BRPI0507244B1

BRPI0507244B1 - Processo para maturação de queijo ou um produto derivado de queijo e uso de carboxipeptidase-1 de aspergillus niger

Info

Publication number: BRPI0507244B1
Application number: BRPI0507244-1A
Authority: BR
Inventors: Albertus Alard Van Dijk; Baukje Folkertsma; Petrus Jacobus Theodorus Dekker Dekker
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-26
Publication date: 2019-09-24
Also published as: CA2554258C; JP2011172591A; US20070160711A1; CA2554258A1; PL1705998T3; BRPI0507244A; EP1705998A1; EA200601397A1; CN1913783A; AU2005211178A1; JP2007519410A; EP1705998B1; WO2005074695A1; NZ548762A; EA013237B1; US20140205717A1; ES2487440T3; AU2005211178B2; DK1705998T3

Abstract

carboxipeptidase para maturação de queijo a presente invenção se refere a um processo para o desenvolvimento de sabor em um alimento fermentado no qual um carboxipeptidase é usada.

Description

PROCESSO PARA MATURAÇÃO DE QUEIJO OU UM PRODUTO DERIVADO DE QUEIJO E USO DE CARBOXIPEPTIDASE-1 DE ASPERGILLUS NIGER Campo da Invenção [001] A presente invenção se refere à maturação de queijo.

Antecedentes da Invenção [002] O sabor de produtos alimentícios é um dos atributos chave para o consumidor. Em produtos fermentados, por exemplo, produtos da indústria de laticínios, sabores são derivados de componentes do leite através de atividades enzimáticas de microorganismos. No queijo, por exemplo, vários compostos de sabor têm sido identificados como sendo essenciais e muitos deles são derivados da degradação de caseína. Outros processos enzimáticos, tais como lipólise, também estão envolvidos, mais notavelmente em queijo onde fungos estão envolvidos no processo de maturação, por exemplo, queijo Camembert e Roquefort. Além disso, a fermentação de lactose poderia levar aos compostos de sabor, tais como ácido propiônico (Smit e colaboradores, Food Res. Int. (2000) 33, 153 - 160).

[003] A proteólise em queijo, durante a maturação, representa um papel vital no desenvolvimento de textura, bem como sabor e tem sido objeto de diversas análises (veja, por exemplo, McSweeney & Sousa, Lait (2000) 80, 293 - 324) . A proteólise contribui para mudanças texturais da matriz do queijo, devido à ruptura da rede de proteínas, diminuição em aw, através de ligação à água por carboxila liberada e grupos amino e aumento no pH, o que facilita a liberação de compostos saborosos durante a mastigação (Sousa e colaboradores, Int. Dairy Journal (2001)), 11, 327

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- 345). Ela contribui diretamente para o sabor e a falta de sabor (por exemplo, amargo) de queijo através da formação de peptídeos e aminoácidos livres, bem como liberação de substratos (aminoácidos) para mudanças carboxílicas secundárias, isto é, transaminação, desaminação, descarboxilação, dessulfurização, catabolismo de aminoácidos aromáticos e reações de aminoácidos com outros compostos. A taxa e o padrão da proteólise podem ser influenciados pela localização dentro do queijo.

[004] A maturação de queijo é um processo que consome tempo, envolvendo reações complexas e bem balanceadas entre glicólise, proteólise e lipólise dos componentes do leite. Na maioria dos queijos, enzimas bacterianas representam um papel importante nesse processo. É bem conhecido que a mudança do teor de enzima bacteriana no queijo afeta diretamente a taxa de maturação do queijo e seu sabor final (Klein & Lortal, Int. Dairy Journal (1999) 9, 751 - 762) . Uma maneira de influenciar a maturação do queijo é aumentar a quantidade de enzima bacteriana no coalho do queijo pela adição de todas as bactérias de ácido láctico, incapazes de se desenvolver e produzir níveis significativos de ácido láctico, mas ainda distribuindo enzimas de maturação ativas durante o envelhecimento do queijo. Os iniciadores, normalmente, são enfraquecidos e referidos como atenuados.

[005] Uma vez que essa maturação do queijo é um processo consumidor de tempo, ele também é caro. Os queijos precisam ser armazenados durante a maturação sob condições definidas precisamente para temperatura e umidade por semanas a meses. O tempo de maturação varia consideravelmente entre os vários queijos, de 3 semanas

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3/19 (por exemplo, mussarela) a mais de 2 anos (por exemplo, Parmesão, cheddar extra maduro). Qualquer processo que resultará em aceleração da maturação de queijo é interessante de um ponto de vista econômico, a mesma quantidade de queijo pode ser produzida em um intervalo de tempo mais curto.

[006] A proteólise no queijo é um processo muito complexo e proteases de várias origens estão envolvidas (para análise, veja, por exemplo, Fox & McSweeneu, Food Ver. Int (1996) 12, 457 - 509) . Essas proteases são o coagulante que foi usado durante a fabricação do queijo (por exemplo, quimiosina, pepsina ou proteinases de ácido fúngico), proteínas próprias do leite (por exemplo, plasmin), as proteases proporcionadas pelas bactérias iniciadoras, proteases de microflora anormal não iniciadora, proteases de um segundo inoculo (em algumas variedades, por exemplo, P. roqueforti, P. camemberti, Br. Linens), células bacterianas atenuadas e proteases exógenas. As células atenuadas e as proteases exógenas são ferramentas recentes no desenvolvimento da aceleração de maturação de queijo. A geração de aminoácidos livres é uma etapa importante na aceleração de maturação de queijo. Embora os aminoácidos livres contribuam para o aroma global do queijo, sua contribuição é relativamente pequena. Os aminoácidos são os precursores, que são, subseqüentemente, convertidos pelos microorganismos que estão presentes no queijo para compostos de sabor. A disponibilidade de aminoácidos, portanto, é importante para a formação de sabor do queijo e, assim, para a maturação de queijo.

[007] A principal alternativa para o uso de queijo

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4/19 natural em alimentos processados para o consumidor, requerendo um sabor de queijo, são concentrados para sabor de queijo de alta intensidade, tais como queijo modificado por enzimas (EMCs), pós de queijo e sabores de queijo (Kilcawley, Wilkinson & Fox, Int. Dairy Journal (1998), 8, 1 - 10). Os sabores de queijo não são produzidos para uso em queijo como tal, mas são produzidos para serem aplicados em outro alimento que contém, convencionalmente, queijo natural. Queijo é adicionado, tradicionalmente, a produtos como uma preparação seca de pulverização para otimização de sabor, aparência e textura. A quantidade de queijo usado varia e o sabor e a qualidade do produto depende do tipo de queijo usado. Queijo que foi tratado enzimaticamente para acentuar o sabor ou a porção significativa do perfile daquele queijo é considerado ser um EMC e proporciona ao fabricante uma nota de queijo forte em uma forma que é eficaz em custo, nutritiva e natural (Kilcawley, Wilkinson & Fox, Int. Dairy Journal (1998), 8, 1 - 10). EMCs têm um perfil de sabor que pode ser bastante diferente daquele de um queijo natural e ainda em diluição com uma base suave ou quase suave adequada, proporcionam a nota de queijo desejada no produto final. A base da tecnologia de EMC é o uso de enzimas específicas para produzir sabores de queijo típicos de substratos adequados. Proteases, termo que inclui tanto as endo-proteases quanto as exo-proteases, são enzimas importantes na produção de EMC. Seu papel é similar àquele na maturação de queijo. A proteólise em EMC é extensiva e produz tanto níveis de sabor quanto notas de amargo; estas últimas podem ser impedidas, removidas ou mascaradas por proteólise controlada, adição de

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5/19 exopeptidases específicas ou inclusão de agentes de mascaramento, por exemplo, queijo maduro ou glutamato de monossódio (Wilkinson & Licawley, Boletim do IDF (2002), 371, 10 - 15).

[008] Muitas proteases estão envolvidas na geração desses sabores de queijo. A geração do sabor adequado para um queijo (ou produto derivado de queijo como EMC) requer um equilíbrio delicado de atividades proteolíticas das proteases envolvidas. Qualquer desequilíbrio facilmente levará aos sabores que não são desejados, como o desenvolvimento de um gosto amargo. Especialmente o desenvolvimento de amargo no queijo (ou EMC) foi bem descrito e documentado (veja, por exemplo, LeMieux & Simard, Lait (1991) 71, 599 - 636; Lemieux & Simard, Lait (1992) 72, 335 - 382). O desenvolvimento de proteases para queijo ou EMC para acentuar processos de maturação é, portanto, um processo muito delicado e complicado. Exoproteases são preferidas em relação às endo-proteases porque elas têm uma tendência inferior para induzir a formação de amargo. As endo-proteases são conhecidas para introduzir facilmente esse amargo e, portanto, não são usadas, de preferência. Há, porém uma necessidade industrial clara por enzimas de maturação de queijo, tais como proteases e através dos anos diversas preparações de proteases comerciais têm sido introduzidas no mercado. Uma visão geral de produtos comerciais disponíveis é dada em diversos papéis (Wilkinson, van den Berg & Law, Boletim do IDF (2002) 371, 16 - 19; Kilcawley, Wilkinson & Fox, Food Biotechnol (2002) 16, 29 - 55; Kilcawley, Wilkinson & fox, Enzyme Microb. Technol. (2002) 31, 310 - 320). Exemplos

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6/19 incluem preparações de enzimas derivadas de espécies fúngicas (incluindo, mas não limitado aos mesmos,

Bioprotease P Conc e Bioprotease A conc de Quest, Países

Baixos, Protease M & Protease M & Protease A e protease

Ácida A de Amano, Promod 215 de Biocatalysts, Sternzyme B5026 de Stern, Flavourzyme MG/A de Novozymes, Dinamarca) e espécies bacterianas (incluindo, mas não limitado às mesmas, Protamex e Neutrase, de Novozymes, Dinamarca, Protease N, de Amano, Promod 24P e 24L, de Biocatalysts, Protease B500 de DSM, Países Baixos, e Protease 200L, de Rhodia Foods, França). As proteases variam consideravelmente em composição com relação à presença de proteases específicas e/ ou a relação em que essas proteases ocorrem em um produto específico. Os artigos de Kilcawley, Kilcawley, Wilkinson e Fox, referidos acima, mostram claramente que a maioria dos produtos de proteases comerciais são uma mistura de atividades de endo- e exopeptidases. Diversos produtos são desenvolvidos para conter apenas atividade de exo-peptidase. Para aplicações em alimentos, esses são, invariavelmente, amino-peptidases, e exemplos incluem DBS50 e DBP20 (da Rhodia, França),

Corolase LAP (de Rohm, Alemanha), Flavourzyme MG/A (de

Novozymes, Dinamarca), Accellerzyme AP (de DSM, Países Baixos) e Peptidase R (de Amano, Japão). As aminopeptidases são desenvolvidas e selecionadas e selecionadas para a liberação de amino ácidos, que são precursores importantes de sabor do queijo, tais como leucina, fenilalanina e valina. Diversos pedidos de patente (por exemplo, W096/38549) descrevem a preparação e o uso de amino peptidases, livres de endo-proteases, que podem ser

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7/19 usadas para acelerar a maturação de queijo. Embora haja uma descrição do uso de uma única carboxipeptidase do trigo para reduzir o amargor de peptídeos amargos de peptídeos da caseína do leite (Umetsu, Matsuoka & Ichishima, J. Agric. Food Chem (1983) 31,50- 53), não há descrição do uso de uma preparação de protease contendo uma única atividade de carboxipeptidase, que tenha sido útil para a aceleração de maturação de queijo. Preparações de proteases comerciais contendo atividade de carboxipeptidase são conhecidas (por exemplo, FlavorPro 192 de Biocatalysts), mas essas sempre contêm misturas de amino- peptidase, endo-protease e, possivelmente, outras atividades de protease, além da atividade de carboxipeptidase.

[009] A adição de protease para maturação de queijo pode ser feita em vários estágios da preparação do queijo. De preferência, as enzimas são adicionadas ao leite do queijo antes ou junto com a adição do coagulante (por exemplo, quimiosina). A adição nesse ponto assegura uma distribuição homogênea das enzimas por todo o queijo. Alternativamente, as enzimas podem ser adicionadas em um estágio posterior, por exemplo, durante o estágio de salgação na fabricação do Cheddar, mas isso introduz o risco de distribuição não homogênea de enzima no queijo e formação de chamados pontos quentes. Por aquela razão, a adição das enzimas ao leite do queijo é preferida. Uma desvantagem é que a maior parte da enzima (60-90%), freqüentemente, não é incorporada no coalho do queijo e é descartada na fração de soro do leite, onde pode dar origem a (proteólise) indesejada, que torna o soro do leite menos ou não adequado para outras aplicações. Especialmente,

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8/19 endo-proteases, com atividade significativa em pH5-7, poderiam tornar essas atividades colaterais indesejadas, mas também amino peptidase, que, freqüentemente, tem atividade ótima nessa faixa de pH, pode dar origem à formação, por exemplo, de sabores indesejados. Outro problema potencial, especialmente da adição de endoproteases ao leite do queijo, é que elas interferem com o processo de coagulação, dando origem à hidrólise específica, levando à redução do rendimento do queijo. Também amino-peptidases podem causar perdas de rendimento, uma vez que elas, usualmente, são bem ativas em pH6-7, a faixa de pH usual da fabricação de queijo. Proteases que não são ou quase não são ativas em valores de pH durante a fabricação do queijo, mas que se tornam ativas no queijo, são preferidas porque elas não interferem com o processo de fabricação do queijo e não causarão reações indesejadas no soro do leite.

Descrição da Invenção [010] De acordo com a presente invenção, maturação acelerada de queijo pode ser obtida pelo uso de carboxypeptidases. A preparação de carboxipeptidase será livre de atividade de endo-proteases e será capaz de pelo menos liberar aminoácidos, que são importantes para a formação do sabor do queijo, tais como leucina, fenilalanina, valina e metionina. A carboxipeptidase é adicionada em níveis de atividade entre 1 e 2500 CPG/g de substrato (por exemplo, leite do queijo), de preferência, 1-250 CPG/g de substrato ou, mais preferivelmente, 1-25 CPG/g de substrato. Unidades de CPG são definidas no exemplo 1. A atividade da protease é medida pela hidrólise

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9/19 de uma caseína (6 g/L na solução de ensaio) em pH 6,0, 4°C, por 1 hora. 1 PU é a quantidade de enzima que produz, em um minuto, um hidrolisato (solúvel em TCA, cuja absorvência (280 nm) é igual a uma solução de tirosina de 1 μΜ) . A preparação de carboxipeptidase é definida como livre de atividade de endo-protease quando a proporção de atividade de endo-protease (PU) /carboxipeptidase (CPG) na preparação é menor do que 0.01, de preferência, menor do que 0.001 e, mais preferivelmente, menor do que 0.0005. A carboxipeptidase é, de preferência, uma carboxipeptidase de espectro amplo, que é capaz de líber a maior parte dos aminoácidos naturais dos peptídeos ou proteínas. Carboxipeptidase de espectro amplo é definida como uma enzima que é capaz de liberar pelo menos 80% dos aminoácidos em quantidades detectáveis pelo método conforme descrito no exemplo 3 desta aplicação. De preferência, a preparação de carboxipeptidase contém uma carboxipeptidase em que 90% da atividade da carboxipeptidase é causada por uma única enzima, medida como descrito no exemplo 1, mas combinações de carboxipeptidases também são permitidas.

[011] Os requerentes verificaram, surpreendentemente, que o uso de uma carboxipeptidase purificada CPD I (PEPG) de um tipo de Aspergillus é bem capaz de por si própria acelerar a maturação de queijo. Exemplos de Aspergilli adequada são A. niger, A. Oryzae e A. sojae. De preferência, CPD 1 de A. niger é usado. A enzima foi descrita (Dal Degan, Ribadeau-dumas & Breddam, Appl. Environ. Microbiol (1992) 58,2144-2152) e sequenciada (Svendsen & Dal Degan, Bioch. Biophys. Acta (1998) 1387,369-377). A carboxipeptidases também pode ser usada

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10/19 para acelerar o desenvolvimento de sabor do queijo em EMCs. Outras aplicações preferidas da carboxipeptidase estão no campo de desenvolvimento de sabor em alimentos fermentados, como lingüiças e cervejas fermentadas em que, similar à situação no queijo, a disponibilidade de aminoácidos livres, como valina, leucina, isoleucina e fenilalanina, bem como enxofre contendo aminoácidos, como metionina, são conhecidos por serem de importância particular.

Legendas para a Figura [012] A Figura 1 mostra o perfil de atividade em relação ao pH.

Exemplo 1

Clonagem de CPD-I (PEPG) [013] A seqüência de aminoácidos de carboxipeptidase I (PEPG) de A. niger é descrita (Svendsen & Dal Degan, Bioch. Biophys. Acta (1998) 1387, 369-377). Iniciadores de PCR degenerados foram destinados a clonar o gene de pepG de uma biblioteca genômica de Aspergillus niger N400 (CBS 120.49), usando métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. O gene foi fundido à 3'extremidade do promoter de glucoamilase. Exemplos análogos de fusões de genes estruturais ao promoter de glucoamilase têm sido descritos (EP-A-0420358, EP-A-0463706 e W099/38956) . O primeiro gene estruturas de pepG foi amplificado por PCR de um fragmento genômico contendo o gene e purificado. Em segundo lugar, a região de promotor do gene de glaA foi amplificada por PCR usando, na 3' extremidade, um iniciador que sobrepõe a 5'extremidade do gene estrutural de pepG. Terceiro, os dois framentos de PCR foram fundidos através de PCR de fusão com um iniciador de oligonucleotídeo 5' do promotor de

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11/19 glaA e um oligonucleotídeo sobrepondo o códon terminal (stopcodon) de pepG na direção reversa. Quarto, o fragmento de fusão resultante foi clonado no vetor de expressão A niger pGBTOP7 (WO99/38956), resultando em um plasmídeo de fusão contendo promotor de glaA, gene estrutural de pepG e o terminador de glaA. Esse plasmídeo foi digerido com Hindlll e co-transformado com pGBBAAS-1 digerido com XhoI para Aspergillus niger ISO502, essencialmente como descrito em WO 99/38956. Transformantes selecionados para crescimento em placas de acetamida foram analisados usando PCR de colônia para verificar a presença de cassete de expressão de pepG, usando técnicas conhecidas. A seqüência de gene foi determinada e a seqüência de DNA genômico, a seqüência de codificação e a seqüência de aminoácido correspondente são dadas como SEQ ID NO.: 1,2 e 3, respectivamente. Transformantes de A. niger pepG foram cultivados em frasco de agitação, usando métodos conforme descrito previamente (WO 99/38956). Após crescimento durante 6 dias em 34° C, sobrenadantes foram analisados em atividade. A atividade de PEPG foi determinada pela adição de 10 μ l do sobrenadante da cultura em 9 90 μ l de uma solução contendo 45 mM de acetato de Na (pH 4,5); 0,95 mM de EDTA e 0,2 mM FA-Phe-Ala (obtido de Bachem) . A mudança na densidade óptica em 337 nm foi seguida. A diminuição na densidade óptica é uma medida para a atividade de PEPG. Uma unidade de enzima (1 CPG) é definida como a quantidade de enzima necessária para diminuir a densidade óptica em 337 nm por 1 unidade de absorvência por minuto sob as condições de teste. O transformante usando o valor mais alto de CPG por ml foi selecionado para expressão de PEPG.

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Exemplo 2

Purificação de PEPG [014] PEPG foi purificado do caldo de cultura de Aspergillus niger, expressando a enzima de acordo com o método descrito (Dal Degan, Ribadeau-dumas & Breddam, Appl. Environ. Microbiol (1992) 58, 2144-2152) com a exceção de que a etapa de CABS- Sepharose foi omitida. A atividade da enzima final substancialmente purificada foi estabelecida ser 150 CPG/ml, usando a medição de atividade conforme descrito no exemplo 1. A atividade da endo-protease estava abaixo dos limites de detecção (< 0,6 PU/ml). A produção e a purificação de PEPG foram repetidas, rendendo uma preparação final contendo atividade de carboxipeptidase de 650 CPG/ml e atividade de endo-protease de 2,25 PU/ml. A proporção PU/CPG para a última preparação foi 0,003.

Exemplo 3

Determinação da especificidade do substrato de PEPG [015] A especificidade de substrato do PEPG purificado foi determinada usando substratos Z-Ala-X, em que Z is benziloxicarbonila e X é qualquer um dos aminoácidos (um código de letra) A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y. Todos os substratos foram obtidos de Bachem, exceto quando X= Q ou T, substratos que foram obtidos de PEPSCAN (Países Baixos). A especificidade da enzima foi determinada em pH 4,0 e 40° C em soluções que continham 3 mM dos substratos de peptídeos. A reação foi iniciada pela adição de 5 μl de solução de enzima (440 unidades/ ml) a 95 μl das misturas de reação. Amostras foram tomadas para cada substrato imediatamente, em t=0 minutos e colocadas em lâminas de TLC (Merck HPTLC [lâminas 20X10 Sílica gel 60) ,

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13/19 outra amostra foi tomada após 45 minutos de incubação e também colocada na mesma lâmina de TLC. Como um controle, as soluções de substrato sem a enzima foram colocadas na mesma lâmina de TLC. A lâmina foi corada para grupos amino livres através de borrifação com uma pulverização de ninidrina pronta para uso (ACROS). A atividade da enzima foi classificada de - (nenhuma atividade), +/- (baixa atividade) a + (pouca atividade) a +++++ (atividade muito alta). Atividade muito alta (+++++) em um substrato particular é marcada quando todo o substrato já foi convertido na amostra de t=0. Os resultados são como segue:

X	Escore da atividade	Ref	X	Escore de atividade	Ref
A	+ +	490	M	+ + + + +	5820
C	nt	nt	N	+	nt
D	+	160	P	+/-	3
E	+ +	nt	Q	+ +	41
F	+ + + +	nt	R	+ +	130
G	+	5	S	+ +	70
H	+	10	T	+ +	nt
I	+ + + +	7090	V	+ + + + +	3380
K	+ + +	200	W	+	nt
L	+ + + + +	2950	Y	+ + +	nt

nt: não testado. Ref: dados extraídos de Dal Degan,

Ribadeau-dumas & Breddam, Appl. Environ. Microbiol (1992)

58, 2144-2152. Os números indicam valores de kcat/kM em min^-1 mM^-1.

[016] A tabela mostra que PEPG clonada e purificada é similar a uma descrita por Dal Degan, em 1992, mas há algumas diferenças inesperadas. A enzima, de preferência,

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14/19 libera os aminoácidos F, I, L, M e V. A preferência do gene clonado é, porém, diferente daquela descrita por Dal Degan e colaboradores, que tem a maior preferência para I, enquanto a enzima clonada mostra a atividade mais alta em L, M e V. Também, a enzima purificada é mais ativa em K, mais ativa do que, por exemplo, em A e D, o que é diferente dos dados descritos por Dal Degan e colaboradores. Claramente, a carboxipeptidase tem uma especificidade de substrato muito ampla e é capaz de lidar com todos os aminoácidos, exceto, possivelmente, C, que não foi testado.

Exemplo 4

Demonstração de maturação de queijo acelerada de PEPG em mini queijo (tipo Cheddar) [017] Queijos em miniatura foram produzidos como descrito por Shakeel-Ur-Rehman e colaboradores. (Protocolo para a fabricação de queijos em miniatura em Lait, 78 (1998), 607-620) . Leite de vaca em estado natural foi pasteurizado por aquecimento durante 30 minutos em 63°C. O leite pasteurizado foi transferido para garrafas de centrífugas de plástico, de boca larga (200 ml por garrafa) e resfirados para 31°C. Subseqüentemente, 0,72 ml de cultura de iniciação DS 5LT1 (DSM Gist B. V., Delft, Holanda) foi adicionado a cada um dos 200 ml de leite pasteurizado nas garrafas de centrifugas e o leite foi submetido à maturação durante 20 minutos. Então, CaCl₂ (132 μ L de uma solução de 1 mol.L^-1 por 200 ml de leite maturado) foi adicionado, seguido por adição do coagulante (0,04 IMCU por ml). No caso, o experimento envolveu o uso de PEPG, essa enzima foi adicionada junto com o coagulante. As soluções de leite foram mantidas durante 40

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15/19 minutos a 31°C até que um coágulo foi formado. O coágulo foi cortado manualmente por cortadores de arame estirado, espaçados 1cm em um quadro. A cura foi permitida por 2 minutos, seguida por agitação suave durante 10 minutos. Após o que a temperatura foi aumentada gradualmente para 39°C durante 30 minutos, sob agitação contínua da mistura de coalho/ soro de leite. Ao alcançar um pH de 6,2, as misturas de coalho/ soro de leite foram centrifugadas em temperatura ambiente durante 60 minutos em 1.700g. O soro de leite foi drenado e os coalhos foram mantidos em um banho de água em 36°C. Os queijos foram invertidos a cada 15 minutos, até que o pH tivesse diminuído para 5,2 -5,3 e foram, então centrifugados em t ambiente em 1.700g por 20 minutos. Após a fabricação, o queijo foi maturado em 12°C e análise sensorial foi realizada após 3 e 6 semanas de maturação e um painel mínimo de 3 pessoas.

[018] Diversas dosagens de PEPG para o leite de queijo foram usadas: 0(=controle), 5, 50 e 500 CPG/200 ml de leite de queijo. A adição de PEPG levou, claramente, a um aumento geral na intensidade do sabor, levando a um gosto mais maturado, quando comparado com o queijo de controle. Esse foi o caso em todos os níveis de adição de PEPG, ainda que o nível mais baixo (5 CPG/200 ml) requeresse 6 semanas de maturação para dar um efeito claro. Nas outras doses, (50 e 500CPG/ml) o efeito sobre o gosto já era óbvio após 3 semanas de maturação. Os resultados mostraram, claramente, que PEPG acelera o desenvolvimento do sabor do queijo e que o efeito era dependente da dose e que nenhum sem gosto tinha se desenvolvido.

Exemplo 5

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Demonstração de maturação de queijo acelerada de PEPG em queijo tipo Gouda [019] Queijos Gouda foram preparados em cubas de 200 L, usando a cultura de iniciação DelvoTec® DX31 D (obtido de DSM) e Maxiren600 (obtido de DSM; 55 IMCU/l de leite; DSM)como o coagulante, usando um protocolo padrão de fabricação de queijo Gouda conhecido por uma pessoa habilitada na técnica. O leite cru foi padronizado para uma relação de caseína para gordura de, aproximadamente, 0,9 e pasteurizado por 15 segundos em 72°C. PEPG foi adicionada imediatamente antes da adição de Maxiren, em um nível de 25CPG/L. Um queijo de controle foi preparado do mesmo lote de leite, usando o mesmo processo de fabricação, mas sem a adição de PEPG. Após a coagulação o coalho foi cortado e agitado por 20 minutos a uma velocidade baixa. Em seguida, o soro de leite foi substituído por água quente (40% de volume inicial) para aumentar a temperatura de 31°C para 36°C. Após isso, a mistura coalho/ soro do leite foi agitada, em uma velocidade crescente, por outros 30 - 40 minutos até que o coalho esteja firme o bastante para drenagem. O coalho foi arqueado e deixado por meia hora antes de ser colocado em moldes de 5 kg. Os queijos foram prensados, usando pressão crescente, por cerca de 4 horas após o que o queijo foi deixado repousar durante a noite. Na manhã seguinte, eles foram colocados em salmoura por 24 horas. Após permitir que os queijos secassem, um revestimento protetor foi colocado sobre os queijos e os queijos começaram seu período de maturação. Durante esse período, eles foram mantidos em 15° C, umidade relativa de, aproximadamente, 80%. Os queijos foram, regularmente,

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17/19 virados e revestidos durante o período de maturação. Os queijos foram organolepticamente avaliados após 6 semanas e 3 meses de maturação pelo uso de um painel treinado, consistindo de um número mínimo de 8 pessoas. Após 6 semanas, o queijo contendo PEPG recebeu escores significativamente mais altos para doçura, quando comparado com o queijo de controle. Após 3 meses de maturação, o queijo contendo PEPG era claramente diferente do queijo de controle, mostrando sabor significativamente maior e, também, cremosidade claramente diferente. O sabor de queijo do queijo contendo PEPG eram agradável e mais maduro, quando comparado com o queijo de controle. O experimento mostrou, claramente, que o PEPG acelera o desenvolvimento do sabor do queijo e que nenhum tipo de sem gosto se desenvolveu.

Exemplo 6

Demonstração do perfil do pH de PEPG [020] A reação de enzima foi determinada em tampões de vários pH. A solução tampão em pH 2,3 e 4 continha 0,1 M de fosfato de sódio; 0,05M de ácido cítrico e 0,05M de ácido acético; o tampão em pH 4,5 e 6 continha 0,05 M de fosfato de sódio; 0,05M de ácido acético e 0,05M Tris. O pH foi ajustado para o valor corrente, usando 4M HCl ou 4M de NaOH. A solução de substrato continha 8mM FA-Phe-Ala em metanol. A solução de ensaio continha 965 pl de tampão, 25 μl de solução de substrato e 10 μl de enzima purificada. As reações foram realizadas em 25°C, e mudança de absorção em 337 nm foi seguida por 10 minutos. A atividade relativa foi calculada da mudança na absorvência. Os resultados são a média de duas medições separadas, exceto para a medição

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18/19 no pH ser 4, que foi realizada em duplo em dois tampões

diferentes.	Os	resultados	são	dados na figura 1.
[021]	O	perfil	mostra	da	figura 1 que a enzima tem	um
pH ótimo	de	pH	4.	O ótimo	é,	claramente, maior do que o	pH
ótimo de	3,1	-	3,4	para a	carboxipeptidase descrita por	Dal

Degan (Dal Degan, Ribadeau-dumas & Breddam,Appl. Environ. Microbiol (1992) 58, 2144 - 2152 e referências nele citadas).

Exemplo 7

Uso de carboxipeptidase para preparação de queijo modificada por enzima [022] Uma pasta de queijo foi preparada de uma mistura de 90% de queijo Gouda de 5 semanas e 10% de queijo Gouda envelhecido, basicamente como descrito por Smit e colaboradores ( (1995). Modelo ch-easy: um modelo baseado em queijo para estudar a maturação de queijo. eM P. Etievant, Bioflavours. (pp. 185 - 190).

Preparação de EMC usando carboxipeptidase [023] Queijo Gouda novo (aproximadamente com 6 semanas) foi comprador de um super-mercado local e foi ralado finamente finely grated. MilliQ-água foi adicionado ao queijo ralado para alcançar um teor de água final de, aproximadamente, 50% e, após mistura, a pasta de queijo foi dividida em porções de 200 gramas em recipientes separados. A mistura foi aquecida durante 5 minutos em 80° C para eliminar o crescimento de micróbios. Um dos recipientes foi analisado para verificar a eliminação de crescimento de micróbios por análise de contagem de lâmina para bactérias, germes e mofo. Os outros recipientes foram armazenados em 4°C para uso posterior. Quando a ausência de crescimento de

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19/19 micróbios foi confirmada por análise de contagem de lâmina, as pastas de queijo preferidas nos recipientes restantes foram usadas.

[024] Antes de fazer as adições, a pasta de queijo foi aquecida até 55°C e resfriada suavemente para 30°C. Soluções de PEPG foram preparadas em MilliQ- água, contendo 1,6; 0,16 e 0,016 CPG/ml. Subseqüentemente, 2 ml de cada solução de PEPG foram adicionados aos recipientes individuais, contendo 200g de pasta de queijo e a mistura foi misturada através de agitação; a pasta de controle não continha PEPG algum, mas apenas milliQ. Os recipientes foram, então, armazenados em 17°C. Após 4 semanas, o sabor das pastas foi avaliado organolepticamente por um painel sensório. Concentrações crescentes de PEPG resultaram em intensidade claramente crescente de sabor das pastas de queijo. A PEPG, aparentemente, é útil em processos de EMC para gerar sabor do queijo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para maturação de queijo ou um produto derivado de queijo, caracterizado por utilizar uma carboxipeptidase-1 (CPD-1) de Aspergillus niger de SEQ ID NO.: 3.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da atividade da carboxipeptidase-1 ser causada em pelo menos 90% por uma única enzima.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato da proporção de atividade de endoprotease (PU) e da atividade de carboxipeptidase (CPG) ser menor do que 0,01.
4. Uso de uma carboxipeptidase-1 (CPD-1) no processo para maturação de queijo ou um produto derivado de queijo, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato da carboxipeptidase-1 (CPD-1) de Aspergillus niger apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 3.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser na preparação de EMC (queijo modificado por enzima).
6. Uso, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por compreender geração de sabor.