BRPI0418720B1 - método para cultivar a cepa de rhodococcus rhodochrous m33 produtora de nitrila hidratase, e, uso de meio de cultura - Google Patents

Abstract

"método para cultivar a cepa de rhodococcus rhodochrous m33 produtora de nitrila hidratase, e, meio de cultura" a invenção refere-se a um método para cultivar a cepa de rhodococcus rhodochrous m33 produtora de nitrila hidratase, empregando-se um meio de cultura que se baseia em um tampão de fosfato com de 12 a 60 mm e que atende a necessidade de fósforo das células, mantendo-se o valor do ph durante a cultura na faixa de 5,5 a 9,0, e, após o consumo da quantidade inicialmente carregada de glucose, adiciona-se ácido acético como nova fonte de carbono. a invenção refere-se também ao meio de cultura empregado no processo.

Description

“MÉTODO PARA CULTIVAR A CEPA DE RHODOCOCCUS RHODOCHROUS M33 PRODUTORA DE NITRILA HIDRATASE, E, USO DE MEIO DE CULTURA” A invenção refere-se a um método biotecnológico para cultura da cepa de Rhodococcus rhodochrous M33 produtora de nitrila hidratase, e a um meio de cultura empregado no método para incrementar o rendimento de biomassa apresentando uma alta atividade de nitrila hidratase. O desenvolvimento de métodos de produção biotecnológica industrial de compostos químicos levou a um maior interesse em microorganismos com enzimas especiais que podem ser usados para reações biocatalíticas selecionadas. Um exemplo disso é o método de produção biotecnológica para a síntese de amidas, sendo que referido método baseia-se na capacidade de alguns microorganismos em sintetizar nitrila hidratase, uma enzima que catalisa a conversão de nitritos de ácidos orgânicos às amidas correspondentes. Com relação a isto, cepas bacterianas que podem transformar o acrilonitrila em acrilamida são particularmente interessantes. O método de cultura dos respectivos microorganismos desempenha um papel importante na produção do biocatalisador ou biomassa cataliticamente ativa. Usualmente, encontram-se disponíveis duas opções para incrementar o rendimento da atividade enzimática por volume unitário de caldo de cultura (atividade total em U/ml): 1. ativar a síntese de enzima da célula (bacteriana), ou, em outras palavras, incrementar a atividade enzimática específica (U/mg de biomassa seca) 2. incrementar o rendimento de células ativas (biomassa ativa) por volume unitário de caldo de cultura.

Na Patente Britânica 2087926 A e na literatura de patentes indicada aqui descreve-se, inter alia, um método para cultivar a cepa N-774 de Corynebacterium (número de depósito FERM 4446 do Fermentation Research Institute). A cepa, que apresenta uma em um meio mineral contendo um composto de ferro solúvel em água em concentrações de pelo menos 0,2 mg/1 em conjunto com 1% em peso de hidrolisados de caseína (ácidos casamino). As desvantagens deste método são os altos custos dos hidrolisados de caseína e a baixa atividade de nitrila hidratase obtida: atividade específica = 53,3 U/mg, biomassa seca = 5,66 mg/ml, atividade total = 301,7 U/ml. É de conhecimento geral que nitrilas e amidas de ácidos orgânicos, particularmente ácidos propiônico e isobutírico, levam à indução de nitrila hidratase. Com relação a isto, pode-se inferir da Patente dos Estados Unidos n° 4.555.487 que a adição de referidos compostos, que são conhecidos como agentes indutores de enzima, ou indutores, no meio de cultura da cepa B 23 de Pseudomonas chlororaphis (FERM BP-187) e cepa PS 1 de Pseudomonas sp. (FERM BP-188) toma possível obter biomassa (5,36 g/1 de biomassa seca) com uma atividade específica de 62,65 U/mg e uma atividade total de 335,8 U/ml.

As desvantagens deste método residem no uso de indutores dispendiosos, e numa baixa atividade de nitrila hidratase das células obtidas. O meio de cultura descrito na EP 0115781 para incubação da cepa B23 de Pseudomonas chlororaphis (FERM BP-187) e cepa PS-1 de Pseudomonas sp. (FERM BP-188) contém não só os indutores descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 4,555,487, mas também um ou mais α-aminoácidos como agentes para incrementar a atividade de enzima. Por exemplo, α-aminoácidos, como cistina, cisteína, alanina, valina, metionina, etc. são usados numa concentração na faixa de 0,1 a 10,0 g/1. No entanto, a atividade específica da biomassa obtida desta maneira não excede 105,7 U/mg, e a atividade total não excede 428,1 U/ml.

Uma atividade maior de nitrila hidratase foi obtida com a incubação da cepa Rhodococcus rhodochrous M33, como descrito na Patente Alemã 4480132. Esta publicação mostra que, durante a cultura da cepa em um meio sintético contendo glucose (concentração de 5 g/1), é possível obter células mostrando uma atividade específica de até 200 U/mg e uma atividade total de até 360 U/ml. Uma vantagem substancial do método proposto é a simplicidade do meio, que não contém quaisquer componentes dispendiosos. No entanto, a elevação da concentração de glucose para 20 g/1 produz um incremento da atividade total que não excede 1368 U/ml.

Um método industrialmente vantajoso é aquele descrito na Patente Européia 0362829 para a cultura da cepa J1 de Rhodococcus rhodochrous (FERM BP-1478). No meio, que contém um indutor de baixo custo (uréia (concentração de 15 g/1) e compostos de cobalto divalente), o método de cultura proposto toma possível obter células que apresentam uma atividade específica de 578 U/mg. Para incrementar o rendimento de células (rendimento de biomassa), adiciona-se peptona e extrato de levedura no meio. No entanto, as atividades totais obtidas não excedem 2480 U/ml, porque o rendimento de biomassa é de apenas 4,3 g/1. A ampliação da escala do processo de cultura em condições industriais incrementou o rendimento de células para 28 g/1; acompanhado de uma queda da atividade específica de nitrila hidratase para 76 U/mg e uma redução da atividade total para 2100 U/ml (Yamada H., Kobayashi M., "Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide", Biosci. Biotech. Biochem., 60 (9), 1391-1400, 1996.

Outro método para cultivar a cepa de Rhodococcus rhodochrous M33 encontra-se descrito na literatura (Kim B-Y., Kim J-C., Lee H-H., Hyun H-H., "Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33", Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 11-17, 2001). Este método compreende uma fermentação de tipo batelada alimentada, com adição limitada de glucose, em um fermentador de 5 litros com um meio de cultura puramente sintético qüe consiste de KH2PO4, K2HPO4, FeS04 x 7 H20, EDTA-2Na, MgS04 x 7 H20, NaCl, CoCl2 x 6 H20, uréia e glucose. Mediante a introdução dosada constante de uma solução de glucose a 40% e três adições periódicas de CoCl2 x 6 H20 (0,01 g/1) à solução de glucose, obteve-se um rendimento de células de 24 g/1 e uma atividade específica de nitrila hidratase de 120 U/mg. No entanto, a atividade total obtida após um tempo de fermentação relativamente longo de aproximadamente 115 horas não excedeu 2880 U/ml.

Assim, ainda existe uma necessidade de métodos biotecnológicos para a cultura de cepas produtoras de nitrila hidratase que tomam possível incrementar o rendimento industrial de biomassa apresentando uma alta atividade de nitrila hidratase.

Portanto, é um objeto da presente invenção proporcionar um método do tipo referido.

Verificou-se, surpreendentemente, que um método para a cultura do Rhodococcus rhodochrous produtor de nitrila hidratase, por exemplo, a cepa M33, que é depositada sob o número de depósito DSM 14230 junto ao DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas de Células GmbH), Marschroder Weg 1 b, D-38124 Bmnswick, Alemanha, proporciona o objeto da invenção quando a cultura é realizada empregando-se um meio de cultura que se baseia em um tampão de fosfato de 12 a 60 mM, atende as necessidades de fósforo das células e mantém o pH na faixa de 5,5 a 9,0 durante a cultura, e a que se adiciona ácido acético como uma nova fonte de carbono após o consumo da glucose fornecida inicialmente.

De acordo com a invenção, emprega-se um meio de cultura que atende as necessidades de fósforo das células e toma possível manter o pH na faixa de 5,5 a 9,0 durante a cultura. De preferência, um meio de cultura do tipo referido contém extrato de milho como fator de crescimento adicional.

No método da invenção, é particularmeníe preferível usar um extrato de milho como fator de crescimento adicional no meio de cultura, por meio da adição do mesmo em forma de, por exemplo, licor de maceração de milho numa concentração de, por exemplo, de 1 a 10 g/1. O extrato de milho usado pode ser qualquer licor de maceração de milho que contenha os constituintes dos grãos de milho que passaram à solução em forma concentrada como um resultado de uma processo de maceração convencional. De acordo com a invenção, usa-se licores de maceração de milho, de preferência, fornecidos sob nome Cerestar 15840 pela Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld. O meio de cultura (abreviado a seguir como SI) que pode ser usado no método da invenção apresenta, de preferência, a composição a seguir (em g/1): a) 7,9 g/1 de Na2HP04 x 12 H20 b) 1,8 g/1 de KH2P04 c) de 0,02 a 0,04 g/1 de CoCl2 x 6 H20 d) 1,0 g/1 de MgS04 x 7 H20 e) 0 to 10 g/1 de extrato de milho f) de 20 a 90 g/1 de glucose g) de 4 a 20 g/1 de uréia Em particular, emprega-se um meio de cultura do tipo referido ao qual se adicionou o extrato de milho numa concentração de 1 a 10 g/1, de preferência, de 2 a 8 g/1 e, mais preferivelmente, de 2 a 6 g/1. Da forma mais preferível, o extrato de milho é usado numa concentração de 4 g/1 no meio de cultura. A base deste meio de cultura é um tampão de fosfato de 12 a 60 mM, que atende as necessidades de fósforo das células e assegura que o pH pode ser mantido na faixa de 5,5 a 9,0 durante a cultura, sendo que se usa glucose e ácido acético como fontes de carbono, e sendo que se usa ácido acético como uma nova fonte adicional de carbono além de glucose De forma muito preferível, emprega-se um tampão de fosfato 35,3 mM no método da invenção.

De maneira vantajosa, o meio de cultura contém de 20 a 90 g/1, de preferência, de 20 a 60 g/1 e, mais preferivelmente, de 20 a 40 g/1 de glucose como a fonte de carbono, particularmente para cultura em frascos agitados. Além de glucose, é possível usar ácido acético como uma fonte de carbono, sendo que as fontes de carbono são adicionadas, de preferência, por meio de um procedimento de duas fases, particularmente para cultura em fermentadores no laboratório ou em escala industrial. A primeira fase deste procedimento é caracterizada por crescimento celular iniciado, intensificado, de Rhodococcus rhodochrous M33 com base na primeira fonte de carbono fornecida inicialmente no meio, de preferência, 20 g/1 de glucose. Após consumo da glucose, a fermentação é continuada na segunda fase de uma maneira conhecida como processo de batelada alimentada, em que se usa ácido acético como uma fonte de carbono. O ácido acético menos caro pode substituir a glucose apropriada para cultura, e referido ácido acético assegura uma elevada atividade específica de nitrila hidratase e uma elevada atividade total.

De maneira vantajosa, o ácido acético pode ser adicionado altemativamente na forma de seus sais solúveis em água, sendo que acetato de sódio é particularmente preferido como um sal de acetato solúvel em água. Em uma concretização da invenção, o sal de acetato solúvel em água a ser usado de acordo com a invenção é dosado logo após o consumo da glucose, sendo que neste caso, o acetato de sódio que é usado preferivelmente pode ser adicionado em uma concentração de alimentação de 1 a 4 g/1. Prefere-se particularmente a adição de acetato de sódio numa concentração de alimentação de 3 g/1.

Em outra concretização do método da invenção, o sal solúvel em água de ácido acético, de preferência, acetato de sódio, esta presente na batelada inicial. Após o pH ter se elevado a pH de 7,5 a 8,5, adiciona-se então ácido acético como uma solução aquosa a de 20 a 50%, de preferência, a 30%. De maneira vantajosa, a solução aquosa de ácido acético é dosada em um sistema de alimentação com pH estabilizado com um pH de 7,5 a 8,5, particularmente em pH 7,9.

Adicionalmente, o método da invenção pode ser realizado dosando-se os componentes a serem adicionados, de preferência, CoCl2 x 6 H20 e uréia, em determinados momentos e em concentrações vantajosas durante a fermentação, sendo que o cobalto atua como um co-fator e a uréia como um indutor.

Em particular, dosa-se no meio de cultura de 4 a 20 g/1 de uréia e de 0,02 a 0,04 g/1 de CoCl2 x 6 H20 para indução da nitrila hidratase. De preferência, parte da uréia está presente como indutor na batelada inicial do meio, de preferência, numa concentração de 4 g/1, e o restante é dosado numa concentração de alimentação que, de preferência, é de 6 g/1 após o consumo da glucose fornecida inicialmente.

De acordo com a invenção, a adição do co-fator de CoCl2 x 6 H20 pode ocorrer misturando-se o CoCl2 x 6 H20, de preferência, numa concentração de alimentação de 0,01 g/1, sendo que o meio, no início da fase de crescimento exponencial, baseia-se em glucose como a fonte de carbono, e, depois, após o consumo da glucose, efetua-se a introdução dosada adicional, de preferência, em uma concentração de alimentação de 0,03 g/1.

Verificou-se surpreendentemente que o tempo de fermentação pode ser encurtado se o método da invenção for realizado dosando-se CoCl2 x 6 H20, de preferência, em uma concentração de alimentação de 0,01 g/1, no momento do início da fase de crescimento exponencial fase de crescimento exponencial. A cultura da cepa por meio do método da invenção ocorre em frascos dotados de defletores (culturas agitadas) e em fermentadores de laboratório e industriais a temperaturas que compreendem de 25 a 30°C durante um tempo de cultura de 48 a 170 horas. Em uma concretização preferida do método da invenção, o fornecimento de oxigênio durante a cultura, particularmente em fermentadores industriais, é controlado de tal forma que a pressão parcial relativa de O2 é superior a 30%, de preferência, £50%.

As vantagens do método da invenção para cultura da cepa de Rhodococcus rhodochrous M33 produtora de nitrila hidratase são que, usando o meio de cultura da invenção, particularmente quando se emprega extrato de milho como fator de crescimento adicional, é possível produzir não só grandes quantidades de biomassa contendo nitrila hidratase (rendimento de até 39,5 g/1 de biomassa seca), mas também uma biomassa apresentando uma elevada atividade específica de (até 315 U/mg), embora seja possível obter uma atividade total de nitrila hidratase de 7169 U/ml, como se pode inferir dos exemplos abaixo.

Em contraste com o conhecido método para a cultura de cepas produtoras de nitrila hidratase, o presente método de acordo com a invenção é caracterizado pelo uso de um meio de cultura baseado em um tampão de fosfato de 12 a 60 mM, que atende as necessidades de fósforo das células e mantém o pH na faixa de 5,5 a 9,0 durante a cultura, e pela dosagem de ácido acético como a nova fonte de carbono após consumo da quantidade de glucose fornecida inicialmente. Além disso, é possível usar extratos de milho em forma de licor de maceração de milho como fator de crescimento adicional. Adicionalmente, é vantajoso que a glucose, que pode ser usada para cultura no meio de cultura, possa ser substituída por ácido acético menos dispendioso, e, assim, assegura-se uma elevada atividade específica de nitrila hidratase e elevada atividade total quando se usa o método da invenção.

Teste padrão para medição da atividade de nitril: 1 ml de solução de acrílonitrila com concentração de 2% em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,5) é misturado com 1 ml de suspensão de células de M33 obtido por meio de centrifugação prévia do caldo de cultura, lavagem e subsequente ressuspensão das células em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,5). A suspensão contém de 0,08 a 0,16 mg de células (peso seco). A reação ocorre durante 5 minutos a 20 °C, após o que a reação é interrompida por meio da adição de 20 μί de HC1 concentrado. A concentração da acrilamida formada é determinada por meio de cromatografía a gás ou fotometria. A atividade de nitrila hidratase é indicada nas unidades a seguir: • atividade específica - em mol de acrilamida/min x mg de biomassa seca = [U/mg] • atividade total - em mol de acrilamida/min x ml de caldo de cultura = [U/ml] A invenção é ilustrada com os exemplos a seguir: EXEMPLO 1 Frascos dotados de defletores (250 ml) contendo 50 ml de meio de cultura "SI" (composição em g/1: 7,9 de Na2HP04 x 12 H20; 1,8 de KH2P04; 0,02 de CoCl2 x 6 H20; 1,0 de MgS04 x 7 H20; 2,0 de extrato de milho; pH 7,2 ± 0,2) e contendo glucose (50 g/1) e uréia (de 4 a 20 g/1) foram inoculados com 1 ml de cultura de inóculo de Rhodococcus rhodochrous M33. O inóculo havia sido incubado durante um período de 24 horas no mesmo meio. A cultura ocorreu em um incubador agitado a 180 rpm (movimento circular) e a 30°C durante um período de 96 horas. Determinou-se o rendimento de biomassa e a atividade de nitrila hidratase das células. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 EXEMPLO 2 Frascos dotados de defletores (250 ml) contendo 50 ml de meio de cultura "SI" (composição em gA: 7,9 de Na2HP04 x 12 H2O; 1,8 de KH2PO4; 0,02 de C0CI2 x 6 H20; 1,0 de MgS04 x 7 H20; 16,0 de uréia; pH 7,2 ± 0,2) e contendo glucose (50 g/1) e extrato de milho (de 0 a 10 g/1) foram moculados com 1 ml de cultura de inóculo de Rhodococcus rhodochrous M33. O inóculo fora incubado durante um período de 24 horas no mesmo meio. A cultura ocorreu em um incubador agitado a 180 rpm (movimento circular) e a 30°C durante um período de 96 horas. Determinou-se o rendimento de biomassa e a atividade de nitrila hidratase das células, e os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 *0,01 g/1 de FeS04 x 7 H2O foi dosado a esta mistura de partida. A partir dos dados apresentados previamente fica evidente que a adição de extrato de milho levou a um incremento das atividades específica e total de nitrila hidratase. A concentração ótima do extrato de milho foi de 4 g/1- EXEMPLO 3 Fiascos dotados de defletores (250 ml) contendo 50 ml de meio de cultura "SI” (composição em g/1: 7,9 de Na2HP04 x 12 H20, 1,8 de KH2P04; 0,02 de CoCl2 x 6 H20; 1,0 de MgS04 x 7 H20; 16,0 de uréia; 4,0 de extrato de milho; pH 7,2 ± 0,2) continham glucose em concentrações de 20 a 90 g/1. Inoculação e incubação dos frascos ocorreu como no Exemplo 1. O rendimento medido de biomassa e a atividade de nitrila hidratase das células encontram-se resumidos na Tabela 3.

Tabela 3 Como se pode observar na Tabela 3, o rendimento de células e a atividade total de nitrila hidratase incrementou proporcionalmente ao incremento da concentração de glucose no meio de cultura. Isto resultou do fato de que todos os componentes do meio de cultura estavam presentes em concentrações não-limitantes. EXEMPLO 4 Um fermentador de laboratório de 3 litros contendo 1,5 litro de meio "SI" (composição em g/1: 7,9 de Na2HP04 x 12 H20; 1,8 de KH2P04; 0,01 de CoCl2 x 6 H20; 1,0 de MgS04 x 7 H20; 16,0 de uréia; 4,0 de extrato de milho; pH 7,2 ± 0,2) e contendo 5 g/1 de glucose foi inoculado com 100 ml de cultura de inóculo de Rhodococcus rhodochrous M33. O inóculo fora incubado durante um período de 24 horas em um meio com a mesma composição.

Condições de cultura: • temperatura 30°C • velocidade de agitação 560 rpm • taxa de aeração 1,5 win (vollvol/min) Após um tempo de fermentação de 18 horas, dosou-se 1,5 g/1 de glucose a cada 2 horas até se obter uma concentração final de 40 g/1. Os resultados mostraram que 16,4 g/1 de biomassa seca mostrando que havia sido produzida uma atividade específica de 215 U/mg. A atividade total foi de 3526 U/ml. EXEMPLO 5 Um fermentador de laboratório de 3 litros contendo 1,5 litro de meio "SI" (composição em g/1: 7,9 de Na2HP04 x 12 H20; 1,8 de KH2P04; 0,01 de CoCl2 x 6 H20; 1,0 de MgS04 x 7 H20; 16,0 de uréia; 4,0 de extrato de milho; pH 7,2 ± 0,2) e contendo 20 g/1 de glucose foi inoculado como no Exemplo 4. As condições de cultura também foram como no Exemplo 4. Após um tempo de fermentação de 24 a 36 horas e consumo de toda a glucose, dosou-se 6 g/1 de uréia, 3 g/1 de acetato de sódio, e 0,03 g/1 de CoCl2 x 6 H20. Após um incremento do pH do meio, introduziu-se ácido acético a 30% (batelada alimentada). Nestas condições, verificou-se que 19,6 g/1 de biomassa seca apresentando uma atividade específica de 315 U/mg foram produzidos durante um período de 72 horas. A atividade total foi de 6174 U/ml. EXEMPLO 6 Um fermentador de laboratório de 15 litros contendo 7,0 litros de meio "SI" (composição em g/1: 7,9 de Na2HP04 x 12 H20; 1,8 de KH2P04; 1,0 de MgS04 x 7 H20; 4,0 de uréia; 4,0 de extrato de milho; pH 7,2 ± 0,2) e contendo 20 g/1 de glucose foi inoculado com 4% (v/v) de cultura de inóculo de Rhodococcus rhodochrous M33. O inóculo fora incubado durante um período de 24 horas como uma cultura agitada em um meio com a mesma composição.

Condições de cultura: • temperatura de 29 a 30 °C • taxa de aeração 0,5 wm • pressão de superposição 0,3 bar • pressão parcial relativa de 02 ^>0% (controlada via velocidade do agitador) • velocidade do agitador 300 a 600 rpm Após um tempo de fermentação de 12 horas (início da fase de crescimento exponencial), dosou-se 0,01 g/1 de C0CI2 x 6 H20. Após um tempo de fermentação de 21 a 23 horas e consumo de toda a glucose, dosou-se 6 g/1 de uréia, 3 g/1 de acetato de sódio e 0,03 g/1 de C0CI2 x 6 H2O. Após o pH do caldo de cultura ter se elevado a 7,9, dosou-se uma nova fonte de carbono em forma de ácido acético (30%) acompanhado da regulação do pH em 7,9 (alimentação com pH estabilizado). Nestas condições, foi possível produzir 19,9 g/1 de biomassa seca apresentando uma atividade específica de 294 U/mg durante um período de apenas 66,5 horas. A atividade total foi de 5851 U/ml.

Devido ao fato de que C0CI2 x 6 H20 não foi adicionado no meio antes do início da fase de crescimento exponencial, foi possível reduzir o tempo de fermentação em comparação com o Exemplo 5. EXEMPLO 7 Um fermentador de produção industrial apresentando uma capacidade de 15 m3 e contendo 10 m3 de meio de cultura "SI" (composição em g/1: 3,48 de H3PO4; 0,74 de KOH; NaOH para ajuste do pH em 6,9; 0,01 de C0CI2 x 6 H20; 1,0 de MgS04 x 7 H20; 4,0 de uréia; 4,0 de extrato de milho; pH 7,2 ± 0,2) contendo 20 g/1 de glucose foi inoculado com 5% (v/v) de cultura de inóculo de Rhodococcus rhoãochrous M33. Incubação do inóculo fora completada previamente durante um período de 24 horas, em um pré-fermentador, novamente empregando meio "SI".

Condições de cultivo: • temperatura 28 a 30°C • velocidade do agitador 160 a • taxa de aeração 0,5 vvm Após um período de 24 a 36 horas e consumo de toda a glucose, 6 g/1 de uréia, 3 g/1 de acetato de sódio e 0,03 g/1 de CoCl2 x 6 H20 foram medidos no meio. Alimentação do ácido acético foi realizada em um modo similar ao descrito no Exemplo 6. Após um tempo de fermentação de 72 horas, foi percebido que 18,8 g/1 da biomassa seca mostrando uma atividade específica de 290 U/mg foram produzidas. A atividade total foi 5452 U/ml.

Claims (19)

1. Método para cultivar a cepa de Rhodococats rkodochrotts M33 produtora de nitrila hidratase, listada sob a referência de depósito DSM 14,230 no DSMZ, caracterizado pelo falo de que se usa um meio de cultura que contém ureia e CoCE x 6 H:ü e é baseado em um tampão de fosfato de 12 a 60 mM, e que mantém o pH durante a cultura na faixa de 5,5 a 9,0, e em que se dosou ácido acético e/ou um sal solúvel em água do mesmo como uma nova fonte de carbono quando toda a glicose fornecida inicial mente tiver sido consumida.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se usa extrato de milho como fator de crescimento no referido meio de cultura.

3. Método de acordo com a reivindicação I ou 2, caracterizado pelo falo de que se usa licor de mace ração e/ou solução de maeeração de milho como extratos de milho.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo falo de que referido extrato de milho é usado em referido meio de cultura numa concentração de 1 a 10 g/1.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que se usa glucose e ácido acético como fontes de carbono no meio de cultura,

6. Método dc acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que referido meio de cultura contém, como fonte de carbono, glucose numa concentração de 20 a 90 g/1.

7. Método dc acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ácido acético é adicionado inicialmente em forma de um sal solúvel em água do mesmo.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o sal solúvel em água de ácido acético usado é acetato de sódio.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o sal solúvel em água de ácido acético é usado na batelada inicial e que, quando o pH se elevou para pH de 7,5 a 8,5, se dosa o ácido acético.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o sal solúvel em água de ácido acético é dosado numa concentração de 1 a 4 g/1 e, de preferência, de 3 g/1 após o consumo da glucose.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a adição subseqüente de ácido acético é realizada em forma de uma solução aquosa com concentração de 20 a 50%, de preferência, concentração de 30%.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a solução de ácido acético é dosada em modo de alimentação com pH estabilizado em um pH de 7,5 a 8,5, de preferência, em pH 7,9.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a ureia e o CoCl2 x 6 H20 foram medidos no referido meio de cultura.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a ureia está presente na batelada inicial do meio em uma concentração de 4g/l e o restante é medido em uma concentração de alimentação de 6g/l seguindo o consumo da glicose fornecida inicialmente.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que CoCl2 x 6 H20 é adicionado ao meio no início da fase de crescimento exponencial, baseado em glucose como fonte de carbono, e é novamente dosado após o consumo da glucose.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que, durante a cultura em um fermentador, o fornecimento de oxigênio é controlado de tal forma que a pressão parcial relativa de 02 é superior a 30% e é, de preferência, > 50%.

17. Uso de um meio de cultura, caracterizado pelo fato de ser no método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, compreendendo a) 7,9 g/1 de Na2HP04x 12 H20 b) 1,8 g/1 de CH2P04 c) 0,02 - 0,04 g/1 de CoCl2 x 6 H20 d) 1,0 g/1 MgS04x 7 H20 e) de 0 a 10 g/1 de extrato de milho f) de 20 a 90 g/1 de glucose g) de 4 a 20 g/1 de ureia; e h) ácido acético e/ou um sal solúvel em água do mesmo, como uma fonte adicional de carbono.

18. Uso de um meio de cultura de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém o extrato de milho numa concentração de 1 a 10 g/1 de meio de cultura.

19. Uso de um meio de cultura de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que se baseia em um tampão de fosfato de 12 a 60 mM, e mantém o pH durante o cultura na faixa de 5,5 a 9,0.