 20 traço de metabólitos. As fezes humanas continham componentes de dalbavancina microbiologicamente ativos. A dalbavancina é também excretada no leite da rata. Portanto, a dalbavancina é eliminada do corpo via metabolismo, excreção urinária, e excreção fecal. Isto prediría que poucos, se alguns, ajustes 25 das doses seriam requeridos com base na demografia do paciente. Surpreendentemente, os pacientes com insuficiência renal grave (depuração de creatinina CL_Cr menor do que 30 mL/min) atingiram níveis mais elevados do que os pacientes renais normais (depuração de creatinina CL_Cr maior do que 80 mL/min) . Os pacientes graves com uma dose de 1 g no Dia 1 pareceram similares aos níveis para um paciente normal que recebeu 100 mg no Dia 1 e 500 mg no Dia 8.

Composições farmacêuticas

A invenção proporciona composições farmacêuticas formuladas para a administração de dalbavancina de acordo com os métodos descritos acima. As composições farmacêuticas ------da invenção podem estar na forma de uma dose unitária de dalbavancina, que inclui uma quantidade de dalbavancina * suficiente para proporcionar um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo de dalbavancina no plasma por diversos dias, frequentemente pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 5 dias, ou pelo menos cerca de uma semana ou mais, quando a composição for administrada a um indivíduo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Geralmente, um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo de dalbavancina no plasma é pelo menos cerca de 4 mg por litro de plasma. Os níveis de dalbavancina no plasma podem ser medidos por métodos bastante conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos acima.

A dalbavancina pode opcionalmente estar em uma forma farmaceuticamente aceitável para a administração a um indivíduo, opcionalmente como um sal não-tóxico, farmaceuti25 camente aceitável.

Os exemplos de sais de dalbavancina adequados incluem os sais formados por reação padrão com ácidos tanto orgânicos quanto inorgânicos, tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoracético, tricloroacético, succínico, cítrico, ascórbico, láctico, maléico, glutâmico, canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, láurico, esteárico, salicí5 lico, metanossulfônico, benzenossulfônico, sórbico, pícrico, benzóico, cinâmico, e similares. Os exemplos representativos de bases que podem formar sais com a dalbavancina incluem os hidróxidos de metais alcalinos ou metais ãlcalino-terrososr - -tais como o hidróxido de sódio, potássio, cálcio, magnésio, e bário, o amônio e as aminas orgânicas alifáticos, alicíclicas, ou aromáticas, tais como a metilamina, a dimetilamina, a dietilamina, a etanolamina, e a picolina. (Ver, por exemplo, a Pat. U.S. N° 5.606.036).

Em algumas modalidades, é proporcionada uma formu15 lação de dalbavancina aquosa, farmaceuticamente aceitável, que é adequada para a administração parenteral, tal como, por exemplo, a injeção intravenosa. Para a preparação de tal formulação aquosa, podem ser usados métodos bastante conhecidos na técnica, e podem ser usados quaisquer veículos, diluentes, excipientes, ou outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis, normalmente usados na técnica. Em uma modalidade, uma formulação aquosa farmaceuticamente aceitável para a injeção intravenosa inclui 5% de dextrose.

A dalbavancina pode ser administrada parenteral25 mente, i.e., a rota de administração é por injeção sob, ou através de, uma ou mais camadas das membranas da pele ou mucosa. Visto que esta rota dribla estas barreiras protetoras altamente eficientes do corpo humano, pode ser obtida uma pureza excepcional de uma forma de dosagem parenteral, livre de microorganismos e particulados insolúveis. O processo usado na preparação de tal forma de dosagem deve incluir boas práticas de manufatura que produzirão e 5 manterão a qualidade requerida do produto em termos de esterilidade e eficácia terapêutica. Além disso, a forma deve estar estável quando armazenada na temperatura ambiente, para uma forma de dosagem prática e conveniente.

Existem diversos métodos convencionais geralmente disponíveis para converter os materiais de droga em massa em uma forma de dosagem adequada para a administração parenteral. Estes métodos estão, em geral, resumidos no Remington's Pharmaceutical Sciences, décima oitava edição, 1990 (Remington).

Esterilização por Vapor

A USP define a esterilização com vapor como empregando vapor saturado sob pressão, por pelo menos 15 minutos, em um mínimo de 121°C, em um vaso pressurizado. Uma droga em sua forma sólida pode ser colocada em uma autoclave 20 para efetuar a esterilização por vapor. Uma droga em sua forma de solução pode ser colocada diretamente em uma autoclave ou estar contida em um recipiente vedado e ser colocada em uma autoclave para efetuar o mesmo tipo de esterilização por vapor.

Esterilização por Calor a Seco

Na esterilização por calor a seco, um material de droga em massa é submetido a temperaturas elevadas, em umidade relativamente baixa. Porque o calor a seco é menos

«I eficiente do que o calor a úmido para a esterilização, são requeridos tempos de exposição mais longos e temperaturas mais elevadas do que aqueles usados na esterilização por vapor. 0 objetivo é matar os microorganismos por um processo 5 de oxidação. Embora o estabelecimento dos ciclos exatos e corretos de tempo-temperatura não seja rotineiro, as temperaturas típicas usadas são 140 - 170°C de 1 a 3 horas.

Esterilização por Radiação

A esterilização por radiação pode empregar a radiação eletromagnética ou a radiação de partículas. A radiação eletromagnética, compreendida de fótons de energia, inclui a radiação ultravioleta, gama, de raios X, e cósmica. A radiação gama, emitida de materiais radioativos, tais como o cobalto-60 ou o césio-137, é a fonte de esterilização 15 eletromagnética mais frequentemente usada. A radiação de partículas mais amplamente empregada para a esterilização é a radiação de partículas beta ou elétrons.

Filtração Esterilizante

A filtração esterilizante é um processo que remove, porém não destrói, os microorganismos de uma corrente fluida. Tal filtração é o método de escolha para as soluções que são instáveis a outros tipos de processos de esterilização.

Dessecagem por Congelação (Liofilização) Estéril

Este método emprega a filtração esterilizante com a etapa subseqüente de separar a droga esterilizada da solução por sublimação da solução após a solução ser congelada, abandonando a substância de droga. 0 método tipicamente compreende as seguintes etapas:

1) dissolver a droga em massa em solução aquosa

2) esterilizar a solução através de filtração por membrana

3) despejar a solução esterilizada em frascos pequenos pré-esterilizados, abertos, e colocar em câmara de 1iofilização

4) congelar a solução nos frascos pequenos

5) evacuar a câmara para sublimar o gelo sob baixa temperatura

6) aumentar a temperatura até a temperatura ambiente ou acima para remover a água residual.

Dessecagem por Congelação (Liofilização) Estéril com adição de água (vapor) estéril

Este método emprega a filtração esterilizante com as etapas subsequentes de separar a droga esterilizada da solução através de dessecagem por congelação (liofilização), e adicionar água estéril na forma de vapor.

Precipitação Estéril

Este método emprega a filtração esterilizante com a etapa subsequente de precipitar a droga esterilizada da solução. Mais especificamente, uma droga em massa é primeiramente dissolvida em água em uma temperatura elevada (acima da temperatura ambiente), a solução aquecida é então filtrada sob condições assépticas para remover quaisquer microorganismos, e a solução filtrada é então esfriada para precipitar a droga da solução. A droga precipitada é então

2J&/

separada	da solução	por	filtração ou centrifugação,	e
carregadas	para recipientes	por despejamento	dos	pós	sob
condições	assépticas.	Para	o despejamento	dos	pós	ser

* prático, a droga deve ter boas propriedades de escoamento o pó deve geralmente ser granular, não-cristalino e de tamanho de partícula uniforme.

Uma composição farmacêutica para a administração parenteral inclui a dalbavancina üm^-diluente fisiológica— -------mente aceitável, tal como a água estéril ou deionizada, para injeção, a solução salina fisiológica, 5% de dextrose, solvente miscível com a água (p.ex., o álcool etílico, o polietileno glicol, o propileno glicol, etc.), veiculo nãoaquoso (p.ex., óleo, tal como o óleo de milho, o óleo de caroço de algodão, o óleo de amendoim, e o óleo de gergelim), ou outro diluente comumente usado. A formulação pode adicionalmente incluir um agente solubilizante, tal como o polietileno glicol, o polipropileno glicol, ou outro agente solubilizante conhecido, tampões para estabilizar a solução (p.ex., citratos, acetatos, e fosfatos) e/ou antioxidantes (p.ex., ácido ascórbico ou bissulfito de sódio). (Ver, por exemplo, a Patente U.S. N² 6.143.739). Os outros veículos farmacêuticos adequados e as suas formulações são descritos no Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Conforme é sabido na técnica, as preparações farmacêuticas da invenção também podem ser preparadas para conter níveis aceitáveis de particulados (p.ex., sem partículas) e ser não-pirogênicas (p.ex., atendendo as exigências de um injetável na U.S. Pharmacopeia) .

Em uma modalidade, é proporcionada uma composição farmacêutica por dissolução de uma dose secada (p.ex., liofilizada) de dalbavancina, freqüentemente contendo um estabilizador ou mistura de estabilizadores, em uma quantidade de água e, preferivelmente água deionizada, em um volume suficiente para dissolver o liófilo. Tipicamente, a quantidade damente 10 acima de de água suficiente para mL e o pH resultante da

3,0, e cerca de 3,5 a dissolução é aproximasolução de dalbavancina é

4,5. Esta solução é adicionalmente diluída em um diluente mente contendo 5% de dextrose, tal contida em um saco intravenosa, eleva o cerca de 5 a 5,5. Em de pH uma secundário, freqüentecomo uma quantidade gotej amento da solução para a administração de dalbavancina para outra modalidade, o pH da solução de dalbavancina em um saco de gotejamento é cerca de 4,5. O diluente secundário pode ser a água deionizada e estéril para injeção. Em uma modalidade, o diluente aquoso é 5% de dextrose.

As composições farmacêuticas para a administração parenteral podem ser preparadas em frascos pequenos estéreis contendo uma ou mais doses unitárias de dalbavancina, em uma quantidade terapêutica ou profilaticamente efetiva, conforme 25 descrito acima, opcionalmente incluindo um excipiente, sob condições nas quais é mantida a eficácia bactericida da dalbavancina. A composição pode estar na forma de um pó seco (p.ex., liofilizado). Antes do uso, o pó é reconstituído com um diluente fisiologicamente aceitável e então, removido, via seringa, para a administração a um paciente. Uma formulação farmacêutica conforme acima descrita pode ser esterilizada por qualquer meio aceitável, incluindo, por 5 exemplo, os métodos de esterilização de feixes-e ou gama, ou por filtração estéril.

Uma formulação típica para a administração parenteral pode incluir a dalbavancina em uma concentração tal como cerca de 0,1 a cerca de 100 mg, cerca de 0,5 a cerca de 10 50 mg, cerca de 1 a cerca de 10 mg, ou cerca de 2 a cerca de mg de dalbavancina por ml de preparação final.

Em algumas modalidades, uma composição farmacêu15 tica de acordo com a invenção inclui dalbavancina e um ou mais antibióticos preferência, pelo menos um dalbavancina na mistura é uma mistura adicionais.

que não seja de

De efetivo (p.ex., bactericida) contra uma ou mais espécies de bactérias Gram-negativas, tal como, por exemplo, o aztreonam, e/ou contra uma ou mais cepas bacterianas Gram-positivas contra as quais a dalbavancina não é efetiva, tal como, por exemplo, a ilnezolida ou a daptomicina. A mistura pode também incluir um veículo farmaceuticamente aceitável, como descrito acima.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção incluem uma ou mais substâncias estabili25 zantes, as quais inibem a degradação de um ou mais dos componentes de dalbavancina até materiais menos ativos ou inativos, homólogos, ou materiais relacionados, por exemplo, a MAG. Conforme usado aqui, a substância estabilizante ou

o estabilizador refere-se a uma substância que estabiliza o nível de um ou mais dos componentes constituintes de dalbavancina, por exemplo, B_o, na composição. Uma quantidade efetiva estabilizante refere-se a uma quantidade de estabilizador suficiente para aumentar a estabilidade de longa duração de um ou mais componentes de uma composição de dalbavancina. Em algumas modalidades, pode ser proporcionada uma quantidade efetiva estabilizante por uma mistura de duas ou mais substâncias estabilizantes, cada uma das quais, sozinha, não está presente em uma quantidade suficiente para proporcionar um efeito estabilizador.

Os exemplos de estabilizadores incluem, por exemplo, as substâncias não-iônicas, tais como os açúcares, p.ex., os mono-, di-, ou polissacarídeos, ou os seus derivados, os álcoois de açúcares, ou os polióis. Tais substâncias estabilizantes incluem, por exemplo, o manitol, a lactose, a sacarose, o sorbitol, o glicerol, a celulose, a trealose, a maltose, a rafinose, a dextrose, as dextranas de pesos moleculares baixos e altos, ou as suas misturas.

Além dos açúcares, os estabilizadores podem também ser os aminoácidos. Os estabilizadores de aminoácidos incluem os aminoácidos naturais e sintéticos e os derivados de aminoácidos. Em uma modalidade preferida, os aminoácidos são a glicina, a alanina, a valina, a leucina, a isoleucina, a fenilalanina, o triptofano, e a asparagina. Os estabilizadores podem também ser as ciclodextrinas, as amidas cíclicas, tais como a niacinamida e a benzamida, o ácido

salicílico, e os seus hidroxil ácidos e ésteres substituídos em orto, meta, para.

Além de adicionar estabilizadores, o ajuste do pH dos compostos foi verificado aumentar a estabilidade da 5 composição. 0 pH particular da composição que aumenta ou maximiza a estabilidade depende do tipo e da quantidade de estabilizador adicionado. 0 pH pode ser, de preferência, cerca de 1-7, mais preferivelmente 2-6, mais preferivelmente 3-5, mais preferivelmente 4-5, mais preferivelmente em torno 10 de 4,5.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica inclui uma razão em peso de manitol: dalbavancina de 1: 2. Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica inclui uma razão em peso de manitol:lactose:dalbavancina de 1:1:4. Surpreen15 dentemente, foi verificado que uma combinação de manitol e lactose proporciona um efeito estabilizador maior do que uma ou outra substância sozinha. Frequentemente, o pH de uma composição farmacêutica da invenção é, por exemplo, cerca de 3 a cerca de 5, por exemplo, cerca de 3,5 ou cerca de 4,5.

Em algumas modalidades, podem ser empregados um ou mais procedimentos para reduzir a formação de MAG. Por exemplo, a liofilização da dalbavancina na presença de uma substância estabilizante, tal como o manitol e/ou a lactose, pode ser empregada para reduzir a quantidade de MAG formada.

A armazenagem das composições de dalbavancina é frequentemente em temperatura menor do que a ambiente, tal como em torno de 5°C, para aumentar a estabilidade.

Secagem

A remoção de acetona dos produtos naturais com altos pesos moleculares pode ser bem difícil porgue ela pode formar adutos com eles. A sua remoção pode ser efetuada na 5 presença de água que substitui a acetona no produto sólido.

Além disso, o processo de secar a dalbavancina é mais sensível devido à possibilidade de formar MAG, que depende do pH, temperatura, vácuo, e tempo. Para minimizar a formação de MAG e acelerar o processo de secagem, a água com baixo teor 10 de endotoxinas é adicionada ou pulverizada sobre o produto durante o processo de secagem, para substituir a acetona. A água excessiva é posteriormente reduzida com horas adicionais de secagem.

A secagem é efetuada sob vácuo (temperatura interna 15 a <25°C). Quando a maior parte da acetona tiver sido removida do produto, aproximadamente 20 % (p/p) da água com baixo teor de endotoxinas é pulverizada sobre o produto sólido e a secagem é continuada nas mesmas condições. Para seguir o processo de secagem, a acetona e as análises de 20 Karl Fischer (K.F.) são efetuadas, e água adicional é pulverizada sobre o produto sólido, até que a acetona residual seja menos do que 1,5 %.

Estudo 25

Secagem a 20-30°C a 50 x 10⁵ mPa (50 mbar).

Este procedimento foi primeiramente simulado no laboratório usando um evaporador rotativo. A Batelada de dalbavancina 027 foi secada a 30°C, sem adicionar água, dando um produto que continha 6,4 % de MAG e 3,2 % de acetona. 126 g desta batelada de dalbavancina secada (batelada 027, razão de HCl/Dalba 1,7 mol/mol) foram carregados em um frasco de fundo redondo de 1 L, e o sólido foi pulverizado com 25 mL de água de duas em duas horas, mantendo a temperatura do banho de água a 20-30°C e o vácuo a 50 x

10⁵ mPa (50 mbar). As amostras da dalbavancina foram retiradas em tempos específicos e analisadas quanto à acetona, análises de K.F., e MAG. Os dados obtidos são descritos na

Tabela 4A. Todas as porcentagens de MAG descritas nesta tabela são a diferença entre a quantidade real e a quantidade de partida.

TABELA 4A

Tempo h	T °C	P MPa	% de Água	% de Acetona	% de Delta MAG	% de Água pulverizada
0	-	-	1,6	3,2	0
2	20-25	50xl05	8,3	2,8	0	20
4	20-25	50xl05	15,6	1/9	0	20
6	2-=25	50xl05	23,3	0, 9	0	-
8	30	50xl0s	22, 6	0, 56	-	-
10	30	50xl05	21,8	0,43	0	-
12	30	SOxlO5	20,8	0,22	0	-

Este experimento foi completado com algumas horas de secagem adicionais, nas mesmas condições, reduzindo o 15 teor de água abaixo de 15 %.

Secagem a 30°C a 1 x 10⁶ mPa (10 mbar).

125 g da Batelada de dalbavancina 027, 6, 4 % de

MAG (% de área da HPLC), foram secados a 30°C e 1 x 10⁶ mPa (10 mbar) por 24 horas, usando o mesmo equipamento do expe-

rimento anterior. Os resultados obtidos são descritos na

Tabela 4B.

TABELA 4B

Tempo	T	P	% de KF	% de	% de	% de Água
h	°C	MPa	Acetona	Delta MAG	pulverizada
0	-	-	1,6	3,21	-	20
2	30	IxlO6	13,0	1,09	0	20
4	30	IxlO6	15,08	1, 18	0	20
6	30	IxlO6	16,8	0,02	0	-
24	30	IxlO6	8,89	0,02	0

A partir destes experimentos de laboratório, pode ser concluído que o processo de secagem pode ser simplificado adicionando a água ao produto sólido. Estes resultados foram inesperados, uma vez que a degradação da dalbavancina para MAG é uma etapa de hidrólise, poder-se-ia esperar que o aumento na água aumentaria o processo de degradação. Neste 10 modo, a acetona é rapidamente removida do produto, com isso reduzindo o tempo de secagem e evitando a formação de MAG adicional. Além disso, pode ser observado (Tabela 4B) que uma pressão residual menor deu uma redução significativa do processo de secagem. Também é surpreendente que o nível de 15 acetona fosse reduzido na presença de uma grande quantidade de água.

Secagem da Dalbavancina em Secadora de Tambor Rotativo

A dalbavancina úmida foi colocada em uma secadora de tambor rotativo, DR 216, e secada a 29-32°C (temperatura 20 externa) com vácuo máximo [< 50 x 10⁵ mPa (50 mbar) ] . No inicio, a temperatura interna diminuiu de 30 para 17-18°C e

então, quando começou a aumentar, uma amostra de produto foi tirada para análise (17,2 % de água e 9,5 % de acetona) . Neste ponto, a água com baixo teor de endotoxinas (cerca de 20 %, p/p) foi pulverizada na secadora sobre o produto agitado e foram tiradas amostras adicionais, na hora, para análise. Após duas horas, a água com baixo teor de endotoxinas foi pulverizada novamente até que a quantidade de acetona fosse menor do que 0,5 %, (Tabela 4C).

TABELA 4C

Temperatura externa 29-30°C Pressão = 10 χ 10⁵-15 χ 10⁵ mPa

Tempo h	Peso Kg	Temp.Int.	Água adicionada mL (*)	N°da análise	% de água	% de acetona	% de área da MAG
0			19,1				0, 11
1		17,4					* *
2		18,3					**
3		23,5		200201019	17,27	9,52	*
4,5		26, 8	500	tf	13, 59	4,10	0,13
6,5		28,1	500	rr	19,60	0, 61	0,16
8,5		28,1		tf	22,38	0,13	0,12
9,5		28,5		ft	19,86	0,12	0,13
11,5		21,9		ir	17,68	0, 09	0,31
15		29,5		If	14,11	n.d.	0,38

Peso final de 2592 g, N- da An. 200201027: 13,93 % de água (K.F.), 0,12 % de acetona, 0,38 % de MAG.

(*) a água foi pulverizada na secadora de tambor rotativo após a amostragem

Comparação da Secagem na Presença e na Ausência de Água

Este estudo é uma comparação entre os processos de secagem das bateladas de dalbavancina 027 e 027/R realizados na ausência (batelada 027) e na presença de água (027/R) . As

bateladas de dalbavancina 027 (14,6 kg) e 027/R (8,3 kg) foram secadas sob vácuo, a 25-35°C (temperatura interna), usando uma secadora de tambor rotativo (DR 216) . A batelada 027 foi secada sem adicionar água. Em contraste, quatro 5 adições de 400 mL cada de água com baixo teor de endotoxina foram pulverizadas sobre a batelada 027/R. Durante cada secagem, as amostras de dalbavancina foram tiradas em tempos específicos, para análise. Os resultados são descritos na Tabela 5. Para a batelada 027, a MAG foi somente determinada 10 no final do processo de secagem.

TABELA 5

	Lote	Lot 027/R
Horas	Temp (’C)	Pressão mPa	KF (%)	Acetona (%)	MAG (%)	Temp (“C)	Pressão mPa	KF (%)	Acetona (%)	MAG (%)	Água adicionada (mL)
0	32	280xl05			0,52(*)	30	171xl05			0,22 (°)
2	29	32
3	-	-				23	57xlOs	16	6,7	0,23
7	-	-				29	1X105	7,43	3, 94	0,44	400
9	-	-				28,4	2xl05	8	2,6	0, 48	400
11	-	-				28	4xl05	10	1,5	0,59	400
12,5	-	-				27	12xlOS	13, 9	1	0,74	400
15	-	-				27,3	9xl05	12	0, 45	0, 88	-
17	35	0	5,5	2,9
18	-	-	-	-		27,5	8X105	11,5	0,26	0, 96	-
26	37,8	-	-	-
65	35,7	0	1,6	3,1	n.a.
N° da análise 200101408 MAG. 6,46% K.F. 1,63% Acetona 3,14%	N° da análise 200101944 MAG. 1,81% K.F. 11,86% Acetona 0,27%

(*) N° da An. 200101392 (°) N° da An. 200101913

Dados da Produção em Escala Integral

Abaixo, na Tabela 6, está um resumo do processo e dos níveis de MAG entre as campanhas de escala integral de 2002 e 2004.

⁵ ΤΆΒΕ1Α 6

Campanha		2002			2004
Lote	020004/R	02005/R	020006	DA204001	DA2040002	DA2040003
% de MAG	2, 3	0, 8	1,7	0,4	0,3	0,3

No Processo de 2002, o produto de dalbavancina é secado sob vácuo a menos do que 30°C. Em diversos tempos, a água com baixo teor de endotoxinas é pulverizada sobre o produto. A secagem é continuada até que o teor de acetona 10 seja menos do que 0,5%.

No processo de 2004, o API da dalbavancina é recuperado por centrifugação, lavado com acetona gelada (010°C), e secado sob vácuo (temperatura interna a <25°C). A MAG é o degradante primário de dalbavancina e a sua formação 15 é dependente da temperatura. Durante o processo de secagem, a água é adicionada para substituir a acetona, para obter, no final, um teor de acetona de menos do que 1,5% (GC) .

Conforme aparente a partir da Tabela 5, a secagem em baixa temperatura na presença de água resultou em uma quantidade 20 inesperadamente mais baixa de acetona presente (comparar 0,27% no Lote 027/R com 3,14% no Lote 027) e uma quantidade de produto de degradação de MAG inesperadamente baixa (comparar 1,81% no Lote 027/R com 6,46% no Lote 027).

Portanto, um método para secar a dalbavancina 25 inclui as etapas de adicionar água ao produto de dalbavanΖ75

cina para substituir a acetona. Uma quantidade preferida de água a ser adicionada é cerca de 20 % do produto seco final presumido. Alternativamente, a quantidade de água pode ser cerca de 15 %, alternativamente cerca de 25 %, alternativamente cerca de 30 %, alternativamente cerca de 40%, alternativamente cerca de 45 %, alternativamente cerca de 50 % do produto seco final presumido.

Um método para secar a dalbavancina pode incluir as etapas de secar o produto de dalbavancina por cerca de 2 horas, sem a adição de qualquer água, em torno de 13332,24 Pa (100 torr) e em uma temperatura de menos do que cerca de 25°C. A água com baixo teor de endotoxinas é então pulverizada sobre o produto e o produto é então secado por cerca de duas horas mais. 0 nível de acetona é então amostrado e checado. Se o nível for mais do que cerca de 1,5%, a água adicional é pulverizada sobre o produto e o produto é novamente secado até que o nível de acetona seja menos do que cerca de 1,5%.

Manufatura

Todas as operações de manufatura de solução em massa ocorrem em uma área de classe 100.000 (Grau D). Os despejamentos assépticos ocorrem em uma área de fluxo de ar laminar de classe 100 (Grau A).

Um vaso de manufatura adequado é carregado com cerca de 80% do volume de batelada teórico de Agua para Injeções. A solução é misturada e a temperatura é mantida entre 15-30°C. A dalbavancina é adicionada e misturada até que ela seja dissolvida. Pelo menos um estabilizador é adicionado à solução e misturado até estar dissolvido. A água para injeção é adicionada para levar a solução até o volume final e o pH é ajustado, se necessário, com HC1 a 0,IN ou NaOH a 1,0N até um pH apropriado. A solução em massa é esterilizada por filtração através de dois filtros de esterilização de 0,2 micron, em série, para um vaso receptor esterilizado. (Um pré-filtro pode ser usado, se necessário, para auxiliar na clareza do filtro ou para reduzir a carga de partículas para os filtros de esterilização). A solução é assepticamente despejada em frascos pequenos de vidro do Tipo I estéreis/despirogenados. As tampas de liofilização siliconizadas estéreis são parcialmente inseridas na posição de liofilização e os frascos pequenos são transferidos para a câmara de liofilização.

0 processo de liofilização é monitorado pelo uso de sondas de termopares para frascos pequenos representativos. Os frascos pequenos são congelados a -45°C e mantidos

I por 3 horas, após o que é aplicado vácuo. A temperatura de prateleira é ajustada para -25°C. Quando todos os termopares estiverem -29°C ou mais quentes, a temperatura de prateleira é ajustada para 0°C. Quando todos os termopares estiverem 5°C ou mais quentes, a temperatura de prateleira é ajustada para +30°C. Quando todos os termopares estiverem +27°C ou mais quentes, os frascos pequenos são mantidos por 14+2 horas. A câmara é restabelecida para a pressão atmosférica pela introdução de nitrogênio estéril que tenha sido filtrado através de um filtro de 0,2 micron e os frascos pequenos são então vedados colapsando as prateleiras de

¹⁵ liofilização. Os frascos pequenos são então removidos da câmara e as vedações de alumínio são aplicadas.

Todos os componentes e o equipamento são esterilizados por processos apropriados. Os frascos pequenos são lavados e esterilizados em um forno de ar quente, em uma temperatura não menor do que 255°C por não menos do que 3 horas. As tampas são esterilizadas em autoclave por vapor, em uma temperatura de 123-125°C e uma pressão da câmara de cerca de 227, 53 kPa (33 psi) . O tempo de contato na faixa estéril é tipicamente 50-60 minutos.

A validação dos processos de esterilização utiliza a abordagem de matança exagerada para os ciclos de esterilização tanto de vapor quanto de calor seco. Todos os ciclos de esterilização proporcionam uma letalidade suficiente para proporcionar pelo menos uma probabilidade de 10⁶ de sobrevivência microbiana, independente dos microorganismos de ocorrência natural. Todos os ciclos são projetados com letalidades suficientes para proporcionar não menos do que reduções de log 12. Os ciclos de calor seco proporcionarão um mínimo de uma redução de log 3.

Estudos da Estabilidade

A dalbavancina foi verificada decompor-se durante o processo de liofilização. A adição de um estabilizador foi verificada diminuir a quantidade de decomposição do componente ativo B_o durante os estudos de estabilidade.

É mostrada nas Figuras 1-4 a estabilidade de diversas formulações liofilizadas de dalbavancina a 25°C e 40°C, ao longo do tempo. Sob as orientações da FDA, um

¹⁵ produto que é estável por três a seis meses, a 40°C, é assumido ser estável por dois anos na temperatura ambiente. As Figuras IA, 2A, 3A e 4A mostram a diminuição na quantidade de componente de dalbavancina B_o, que é um dos componentes de dalbavancina bactericidamente ativos. Conforme discutido acima, o componente B_o é também um dos componentes principais da maior parte das composições de dalbavancina. As Figuras 1B, 2B, 3B, e 4B mostrara o aumento na quantidade de MAG, um componente menos ativo acreditado ser um produto de decomposição de um ou mais dos outros componentes de dalbavancina. A Tabela 7 lista as composições para cada uma das formulações usadas nos estudos de estabilidade, cujos resultados são mostrados nas Figuras 1-4. Quaisquer destas composições poderíam ser usadas para produzir uma forma de dosagem sem partículas, estéril, estável.

TABELA 7

Composições de Diversas Formulações de Dalbavancina

Composição	Dalbavancina (mg/frasco pequeno)	Manitol (mg/frasco pequeno)	Lactose (mg/frasco pequeno)	PH
A	250	62,5	—	3,4
B	250	—	—	3,69
C	250	62,5	—	3, 80
D	250	—	—	3, 01
E	250	62,5	—	3, 01
F	250	—	—	4,5
G	250	62,5	—	4,5
H	250	62,5	—	5,3
I	250	125	—	5,0
J	250	62,5	—	5,0
K	250	125	—	4,5

Composição	Dalbavancina (mg/frasco pequeno)	Manitol (mg/frasco pequeno)	Lactose (mg/frasco pequeno)	pH
L	250	62,5	—	4,5
M	250	62,5	62,5	4,5
N	250	—	125	4,5
0	250	125	—	3,3

Conforme visto nas Figuras IB e 2B, em T = 0, já existe uma quantidade significativa (mais do que 4%) de MAG presente para a Composição D, que contém a dalbavancina sem nenhum outro componente que não seja de dalbavancina e que 5 não tenha sido ajustada no pH (pH cerca de 3,01), a 25°C e 40°C, respectivamente. Na temperatura mais elevada, a formação de MAG aumentou em uma taxa bem maior. Após 3 e 6 meses a 40°C, a Composição D tinha 21,0 % de MAG e 23,7 % de MAG, respectivamente (ver a Figura 2B) . Isto implica que a dalbavancina pura é altamente instável, e que meramente liofilizar a dalbavancina resulta em degradação significativa. Além disso, a secagem normal também resulta na formação do produto de degradação de MAG. A armazenagem a -20°C é requerida para algumas formulações de dalbavancina.

Quando o pH é aumentado, sem a adição de quaisquer outros componentes que não sejam de dalbavancina, a estabilidade aumentou. A Composição D não foi ajustada no pH e tinha um pH de cerca de 3,01. A Composição B foi ajustada para pH 3,69. A Composição F foi ajustada para pH 4,5.

Conforme visto nas Figuras IA e 2A, à medida que o pH era aumentada, havia menos degradação inicial de Bo e menos degradação global ao longo do tempo. Analogamente, nas Figura

1Β e 2B, houve menos formação de MAG nas composições que foram ajustadas para um pH mais elevado, tanto inicialmente quanto ao longo do tempo, em ambas as temperaturas.

A adição de manitol foi também mostrada aumentar a estabilidade da dalbavancina significativamente. A degradação do fator B_o e o aumento na MAG ao longo do tempo foram também reduzidos significativamente em comparação com a Composição D, que também não foi ajustada no pH, porém não continha nenhum manitol. Conforme visto na Composição E 10 (62,5 mg de manitol, aproximadamente pH 3,01), mesmo sem nenhum ajuste do pH, houve um aperfeiçoamento significativo na estabilidade, tanto no processo de liofilização inicial quanto ao longo do tempo. No tempo T - 0, há aproximadamente 2% de MAG presente em T = 25°C (ver a Figura IA) e T = 40°C 15 (ver a Figura 2A) , que é menos do que a metade da quantidade de MAG presente na Composição D em T = 0.

À medida que o pH era aumentado e a quantidade de manitol era mantida constante, a estabilidade da dalbavancina também aumentava. Uma comparação das Composições E, C, e G 20 ilustra que, à medida que o pH era aumentado de cerca de 3,01 para 3,8 a 4,5, a quantidade de degradação de dalbavancina também diminuía. Conforme visto nas Figuras IA e 2A, à medida que o pH era aumentado, houve menos degradação inicial de B_o e menos degradação global ao longo do tempo.

Analogamente, nas Figuras 1B e 2B, houve menos formação de MAG nas composições que foram ajustadas para um pH mais elevado, tanto inicialmente quanto ao longo do tempo.

J?S1

O aumento da quantidade de manitol, ao mesmo tempo mantendo o pH constante, também resultou em um aumento na estabilidade. Por exemplo, embora os Compostos L e K, que contêm 62,5 mg e 125 mg de manitol em pH 4,5, respectiva5 mente, tenham quantidades similares de B_o em T = 0, a mudança na porcentagem de B_o após 12 meses foi significativamente menor para o Composto K. Um padrão similar pode ser visto para os Compostos J e I, que contêm 62,5 mg e 125 mg de manitol em pH 5,0, respectivamente.

Embora a mudança do pH das composições contendo somente manitol resultasse em mudanças na quantidade de degradação de B_o, não havia nenhuma tendência previsível. Os Compostos L, J, e H contêm 62,5 mg de manitol em pH 4,5, 5,0, e 5,3, respectivamente. As mudanças na porcentagem de

Bo após 12 meses foram 1,0, 1,2, e 0,7, respectivamente, a

25°C. Os Compostos O, K, e I contêm 125 mg de manitol em pH 3,3, 4,5, e 5,0, respectivamente. As mudanças na porcentagem de Bo para estas composições após 12 meses foram 0,5, 0,1, e 0,3, respectivamente, a 25°C. Notavelmente, após 2 meses a

40°C, a quantidade de componente B_o somente diminuiu em 1,9 % no Composto O e 1,0 % no Composto M (Ver a Figura 4A) .

Embora a mudança na porcentagem de B_o para o Composto 0 (125 mg de manitol, pH 3,3) seja similar às outras diferenças verificadas para as composições contendo 25 125 mg de manitol (ver as Composições I e K), conforme visto na Figura 3A, a quantidade de degradação inicial de B_o em T = 0 é significativamente menor para o Composto O (88,3% de B_o) . Este é especialmente o caso quando comparado com o

Composto Κ (pH 4,5) e ο Composto I (pH 5,0), que tinham 85,3% de Bo e 85,5% de B_o, respectivamente. As diferenças entre a quantidade de B_o presente e a quantidade de MAG presente no Composto O (ver as Figuras 3A e 3B) podem mais provavelmente ser explicadas pelo fato que, como explicado anteriormente, B_o não é o único componente de dalbavancina que degrada para formar MAG.

A lactose também parece ser um estabilizador adequado para a dalbavancina. Para o Composto N, que contém 10 125 mg de lactose em pH 4,5, a mudança na porcentagem de B_o durante 12 meses foi somente 0,6 a 25°C. Após 2 meses a 40°C, a mudança na porcentagem de B_o foi somente 1,4. A lactose sozinha, entretanto, não parece estabilizar a dalbavancina tão bem como o manitol. Em pH 4,5, o componente B_o 15 do Composto K (125 mg de manitol) somente diminuiu em 1,0 após 2 meses a 40°C.

A combinação de manitol e lactose também parece estabilizar a dalbavancina e é particularmente preferida. O manitol e a lactose têm propriedades estabilizantes simila20 res. O manitol, entretanto, é um diurético. Portanto, em uma modalidade preferida, a quantidade de manitol é minimizada. 0 Composto M contém 62,5 mg cada de manitol e lactose. Conforme visto na Figura 3A, a mudança na porcentagem de MAG durante 12 meses a 25°C foi somente 0,6. Além disso, como 25 visto na Figura 4A, a quantidade de MAG somente aumentou em 2,1% após 3 meses a 40°C. Isto é menos degradação do que aquela vista para os Compostos N (125 mg de lactose) e K (125 mg de manitol), os quais, ambos, mostraram um aumento

na quantidade de MAG de 2,9% após 3 meses a 40 °C. Foi inesperado que uma combinação de metade de cada uma das quantidades de manitol e lactose usadas em outras formulações resultaria em um aumento maior na estabilidade da 5 dalbavancina.

O dado adicional de estabilidade para a dalbavancina estabilizada com manitol e lactose em torno de pH 4,5 é descrito nas Tabelas 8A-D abaixo para diversas temperaturas.

TABELA 8A

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 554399 a

40°C/75% de UR (frasco pequeno de 500 mg, manitol e lactose, pH 4,5)

TESTE		TEMPO	MESES)
0	1	3	6
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	95,4	95,7	92,2	91,6
Distribuição dos Componentes
(Ao + Ai)	2, 6	2, 5	2,4	2,5
Bo	87,0	86, 0	85, 4	84,9
(Bi + B2)	5, 8	6,2	6,3	6,4
Degradantes
MAG	1,0	1,5	1,9	2,2
Máximo Individual não Especificado	n.d.	n.d.	n. d.	n.d.
Degradantes totais	1,0	1,5	1,9	2,2
Tempo de Reconstituição	115	57	47	55
Matéria Particulada
Partículas ^10 micra	Atende a USP	—	—	—
Partículas ^25 micra	Atende a USP	—	—	—
Umidade	0, 4	0,5	0,5	0, 6
pH da Solução Reconstituída	4,3	4,6	4,5	4,5
Esterilidade	Atende a USP	—	—	—

n.d, não detectado não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

101

TABELA 8B

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 554399 a 30°C/65% de UR (frasco pequeno de 500 mg, manitol e lactose, pH 4,5)

TESTE	TEMPO (MESES)
0	1	3	6	9	12
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	95,4	97,3	94,2	93,7	94,0	93,8
Distribuição dos Componentes
(Ac + Ai)	2,6	2,5	2,5	2,5	2,4	2,4
B0	87,0	86,2	85,8	85,3	86,7	85,9
(By + B2)	5,8	6,2	6,4	6,5	5,5	6,4
Degradantes
MAG	1,0	1,1	1,3	1,5	1,7	1,7
Máximo Individual não Especificado	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
Degradantes totais	1,0	1,1	1,3	1,5	1,8	1,7
Tempo de Reconstituição	115	146	53	40	37	49
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas £10 micra	Atende a USP	—	—	—	—	—
Partículas £25 micra	Atende a USP	—	—	—	___	—
Umidade	0,4	0,4	0,4	0,5	0,6	0,5
pH da Solução Reconstituída	4,3	4,5	4,5	4,4	4,5	4,5
Esterilidade	Atende a USP	—	—	—	—	—

n.d. não detectado

--- não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

102

TABELA 8C

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 554399 a 25°C/60% de UR (frasco pequeno de 500 mg, manitol e lactose, pH 4,5)

TESTE	TEMPO (MESES)
0	3	6	9	12
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	95,4	94,6	93,2	93,9	92,6
Distribuição dos Componentes
(Ao + AJ	2, 6	2, 5	2,5	2,5	2,4
Bo	87,0	86,0	85,9	87,0	86,2
(Bi + B2)	5,8	6,4	6,3	5,7	6,4
Degradantes
MAG	1,0	1,2	1,2	1,4	1,4
Máximo Individual não Especificado	n.d.	n. d.	n.d.	n.d.	n.d.
Degradantes totais	1,0	1,2	1,2	1,4	1,4
Tempo de Reconstituição	115	55	68	54	50
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas £10 Micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP
Partículas £25 Micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP
Umidade	0,4	0,3	0,4	0,4	0,5
pH da Solução Reconstituída	4,3	4,5	4,5	4,6	4,6
Esterilidade	Atende a ] USP	—	—	—	Atende a USP

n.d. não detectado

--- não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

103

TABELA 8 D

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 554399 a 5°C (frasco pequeno de 500 mg, manitol e lactose, pH 4,5)

		TEMPO (MESES)
TESTE	0 1	3	6	9	12
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	95,4	94,7	92,7	93,7	93,4
Distribuição dos Componentes
(Ao + AO	2, 6	2,5	2,5	2,5	2,4
Bo	87,0	86,2	86, 1	87,6	86,9
(Bi + B2)	5,8	6,4	6,4	5,7	6,4
Degradantes
MAG	1,0	0,9	0,9	1,0	0,9
Máximo Individual não Especificado	n.d.	n.d.	n.d.	n. d.	n.d.
Degradantes totais	1,0	0,9	0, 9	1,0	0,9
Tempo de Reconstituição	115	90	88	75	72
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas £10 micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP
Partículas ^25 Micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP
Umidade	0, 4	0,3	0,3	0,4	0,4
pH da Solução Re cons t i tuí da	4,3	4,5	4,5	4,5	4,6
Esterilidade	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP

n.d. não detectado

--- não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

104

Os dados a partir de estudos adicionais da estabilidade de longa duração estão listados nas Tabelas 911. As amostras foram analisadas por HPLC de fase reversa utilizando gradiente de fase móvel binário e um sistema de 5 detecção por UV, para determinar a estabilidade da formulação de dalbavancina. O teor de dalbavancina foi determinado usando um padrão de referência externo. A porcentagem de distribuição dos componentes de dalbavancina foi calculada comparando a área de cada componente individual com a área 10 total de todos os componentes principais da droga. A porcentagem de distribuição de impurezas foi calculada comparando cada área de impureza individual com a área cromatográfica total.

As amostras foram testadas quanto ao ensaio de 15 HPLC, bioensaio, teor de água, limites microbianos, pH, distribuição de HPLC, ou impurezas totais. Os resultados são mostrados nas Tabelas 9-11. O dado de estabilidade para a Batelada 025 é mostrado nas Tabelas 9A, 10A, e 11A, que tem 1,5% de MAG em T = 0. O dado de estabilidade para a Batelada 20 020005/R é mostrado nas Tabelas 9B, 10B, e 11B, que tem 0,8% de MAG em T = 0, como um resultado de um processo de secagem diferente que é descrito abaixo.

A dalbavancina demonstrou boa estabilidade durante a armazenagem a -20°C (ver as Tabelas 9A-B) , sem nenhuma 25 alteração significativa no bioensaio, no ensaio de HPLC, na distribuição de HPLC, ou nas impurezas totais. O pH permaneceu inalterado e um ligeiro aumento no teor de água foi observado.

105

A degradação foi observada durante 36 meses a 5°C (ver a Tabela 10A) , como evidenciado por um aumento no teor de MAG em torno de 2,9% e uma diminuição correspondente no Fator B_o em torno de 3,6%. Não foi observada nenhuma 5 tendência nas impurezas totais, e o bioensaio e o pH permanecem essencialmente inalterados. São vistos resultados similares para a Batelada 020005 (ver a Tabela 10B).

Foi observada uma degradação mais extensa durante a armazenagem a 25°C durante 12 meses (ver a Tabela 11A) , 10 com um aumento em MAG de cerca de 10,2% e uma diminuição no fator B_o de aproximadamente 8,5%. Os níveis dos outros fatores, substâncias relacionadas, e pH permaneceram inalterados. 0 teor de água aumentou em torno de 1,6%.

106

TABELA 9A

Dados de Estabilidade para a Batelada de Dalbavancina Não

Formulada 025 a ~20°C (pH 3,5)

TESTE	TEMPO (MESES)
0	3	6	9	12	18	24	36
Aspecto Físico	—	—	—	—	—	—	—	—
Ensaio de HPLC (anidra, sem base, % p/p	92,0	93,3	90,1	88,6	88,4	91,1	89, 6	90,3
Distribuição dos Componentes (HPLC S de AUC)
Ao + Ai	4,0	4,0	4,0	4,0	3,9	3,9	3,9	3,8
Bo	83, 4	83,5	82,1	82, 9	84,4	83,8	83,5	82,7
Βχ + B2	7,5	7,4	8,1	8,0	7,4	7,3	7,5	7,9
Substâncias Relacionadas (HPLC % de AUC)
MAG	1,5	1,5	1,3	1,6	1,3	1,5	1,4'	1,2
Máximo Individual Não Especificado	0,2	0, 2	0, 2	0,2	0,2	0,2	0,2	0, 2
Impurezas Totais	5,1	5,1	5,8	5,2	4,3	4,9	5,2	5,6
Umidade (% p/p)	11,0	13,3	12,1	12,6	12,1	12,8	12,2	14,2
pH	3, 0	2,9	3,0	2,9	2,9	2,9	2,9	2,8
Limites Microbianos*	<10,<10 cfu/g	—	—	—	—	—	___	—

--- Nâo testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade * Contagem aeróbica total, contagem total de fungos e leveduras combinados

107

TABELA 9Β

Dados de Estabilidade para a Batelada de Dalbavancina Não

Formulada 020005/R a -20°C

TESTE	TEMPO (MESES)
0	3	6	9	12	18
Aspecto Fisico	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado
Ensaio de HPLC (anidra, sem base, % p/p)	92,0	94,4	92,5	94, 6	91,0	92,1
Distribuição dos Componentes (HPLC % de AUC)
Ao + Ai	2,5	2,5	2,5	2,5	2,4	2,5
Bo	87,1	87,5	86,7	86,6	86,5	87,3
Βχ + B2	6,2	5,6	6,2	6,2	6, 6	5,9
Substâncias Relacionadas (HPLC % de AUC)
MAG	0, 8	0,9	0,9	0, 8	0,9	0,9
Máximo Individual Não Especificado	0,2	0,2	0,2	0,3	0,2	0,2
Impurezas Totais	4,3	4,5	4,6	4,7	4,4	4,4
Umidade (% p/p)	18,2	20,1	20,1	20,3	20,0	19, 6
PH	2,4	2, 5	2,4	2,5	2,5	2,6
Limites Microbianos*	2,1 cfu/g		—	—	—	—

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

Contagem aeróbica total, contagem total de fungos e leveduras combinados

108

TABELA 10A

Dados de Estabilidade para a Batelada de Dalbavancina Não

Formulada 025 a -5°C

TESTE	TEMPO (MESES)
0	3	6	9	12	18	24	36
Aspecto Físico	—	—	—	—	—	—	—	—
Ensaio de HPLC (anidra, sem base, % p/p	92,0	91,0	90,3	91,8	90, 5	89,3	88,2	87,3
Distribuição dos Componentes (HPLC % de AUC)
Ao + Αχ	4,0	4,0	3,9	3,9	3,8	3,9	3,8	3,7
Bo	83,4	83,1	81,3	81,8	83,3	82,2	81,3	79,8
Bi +	7,5	7,4	7,9	7,7	7,2	7,2	7,2	7,5
Substâncias Relacionadas (HPLC % de AUC)
MAG	1, 5	1,8	2,0	2,5	2,8	3,3	3,8	4,4
Máximo Individual Não Especificado	0,2	0,3	0,3	0,2	0,2	0,2	0,2	0,3
Impurezas Totais	5,1	5,5	6,9	6, 5	5,7	6,7	7,7	9,0
Umidade (% p/p)	11,0	12,3	11,8	13,2	15,0	14,8	14,9	17,6
PH	3, 0	3,0	3,0	2,9	2,9	2,9	2,9	2,8
Limites Microbianos*	<10,<10 cfu/g	—	—	—	<1,3 cfu/g	—	<1,1 cfu/g	<1,<1 cfu/g

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

Contagem aeróbica total, contagem total de fungos e leveduras combinados

109

TABELA 10B

Dados de Estabilidade para a Batelada de Dalbavancina Não

Formulada 020005/R a 5°C

	TEMPO (MESES)
TESTE	0	3	6	9	12	18
Aspecto Físico	PÓ branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado	Pó branco a castanho amarelado
Ensaio de HPLC (anidra, sem base, % p/p)	92,0	92, 0	91,7	91,8	89,2	89,7
Distribuição dos Componentes (HPLC % de AUC)
Ao + Ai	2,5	2,5	2,5	2,4	2,4	2,3
B0	87,1	87,1	85, 6	85,3	84,6	84,3
Bi + B2	6,2	5,6	6,2	6,1	6,4	5, 5
Substâncias Relacionadas (HPLC % de AUC)
MAG	0,8	1,5	1,9	2,1	2, 6	4,1
Máximo Individual Não Especificado	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Impurezas Totais	4,3	4,9	5, 8	6,3	6, 6	7,9
Umidade (% p/p)	18,2	17,4	17,2	16,4	15,4	14,2
PH	2,4	2,5	2,4	2,5	2,5	2,5
Limites Microbianos*	2,1 cfu/g	—	—	—	<1,<1 cfu/g	—

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

Contagem aeróbica total, contagem total de fungos e leveduras combinados

110

TABELA 11A

Dados de Estabilidade para a Batelada de Dalbavancina Não

Formulada 025 a 25°C/ 60% de UR.

TESTE	TEMPO (MESES)
0	1	3	6	12
Aspecto Físico	—	—	—	—	—
Ensaio de HPLC (anidra, sem base, % p/p	92,0	90,9	87,0	85,2	78,8
Distribuição dos Componentes (HPLC % de AUC)
Ao + Ai	4,0	3,9	3,8	3,7	3,4
Bo	83,4	81,6	79,5	76,3	74,9
B1 + B2	7,5	7,4	7,0	7,3	6,3
Substâncias Relacionadas (HPLC % de AUC)
MAG	1,5	3,6	6, 0	8,1	11,7
Máximo Individual Não Especificado	0,2	0,2	0, 2	0,4	0,3
Impurezas Totais	5,1	7,1	9, 6	12,7	15,4
Umidade (% p/p)	11,0	11,3	12,1	12,9	12, 6
pH	3,0	3, 0	3,0	3,0	3, 0
Limites Microbianos*	<10,<10 cfu/g	—	—	—	1,<1 cfu/g

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

Contagem aeróbica total, contagem total de fungos e leveduras combinados

111

TABELA 11B

Dados de Estabilidade para a Batelada de Dalbavancina Não

Formulada 020005/R a 25°C/ 60% de UR.

TESTE	TEMPO (MESES)
0	1	3	6
Aspecto Fisico	Pó branco	Pó branco	Pó branco	Pó branco
Ensaio de HPLC (anidra, sem base, % p/p	92,0	91,2	87,2	83,3
Distribuição dos Componentes (HPLC % de AUC)
Ao + Αχ	2,5	2,5	2,3	2,3
Bo	87,1	84,9	82,3	78,7
Bi + B2	6,2	5,3	5,3	5,8
Substâncias Relacionadas (HPLC % de AUC)
MAG	0,8	3,6	6,1	8,2
Máximo Individual Não Especificado	0,2	0,2	0,3	0,7
Impurezas Totais	4,3	7,3	10,1	13,2
Umidade (% p/p)	18,2	15,2	13, 8	12, 6
PH	2,4	2,6	2,5	2,5
Limites Microbianos*	2,1 cfu/g	—	—	—

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

Contagem aeróbica total, contagem total de fungos e leveduras combinados

112

VX

Foram também conduzidos testes de estabilidade do produto esterilizado. As amostras foram testadas quanto ao aspecto da torta e da solução, tempo de reconstituição, pH, ensaio de HPLC, bioensaio, teor de água, esterilidade, 5 distribuição de HPLC, e substâncias relacionadas. Os resultados são mostrados nas Tabelas 12-14.

O produto liofilizado mostra boa estabilidade quando armazenado a 5°C, com somente alterações pequenas no ensaio de HPLC e na distribuição de HPLC (ver as Tabelas 12A 10 e B) . Â medida que a temperatura aumenta (ver as Tabelas 13 e 14) , há uma diminuição no Fator B_o, com um aumento correspondente na MAG. Os outros fatores não parecem ser afetados pela temperatura. O aspecto do produto e o pH não parecem ser afetados pela temperatura. Também não é possível 15 determinar uma tendência clara no tempo de reconstituição, considerando que a inspeção visual do produto solubilizado pode requerer alguns segundos.

113

TABELA 12A

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 149570 a

5°C (liofilizada, manitol, pH 3,5)

	TEMPO (MESES)
	0	3	6	9	12	18	24	36
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a antarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	97,3	99,8	100,7	100,2	100,0	100,2	99,3	104, 4
Distribuição dos Componentes
(Ao + Ai)	3, 6	3,6	3, 6	3,7	3,6	3,6	3,7	3,7
Bq	79,4	79,6	80,3	80,1	80,0	80,1	80,0	81,3
Pós Bo	12,8	12,3	11,3	11, 6	11,6	11,7	11, 6	10, 6
Degradantes
MAG	0, 6	0, 6	0,7	0, 6	0,7	0,7	0,7	0,7
Tempo de Re cons t i tui ç ão	90	45	40	45	40	40	41	66
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas £ 10 micra	—	—	—	—	—	—	—	—
Partículas ^25 micra	—	—	—	—	—	—	—	—
Umidade	0,8	1,4	1,2	nd	1,1	1,6	1,5	1,3
pH de Solução Reconstituída	3,7	3,5	3,5	3,5	3, 5	3,4	34,	3, 5
Esterilidade	Estéril	—	—	—	Estéril	—	Estéril	Estéril

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade * Análise efetuada com o método de HPLC de revelação. As dalbavancinas Bj e B₂ não foram resolvidas com este método

114

TABELA 12B

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 442378 a

5°C (liofilizada, manitol, pH 3,5)

	TEMPO (MESES)
	0	3	6	9	12	18
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a ama reio claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	101, 8	102,9	100, 8	99, 9	101, 4	99, 4
Distribuição dos Componentes
Aq + Ai	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
Bo	85,7	85, 5	85,6	85, 3	85,3	85,5
Bi + B2	5,5	5, 8	5,6	5,7	6,2	5,7
Degradantes
MAG	1,7	1, 8	1,6	1,7	1,7	1,9
Máximo Individual Não Especificado	n.d.	n.d	0,1	n.d	n.d.	n.d.
Degradantes Totais	1,7	1,8	1,8	1,7	1,7	1,9
Tempo de Reconsituição	75	46	43	43	32	32
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas £ 10 micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP	—
Partículas £ 25 micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP	—
Umidade	0,3	0,3	0,4	0,7	0, 4	0, 6
pH de Solução Reconstituída	3,4	3,4	3,4	3,2	3,4	3,3
Esterilidade	Estéril	—	—	—	Estéril	—

n.d. Não detectado

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

115

TABELA 13A

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 149570 a

25°C/ 60% de UR (liofilizada, manitol, pH 3,5)

TESTE	TEMPO (MESES)
	0	1	3	6	9	12
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	97,3	99,4	98,3	100,3	99,7	98,7
Distribuição dos Componentes
(Ao + AJ	3, 6	3,7	3,6	3, 6	3,6	3,7
Pós Bo*	12,8	10, 6	12,1	11,1	10,9	11,6
Degradantes
MAG	0,6	0, 8	1,1	1,3	1,8	1,8
Tempo de Reconstituição	90	50	45	45	30	40
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas > 10 micra	—	—	—	—	—	—
Partículas 25 micra	—	—	—	—	—	—
Umidade	0, 8	nd	1,6	1,4	nd	1.6
pH de Solução Reconstituída	3,7	3,6	3, 6	3,5	3,5	3,5
Esterilidade	Estéril	—	—	—	—	Estéril

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade * Análise efetuada com o método de HPLC de revelação. As dalbavancinas Bi e B_z não foram resolvidas com este método.

116

TABELA 13B

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 442378 a

25°C/ 60% de UR (liofilizada, manitol, pH 3,5)

	TEMPO (MESES)
	0	1	3	6	9	12
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	101, 8	103, 9	100,2	98, 6	100,7	98,0
Distribuição dos Componentes
(Ao + Ai)	2,5	2,5	2, 4	2,5	2,4	2,5
Bo	85,7	85, 0	85, 5	84, 4	84,3	83, 9
(Bl + Bz)	5,5	5,8	5,4	5,7	6,1	5, 6
Degradantes
MAG	1,7	2,3	2,4	2,8	2,9	3,5
Máximo Individual Não Especificado	n.d.	n.d.	0,2	n.d.	n.d.	0,1
Degradantes Totais	1,7	2,3	2,5	2, 8	2,9	3,6
Tempo de Reconstituição	75	45	38	33	25	31
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas > 10 micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP	—
Partículas £ 25 micra	Atende a USP	—	—	—	Atende a USP	—
Umidade	0,3	0,7	0, 6	0,7	0,7	0, 8
pH de Solução Reconstituída	3,4	3,4	3,4	3,3	3,4	3,4
Esterilidade	Estéril	—	—	—	Estéril	—

n.d. Not detect = Não detectado

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

117

TABELA 13C

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 442378 a

30°C/ 65% de UR (liofilizada, manitol, pH 3,5)

TESTE	TEMPO (MESES)
	0	1	3	6	9	12
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	100,0	98,5	99,7	100, 0	95,3	96, 8
Distribuição dos Componentes		..
(Ao + Aj)	2,5	2,4	2,4	2,4	2,4	2,4
Bo	86,3	85, 6	84,7	84, 3	83,2	83,0
(Bi + B2)	5,5	5,5	5,7	5,9	6,3	5, 6
Degradantes
MAG	1,7	2,1	2,5	3, 0	3,5	4,2
Máximo Individual Não Especificado	0,1	0,1	0,2	0,2	0,2	0,2
Degradantes Totais	1,8	2,3	2,9	3,3	3,8	4,5
Tempo de Reconstituição	45	55	31	27	46	26
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas £ 10 micra	Atende a USP	—	—	—	—	—
Partículas 2 25 micra	Atende a USP	—	—	—	—	—
Umidade	0,5	0,7	0,9	0,7	0,9	0,9
pH de Solução Reconstituída	3,5	3, 6	3,3	3,4	3,3	3,3
Esterilidade	Estéril	—	—	—	—	—

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

3½

118

TABELA 14A

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 149570 a

40°C/ 75% de UR (liofilizada, manitol, pH 3,5)

TESTE	TEMPO (MESES)
0	1	3	6
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	97, 3	98, 6	94,7	95,1
Distribuição dos Componentes
(Ao + Αχ)	3,6	3,7	3, 5	3,5
Bo	79, 4	79, 8	77,1	76,5
Pós Bo *	12,8	10,5	11,9	10,7
Degradantes
MAG	0, 6	2,0	3,7	5,5
Tempo de Reconstituição	90	55	45	40
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas £ 10 micra	—	—	—	—
Partículas £ 25 micra	—	—	—	—
Umidade	0, 8	n.d.	2,0	1,7
pH da Solução Reconstituída	3,7	3,5	3, 6	3,5
Esterilidade	Estéril	—	—	—

--- Não testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade * Análise efetuada com o método de HPLC de revelação. As dalbavancinas Bi e B₂ não foram resolvidas com este método

119

TABELA 14B

Estabilidade da Dalbavancina para o Lote de Injeção 442378 a

40°C/ 75% de UR (liofilizada, manitol, pH 3,5)

TESTE	TEMPO	MESES)
0	1	3	6
Aspecto Físico	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro	Sólido branco a não totalmente branco a amarelo claro
Ensaio de HPLC	101,8	101,5	98, 6	91, 8
Distribuição dos Componentes
(Ao + Ai)	2,5	2,4	2,4	2,2
B0	85, 7	84,2	82,0	80, 6
(Bi + B2) *	5, 5	5, 8	5,6	5,2
Degradantes
MAG	1,7	3,2	5,3	6, 6
Máximo Individual Não Especificado	n.d.	0, 3	0,2	0, 5
Degradantes Totais	1,7	3, 8	5, 6	6, 6
Tempo de Reconstituição	75	46	46	41
Aspecto da Solução	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara	Solução transparente a amarela clara
Matéria Particulada
Partículas 2 10 micra	Atende a USP	—	—	—
Partículas 2 25 micra	Atende a USP	—	—	—
Umidade	0,3	0,6	0, 8	0,8
pH da Solução Reconstituída	3,4	3,4	3,4	3,4
Esterilidade	Estéril	—	—	—

n.d. Não detectado

Nâo testada neste ponto de tempo, conforme protocolo de estabilidade

120

Fotoestabilidade

A dalbavancina para injeção (frascos pequenos de

500 mg) foi também avaliada quanto à fotoestabilidade em frascos pequenos rotulados. Dez frascos pequenos rotulados foram introduzidos em uma câmara de fotoestabilidade, juntamente com um controle escuro consistindo em dez frascos pequenos rotulados, enrolados com folha de alumínio. As amostras de teste foram expostas a não menos do que 1,2 milhão de lux horas e uma energia próxima à ultravioleta integrada de não menos do que 200 watt horas/metro². As amostras foram avaliadas quanto ao aspecto, aspecto da solução, pH, umidade, e ensaio de HPLC. Os resultados desta avaliação são apresentados na Tabela 15.

121

TABELA 15

Resultados da Fotoestabilidade da Embalagem Imediata para

500 mg/Produto de Droga em frasco pequeno

Teste	Resultados
	Expostas à Luz	Controle Escuro
Aspecto	Sólido branco a não totalmente branco	Sólido branco a não totalmente branco
Aspecto da Solução	Solução amarela clara	Solução amarela clara
Ensaio (anidro, sem base)	91, 8%	92,8%
Teor de Umidade	0,3%	0,3%
PH	4,5	4,5
Tempo de Reconstituição (sec)	43	68
Distribuição dos Componentes (% de AUC)
~ Ao	0,7%	0, 7%
- AX	1,7%	1,8%
- Bo	86,0%	86,2%
- Bx	4,2%	4,3%
- b2	1, 9%	2, 0%
Substâncias Relacionadas (% de AUC)
- cD	0,3%	0,3%
- cx	0,1%	0,1%
- D0	0,2%	0,2%
- Dt	0,3%	0, 3%
- IsoBo	0,9%	1, 0%
- MAG	1,2%	1,1%
- Tricloro	0,5%	0, 5%
- RRT 0,85	0,1%	n.d.
Impurezas Totais (% de AUC)	5,4%	5,0%

n.d. não detectado

122

Uma comparação das amostras expostas à luz e de controle escuro mostra que as amostras expostas à luz permanecem comparáveis, com ligeiras modificações na potência, nos níveis de componentes de API, e nas impurezas 5 totais.

As amostras expostas à luz demonstraram a presença

de um nível muito baixo de uma impureza não especificada em

RRT 0.85, que não foi detectada nas amostras de controle escuro. A avaliação deste componente por HPLC/ΕΜ indicou que é o derivado mono-clorado dos homólogos de dalbavancina B.

Com base nestes resultados, a Dalbavancina para Injeção é considerada fotoestável em sua embalagem imediata. Eficácia aperfeiçoada e efeitos colaterais reduzidos

A dosagem semanal de dalbavancina em altos níveis de dosagem (i.e., resultando em níveis no soro surpreendentes altos e de longa duração) mostra um perfil de segurança surpreendentemente bom, similar, ou melhor, àquele observado com a terapia padrão de doses mais baixas de antibióticos convencionais, administrados diariamente ou mesmo 2-4 vezes ao dia, como demonstrado pelos Exemplos aqui contidos. Uma dosagem surpreendentemente alta (i.e., resultando em níveis no soro surpreendentes altos e de longa duração) de dalbavancina pode ser administrada, com menos freqüência do que os outros antibióticos, e sem efeitos colaterais adversos, capacitando uma eficácia aperfeiçoada e o cumprimento pelo paciente.

Conforme discutido no Exemplo 1, o tratamento com a dalbavancina resulta em uma baixa incidência de eventos

123 adversos. Os eventos adversos sérios incluem qualquer experiência de droga adversa ocorrendo em qualquer dose que resulte em morte, possa provocar a morte, resulte em hospitalização ou prolongamento de hospitalização existente, 5 ou deficiência ou incapacidade persistente ou significativa.

No ensaio de Fase II descrito no Exemplo 1, 90% das reações

adversas, tais como diarréia, náusea, hiperglicemia, dor nos membros, vômito, e constipação, foram de gravidade branda a moderada. O uso de dalbavancina no ensaio no Exemplo 1 não resultou em nenhum evento adverso sério relacionado ao tratamento com a droga de estudo.

Kits

A invenção também proporciona kits para uso nos métodos de tratamento ou profilaxia de infecções bacterianas.

Os kits incluem uma composição farmacêutica da invenção, por exemplo, incluindo pelo menos uma dose unitária de dalbavancina, e instruções que proporcionam informação a um provedor de cuidados da saúde em relação ao uso para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana. As instruções podem ser proporcionadas na forma impressa ou na forma de um meio eletrônico, tal como um disquete, CD, ou DVD, ou na forma de um endereço de página eletrônica da rede onde possam ser obtidas tais instruções. Frequentemente, uma dose unitária de dalbavancina inclui uma dosagem tal que, quando administrada a um indivíduo, seja mantido um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo de dalbavancina no plasma no indivíduo, por pelo menos 5 dias. Em algumas modalidades, um kit inclui duas dosagens unitárias a serem

124 administradas pelo menos 5 dias separadamente, frequentemente cerca de uma semana separadamente, freqüentemente incluindo uma primeira dosagem de dalbavancina que é cerca de 1,5 a cerca de 3 vezes maior do que a segunda dosagem. A dalbavancina é freqüentemente incluída como uma composição

farmacêutica aquosa estéril ou composição de pó seco (p.ex., liofilizada).

É proporcionado um acondicionamento adequado.

Conforme usado aqui, o acondicionamento refere-se a uma matriz ou material sólido comumente usado em um sistema e capaz de incluir, dentro de limites fixos, uma composição de dalbavancina adequada para a administração a um indivíduo.

Tais materiais incluem os frascos de vidro e plástico (p.ex., polietileno, polipropileno, e policarbonato), os frascos pequenos, o papel, o plástico, e os envelopes laminados de folha plástica e similar. Se forem empregadas as técnicas de esterilização por feixes-e, o acondicionamento deve ter densidade suficientemente baixa para permitir a esterilização dos conteúdos.

Os kits podem também opcionalmente incluir equipamento para a administração da dalbavancina, tal como, por exemplo, seringas, ou equipamento para a administração intravenosa, e/ou uma solução estéril, p.ex., um diluente, tal como 5% de dextrose, para preparar uma composição de pó seco (p.ex., liofilizada) para a administração.

Os kits da invenção podem incluir, além da dalbavancina, um antibiótico que não seja a dalbavancina, ou

125 mistura de antibióticos que não sejam a dalbavancina, para uso com a dalbavancina, como descrito nos métodos acima.

Nos exemplos abaixo, as abreviações que seguem têm os seguintes significados. Se uma abreviação não for definida, ela tem o seu

AcOH

AcONa =

O- ^aq *

AST

ALT

BV

CV d

D

DCC

DMEPA

DMSO eq

EU g

GC

HC1

H₂O

HOBT

HPLC performance

H₂SO₄

IPA significado geralmente aceito.

ácido acético acetato de sódio aquoso(a) aspartato amino transferase alanina amino transferase volume de leito coeficiente de variação diâmetro dalton dicicloexilcarbodiamida

3-(dimetilamino)-propilamina dimetil sulfonamida equivalente unidades de endotoxinas grama cromatografia gasosa ácido clorídrico água hidrato de 1-hidroxibenzotiazol cromatografia líquida de alta ácido sulfúrico isopropilamina

126

IU

KF kg =

L

LC/EM/EM = /espec de massa

LDH

LSC _y m³ 10 MeOH mg mL mol unidade internacional fluoreto de potássio quilograma litro cromatografia líquida/espec de massa lactato desidrogenase contagem de cintilação liquida metro cúbico metanol miligrama mililitro molar

PM - peso molecular

N = normal

NaOH = hidróxido de sódio

NMP - N-metil-2-pirrolidona

QTD = distribuição quantitativa de tecido

Tr = tempo de retenção sd = desvio padrão

ΤΕΆ = trietilamina

Os exemplos que seguem são pretendidos para ilustrar, porém não limitar, a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Eficácia e Segurança da Dalbavancina uma Vez por Semana em

Infecções Profundas da Pele e do Tecido Mole

127

Este estudo controlado, aleatorizado, avaliou a segurança e a eficácia de dois regimes de doses de dalbavancina. Pacientes adultos com infecções da pele do tecido mole (SSTI) envolvendo estruturas profundas requerendo de estudo:

cina via da pele ou intervenção foram aleatorizados para três grupos o Braço injeção estudo 2 recebeu 1 de estudo 1 recebeu dalbavancina IV no padrão de cuidado.

1100 mg de dia 1; o dalbavanBraço de de dalbavancina IV no dia 1 e

500 mg de dia 8; o Braço de estudo

A resposta clínica e recebeu microbiológica e os eventos adversos foram avaliados.

Populações para análise

Havia 62 pacientes aleatorizados receberam pelo menos uma dose de medicação no estudo; todos de estudo. Quatro populações de estudo foram avaliadas quanto à segurança e à eficácia e foram definidas como se segue: A população pretendida para tratar (ITT) incluía todos os pacientes que receberam pelo menos uma dose de droga de estudo (todos pacientes aleatorizados no estudo)- A população pretendida para tratar microbiológica (MITT) eram todos os pacientes ITT que tinham um patógeno Gram-positivo confirmado por cultura na linha de base. A população clinicamente avaliável foi definida como aquelas que 1) preencheram todos os critérios de entrada do estudo, 2) não tiveram nenhuma alteração na terapia antimicrobiana para a infecção Grampositiva seguindo o Dia 4, exceto pela terapia oral redutora (somente aplicada ao grupo de padrão de cuidado), 3) retornaram para a visita de avaliação de acompanhamento (FU)

128 (exceto uma deficiência do tratamento), e 4) não receberam um antimicrobiano simultâneo aprovado sem protocolo (exceto uma deficiência do tratamento). A população microbiologicamente avaliável era o subgrupo de pacientes clinicamente 5 avaliáveis que tinha patógeno Gram-positivo confirmado por cultura na linha de base.

As populações de estudo são mostradas na Tabela 16.

TABELA 16 / ---------------Populações de Estudo para o Tratamento de SSTIs com

Dalbavancina

Populações	Braço de estudo 1 Dalbavacina 1100 mg dia 1	Braço de estudo 2 Dalbavacina 1000 mg dia 1, 500 mg dia 8	Braço de estudo 3 Padrão de cuidado
ITT aleatorizada	20	21	21
Tratada	20 (100%)	21 (100%)	21 (100%)
Estudo Completado	18/20 (90%)	20/21 (95,2%)	21/21 (100%)
Clinicamente aval no EOT	16/20 (80%)	17/21 (81%)	21/21 (100%)
Clinicamente aval no FU	13/20 (65%)	17/21 (81%)	21/21 (100%)
MITT	14/20 (70%)	13/21 (61,9%)	14/21 (66,7%)
Micro aval no EOT	13/20 (65%)	11/21 (52,4%)	14/21 (66,7%)
Micro aval no EOT	11/20 (55,4%)	11/21 (52,4%)	14/21 (66,7%)

ITT - pretendida para tratar

MITT - subgrupo da população ITT com infecção Gram-positiva confirmada por cultura

EOT - final do tratamento

FU - acompanhamento

A idade média dos pacientes era 50-55 anos (faixa de 18-86 anos). Não havia nenhuma diferença aparente na idade através dos braços de tratamento. Havia diferenças no sexo através dos braços de tratamento, porém, globalmente, o 15 estudo arrolou números iguais de homens e mulheres. A

129 população de pacientes era predominantemente de raça branca.

Estes resultados estavam consistentes para as populações tanto ITT quanto clinicamente avaliáveis.

pacientes foram arrolados, 20 no Braço de estudo 1 e 21, cada, nos Braços de estudo 2 e 3. Os comparadores mais comuns para o padrão de cuidado foam a clindami-

cina, a ceftriaxona, a vancomicina e a cefazolina. A duração média do tratamento no Braço de estudo 3 foram 15 dias.

Patógenos na linha de base e suscetibilidade

Dos 62 pacientes ITT, 66% (14 de dalbavancina em uma única dose, 13 de dalbavancina em duas doses, 14 de padrão de cuidado) tiveram um patógeno Gram-positivo da préterapia isolado (população MITT). O patógeno mais comum foi o S. aureus. A distribuição de patógenos na linha de base é ___ 15 _mostrada na Tabela 17.

TABELA 17

Patógenos Gram-positivos na Linha de Base e Faixa de MIC de

Dalbavancina para a População MITT

Número com Patógeno (MIC)	Dalbavancina em Única dose (1100 mg) (N=14)	Dalbavancina em Duas doses (1000/500 mg) (N=13)	Regimes de Padrão de Cuidado
Todos S. aureus	13 (0,12)	11 (0,12)	10 (0,016-0,25)
Sensível à meticilina	7	6	8
Resistente à meticilina	6	5	2
Estreptococo do Grupo B	0	2 (0, 016)	2 (0,016)
Streptococcus pyogenes	0	1 (0, 016)	1 (0,016)
Cepas diversas de Streptococcus e não tipificáveis	3 (0,016)	2 (0,016)	4 (0,016)

130

Respostas clínicas e microbiológicas

A eficácia dos	três	regimes	de	tratamento	foi
determinada avaliando a resposta	clínica	dos	pacientes e	as
respostas microbiológicas	documentadas	ou	presumidas.	0

ponto final da eficácia primária foi a resposta clinica na

visita de acompanhamento para a população clinicamente avaliável. A resposta clínica, para as visitas tanto no EOT quanto de FU, foi categorizada como sucesso (cura ou melhora) ou insucesso (incluindo os resultados indetermi10 nados). Os pacientes classificados como sucessos não devem ter recebido tratamento antibacteriano sistêmico adicional para a sua infecção. 0 insucesso foi definido como a persistência de um ou mais sinais e sintomas locais ou sistêmicos de SSTI, de modo tal que o tratamento com agentes 15 antibacterianos sistêmicos novos ou adicionais fosse requerido para a SSTI.

O resultado microbiológico, uma variável de eficácia secundária, foi avaliado na subpopulação de pacientes que tinham SSTI documentada microbiologicamente 20 (i.e., pelo menos um patógeno identificado na linha de base) . Uma resposta microbiológica foi avaliada para cada patógeno Gram-positivo identificado na linha de base (i.e., erradicação, erradicação presumida, persistência, persistência presumida). Para os pacientes para os quais não foram 25 efetuadas culturas de acompanhamento, as respostas microbiológicas para os patógenos na linha de base foram presumidas na base da resposta clínica. A resposta microbiológica pelo paciente nas visitas no EOT e de FU foi graduada como

131 sucesso (i.e., todos os organismos Gram-positivos erradicados ou erradicados presumivelmente) ou insucesso (i.e., pelo menos um organismo Gram-positivo persistiu ou presumiu-se ter persistido, múltiplos patógenos com erradicação parcial).

Em ambas as visitas no

EOT e de FU, foram avaliadas a colonização e a superinfecção. Na visita de FU, a resposta bacteriológica de um paciente podería também incluir a

λ t recorrência.

Eficácia clínica

As taxas de sucesso clínico são mostradas na

Tabela 18. Na população clinicamente avaliável, 61,5% dos pacientes na dalbavancina em dose única, 94,1% na dalbavancina em duas doses, e 7 6,2% no grupo de padrão de cuidado foram classificados como sucessos na hora da avaliação de 15 FU. Em uma sub-análise exploratória destes pacientes categorizados com SSTI profunda ou complicada na linha de base, a terapia de dalbavancina em duas doses também proporcionou uma taxa de sucesso clínico mais elevada (93,8%), comparada com as terapias de dalbavancina em dose 20 única e de padrão de cuidado, 58,3% e 73,7%, respectivamente .

Foram verificadas taxas de sucesso similares em ambas as avaliações no EOT e de FU nas populações ITT e microbiologicamente avaliáveis de apoio, com uma tendência 25 consistente para uma resposta mais favorável seguindo o tratamento com a dalbavancina em duas doses (Tabela 17) .

Para a população MITT, as taxas de sucesso clinico na avaliação de FU para aquelas com S. aureus resistente à

132 meticilina (MRSA) foram 50% (3/6) para a dalbavancina em dose única, 80% (4/5) para a dalbavancina em duas doses, e

50% (1/2) para os pacientes tratados com um regime de padrão de cuidado.

TABELA 18

Taxas de Sucesso Clinico por Análise de População e Grupo de

Tratamento

População	Dalbavancina em Única dose (1100 mg)	Dalbavancina em Duas doses (1000/500 mg)	Regimes de Padrão de Cuidado
ITT no EOT	15/20 (75,0)	19/21 (90,5)	17/21 (81,0)
ITT no FU	12/20 (60,0)	19/1 (90,5)	16/21 (76,2)
MITT no EOT	10/14 (71,4)	12/13 (92,3)	10/14 (71,4)
MITT no FU	7/14 (50,0)	12/13 (92,3)	9/14 (64,3)
Clinicamente avaliável no EOT	13/16 (61,5)	16/17 (94,1)	17/21 (81,0)
Clinicamente avaliável no FU	8/13 (61,5)	16/17 (94,1)	16/21 (76,2)
Microbiologicamente avaliável no EOT	10/13 (76,9)	10/11 (90,9)	10/14 (71,4)
Microbiologicamente avaliável no FU	6/11 (54,5)	10/11 (90,9)	9/14 (64,3)

Eficácia microbiológica

As taxas de sucesso dos diferentes regimes de tratamento em relação aos diferentes patógenos são mostradas na Tabela 19. Para a população microbiologicamente avaliável, as taxas de erradicação/erradicação presumida na avaliação de FU para todos os organismos foram 58,3% (7/12) para a dalbavancina em dose única, 92,3% (12/13) para a dalbavan15 cina em duas doses, e 70,6% (12/17) para os pacientes no grupo de padrão de cuidado. Para os isolados que persistiram, não houve nenhuma alteração na MIC de dalbavancina.

No FU, as taxas de erradicação de S. aureus foram maiores

133 para ο grupo de dalbavancina em duas doses (90%) comparadas com os tratamentos de dalbavancina em dose única (50%) e padrão de cuidado (60%). Foram observadas verificações similares para a população MITT; a dalbavancina em duas 5 doses erradicou 80% dos isolados de MRSA (Tabela 19).

TABELA 19

Taxas de Sucesso por Patógeno para a População ITT

Microbiologicamente na Avaliação de FU

	Dalbavancina em Única dose (1100 mg)	Dalbavancina em Duas doses (1000/500 mg)	Regimes de Padrão de Cuidado
Organismos totais	7/16 (43,8%)	14/16 (87,5%)	12/17 (70,6%)
Todos S.aureus	5/13 (38%)	9/11 (82%)	6/10 (60%)
Sensível à meticilina	2/7 (29%)	5/6 (83%)	5/8 (63%)
Resistente à meticilina	3/6 (50%)	4/5 (80%)	1/2 (50%)
Espécies variadas de estreptococos	2/3 (67%)	4/4 (100%)	5/7 (71%)

Para as populações microbiologicamente avaliáveis e MITT, as taxas de sucesso microbiológico no EOT e no FU são resumidas na Tabela 20. Foram descritas taxas de sucesso microbiológico comparáveis em ambas as visitas para os pacientes tratados com dalbavancina em duas doses e com regimes de padrão de cuidado (aproximadamente 64% a 77%), ao 15 passo que aqueles que receberam uma única dose de dalbavancina tiveram taxas menores de sucesso (<40%). As taxas de sucesso microbiológico no EOT/FU na população microbiologicamente avaliável equipararam-se às verificações das respostas clínicas: 38,5%/27,3% para a dalbavancina em dose 20 única, 72,7%/72,7% para a dalbavancina em duas doses, e

134

71,4%/64,3% para a terapia de padrão de cuidado. Foram observadas verificações similares para a população MITT (dados não mostrados).

TABELA 20

Taxas de Sucesso Microbiológico

	Dalbavancina em Única dose (1100 mg)	Dalbavancina em Duas doses (1000/500 mg)	Regimes de Padrão de Cuidado
População MITT
EOT	5/14 (35,7)	10/13 (76,9)	10/14 (71,4)
FU	3/14 (21,4)	9/13 (69,2)	9/14 (64,3)
População microbiologicamente avaliável
EOT	5/13 (38,5)	8/11 (72,7)	10/14 (71,4)
FU	3/11 (27,3)	8/11 (72,7)	9/14 (64,3)

Análise farmacocinética

Para os pacientes aleatorizados para os grupos de tratamento com dalbavancina, foram obtidos 5 ml de sangue no

Dia 8 para a determinação das concentrações de dalbavancina no plasma. Para os pacientes aleatorizados para receber uma dose de 500 mg de dalbavancina no Dia 8, o sangue foi obtido exatamente antes da administração da segunda dose. Foram obtidos 5 ml de amostras sanguíneas adicionais nos Dias 10 e para os pacientes que foram aleatorizados para o grupo de 15 dalbavancina em dose única e nos dias 20 e 34 para aqueles que receberam duas doses de dalbavancina.

As concentrações de dalbavancina no plasma foram determinadas usando métodos validados de cromatografia líquida e espectrofotômetro de massa. O limite inferior de 20 quantificação foi 500 ng/ml para o plasma.

135

As concentrações médias de dalbavancina coletadas nos Dias de estudo 8, 10, e 24 no regime de dose única foram 31,1 ± 7,1, 25,2 ± 4,8, e 10,2 ± 3,5 mg/1 (média ± SD) , respectivamente. As concentrações de dalbavancina seguindo o 5 regime de duas doses nos Dias de estudo 8 (antes da segunda dose), 20, e 34 foram 30,4 ± 8,2, 21,2 ± 10,0, e 9,0 ± 4,4 mg/1, respectivamente. Conforme esperado, todos os pacientes

tiveram concentrações de dalbavancina de mais do que 20 mg/1 através da primeira semana seguindo a primeira dose, e os níveis acima de 2 0 mg/1 foram mantidos por uma semana adicional com uma dose adicional de 500 mg IV no dia 8.

Geralmente, as concentrações bactericidas mínimas são aproximadamente 4 a 10 mg/1.

Avaliação da segurança

Cada paciente que recebeu pelo menos uma dose de droga de estudo (população

ITT) foi avaliado quanto à segurança da droga através do monitoramento dos eventos adversos (AEs), incluindo os resultados de testes de laboratórios clínicos e os sinais vitais anormais. Os AEs foram classificados pelo investigador quanto à sua gravidade (brandos, moderados, graves, que podem causar morte), e pela relação com a droga de estudo (não relacionados, improvavelmente relacionados, possivelmente relacionados, ou provavelmente relacionados).

Um resumo dos dados de AE é apresentado na Tabela 21. A maior parte das reações adversas (90%) foi considerada de gravidade branda a moderada. Todas as reações adversas sérias (8 eventos em 5 pacientes) não estavam relacionadas

136

-òQO ao tratamento com a droga de estudo. Aproximadamente 59% de todos os pacientes que relataram pelo menos um 7XE emergente ao tratamento (19 de dalbavancina em dose única, 16 de dalbavancina em duas doses, 21 de padrão de cuidado) experimentaram um evento que foi categorizado pelo como possível ou provavelmente relacionado estudo. Especificamente, os AEs relacionados à investigador à droga de droga foram

relatados em dose única, 10 dalbavancina de duas doses, e 12 (57%) de padrão de cuidado.

Os AEs relacionados à droga mais frequentemente relatados em ambos os grupos de tratamento com dalbavancina e de padrão de cuidado foram a diarréia náusea. Um resumo dos tipos de AEs observados para os diferentes grupos de tratamento é apresentado na Tabela 22.

Nenhum paciente tratado com dalbavancina descontinuou o tratamento prematuramente devido a um AE. Três dos 21 (14%) pacientes em um regimento de padrão de cuidado descontinuaram o tratamento prematuramente devido a um AE, incluindo um paciente que desenvolveu urticária no Dia 1, que foi provavelmente relacionada à droga, e dois pacientes que tiveram AE não relacionado à droga de estudo (superinfecção com P. aeruginosa e nível de depressão de vancomicina elevado).

137

TABELA 21

Resumo dos Dados de Eventos Adversos (AEs)

	Dalbavancina em Única dose (N=20)	Dalbavancina em Duas doses (N=21)	Padrão de Cuidado (N=21)
> 1 AE	95%	76,2%	100%
% AE grave	15%	9,5%	4,8%
> 1 AE possivelmente/provavelmente relacionado ao tratamento	55%	48%	57%
AE resultando em descontinuação da medicação de estudo	0	0	14,3%
> 1 AE grave	2 (10%)	2 (9,5%)	1 (4,8%)

TABELA 22

Eventos Adversos Mais Comuns

	Dalbavancina em Única dose (N=20)	Dalbavancina em Duas doses (N=21)	Padrão de Cuidado (N=21)
Diarréia	20%	9, 5%	28, 6%
Náusea	20%	28,6%	9,5%
Hiperglicemia	5%	14,3%	19%
Dor dos membros	10%	9,5%	9,5%
Vômito	10%	14,3%	4,8%
Constipação	5%	4,8%	14,3%

Discussão

Este ensaio de Fase II aleatorizado, que não é às cegas, mostra que a dalbavancina é efetiva para o tratamento de adultos com SSTI. A maior parte dos pacientes arrolados tinha infecções profundas e complicadas (>90%) e infecções 10 que requereram intervenção cirúrgica (~70%), enquanto que aproximadamente 45% tinham diabete melito latente.

As duas doses por semana de dalbavancina tiveram uma taxa de resposta clinica numericamente maior do que uma

138 dose única de dalbavancina ou o regime de padrão de cuidado.

O dado a partir das populações tanto ITT quanto clinicamente avaliáveis sugere que um regime de duas doses de dalbavancina injetáveis, semanalmente, sequenciais (1000 mg, 500 mg semanalmente) é efetivo no tratamento de SSTIs. 0 grupo de padrão de cuidado foi tratado por uma duração média de 13 dias. No acompanhamento, 94% dos pacientes clinicamente avaliáveis, tratados com a dalbavancina em duas doses, foram considerados sucessos clínicos versus 76% daqueles que rece10 beram um regime de padrão de cuidado e 61,5% dos pacientes que receberam a dalbavancina em dose única.

O S. aureus foi o organismo mais frequentemente isolado na linha de base. Neste ensaio, aproximadamente 83% dos pacientes foram infectados com S. aureus e 38% de todas

as cepas de S. aureus eram MRSA. A maioria das infecções (80%) foi causada por um único patógeno. As MICs para a dalbavancina contra os isolados Gram-positivos, incluindo o MRSA, variaram de 0,016 a 0,25 mg/L.

As taxas de sucesso microbiológico equipararam-se àquelas da resposta clínica para a população clinicamente avaliável. Para todos os organismos combinados, o tratamento com o regime de dalbavancina em duas doses semanalmente proporcionou taxas de erradicação mais elevadas na avaliação após a terapia de 2 semanas (92%) em comparação com as terapias de dalbavancina em dose única (58%) e de padrão de cuidado (71%). Globalmente, as taxas de erradicação de S. aureus foram observadas em 90%, 50%, e 60% dos pacientes, respectivamente. Para a população MITT, as taxas de erradl139

cação para o MRSA foram 80% para o regime de dalbavancina em duas doses versus 50% para ambas as terapias de dalbavancina em dose única e de padrão de cuidado.

' As concentrações de dalbavancina obtidas no final dos períodos de tratamento a cada semana com dose única e com duas doses (Dia 10 ou Dia 20, respectivamente) foram

similares, sugerindo pouco acúmulo de droga seguindo a segunda dose a cada semana. A taxa mais elevada de sucesso clinico observada com o regime de duas doses é sugestiva da morte dependente do tempo, onde os níveis constantes de droga ou exposição à droga foram proporcionados com duas doses de dalbavancina separadas por uma semana. Os níveis de dalbavancina no plasma, medidos no final do intervalo de dosagem semanalmente, eram substancialmente maiores do que a

MICgo descrita para os patógenos responsáveis pela maior

parte das SSTIs (<0,03 a 0,5 mg/L) , incluindo aqueles verificados neste ensaio. Estes níveis estavam também acima das concentrações bactericidas mínimas de 4 a 10 mg/1.

A taxa global de reações adversas foi similar tanto para os regimes de dalbavancina quanto para o grupo de padrão de cuidado. Os eventos adversos gastrointestinais relacionados às drogas (i.e., diarréia ou náusea) foram mais comumente relatados através dos três grupos de tratamento. A maioria destes eventos era branda e autolimitada. Nenhum 25 paciente tratado com dalbavancina foi retirado do estudo cedo devido a uma reação adversa, nem quaisquer eventos adversos sérios foram atribuíveis ao glicopeptídeo descrito, no entanto 14% do grupo de padrão de cuidado retirou-se

140

devido aos efeitos adversos. O novo regime de dosagem, desse modo, teve efeitos colaterais adversos reduzidos em comparação com o padrão de cuidado. O dado a partir deste ensaio não encontrou nenhuma evidência que a dalbavancina induz qualquer grau de hepatotoxicidade ou nefrotoxicidade clinicamente significativa.

O regime de dalbavancina em duas doses parece efetivo para o tratamento de pacientes com SSTIs complicadas. A dalbavancina em ambas as doses foi bem tolerada neste ensaio clínico, com um perfil de evento adverso similar àquele do grupo de padrão de cuidado.

Exemplo 2

Eficácia e Segurança da Dalbavancina Uma Vez Semanalmente no

Tratamento de Infecção na Corrente Sanguínea Relacionada a

Cateteres (CR-BSI)

Este estudo avaliou a segurança e a eficácia (clínica e microbiológica) de um regime de dosagem semanalmente de dalbavancina, no tratamento de adultos com infecção na corrente sanguínea relacionada a cateteres (CR-BSI), devida a patógenos bacterianos gram-positivos, em relação ao tratamento padrão de cuidado, a vancomicina.

Metodologia

Os pacientes com CR-BSI devida a patógeno(s) Grampositivo(s) suspeito(s) ou conhecido(s) , que atendem os 25 critérios de inclusão/exclusão, foram aleatorizados para um de dois braços de tratamento neste estudo de múltiplos centros, comparativo, que não é às cegas. A dalbavancina foi administrada uma vez a cada semana em dalbavancina semanal-

141 mente e o comparador (vancomicina) foi administrado diariamente em vancomicina. A remoção do cateter foi requerida para os pacientes com infecção por Staphylococcus aureus; o controle do cateter foi deixado a critério do Investigador para os pacientes com infecção por estafilococos negativos para coagulase (CoNS). A eficácia foi clinicamente baseada

na melhora ou resolução dos sinais e sintomas clínicos da

CR-BSI, de modo tal que nenhum antibacteriano adicional fosse permitido, e microbiologicamente na erradicação ou na presença da linha de base ou de outros patógenos. As concentrações de segurança e de dalbavancina no plasma foram também avaliadas.

População para Análise

Aproximadamente 80 pacientes foram planejados (40, cada, para os braços de tratamento 1 e 3) ; 67 pacientes foram analisados (33 em dalbavancina semanalmente e 34 em

vancomicina). Sete (7) pacientes da dalbavancina diariamente foram incluídos nas análises de segurança somente. Setenta e cinco (75) pacientes foram aleatorizados e 74 foram tratados em 13 locais nos Estados Unidos; 64 pacientes completaram o estudo. As características demográficas eram, em geral, similares através dos braços de estudo. A idade média para os pacientes na dalbavancina semanalmente era 54 anos (faixa de 20-78 anos) e na vancomicina era 57 anos (faixa de 19-85 anos). Os homens e as mulheres foram igualmente representados globalmente; havia ligeiramente mais homens na dalbavancina semanalmente e mais mulheres na vancomicina. A maior parte dos pacientes era de raça branca (>65), foi

142 categorizada como tendo CR-BSI provável, e tinha cateteres sem túneis. Para a população ITT microbiológica, os patógenos mais comuns para ambos os braços de tratamento foram CoNS e

S. aureus. Dos isolados de S. aureus, 5/11 (45,4%) e 9/12 5 (75,0%) foram identificados como resistentes à meticilina (MRSA) para os braços de estudo 1 e 3, respectivamente.

Diagnose e Critérios Principais para Inclusão

Pacientes com bacteremia Gram-positiva documentada, definida como pelo menos uma cultura de sangue positiva para

S. aureus, ou pelo menos duas culturas de sangue positivas para todos os outros organismos (com pelo menos uma das culturas a partir de uma amostra retirada de modo percutâneo), foram incluídos. Além disso, também foram arrolados os pacientes que atenderam todos os outros critérios de inclusão,

e também atenderam cada abaixo:

1. Pelo menos bacteremia: temperatura de de modo retal, oral (0,5% uma das duas condições listadas dois dos seguintes sinais de núcleo >38,0°C ou <36,0°C, medida adicionado à temperatura medida) , timpânico ou via um cateter central; contagem de WBC >12.000/mm³ ou <4.000/mm³ ou contagem diferencial mostrando >10% de formas de bandas; taquicardia (taxa de pulso >100 bpm), taquipnéia (taxa respiratória >20 respirações/minuto); hipotensão transiente (pressão sanguínea sistólica <90 mm de

Hg)

2. Nenhuma fonte aparente para a manifestação clínica de bacteremia senão o cateter (pode ter sinais e sintomas locais no lugar do cateter).

143

Tratamento tratamento durou 14 dias para os pacientes com infecção por S. aureus, e 7 a 14 dias para todos os outros patógenos. Por causa da meia-vida longa da dalbavancina, a 5 duração da terapia de droga de estudo foi assumida ser 7 dias para cada dose de dalbavancina dada na dalbavancina

semanalmente. A dalbavancina foi administrada intravenosamente com uma dose de carga de 1000 mg no Dia 1 e uma dose de 500 mg no Dia 8. A vancomicina foi administrada intrave10 nosamente com uma dose de 1000 mg a cada 12 horas (ou ajustada na dose com base nos níveis de droga).

Critérios para Avaliação

A eficácia foi avaliada com base nas respostas clínicas e microbiológicas. 0 parâmetro de resultado primário foi a resposta global na visita de teste de cura (TOC) na população pretendida para tratar (ITT) microbiológica. A

segurança foi avaliada pela coleta e análise de dados sobre eventos adversos (AEs), testes de laboratórios clínicos, exames físicos, sinais vitais, e ECGs. As concentrações de dalbavancina no plasma foram determinadas em até sete ocasiões (antes e depois da primeira dose no Dia 1, no dia 4 ± 2 dias, antes e depois da segunda dose no Dia 8, no final do tratamento (EOT) e no TOC. Devido à eliminação do braço 2 durante o estudo, somente os dados demográficos e os dados de segurança a partir daqueles pacientes são descritos; a eficácia não foi avaliada.

144 õe/

Métodos Estatísticos

Os dados de eficácia, segurança, e concentração de dalbavancina são apresentados usando estatística descritiva.

Para a análise da eficácia primária, segurança foram também determinados,

95% de intervalos de e para as análises do fator prognóstico usando a variável de eficácia primária, foi usada a regressão logística.

Resultados da Eficácia

Para a análise da eficácia primária, a resposta global na população ITT microbiológica no TOC, os pacientes que receberam a dalbavancina em dalbavancina semanalmente

Cl:

73,2, 100,0) tiveram uma taxa de sucesso maior do que (50,0%, 95% de

Para os

Cl:

pacientes que receberam a vancomicina

31,5, 68,5).

as análises da eficácia secundária, o sucesso global, o sucesso clínico, e o sucesso global e clinico por patógeno, por categoria de infecção, por situação do cateter

na linha de base, e por tipo de cateter para as populações

ITT microbiológticas maiores no braço braço de estudo por paciente foi de com e avaliáveis, no EOT e estudo com dalbavancina no

TOC, eram comparado ao vancomicina. O sucesso microbiológico similar para os braços de tratamento no

EOT, porém foi maior para o braço de estudo com no TOC. Para o CoNS, o sucesso microbiológico foi maior no braço de estudo com dalbavancina dalbavancina por patógeno tanto no EOT no lugar do cateter foi resolvida para ambos os braços de estudo.

quanto no

TOC. Pelo EOT, a maior parte dos sinais e sintomas

5

Resultados de Segurança

Os eventos adversos (AEs) foram relatados por 71 pacientes (95,9%). O número de pacientes relatando AEs foi similar através dos braços de estudo, embora mais AEs fossem 5 relatados nos grupo de dalbavancina do que no grupo de vancomicina. Os AEs mais comuns foram diarréia, constipação, anemia, e hipotensão. A maioria dos AEs foi considerada pelo

Investigador ser de intensidade branda ou moderada. Os eventos adversos considerados estar (possível ou provavel mente) relacionados à droga de estudo estavam uniformemente distribuídos através dos braços de estudo. Um (1) paciente (3%) no braço de estudo de dalbavancina teve um AE não sério, não relacionado, que resultou na descontinuaçâo da dalbavancina; nenhum AE resultou na retirada do estudo. Três (3) pacientes (8,8%) no braço de estudo com vancomicina tiveram AEs que resultaram na descontinuaçâo do comparador;

AEs resultaram na retirada do estudo. A distribuição dos

SAEs foi similar entre os grupos de tratamento; nenhum SAE no braço de estudo com dalbavancina e um SAE no braço de estudo com vancomicina foi considerado estar relacionado à droga de estudo. Houve 5 mortes neste estudo. Todos os AEs que resultaram em morte não estavam relacionados à medicação de estudo. Não houve nenhuma anormalidade de laboratório significativa em qualquer braço de estudo. Poucos valores de 25 laboratório foram relatados como AEs. Nenhum era SAE ou resultou na descontinuaçâo da droga de estudo.

A pressão sanguínea diastólica aumentada foi a mudança clinicamente significativa, anormal, mais comum,

146 através de todos os grupos de tratamento. A hipertensão foi relatada como um AE para 3/74 pacientes (4,1%, 2 pacientes na dalbavancina, 1 paciente na vancomicina); somente 1 paciente (que recebeu dalbavancina) teve pressão sanguínea aumentada como um AE considerado relacionado à medicação de estudo. A dalbavancina não exibiu nenhum impacto sobre frequência cardíaca, a condução intraventricular.

condução atrioventricular ou diferença média de efeito sobre os valores de QTc foi 7 ms maior para o grupo de dalba10 vancina em comparação com o grupo de vancomicina. Não foi observada nenhuma diferença significativa entre os tratamentos para a frequência de pessoas que moram afastadas

durante a terapia de droga.

Portanto, a dalbavancina dada como uma dose IV inicial de 1000 mg, seguida 1 semana posteriormente por uma segunda dose IV de 500 mg, parece bem tolerada e altamente efetiva para o tratamento de CR-BSI causada por patógenos Gram-positivos, com taxas de respostas superiores à vancomicina.

Exemplo 3

Farmacocinética e Excreção Renal da Dalbavancina em Pacientes Saudáveis

Os objetivos principais deste estudo foram caracterizar a farmacocinética da dalbavancina e calcular o grau 25 de excreção renal em pacientes saudáveis que receberam uma dose terapêutica da droga. Este foi um estudo não-comparativo, que não feito às cegas.

147

Tratamento com a droga de estudo

Pacientes machos ou fêmeos saudáveis, entre 18 e anos de idade, foram administrados com uma dose única IV de 1000 mg de dalbavancina infudida, durante 30 minutos.

Seis pacientes, uma mulher e cinco homens, foram arrolados, receberam a medicação de estudo, e completaram

todos os aspectos do estudo. Três pacientes eram de raça branca e três pacientes eram afro-americanos. A idade média era 29,8 anos (faixa de 22 a 63). A altura média era 1,74 metro (68,6 polegadas) [(faixa de 1,60 a 1,91 (63 a 75)] e o peso médio era 81,5 kg (179,6 Ibs) [63,5 a

110,7 (140 a

Farmacocinética coletados

28, e 42.

sangue e nos

As heparini zados dias de amostras a urina estudo 1, sanguíneas e centrifugadas. 0 (coletas de

2, 3,

4, 5,

6, foram plasma retiradas

h) foram

7, 14, 21, para tubos foi separado e arma-

zenado congelado a -20°C até a hora do ensaio.

As amostras de plasma e urina foram testadas quanto à dalbavancina usando métodos de LC/EM/EM validados. O limite inferior de quantificação do ensaio era 500 ng/mL para a urina e o p1asma.

Os parâmetros farmacocinéticos da dalbavancina foram estimados por métodos não-compartimentais usando o 25 software WinNonlin® (Pharsight Corporation). Os valores de concentração de pico (C_má_X) foram obtidos diretamente a partir dos dados observados. A área sob a curva de concentração no plasma-tempo (AUC) foi calculada usando a regra trapezoidal

148 linear. A depuração (CL) foi computada como dose/AUC. A meia-vida de eliminação (t_x/₂) foi estimada por regressão linear da parte linear log da curva de concentração log versus o tempo. As estimativas do volume de distribuição (V_z) foram calculadas usando os parâmetros de regressão,

enquanto que o volume de distribuição no estado estacionário (Vss) foi calculado a partir da área sobre a primeira curva de momento (AUMC) multiplicada pela dose e dividida pela AUC. A quantidade cumulativa de dalbavancina excretada na urina foi determinada como o integrando da taxa de excreção na urina (AURC) . A CL_R, ou depuração renal, foi calculada como a razão: CL_R = AURC/AUC.

As concentrações de dalbavancina no plasma versus o tempo são mostradas para todos os pacientes na Figura 5.

Os parâmetros farmacocinéticos são apresentados na Tabela

23. As concentrações foram similares através de todos os pacientes. As concentrações plasmáticas de pico eram aproximadamente 300 mg/L e foram obtidas imediatamente seguindo o final da infusão. A dalbavancina mostra um volume aparente 20 de distribuição de mais do que 10 L e é assumida estar bem distribuída no fluido extracelular.

A dalbavancina foi lentamente eliminada com uma ti/2 de 9-12 dias. A depuração total da droga foi 0, 0431 ± 0,0074 L/h. A fração estimada de droga excretada inalterada na urina foi 42% da dose administrada, e a depuração renal foi estimada como 0,018 L/h. A variabilidade observada através dos pacientes era baixa, com um coeficiente de

J33

149 variação de menos do que 22% através de todos os parâmetros farmacocinéticos.

TABELA 23

Parâmetros farmacocinéticos

	Cmáx	tl/2 h	AUC Mg.h/L	vz L	CL L/h	Vss L	AURC Mg	% de Excreção Renal	clr L/h
Média	301	257	23843	16, 0	0,0431	11,5	419	41,9	0,0181
Sd	65	21	4526	3,1	0,0074	2,13	27	2,7	0,0036
cv %	21,6	8,1	19, 0	19,5	17,1	18, 6	6,4	6,4	20,1
Min	243	227	19844	11,7	0,0332	8,58	379	37,9	0,0130
Máx	394	282	30100	19,6	0,0504	13, 9	448	44,8	0,0226

Avaliações de Segurança

Os eventos adversos foram registrados e avaliados quanto à gravidade e relaçao com a droga de estudo. Os dados de laboratório (painel da química, CBC com diferencial, urinálise) foram coletados e avaliados quanto a mudanças a partir de valores de linha de base e fora da faixa. O ECG, o

exame físico, e os sinais vitais foram obtidos, e as mudanças a partir da linha de base foram avaliadas.

A dalbavancina foi bem tolerada neste estudo.

Nenhuma morte de paciente ou evento adverso sério foi rela15 tada durante este estudo e nenhum paciente foi retirado prematuramente do estudo devido a um AE.

Todos os voluntários relataram pelo menos um AE, todos de intensidade branda. Três voluntários relataram AEs que estavam possivelmente relacionados à medicação de 20 estudo; ALT elevada (valor 46 IU/L, limite superior de normal 40 IU/L) em um paciente; eosinofilia (valor 0,5 x

10³/qL, limite superior de normal 0,4 x 10³/qL), LDH elevada

150 (valor 303 IU/L, limite superior de normal 90 IU/L), ALT elevada (valor 54 IU/L, limite superior de normalmente 40 IU/L), AST elevada (valor 42 IU/L, limite superior de normal 40 IU/L), tudo em um paciente; e tinido em um paciente.

Não foi vista nenhuma tendência para resultados de hematologia, química, sinais vitais, e ECG pós-linha de base.

Discussão

Uma única dose IV de 100 0 mg de dalbavancina foi bem tolerada. Seguindo uma infusão intravenosa única de 1000 mg, as concentrações de dalbavancina no plasma acima de 45 mg/1 são mantidas por pelo menos sete dias. Isto está acima das concentrações sabidas serem bactericidas (4-32 mg/1). Isto suporta o uso de dalbavancina como um regime de uma vez

semanalmente. 0 perfil de eliminação urinária indica que a excreção renal é uma via de eliminação importante, com aproximadamente 40% excretados na urina. Esta verificação está consistente com as observações nos animais. Visto que os rins não são a rota exclusiva de eliminação, um ajuste da dosagem para a dalbavancina pode não ser necessário em pacientes renalmente debilitados.

Exemplo 4

Farmacocinética da Dalbavancina em Pacientes com

Deterioração Renal

Estes foram estudos que não foram feitos às cegas, conduzidos para examinar a segurança e a farmacocinética da dalbavancina intravenosa, quando administrada a pacientes com deterioração renal branda, moderada e grave.

151

Tratamento com a droga de estudo

Pacientes machos e fêmeos, entre idades de 18 e

80, eram adequados para o arrolamento. Os pacientes tinham de estar dentro de -10% a + 50% de peso do corpo ideal para o seu quadro de sexo, altura, e corpo.

Farmacocinética

Amostras sanguíneas em série foram coletadas antes da dose e através de pelo menos 2 semanas após o final da infusão e testadas quanto à dalbavancina usando um método de

LC-EM/EM validado.

Os parâmetros farmacocinéticos da dalbavancina foram estimados por métodos não-compartimentais. As concentrações de pico (Cmáx) foram obtidas diretamente dos dados observados. A área sob a curva de concentração no plasma15 tempo (AUC) foi calculada usando a regra trapezoidal linear.

Os parâmetros farmacocinéticos dos pacientes com

deterioração renal saudável e dos pacientes com deterioração renal a mais grave (RI Grave) são apresentados na Tabela 24.

TABELA 24

Parâmetros farmacocinéticos

Parâmetro Farmacocinétic o	Regime de Dosagem
1000 mg	1120 mg	1000 mg + 500 mg	500 mg para RI GraveΛ	1000 mg para RI GraveΛ
AUC (mg.h/L)	24453 +/- 3711	25790 +/- 2447	33000'	24376 +/- 6615	-48000'
AUC7 (mg.h/L)	13412 +/- 2120	13644 +/- 2120	12000'	6860 +/- 1613	-14000'
AUC14 (mg.h/L)	17737 +/- 2325	20207 +/- 2122	23000'	10986 +/- 2817	-22000 '
AUC42 (mg.h/L)	23137 +/- 3326		33000'		-38000'
Cmáx (mg/L)	340 + /- 68	325 +/- 41	300'	137 +/- 22	-300 '
Cdia 7 (mg/L)	40,9 +/- 5,2®	55,4 +/- 8,1	40 '	-30-40	-57'
cdial4 (mg/L)	21,3 +/-2,5®	22,8 +/-1,9	40 '		-40'

152

^Λ Dados clínicos preliminares * Estimados usando parâmetros diretamente referidos, ou extrapolados de gráficos ' Com base em dados simulados ou extrapolados baseados em um outro estudo;

não diretamente referidos em um compêndio

AUC = exposição à droga como estimada pela área sob a curva de concentração no plasma-tempo;

AUC7 = exposição à droga através de 7 dias após a dose ou através do período de tratamento;

AUC14 = exposição à droga através de 14 dias após a dose ou através do período de tratamento; AUC42 = exposição à droga através de 42 dias após a dose ou através do período de tratamento;

= concentração máxima de droga observada no plasma;

C7 - concentração de droga 7 dias após a dose, antes da administração de uma outra dose possível;

Cl4 = concentração de droga 14 dias após a dose, antes da administração de uma outra dose possível.

Discussão

Para os pacientes com deterioração renal grave, é administrada ao paciente uma única dose de 500 ou 1000 mg de dalbavancina. Conforme aparente a partir da Tabela 24, após dias, um paciente com deterioração renal grave que recebeu uma única dose de 1000 mg tem uma AUC14 (mg.h/L) de 25 aproximadamente 22000, que é inesperadamente muito similar

aos pacientes normais no regime de duas doses de 1000 mg +

500 mg (AUC14 mg.h/L de 23000).

Para os pacientes com insuficiência renal branda, não foi requerido nenhum ajuste de dosagem da dalbavancina.

As concentrações de dalbavancina e os parâmetros farmacocinéticos eram similares nos pacientes com deterioração renal branda e nos pacientes com função renal normal. Além disso, a dalbavancina foi bem tolerada em pacientes com função renal normal ou brandamente deteriorada. Ver Dowell, J. e col. Dalbavancin Dosage Adjustments Not Required for

Patients with Mild Renal Impaiment apresentado no Encontro

ECCMID de 2003, Glasgow (Clinicai Microbiology and

357

153

Infection, Volume 9 (Suplemento 1) página 291; 2003) e

Stogniew, M. e col· Pharmacokinetic Attributes for Dalbavancin: Well Distributed and Completely Eliminated with Dual Routes of Elimination apresentado no Encontro ECCMID de 2003, Glasgow (Clinicai Microbiology and Infection, Volume 9 (Suplemento 1) páginas 291-292; 2003), ambos os quais são, pelo presente, expressamente incorporados por AX referência em sua totalidade.

Vy

Exemplo 5

Deterioração Renal e Doença Renal em Estágio Final

Uma via principal para a eliminação da dalbavancina é a excreção tanto da dalbavancina intacta quanto da OH-dalbavancina na urina, e é provável que a droga seja usada em pacientes com graus diversos de deterioração renal.

Por causa disso, a segurança e a farmacocinética da dalbavancina, em pacientes com diversos graus de deterioração

renal, foram examinadas nos Estudos Clínicos VER001-3,

VER001-11 e VER001-13.

Estudo Clínico VER001-3 foi terminado cedo (5 pacientes arrolados; 3 pacientes receberam a dalbavancina) quando foi determinado que a dosagem que estava sendo examinada (70 mg) era muito baixa, comparada à dosagem maior, a cada semana, que estava sendo proposta para o estudo clínico. O Estudo Clínico VER001-13 examinou os pacientes com deterioração renal branda e moderada e o Estudo Clínico VER001-11 examinou os pacientes com deterioração renal grave e os pacientes com doença renal em estágio final (ESRD). Os pacientes de controle combinados foram arrolados em todos os

154 estudos. A deterioração renal foi definida por depuração de creatinina estimada: branda = 51-79 mL/min, moderada = 31-50 mL/min, e grave í 30 mL/min. Os pacientes com ESRD eram dependentes da diálise através do curso do estudo (3 vezes 5 semanalmente). As doses únicas de 1000 mg de dalbavancina IV foram examinadas nos pacientes com deterioração renal branda e moderada, as doses de 500 mg de dalbavancina foram estudadas nos pacientes com ESRD, e as doses únicas de 500 e 1000 mg foram estudadas nos pacientes com deterioração renal 10 grave.

A dalbavancina foi bem tolerada em cada um destes estudos de deterioração renal. Foram observadas porcentagens similares de pacientes relatando eventos adversos em cada um dos grupos de estudo. A maioria dos eventos adversos 15 informados foi de gravidade branda ou moderada e não estava relacionada à medicação de estudo. Não houve nenhum dis-

túrbio de laboratório clinicamente significativo em quaisquer dos pacientes do estudo enquanto recebiam a dalbavancina .

No Estudo Clinico VER001-13, a administração da dalbavancina aos pacientes com função renal normal e aos pacientes com deterioração renal branda resultou em perfis comparáveis de concentração-tempo durante o intervalo de amostragem de 60 dias. Através do período de tratamento 25 relativo, 7 dias após a dose, os perfis de concentraçãotempo eram comparáveis entre os pacientes com função renal normal, e os pacientes com deterioração renal branda ou moderada. Um aumento pequeno nas concentrações foi observado

037

155 nos pacientes com deterioração renal moderada depois do Dia

14, quando as concentrações estavam relativamente baixas e abaixo de 40 mg/L. Os perfis de concentração de dalbavancina no plasma-tempo nestes pacientes, seguindo 1000 mg de 5 dalbavancina, são mostrados na Figura 18. Os parâmetros farmacocinéticos da dalbavancina são mostrados na Tabela 25.

Nenhum ajuste da dosagem é requerido para os pacientes com deterioração renal branda ou moderada (CL_Cr > 30 mL/min). As verificações a partir deste estudo estão consistentes com os 10 pacientes estudados na análise farmacocinética da população (CL_cr > 50 mL/min) .

A dalbavancina foi administrada aos pacientes com função renal normal, aos pacientes com deterioração renal grave, e aos pacientes com ESRD no Estudo Clinico VER001-11.

Os perfis de concentração de dalbavancina-tempo observados neste estudo são mostrados na Figura 19. As concentrações

eram similares entre os pacientes com função renal normal e os pacientes com deterioração renal grave ou ESRD através das primeiras 12 horas, porém uma diferença pequena e gradualmente crescente foi observada nos pacientes com deterioração renal grave. As concentrações foram aumentadas em L 40% através da primeira semana após a dose, e as diferenças continuaram a aumentar através do restante do perfil. Os pacientes com ESRD foram divididos em pacientes 25 que receberam a dalbavancina antes ou após a sua primeira sessão de diálise. Não foi observada nenhuma diferença nos perfis de concentração entre estes dois subgrupos. As concentrações nos pacientes com ESRD foram, entretanto,

156 similares aos pacientes com função renal normal, indicando compensação na insuficiência renal devida à diálise regularmente programada (3 vezes/semana) . Os níveis no dialisado correspondendo a este nível de diálise da droga eram muito 5 pequenos para medir.

Os parâmetros farmacocinéticos da dalbavancina nos pacientes com deterioração renal grave e nos pacientes com ESRD (VER001-11) são comparados aos pacientes com deterioração renal branda ou moderada (VER001-13) na Tabela 10 25. As doses únicas de 500 e 1000 mg foram estudadas nos pacientes com deterioração renal grave; as concentrações e as exposições estavam consistentes com a proporcionalidade de dose (Figura 20, Tabela 25) . As exposições de drogas individuais dentro do período de tratamento relativo (AUC_O_ 15 Dia7) estavam geralmente consistentes através da CL_cr individual, com somente um pegueno aumento na exposição observado para os pacientes com deterioração renal grave (Figura 21). As diferenças nas exposições eram muito maiores quando examinadas através do perfil inteiro de concentração2 0 tempo. A área sob a curva de concentração no plasma-tempo extrapolada através do infinito (AUCo-mf) foi aumentada 97% nos pacientes com deterioração renal grave. Os pacientes com ESRD tiveram somente um aumento de 45% na AUCo-inf, refletindo alguma compensação na insuficiência renal com a 25 diálise regularmente programada.

Com base nos parâmetros farmacocinéticos e simulações baseadas nos dados, é recomendado um ajuste de dosagem para os pacientes com deterioração renal grave. O objetivo

157 do ajuste da dosagem é igualar as concentrações e as exposições durante o período de tratamento relativo de duas doses (14 dias), ao mesmo tempo minimizando a exposição global da droga. Um total de 9 regimes de dosagem simulados 5 foi examinado nos pacientes com deterioração renal grave. Os resultados destas simulações são resumidos na Figura 22, mostrando a exposição durante o período de tratamento relativo versus a exposição global. Uma dose de 750 mg de dalbavancina seguida uma semana mais tarde por 250 mg de 10 dalbavancina é o ajuste de dosagem recomendado para os pacientes com uma CL_cr < 30 mL/min. Este regime de dosagem mantém as concentrações acima de 20 mg/L, iguala as exposições de tratamento observadas para os pacientes com função renal normal, e minimiza a exposição global. A Figura

23 mostra os perfis de concentração de dalbavancina-tempo

simulados para i) pacientes com função renal normal recebendo 1000 mg (Dia 1) + 500 mg (Dia 8) , ii) pacientes com deterioração renal grave recebendo 1000 mg (Dia 1) + 500 mg (Dia 8), e iii) pacientes com deterioração renal grave

0 recebendo o ajuste de dosagem recomendado de 750 mg (Dia 1)

+ 250 mg	(Dia 8).	Os	pacientes	que recebem	terapia	de
diálise regular (2	a	3 vezes	semanalmente)	têm alguma
depuração	compensada	da	droga por	diálise e não	requerem	um
ajuste da	dosagem.

158

TABELA 25

Parâmetros Farmacocinéticos da Dalbavancina para Pacientes Saudáveis e Renalmente Deteriorados SEGUINDO uma dose única de dalbavancina

<n — H Q Ό cn -H s -	Deterioração Renal Branda (N=6)	Deterioração Renal Moderada (N=-6)	Função Renal Normal (N=9)	Deterioração Renal Grave (N=6)	Deterioração Renal Grave (N=-4)	OJ ι—1 *5« o « MD M Cm	<D trj •r-t ι—l <*> •H II Ό tZ 1 ~ 01 Ό	Função Renal Normal (N=6)	Função Renal Normal (N=3)
Estudo	VER001- 13	VER001- 13	VERO01- 13	VER001- 11	VERO01- 11	VER001- 11	VERO01- 11	VER001- 11	VER001- 2
Dose (mg)	1000	1000	1000	500	1000	500	500	500	1120
Cmáx	266, 8	330,7	248, 8	136,5	315,3	140, 7	145,8	137,3	325
(mg/L)	(42,3)	(55,7)	(33,0)	(21,6)	(89,7)	(26,4)	(71,5)	(39,5)	(41)
AUCodia 7	9714	11050	8992	6077	10653	6069	4969	5245	13644
(mg.h/L)	(1406)	(2005)	(1362)	(1392)	(1474)	(1768)	(1153)	(1661)	(1305)
AUCo-dia	15333	18060	13765	10412	18698	10620	8500	7971	20207
(mg.h/L)	(1884)	(3065)	(1986)	(2658)	(1780)	(2881)	(2297)	(2422)	(2122)
AUCo-jnf	27047	37665	24561	24074	44497	19772	15587	12219	25790
(mg.h/L)	(4084)	(7123)	(5252)	(6613)	(11483)	(5065)	(6050)	(3298)	(2447)
CL	0,0376	0,0273	0,0422	0,0222	0,0238	0,0264	0,0350	0,0429	0,0437
(L/h)	(0,0048)	(0,0045)	(0,0079)	(0,0064)	(0,0068)	(0,0063)	(0,0113)	(0,0092)	(0,004)
Vss	16,5	14,7	18,5	13,2	14,2	12,8	14,6	15,0	8,49
(L)	(3,3)	(2,1)	(3,6)	(2,9)	(0,8)	(3,4)	(3,2)	(4,2)	(1,05)
tl;2	389	432	417	454	469	376	347	333	149
(h)	(59)	(43)	(108)	(102)	(103)	(63)	(78)	(91)	(3,6)

Exemplo 6

Deterioração Hepática

A dalbavancina é eliminada por vias tanto renais quanto não renais e a dalbavancina provavelmente será usada

159 em pacientes com graus diversos de deterioração hepática.

Foram examinadas a segurança e a farmacocinética da dalba vancina em pacientes com diversos graus de deterioração hepática no Estudo Clínico VER001-12. O estudo arrolou pacientes de outra forma saudáveis, com deterioração hepática branda, moderada, ou grave (escores de Child-Pugh 5 a 6, 7a

9, e 10 a 15, respectivamente), e pacientes de controle combinados com função hepática normal. Os pacientes receberam uma dose única IV de 1000 mg de dalbavancina no Dia 1, seguida por uma dose IV de 500 mg de dalbavancina no Dia 8.

As concentrações e as exposições da dalbavancina não aumentaram com os graus crescentes de deterioração hepática (Figura 24) . A administração da dalbavancina aos pacientes com função hepática normal e aos pacientes com 15 deterioração hepática branda resultou em perfis comparáveis de concentração-tempo durante o intervalo de amostragem de 60 dias. A administração da dalbavancina aos pacientes com deterioração hepática moderada e aos pacientes com deterioração hepática grave resultou em concentrações observadas 20 ligeiramente diminuídas, quando comparados aos pacientes com função hepática normal. A droga foi bem tolerada através de todos os grupos.

A exposição à dalbavancina para os pacientes com função hepática normal e os pacientes com deterioração 25 hepática branda foi comparável (Tabela 26) . Uma tendência na CL foi evidente para os pacientes com deterioração hepática moderada e os pacientes com deterioração hepática para uma diminuição na exposição à dalbavancina e um aumento

160 grave. Globalmente, a variabilidade dos parâmetros farmacocinéticos entre os pacientes era baixa e geralmente abaixo de 30% e, embora os parâmetros farmacocinéticas da dalbavan cina fossem estatisticamente diferentes entre os grupos de deterioração hepática superiores e inferiores, as faixas dos parâmetros de exposição significativamente coincidiram

As mudanças nos parâmetros farmacocinéticos da dalbavancina distribuição pareceram ser influenciadas pelo da droga. Os volumes de distribuição volume de aumentaram em uma maneira proporcional igual ou inversamente proporcional que a CL e a AUC. A meia-vida de eliminação terminal da droga foi virtualmente inalterada através dos grupos. Os pacientes com deterioração hepática moderada e grave, que c

tem significativamente mais ascites e edema, têm volumes maiores de distribuição da droga e subsequentemente exposições à droga ligeiramente menores.

Houve uma sobreposição nas concentrações através dos perfis sobre os grupos, com as concentrações médias permanecendo acima de 20 mg/L em todos os grupos através da duração pretendida de tratamento de 14 dias. Houve também uma sobreposição na exposição à droga através dos grupos (Figura 25). Mesmo com uma diminuição na exposição média, os pacientes com deterioração hepática grave ainda tinham uma exposição à droga através do período de tratamento relativo (14 dias) que excedia os parâmetros requeridos para a terapia. Nenhum ajuste da dosagem de dalbavancina é requerido para os pacientes com qualquer grau de deterioração hepática.

161

TABELA 26

Parâmetros Farmacocinéticos da Dalbavancina para Pacientes

Saudáveis e Hepaticamente Deteriorados SEGUINDO 1000 MG de dalbavancina no Dia 1 e 500 MG de dalbavancina no Dia 8

Média (± SD)	Deterioração Hepática Branda (N=6)	Deterioração Hepática Moderada (N=6)	Deterioração Hepática Grave (N=5)	Função Hepática Normal (N=9)
(mg/L)	331,7 (80,6)	227,2 (37,5)	199,0 (30,4)	278,3 (52,6)
Cmáx2 (mg/L)	177,0 (62,4)	122,7 (27,2)	118,9 (23,9)	166,3 (42,9)
AUC0 daia (mg.h/L)	11146 (3478)	7710 (1099)	7561 (1540)	10577 (2493)
AUCo-diais (mg.h/L)	21158 (5808)	14826 (1925)	14112 (2911)	20473 (4883)
AUCo-inf (mg.h/L)	33117 (6479)	23628 (3527)	21639 (5940)	33851 (8184)
CL (L/h)	0,0466 (0,0084)	0,0647 (0,0098)	0,0736 (0,0202)	0,0466 (0,0110)
Vss	18,1 (5,2)	24,4 (3,0)	25,2 (4,0)	18,3 (3,7)
tl/2 (h)	323 (27)	320 (24)	322 (68)	321 (24)

Exemplo 7

Ligação da Dalbavancina às Proteínas usando Microcalorimetria Isotérmica por Titulação

A ligação da dalbavancina às proteínas foi medida por microcalorimetria isotérmica por titulação (ITC) em 10 fosfato a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4, a 25 e 37°C, usando um instrumento Microcal VP-ITC. Em um experimento típico, 25 x 10 μΐ de proteína (-150 μΜ) foram injetados em uma solução de dalbavancina contendo célula de calorímetro (-5 μΜ) . As concentrações reais de proteína e dalbavancina foram deter15 minadas por medição da absorbância a 280 nm. Os experimentos de controle incluíram injeções de proteína no tampão (na ausência de dalbavancina) para serem responsáveis pelos calores de diluição da proteína sob condições idênticas.

162

Para comparação, foram efetuados experimentos similares, com algumas modificações necessárias, usando a teicoplanina.

Os experimentos com dalbavancina foram conduzidos com cada uma das seguintes proteínas: albumina humana; albu5 mina de cão; albumina de rato; albumina bovina; e a-glicoproteína humana. A teicoplanina foi estudada com a albumina humana e a oc-glicoproteína. Uma comparação das afinidades de

TABELA 27

Comparação das afinidades de ligação aparentes (Ka, X 10⁵ M¹)

	25°C	37°C
Dalbavancina
Albumina Humana	1,35 (± 0,2)	1,33 (± 0,15)
Albumina de rato	3,1 (± 0,5)	2,8 (± 1,8)
Albumina de cão	0,62 (± 0,09)	0,50 (± 0,13)
Albumina bovina	1,38 (± 0,14)
a-glicoproteína	1,84 (± 0,36)	4,8 (± 2,3)
Teicoplanina
Albumina humana	0,96 (± 0,08)
a-glicoproteína	0,07 (± 0,01)

Os ± erros mencionados são os desvios padrões obtidos a partir da rotina de adaptação.

Os efeitos integrados de calor, após correção dos calores de diluição, foram analisados por regressão nãolinear usando um modelo de ligação de local único simples 15 com o pacote de software Microcal ORIGIN padrão. Os dados brutos (qcal/s) para cada injeção foram integrados para dar o efeito total de calor por adição, então divididos pela quantidade de injetante para dar kcal/mol de injetante. A

163 mesma integração foi aplicada para os efeitos de diluição de controle, e este foi subtraído dos dados reais de titulação.

Isto proporcionou um diferencial da curva de ligação na qual o grau de ligação é proporcional ao calor total liberado (ou 5 absorvido). Isto foi então analisado pelos métodos de regressão não-linear em termos de diversos modelos de ligação padrões. 0 modelo mais simples assume equilíbrio de ligação

não-competitiva simples, e dá três parâmetros:

K_a (= 1/Kdiss) é a associaçao de ligação (constante de dis10 sociação)

ΔΗ = a entalpia de ligação (o tamanho do sinal relacionado à ligação)

N = número de locais de ligação (assumindo que o modelo de ligação está correto)

Assumindo a ligação não-competitiva, N é o número (relativo) de mols de injetante requerido para saturar todos os locais de ligação disponíveis na amostra.

Para os experimentos com a dalbavancina, amostra e a proteína (HSA, etc.) a dalbavancina é a é o injetante. Estes resultados preliminares indicam que a ligaçao é relativamente fraca e, por causa da solubilidade insatisfatória da dalbavancina, é difícil determinar a estequiometria de ligação (N) inequivocamente. Entretanto, conforme visto na

Figura 6, em todos os casos, o dado adapta-se bem com N<1 (i.e., menos do que um para um de proteína para dalbavancina). Consequentemente, um valor de N = 0,5 significa que somente necessita metade de tantos mols de

164 proteína para ligar toda a dalbavancina quanto seriam esperados. Em outras palavras, cada proteína aparentemente liga duas moléculas de dalbavancina. É possível que a dalbavancina forme um dímero que liga 1:1 com uma proteína.

Os resultados da modelagem da estequiometria de ligação sugerem que duas moléculas de dalbavancina são ligadas a uma molécula de proteína, ao contrário da teicoplanina, que exibe uma ligação a 1:1.

A Tabela 28 apresenta a porcentagem de ligação calculada para as concentrações de antibióticos na faixa de 1-500 μΜ, assumindo concentrações fisiológicas de soro albumina humana (6 x 10~⁴ M) e a-glicopeptídeo (1,5 x 10⁵ M) . Para relacionar isto à situação clínica, a concentração de pico da dalbavancina no homem é aproximadamente 300 mg/L, ou 165 μΜ.

TABELA 28

Porcentagem de Ligação Calculada da Teicoplanina e da

Dalbavancina às Proteínas no Plasma

Concentração de antibiótico	Dalbavancina	Teicoplanina
Albunina Humana
1	98,8	98,3
10	98,8	98,3
100	98,7	98,0
165	98,6	ND
250	98,5	ND
500	98,0	ND
oc-Glicoproteína humana
1	73,0	9,6
10	68,2	9,1
100	26, 2	6, 0

165

Concentração de antibiótico	Dalbavancina	Teicoplanina
165	16, 9	ND
250	11,4	ND
500	5,9	ND

ND = Não efetuada

Nestes experimentos, a ligação da dalbavancina à soro albumina humana excede 98%. A fração ligada é razoavelmente constante através da faixa selecionada de concentrações de dalbavancina, i.e., 1-500 μΜ. Esta faixa inclui as concentrações terapêuticas no homem. A ligação da dalbavancina à α-glicoproteina é muito maior do que aquela da teicoplanina. A dalbavancina demonstra alta capacidade e baixa afinidade para proteínas plasmáticas de origem diferente, com valores de K_a similares através das proteínas 10 de todas as espécies testadas. Estes resultados auxiliam a explicar algumas das características farmacocinéticas únicas da dalbavancina. A ligação e a formação de um complexo de dalbavancina:proteína a 2:1 também explicam a meia-vida prolongada, e o volume de distribuição aparente, que asse15 melha-se ao volume de água extracelular. A baixa afinidade ajuda a explicar a atividade in vivo observada, que excede consideravelmente o que seria esperado para um composto com uma fração livre próxima a 1%. A alta capacidade para as proteínas plasmáticas auxilia a explicar as concentrações no 20 plasma relativamente altas atingidas, apesar da solubilidade insatisfatória do composto no pH fisiológico.

166

Exemplo 8

Características Farmacocinéticas e Distribuição da

Dalbavancina no Tecido em Ratos

Foram efetuados dois estudos em ratos adminis5 trados com uma infusão IV única de 20 mg/kg de [³HJdalbavancina. As excreções e mais do que 4 0 tecidos dife-

rentes foram coletados através de 70 dias após a administração, e a distribuição no tecido e a farmacocinética da radioatividade derivada da droga foram determinadas.

A [³H]-dalbavancina purificada por HPLC foi usada para estes estudos. A droga radiomarcada foi produzida via troca de tritio e purificada por HPLC.

Estudo do balanço de massa em rato

Os estudos de balanço de massa foram conduzidos para determinar o padrão de excreção da dalbavancina seguindo uma infusão intravenosa (IV) única de dalbavancina, em ratos machos.

Quinze ratos machos Sprague-Dawley receberam uma dose IV única de ³H-dalbavancina (20 mg/kg, 100 gCi/rato).

Seguindo a administração da dose, a urina e as fezes foram coletadas em intervalos de 24 horas até 14, 36, e 70 dias após a dose (3 ratos/tempo de coleta final). As lavagens das gaiolas com água e metanol também foram coletadas. As carcaças foram analisadas no final do período de coleta.

Todas as amostras foram analisadas quanto ao teor total de radioatividade por contagem de cintilaçâo liquida (LSC).

Seguindo a administração IV de ³H-dalbavancina nos ratos, a radioatividade derivada da droga foi eliminada

167 tanto na urina (~ 2/3 de radioatividade excretada) quanto nas fezes (~ 1/3 de radioatividade excretada). Aproximadamente metade da radioatividade administrada foi eliminada na urina e nas fezes dentro da primeira semana, o que está consistente com uma ti/₂ plasmática de aproximadamente 1 semana. Em 70 dias após a dose, somente 4,5% da dose permaneceu na carcaça. Uma radioatividade ínfima foi recuperada nas lavagens das gaiolas. Virtualmente toda a radioatividade administrada foi considerada (urina, fezes, carcaça, lava10 gens das gaiolas, e troca de trítio) durante o estudo.

Estudo de distribuição no tecido quantitativa (QTD) em rato

Os estudos de distribuição no tecido quantitativa foram conduzidos para avaliar a distribuição da dalbavancina no tecido seguindo uma infusão IV única de dalbavancina, em 15 ratos machos.

Quarenta e um ratos machos Sprague-Dawley receberam uma infusão IV única de ³H-dalbavancina (20 mg/kg, 50 gCi/rato). Os ratos (3 por ponto de tempo) sofreram eutanásia em 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 336, 840,

1176 e 1680 horas após a dose, para a coleta de sangue, plasma, e tecidos (incluindo a carcaça). Todas as amostras foram analisadas por LSC.

Os perfis de concentração-tempo foram determinados para mais do que 40 tecidos, incluindo o rim, o fígado, o 25 baço, o sangue, o plasma, o pulmão, e a pele. As concentrações e os valores de ti/₂ da radioatividade derivada da droga nos tecidos, incluindo a pele, eram comparáveis àqueles observados no plasma. A dalbavancina foi verificada

168 ser distribuída rápida e extensivamente com todos os tecidos, tendo concentrações quantificáveis de radioatividade derivada da droga dentro de 12 horas após a pós-infusão. A maioria dos tecidos atingiu uma concentração máxima (C_máx) dentro de 24 horas após a dose. A radioatividade recuperada após 5 dias foi <5% da dose em gualquer tecido individual. Em 70 dias após a dose, somente a carcaça manteve > 1% (2,34%) da radioatividade administrada. Assim, a dalbavancina não se acumulou em nenhum tecido individual, órgão, ou componente celular do sangue. As concentrações de radioatividade no SNC eram baixas, porém detectáveis neste modelo de animal saudável. A dalbavancina foi verificada penetrar na pele com concentrações de radioatividade derivada da droga que eram tão altas quanto, ou maiores do que, no plasma. A razão de sangue para plasma da radioatividade derivada da droga permaneceu relativamente constante com o tempo e era <1.

Como parte dos estudos de QTD, as amostras de bile foram coletadas de ratos canulados no duto biliar (4 animais) através de 384 h (16 dias) após a dose. Quase 11% da dose foi recuperada na bile durante 384 h após a dose. Isto representa a maior parte da radioatividade derivada da droga encontrada nas fezes.

Exemplo 9

Atividade Farmacodinâmica da Dalbavancina

O objetivo da terapia antimicrobiana é proporcionar concentrações ativas no local da infecção, por um período de tempo adequado, para erradicar os patógenos

169 invasores. Ο método principal para avaliar a atividade antimicrobiana in vitro é a determinação das concentrações mínimas inibitórias e bactericidas (MIC e MBC) . Entretanto, estes parâmetros somente medem os efeitos líquidos para um 5 período de incubação prescrito e não caracterizam o curso de tempo de atividade antimicrobiana. A MBC não determina se a taxa e o grau de atividade bactericida podem ser aumentados por aumento das concentrações de droga. Além disso, as determinações da MIC não medem se existem efeitos inibitó10 rios sobre as bactérias que persistem após a remoção da droga.

Um número crescente de estudos sugere que a taxa de atividade bactericida, a sua dependência na concentração ou o tempo de exposição, e a presença ou ausência de um 15 efeito pós-antibiótico claramente descrevem o curso de tempo da atividade antimicrobiana e são parâmetros farmacodinâ-

micos importantes para determinar os regimes de dosagem ótimos. Por exemplo, a morte bacteriana por antibióticos de beta-lactam mostra pouca dependência na concentração e o grau de morte é devido principalmente à duração da exposição. Além disso, as beta-lactams produzem efeitos curtos, ou nenhum efeito, pós-antibiótico (PAE) com bacilos gramnegativos. Assim, predir-se-ia que os regimes de dosagem que mantêm os níveis de droga acima da MIC por um período de tempo suficiente demonstrariam a melhor eficácia. Isto tem sido confirmado em diversos modelos de animais. Por outro lado, as fluorquinolonas exibem morte dependente da concentração e produzem efeitos prolongados pós-antibiótico in

170 vivo. Predir-se-ia que a quantidade de droga, em vez da frequência de dosar, seria o determinante importante da eficácia para estas drogas. Isto também tem sido confirmado em diversos modelos de animais. Mais importantemente, a magnitude do parâmetro farmacocinético/farmacodinâmico requerido para a eficácia tanto para as beta-lactams quanto para as f luorquinolonas tem sido similar nos modelos de infecção de animais e infecções humanas.

Os estudos que seguem foram projetados para caracterizar as características farmacodinâmicas in vivo da dalbavancina. Foi determinado o impacto do regime de dosagem sobre a eficácia in vivo da dalbavancina no modelo de infecção da coxa experimental em camundongos neutropênicos. Os estudos foram também efetuados para investigar [1] qual parâmetro farmacocinético (nível de pico no soro, área sob a curva de concentração versus tempo (AUC), a duração do tempo que os níveis de soro excedem a MIC) melhor prediz a eficácia da dalbavancina e [2] se a magnitude do parâmetro PK/PD requerido para a eficácia é similar entre as bactérias gram-positivas comuns, incluindo os pneumococos resistentes à penicilina e o S. aureus resistente à meticilina. Finalmente, foi determinado o efeito do local da infecção sobre a atividade da dalbavancina tanto contra o S. pneumoniae quanto contra o S. aureus em ambos os modelos de infecção da coxa e por pneumonia.

Organismos de Estudo e MICs para a Dalbavancina

Os organismos de estudo e as suas MICs para a dalbavancina são listados na Tabela 29. As MICs foram

171 determinadas em MHB por técnicas de microdiluição de NCCLS padrões. O MHB foi suplementado com sangue de cavalo lisado a 3% para as determinações das MICs com S. pneumoniae. Todas as MICs foram efetuadas pelo menos em duplicata.

TABELA 29

Atividade In Vitro da Dalbavancina Contra as Cepas de S.

pneumoniae e S. aureus.

Organismo	MIC/MBC da Dalbavancina (mg/L)	MIC da Penicilina (mg/L)	MIC da Meticilina (mg/L)
cepa de S. pneumoniae
1199	0, 004	1,0	-
1293	0, 004	2,0	-
1325	0, 008	2,0	-
1329	0, 008	2,0	-
10813	0, 03	0, 008	-
cepa de S. aureus
25923	0,12/0,50	-	0,12
33591	0,12/0,25	=	>8, 0
31005	0,06/0,25	-	0,12
MRSA	0,12/0,25	-	>8, 0
Smith	0,06/0,50	-	0,12

Cinco organismos pneumocócicos e seis estafilocócicos foram utilizados. As MICs da dalbavancina para os pneumococos variaram de 0, 004 a 0,03 mg/L. A faixa de MICs para os isolados de S. aureus era mais estreita e maior do que aquelas contra os pneumococos, variando de 0,06-0,12 mg/L.

Farmacocinética

A farmacocinética da dalbavancina no plasma em camundongos suíços ICR neutropênicos infectados nas coxas é

172 mostrada na Figura 44. A neutropenia neste outros estudos foi produzida por injeções de e em todos os ciclofosfamida,

150 mg/kg 4 dias antes do estudo, 100 mg/kg dia antes do estudo e 100 mg/kg a cada 48 horas após o início da infecção até o final do estudo. As contagens de neutrófilos permaneceram menores do que 100/mm³ pela duração do estudo. As doses de 2, 5, 5, 10, 20, 40, e 80 mg/kg foram estudadas. A

droga foi administrada por injeção intraperitoneal de volume de 0,2 ml. O sangue foi removido de grupos de três camundongos por aspiração retro-orbital para tubos capilares heparinizados em

0,5, 1,

2, 4, 6, 24,

48, 72, e horas após a dosagem. O plasma foi separado, e as concentrações de dalbavancina no plasma foram medidas usando um ensaio microbiológico com Bacilus subtilus como o organismo de teste. Os níveis de pico foram observados em 4-6 h. As meias-vidas da dalbavancina foram determinadas por regressão linear dos mínimos quadrados. A AUC foi calculada pela regra trapezoidal estimada em a partir

24, 36, infinito.

AUC em 24 dividida por 6. A das concentrações médias. A AUC foi

48, 72, 96 h e extrapolada para o h foi calculada como a AUC em 6 dias dalbavancina exibiu farmacocinética linear.

meia-vida foi prolongada e variou de 7,6 a 13,1 horas.

Ligação à Proteína

O impacto da ligação da droga ao soro e às proteí para duas cepas de S. aureus em caldo, soro de camundongo infectado soro humano, e albumina (Tabela 30) . As MICs para nas no soro foi investigado comparando a MIC da dalbavancina

173 ambas as cepas no caldo foi 0,12 mg/L. As MICs (aritméticas) em 95% de soro de camundongo aumentaram para 32 mg/L. As MICs no ultrafiltrado de soro de camundongo elevou-se para somente 0,5 mg/L, sugerindo que a grande maioria da diferença nas MIC foi devida à ligação à proteína. Um estudo similar com o soro e a albumina humanos resultou em um aumento para somente 8 mg/L. Com base na diferença nas MICs entre o caldo e soro de camundongo, o grau de ligação à proteína foi estimado ser 99,6%. Este grau de ligação foi considerado nas análises farmacodinâmicas subsegüentes. O grau de ligação no soro humano seria estimado ser 96%.

TABELA 30

Impacto do Soro, do Ultrafiltrado de Soro, e da Albumina humana sobre a Atividade In Vitro da Dalbavancina Contra Cepas Selecionadas de S. aureus

Organismo	MIC em Caldo	MIC em 95% de Soro de Camundongo	MIC em 95% de Soro Humano	MIC em 95% de Albumina Humana	MIC em Ultrafiltrado de 95% de Soro de Camundongo
Cepa de S.aureus
25923	0,12	32	8, 0	8,0	0, 5
MRSA	0,12	32	8,0	8,0	0, 5

Modelos de Infecção

O modelo de infecção na coxa de murino foi usado para todos os organismos através dos diversos estudos. Neste modelo bem estabelecido, aproximadamente 10⁶ cfu dos organismos de estudo são injetados em uma ou em ambas as coxas (em 0,1 ml) duas horas antes do início da terapia. O número de organismos na coxa, no início da terapia, nos estudos que

174

Õ5S seguiram, variou de ίο^7,15-7,59 cfu/coxa. O modelo de infecção no pulmão de murino foi usado somente com um isolado único de S. pneumoniae ou S. aureus. Neste modelo, os camundongos foram infectados por uma inoculação intranasal de (aproxi5 madamente 10⁸'⁵ cfu/ml) de 50 ul via as narinas dos camundongos anestesiados. O tratamento começa 2 h após a inocuem cu j o tempo os camundongos tinham 10⁷'^{4 7,6} cfu/ pulmão.

Morte

In Vivo com o Tempo

Os efeitosde uma dose única de dalbavancina sobre a morte o tempo in vivo de uma cepa de S. pneumoniae são mostrados nas Figuras 45 e representa a média de 4 coxas. Foram usados doses, estudo níveis e S. aureus com

46. Cada ponto cinco níveis de variando 16 vezes. Os níveis de doses contra S aureus variaram de 5 até 80 de doses usados no estudo contra S.

usados mg/kg.

no

Os pneumoniae variaram de

0, 625 até 10 mg/kg. O grau de matança de ambas

as espécies foi amplo (>2 log com as doses mais elevadas estudadas).

Entretanto, o grau e taxa de matança do isolado pneumocócico foram maiores do que a cepa estafilocócica.

O estudo com as duas doses mais elevadas de dalbavancina resultou na morte de S.

aureus. Três dos cinco níveis de doses usados no estudo contra S. pneumoniae reduziram a carga de organismos quase quatro log nas coxas dos camundongos infectados.

Estudos do Regime de Dosagem

Nestes estudos, os regimes de dosagem múltiplos, variando a dose e o intervalo de dosagem, foram adminis-

175 trados de modo intraperitoneal em volumes de 0,2 ml aos grupos de camundongos por 144 h (6 dias) . Os intervalos de dosagem escolhidos foram 12, 24, 36, e 72 horas. Cinco doses diferentes (aumentos de duas vezes) foram usadas. O estudo contra S. aureus utilizou níveis de doses totais (mg/kg/6d)

variando de 30 a 480 mg/kg/6d. O estudo contra S. pneumoniae utilizou níveis de doses totais (mg/kg/6d) variando de 0,6125 a 10 mg/kg/6d. As Figuras 47 e 48 ilustram as curvas de respostas às doses para a dalbavancina nos intervalos de dosagem diferentes para as cepas de S. pneumoniae e S. aureus nas coxas de camundongos neutropênicos. Cada ponto representa a média de 4 coxas. Em geral, o aumento do intervalo de dosagem resultou em uma ligeira mudança das curvas de respostas às doses para a esquerda, indicando mais

eficácia com os regimes para os quais as doses grandes foram administradas infreqüentemente.

Cada uma das curvas de respostas às doses foi também matematicamente caracterizada usando um modelo de efeito máximo. Esta metodologia utiliza a equação de Hill 20 para estimar, por regressão não-linear, o efeito máximo (Emáx), a dose (P50) requerida para obter 50% do Emáx, e a inclinação da relação entre dose-resposta. A partir destes parâmetros, nós pudemos então calcular a dose requerida para produzir um efeito bacteriostático líquido durante o período 25 de tratamento de 144 horas, bem como as doses necessárias para produzir uma redução de 1 e 2 log na carga de organismos. A dose estática e a dose associada com uma morte de 1 e 2 log, para cada uma das combinações de droga

176 organismo e os diversos regimes de dosagem, são mostradas na

Tabela 31.

TABELA 31

Dosagens de Dalbavancina Requeridas para Atingir um Efeito

Estático Líquido, Morte de 1 e 2 Log para Quatro Intervalos de Dosagem Diferentes, em um Modelo de Infecção por S.

pneumoniae e S. aureus.

Orga- nismo	q 12 h	q 24 h	q 36 h	q 72 h
SD mg/kg (95%CI)	Morte de 1 log mg/kg (95SCI)	Morte de 2 log mg/kg (95%CI)	SD mg/kg (95%CI)	Morte de 1 log mg/ kg (95%CI)	Morte de 2 log mg/kg (95%CI)	SD mg/kg (95%CI)	Morte de 1 log mg/kg (95%Cl)	Morte de 2 log mg/kg (95%CI)	SD mg/kg (95%CI)	Morte de 1 log mg/kg (95%CI)	Morte de 2 log mg/kg (95%CI)
	2,3	2, 8	3,5	1,34	1,54	1,75	1,26	1,53	1,81	0,71	0,77	0,82
SP1O813	(1, 9-	(2,3-	(2,8-	(1,14-	(1,34-	(1,47-	<1,16-	(1,41-	(1,67-	(,64-	(,59-	¢,62-
	2,7)	3,3)	4,2)	1,57)	1,74)	1,36)	1,36)	1,65)	1,95)	,88)	,95)	1,02)
ΞΑ20213	80 (8-152)	-	-	26 (-39- 91)	267 (-400- 934 )	-	15 (-14- 44)	36 (-34- 106)	122 (-117- 361)	10 (-18- 38)	31 (-55- 117 )	(128 (-230- 486)

dose apresentada como dose total durante 6 dias aumento do regime de dosagem de 12 para 3 6

horas, no estudo contra

S. pneumoniae, não resultou em uma mudança apreciável nas finais microbiológicos.

valo de similar regimes dosagem de 72 doses associadas com os

Entretanto, a eficácia h requereu menos droga.

foi observada no estudo contra de dosagem que produziram uma três com o pontos interUma relação

s.

aureus.

Os únicos morte de e 2 log contra S. aureus foram os intervalos de e 72 h.

Parâmetros Farmacodinâmicos que se Correlacionam com a Eficácia

Nós determinados qual parâmetro PK/PD correlaciona-se melhor com a eficácia relacionando o número de bactérias na coxa, no final de 144 horas de terapia, com [1] a razão de pico/MIC, [2] a razão de AUC/MIC, e [3] a

177 porcentagem do intervalo de dosagem que os níveis de soro excedem a MIC para cada um dos regimes de dosagem estudados. Os valores dos parâmetros PK/PD para aquelas doses não especificamente estudadas foram extrapolados a partir dos valores das log cfu por em 24 horas doses mais próximas estudadas. A relação entre coxa e a razão de pico/MIC, a razão de AUC/MIC porcentagem de tempo que os níveis de soro

excederam

MIC são ilustradas na

Figura 4 9 para o S.

pneumoniae na

Figura 50 para o

S. aureus. Cada ponto representa média de quatro coxas.

Observou-se uma forte correlação com as razões de auc/Mie em 24 h e de pico/MIC, para ambos os organismos.

Entretanto, a regressão dos dados com a razão de AUC/MIC em 24 h resultou na mais forte

Os dados ilustrados nestas figuras foram também analisados pelo mesmo modelo de resposta à dose máxima mencionado acima, exceto que foram usados parâmetros PK/PD diferentes no lugar da dose. 0 R² representa o coeficiente de determinação observado para a relação entre a eficácia e cada parâmetro PK/PD. 0 coeficiente de determinação (ou R²) representa a porcentagem da variância nos números bacterianos que pode ser atribuída a cada parâmetro PK/PD e era alto tanto para AUC/MIC quanto para Cmáx/MIC.

Magnitude ou Alvo do Parâmetro PK/PD

Para determinar se a AUC/MIC requerida para um efeito estático era similar para os múltiplos patógenos, nós estudamos a atividade in vivo dos regimes de dosagem de 24 e 72 horas da dalbavancina contra 5 cepas de S.pneumoniae e 6 cepas de S. aureus, após 6 dias de terapia. As curvas de

178

Ο respostas às doses para a dalbavancina contra estas diversas cepas são mostradas nas Figuras 51 e 52. Nas Figuras 51 e 52, a dose é representada pela razão de AUC/MIC em 24 h, média, sem droga, durante o período de 6 dias de estudo. Em geral, o formato das curvas de respostas às doses era similar para todas as cepas. A posição da curva de resposta à dose estava relacionada à MIC do organismo. Entretanto, as curvas de respostas às doses para os organismos pneumocócicos estão deslocadas ligeiramente para a esquerda. Este deslocamento da curva sugere que menos droga era necessário para o efeito contra os pneumococos do que os estafilococos. A dose estática, a morte de 1 log e 2 log e a AUC/MIC em 24 h sem droga e a Cmáx/MIC associadas são mostradas na Tabela 32. 0 grau de matança bacteriana era relativamente similar para a maior parte das cepas. Todas as cepas exibiram mais do que uma queda de 4 logio na cfu durante o estudo de 6 dias.

TABELA 32

Eficácia da Dalbavancina Contra S. pneumoniae e S. aureus

Organismo	MIC/ MBC (mg/L)	Efeito Estático	Morte de 1 Log	Morte de 2 Log
mg/kg/ 24h	124AUC /MIC	124AUC /MBC	mg/kg/ 24h	124AUC /MIC	124AUC /MBC	mg/kg/ 24h	12 4 AUC /MIC	124AUC /MBC
Regime de q 24 h
SP1199	0,004	0, 40	16,0		0,49	19,4		0,57	22,7
SP1293	0, 004	0, 44	17,4		0,55	21,7		0, 65	25, 9
SP1325	0,008	1, 46	29,0		1,6	31,8		1,73	34,5
SP1329	0,008	0, 90	18,0		1,18	23,5		1,45	26,7
Spl0813	0, 03	1, 34	7,5		1,54	8,7		1,75	9,9
Média ± SD		0,91 ± 0, 44	17,6 ± 6,9		1,1 ± 0,47	21 ± 7,4		1,23 ± 0,52	24,3 ± 8,2

179

Organismo	MIC/ MBC (mg/L)	Efeito Estático	Morte de 1 Log	Morte de 2 Log
mg/kg/ 24h	124AUC /MIC	124AUC /MBC	mg/kg/ 24h	124AUC /MIC	124AUC /MBC	mg/kg/ 24h	124AUC /MIC	12 4AUC /MBC
SA25923	0,12/ 0, 25	42,7	216	52	51,2	250	60	60	289	69,3
SA33591	0,12/ 0, 25	22,3	96,2	46	27,7	121	58,3	33,5	157	74,3
SA31005	0,06/ 0, 12	49,3	483	242	-	-	-	-	-	-
MRSA	0,06/ 0,25	37,7	374	90	45,3	452	109	53,5	519	125
SA Smith	0,127 0,25	33,5	156	75	50,7	248	119	73,5	361	173
Média ± SD		37.1 ± 9.1	265 ± 143	101 ± 72	43,7 ± 9,5	268 ± 119	86,6 ± 27,6	55 ± 14	332 ± 131	110 ± 42
Regime de g 72 h		mg/kg /72 h
SP1325	0, 008	0, 83	6, 0		0,99	8, 8		1,16	17, 6
SP1293	0,004	1,01	14,1		1,28	18		1,68	23, 8
SP1199	0,004	0, 72	10,3		0, 85	12,1		0,99	35,3
SP1396	0,008	0, 52	4,0		0, 61	4,3		0,69	4,8
SP10813	0,03	0,71	1,4		0,77	1,6		0,82	1,6
Média ± SD		0,77 ± 0, 18	7,2 ± 4,5		0,93 ± 0,24	9,0 ± 5, 8		1, 13 ± 0,36	16, 6 ± 12,3
SA25923	0,12/ 0,50	160	274	66	185	317	76,1	214	367	88,1
SA33591	0,12/ 0,25	74	123	59	93	160	76,6	114	195	94
MRSA	0,06/ 0, 25	43	146	35,3	62	202	48,8	85	292	70
SA Smith	0,12/ 0,25	59	96	46,1	95	163	78,0	148	254	22
SA307109	0,06/ 0,50	31	94	11,3	34	108	12,9	37	121	14,6
SA31005	0,06/ 0,12	67,7	223	112	94, 6	325	163	127	364	217
Média ± SD		72 ± 41	160 ± 67	55 ± 31	94 ± 46	213 ± 8,14	75,9 ± 45,2	120 ± 54	266 ± 88	101 ± 61

Para os regimes de dalbavancina utilizando dosagem a cada 24 h, os valores de AUC/MIC em 24 h, sem droga, associados com o efeito estático contra S. pneumoniae e S.

180 aureus, foram 17,6 ± 6, 9 e 265 ± 143, respectivamente. As curvas de respostas às doses eram pronunciadas e os valores de AUC/MIC em 24 h associados com uma morte de 1 e 2 log não eram apreciavelmente elevados. A terapia contra os 5 pneumococos, baseada na AUC/MIC em 24 h, requereu 12 a 23 vezes menos droga, como sugerido pelas curvas de respostas

às doses. Para o S. aureus, a MBC foi 2 a 4 vezes maior do que a MIC. Caso se considere a AUC/MBC para o S. aureus, os valores seriam somente 4 a 8 vezes maiores do que para o S.

pneumoniae.

Para os regimes que utilizaram dosagem menos frequente (a cada 72 h) , os valores de AUC/MIC em 24 h, sem droga, associados com um efeito estático contra S. pneumoniae e S. aureus, foram 7,2 ± 4,5 e 160 ± 67, respectivamente. As 15 magnitudes PK/PD necessárias para obter os três pontos finais microbiológicos in vivo (dose estática, morte de 1 e log) foram menores para os regimes de dosagem mais amplamente espaçados. Quando a dalbavancina foi dosada a cada 72 h, os valores de AUC/MIC em 24 h, associados com os diversos pontos finais, foram 1,3 a 2,4 vezes menores do que quando a droga foi dosada a cada 24 h.

A resistência à penicilina no S. pneumoniae e a resistência à meticilina no S. aureus não impactaram a AUC/MIC em 24 h requerida para a eficácia da dalbavancina.

Impacto dos Neutrófilos sobre a Atividade da Dalbavancina

Para determinar o efeito dos neutrófilos sobre a atividade da dalbavancina, nós comparamos as curvas de respostas às doses com a dosagem de 24 horas da droga em

181 camundongos tanto normais quanto neutropênicos, infectados com S. pneumoníae. As curvas de respostas às doses subseqüentes são mostradas na Figura 53. Cada ponto representa o valor médio de 4 coxas. A dose estática, e as doses 5 associadas com uma morte de 1 e 2 log foram calculadas a partir dos parâmetros estimados por regressão não-linear, usando a equação de Hill. As doses (mg/kg/6 d) requeridas

para atingir estes pontos finais nos camundongos tanto normais quanto neutropênicos são mostradas na Tabela 33. A presença de neutrófilos resultou em uma redução de 1,7 a 2,1 vezes nas doses necessárias para a eficácia. Entretanto, estas diferenças não eram estatisticamente significativas.

TABELA 33

Impacto dos Neutrófilos sobre a Eficácia In Vivo da

Dalbavancina Contra S. pneumoníae.

	SD mg/kg (95% Cl)	Morte de 1 log mg/kg (95% Cl)	Morte de 2 log mg/kg (95% Cl)
Normais	2,03 (1,99-2,07)	2,35 (2,25-2,44)	2,66 (2,56-2,76)
Neutropênicos	4,13 (0,23-8,0)	4,38 (0,28-8,50)	4,62 (0,32-8,90)

Impacto do Local da Infecção sobre a Atividade da

Dalbavancina

Para determinar o impacto do local da infecção sobre a atividade da dalbavancina, nós comparamos as curvas 20 de respostas às doses com a dosagem de 24 horas da droga em ambos os modelos de infecção na coxa e no pulmão (Figura

54) . Tanto o S. pneumoníae quanto o S. aureus foram utilizados nestes modelos. As curvas de respostas às doses nos

182 dois modelos utilizando o S.

pneumoniae eram quase idênticas.

Em um estudo similar contra

S. aureus, a curva de resposta à dose no modelo de pulmão é deslocada para a esquerda, sugerindo que menos droga era necessária para a eficácia neste local de infecção. Entretanto, os intervalos de segurança no estudo estafilocócico eram grandes e estas diferenças não foram significativas.

Conclusões atividade

Os estudos acima mencionados caracterizaram a farmacodinâmica in vivo da dalbavancina contra uma variedade de patógenos. Estes podem ser resumidos como se segue.

A dalbavancina produziu atividade bactericida in vivo tanto contra S. pneumoniae quanto S. aureus em ambos os modos de infecção na coxa e no pulmão.

• A eficácia da dalbavancina era dependente da dose.

• Os parâmetros PK/PD dependentes da dose, AUC/

MIC em 24 h e Cmáx/MIC, estavam fortemente correlacionados com a atividade in vivo da dalbavancina. A regressão dos dados de respostas às doses com o parâmetro de AUC/MIC em 24 h resultou nos coeficientes de determinação mais elevados. A terapia com os intervalos de dosagem mais amplamente espaçados foi mais efetiva nestes modelos.

• Os valores de AUC/MIC em 24 h associados com o efeito microbiológico eram similares entre as cepas dentro das espécies estudadas. A resistência à beta-lactam no S.

183 pneumoniae e no S. aureus não impactou a atividade in vivo da dalbavancina.

• A eficácia contra S. pneumoniae requereu valores de AUC/MIC em 24 h menores do que contra S. aureus.

Isto pode, em parte, ser explicado pelas diferenças na MIC e na MBD entre as espécies.

• A eficácia contra S, pneumoniae, quer seja baseada em um efeito estático líquido, quer seja na morte de 1 ou 2 log, requereu uma AUC/MIC sem droga, durante os 6 dias de terapia, próxima a 100 nestes modelos de infecção. A eficácia contra S. aureus, baseada de modo similar, requereu uma AUC/MIC sem droga, durante os 6 dias, de próxima a 1000.

• A neutropenia teve impacto mínimo sobre a atividade in vivo da dalbavancina.

Exemplo 10

Determinação quantitativa da dalbavancina no plasma por

HPLC-EM/EM

O método de HPLC-EM/EM foi desenvolvido para a medição quantitativa da dalbavancina no plasma, como descrito 20 abaixo.

Preparação dos padrões de calibração de dalbavancina e de conrole de qualidade

As soluções de estoque de dalbavancina foram preparadas dissolvendo a dalbavancina em água deionizada, para preparar uma solução a 1000 qg/ml, seguida por diluições em série em água deionizada, para preparar soluções a 500, 50 e 10 qg/ml.

184

Os padrões dalbavancina de 100, tando o plasma humano de

60, com calibração da concentração de e 40 pg/ml foram preparados espevolumes apropriados de uma solução de estoque de dalbavancina a 1000 gg/ml, preparada conforme descrito acima. Os padrões de calibração da concentração de e 10 qg/ml foram preparados espetando o plasma humano com volumes apropriados de uma solução de estoque de dalbavan-

cina a 500 pg/ml, e um padrão de calibração de 0,5 gg/ml foi preparado espetando de uma cina a humano o plasma humano com um volume apropriado solução de estoque a 10 qg/ml.

Os padrões de controle de qualidade de dalbavan90 e com um dalbavancina gg/ml foram preparados espetando o plasma volume apropriado de uma solução de estoque de a 1000 qg/ml, preparada conforme descrito acima. 0 padrão de controle de qualidade de 1,5 gg/ml foi preparado espetando o plasma humano com um volume apropriado de uma solução a 50 pg/ml.

tf#

Preparação da solução de preparação de padrão interno

Uma solução de preparação de padrão interno BI20

K0098 a 30 gg/ml, que é o derivado de dietil-amino-propil25 amino mente ml de A-40926, foi preparada como se segue. Aproximada10 mg de BI-K0098 foram de fase móvel A (80%

Fórmico

10% de a 10 mM, pH 3 (v/v), dissolvidos em aproximadamente de

10%

2-Propanol (v/v)) para

Formiato de Amônio/Ácido preparar uma solução de estoque de padrão interno a 1000 pg/mg. A solução de estoque (300 μΐ) foi então diluída até um volume de 10 ml com a fase

185 móvel A, para preparar uma solução de padrão interno a 30 pg/ml.

Preparação de amostras para análise

As amostras foram preparadas como se segue, para a determinação quantitativa da concentração de dalbavancina no plasma. Foram adicionados 100 μΐ de solução padrão de prepa-

ração de padrão interno a 50 μΐ dos padrões de calibração ou de controle de qualidade, preparados conforme descrito acima, e misturados. A mistura foi deixada equilibrar-se por cinco minutos, na temperatura ambiente, seguida por adição de 250 μΐ de acetonitrila. A mistura foi então remoinhada por 10 segundos, seguida por centrifugação por 1 minuto em torno de 10.000 rpm sobre uma micro-centrifugueta ALC 4214.

Os sobrenadantes foram transferidos para tubos limpos e evaporados até a secura em um Sistema Savant Speed-Vac, em torno de 40°C. As amostras foram então suspensas novamente

em 150 μΐ de fase móvel A.

Método analítico

As amostras de 50 μΐ preparadas para análise conforme descrito acima foram injetadas em uma coluna

Phenomenex Júpiter Cib (50 x 2 mm, Ci₆ 5 pm 300 A) , e analisadas sob condições de HPLC com gradiente em uma vazão de 0,3 ml/min. As condições de gradiente foram: inicial, 80% de fase móvel A/20% de fase móvel B (20% de Formiato de 25 Amônio/Ácido Fórmico a 10 mM, pH 3 (v/v) , 40% de Acetonitrila (v/v), 40% de 2-propanol (v/v)); 1 minuto, 20% de fase móvel A/80% de fase móvel B; 2 minutos, 20% de fase móvel

370

186

A/80% de fase móvel B; 2,5 minutos, de volta para as condições iniciais.

O sistema de HPLC foi acoplado a um espectrômetro de massa quadrupolo triplo PE SCIEX API-2000, com a pulveri-

zação de íons turbo operando em um modo de ionização positivo. O ar foi usado para gerar uma pulverização na fonte de íons. A temperatura da sonda foi ajustada a 500°C com o nitrogênio como o gás de cortina. 0 monitoramento das reações múltiplas (MRM) foi empregado usando o nitrogênio como o gás de colisão. Os analitos foram detectados monitorando-se as seguintes transições iônicas: 909,3 Da 1429,3 Da para a dalbavancina, e 923, 3 Da —> 1457,3 Da para o padrão interno (BI-K0098). Para evitar a contaminação do espectrômetro de

massa, foi efetuado um desvio do fluxo após a coluna no primeiro minuto e 2,5 minutos após o começo da corrida cromatográfica.

O software Sample Control 1.4 foi usado para a aquisição de análise de dados e o software MacQuan 1.6 foi usado para a integração dos picos cromatográficos e avaliação dos dados estatísticos.

Curvas de calibração

A linearidade do método de ensaio foi avaliada testando os padrões de calibração para gerar uma curva de calibração. A concentração da dalbavancina em uma amostra de 25 plasma foi determinada calculando a razão da área de pico entre a dalbavancina e o padrão interno.

As curvas de calibração para as concentrações de dalbavancina sobre uma faixa analítica de 0,5-100 pg de

187 dalbavancina/ml de plasma humano foram construídas usando a equação y = A + Bx (1/x em peso), onde A representa a intercepção da curva, B representa a inclinação da curva, x representa a concentração de dalbavancina do padrão de 5 calibração (gg/ml) , e y representa a razão de área de pico de dalbavancina para padrão interno. Foram construídas três curvas de calibração separadas. Os resultados mostraram que

a razão de área de dalbavancina/padrão interno e as concen10 trações de dalbavancina variaram linearmente sobre a faixa analítica.

limite inferior de quantificação (LLOQ) foi 0,5 pg de dalbavancina por ml de plasma humano.

As inclinações para as curvas de calibração eram reproduzíveis e os seus coeficientes de correlação eram maiores do que 0,9995.

Estabilidade da dalbavancina no plasma

A estabilidade da dalbavancina nas amostras de plasma foi testada analisando três réplicas de padrões de controle de qualidade de amostras de plasma humano, preparadas conforme descrito acima, em duas concentrações diferentes, 1,5 e 90 qg/ml. A concentração de dalbavancina detectável era estável após três ciclos de tratamento por congelamento-descongelamento. A concentração de dalbavancina nas amostras processadas era estável após 24 horas na temperatura ambiente. Não foi observada nenhuma redução na concentração de dalbavancina em relação às amostras no tempo 25 zero.

188

Exemplo 11

Análise da Espectroscopia de Massa da Dalbavancina

A natureza dos multimeros de dalbavancina em solução foi investigada e as condições que influenciam a razão de população do multimero de dalbavancina para monômero de dalbavancina foram determinadas por espectroscopia de massa de íons por eletropulverização (ESI-EM).

Os experimentos foram efetuados usando um espec10

trômetro de massa

API 111+ da Applied Biosystem, equipado com uma

Triplo, fonte de operando

TurboIonSpray, um analisador Quadrupolo no modo de íon positivo. As condições otimizadas são descritas na Tabela 34 abaixo.

TABELA 34

Condições Instrumentais para a Análise de Dalbavancina no

Espectrômetro de	Massa API III+ da Applied Biosystem
Fonte de IonSpray:		Analisador de EM:
		Voltagem da placa de
Voltagem de IonSpray	5000 V	interface	650 V
Voltagem da placa de		Voltagem de offset do
orifício	80 V	caminho de Q0	40 V
Fluxo do gás de cortina Fluxo do gás de	0,6 L/min	Massa do parque de Ql	1000
nebulizador	1,2 L/min	Resolução de Ql	120, 8
Fluxo do líquido	5 μί/πιίη	Massa de Ql delta Voltagem de offset do	0,2
Aquecedor de interface	60°C	caminho de Ql	27 V
		Voltagem da lente 7 Voltagem de offset do	-50 V
		caminho de Q2	-50 V
Condições de varredura		Massa do parque de Q3	1000
(varredura de Ql) :		Resolução de Q3	110
		Massa de Ql delta Voltagem de offset do	0
Etapa	0,1 amu	caminho de Q3	-70 V
Tempo de residência	1 ms	Voltagem da lente 9 Voltagem da placa de	-250 V
		Faraday Voltagem do multiplicador	-250 V
		de elétrons de canal	-3800 V

189

Dalbavancina em solução

Os parâmetros instrumentais foram ajustados em uma solução de dalbavancina contendo 0, 1 mg/ml de dalbavancina dissolvida em uma solução de água:isopropanol a 8:2. Um espectro da dalbavancina em solução foi adquirido na faixa

de 500-2000 amu seguindo a injeção direta da solução. O espectro resultante, conforme visto na Figura 7, indica a presença de multímeros de dalbavancina. Como um exemplo não limitativo, uma linha do espectro é atribuível a um homomul10 tímero de B_o, que está presente com uma espécie iônica (2nM + y(⁺3) ) , onde n é um número inteiro positivo indicando a multiplicidade do homomultímero, p.ex., η = 1 quando o multímero for um homodímero e n = 2 quando o multímero for um homotetrâmero, M indica a massa do monômero, y = n e ⁺3 indica uma carga de íon + três. Por exemplo, o homodímero de

B_o é proporcionado quando n = 1, y = 1, e M = massa de B_o.

Esta espécie de homodímero é atribuída a uma linha de íon (2M ⁺3) no espectro de massa.

Influência da concentração de dalbavancina sobre a razão de população de multímero para monômero de dalbavancina

A influência da concentração de dalbavancina sobre a razão de população de multímero para monômero foi avaliada por espectroscopia de massa, usando as condições descritas acima. Os espectros foram adquiridos por infusão direta das 25 soluções de dalbavancina em concentrações de 20, 40, 60, e qg/mL. As intensidades dos picos principais foram descritas como uma função da concentração de dalbavancina e

190 as razões de população de multímero para monômero de dalbavancina foram determinadas, como mostrado na Figura 8.

Os dados indicam que a razão de população de multímero de dalbavancina para monômero de dalbavancina 5 aumenta com a concentração crescente. Isto pode auxiliar a explicar as altas capacidades de carga de droga que podem

ser administradas a um indivíduo. A função do multímero como um depósito de monômero pode diminuir a tendência das amostras de concentrações maiores de formarem precipitados e aumentar as concentrações que podem ser administradas a um indivíduo. A presença de multímeros pode também permitir a rápida administração de uma dose de dalbavancina a um indivíduo.

Um exemplo não limitativo de um método de determi15 nar a razão de população de multímero para monômero de dalbavancina é proporcionado, por exemplo, determinando a razão entre as intensidades de pico dos ions A e B, conforme

mostrado na Figura 7. A divisão da intensidade do pico A pela intensidade do pico

B proporciona uma medição da razão de população de multímero para monômero de dalbavancina.

Influência do pH sobre a razão de população de multímero para monômero de dalbavancina

A influência do pH da solução sobre a razão de população de multímero para monômero de dalbavancina foi 25 avaliada nas condições instrumentais descritas acima e nos seguintes valores de pH da solução: 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, e 5,5. A razão de população de multímero para monômero de dalbavancina foi determinada em cada um dos valores de pH >375

191 e representada graficamente contra o pH, como visto na

Figura 9. Foi determinado que a razão de população de multimero para monômero de dalbavancina aumenta com o pH crescente.

Embora não estando limitado à teoria, acredita-se que os grupos iônicos, tais como um grupo carboxilato sobre um primeiro monômero de dalbavancina, auxiliem na estabili-

zação dos multimeros de dalbavancina pela formação de interações iônicas com ions opostamente carregados, tais como os grupos de nitrogênio terciário, sobre um segundo monômero de dalbavancina. Tais interações iônicas podem ser influenciadas pelo pH. Acredita-se que a tendência crescente da dalbavancina de estar presente como um multimero no pH mais elevado seja indicação que as interações iônicas são importantes na estabilização do multimero. Em particular, acredita-se que os multimeros de dalbavancina sejam desestabilizados em pH mais baixo, presumivelmente devido à interrupção das interações iônicas que contribuem para a estabilidade do multimero, visto que certos grupos funcionais, tais como os grupos carboxilato, podem ser protonados nos valores de pH mais baixos.

Influência da concentração iônica da solução sobre a razão de população de multimero para monômero de dalbavancina

A influência da concentração iônica da solução sobre a razão de população de multimero para monômero de espectros de massa foram obtidos no modo positivo de eletropulverização, em um instrumento de captura de ions dalbavancina foi determinada por espectrometria de massa.

Os •37G

192

Finnigan LCQ^Deca, previamente ajustado e calibrado no modo de eletropulverização usando Ultramark 1621, cafeína e MRFA (Lmetionil-arginil-fenilalanil-arginina). Todos os espectros de massa foram registrados usando as condições listadas na 5 Tabela 35. Os parâmetros da amostra que foram investigados são listados na Tabela 36.

TABELA 35

Condições da EM

Condições de Entrada da Amostra: Temperatura do Vaso Capilar: Gás Sheat (unidades arbitrárias de N2)	200 40
Ajustes da Voltagem de Entrada da Amostra: Polaridade: Voltagem da Fonte (kV): Voltagem do Vaso Capilar (V): Offset da Lente do Tubo (V):	positiva 4,70 34 -60
Condições de Varredura Total: Faixa de varredura (amu): Número de micro-varreduras: Tempo de íon máximo (ms):	500-2000 3 200
Condições de Varredura com Zoom: Faixa de varredura (amu): Número de micro-varreduras: Tempo de íon máximo (ms):	1218-1228 5 50

TABELA 36

Parâmetros da Amostra

Amostra	Ug/mL	Solvente	pH
Dalbavancina	100	COO*NH4 + 5 mM	5
100	COO’NH4 + 50 mM	5
100	COO‘NH4 + 100 mM	5

As soluções em água de amostra foram infundidas a qL/min via uma bomba de seringa Harward e os espectros de massa foram obtidos, conforme visto nas Figuras 10-12.

377

193

Os espectros obtidos indicam que a razão de população de multimero para monômero de dalbavancina é influenciada pela concentração iônica. Um aumento na concentração de tampão foi verificado corresponder a uma 5 diminuição nos traços de massa do multimero e, portanto, uma diminuição na razão de população de multimero para monômero

de dalbavancina.

Conforme mencionado, acredita-se que as interações iônicas sejam importantes na estabilidade do multimero de dalbavancina.

fato que a concentração iônica crescente estava correlacionada com a intensidade decrescente de traços de massa do multimero confirma a função das . interações iônicas na estabilidade do multimero. Entretanto, como os traços de massa do multimero estavam presentes mesmo nas concentrações iônicas mais elevadas, uma outra segunda interação pode estar envolvida na estabilização do multimero .

í Embora não ligado a qualquer teoria, acredita-se que as interações hidrofóbicas sejam importantes na estabilização das espécies de multimeros de dalbavancina. Se a estabilização destes multimeros de dalbavancina não covalentes fosse somente devida às interações iônicas, seria esperado que um aumento na concentração iônica resultasse na perda total da espécie de massa de multimero. Ou seja, seria 25 esperado que, à medida que a concentração iônica da solução aumentasse, as interações iônicas que estabilizam o multimero fossem rompidas pela população aumentada de ions em solução, com os quais os monômeros associar-se-iam mais

194 prontamente. Consequentemente, a concentração iônica da solução levaria os multímeros a desassociarem-se em componentes de monômeros e os espectros de massa resultantes estariam livres de quaisquer traços de massa de multimero.

Entretanto, mesmo em concentração iônica da solução alta (tal como formato de amônio a 100 mM) , a presença de

multímeros de dalbavancina é

Desse modo, os multímeros de estabilizados, pelo menos detectada no espectro de massa, dalbavancina são julgados serem em parte, por interações hidrofóbicas.

Composto estruturalmente similar

Acredita-se que a eficácia aperfeiçoada da Dalbavancina seja devida, pelo menos em parte, a sua capacidade de formar multímeros. Acredita-se que esta característica

única não seja compartilhada mesmo por compostos muito estruturalmente similares. Um composto com uma estrutura química similar à Dalbavancina foi investigado através de análise por espectroscopia de massa quanto à sua capacidade de formar multímeros. Os espectros de massa foram obtidos no modo positivo de eletropulverização, em um instrumento de captura de íons Finnigan LCQ^Deca, antes ajustado e calibrado no modo de eletropulverização usando Ultramark 1621, cafeína e MRFA (L-metionil-arginil-fenilalanil-arginina). Todos os espectros de massa foram registrados usando as condições listadas na Tabela 37. Os parâmetros da amostra que foram investigados são listados na Tabela 38. As soluções em água de amostra foram infundidas a 10 gL/min via uma bomba de

195 seringa Harward e os espectros de massa foram obtidos, conforme visto nas Figuras 13 e 14.

TABELA 37

Condições dos Espectros de Massa

Condições de Entrada da Amostra: Temperatura do Vaso Capilar: Gás Sheat (unidades arbitrárias de N2)	200 40
Ajustes da Voltagem de Entrada da Amostra:
Polaridade:	positiva
Voltagem da Fonte (kV):	4,70
Voltagem do Vaso Capilar (V):	34
Offset da Lente do Tubo:	-60
Condições de Varredura Total:
Faixa de varredura (amu):	500-2000
Número de micro-varreduras:	3
Tempo de íon máximo (ms):	200
Condições de Varredura com Zoom:
Faixa de varredura (amu):	1218-1228
Número de micro-varreduras:	5
Tempo de íon máximo (ms):	50

TABELA 38

Parâmetros da Amostra

Amostra	Ug/mL	Solvente	PH
Teicoplanina	50	H2O	n.a.
100	h2o	n.a.

n.a. = não ajustado

Um antibiótico de glicopeptídeo similar (teicoplanina) não mostra complexos multiméricos em solução em 10 diversas concentrações. Isto suporta a indicação que compostos estruturalmente similares não conseguem formar espécies multiméricas em solução, e que este fenômeno pode desempenhar uma função importante na atividade da dalbavancina.

380

196

Espectrometria de massa por tempo de vôo com

Exemplo 12 dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALD-TOF) de complexos de proteína-dalbavancina μΐ de HSA, 0,150 mM, foram misturados com 10 μΐ de solução de dalbavancina (a partir de 0,075 mM,

0,15 mM,

0,3 mM e 1,5 mM) e incubados por 60 min a 37°C. As amostras foram preparadas para análise usando a técnica de gotícula secada. Os espectros foram obtidos em um espectrômetro de massa por tof,

BRUKER FLEX III, previamente ajustado e calibrado tirando a usando média laser. Matriz: 9 sinapinico solução de soro albumina bovina padrão, adquirindo e dos espectros partes de DHB-9 acetonitrila/HjO gerados por 200 tiros de (ácido 2,5-diidróxi-benzói(50:50), 1 parte de ácido saturado em acetonitrila/H₂O (50:50). 0,5 amostra e 0,5 ul de solução de matriz ul de foram misturados e colocados sobre o alvo do laser.

A dalbavancina se liga à proteína como o monômero dalbavancina). Em razões muito altas de dalbavancina presença de complexos contendo 2 moléculas de dalbavancina por molécula de proteína.

Exemplo 13

Calorimetria Isotérmica por Titulação da Ligação da

Dalbavancina à N,N'-diacetil-Lys-D-Ala-D-Ala na presença de

Soro Albumina Humana

A ligação da dalbavancina à N,Ν'-diacetil-Lys-DAla-D-Ala, um análogo peptídico dos alvos da parede celular

0?/

197 da dalbavancina, foi investigada por calorimetria isotérmica por titulação (ITC), na presença de HSA, sobre uma faixa de concentrações (até 600 μΜ) , a 25°C, com algumas medições adicionais a 37°C. A HSA aumentou a solubilidade da dalba5 vancina e reduziu a sua afinidade de ligação pelo ligante de tri-peptideo. Os resultados foram comparados com aqueles para a vancomicina. Os efeitos observados estabilizaram-se

nas concentrações de HSA relativamente baixas, consistente com um modelo de ligação não-competitiva que permite a ligação do ligante à dalbavancina tanto livre em solução quanto (mais fracamente) ao complexo de dalbavancina-HSA.

Os experimentos preliminares demonstraram que, na ausência de proteínas em soro, a dalbavancina e a vancomicina mostram perfis similares de ligação: ambas proporcionam ligação exotérmica à N_AN^z-diacetil-Lys-D-Ala-DAla, porém nenhuma evidência de ligação ao dipeptídeo (D-

Ala-D-Ala) ou ao Lys-D-Ala-D-Lactato. Para a interação entre dalbavancina/tri-peptideo, os dados estavam consistentes com a ligação com Kdi_ss = 1-10 μΜ, dependendo da temperatura, similares à vancomicina sob as mesmas condições. Na presença de HSA, a solubilidade da dalbavancina é significativamente aumentada e a afinidade de ligação pelo tri-peptideo é reduzida em um modo consistente com a ligação competitiva ou não-competitiva pela HSA pelo antibiótico. Os experimentos 25 descritos neste Exemplo foram projetados para: (a) comparar as medições de dalbavancina/tri-peptideo em diferentes temperaturas (25 e 37°C) e diferentes concentrações de HSA;

198 (b) usar estes dados para construir um modelo de ligação para comparar com os números observados.

A dalbavancina foi fornecida pela Biosearch Itália.

Os outros reagentes eram da Sigma: cloridrato de vancomicina (Sigma V-2002, fw 1485.7), N,N'-diacetil-Lys-D-Ala-D-Ala

(Sigma D-9904, fw 372.4), albumina humana (HSA; Sigma A3782; mw 69,366).

Os antibióticos e os peptideos foram dissolvidos em tampão aquoso (fosfato de Na a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH

7,4) contendo HSA, com agitação suave, imediatamente antes de cada experimento. As concentrações de peptideos foram determinadas por peso. As concentrações de dalbavancina foram determinadas por peso ou por absorbância de UV usando os coeficientes de extinção molar ε = 12430 (dalbavancina, 15 A₂8o^1% = 68,42), ε₂8ο = 6690 (vancomicina). As concentrações de

HSA foram determinadas por absorbância de UV (HSA, ε₂8ο =

37.700; A₂8o^1% = 5,44). Os espectros foram registrados na temperatura ambiente, em cadinhos de quartzo de comprimento de trajetória de 1 cm, usando os espectrofotômetros UV-160A ou UV-1601 da Shimadzu, com as amostras diluídas quantitativamente com o tampão, se necessário, para dar a absorbância na faixa de 0,1-1 A.

A calorimetria isotérmica por titulação foi efetuada usando um instrumento Microcal VP-ITC a 25°C e

37°C, usando procedimentos de operação padrões. Ver, p.ex.,

Wisemanet e col., Anal. Biochem. (1989) 179, 131-137;

Cooper, e col., Philos. Tarns. R. Soc. Lond. Ser. A-Math.

Phys. Eng. Sei. (1993) 345, 23-35; Cooper, A.,

Isothermal

199

Titration Microcalorimetry em C. Jones,

B. Mulloy e A. H.

Thomas (Eds.), Microscopy, Optical

Spectroscopy, and

Macroscopic Techniques.

Humana Press,

Totowa,

NJ, pág. 137-150; Cooper,

A.,

Microcalorimetry of Proteinprotein Interactions em

J.

E. Ladbury e B.

Z. Chowdhry (Eds.); Biocalorimetry: The

Applications of Calorimetry in the Biological Sciences. Wiley, (1998)

Pág.

103-111;

3^3

Cooper, A., Curr. Opin, Chem. Biol. (1999) 3,

557-563.

As amostras foram desgaseificadas suavemente, antes de carregar, para impedir a formação de bolhas na célula do calorímetro. Cada experimento tipicamente compreendeu 25 μΐ de injeções de solução de peptídeo (« 1 mM) na célula do calorímetro (volume « 1,4 ml) contendo solução de antibiótico (» 20-100 μΜ). Os experimentos de controle 15 envolveram a injeção de ligante no tampão, sob condições idênticas, para determinar os calores da diluição de

peptídeo, e estes valores foram usados para a correção dos dados de ligação brutos antes da análise. Os experimentos de ligação de dalbavancina/tri-peptideo foram repetidos diversas vezes em cada temperatura. Os dados de ligação por

ITC foram analisados usando o software padrão Microcal ORIGIN® para determinar o número aparente de locais de ligação (N) , a afinidade de ligação (K_aas = 1/Kdiss) e a entalpia de ligação (ΔΗ).

200

TABELA 39

Dados termodinâmicos para ligação da ligação do tri-peptideo à dalbavancina e à vancomicina, determinados por ITC, assumindo um modelo de ligação não-cooperativa simples: efeitos da temperatura e HSA.

	T °C	N	M'1	Kdiss μΜ	Δη kcal/mol	AS Eu	[HSA] μΜ
Dalbavancina	10	0,59	6,70E+05	1,49	-10,26	-9, 60	0
	10	0,59	9,20E+05	1,09	-8,95	-4,30	0
	10	0, 59	6,Θ5Ε+05	1, 46	-10,30	-9, 60	0
	10	0, 56	6,24E+05	1, 60	-10,30	-9,90	0
	25	0, 6	3,13E+05	3, 19	-10,10	-8,90	0
	25	X	3,30E+05	3, 03	-11,30	-12,60	0
	25	X	3,20E+05	3,13	-11,70	-14,00	0
	25	X	2,80E+05	3, 57	-14,30	-23,00	0
	25	0,57	3.03E+05	3,30	-12,60	-17,00	0
	25	0,74	3,19E+05	3,13	-11,20	-12,50	0
	25	0,54	3,93E+05	2,54	-12,90	-17,60	0
com HSA	25	0,37	1,18E+05	8, 47	-26,40	-65,50	13, 6
com HSA	25	0,35	1,18E+05	8,47	-27,80	-70,10	13,6
com HSA	25	0, 68	3,50E+04	28,57	-20,00	-46,20	34,2
com HSA	25	0, 83	2,76E+04	36,23	-16,90	-36,50	80,7
com HSA	25	1,38	3,49E+04	28,65	-18,60	-41,70	104
com HSA	25	0,9	3,10E+04	32,26	-21,05	-50,00	288
com HSA	25	1,242	2,Θ4Ε+04	35,21	-19,50	-44,90	403
com HSA	25	0, 86	2,18E+04	45,87	-15,00	-30,40	601
	37	0, 82	1,30E+05	7, 69	-12,50	-16,80	0
	37	0, 6	1,10E+05	9,09	-17,40	-33,20	0
com HSA	37	0,179	1,25E+04	80,00	-98,60	-299,00	482
com HSA	37	0,5	95 68	104,52	-26, 60	-67,60	516
Vancomicina	10	1,1	6,90E+05	1,45	-9,49	-6,80	0
	25	0, 91	3,40E+05	2, 94	-10,70	-10,60	0
	25	0,97	3,60E+05	2,78	-12,90	-17,80	0
com HSA	25	1, 05	2,90E+05	3, 45	-10,09	-8,80	513

201

Os experimentos de ITC sobre a ligação do tripeptideo à dalbavancina, na ausência de HSA, fornece dados consistentes para as afinidades de ligação, com K_dlss média na região de 1,4, 3,1, e 8,4 μΜ, a 10, 25, e 37°C, 5 respectivamente (Tabela 39). A ligação é exotérmica. Os cálculos das concentrações aqui indicam que N está mais próximo a 0,5 sob estas condições. Isto está consistente com

a ligação de uma molécula de tri-peptideo por dimero de dalbavancina, sob estas condições. Estas afinidades de ligação e entalpias de ligação são comparáveis àquelas observadas com a vancomicina, sob as mesmas condições (Tabela 39, e D. McPhail, A. Cooper, J. Chem. Soc.-Faraday Trans. (1997) 93, 2283-2289). Observar também que a vancomicina sofre dimerização induzida por ligante nas concen15 trações mais elevadas.

A adição de HSA às misturas de dalbavancina reduz a afinidade de ligação aparente entre o tri-peptideo e a dalbavancina, embora a ligação seja aparentemente mais exotérmica (Tabela 39). A dependência na concentração de HSA para isto, a 25°C, é mostrada na Figura 15. Após um aumento inicial (enfraquecimento) na Kd_iss aparente para 35 μΜ de HSA, ela permanece relativamente constante para as concentrações mais elevadas de HSA, aproximando-se dos níveis fisiológicos (600 μΜ) . 0 nível de estabilização nas concentrações altas de HSA (K_diss « 35 μΜ) corresponde a uma afinidade de ligação aproximadamente 10-12x mais fraca do que na ausência de HSA. É vista uma redução similar a 37°C.

202

O efeito da HSA não foi devido à interação com o tri-peptideo. Os experimentos de ITC de controle para a ligação da vancomicina ao tri-peptideo na presença de HSA forneceram resultados comparáveis àqueles vistos na ausência 5 de HSA (ver a Tabela 39). Isto indica que nem o peptideo nem o antibiótico estreitamente relacionado, a vancomicina,

interagem com a HSA em solução. Segue-se que qualquer efeito da HSA sobre a interação entre dalbavancina/tri-peptideo deve ser devido à interação entre a HSA e a dalbavancina.

Embora não desejando estar ligado por teoria, os dados acima mencionados estão consistentes com um modelo de ligação não-competitiva. Este modelo assume que o ligante de tri-peptideo (L) pode ligar-se à dalbavancina (D) tanto no estado livre quanto (possivelmente com afinidade diferente) no complexo de dalbavancina-HSA.

(	D + L ÍR DL D + HSA 9Ϊ D.HSA	Kl = [D][L]/[DL] Khsa = [D] [HSA] / [D.HSA] Kldhsa = [D.HSA] [L] / [LD.HSA]
D.HSA	+	L *R LD.HSA ;
			Constante de	dissociação de ligação aparente

(observada) (não-competitiva):

Κηρ.τ. = [D total] [L]/[complexo de DL total] = ([D] + [D.HSA] ) [L] / ( [DL] + [LD.HSA]) — + [ HSA]/K_HSa) / {1 + [HSA] . K_l/Khsa · Kldhsa}

Este mostra uma dependência hiperbólica de K_ap._L na concentração de HSA livre, que harmoniza-se bem com o dado

203 observado (Figura 15) . Na [HSA] alta, este atinge um valor assintótico (de estabilização)

K_ap.L = K_Ldhsa (para [HSA] grande)

Isto sugere que a afinidade de ligação pelo tri5 peptideo é em torno de 35 μΜ quando a dalbavancina estiver ligada à HSA, em comparação com 3 μΜ para a dalbavancina livre (números a 25°C).

Podem ser sugeridos mecanismos adicionais em termos de se a dalbavancina está atuando como um monômero ou 10 um dimero em suas interações com os peptideos ou as proteínas. A comparação direta da dalbavancina com a vancomicina (que mostra ligação inequívoca a 1:1 nestas baixas concentrações) mostra que a ligação está completa nas razões molares menores (N menor) para a dalbavancina (Figura 16) .

Isto está consistente com um complexo de dalbavancina: peptideo a 2:1.

Entretanto, na presença de HSA, os valores de N aparentes aumentam (Tabela 39) , e podem estar mais consistentes com a formação de complexo a 1:1. Embora não 20 desejando estar ligado por teoria, o modelo mostrado na

Figura 17, mostrando a interação possível dos monômeros e dos dímeros de dalbavancina com os ligantes de tri-peptídeo e a HSA, está consistente com estas observações. A Figura 17A representa a dalbavancina como em equilíbrio de 25 monômero-dímero em solução (predominantemente como dimero), porém ligando-se como monômero a dois locais separados sobre a HSA. Isto está consistente com os valores de N = 0,5

204 observados pela ITC para a ligação das proteínas em soro à dalbavancina (Exemplo 3). A Figura 17B representa a ligação do ligante ao dimero de dalbavancina em solução, e (mais fracamente) aos monômeros de dalbavancina ligados à HSA.

Isto está consistente com a ligação não-competitiva da dalbavancina tanto ao tri-peptideo quanto à HSA, com

estequiometrias aparentes variáveis.

Em resumo, este Exemplo mostra que a HSA reduz a afinidade de ligação da dalbavancina pelo ligante de tripeptideo em um modo consistente com um mecanismo naocompetitivo e que a dalbavancina ligada à HSA mantém a sua capacidade de ligar os ligantes de tri-peptideos, embora com afinidade reduzida. Estes resultados estão também consistentes com um modelo no qual a dalbavancina está em equilíbrio de monômero-multímero, predominantemente multimé-

rica em solução, com forte afinidade dos multímeros pelo ligante de peptideo. Os monômeros de dalbavancina, tanto livres quanto ligados à soro albumina, também podem ligar peptídeos com uma afinidade reduzida.

Exemplo 13

Preparações de A-40926 e Dalbavancina

Preparação do A-40926

A-40926, o glicopeptídeo natural produzido por fermentação, foi o material de partida para a produção da

Dalbavancina. Ele foi produzido por uma Nonomuria sp ATCC

39727 como uma mistura de A-40926 e o seu derivado de acetila (ver a Patente U.S. N^£ 4.935.238 e B. Golstain e col. Antimi crobial Agent and Chemotherapy, dez. de 1987,

205

JP?

págs. 1961-1966). O derivado de acetila foi primeiramente desacetilado para A-40926. Após a desacetilação, o A-40926 foi purificado por cromatografia em coluna sobre poliamida, conforme descrito abaixo. A descrição que segue é represen tativa do método de produção atual. As quantidades descritas aqui são aproximadamente 1/4 das quantidades normalmente trabalhadas em uma preparação industrial.

Desacilação do A-40926 m³ de contendo um total de cerca de g/L de A-40926 e de seu derivado de acetila, foram ajustados, sob agitação, em pH

11,4 com o

NaOH 30 %. A agitação foi continuada por 6 horas, então a temperatura foi reduzida para 15°C e o trado (Microfiltro Koch Protosep IV caldo foi microfilcom uma membrana cerâmica de 0,12 m², 0,1 μ). Durante a microfiltração, a água foi adicionada continuamente ao retentado para obter, no final do

de 4,5-5 m³ processo, (metade do permeado, um permeado de 20-25 m³ e um retentado valor de partida).

que continha o A-40926, foi analisado por HPLC. Quando a desacetilação foi completada, o pH da solução de permeado foi ajustado em pH 7 com sulfúrico m³ de mg/L). 0 processo foram obtidos caldo filtrado contendo 6,62 kg de

A-40926 (268 rendimento da desacetilação foi 66,2 de microfiltração seja realizado por um

%. Caso o tempo mais neste processo, o rendimento pode ser aumentado até 90 %.

longo e volume de extração maior do que aqueles empregados

206

Purificação do A-40926 sobre coluna de poliamida

Após a extração, o A-40926 filtrado foi purificado sobre uma coluna descrito abaixo. A quantidade descrita contido no caldo de poliamida, como nesta descrição aproximadamente 1/10 da quantidade normalmente trabalhada em uma preparação industrial e é representativa do método de produção atual.

500 L de resina de poliamida SC6 (da Macherey

Nagel) foram suspensos em água para uma coluna. A resina foi

6,5, eluindo a coluna com pelo de uma solução de tampão carbonato de sódio em solução resultante com o desmineralizada e carregados então condicionada em pH 6menos 2 BV (volume de leite) preparada por dissolução de 4

800 L ácido

O caldo filtrado de mg/L; A-40926 2475 g;

kg de de água e ajuste do acético.

A-40926 (9000 L; ensaio pH da

0, 275 pH 6±0,2; temperatura 10±3°C) foi carregado para a coluna em torno de 5 g de atividade por litro de resina atividade/resina de seguintes soluções:

(foi

5-8 normalmente usada g/L) . A coluna foi

BV (1500 L) preparada por dissolução de 7,5 kg

1500 L de acético; 4 dissolução uma razão lavada com de uma solução em pH de carbonato de sódio de as em água desmineralizada e ajuste do pH com ácido

BV (2000 L) de uma solução em pH 8, preparada por de 10 kg de carbonato de sódio em 2000 L de água desmineralizada e ajuste do pH com ácido acético; 1,5 BV kg de carbonato de sódio em 750 L de água desmineralizada e ajuste do pH com ácido acético.

(750 L) de uma solução em pH 9, preparada por dissolução de

207

O A-40926 foi recuperado da coluna por eluiçâo com

BV (2000 L) de uma solução de tampão em pH 10, preparada por dissolução de 10 kg de carbonato de sódio em 2000 L de água desmineralizada e ajuste do pH com ácido acético. As 5 frações contendo o A-40926 purificado (concentração de A40926 maior do que

0, 5 g/L e % de área de HPLC do componente principal (Bo+Bi) maior do que

%) foram coletadas,

neutralizadas com

HC1

IN, e analisadas por HPLC.

Aproximadamente 2000 L de resina usada solução para a com 1,5 BV de mistura a

1:1 de clara final purificação isopropanol seguida por uma lavagem com 5 BV foram obtidos.

foi regenerada / 5% de NaoH, de água desmineralizada.

Concentração do A-40926 solução que veio da coluna foi submetida a diversas rodadas de etapas de diluição/concentração para eliminar a maior parte dos sais inorgânicos na solução. A solução foi concentrada para 80 L por nanofiltração, usando uma membrana com um corte de 250 D, diluída com 80 L de água desmineralizada, e concentrada novamente no volume de 20 partida (80 L) por nanofiltração. Esta operação foi repetida

pelo menos 5	vezes.	0 pH da solução	final	(80 L, pH	7,5) foi
ajustado em	pH	6, 3	com 23 % de HC1.	A	solução foi então
diluída com	80	L	de acetona, e	o	seu	pH foi	ajustado
novamente em	pH	2,6	com 23 % de HC1.

Descoloração

680 g de carvão vegetal PA 200 C (~0,3 g/g de A40926) foram adicionados, sob agitação, à solução obtida na etapa acima mencionada (160 L) . A agitação foi continuada

208 por pelo menos 30 minutos, na temperatura ambiente, então cerca de 0,5-0,6 kg de auxiliar de filtro (DIF-BO) foi adicionado. A mistura foi filtrada através de um cartucho de filtro. A solução clara obtida foi concentrada sob vácuo (45°C) para reduzir a acetona abaixo de 10 %. O volume final

foi cerca de 100 L. 0 pH foi então ajustado em 6,7 com NaOH aq., e a etapa de concentração foi continuada, usando o nanofiltro usual, até que a concentração de A-40926 estivesse em torno de 100 g/L. 20 L de solução concentrada foram obtidos (A-40926 1884 g, 94,2 g/L).

Precipitação e secagem

A solução anterior foi diluída sob agitação com 20 L de acetona, e o seu pH foi ajustado a 5,1 com 10% de HCI. Foram adicionados 5 volumes adicionais de acetona (100 L) a 15 esta solução, para completar a precipitação do A-40926. Se o teor de água não estivesse <15% neste ponto, acetona adicional era adicionada. Após 2 horas, a suspensão foi centrifugada, e o sólido foi lavado com 3 x 10 L de acetona nova. Os licores-mãe foram analisados e descartados após ter verificado a ausência de produto.

A-40926 sólido foi secado sob pressão reduzida, a 30-35°C, em uma secadora estática, até que a acetona residual estivesse abaixo de 2 % e a água fosse menos do que 10 %. O produto foi então peneirado através de uma peneira de malha 50, obtendo 2,08 kg de A-40926 purificado (ensaio de HPLC 81,4 %; água 6,2 %; cinzas sulfatadas 4,8 %) . O rendimento, partindo da atividade carregada sobre a coluna, foi 68,4 %.

209

Síntese da Dalbavancina

A dalbavancina (BI-397) foi preparada a partir do glicopeptídeo natural A-40926, através de uma síntese de

três etapas, como descrito em Malabarba e Donadio (1999),

Drugs of the Future, 24(8):839-846. Especificamente, o A40926 foi primeiramente submetido a uma etapa de esterificação para preparar o MA, que foi então submetido a uma etapa de amidação para preparar o MA-A-1. Uma etapa de hidróiise final então converteu o MA-A-1 na dalbavancina.

Etapa de esterificação (Etapa 1)

A seguinte descrição é representativa do método atual em uso.

Preparaçao de H2SO4 96%/MeOH (Solução A)

Em um frasco de fundo redondo de 15 L, equipado com um agitador mecânico e um termômetro, foram adicionados

2,28 L de H₂SO 96% (~300 mL de H₂SO₄ 96% por kg de pó de A40926), gota a gota, a 7,9 L de MeOH. Um banho de gelo externo foi usado para manter a temperatura entre 0 e 5°C.

Procedimento de reação

O material de partida A-40926 (7, 6 kg; batelada

019, ensaio 85, 09 %; atividade 6,46 kg; 3,73 mols) foi suspenso em um reator revestido com vidro, de 140 L, em MeOH (46 L) , e a suspensão resultante foi esfriada a 0°C ± 2°C.

Nesta temperatura, a suspensão foi tratada com a Solução A previamente preparada (H₂SO4/MeOH). A solução resultante foi agitada a 0°C por 22-26 horas, ao mesmo tempo em que a reação (uma alíquota da reação diluída 100 vezes com mistura a 1:1 de acetonitrila/água) era monitorada através de

210

I V * • Ü

T análise por

HPLC a cada duas horas. A esterif icação foi considerada completa quando o A-40926 residual era menor do que 5 % e o diéster era não mais do que 10 % como % de área de HPLC.

Isolamento do éster (MA)

Quando a reação estava completa, a mistura foi esfriada a -5°C (+/- 2°C) e diluída com o mesmo volume de

a temperatura abaixo de 5°C. O produto (MA) foi precipitado por ajuste do pH da solução a

5,5 (+/- 0,2) lentamente adicionando 10,2 L de trietilamina (TEA). A agitação foi continuada por uma hora adicional a 02°C, então o sólido obtido foi centrifugado, lavado com água

L por kg de A-40926) e finalmente com MeOH (3 L de

MeOH por kg de A-4092 6 de

15°C. A lavagem com remover os sulfatos do

Os analisados e atividade. O partida) previamente esfriado a 10água

MA.

licores-mãe e descartados se foi feita as lavagens contivessem principalmente para foram separadamente produto foi· secado in vácuo [6,67

Hg)] a 35-40°C (temperatura externa) até que a kPa (50 mm de água residual de atividade,

3,23 mols) foram obtidos como um pó amarronzado.

A análise mostrou os seguintes valores de % de área de HPLC: MA 89,8, A-40926 3,2, Derivado de diéster 5,9.

O ensaio de HPLC foi 74,2 %, atividade 5,637 kg; 3,23 mols;

rendimento seguinte, sem nenhuma purificação adicional.

*

211

Etapa de amidação (Etapa 2)

A descrição que segue é representativa do método

3?5 de produção atual.

Preparação da mistura de DMSO / HC1 (Solução B)

A DMSO (1,6 L) foi colocada em um frasco de fundo redondo de 10 L, equipado com um agitador mecânico e um termômetro, e esfriada com um banho de gelo abaixo de 10°C. 0 HC1 37% (1 L) foi então lentamente adicionado, sob agitação, mantendo a temperatura da mistura abaixo de 2 5°C.

Procedimento de amidação (produção de MA-A-1)

5,95 kg de material de partida MA (ensaio 76,3 %,

KF 8,9 %; 2,68 mols) foram lentamente dissolvidos, sob agitação, em 19,2 L da mistura a 1:1 de DMSO / MeOH (--1,6 L de DMSO e 1,6 L de MeOH por kg de pó de MA), na temperatura 15 ambiente. Após 1 hora de agitação, 709 mL de 3-(dimetilamino)-propilamina (DMEPA, PM 102,1; densidade = 0,812 g/mL;

5,63 mols; 1,96 mol por mol de MA de partida) e 325 g de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT’H₂O; PM 253,1; 2,04 mols; 0,71 mol por mol de MA de partida) foram adicionados à mistura de reação. A agitação foi continuada até que fosse obtida uma solução completa, então a mistura foi ajustada em pH 3-3,1 (medido após diluir uma alíquota da reação 10 vezes com água) adicionando lentamente cerca de 2,0 L de Solução B (DMSO/HC1)

Uma solução de dicicloexilcarbodiamida (DCC),

206,3; 1,74 mol por mol de MA) em 4,1 L de mistura a 1:1 de

DMSO/MeOH, foi adicionada à mistura de reação agitada, em 10 preparada por dissolução de 1,03 kg de DCC (4,99 mols; PM

212

minutos. A agitação foi continuada por horas, então 51,5 g adicionais de DCC sólida (0,25 mol) foram adicionados à mistura de reação, a fim de diminuir o

MA residual abaixo de

5%, mantendo o nível de isouréias são um grupo de subprodutos produzidos por reação adicional da Dalbavancina com o excesso de DCC.

Tipicamente, após 2 horas adicionais (total de 7

reação estava completada. No final, a mistura foi diluída com água para 15% (v/v) e (60 L) para diminuir a ajustada em pH 2,3 com concentração de DMSO

HC1 IN (0,85 L) para destruir qualquer DCC residual.

Hidrólise de MA-A-1 para Dalbavancina (Etapa 3)

Após

12,0-12,1 com por 4 horas, minutos,

NaOH a 15 mantendo adições de NaOH a 15%.

a mistura foi ajustada em pH (8 L) . A agitação foi continuada mistura neste pH com pequenas

Após este tempo, o MA-A-1 residual era menos do que 0,2 % como % de área de HPLC.

A mistura foi então acidificada em pH 3,0 com HC1 a IN (19 L), e a suspensão foi filtrada para remover dicicloexiluréia formada. A torta sólida foi lavada sobre filtro com água desmineralizada (2 x 20 L) . As lavagens e filtrado foram unidos conjuntamente, obtendo uma solução clara que foi analisada por HPLC. Foram obtidos 152,8 L de solução contendo 21,74 g/L de Dalbavancina (atividade total

3322 g; 1,828 mol, rendimento = 68,2 %).

Purificação da dalbavancina

A descrição que segue é representativa do método de produção atual.

213

Os 152,8 L de solução obtidos a partir da etapa de hidrólise e contendo 3322 g de atividade de Dalbavancina foram divididos em separadamente sobre duas partes e cada uma foi purificada a mesma coluna cromatográfica contendo

400 L de poliamida.

Nestas duas corridas de purificação, as razões de atividade/resina foram 4,3 e 4,0 g/L, respectivamente .

Preparação da coluna de poliamida

A coluna revestida com vidro (diâmetro interno cm, a - 320 cm) , contendo 400 L de resina de poliamida, foi limpa de acordo com os procedimentos de regeneração de resina (ver abaixo) e condicionada com 2 BV (800 L) de água desmineralizada acidificada com 4 L de AcOH (pH = 3,2).

Purificação da primeira porção

A primeira porção de 76,4 L de solução de partida foi diluída com H₂O (56 L) para diminuir o teor de DMSO abaixo de 5% (v/v), e acidificada para pH 2,78 com HC1 a 1 N (3,4 L) , Esta solução foi então carregada para a coluna em uma vazão de 150 L/h. Após o carregamento, a resina foi lavada com as seguintes soluções: 4 BV (1600 L) de H₂O acidificada com AcOH (8 L), pH = 3,2; 5 BV (2000 L) de AcONa 0,1 M, pH = 8,2; 1 BV (400 L) de H₂O acidificada com AcOH (1

L), pH - 3,2. A dalbavancina foi eluída com 4 BV (2400 L) de H₂O/MeOH (8:2) acidificada com AcOH (6 L), pH - 3,4.

Durante a etapa de eluição, 22 frações de 50-60 L cada foram coletadas e analisadas por HPLC. As frações de 9 a 2 5 (concentração de Dalbavancina maior do que 0, 5 g/L e % de área de HPLC de (Β₀+Β_χ) ? 80%) foram reunidas conjunta-

214

mente, obtendo 969 L de solução com 1,56 kg de Dalbavancina (rendimento = 93,9 %). Esta solução foi então concentrada por nanofiltração, obtendo 125,7 L de solução com 1,38 kg de Dalbavancina. 850 L de permeado, contendo 145 g de Dalba5 vancina impura (8,7%), foram neutralizados e descartados.

Regeneração da resina

Antes da reutilização, a resina foi lavada com as

L) de MeOH água a 1:1 acidificada com ácido acético (2,5 mL/L); 2,5

BV

0,5 % de NaOH / isopropanol a

1:1;

BV (4000

L) de água desmineralizada. A resina foi então re-equilibrada com BV (800 L) de água acidificada com ácido acético (2,5 mL/L).

Purificação da segunda porção

A segunda porção da solução de partida, que veio da etapa de hidrólise (76,5 L) , foi diluída com H₂O (56 L) para diminuir o teor de DMSO abaixo de 5% (v/v) e acidificada para pH 2,87 com 3,0 L de HC1 a 1 N. A porção foi então purificada conforme anteriormente descrito na purificação da primeira porção. As frações reunidas (vol. = 20 972 L, Dalbavancina 1,54 kg, rendimento ~ 92,7%) foram concentradas por nanofiltração, obtendo 133 L de solução com

1,46 kg de atividade. 850 L de permeado, contendo 73 g de

Dalbavancina (4,3 %), foram descartados.

As soluções concentradas que vieram das duas etapas de purificação foram analisadas novamente e reunidas conjuntamente, dando 258 L de solução contendo 2840 q de Dalbavancina purificada. O rendimento de purificação foi 86 %. 0 rendimento total, começando a partir de MA, foi 58,3 %.

215

Regeneração final da poliamida

Após a segunda corrida de purificação, a poliamida foi regenerada com: 2,5 BV de MeOH-água a 1:1, acidificada com AcOH (2,5 L) em pH - 3,4; 2,5 BV de NaOH a 0,5 %5 isopropanol a 1:1; 10 BV de água desmineralizada.

Descoloração e precipitação da Dalbavancina

1,5 mol de HCI a IN por mol de Dalbavancina e 0,3

g de carvão vegetal CG1 (0,85 kg, da NORIT) por grama de

Dalbavancina foram adicionados aos 258 L de solução obtidos acima. A mistura foi agitada na temperatura ambiente por pelo menos 45 min.

3,1. A suspensão foi então filtrada sobre um cartucho SUPRA DISC mod. SDP-EK1 da SEITZSCHENK, e a torta foi lavada com 50 L de H₂O/MeOH a 8:2. O filtrado foi analisado e concentrado novamente por nanofil tração, usando uma membrana MPS 44 com um corte de 250 D.

Foram obtidos 21,3 L de solução concentrada contendo 119 g/L de Dalbavancina (pH 4,1; MeOH 1,9 %, GC). 909 mL de HCI a 1

N foram finalmente adicionados para ajustar o pH a 2,63, que corresponde à razão de salificação de 1,65 mol_Hci/niolDaibavancina

A solução (22,2 L) foi vertida, sob agitação, em

200 L de acetona. O sólido obtido após a decantação foi centrifugado e lavado com 14 L de acetona nova. O produto foi então secado sob pressão reduzida [6,67 kPa (50 mm de

Hg) ] a 35°C, mantendo a temperatura interna abaixo de 30°C por 17 horas. Durante o processo de secagem, 1 L de água com baixo teor de endotoxina (<250 EU/mL), dividido em duas porções de 0,5 L cada, foi pulverizado sobre o sólido após três e cinco horas, para remover a acetona residual que, de

216 outro modo, é difícil de eliminar. O produto foi então peneirado (malha 50), obtendo 2592 q de Dalbavancina (Ensaio de HPLC 82,4 %; água (KF) 14 %; Cl 3,0 %).

Exemplo 14

Métodos Alternativos para a Preparação de A-40926 e

Dalbavancina

Os métodos descritos abaixo são métodos alterna-

tivos que podem ser usados no processo de preparação de A40926 e Dalbavancina.

Preparação do A-40926 sobre XAD-7 HP

Desacetilação e microfiltração de micélio

150 L de caldo de fermentação contendo o A-4 092 6 (pH 7) foram agitados em um reator adequado, na temperatura ambiente (24°C) , e ajustados em pH 11,5 com uma solução de

NaOH a 2,5 N (2,5 L). Após 4 horas de agitação, o caldo foi ajustado em pH 10,6 com HC1 a 15%, e microfiltrado através

de uma membrana de 0,2 mícron. 439 L de permeado claro foram coletados e então concentrados por nanofiltração usando uma membrana MPS 44 com um corte de 250 D. A solução concentrada de A-40926 obtida (58,6 L; 3,89 g/L) foi ajustada em pH 6,4 e armazenada a 4°C até ser usada.

Preparação da coluna e purificação

A resina XAD-7 HP (8 L) foi suspensa em uma solução a 1:1 de água/metanol, filtrada, e carregada para 25 uma coluna de vidro apropriada (diâmetro interno de 12 cm) com uma bomba peristáltica.

A resina foi então lavada com água e equilibrada com 6 BV de uma solução aquosa de carbonato de sódio

217 tamponada em pH 6, preparada dissolvendo 5 g de carbonato de sódio por litro de água e ajustando o pH com ácido acético.

Uma porção de caldo concentrado contendo 194 g de

A-40926 foi carregada para a coluna de XAD-7 HP. A resina foi então lavada com as duas soluções tamponadas que seguem, em uma vazão de BV/hora, a fim de eliminar parte das substâncias hidrofilicas e das coloridas presentes: 3 BV (24

L) de solução aq. a 0,5 % de Ácido Acético, ajustada em pH 5 com hidróxido de sódio a 30 %; 5 BV (40 L) de uma mistura a

8:2 de água/acetona com 5 mL de ácido acético / L de água.

A-40926 foi finalmente eluido com 8 BV (64 L) de uma mistura a 1:1 de água/acetona, acidificada com 5 mL de ácido acético/L de água. 16 frações de 4 L cada foram coletadas. As frações ricas (de 5 a 15), nas quais a 15 concentração de A-40926 era maior do que 0,5 g/L, foram unidas conjuntamente, obtendo uma solução contendo 163,4 g

de A-40926 (43 L, 3,8 g/L). O rendimento da coluna foi 81,3

%. As outras frações (200 L) contendo 0,23 g/L (45,3 g; 22,2 %) de A-40926 menos puro foram descartadas.

Após a eluição, a resina foi regenerada com 6 BV (55 L) de mistura de NaOH 0,5 % / isopropanol (1:1), finalmente lavada até neutra com 10 BV de água.

Tratamento com carvão ativo

As frações coletadas foram ajustadas em pH 2,5 com

HC1 37% (70 mL) e então descoloridas com 50 g de carvão ativo tipo PA 200 (0,3 g/g de A-40926). A suspensão obtida foi agitada por 2 horas na temperatura ambiente e então filtrada através de um filtro KS 50 (d = 25 cm, tempo = 2,5

492218 horas), obtendo 45,6 L de uma solução de A-40926 ligeiramente amarela (3,5 g/L; rendimento = 96,4 %).

Concentração

A solução descolorida foi ajustada em pH 7 com

NaOH 30% (230 mL) e concentrada por nanofiltração e ultrafiltração. O uso destas técnicas foi importante para a eliminação das substâncias hidrofilicas que foram detectadas sobre os cromatogramas de HPLC em T_r = 2-4 minutos. Quando o retentado foi concentrado para 1/10 do volume de partida (4

L), o mesmo volume de água foi adicionado e a solução obtida foi concentrada novamente. Esta etapa de concentração/ diluição foi repetida três vezes para reduzir a acetona residual para 0,25 %. A solução final (2,2 L, 146,3 g de A40926, 66,5 g/L, rendimento = 91,5%) foi analisada por HPLC.

0 rendimento de purificação foi 75,4 %.

Cristalização do A-40926

Uma porção de 300 mL da solução de A-40926 (19,9 g f' ( de A-40926) foi adicionalmente concentrada para 100 mL por utilização de um ultrafiltro em escala de laboratório e então aquecida a 60-65°C. O pH desta solução foi ajustado em 7 (30% de NaOH), e foi adicionado 1,2 mL de mistura a 5:1 de acetona/isopropanol por mL de solução concentrada, gota a gota, nesta temperatura. A mistura resultante foi deixada esfriar a 20°C. Após 1,5 hora, o sólido obtido foi filtrado, lavado sobre o filtro com acetona, e secado a 40°C por 15 horas. 20,6 g do produto (ensaio de HPLC 82,0 %; A-40926 16,9 g) foram obtidos. O rendimento da precipitação foi 84,9

4W

219

%. O rendimento global, começando a partir do caldo filtrado, foi cerca de 64 %.

Preparação do A-40926 sobre CG-71

Preparação da coluna

A resina CG-71 (350 mL) foi vertida em uma coluna de vidro (diâmetro interno = 4 cm) e lavada com água. A resina foi equilibrada com 3 BV de uma solução de carbonato de sódio, preparada por dissolução de 5 g de carbonato de sódio em água, em pH 6, com ácido acético. 250 mL de caldo de fermentação (pH 7), contendo 14,7 g de A-40926, foi carregado para a coluna (42 g/L de resina) . A resina foi lavada com as três soluções que seguem: 1050 mL (3 BV) de solução aquosa de carbonato de sódio (5 g/L) ajustada em pH 6 com ácido acético; 1750 mL (5 BV) de solução aquosa de carbonato de sódio (5 g/L) ajustada em pH 8 com ácido acético; 3150 mL (9 BV) de solução aquosa de carbonato de sódio (5 g/L) ajustada em pH 9 com ácido acético.

A atividade foi então eluída com 10 BV de água desmineralizada. 20 frações de 500 mL cada foram coletadas. As frações 12 a 15 foram reunidas conjuntamente, obtendo 2,2 L de solução purificada contendo 11,7 g de A-40926 (rendimento = 79,6%). Esta solução foi então concentrada por ultrafiltração e a solução de concentrado foi adicionalmente diluída com água desmineralizada e ultrafiltrada novamente. A solução obtida foi adicionalmente concentrada sob pressão reduzida para 50 mL.

220

Cristalização do A-40926

A solução concentrada foi aquecida a 60°C e tratada, sob agitação, com uma mistura a 5:1 de acetona/IPA (60 mL) . A mistura foi então lentamente esfriada na 5 temperatura ambiente. O sólido obtido foi filtrado, lavado com acetona sobre o filtro, e secado sob vácuo a 35°C por 80 horas. 8,9 g de A-40926 purificado (ensaio de HPLC 84,2%) foram obtidos. O rendimento global foi 51 %.

Etapa alternativa de amidação na síntese da dalbavancina usando a N-Metil-2-pirrolidina (NMP) como um solvente

A mistura de MA foi adicionada, em porções, sob agitação, a uma mistura a 1:1 de NMP/MeOH (64 mL) . A agitação a 20-25°C foi continuada até a solução completa, então a DMEPA (2,42 mL; 1,96 mol/eq^) e o HOBT (1,06 g;

0,71 mol/eqMA) foram adicionados. O pH da mistura de reação (checado em ajustado para uma amostra

3,0 com preparada a partir de mL de NMP) . Então, mol/eqMA) em NMP/MeOH

9, 37

34, 0 uma diluída a 1:10 com água) foi mL de HCI 15% em NMP (previamente mL de HCI 37% dissolvido em solução de DCC (3,17 g;

adicionada,

57, 5

1, 57 sob agitação. A reação foi monitorada por HPLC.

A reação estava completa após cerca de 6 horas (MA-A-1 88,9%, MA 7,3%, ISO

3,7%). Este experimento sugere que a NMP pode ser uma alternativa conveniente para a DMSO para a reação de 25 amidação. 0 processo inteiro não foi influenciado por esta mudança de solvente e a Dalbavancina final obtida era quimicamente equivalente às outras bateladas.

221

Método alternativo de preparação da Dalbavancina:

Procedimento em um cadinho g do complexo de A-40926 (titulo de HPLC

80, 66%, 4,6 ramols) foram suspensos em 24 mL de MeOH, sob agitação, na temperatura ambiente, em um reator de vidro de

100 mL. A mistura foi esfriada a 0°C, e uma solução de 4 g de HC1 (g) em 16,4 mL de MeOH foi adicionada para completar

O	a solubilização do produto.
elevar para 20°C, enquanto
10	horas adicionais.
	Após este tempo,
	foram adicionados à mistura
	A 1,1-dimetiamina
«	ajustando o pH da mistura

A temperatura foi então deixada a agitação era continuada por 24

0 mL de DMSO e 0,4 g de HOBT de reação.

propilamina foi então adicionada, de reação resultante entre 3-3,1 (medido após diluir uma amostra a 9:1 com água). 1,8 g de

DCC sólida foi então adicionado e a agitação foi continuada por 15 horas adicionais. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida em um reator de vidro de 1 L e

diluída com	80 mL de	água.	0 pH foi então	levado para	12
pela adição	de 240	mL de	NaOH a 15%.	A agitação	foi
continuada	por 60 minutos	adicionais, e	a mistura	foi
acidifiçada	em pH 2,8	com 260 mL de HC1 aq.	a 15%. Cerca	de
8 00 mL de	solução	clara	final, contendo 6,4 g	de

Dalbavancina, foram obtidos (rendimento = 76%) .

As análises por HPLC mostraram que o perfil do produto obtido é comparável com aquele obtido com os outros processos de fabricação.

222

Compostos Antibióticos de N¹⁵, N¹⁵-Dialquila

A presente invenção proporciona compostos antibióticos de N¹⁵, N¹⁵-dialquila, úteis, por exemplo, para prevenir

e/ou tratar	as	infecções	microbianas em mamíferos.	Por
5 conveniência,	na	descrição	aqui contida, os compostos	de
dalbavancina	são	numerados	de acordo com a Patente l	J.S.

5.750.509 e como representados na Figura 26.

Em certas modalidades, a presente invenção proporciona compostos antibióticos de N¹⁵, N^J5-dialquila de acordo 10 com a fórmula (III), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato dos mesmos:

OG

(Π1).

Em certas modalidades, a presente invenção proporciona compostos antibióticos de N¹⁵, W^I5-dialquila de acordo com a fórmula (IV), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato dos mesmos:

223

As Fórmulas (III) e (IV) proporcionam o núcleo de peptídeo dos compostos antibióticos de N¹⁵, N^is-d±alquila da invenção. O peptídeo compreende sete aminoácidos com a extremidade de amino no lado direito, como representado nas fórmulas (III) e (IV) , e a extremidade de carbóxi na esquerda. De acordo com este aspecto da invenção, os compostos antibióticos de N¹⁵, N^-dialquila compreendem dois substituintes de alquila sobre o nitrogênio terminal de amino, ou N¹⁵. Em outras palavras, nas fórmulas (III) e (IV), R¹ e R¹' são alquila.

Nas modalidades preferidas, R¹ e R^v são alquila de C1-4. Em certas modalidades, R¹ e R¹' são, cada um, independentemente selecionados a partir de propila, etila e metila. Nas modalidades adicionais, R¹ e R¹' são, cada um, independentemente selecionados a partir de etila e metila. Nas modalidades mais preferidas, pelo menos um de R¹ e R¹' é metila. Nas modalidades as mais preferidas, R¹ e R^v são metila.

O restante da molécula pode ser modificado no mesmo modo como os compostos de dalbavancina conhecidos para

224 aqueles de habilidade na técnica. Desse modo, X é um grupo aminoalquilamino, como definido nas seções acima. Os grupos aminoa1quilamino ilustrativos são descritos na Patente U.S. N^Cl 5.750.509. Em certas modalidades, X é N,N-dimetilaminopropilamino.

Assim, nas modalidades particulares, a invenção proporciona compostos de acordo com a fórmula (V), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato dos mesmos:

(V).

Os compostos antibióticos de N¹⁵, N¹⁵-dialquila da invenção podem ser glicosilados em uma ou mais posições, como é conhecido para aqueles de habilidade na técnica. Nas modalidades preferidas, os compostos antibióticos de N¹⁵,N¹⁵dialquila são glicosilados nas posições G e M da fórmula (III) ou (IV). Nas modalidades particulares, M é hidrogênio ou uma porção de açúcar. Por exemplo, M pode ser hidrogênio, α-D-manopiranosila ou 6-O-acetil-a-D-manopiranosila. Nas

225 modalidades particulares, G é hidrogênio ou uma porção de açúcar. Por exemplo, G pode ser hidrogênio ou glicuronamina.

Em certas modalidades, uma ou ambas as porções de

açúcar podem ser aciladas ou acetiladas, ou ambas. Por exemplo, quando G for a glicuronamina, a porção de glicuronamina pode ser acilada com um ácido graxo. O ácido graxo pode ser qualquer ácido graxo conhecido para aqueles de habilidade na técnica. Nas modalidades particulares, o ácido graxo é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido 8-metil nonanóico, ácido n-decanóico, ácido 9-metildecanóico, ácido n-undecanóico, ácido 10-metil-undecanóido, ácido n-dodecanóico, ácido 11-metil-dodecanóico, ácido n-

tridecanóico, ácido 12-metil-tridecanóico e ácido ntetradecanóico. Nas modalidades preferidas, o ácido graxo é 15 um ácido graxo de Ci₂. Nas modalidades particulares, o ácido graxo é o ácido 10-metil-undecanóico.

Em certas modalidades, a presente invenção proporciona um composto de acordo com a fórmula (VI) , ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo:

226

(Vi).

Na fórmula (VI), R² é acila de Cio-n. Nas modalidades particulares, R² é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido 8-metil nonanóico, ácido n-decanóico,

ácido 9-metil-decanóico, ácido n-undecanóico, ácido 105 metil-undecanóico, ácido n-dodecanóico, ácido 11-metil-dodecanóico, ácido n-tridecanóico, ácido 12-metil-tridecanóico e ácido n-tetradecanóico. Nas modalidades preferidas, R² é um ácido graxo de Ci₂. Nas modalidades particulares, R é o ácido 10-metil-undecanóico.

Conforme descrito nas seções sintéticas abaixo, os compostos antibióticos de N¹⁵ _r iX-dimetila podem ser sintetizados a partir dos compostos de dalbavancina. Desse modo, certos compostos antibióticos de N¹⁵, W^J5-dimetila da invenção possuem as porções de açúcares e os ácidos graxos da dalbavancina A_o, Ai, B_o, Bj, Co e Ci.

4//

227

Nas modalidades particulares, a presente invenção proporciona os compostos antibióticos de N^1S, N^I5-dimetila. Um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dimetila compreende a fórmula (I) ou (II) com dois grupos metila em N²⁵. 0 composto antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dimetila pode ser glicosilado com uma ou mais porções de açúcares, como descrito acima. Em certas

modalidades, um composto antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dimetila é acilado sobre uma ou mais destas porções de açúcares. Nas modalidades preferidas, o grupo acila é o ácido 10-metilundecanóico.

Nas modalidades preferidas, a presente invenção proporciona o composto antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dimetila de acordo com a estrutura (VII) que segue, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo:

Em certas modalidades, o composto antibiótico de

N¹⁵,N²⁵-dialquila da invenção está purificado. Conforme usado

228 aqui, o termo purificado indica que o composto antibiótico de N^1S, N^I5-dialquila está enriquecido em relação aos outros compostos de dalbavancina em uma composição. Por exemplo, o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila pode estar enri5 quecido em relação a uma mistura na qual o composto antibiótico de N¹⁵, W^J5-dialquila é produzido, por exemplo,

uma mistura derivada de um caldo de fermentação como descrito nos exemplos abaixo. Em certas modalidades, o composto antibiótico de N¹⁵ _f N^J5-dialquila está enriquecido duas, três, cinco, dez, cem, mil ou dez mil vezes.

Nas modalidades adicionais, o composto antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dialquila está isolado. Como usado aqui, o termo isolado indica que o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila está enriquecido em relação aos dalbavancina em uma composição.

compostos que não são de

Por exemplo, o composto antibiótico de N¹⁵, W^J5-dialquila pode estar enriquecido em relação a uma mistura na qual o composto antibiótico de N¹⁵, W^J5-dialqula é produzido, por exemplo, uma mistura derivada de um caldo de fermentação como descrito nos exemplos abaixo. Em certas modalidades, o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila está enriquecido duas, três, cinco, dez, cem, mil ou dez mil vezes.

Nas modalidades ainda adicionais, o composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dialquila está purificado e isolado.

Conforme usado aqui, o termo purificado e isolado indica que o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila está enriquecido em relação aos compostos que não são de dalbavancina e em relação aos outros compostos de dalbavancina em uma

229 composição. Por exemplo, o composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵dialquila pode estar enriquecido em relação a uma mistura na qual o composto antibiótico de N¹⁵, N^-dialquila é produzido, por exemplo, uma mistura derivada de um caldo de fermentação 5 como descrito nos exemplos abaixo. Em certas modalidades, o composto antibiótico de N¹⁵, W⁷⁵-dialquila está enriquecido

duas, três, cinco, dez, cem, mil ou dez mil vezes.

Compostos Antibióticos de N¹⁵, iM-Pialguila

A presente invenção também proporciona compostos antibióticos de N¹⁵, N^í5-dialquila tendo um grupo ácido carboxilico na carbonila 63. Estes compostos são úteis, por exemplo, para a preparação dos compostos antibióticos de N¹⁵,N¹⁵dialquila da invenção. Em certas modalidades, estes compostos antibióticos de N¹⁵, W^I5-dialquila são também úteis para 15 prevenir e/ou tratar as infecções microbianas em mamíferos.

Em certas modalidades, a presente invenção proporciona compostos antibióticos de N¹⁵, N¹⁵-dialquila de acordo com a fórmula (VIII), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato dos mesmos:

(VIII).

230

Em certas modalidades, a presente invenção proporciona compostos antibióticos de N^:5, N^J5-dialquila de acordo com a fórmula (IX), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato dos mesmos:

As fórmulas (VIII) e (IX) proporcionam o núcleo de peptideo dos compostos antibióticos de N^{5 * * * * 10 * * * * 15 * * * * 20}, N^I5-dialquila deste aspecto da invenção. 0 peptideo compreende sete aminoácidos, com a extremidade de amino no lado direito,

como representado nas fórmulas (III) e (IV), e a extremidade de carbóxi na esquerda. De acordo com este aspecto da invenção, os compostos antibióticos de N¹⁵, N^I5-dialquila compreendem dois substituintes de alquila sobre o nitrogênio terminal de amino, ou N¹⁵. Em outras palavras, nas fórmulas (I) e (II), R¹ e R^v são alquila. Ademais, nas Fórmulas (VIII) e (IX), X é OH, como nos compostos antibióticos A

40926 conhecidos para aqueles de habilidade na técnica.

Nas modalidades preferidas, R¹ e R¹' são alquila de

C1-4. Em certas modalidades, R¹ e R¹' são, cada um, independentemente selecionados a partir de propila, etila e metila.

Nas modalidades adicionais, R¹ e R¹' são, cada um, indepen231 dentemente selecionados a partir de etila e metila. Nas modalidades mais preferidas, pelo menos um de R¹ e R¹' é metila. Nas modalidades as mais preferidas, R¹ e R¹·^, são metila.

Os compostos antibióticos de N¹⁵, N²⁵-dialquila da invenção podem ser glicosilados em uma ou mais posições,

como é conhecido para aqueles de habilidade na técnica. Nas modalidades preferidas, os compostos antibióticos de N^JS,Nⁱ⁵dialquila são glicosilados nas posições G e M das fórmulas (VIII) e (IX) . Nas modalidades particulares, M é hidrogênio ou uma porção de açúcar. Por exemplo, M pode ser hidrogênio, α-D-manopiranosila ou 6-O-acetil-a-D-manopiranosila. Nas modalidades particulares, G é hidrogênio ou uma porção de açúcar. Por exemplo, G pode ser hidrogênio ou glicuronamina.

Em certas modalidades, uma ou ambas as porções de açúcar podem ser aciladas ou acetiladas, ou ambas. Por exemplo, quando G for a glicuronamina, a porção de glicuro-

namina pode ser acilada com um ácido graxo. 0 ácido graxo pode ser qualquer ácido graxo conhecido para aqueles de habilidade na técnica. Nas modalidades particulares, o ácido graxo é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido

8-metil nonanóico, ácido n-decanóico, ácido 9-metildecanóico, ácido n-undecanóico, ácido 10-metil-undecanóido, ácido n-dodecanóico, ácido 11-metil-dodecanóico, ácido ntridecanóico, ácido 12-metil-tridecanóico e ácido n-tetrade25 canóico. Nas modalidades preferidas, o ácido graxo é um ácido graxo de Ci₂. Nas modalidades particulares, o ácido graxo é o ácido 10-metil-undecanóico.

232

Em certas modalidades, a presente invenção proporciona um composto de acordo com a fórmula (X) , ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo:

Na fórmula (X), R² é acila de C10-14. Nas modali5 dades particulares, R² é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido 8-metil nonanóico, ácido n-decanóico, ácido 9-metil-decanóico, ácido n-undecanóico, ácido 10metil-undecanóico, ácido n-dodecanóico, ácido 11-metildodecanóico, ácido n-tridecanóico, ácido 12-metil-trideca10 nóico e ácido n-tetradecanóico. Nas modalidades preferidas, R² é um ácido graxo de C12. Nas modalidades particulares, R² é o ácido 10-metil-undecanóico.

Conforme descrito nas seções sintéticas abaixo, os compostos antibióticos de N¹⁵, N²⁵-dimetila podem ser 15 sintetizados a partir dos compostos antibióticos A 40926.

233

Ο t

V c

Desse modo, certos compostos antibióticos de N¹⁵, N²⁵-dimetila da invenção possuem as porções de açúcares e os ácidos graxos do fator antibiótico de A 40926 A_o, Ai, B_o, Bi, C_o e Ci.

Nas modalidades particulares, a presente invenção proporciona os compostos antibióticos de N¹⁵, N²⁵-dimetila. Um composto antibiótico de N¹⁵, 2V^I5-dimetila compreende a fórmula (VIII) ou (IX) com dois grupos metila em N¹⁵. Um composto antibiótico de N^J5~dimetila pode ser glicosilado com uma ou mais porções de açúcares, como descrito acima. Em certas modalidades, um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dimetila é acilado sobre uma ou mais destas porções de açúcares. Nas modalidades preferidas, o grupo acila é o ácido 10-metilundecanóico.

Nas modalidades preferidas, a presente invenção proporciona o composto antibiótico de N¹⁵, W^J5-dimetila de acordo com a estrutura (XI) que segue, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo:

OH OH (XI).

234

Em certas modalidades, o composto antibiótico de N¹⁵, W^J5-dialquila da invenção está purificado. Conforme usado aqui, o termo purificado indica que o composto antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dialquila está enriquecido em relação aos outros

compostos antibióticos em uma composição. Por exemplo, o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila pode estar enriquecido em relação a uma mistura na qual o composto antibiótico de N^1S, N^J5-dialquila é produzido, por exemplo, uma mistura derivada de um caldo de fermentação como descrito nos exemplos abaixo. Em certas modalidades, o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila está enriquecido duas, três, cinco, dez, cem, mil ou dez mil vezes.

Nas modalidades adicionais, o composto antibiótico de Nⁱ⁵, N^J5-dialquila está isolado. Como usado aqui, o termo 15 isolado indica que o composto antibiótico de N^1S,N¹⁵dialquila está enriquecido em relação aos compostos que não são antibióticos em uma composição. Por exemplo, o composto antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dialquila pode estar enriquecido em relação a uma mistura na qual o composto antibiótico de

N¹⁵, N^I5-dialqula é produzido, por exemplo, uma mistura derivada de um caldo de fermentação como descrito nos exemplos abaixo. Em certas modalidades, o composto antibiótico de N¹⁵, N^-dialquila está enriquecido duas, três, cinco, dez, cem, mil ou dez mil vezes.

Nas modalidades ainda adicionais, o composto antiConforme usado aqui, o termo purificado e isolado indica que o composto antibiótico de N¹⁵, Nⁱ⁵-dialquila está enriquecido biótico de N¹⁵, N²⁵-dialquila está purificado e isolado.

235 •fc r

4/7 em relação aos compostos que não são antibióticos e em relação aos outros compostos de dalbavancina em uma composição. Por exemplo, o composto antibiótico de N^{15 * * * * 20 * * * * 25}, W^J5-dialquila pode estar enriquecido em relação a uma mistura na 5 qual o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila é produzido, por exemplo, uma mistura derivada de um caldo de fermentação

como descrito nos exemplos abaixo. Em certas modalidades, o composto antibiótico de N^1S, N^J5-dialquila está enriquecido duas, três, cinco, dez, cem, mil ou dez mil vezes.

Métodos de Preparar os Compostos da Invenção

Os compostos da invenção podem ser preparados de acordo com qualquer método aparente para aqueles de habilidade na técnica para preparar tais compostos antibióticos de N¹⁵, N^I5-dialquila.

Por exemplo, em certas modalidades, um composto antibiótico de N¹⁵, W^I5-dialquila, ou composição, da invenção pode ser preparado por alquilação do composto de N¹⁵monometila, pu composição, correspondente por qualquer prática aparente para alguém de habilidade na técnica. Por exemplo, um composto, ou composição, de N^J5-monometila pode ser metilado por contato do composto ou da composição com uma mistura de HCHO, NaBH₃CN, DMF, H₂O e NaHCO3, na temperatura ambiente, conforme ilustrado no Esquema 1. Em uma modalidade particular, um composto, ou composição, de

W^J5-monometil dalbavancina é dissolvido em água e DMF, às quais são adicionados o formaldeido e o bicarbonato de sódio, seguidos por NaBH₃CN, para produzir o composto, ou a composição, antibiótico de N¹⁵, N^J5-dimetila.

236

zch3 R—N H	HCHO, NaBHjCR üMF, HjO, NâHCO, TA	R-	zch3 ch3
	Esquema 1
composto,	ou a composição,	de NI5-monometila

correspondente pode ser preparado de acordo com técnicas publicadas, tais como aquelas descritas extensivamente na

Patente U.S. N²

5.750.509 e na Publicação de Pedido de

Patente U.S.

_N°

US 2004/0142883, cujos conteúdos sao incorporados por referência em suas totalidades. Na medida em que os compostos ou as composições têm grupos protetores sobre o seu nitrogênio N¹⁵, eles podem ser removidos por qualquer prática conhecida para a pessoa de habilidade na

técnica.

Os	materiais	de
dalbavancina	Ao, Ai,	Boz	Bi,
de A 40926	Ao, Ai,	Bo,	Bi,

partida

Cq e Ci e exemplos a

abaixo,

Cq e Ci.

adequados incluem a os fatores antibióticos

Conforme mostrado nos preparada a partir da método. A preparação

N^1S, N^J5-dimetil dalbavancina dalbavancina B_o

Bo de acordo com foi este destes compostos de dalbavancina é descrita extensivamente na Publicação de Pedido de Patente

U.S. N° 2004/0142883. Estes compostos de dalbavancina têm as seguintes estruturas:

237

OH

OH OH em que R é como se segue:

Composto de Dalbavancina	R
Ao	-CH(CH3)2
Ai	-ch2ch2ch3
Bo	-CH2CH(CH3)2
Bi	-ch2ch2ch2ch3
Co	-ch2ch2ch (CH3)2
Ci	-CH2CH2CH2CH2CH3

Nas modalidades adicionais, um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila da invenção pode ser preparado a partir do caldo de fermentação de A 40926 antibiótico. O caldo de fermentação compreende o A 40926 antibiótico e os compostos relacionados que podem ser preparados de acordo com as técnicas descritas, por exemplo, na Patente U.S. N² 5.750.509 e na Publicação de Pedido de Patente U.S. N² US

2004/0142883. 0 caldo pode ser purificado para produzir os

238

compostos antibióticos de A 40926 desejados, os quais podem ser esterificados, amidados e hidrolisados de acordo com a Patente U.S. N² 5.750.509 e a Publicação de Pedido de Patente U.S. N- US 2004/0142883, para produzir uma mistura de compostos de dalbavancina. Os compostos antibióticos de N¹⁵, N^I5-dialquila podem ser purificados e/ou isolados da mistura de acordo com qualquer prática aparente para aqueles de habilidade na técnica. Nos exemplos abaixo, as técnicas de HPLC são usadas para purificar os compostos antibióticos de N¹⁵, iX-dialquila da invenção.

Composições

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona composições compreendendo um ou mais compostos da invenção. Geralmente, as composições da invenção compreendem um composto da invenção e um ou mais outros compostos. Os outros compostos podem ser os compostos da invenção, os compostos conhecidos para aqueles de habilidade na técnica, os compostos ainda a serem descobertos ou publicados ou outros compostos.

Em certas modalidades, as composições são composições farmacêuticas, descritas em mais detalhe nas seções abaixo.

Nas modalidades particulares, as composições compreendem um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila da invenção e um composto de dalbavancina ou de A 40926 antibiótico. 0 composto de dalbavancina ou de A 40926 antibiótico pode ser qualquer composto de dalbavancina ou de A 40926 antibiótico conhecido para aqueles de habilidade na

239 c

técnica. Os compostos de dalbavancina ilustrativos incluem aqueles descritos na Patente U.S. N² 5.750.509 e na Publicação de Pedido de Patente U.S. N² US 2004/0142883, cujos conteúdos são, pelo presente, incorporados por referência em suas totalidades. Os compostos de A 40926 antibióticos ilustrativos são descritos nas Patentes U.S. N— 4.935.238, 4.868.171 e 4.782.042, cujos conteúdos são, pelo presente, incorporados por referência em suas totalidades.

Os compostos de dalbavancina ilustrativos incluem a dalbavancina An, Ai, B_o, Bi, C_o e Ci. A preparação destes compostos de dalbavancina é descrita extensivamente na Publicação de Pedido de Patente U.S. N² US 2004/0142883. Estes compostos de dalbavancina são adicionalmente descritos nas seções acima. Obviamente, as composições da invenção podem compreender compostos de dalbavancina adicionais, não listados entre os compostos de dalbavancina ilustrativos acima mencionados.

Em certas modalidades, as composições compreendem multimeros dos compostos da invenção. Os multimeros podem ser dimeros, trimeros ou maiores. Os multimeros podem ser homomultimeros, heteromultímeros ou uma mistura de homomultimeros e heteromultímeros. Por exemplo, o multimero pode compreender uma combinação de quaisquer dos fatores presentes na composição de dalbavancina, incluindo quaisquer dos fatores de dalbavancina Ao, Ai, Bo, Bi, B₂, Co, Ci, Do, Di, MAG, ou isoB₀. Por exemplo, o multimero pode compreender um composto de N¹⁵-alquil dalbavancina e um composto de N¹⁵, N¹⁵4211

240 dialquil dalbavancina. Em certas modalidades, a presente invenção também proporciona homodimeros dos compostos da invenção. Nas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona heterodimeros dos compostos da invenção com 5 compostos de dalbavancina. Os compostos de dalbavancina podem ser as dalbavancinas da invenção ou as dalbavancinas

conhecidas para aqueles de habilidade na técnica.

Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem uma quantidade significativa de um composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dialquila da invenção em relação aos compostos de dalbavancina ou de A 40926 antibióticos.

Em certas modalidades, em relação aos compostos de dalbavancina ou de A 40926 antibióticos, o composto antibiótico de

N¹⁵, N^J5-dialquila da invenção é pelo menos 0,05, 0,1, 0,15,

0,2, 0,25, 0, 5,

0, 75, 1, 0, 1,25, 1,5, 1, 6, 1,7,

1,75, 1,8,

1,9, 2, 0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90, 95, 96, 97, 98 ou 99% da composição. Nas modalidades preferidas, o composto é de acordo com a fórmula (V).

Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem uma quantidade significativa de um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila da invenção em relação aos compostos de dalbavancina. Em certas modalidades, em relação aos compostos de dalbavancina, o composto antibiótico de

N¹⁵, N^J5-dialquila da invenção é pelo menos 0,05, 0,1, 0,15,

0,2, 0,25, 0, 5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1, 6, 1,7, 1,75, 1, 8,

1,9, 2,0, 2, 5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90, 95, 96, 97, 98 ou 99% da composição. Nas modalidades preferidas, o composto é de acordo com a fórmula (V).

241

Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem uma quantidade significativa de um composto antibiótico de N¹⁵, W^J5-dialquila da invenção em relação aos compostos de A 40926 antibióticos. Em certas modalidades, em 5 relação aos compostos de A 40926 antibióticos, o composto antibiótico de N¹⁵, W^J5-dialquila da invenção é pelo menos 0, 05, 0, 1, 0, 15, 0,2, 0,25, 0, 5, 0, 75, 1, 0, 1,25, 1,5, 1, 6, 1,7, 1,75, 1, 8, 1, 9, 2, 0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% da composição. Nas 10 modalidades preferidas, o composto é de acordo com a fórmula (V) .

Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem uma quantidade significativa de um composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dialquila da invenção em relação aos outros compostos. Em certas modalidades, o composto

antibiótico de N¹⁵, N²⁵-dialquila da invenção é pelo menos

0,05, 0,1,	0,15,	0,2, 0, 25, 0, 5, 0, 75,	1,0,	1,25, 1,5, 1,6,
1,7, 1,75,	1, 8,	1,9, 2,0, 2,5, 5, 10,	15,	20, 25, 30, 40,
50, 60, 70,	80,	90, 95, 96, 97, 98 ou	99%	da composição em

relação aos outros compostos. Nas modalidades preferidas, o composto é de acordo com a fórmula (V).

Nas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona composições compreendendo a dalbavancina A_o, Ai, B_o, Bi, Co e Ci juntamente com um composto antibiótico de 25 N^J5,N^J5-dialquila da invenção, onde a quantidade do composto da invenção está enriquecida em relação a uma ou mais ou toda a dalbavancina Ar>, Aj, B_o, Bi, Co e Ci. A composição pode estar enriquecida, por exemplo, de modo que o composto

432

242

Γ

antibiótico de N^I5,W^J5-dialquila seja pelo menos 0,05, 0,1,

0, 15, 0,2, 0,25, 0,5, 0, 75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,6, 1,7, 1,75,

1, 8, 1,9, 2,0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70,

80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% da composição em relação a uma ou mais ou toda a dalbavancina A_o, Ai, B_o, Bi, C_o e Ci. Nas modalidades preferidas, o composto está de acordo com a fórmula (V).

Em certas modalidades, a presente invenção proporciona composições compreendendo a dalbavancina B_o e um composto antibiótico de N^I5,N^J5-dialquila da invenção. Nas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona composições compreendendo a dalbavancina Bi e um composto antibiótico de N^J5zN^J5-dialquila da invenção. Nas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona composições compreendendo a dalbavancina Bo, a dalbavancina Bi e um composto antibiótico de N^J5zI\T²⁵-dialquila da invenção. Nas modalidades preferidas, o composto antibiótico de N¹⁵ ,N¹⁵~ dialquila da invenção está de acordo com a fórmula (V) . Nas modalidades particularmente preferidas, a presente invenção proporciona composições compreendendo o composto de fórmula (V) , a dalbavancina Bo e a dalbavancina Bi. Estas composições podem ser purificadas, isoladas ou purificadas e isoladas. Em certas modalidades, as composições são 90, 91, 92,

93, 94, 95, 96, 97, 98, 98,5, 99 ou 99,5 % puras. Por puras pretende-se que as composições compreendam aquela quantidade dos compostos da composição. Por exemplo, a composição compreendendo o composto de fórmula (V), a dalbavancina B_o e a dalbavancina compreendería pelo menos

243

90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98,5, 99 ou 99,5 % dos três compostos em relação aos outros compostos na composição. A pureza pode ser avaliada por qualquer meio conhecido para aqueles de habilidade na técnica, tal como a 5 HPLC, por exemplo, pela % de área sob a curva.

Nas composições da invenção, a quantidade de cada componente pode ser calculada por peso, por quantidade molar ( ou por qualquer outra prática conhecida para aqueles de habilidade na técnica.

Métodos de Uso

São proporcionados métodos para a administração do composto antibiótico de N^N^-dialquila ou da composição da invenção a um indivíduo que está necessitado de tratamento para uma infecção bacteriana. Em uma modalidade, o composto antibiótico de N^J5 _zN'^!5-dialquila está de acordo com a fórmula (V). 0 tratamento pode incluir a profilaxia, a terapia, ou a

cura. Os métodos incluem a administração de um composto antibiótico de N^J5AN^J5-dialquilaz ou composição, em uma quantidade terapêutica ou profilaticamente efetiva.

Conforme usado aqui, a quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de um composto ou de uma composição que, quando administrada a um paciente para tratar uma doença, proporcionará um resultado desejado (p.ex., redução ou eliminação de uma infecção bacteriana).

Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode variar, dependendo, inter alia, do composto, da doença e de sua gravidade, e da idade, peso, etc., do paciente a ser tratado, e pode ser administrada em uma ou mais doses. Uma

244 quantidade profilaticamente efetiva refere-se a uma quantidade de um composto antibiótico de N^N^-dialquila ou composição, suficiente para prevenir ou reduzir a gravidade de uma infecção bacteriana futura, quando administrada a um indivíduo que seja suscetível a, e/ou que possa contrair, uma infecção bacteriana, p.ex., em virtude de um procedimento médico ou uma estada no hospital, ou exposição

C' a um indivíduo· com uma infecção bacteriana. Um composto antibiótico de

N^N^-dialquila, ou composição, pode ser administrado em um veículo farmaceuticamente aceitável.

Um composto antibiótico de N^J5,N²⁵-dialquila, ou composição, pode ser administrado como uma dose unitária em uma formulação antibiótica de

N²⁵,N²⁵-dialquila, a qual inclui uma quantidade do composto, suficiente para propor15 cionar um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo do composto no plasma por diversos dias, pelo menos cerca de 5

dias, uma semana, ou 10 dias, quando administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, o composto está de acordo com a fórmula (V) . Em algumas modalidades, o composto é um componente de uma formulação, a qual inclui uma quantidade do composto, suficiente para proporcionar um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo do composto por diversos dias, freqüentemente pelo menos cerca de 5 dias, uma semana, ou 10 dias. O intervalo de dosagem, ou o tempo entre as 25 doses, pode ser, por exemplo, quaisquer de cerca de 2, 3, 4, ²¹

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 25, ou mais dias.

245

Como usados aqui, os termos indivíduo ou paciente são usados de modo intercambiável e referem-se a um vertebrado, tipicamente um mamífero, frequentemente um ser humano.

Ademais, um composto, ou composição, da invenção pode ser formulado com um estabilizador que iniba a

degradação do composto, da composição, e/ou de um ou mais outros componentes antibióticos de N²⁵, Ν'²⁵-di alquila ou outros componentes antibióticos presentes na composição. Em algumas modalidades, o estabilizador é selecionado a partir do grupo consistindo em manitol, lactose, sacarose, sorbitol, glicerol, celulose, trealose, maltose, rafinose, e suas misturas. Em uma modalidade, uma formulação compreende o manitol. Em uma outra modalidade, uma formulação adicional15 mente compreende a lactose. Em uma modalidade, a composição pode ser formulada com uma razão em peso de 1:2 de manitol: composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila. Em uma

outra modalidade, a composição pode ser formulada com uma razão em peso de 1:1:4 de manitol: lactose: composto antibiótico de N^J5,N^j!5-dialquila.

Em algumas modalidades, uma composição ou outra formulação compreende um composto antibiótico de N¹⁵ ,N¹⁵dimetila, um composto de dalbavancina, ou uma combinação destes. Uma composição ou outra formulação pode ser adminis25 trada em uma dosagem que resulte em níveis terapeuticamente efetivos (i.e., bactericidas) da droqa no plasma por diversos dias, frequentemente pelo menos cerca de 5 a cerca de 10 dias, freqüentemente pelo menos cerca de uma semana. Por

246 exemplo, os compostos antibióticos de W^J5,JV'^!5-dialquila, ou as composições, podem ser mantidos no plasma na, ou acima da, concentração bactericida mínima de cerca de 4 mg/1, por pelo menos 5 dias. Os compostos antibióticos de N^1S,N¹⁵5 dialquila, ou as composições, podem ser mantidos em um nível no plasma de pelo menos cerca de 5 mg/1, pelo menos cerca de mg/1, pelo menos cerca de 20 mg/1, pelo menos cerca de 30

mg/1, pelo menos cerca de mg/1, por pelo menos 5 dias, pelo menos cerca de uma semana ou mais. Os níveis de compostos antibióticos de

N^I5,N⁷⁵-dialquila, ou composições, no plasma podem ser medidos por métodos que são bastante conhecidos na técnica, tais como a cromatografia líquida, a espectrometria de massa, ou o bioensaio microbiológico.

Os limites superiores para os níveis de concen15 trações no plasma do composto antibiótico de

N¹⁵ ,N¹⁵· dialquila, ou da composição, podem ser ditados pelas dosagens que inibem os efeitos adversos inaceitáveis na população

pacientes tratada.

O composto antibiótico de W⁷⁵ _zN^J5-dialquila, ou composição, pode ser administrado em uma dose única ou em múltiplas doses. Quando administrado como uma dose única, um composto antibiótico de N^J5 _zN^J5-dialquila ou composição pode ser formulada para conter uma quantidade suficiente do(s) composto (s) antibiótico (s) de N^N^-dialquila, para efetuar 25 as propriedades antibacterianas in vivo por pelo menos 5 dias, alternativamente por pelo menos 6 dias, alternativamente por pelo menos 7 dias, alternativamente por pelo menos dias, alternativamente por pelo menos 9 dias, alternati247

4õ!

. 15

vamente por pelo menos 10 dias, alternativamente por pelo menos 11 dias, alternativamente por pelo menos 12 dias, alternativamente por pelo menos 13 dias, alternativamente por pelo menos 14 dias, alternativamente por pelo menos 15 dias.

Quando as doses múltiplas forem empregadas, um composto antibiótico de N^J5,N^I5-dialquila, ou composição, pode ser administrado semanalmente por duas ou mais semanas. Em uma modalidade, um composto antibiótico de N¹⁵ _rN¹⁵dialquila, ou composição, pode ser administrado em pelo menos duas doses, frequentemente em duas doses, cerca de 5 a cerca de 10 dias separadamente, mais frequentemente uma vez por semana por duas semanas. Em certas modalidades, tal regime proporciona vantagens significativas sobre os protocolos de tratamento com antibióticos convencionais.

Um composto antibiótico de N^J5,..N^J5-dialquila, ou composição, também pode ser administrado em doses múltiplas dois ou mais dias, ou pelo menos uma semana separadamente, ou em uma ou mais doses bissemanalmente. Em algumas modalidades, um composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila, ou composição, pode ser administrado semanalmente, seguido por administração bissemanalmente, ou mensalmente. Em algumas modalidades, um composto antibiótico de N^J5,N^Z5-dialquila, ou composição, pode ser administrado em intervalos a cada semana, por 2, 3, 4, 5, 6, ou mais semanas.

Mais vantajosamente, não é requerida a dosagem diária de um composto antibiótico de N^;5,N²⁵-dialquila, ou composição, porque podem ser usadas doses menos frequentes,

248

4.30 maiores. As doses únicas ou múltiplas podem variar, por exemplo, de cerca de 0,1 a cerca de 5 gramas. Uma dose única de cerca de 0,1 a cerca de 4 gramas, p.ex., cerca de 3 gramas, pode ser administrada por diversos tratamentos de 5 infecção. Onde as doses múltiplas forem administradas, por

exemplo, semanalmente, cada dose pode variar, por exemplo, de cerca de 0,25 a cerca de 5 gramas.

Para as modalidades nas quais pode ser administrada uma dose única para tratar uma infecção, a quantidade da dose pode ser, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 5 gramas, ou cerca de 0,5 a cerca de 4 gramas, ou cerca de 1 a cerca de 3,5 gramas, ou cerca de 2 a cerca de 3 gramas, p.ex., cerca de 3 gramas. Em algumas modalidades, uma dose única de cerca de 1, 1,5, 2, 2,5, ou 3 gramas pode ser administrada para o tratamento de uma infecção bacteriana

Para as modalidades nas quais pode ser administrada uma dose única para profilaxia, a quantidade da dose pode ser, por

exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 3 gramas, ou cerca de 0,1 a cerca de 1 grama, p.ex., cerca de 0,5 ou cerca de 0,25 grama.

Nos esquemas de dosagem que incluem as dosagens múltiplas, as dosagens individuais podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, pode ser administrada uma primeira dose mais elevada, que pode ser, por exemplo, 25 cerca de 1,5 a 3 vezes maior do que uma ou mais doses subseqiientes. Por exemplo, a primeira dose pode ser cerca de

0,5 grama a cerca de 5 gramas e a segunda dose cerca de 0,25 grama a cerca de 2,5 gramas, a primeira dose pode ser cerca

249 de 0,8 a cerca de 2 grama e a segunda dose cerca de 0,4 a cerca de 1 grama, ou a primeira dose pode ser cerca de 0,4 a cerca de 3 grama e a segunda dose cerca de 0,2 a 1,5 grama.

Em algumas modalidades, são administradas pelo menos duas dosagens, onde a primeira dosagem inclui cerca de duas vezes tanto de um composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵dialquila, ou composição, quanto as dosagens subsequentes.

Em uma modalidade, uma primeira dosagem inclui cerca de 1 grama do composto antibiótico de N⁷⁵,N^J5-dialquila, ou da composição, e uma dosagem subseqüente de cerca de 0,5 grama.

Em uma outra modalidade, uma primeira dosagem inclui cerca de 0,5 grama e uma dosagem subseqüente de cerca de 0,25 grama.

Em algumas modalidades, um composto antibiótico de

N^J5,N^J5-dialquila, ou composição, pode ser administrado em duas doses de quantidades iguais ou diferentes, dois ou mais

dias ou pelo menos cerca de uma semana separadamente. Por exemplo, podem ser administradas duas doses de cerca de 0,2 a cerca de 1,5 grama de um composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵20 dialquila, ou composição, cerca de 5 a cerca de 10 dias separadamente, ou cerca de 1 semana separadamente. Em uma modalidade, uma primeira dosagem de cerca de 1 grama e uma segunda dosagem de cerca de 0,5 grama de um composto antibiótico de W¹⁵-dialquila, ou composição, podem ser administradas em torno de 1 semana separadamente.

Em um regime de dosagem múltipla, o tempo entre as doses pode variar, por exemplo, de cerca de 5 a cerca de 10 dias, freqüentemente cerca de uma semana. A freqüência da

250 dose pode ser, por exemplo, duas doses semanalmente, ou semanalmente. O intervalo de dosagem, ou o múltiplas doses

tempo entre	as	doses, pode	ser, por e
cerca de 2,	3, 4	, 5, 6, 7, 8	, 9,	10, 11,
5 17, 18, 19,	20,	21, 22, 23,	24,	25, ou
de doses dadas	pode ser,	por	exemplo

mais dias. O seis ou

12, 13, 14, 15, 16, emplo, qualquer de quatro, cinco, , uma, número duas, três, mais doses, cada dose após a dose

inicial ser dada, depois do intervalo de dosagem selecionado.

Nos esquemas de dosagens múltiplas de certas modalidades, o nível de depressão, ou o nível de um composto antibiótico de no plasma após uma primeira dose, e exatamente antes da administração de 4 mg/1. 0 de uma segunda dose, pode ser pelo menos cerca nível de depressão do composto antibiótico de

N'^J5 _J,N^J5-dialquila, ou da composição, no final de um intervalo

de dosagem, tal como cerca de uma semana, pode ser pelo menos cerca de 20 mg/1, pelo menos cerca de 30 mg/1, ou pelo menos cerca de 40 mg/1.

Um composto antibiótico de N^J5 _J,N^J5-dialquila, ou composição, pode ser administrado parenteralmente, p.ex., de modo intramuscular (i.m.), intravenoso (i.v.), subcutâneo (s.c.), intraperitoneal (i.p.), ou intratecal (i.t.). O programa de dosagem e a dosagem real administrada podem variar dependendo de tais fatores como a natureza e a gravidade da infecção, a idade, o peso, e a saúde geral do paciente e a tolerância de um paciente particular ao composto antibiótico de N⁷⁵,N^I5-dialquila, ou à composição, porém serão averiguáveis para os profissionais da saúde. Em

251

uma modalidade, uma	dose	intravenosa de	um	grama de um
composto antibiótico	de	NJ5 <NI5-dialquila,	ou composição,
pode ser seguida por	uma	dose intravenosa	de	0,5 grama uma
semana mais tarde.
A administração	e a distribuição	da	droga para o

paciente, p.ex., intravenosamente, podem ser feitas em uma taxa controlada, de modo que a concentração no sangue não aumente muito rapidamente ou faça com que ocorra a precipitação. Em algumas modalidades, um composto antibiótico de N^J5^N'^í5-dialquila, ou composição, pode ser administrado em uma taxa apropriada, de modo tal que a droga forme um complexo com a(s) proteína(s) endógena(s) na corrente sanguínea. Sem pretender estar ligado a uma teoria particular, pode-se acreditar que a proteína endógena, tal como a soro albumina humana, possa formar um complexo in vivo com uma ou duas moléculas de um composto antibiótico de N^I5,N'^J5-dialquila. Quando estiver presente uma quantidade suficiente de composição antibiótica de N^J5zN^J5-dialquila dalbavancina, até duas moléculas de composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila podem ligar-se à proteína endógena, e este complexo pode ser formado por ligação de compostos antibióticos de N^I5<N^I5-dialquila separados em dois locais diferentes de ligação. Alternativamente, é possível que o antibiótico de N²⁵,JV^I5-dialquila dimérico possa ligar-se em um local de ligação único sobre a proteína endógena.

A duração da infusão do composto antibiótico de

N^J5,N^J5-dialquila, ou da composição, pode ser, por exemplo, cerca de 1 minuto a cerca de 2 horas. Por exemplo, uma

252 duração de infusão de cerca de 30 minutos pode ser usada com um composto antibiótico de N¹⁵,N^-dialquila, ou composição, e a dose pode ser cerca de 0,5 a cerca de 1 grama. A administração intravenosa sob condições de taxas controladas pode gerar concentrações de composto antibiótico de N¹⁵ ,N¹⁵-

dialquila, ou composição, no corpo que estão em grande excesso do que pode ser atingido na fase de solução em pH fisiológico in vitro. Embora não desejando estar limitado por teoria, isto pode ser devido à formação de um complexo de antibiótico de W^J5 _zN^J5-dialquila com a(s) proteína (s) endógena(s), tal (is) como a soro albumina, que pode aumentar a capacidade do plasma de absorver o composto antibiótico de N^1S,W^I5-dialquila ou a composição.

Em certas modalidades, a formação de um complexo de antibiótico de N^I5,N^í5-dialquila in vitro ou ex vivo pode permitir a administração mais rápida, tal como pelo menos

cerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 10 minutos ou pelo menos cerca de 20 minutos. Tal complexo pode ser obtido misturando a soro albumina humana e/ou uma outra proteína endógena com um composto antibiótico de N²⁵,W^J5-dialquila, ou composição, desse modo formando o complexo in vitro ou ex vivo, e então administrando este complexo ao paciente tratado. Alternativamente, a soro albumina humana ou outra proteína endógena pode ser obtida a partir de fontes autólogas ou por expressão a partir de um microorganismo modificado para conter o gene para a proteína.

A quantidade do composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵dialquila, ou da composição, administrado pode ser quaisquer

253 das dosagens divulgadas aqui. A dose pode ser escolhida de modo tal que um ou mais compostos antibióticos de W^J5,W^J5dialquila permaneçam em um nível terapêutica ou profiláticamente efetivo (i.e., bactericida) no plasma por um período 5 de tempo prolongado, tal como pelo menos 5 dias, ou cerca de uma semana ou mais. É preferida a administração de uma dose de um composto antibiótico de JV^J5,V'^I5-dialquila, ou composi-

ção, que produza e mantenha as concentrações bactericidas por pelo menos cerca de uma semana (ou cerca de 5 a cerca de

10 dias) . Uma concentração bactericida pode ser definida como a concentração de um composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵dialquila, ou composição, requerida para matar pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de

90%, ou pelo menos cerca de qualquer uma de 95%, 96%, 97%, 15 98% ou 99% das bactérias presentes no início de um experimento in vitro, durante um período de 24 horas. Uma

concentração bactericida mínima de um composto antibiótico de N^;5,N^J5-dialquila, ou composição, no plasma pode ser cerca de 4 mg/1.

Os exemplos de indicações que podem ser prevenidas ou tratadas usando os compostos antibióticos de N^1S,N¹⁵dialquila, as composições, e os métodos da invenção incluem as SSTIs tanto complicadas quanto não complicadas, as infecções nas correntes sanguíneas (BSI), as infecções nas 25 correntes sanguíneas relacionadas aos cateteres (CRBSI), a osteomielite, as infecções das articulações protéticas, a profilaxia cirúrgica, a endocardite, a pneumonia adquirida em hospital ou na comunidade, a pneumonia pneumocócica, o

254 tratamento empírico de neutropenia febril, as infecções dos espaços das articulações, e as infecções por dispositivos (p.ex., os marca-passos e os desfibriladores cardíacos internos). As infecções por bactérias Gram-positivas ou resistentes a antibióticos podem ser prevenidas ou tratadas, tais como uma infecção pelo gênero Bacillus, Corynebacteria,

Listeria, Enterococo, Estafílococo, Estreptococo, Neisseria, ou Clostridium, em particular Staphylococcus aureus.

Staphylococcus epidermidis,

Streptococcus pyogenes,

Estreptococo dos Grupos A Bacillus subtilis, Neisseri

Staphylococcus hemolyticus,

Streptococcus pneumoniae, e C, Enterococcus faecalis, gonorrhoeae, ou Clostridium difficile. As outras infecções que podem ser prevenidas ou tratadas usando os compostos antibióticos de N¹⁵,N¹⁵15 dialquila, as composições, e os métodos da invenção incluem as infecções por bactérias gram-negativas, tais como pelo

gênero Bartonella, Brucella, Campylobacter, Enterobacter, Escherichia (bem como outras Proteobactérias), Francisella,

Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Leptospira,

Morganella, Moraxella, Proteus, Providencia, Pseudomonas,

Salmonella, Serratia, Shigella, Stenotrophomonas, Vibrio, e

Yersinia, em particular as infecções por Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosas, e leveduras, tais como Candida albicans.

A invenção também inclui a prevenção ou o trata mento de outras bactérias infecciosas usando os compostos, as composições, e os métodos da invenção, tais como a infecção por Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi,

255

Legionella pneumophilia, Mycobacteria sporozoites (sp.) (p.ex., M. tuberculosas, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae) , Neisseria meningitidis_z Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus do

Grupo A) , Streptococcus agalactiae (Streptococcus do Grupo

B) , Streptococcus (grupo viridans) , Streptococcus bovis,

Streptococcus (sps. anaerobic), Campylobacter sp. Patogênica,

Enterococcus sp. , Haemophilus influenzae, Bacillus antracis,

Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp. ,

Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens,

Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp.,

Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis,

Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, e

Actinomyces israelli.

A prevenção e o tratamento das infecções e dos

distúrbios descritos aqui podem ser efetuados usando os compostos, as composições e os métodos da invenção. Em uma modalidade, o composto antibiótico de N^N^-dialquila está de acordo com a fórmula (V) . Em algumas modalidades, o paciente não tinha sido previamente tratado com um ou mais antibióticos, tais como a vancomicina, ou a teicoplanina. Em outras modalidades, o paciente não tinha sido previamente tratado com um composto antibiótico de N^I5 _zNⁱ⁵-dialquila ou a 25 composição. Em algumas modalidades, o paciente tinha sido previamente testado quanto à resistência bacteriana a um antibiótico. Em outras modalidades, o paciente não tinha

34°

256

sido previamente testado quanto à resistência bacteriana a um antibiótico.

A invenção também inclui os métodos para a prevenção ou o tratamento de SSTIs. Os pacientes que podem beneficiar-se desta prevenção ou deste tratamento podem ter infecções profundas ou superficiais. A SSTI pode envolver o tecido mole mais profundo e/ou requerer intervenção cirúrgica significativa, tal como, por exemplo, um abscesso grande, úlcera infectada, queimadura grande, ou celulite profunda e extensa. As feridas cirúrgicas infectadas também podem também ser prevenidas ou tratadas.

A apresentação clinica da infecção da pele e da estrutura da pele pode variar de foliculite branda até fasciite necrotizante grave. O modo de aquisição também pode variar com as infecções da pele e da estrutura da pele adquiridas na comunidade, que são freqüentemente precedidas por lesões resultantes da exposição ocupacional ou de atividades recreativas, e estão normalmente associadas com uma diversidade maior de patógenos. As infecções da pele e da estrutura da pele adquiridas em hospital estão geralmente associadas com os procedimentos cirúrgicos, o desenvolvimento de úlceras de pressão, e a cateterização. As infecções póscirúrgicas são a terceira infecção nosocomial mais freqüente e são responsáveis por 17% de todas as infecções nosocomiais descritas no National Nosocomial Infection Surveillance System (Sistema de Vigilância de Infecção Nosocomial Nacional) (NNIS). A fonte mais freqüente de infecção pode ser a flora endógena do paciente. O Staphylococcus aureus,

257 os estafilococos negativos para coagulase, e o Enterococcus spp. são os patógenos mais freqüentemente isolados das

SSTIs.

Os sintomas das eritema, a sensibilidade localizado, a drenagem ou mento, a vermelhidão, ou a infecções SSTI podem incluir o ou a dor, o ardor térmico ou o pus, o inchaço ou o enrijeciondulação. Os pacientes que podem

beneficiar-se do tratamento com os métodos da invenção incluem aqueles com infecções profundas ou complicadas ou infecções que requeiram intervenção cirúrgica, ou os pacientes com diabete melito latente ou doença vascular periférica. Estas infecções são freqüentemente causadas por bactérias Gram-positivas, tais como as espécies Staphylococcus ou Streptococcus, tais como o Staphylococcus aureus ou o 15 Streptococcus pyogenes. Os métodos para o tratamento de uma infecção bacteriana da pele ou do tecido mole incluem

administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto antibiótico de N^J5,N'^I5-dialquila, ou composição, a um indivíduo que está necessitado do tratamento, em uma

0 quantidade e de acordo com um regime de dosagem como discutido acima. Em uma modalidade, o composto antibiótico de N^J5,N'ⁱ⁵-dialquila é de acordo com a fórmula (V) . Em uma modalidade, um composto antibiótico de N'^J5 _AN^J5-dialquila, ou composição, é administrado intravenosamente em duas doses, cerca de 5 a cerca de 10 dias separadamente, ou cerca de 1 semana separadamente. Em algumas modalidades, a primeira dosagem inclui pelo menos duas vezes tanto do composto antibiótico de N^J5 _zN^I5-dialquila, ou da composição, quanto a

258 segunda dosagem. Em uma modalidade, a primeira dosagem é cerca de 1000 mg e a segunda dosagem é cerca de 500 mg.

Conforme é entendido por aqueles versados na técnica, os métodos de dosar descritos aqui podem variar dependendo, inter alia, do composto, da doença e de sua gravidade, e da idade, peso, etc., do paciente a ser tratado, porém são verificáveis por um médico, sem experimentação indevida.

A invenção também inclui os métodos para a prevenção profilática do início de uma infecção bacteriana, por exemplo, uma infecção causada por Staphylococcus aureus, ou por uma bactéria do gênero Neisseria ou Clostridium. Em um método profilático da invenção, é administrada uma quantidade profilaticamente efetiva de um composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila, ou composição, a um indivíduo que pode estar suscetível à contração de uma infecção bacteriana, por

exemplo, através de um procedimento médico. 0 composto antibiótico de N⁷⁵,N'^I5-dialquila, ou a composição, pode ser administrado em uma quantidade suficiente para proporcionar um nível profilaticamente efetivo no plasma por pelo menos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 5 dias, ou pelo menos cerca de uma semana ou mais. 0 composto antibiótico de N^J5,N^I5-dialquila, ou a composição, pode ser administrado, por exemplo, parenteralmente, p.ex., via injeção i.m, i.v., i.p., s.c., ou i.t., antes da, subsequente à, ou no mesmo momento que a, cirurgia, como uma etapa preventiva contra a infecção. O composto antibiótico de N^I5,N^JS-dialquila, ou a composição, pode ser administrado

259 imediatamente antes de, ou subsequentemente a, um ou mais dias, ou cerca de uma semanas antes de, ou subsequentemente a, ou durante, um procedimento médico invasivo, tal como uma cirurgia ou uma estada em uma área para cuidado médico, tal como um hospital, para prevenir a infecção. Um método profilático pode ser usado em qualquer situação na qual

possa ser possível ou provável que um indivíduo possa contrair uma infecção bacteriana, incluindo as situações nas quais um indivíduo tenha sido exposto, ou pode ser provável de ser exposto, a um indivíduo infectado de modo bacteriano.

Para os métodos profiláticos, o composto antibiótico de

Nⁱ⁵,N^J5-dialquila, ou a composição, pode ser administrado como uma dose única ou como duas ou mais doses de quantidade igual ou diferente, que são administradas diversos dias até cerca de uma semana separadamente.

Em uma modalidade, um composto antibiótico de N^j5,N^J5-dialquila, ou composição,

pode ser administrado antes da, ou simultaneamente com a, inserção de um cateter intravenoso, para prevenir uma infecção relacionada à corrente sanguínea. Em uma modalidade, o composto antibiótico de N^J5 _zN^J5-dialquila é de acordo com a fórmula (V).

Para os métodos profiláticos, um composto antibiótico de N^I5 _zN'²⁵-dialquila, ou composição, pode ser administrado em uma dose única ou em múltiplas doses, de acordo com 25 quaisquer dos esquemas de dosagem descritos acima. Um composto antibiótico de N^1S, N^I5-dialquila, ou composição, pode ser administrado como uma dose única compreendendo cerca de 0,1 a cerca de 3 gramas, ou cerca de 0,1 a cerca de

260 grama, p.ex., cerca de 0,25 grama ou cerca de 0,5 grama.

Em uma modalidade, uma dose única de cerca de 0,25 grama pode ser administrada intravenosamente durante um período de tempo de cerca de 2 minutos a cerca de 1 hora, p.ex., cerca 5 de 30 minutos. Em uma outra modalidade, o composto antibiótico de N^J5 _zN^I5-dialquila, ou a composição, pode ser

administrado de modo intravenoso, simultaneamente com a administração de um outro tratamento farmacêutico (p.ex., antibiótico).

Em quaisquer dos métodos terapêuticos ou profiláticos descritos acima, o composto antibiótico de N^!5,N‘⁵dialquila, ou a composição, pode ser administrado simultânea ou seqüencialmente com pelo menos um outro antibiótico. Em algumas modalidades, pode ser administrado além do 15 antibiótico de N^I5 _zN^I5-dialquila pelo menos um outro antibiótico que possa ser efetivo (p.ex., bactericida)

contra uma ou mais espécies bacterianas Gram-negativas e/ou uma cepa bacteriana Gram-positiva contra a qual o composto antibiótico de W²⁵ _zW^J5-dialquila não seja efetivo. Em algumas modalidades, o composto antibiótico de N^I5 _zN^J5-dialquila e pelo menos um antibiótico que possa ser efetivo (p.ex., bactericida) contra pelo menos uma espécie bacteriana Gram negativa podem ser administrados como uma mistura na composição de dalbavancina.

Composições Farmacêuticas

A invenção proporciona composições farmacêuticas formuladas para a administração de um composto antibiótico de N'^Í5 _zN^I5-dialquila ou composição de acordo com os métodos

445

261 descritos acima. As composições farmacêuticas da invenção podem estar na forma de uma dose unitária de um composto antibiótico de

N²⁵ _zJV'^Í5-dialquila, ou composição, que inclui uma quantidade de um composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵' dialquila, ou composição, suficiente para proporcionar um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo do composto antibiótico de N^J5 _/N²⁵-dialquila, ou da quando o por diversos di cerca de 5 dias, composição, no plasma

>, pelo	menos	cerca	de	3 dias, pelo	menos
ou pelo	menos	cerca	de	uma semana ou	mais,
o ou a	composição	for	administrada	a um

veículo farmaceuticamente aceitável. Um indivíduo, e um nível terapêutica ou profilaticamente efetivo de composto antibiótico de N²⁵,N'¹⁵-dialquila, ou composição, no plasma pode ser pelo menos cerca de 4 mg por litro de plasma.

Os níveis de composto antibiótico de N^I5,N^J5-dialquila, ou composição, no plasma podem ser medidos por métodos que são bastante conhecidos na técnica, tais como a cromatografia

líquida, a espectrometria de massa, ou o bloensaio micróbio20 lógico. Conforme os níveis dos é sabido por aqueles versados na técnica, outros compostos antibióticos de N^ls _rN¹⁵dialquila ou das composições no soro podem ser quantificados no soro usando metodologias similares.

Os compostos antibióticos de N^J5,N^J5-dialquila e as composições podem opcionalmente estar em uma forma farmaceu25 ticamente aceitável para a administração a um indivíduo, por

Os exemplos de sais adequados de um composto antibiótico de N^Jí _zN^J5-dialquila incluem os sais formados por exemplo, como um sal não-tóxico, farmaceuticamente aceitável.

262 reação padrão com ácidos tanto orgânicos quanto inorgânicos, tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoracético, tricloroacético, succínico, cítrico, ascórbico, láctico, maléico, 5 glutâmico, canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, láurico, esteárico, salicílico, metanossulfônico,

benzenossulfônico, sórbico, pícrico, benzóico, cinâmico, e similares. Os exemplos representativos de bases que podem formar sais com a dalbavancina incluem os hidróxidos de metais alcalinos ou metais a.lcalino-terrosos, tais como o hidróxido de sódio, potássio, cálcio, magnésio, e bário, a *** amônia e as- aminas orgânicas alifáticos, alicíclicas, ou aromáticas, tais como a metilamina, a dimetilamina, a dietilamina, a etanolamina, e. a picolina. (Ver, por exemplo, . 15 a‘Pat. U.S. N- 5.606.036).

Em algumas modalidades, pode ser proporcionada uma formulação de um composto antibiótico de N^J5,N^I5-dialquila, ou composição, aquosa, farmaceuticamente aceitável, que é adequada para a administração parenteral, tal como, por

2Θ--exempio?—a-iujeçèo intravenosa. Em uma modalidade, o composto antibiótico de N^N^-dialquila é de acordo com a fórmula (V) . Para a preparação de tal formulação aquosa de um composto antibiótico de N^N^-dialquila, ou' composição, podem ser usados métodos bastante conhecidos na técnica, e 25 podem ser usados quaisquer veículos, diluentes, excipientes,' ou outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis, normalmente usados na técnica. Em uma modalidade, uma formulação aquosa

447

263 farmaceuticamente aceitável para a injeção intravenosa inclui

5% de dextrose.

Uma composição farmacêutica para a administração parenteral compreende um composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵5 dialquila, ou uma composição, e um diluente fisiologicamente aceitável, tal como a água deionizada, a solução salina fisiológica, 5% de dextrose, solvente miscivel com a água

(p.ex., o álcool etílico, o polietileno glicol, o propileno glicol, etc.), veículo não-aquoso (p.ex., óleo, tal como o óleo de milho, o óleo de caroço de algodão, o óleo de amendoim, e o óleo de gergelim), ou outro diluente comumente usado. A formulação pode adicionalmente compreender um agente solubilizante, tal como o polietileno glicol, o polipropileno glicol, ou outro agente solubilizante conhe15 cido, tampões para estabilizar a solução (p.ex., citratos, acetatos, e fosfatos) e/ou antioxidantes (p.ex., ácido

ascórbico ou bissulfito de sódio). (Ver, por exemplo, a Pat.

U.S. N² 6.143.739). Os outros veículos farmacêuticos adequados e as suas formulações são descritos no

Remington' s Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin.

Conforme é sabido na técnica, as preparações farmacêuticas da invenção também podem ser preparadas para conter níveis aceitáveis de particulados (p.ex., sem partículas) e ser não-pirogênicas (p.ex., atendendo as exigências de um injetável na U.S. Pharmacopeia) .

Em uma modalidade, é proporcionada uma composição liofilizada) de um composto antibiótico de N¹⁵,N^J5-dialquila, farmacêutica por dissolução de uma dose secada (p.ex.,

264 ou composição, frequentemente compreendendo um estabilizador ou mistura de estabilizadores, em uma quantidade de água e, preferivelmente água deionizada, em um volume suficiente para a solubilização. Por exemplo, a quantidade de água 5 suficiente para a solubilização pode ser aproximadamente 10 mL e o pH resultante pode ser acima de 3,0, e cerca de 3,5 a

4,5. A diluição desta solução adicionando-a a uma segunda quantidade de um diluente aquoso, contendo 5% de dextrose, tal como uma quantidade contida em um saco de gotejamento para a administração intravenosa, pode elevar o pH da solução para cerca de 5 a 5,5. Em uma outra modalidade, o pH da solução em um saco de gotejamento pode ser cerca de 4,5. A segunda quantidade de solução aquosa pode ser deionizada ou estéril, ou tanto deionizada quanto estéril. Em uma modalidade, o diluente aquoso é 5% de dextrose. Os outros

métodos de solubilização, e as suas formulações de antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila, serão aparentes para aqueles versados na técnica.

As composições farmacêuticas para a administração parenteral podem ser preparadas em frascos pequenos estéreis contendo uma ou mais doses unitárias do composto antibiótico de N'^J5,N^J5-dialquila, ou da composição, em uma quantidade terapêutica ou profilaticamente efetiva, conforme descrito acima, opcionalmente incluindo um excipiente, sob condições nas quais pode ser mantida a eficácia bactericida do composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila, ou da composição. O composto ou a composição pode estar ou não na forma de um pó seco (p.ex., liofilizado) . Antes do uso, um diluente

265 fisiologicamente aceitável pode ser adicionado e a solução removida, via seringa, para a administração a um paciente. Uma formulação farmacêutica conforme acima descrita pode ser esterilizada por qualquer meio aceitável, incluindo, por exemplo, os métodos de esterilização de feixes-e ou gama, ou por filtração estéril.

Uma formulação para a administração parenteral pode incluir o composto antibiótico de N^j5 _zJV^J5-dialquila, ou a composição, em uma concentração tal como cerca de 0,1 a

cerca	de	100	mg	, cerca de 0	,5	a cerca de	50	mg,	cerca de 1 a
cerca	de	10	mg,	cerca de 1	a	cerca de 5	mg,	ou	cerca de 2 a
cerca	de	4	mg	do composto	antibiótico	de	N15,	NI5-dialquila,

ou da composição, por ml de preparação final.

Em uma modalidade, o composto antibiótico de N^N^-dialquila é de acordo com a fórmula (V).

Em algumas modalidades, uma composição farmacêu-

tica de acordo com a invenção inclui uma mistura de um composto antibiótico de alquila, ou composição, e um ou mais antibióticos adicionais. De preferência, pelo menos um antibiótico que não seja a dalbavancina na mistura pode ser efetivo (p.ex., bactericida) contra uma ou mais espécies de -bactérias Gram-negativas, tal como, por exemplo, o aztreonam, e/ou contra uma ou mais cepas bacterianas Grampositivas contra as quais o composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵25 dialquila, ou a composição, pode não ser efetiva, tal como, descrito acima. Em algumas modalidades, a composição farmapor exemplo, a ilnezolida ou a daptomicina. A mistura pode também incluir um veiculo farmaceuticamente aceitável, como

266 cêutica compreende um composto antibiótico de N¹⁵rN¹⁵dialquila, ou composição, e um ou mais antibióticos adicionais. Em algumas modalidades, a composição de antibiótico de N²⁵zN^J5-dialquila compreende um composto antibiótico de 5 N^I5,jV²⁵-dialquila de acordo com a fórmula (V) .

Em algumas modalidades, as composiçoes farmacêuticas da invenção compreendem uma ou mais substâncias

estabilizantes, as quais inibem a degradação de um ou mais dos compostos antibióticos de N^I5,W^J5-dialquila até materiais menos ativos ou inativos. Conforme usado aqui, a substância estabilizante ou o estabilizador refere-se a uma substância que estabiliza o nível de um ou mais compostos antibióticos de N^J5,N^J5-dialquila, na composição. Uma quantidade efetiva estabilizante refere-se a uma quantidade de um estabilizador suficiente para aumentar a estabilidade de

longa duração de um ou mais compostos antibióticos de N^J5,N^I5-dialquila que podem estar presentes na composição. Em algumas modalidades, pode ser proporcionada uma quantidade efetiva estabilizante por uma mistura de duas ou mais substâncias estabilizantes, cada uma das quais, sozinha, pode não estar presente em uma quantidade suficiente para proporcionar um efeito estabilizador.

Os exemplos de estabilizadores incluem, por exemplo, as substâncias não-iônicas, tais como os açúcares,

p.ex., os mono-, di-, ou polissacarídeos, ou os seus derivados, os álcoois de açúcares, ou os polióis. Tais substâncias estabilizantes incluem, por exemplo, o manitol,

267 a lactose, a sacarose, o sorbitol, o glicerol, a celulose, a trealose, a maltose, a rafinose, ou as suas misturas.

Em uma modalidade, uma formulação de antibiótico de N^J5,N'^!5-dialquila compreende o manitol. Em uma outra 5 modalidade, uma formulação de antibiótico de N^j!5,N^í5-dialquila adicionalmente compreende a lactose. Em uma modalidade, a composição de antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila é formulada

com uma razão em peso de 1:2 de manitol:composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila. Em uma outra modalidade, a composição de antibiótico de N^J5,N^I5-dialquila é formulada com uma razão em peso de 1:1:4 de manitol:lactose: composto antibiótico de

N'^J5,N^J5-dialquila. Uma combinação de manitol e lactose pode proporcionar um maior efeito estabilizador do que uma ou outra substância sozinha. O pH de uma composição farmacêu15 tica da invenção pode ser, por exemplo, cerca- de 2 a cerca de 9, alternativamente de cerca de 3 a cerca de 8, alternativamente de cerca de 4 a cerca de 7, alternativa-

mente de cerca de 5 a cerca de 6, alternativamente de cerca de 3,5 a cerca de 4,5

O pH de uma composição farmacêutica da invenção também pode ser, por exemplo, menos do que cerca de 9, alternativamente menos do que cerca de 8, alternativamente menos do que cerca de 7, alternativamente menos do que cerca de 6, alternativamente menos do que cerca de 5, ou alternativamente menos do que cerca de 4. O pH de uma composição farmacêutica da invenção pode também ser, por exemplo, maior do que cerca de 2, maior do que cerca de 3, alternativamente maior do que cerca de 3,5, alternativamente maior do que cerca de 4, alternativamente maior do que cerca

268 de 4,5, alternativamente maior do que cerca de 5,0, alternativamente maior do que cerca de 5,5, alternativamente maior do que cerca de 6,0, alternativamente maior do que cerca de 6,5, ou altemativamente maior do que cerca de 7,0.

Em algumas modalidades, podem ser empregados um ou mais procedimentos para reduzir a formação de MAG (um

derivado de um composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila da invenção ou um composto de dalbavancina não tendo uma porção de acilglicoronamina) e/ou outros degradantes. Por exemplo, a liofilização de um composto antibiótico de N^1S ,N¹⁵dialquila, ou composição, na presença de uma substância estabilizante, tal como o manitol, pode ser empregada para reduzir a quantidade de MAG formada.

A armazenagem dos compostos antibióticos de

N^J5 _zNⁱ⁵-dialquila e das composições pode ser em uma temperatura menor do que a ambiente, tal como em torno de 5°C, para

aumentar a estabilidade.

A dosagem a cada semana de um composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila, ou composição, em altos níveis de dosagem (i.e., resultando em níveis no soro surpreendentemente altos e de longa duração) pode mostrar um perfil de segurança surpreendentemente bom, similar àquele, ou melhor do que aquele, observado com a terapia padrão de doses mais baixas de antibióticos convencionais, administrados diaria mente ou mesmo 2-4 vezes ao dia, conforme demonstrado pelos

Exemplos aqui contidos. Uma dosagem alta (i.e., resultando em níveis no soro altos e de longa duração, p.ex., 200-5000 mg) de um composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila ou

269

4&3

composição pode ser administrada, com menos frequência do que os outros antibióticos, e sem os efeitos colaterais adversos, capacitando a eficácia aperfeiçoada e o cumprimento pelo paciente.

Em certas modalidades, o tratamento com a composição de antibiótico de N^J5,N²⁵-dialquila resulta em uma baixa incidência de eventos adversos. Os eventos adversos sérios incluem qualquer experiência de droga adversa ocorrendo em qualquer dose, que resulte em morte, possa provocar a morte, resulte em hospitalização ou prolongamento da hospitalização existente, ou deficiência ou incapacidade persistente ou significativa.

Kits

A invenção também inclui os kits para uso nos métodos de tratamento ou profilaxia de infecções bacterianas. Os kits podem incluir um composto ou composição farmacêutica da invenção, por exemplo, compreendendo pelo menos uma dose unitária de um composto antibiótico de N¹⁵,N^I5-dialquila, ou composição, e instruções que proporcionam informação a um provedor de cuidados da saúde em relação ao uso para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana. As instruções podem ser proporcionadas na forma impressa ou na forma de um meio eletrônico, tal como um disquete, CD, ou DVD, ou na forma de um endereço de página eletrônica da rede onde possam ser obtidas tais instruções. Uma dose unitária de um composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila, ou composição, pode incluir uma dosagem tal que, quando administrada a um indivíduo, possa ser mantido um nível terapêutica ou profilaticamente

270 efetivo de um composto antibiótico de N^J5,N^JS-dialquila, ou composição, no plasma no indivíduo, por pelo menos 5 dias. Em algumas modalidades, um kit inclui duas dosagens unitárias a serem administradas pelo menos 5 dias 5 separadamente, cerca de uma semana separadamente, ou incluindo uma primeira dosagem de um composto antibiótico de

N^J5 _zNⁱ⁵-dialquila, ou composição, que pode ser cerca de 1,5 a

cerca de 3 vezes maior do que a segunda dosagem. Em algumas modalidades, um composto antibiótico de N^J5,N'^J5-dialquila, ou composição, pode ser incluído como uma composição farmacêutica aguosa estéril ou composição de pó seco (p.ex., liofilizada) . Em uma modalidade, o composto antibiótico de N^I5 _zN^I5-dialquila é de acordo com a fórmula (V) .

Em algumas modalidades, é proporcionado um acondi15 cionamento adequado. Conforme usado aqui, o acondicionamento refere-se a uma matriz ou material sólido comumente usado em um sistema e capaz de conter, dentro de limites

fixos, um composto antibiótico de N^J5,N¹⁵-dialquila, ou composição, adequado para a administração a um indivíduo.

Tais materiais incluem os frascos de vidro e plástico (p.ex., polietileno, polipropileno, e policarbonato), os frascos pequenos, o papel, o plástico, e os envelopes laminados de folha plástica e similar. Se forem empregadas as técnicas de esterilização por feixes-e, o acondiciona25 mento deve ter densidade suficientemente baixa para permitir a esterilização dos conteúdos.

Os kits podem também opcionalmente compreender equipamento para a administração do composto antibiótico de

465

271

W¹⁵ _zW^J5-dialquila, ou da composição, tal como, por exemplo, seringas, ou equipamento para a administração intravenosa, e/ou uma solução estéril, p.ex., um diluente, tal como 5% de dextrose, para preparar uma composição de pó seco (p.ex., 5 liofilizada) para a administração.

Os kits da invenção podem também compreender, além

do composto antibiótico de N^J5,N^J5-dialquila ou da composição, um antibiótico que não seja a dalbavancina, ou mistura de antibióticos que não sejam a dalbavancina, para uso com o composto antibiótico de N^1S, N^J5-dialquila, ou a composição, como descrito nos métodos acima.

Os seguintes exemplos sintéticos e biológicos são proporcionados para ilustrar esta invenção e não são para serem interpretados, de modo algum, como limitando o escopo 15 desta invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 15

Purificação da N¹⁵, AI²⁵-dimetil dalbavancina B_o

A preparação do A-40926 e a síntese subseqüente da dalbavancina são descritas acima. O presente exemplo descreve a purificação do composto antibiótico de N¹⁵,N¹⁵dimetila de acordo com a fórmula (V), i.e., a N^1S, W^J5-dimetil dalbavancina B_o, a partir de uma mistura de compostos de dalbavancina preparados de acordo com a invenção. Conforme será aparente para aqueles N¹⁵, W^I5-dimetil dalbavancina modificada com dois grupos propósitos deste exemplo e de habilidade na técnica, a

Bo é uma dalbavancina Bo metila sobre N¹⁵. Para os dos exemplos que seguem, o

272

45G antibiótico de N¹⁵, N^I5-dimetila Bo é referido como Composto A nas seções onde o composto tiver ainda de ser inteiramente caracterizado. Também, por conveniência nas seções posteriores, a N¹⁵, N^I5-dimetil dalbavancina Bo é

referida	como	dalbavancina B2. O	antibiótico de	N15,	N15-
dimetila	Bo, a	dalbavancina B2 e o	Composto A são	a mesma
molécula.
		Preparação da Amostra
	Cerca	de 2 L de solução	aquosa orgânica	de	uma
purificação da	dalbavancina preparada de acordo	com	os

* , 15

métodos aqui contidos foram concentrados por evaporação com acetonitrila e água, sob vácuo. A adição do éter dietilico ao resíduo proporcionou 6 g de sólido bruto. Após dissolução em uma mistura de água/acetonitrila a 90/10 v/v, o sólido foi purificado sobre silica gel silanizada (volume do leito 1L; di da coluna = 5 cm) , usando uma eluição com gradiente em etapas de água (pH 3; ácido acético)/acetonitrila. As frações contendo o composto A foram reunidas, concentradas até um. volume pequeno (alguns ml) e submetidas à purificação por HPLC preparativa.

As frações enriquecidas foram coletadas. Após evaporação da acetonitrila sob vácuo e liofilização, foram recuperados alguns qg de composto A.

Exemplo 16

Identificação dos Substituintes de N¹⁵ Amina do Composto A

O Composto A tem um peso molecular de 1828 Da, 14 unidades mais do que os componentes de dalbavancina B_o e Bi (P.M. 1814). A análise por HPLC-ΕΞΙ-ΕΜ demonstrou que, ao

273 contrário dos outros componentes do complexo, a variação é sobre o grupo amino terminal em N²⁵.

Os outros compostos de dalbavancina, possuindo um grupo metilamina (R-NHCH₃) , mostram em seus espectros de 5 massa de fragmentação (ESI-EM/EM) uma perda neutra de 31 unidades (-NH2CH3) . O espectro de fragmentação do Composto A

mostra uma perda de 45 unidades, em vez de 31 unidades. Este tipo de perda neutra pode ser explicado por duas hipóteses estruturais: o N¹⁵ poderia ser um grupo Ν,Ν-dimetilamina (ΒΙΟ N(CH₃)₂, amina terciária) ou um grupo N-etilamina (RNHCH2CH3, amina secundária) .

A análise por HPLC-ΕΞΙ-ΕΜ do Composto A hidrolisado e derivado pode distinguir entre estas duas hipóteses.

A Fig. 29 mostra os três fragmentos peptidicos originados de

Bo após a hidrólise com ácido. São formados dois dipeptideos, AA1+AA3, com o grupo amino ΛΓ²⁵ e um átomo de

cloro, AA5+AA7, e um tri-peptideo AA2+AA4+AA6, com um átomo de cloro. Os outros produtos da hidrólise são as cadeias de ácido graxo e de DMEPA4 (dimetilamino-propila2 0 mino) .

No caso do Composto A, o dipeptideo AA1+AA3 deve ser diferente, como descrito na Fig. 30. A hipótese correta pode ser verificada reagindo o hidrolisado com um agente de derivação, que reage com as aminas primárias e secundárias 25 somente (ver a Fig. 31).

di-peptideo AA1+AA3 do componente B_o deve reagir com dois grupos do agente de derivação (ver a Fig.

31a). No caso do Composto A, podem ser obtidos dois peptideos

452

274 derivados diferentes AA1+AA3, dependendo do grupo amino

N^!' (Fig. 31b). As duas moléculas, teoricamente esperadas de acordo com as hipóteses propostas, terão pesos moleculares facilmente distinguíveis por análise espectrométrica de massa.

Materiais

Composto A

Dalbavancina grau reagente, cód. da

Rudi Pont

750-11

Metanol grau HPLC, cód. de

J. T. Backer

8402

WAT052880

Pacote da Química AccQ

TagTM, cód.

da Waters

Hidrólise

15	A hidrólise tanto da amostra quanto	do	padrão	foi
	efetuada	em uma Estação de Trabalho PICO-TAG (Waters,
	Mildoford,	, EUA).
		Todos os 3 60 qg de Composto A e cerca	de 1 mg	do
	padrão de dalbavancina foram hidrolisados	a	105°C,	na
20	presença	de HC1 a 6N contendo 1% (p/v) de	fenol, por	24
	horas. As	misturas de reação foram reunidas,	evaporadas	até
	a secura	e levadas para um volume final	de	500 L	com
	metanol.	Derivação
25		0 kit de reagente AccQ-FluorTM da	Waters	foi

Fluor é um dos compostos de derivação de amina de carbamato heterocíclico ativado com N-hidroxissuccinimida. A estrutura escolhido para a derivação do peptideo. 0 reagente AccQ275 do agente de derivação e o esquema de reação são descritos no Esquema 2.

Esquema 2 mL de Diluente de Reagente foi adicionado ao frasco pequeno contendo o Pó de Reagente. O frasco pequeno foi remoinhado por 10 segundos e aquecido a 55°C até a dissolução completa. O reagente AccQ-Fluor reconstituído era aproximadamente 10 mM em acetonitrila. 20 μΐ de amostra ou padrao hidrolisada foram colocados em um frasco pequeno com

inserto cônico e 20 μΐ de Tampão de Borato do AccQ-Fluor foram adicionados e remoinhados brevemente. Neste ponto, 40 μΐ de reagente AccQ-Fluor reconstituído foram adicionados e a amostra remoinhada por 30 s. Os frascos pequenos foram aquecidos a 55°C por 10 min. Nestas condições, os grupos amino devem reagir e os subprodutos eventuais devem ser 15 minimizados. Após esta reação, as amostras estavam prontas para a análise por HPLC.

Análise por HPLC-UV-EM

Bomba de EM Thermo Finnigan Surveyor, detector de arranjo de diodo e autoamostrador,

276

Detector de massa ThermoQuest Finnigan LCQ

Deca, equipado com interface ESI.

Cromatografia: Coluna: AccQ-TagTM (Waters

C18

NovoPak :m 3, 9 coluna:

37°C;

Fluxo:

mL/min;

Fase A: acetato de amônio

140 mM pH 5 (ácido

Fase

B: água/acetonitrila

60/40 v/v;

detecção de UV: 254 nm;

Volume de injeção: 20 μΤ,. 0 eluado

4go

da coluna foi dividido para permitir a detecção de UV e massa.

Espectrometria de Massa

Condição de entrada da amostra: temperatura do capilar: 200°C gás sheath: N₂, 40 (unidades arbitrárias) gás auxiliar N₂, 20 (unidades arbitrárias)

Ajuste da voltagem de entrada da amostra: polaridade: positiva voltagem da fonte:

4,7 kV

voltagem do capilar: 10 V offset da lente do tubo: 40

Condições de varredura: modo de varredura: ms total faixa de varredura: 100-700 amu número de microvarreduras 3 tempo máximo de íon 50 ms

Resultados

Os fragmentos derivados e hidrolisados da dalbavancina foram separados por HPLC e avaliados por ESI-EM (dados não mostrados). 0 fragmento AA1+AA3 tinha um tamanho de 7 37 (m/z) , o fragmento AA5+AA7 tinha um tamanho de 68 9

277

(m/z) , e o fragmento AA2+AA4+AA6 tinha um tamanho de 1086 (m/z).

Os fragmentos derivados e hidrolisados do Composto A foram separados por HPLC e avaliados por ESI-EM. O fragmento AA1+AA3 tinha um tamanho de 737 (m/z), o fragmento AA5+AA7 tinha um tamanho de 581 (m/z), e o fragmento

ΑΑ2+ΑΆ4+ΑΆ6 tinha um tamanho de 1086 (m/z).

tamanho do AA5+AA7 confirmou que o Composto A é um composto de N15, Λ/15-dimetila.

Exemplo 17

Metilação da Dalbavancina B_o

A dalbavancina B_o foi preparada seguindo os métodos resumidos, de um modo geral, acima e purificada por HPLC seguindo os métodos descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. N² 2004/0142883. Uma amostra de dalbavancina Bo foi submetida à N-metilação de amina secundária seletiva para produzir o antibiótico de N^J5,N^J5-dimetila B_o. A mistura de reação foi então analisada por HPLC-UV e HPLC-UV-EM no Exemplo abaixo.

Materiais

Dalbavancina B_o

Água, Grau MmilliQ

NaBHaCN, cianoboroidreto de sódio, cód. da Fluka 71435

DMF, N,N-dimetilformamida, cód. de Cario Erba 444926

HCHO, solução de formaldeido, solução em água a 36,5%, cód. da Reidel de Haên 33220.

NaHCO₃, bicarbonato de sódio, grau reagente

278

Método

49,5 mg de dalbavancina foram dissolvidos em 12,5 ml de água e 1,5 mL de DMF em um frasco de fundo redondo (pH

3,5) . Três alíquotas de 200 pL foram retiradas e diluídas com 800 pL de água (tO) . 76 pL de uma solução de formaldeído em água a 36% (v/V) e 2,5 mg de bicarbonato de sódio (pH

5,8) foram adicionados. 8 mg de NaCNBH₃ foram adicionados,

sob agitação, após a dissolução completa do bicarbonato de sódio. Três alíquotas de 200 pL desta mistura de reação foram imediatamente retiradas e diluídas com 800 pL de água e 300 pL de CH₃CN, a fim de obter uma solução clara (t0') . A mistura de reação foi deixada na temperatura ambiente por 30

minutos.	As	amostras	foram retiradas	do meio de	reação	após
10 e 30	minutos, por	extração de 3	alíquotas	de	200	pl e
diluição	de	cada uma	com 800 pl de	água e 300	pl	de	CH3CN
(tlO e t30).

Após 30 minutos, a reação foi interrompida esfriando o frasco para -20°C. A reação foi monitorada através de análise por HPLC-UV e HPLC/UV/EM.

•’ . Exemplo 18

Confirmação Estrutural do antibiótico de N²⁵, N²⁵-dimetila B_o

Este exemplo demonstra que o Composto A e · o antibiótico de N¹⁵, N^J5-dimetila B_o do exemplo anterior são idênticos.

As amostras de reação tO, t0', tlO e t30 foram analisadas por HPLC-UV e comparadas com o padrão de referência. Os cromatogramas de tO', tlO e t30 eram muito

279 similares, demonstrando que a metilaçao ocorre imediatamente .

Na Fig. 33, são mostrados os cromatogramas de tO' vs. tO. O Bo metilado mostrou o mesmo tempo de retenção que o Composto A, do Exemplo 15, acima descrito. A hipótese que o Composto A é o derivado metilado de Bo e, consequentemente, que a cadeia de ácido graxo do Composto A é um ácido

10-metil undecanóico foi, desse modo, demonstrada.

Os resultados de HPLC-UV-EM confirmaram a conclusão estrutural de HPLC-UV descrita no último parágrafo. O pico de N,N'-dimetil de B_o estava perfeitamente sobreposto àquele do Composto A.

Foi, assim, demonstrado que o grupo em N¹⁵ do Composto A é um grupo dimetilamina e não uma etilamina. A

estrutura elucidada do componente do Composto A é descrita na Fig. 28.

A estrutura do composto A foi adicionalmente confirmada por RMN, ΕΞΙ-ΕΜ e IV. Os espectros de RMN foram registrados sobre um Bruker AMX 600 a 39, 85°C (313 K) . A amostra foi dissolvida em DMSO-d6 e as designações da RMN de próton e de carbono foram determinadas pelos espectros de

COSY-DFTP, ROESY, e HMQC. Um tempo de mistura de 350 ms foi selecionado para o experimento de ROESY. Os espectros de massa foram determinados através de ionização por eletropul25 verização no modo positivo em um Thermoquest Finnigan LCQ^deca instrumento KBron Bruker IFS 48.

a 250°C. O espectro de infravermelho foi registrado em um

280

As designações dos picos da RMN são proporcionadas nas Figs. 34. A Tabela 40 descreve as designações 1H de B₂ em comparação com B_o. Os espectros de RMN de B₂ revelam muitas similaridades com a dalbavancina B_o. A cadeia de 5 ácido graxo contém um grupo terminal isopropílico. A maior parte dos deslocamentos químicos de prótons e carbonos é aproximadamente igual aos verificados para o componente de B_o. Os desvios dos deslocamentos químicos principais são observáveis para os sinais que pertencem ao aminoácido 1. Em 10 particular, o singlete a 2,31 ppm (¹³CÔ 40, 06 ppm) dá a integral correspondendo a seis prótons e as correlações de NOE com os prótons xl, lf e le. 0 seu deslocamento químico e as correlações dipolares sugerem que este sinal é devido ao grupo dimetilamino que pertence ao primeiro sistema de spin 15 do aminoácido.

281

TABELA 40

	b2	Bo		b2	Bo
δ1Η	δ2Η 1 Ô13C	δΧΗ	δ3Η	ô13c
wl	-	n.a. j -	6e	7,26	7,28	123,2
ch3	2,31	2,45	30,99	6f	7, 42	7,44	126, 9
xl	4,43	4,33	66,07	w7	8, 41	8, 47	-
1b	6,70	6,71	118, 5	x7	4,42	4, 45	53,3
le	6,93	7,05	117, 6	7d	6,73	6,75	101,1
lf	7,00	7,23	126, 65	7f	6,43	6, 40	107, 9
w2	7,36	8,2	-	AGÍ	5,48	5,40	101,9
x2	4,83	4,79	55,9	AG2	3,72	3,71	55,98
x2	2,81/3,32	2,95/3,37	n · a ·	AG3	3, 62	3, 62	76,11
2b	7, 09	7,1	130, 6	AG4	3, 41	3,51	n.a.
2c	7, 17	7, 07	123, 4	AG5	n.a.	4,27	66,28
2e	6, 97	6, 97	122,33	AG-NH	7,71	7, 77	-
2f	7, 63	7,87	131,29	FA2	2, 02	2,01	35,8
w3	7,58	7,54	-	FA3	1, 43	1,42	24,84
x3	6,10	6,09	54,31	FA4-FA9	1,11-1,22	1,0-1,2	28,8-29,3
3d	6,72	6,55	107, 5	FA10	1,50	1,49	27,2
3f	6, 49	6,78	107, 1	FA11	0, 84	0,84	22,34
w4	7, 64	7, 44	-	FA12	0,84	0,84	22,34
x4	5, 60	5,59	54,63	wNN	7,96	8,19	-
4b	5, 80	5, 78	108, 8	NNa	3,31-3,20	3,17-3,40	35,38
4f	5,11	5,08	103,8	NNb	1, 65	1,87	23,37
w5	8,36	8,48	-	NNc	2,39	2,96	53,94
x5	4,41	4,35	57,72	NNd	2,24	2,71	42,05
5b	7,10	7, 13	135,01	Ml	5,27	5,32	96,7
5e	6,71	6,71	116, 0	M2	3,25	3,3	70,24
5f	6,71	6,71	125,8	M3	n.a.	3,49	73, 6
w6	6, 62	6, 62	-	M4	n.a.	3,69	72,91
x6	4, 14	4,19	61,97	M5	n.a.	3,50	n. a.
z6	5,20	5,38	70,8	M6	n.a.	3,50	60,68
6b	7,69	7,75	126, 6

É proporcionado um espectro de infravermelho na Fig. 35. 0 ESI-EM é proporcionado na Fig. 36. Os dados confirmaram a estrutura do composto A como a dalbavancina B?

(N^1S, N^í5-dimetil dalbavancina B_o) .

282

Exemplo 19

Atividade da Dalbavancina B₂ (Λ/⁷⁵, iM-dimetil dalbavancina B_o)

A N¹⁵, N⁷⁵-dimetil dalbavancina B_o, diversos compostos de W⁷⁵-monometil dalbavancina e diversos antibió5 ticos conhecidos foram isolados e testados in vitro quanto à sua atividade antibacteriana. Os compostos foram preparados de acordo com os exemplos acima e os métodos descritos na

Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2004/0142883. Os compostos de dalbavancina individuais foram purificados por

HPLC.

Preparação da Amostra

Os compostos de N¹⁵-monometil dalbavancina e os compostos antibióticos de N⁷⁵, N⁷⁵-dimetila isolados foram dissolvidos em HC1 a 0,01 N:DMSO: 95:5 v/v. Antes da dissolução, cada amostra foi analisada por HPLC e quantificada. As soluções foram preparadas a 256 pg/ml para

os compostos de N'⁷⁵-monometil dalbavancina (dalbavancina Ao,

Ai, Bo, e Bi) e a 128 μ9/πι1 para o antibiótico de N¹⁵ f N¹⁵dimetila Bo isolado (referido como dalbavancina B₂ nas tabelas abaixo).

A pureza cromatográfica do pico principal foi avaliada em % de área vs. área do cromatograma total, descrito na Tabela 41:

como

283

TABELA 41

PUREZA CROMATOGRÁFICA DQ PICO PRINCIPAL DE DIVERSOS

COMPOSTOS DE N^J5-MONOMETILA E ANTIBIÓTICOS N^J5 _ZN^J5-DIMETILA

ID	Status	Concentração	% do Pico Principal
dalbavancina Ao	Solução	256	82
dalbavancina A-;	Solução	256	80
dalbavancina Bo	Solução	256	96
dalbavancina Bi	Solução	256	79
dalbavancina B2	Solução	128	72

Caracterização Microbiológica

Os compostos testados incluiram os compostos de

N^J5-monometil dalbavancina e os compostos antibióticos de

N¹⁵, N^J5-dimetila descritos acima, bem como a composição de dalbavancina (DA 025/A) compreendendo um composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dimetila, a vancomicina (VA) (Sigma Chemical

Co.,

St. Louis, MO), a Gentamicina (GE) (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO), a Penicilina G (Pen.G) (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO), e a Anfotericina B (Amph.B) (Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO).

Microorganismos

Os microorganismos usados eram cepas de referência, obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), do SmithKline and French Laboratories (SKF), e da Upjohn Company (UC) (Kalamazoo, MI).

Determinações das Concentrações Mínimas Inibitórias (MIC)

As MICs foram determinadas pela metodologia da microdiluição do caldo, seguindo o procedimento de NCCLS padrão (Documento de NCCLS M7-A6, Vol. 23, N- 2, Methods

284 for dilution antimicrobial susceptibility tests for bactéria that grow aerobically Approved Guideline. janeiro de 2003, que pode ser aqui incorporado por referência em sua totalidade) , com ou sem 30% de soro bovino (BS) adulto (PAA

Laboratories GmBH, Haidmannweg Pasching Áustria), usando inóculos bacterianos em aproximadamente 5x10⁵ CFU/ml. Os

meios empregados incluíam o caldo de Müller Hinton de cátion ajustado (Difco Laboratories, Detroit, MI), que foi ajustado com CaCl? e MgCl₂ para uma concentração final de 20 mg/L e

10 mg/L, respectivamente. Os testes foram lidos seguindo 2024 horas de incubação a 35°C.

Resultados

Os resultados das MICs são resumidos na Tabela 42 abaixo. Contra um painel de bactérias gram-positivas, a 15 atividade dos diversos compostos de Nⁱ⁵-monometil dalbavancina isolados e do composto antibiótico de ΝΓ¹⁵, N^J5-dimetila ou ligeiramente maior do que a

composição de DA, a qual compreende uma mistura dos de

N¹⁵, N^I5-dialquila. A solução branco (HC1 0,01N / DMSO 95:5), usada para dissolver em os compostos de teste, era inativa.

Significativamente, o composto antibiótico de

N¹⁵f N^J5-dimetila (B2) mostrou atividade contra as bactérias gram-positivas que era comparável aos, ou maior do. que os, 25 compostos de N¹⁵-monometil dalbavancina. Por exemplo, a atividade do composto antibiótico de N¹⁵, N^I5-dimetila (B₂) é comparável á, ou maior do que a, atividade de B_o através da faixa de bactérias gram-positivas.

285

Bem significativamente, o composto antibiótico de

N¹⁵, N^I5-dimetila (B₂) também mostrou atividade contra a faixa de bactérias gram-negativas testadas. Na realidade, o único composto que era ativo contra o painel representativo de bactérias gram-negativas neste ensaio era o composto antibiótico de N¹⁵, N^J5-dimetila (B₂) isolado, que mostrou atividade com uma faixa de MICs de 16-32 mg/L.

Os valores das MICs dos compostos de referência VA e GE contra as cepas de dos valores de NCCLS.

referência da ATCC estavam na faixa

TABELA 42

ATIVIDADE IN VITRO DOS DIVERSOS COMPOSTOS ANTIBIÓTICOS DE

N¹⁵,N^J5-DIALQUILA E DAS CEPAS DE REFERÊNCIA

Microorganismo	Ao	Al	Bq	Bl
Staphylococ.cus aureus	0,125	0,125	0,25	0,125
Smith ATCC 19636
Ξ.aureus Smith+30% BS	1	2	2	2
cepa de ref. de S. aureus ATCC 292131	0,125	0,125	0,125	0,125
S.epidermidis ATCC 12228	0,125	0,125	<0, 06	<0, 06
Streptococcus	0, 015	£0, 06	<0,06	£0, 06
pyrogenes SKF 13400 S.pneumoníae Felton UC41	0,125	£0, 06	£0,06	<0, 06
Enterococcus faecalis	0,125	0, 125	0,125	0,125
ATCC 7080
Cepa de ref.de F.. faecalis ATCC 292122	£0,06	0,125	0,125	0,125
Bacillus subtilis ATCC	<0, 06	£0, 06	£0,06	£0,06
6633
Escherichia coli SKF	>64	>64	>64	>64
12140
Cepa de ref.de E.coli ATCC259223	>64	>64	>64	>64
— Proteus vulgaris ATCC	>64	>64	>64'	>64
881
Pseudomonas	>64	>64	>64	>64
aeruginosas ATCC 10145 Cândida albicans SKF	>64	>64	>64	>64

MIC (mg/L)

b2	DA	Bran-
025/A	VA	GE	Pen. G	Amph.B	CO*
0,125	0,25	1	0,5	0,06	>64	>1:2
2	2	2	£0,125	0, 06	>64	>1:2
0, 125	0,25	2	8	8	>64	>1:2
£0,03	0,125	2	<0,125	>32	>64	>1:2
£0,03	0,06	1	4	£0, 03	32	>1:2
£0, 03	0,015	0,5	8	£0,03	>64	>1:2
0, 06	0,25	1	8	32	>64	>1:2
0,125	0,25	2	32	4	>64	>1:2
£0, 03	<0,007	£0,125	0,25	£0,03	>64	>1:2
32	>64	>128	2	>32	>64	>1:2
32	>64	>128	1	>32	>64	>1:2
32	>64	>128	2	>32	>64	>1:2	—
16	>64	>128	1	>32	>64	>1:2
32	>64	>128	>128	>32	0,125	>1:2

2270

470

286 * Menor fator de diluição não mostrando atividade.

Faixa de controle de qualidade das MICs para as cepas de referência (NCCLS M100 S-12, Vol. 22, N- 1, jan. de 2002):

¹ VA 0,5-2 mg/L ² VA 1-4 mg/L ³ GE 0,25-1 mg/L

Exemplo 20

Preparação de uma Composição de Dalbavancina Compreendendo a Dalbavancina B₂

Uma composição compreendendo a dalbavancina B_o a dalbavancina Bi e a dalbavancina B₂ purificadas foi produzida por HPLC preparativa.

Uma mistura de dalbavancinas preparada de acordo com os métodos acima descritos foi purificada por HPLC. A purificação foi efetuada sobre uma Kromasil Cl 8, 16 μη, tamanho de poro de 100 Â. O sistema de tampão foi uma solução aquosa de NH₄H₂PO₄ a 50 molares, com o pH ajustado para 5,5. A fase móvel para a eluição foi uma mistura a 66/34 de tampão/acetonitrila. 0 processo produziu uma composição de dalbavancina compreendendo 97% de dalbavancina 15 B_o, dalbavancina Bi e dalbavancina B₂ através de análise por HPLC. Um cromatograma típico de HPLC analítica está na Fig.

37, com a dalbavancina B_o em torno de 29, 901, a dalbavancina Bi em torno de 30,79 (não marcada) e a dalbavancina B₂ em torno de 33,282.

Caracterização da IsoB₀

O espectro de massa da IsoBo (Fig. 38) mostra um íon em m/z 1817, correspondendo à molécula mono-protonada, e outros íons devidos aos adutos de cátions ou às fragmentações parciais da fonte. O peso molecular de 1816 Da e o padrão de

287

4/7/ fragmentação são os mesmos que aqueles observados para os componentes de Β, o que suporta a identificação de IsoBo como um diastereoisômero de B_o (a mesma molécula, com um ou mais estereocentros tendo quiralidade invertida).

0 nível de IsoB₀ foi verificado aumentar sempre que o pH aumentava muito nas diversas etapas de preparação. Portanto, a IsoB₀ foi preparada por tratamento básico da dalbavancina.

Preparação da amostra (BI-K0096)

Aproximadamente 300 mg de IsoBo foram obtidos a partir de 10 g da batelada de dalbavancina 027 por tratamento longo (aproximadamente 165 horas) com. NaOH em água (pH 12,7), na temperatura ambiente. Após a neutralização, o produto de reação foi recuperado como um sólido bruto marrom que foi submetido a uma purificação cromatográfica dupla sobre uma coluna de silica gel silanizada, efetuada eluindo com água (pH 3,5; ácido acético)/acetonitrila em um modo de gradiente em etapas.

A partir das frações ricas, uma área de 79,98% de sólido de BI-K0096 foi isolada. O perfil de HPLC é reproduzido na Fig. 39.

Para verificar a correspondência do BI-K0096 com a impureza de dalbavancina IsoBo, o composto BI-K0096 preparado foi analisado por HPLC usando três métodos diferentes. Em todas as condições testadas, ο BI-K0096 era cromatograficamente idêntico à impureza de IsoBo ·

288

47-3

Análise Estrutural

Os espectros de EM e EM/EM são descritos nas Figs.

A-C. Estes espectros de massa são idênticos àquele do componente B_o. A partir desta análise de massa, não é 5 possível confirmar a variação estereoquimica.

Os espectros de RMN e ¹³C, registrados em DMSOd⁶ em um espectrômetro de 600 MHz, revelaram muitas similari-dades com os espectros da dalbavancina, porém também diferenças importantes (ver as Figs. 41 e 42, 10 respectivamente) . As designações para IsoBq e B_o são descritas na TABELA 43 e as posições correspondentes dos prótons são identificadas na Fig. 43.

TABELA 43

Designações de RMN da Dalbavancina Iso B_o

Designação	iso Bo	Designação	iso Bo
8^	813C	8¼	813C
wl	n.a.	-	6e	n.a.	n.a.
ch3	2,24	33,70	6f	7,42	126, 9
xl	4,26	64,65	w7	8,56	-
lb	7,13	120,5	x7	4,45	n.a.
le	6, 82	116, 6	7d	4,45	n.a.
lf	6, 97	120,87	7f	6,43	108,18
w2	8,19	-	AGÍ	5,23	102,0
x2	4,53	55, 67	AG2	3, 72	55, 91
z2	2, 80	38, 59	AG3	3,55	n.a.
2b	7,01	n.a.	AG4	3, 48	n.a.
2c	6,90	n.a.	AG 5	3,26	n.a.
2e	7,29	n.a.	AG-NH	7,60	-
2f	7,22	n.a.	FA2	2,0	n.a.
w3	8,44	-	FA3	1,41	n,a.
x3	5,34	54,65	FA4-FA9	1,11-1,30	n.a.
3d	6, 51	104,7	FA10	1,49	n.a.
3f	6, 0	101,36	FA11	0, 84	n.a.
w4	8,59	-	FA12	0, 85	n.a.
x4	5, 38	55,07	wNN	8,05	n.a.

47d

289

Designação	iso Bo	Designação	iso Bo
0¾	813C	δχΗ	S13C
4b	5,74	109,07	NNa	3,15;3,23	n. a.
4f	5,12	104,5	NNb	1, 63	n. a.
w5	8,32	-	NNc	2,30	n.a.
x5	4,56	53,20	NNd	2,16	n.a.
5b	7,16	135,3	Ml	5,21	97,7
5e	6,70	115,88	M2	n. a.	n.a.
5f	6,70	n· a.	M3	n.a.	n.a.
w6	6,59	-	M4	n.a.	n.a.
	4,21	62,04	M5	n. a.	n.a.
26	5,26	71,27	M6	n.a.	n.a.
6b	7,77	126, 8

Para algumas partes da molécula, os deslocamentos químicos de prótons e carbonos são aproximadamente os mesmos que para o componente de Bo. Os desvios dos deslocamentos químicos principais são observáveis para os sinais que 5 pertencem à seqüência de aminoácidos 1-4. Os prótons destes sistemas de spin mostram uma Δδ (diferença do deslocamento químico) positiva ou negativa insignificante. O aminoácido 3, em particular, exibe o maior número de mudanças relevantes (x3, w3, 3f, 3d) ; x3 é também a única ressonância que mostra uma modificação importante de seu ³Jhhz a constante de acoplamento CH(x3)-NH(w3) é agora 6,54 Hz comparada a cerca de 10,4 em B_o. Além disso, os experimentos de ROESY indicam diferenças nas correlações dipolares para x3, bem como para a maioria dos prótons próximos a x3. As verificações por RMN 15 descritas e os dados da literatura publicados sobre epímeros de teicloplanina tornam claro que x3 é o centro de epimerização e a epimerização induz uma mudança na conformação em pelo menos uma parte da molécula.

290

Caracterização Microbiológica

Os compostos usados eram:

IsoBo como anteriormente descrito acima

Chemical

Dalbavancina (DA) (BI-K397,

Vancomicina (VA) (batelada

St. Louis, MO,

EUA) .

batelada

121K1140,

025/A/

Sigma

Gentamicina (GE) (batelada

57H1099,

Sigma

Chemical

St. Louis, MO,

Penicilina G

EUA) (Pen.G) (batelada 43H1134,

Sigma

Chemical

St. Louis, MO,

EUA)

Anfotericina

B (Amph.B) (batelada 61H4039,

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA).

A Vancomicina, a Dalbavancina e a Anfoterici15 na B foram dissolvidas a 10 mg/mL em sulfóxido de dimetila (DMSO) e diluídas em água destilada; a gentamicina e a

Penicilina G foram dissolvidas em água destilada.

Meios

Caldo Müller Hinton (Difco Laboratories, Detroit,

MI, EUA) ajustado com CaClz e MgCl? para concentrações finais de 20 mg/L e 10 mg/L, respectivamente.

Soros

Soro bovino (BS) adulto (batelada A05123-159 PAA Laboratories GmBH, Haidmannweg Pasching, Áustria).

Microorganismos

Os microorganismos usados são cepas padrões de referência da American Type Culture Collection (ATCC,

291

Rockville, EUA) , do Smith Kline and French Laboratories (SKF) e da Upjohn Company (UC, Kalamazoo, Michigan, EUA) .

Concentração Mínima Inibitória (MIC)

As MICs foram determinadas pela metodologia de microdiluição de caldo seguindo o procedimento padrão de

NCCLS [13], com ou sem soro bovino a 30%, usando inóculos bacterianos de aproximadamente 5x10⁵ CFU/mL. Os testes foram

lidos após incubação de 20-24 h a 35°C.

Resultados

Contra um painel de bactérias gram-positivas, a atividade do isoBo é muito similar à dalbavancina. (Ver a

TABELA 44)

TABELA 4 4

Atividade In Vitro do IsoBo e dos Compostos de Referência

Microorganismo	MIC (mg/L)
isoBo	DA 025/A	VA	GE	Pen. G	Amph.B	Atividade em branco*
Staphylococcus aureus Smith ATCC 19636	0,5	0,25	1	0,5	0,06	>64	>1:2
S.aureus Smith+30% BS	16	2	2	£0,125	0,06	>64	>1:2
cepa de ref. de S. aureus ATCC 292131	0,25	0,25	2	8	8	>64	>1:2
S.epidermidls ATCC 12228	0, 125	0, 125	2	£0,125	>32	>64	>1:2
Streptococcus pyrogenes SKF 13400	0,06	0, 06	1	4	<0,03	32	>1:2
S.pneumoniae Felton UC41	0,125	0, 015	0, 5	8	<0,03	>64	>1:2
Enterococcus faecalis ATCC 7080	0,25	0,25	1	8	32	>64	>1:2
Cepa de ref.de E.faecalis ATCC 292122	0,25	0,25	2	32	4	>64	>1:2
Bacillus subtilis ATCC 6633	<0,06	<0,007	<0,125	0,25	<0,03	>64	>1:2
Escherichia coli SKF 12140	64	>64	>128	2	>32	>64	>1:2
Cepa de ref.de E.coli ATCC259223	64	>64	>128	1	>32	>64	>1:2
Proteus vulgaris ATCC 881	>64	>64	>128	2	>32	>64	>1:2
Pseudotnonas aeruginosas ATCC 10145	>64	>64	>128	1	>32	>64	>1:2
Cândida albicans SKF 2270	>64	>64	>128	>128	>32	0,125	>1:2

92

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplos, para os propósitos de claridade de entendimento, será aparente para aqueles versados na técnica que certas mudanças e 5 modificações podem ser praticadas, sem sair do espírito e do escopo da invenção. Portanto, a descrição não deve ser interpretada como limitando o escopo da invenção, que é delineado pelas reivindicações em anexo.

Todas as publicações, patentes, e pedidos de 10 patentes citados aqui são, pelo presente, incorporados por referência em sua totalidade, para todos os propósitos e na mesma proporção como se cada publicação, patente, ou pedido de patente individual fosse especifica e individualmente indicado ser assim incorporado por referência.

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica

CARACTERIZADA por compreender:

o fator de dalbavancina B0, B2 e pelo menos um fator de dalbavancina adicional selecionado a partir do grupo consistindo nos fatores de dalbavancina A0, A1

B1, C0, C1 isoB0, e

MAG;

em que a composição farmacêutica compreende de 80% a 98% em peso de fator B₀ e em que um teor de acetona não excede

2,5% (p/p);

um estabilizador, em que o estabilizador é uma combinação de manitol e lactose.

Composição farmacêutica, de acordo com reivindicação 1, CARACTERIZADA por a composição compreender os fatores de dalbavancina B0, B2 e MAG, e em que um teor de MAG é menor que 3,0%.