BRPI0411715B1 - composição farmacêutica compreendendo salinosporamidas - Google Patents

Abstract

SALINOSPORAMIDAS E MÉTODOS PARA USO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se à descoberta de que determinados produtos da fermentação das cepas CNB392 e CNB476 do actinomicete marinho são inibidores eficazes das células hiperproliferativas de mamíferos. As cepas CNB392 e CNB476 estão dentro da família dos Micromonosporaceae, e o epíteto genérico Salinospora foi proposto para esse grupo de obligatos marinhos. Os produtos de reação produzidos por essas cepas são classificados como salinosporamidas, e são especificamente vantajosos para o tratamento de distúrbios neoplásicos, devido ao seu baixo peso molecular, baixos valores de lC50, alta potência farmacêutica, e seletividade para células de câncer sobre os fungos.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADA A REQUERIMENTOS RELACIONADOS

[001]Este requerimento de patente reivindica prioridade sobre o Pedido de Patente N° de Série US 10/838,157, depositado em 30 de abril de 2004, e sobre o Pedido de Patente N° de Série US 10/600,854, depositado em 20 de junho de 2003, ambos intitulados "Salinospora- midas e Métodos de uso das mesmas".

INFORMAÇÃO COM RELAÇÃO A PRIVILÉGIO

[002]Esta invenção foi feita em parte com o apoio do governo sob a Doação N° CA44848, concedida pelo National Institutes of Health, National Câncer Institute. O governo dos Estados unidos pode ter determinados direitos nesta invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[003]A presente invenção se refere de um modo geral a agentes antineoplásicos, e de modo mais específico a salinosporamidas e o uso das mesmas como agentes antineoplásicos.

INFORMAÇÃO PRECEDENTE

[004]As doenças neoplásicas, caracterizadas através da prolife ração de células não submetidas ao controle normal do crescimento de células, são uma causa principal da morte em seres humanos. A experiência clínica na quimioterapia apresenta demonstrado que são desejáveis drogas citotóxicas novas e mais eficazes para o tratamento dessas doenças. Sem dúvida, o uso de agentes antineoplásicos apresenta aumentado devido à identificação de novos neoplasmas e tipos de células de câncer com metástase para áreas diferentes, e devido à eficácia de protocolos de tratamento antineoplásicos como um tratamento médico primário e adjuntivo para o câncer.

[005]Uma vez que os agentes antineoplásicos são citotóxicos (venenosos para as células) eles não interferem somente com o crescimento de células de tumor, porém com aquele das células normais. Os agentes antineoplásicos apresenta mais do um efeito sobre as células de tumor do que sobre as células normais devido ao rápido crescimento das mesmas. Dessa forma, as células de tecido normal que são afetadas pelos agentes antineoplásicos são células que se dividem rapidamente, tais como as da medula óssea (observadas em baixa contagem no sangue), folículos pilosos (observadas através da perda de cabelo) e as GI do epitélio de mucosa (responsáveis por náusea, vômito, perda de apetite, diarréia). Em geral, os agentes anti- neoplásicos apresenta os índices terapêuticos mais baixos de qualquer classe de drogas usadas em seres humanos e por esse motivo produzem toxidez que significativamente e potencialmente põe a vida em risco.Determinados agentes antineoplásicos comumente usados têm toxidez única e aguda com relação a tecidos específicos. Por exemplo, os alcalóides vinca possuem toxidez significativa com relação a tecidos nervosos, enquanto que a adriamicina apresenta uma toxidez específica para o tecido do coração e a bleomicina apresenta para o tecido do pulmão.

[006]Desse modo, existe uma necessidade contínua com rela ção a agentes antineoplásicos que sejam eficazes para a inibição da proliferação de células hiperproliferativas enquanto exibem ao mesmo tempo valores de IC50 mais baixos do que aqueles valores encontrados para os agentes antineoplásicos correntes, resultando por esse motivo em uma redução marcante nos efeitos colaterais potencialmente graves.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007]A presente invenção é à base da constatação de que de terminados produtos da fermentação de cepas CNB392 e CNB476 do actinomiceto marinho são inibidores eficazes das células hiperprolife- rativas em mamíferos. As cepas CNB392 e CNB476 se situam dentro da família das Micromonosporaeae, e o epíteto genérico Salinospora foi proposto para esse grupo de obligato marinho. Os produtos da reação produzidos por essa cepa são classificados como salinosporami- das e são especificamente vantajosos para o tratamento de distúrbios neoplásicos devido ao seu baixo peso molecular, baixos valores IC50, elevada potência farmacêutica e seletividade com relação às células de câncer, sobre os fungos.

[008]Em uma modalidade desta invenção, são providos compos tos que apresenta a estrutura (I)

[009]na qual

[0010]R1 até R3 são cada um independentemente -H, alquila, al quila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, aminA, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila;

[0011]Cada R4 é independentemente alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída;

[0012]E1 até E4 são cada um, independentemente -O, -NR5, ou - S, em que R5 é -H ou C1-C6 alquila; e

[0013]X é de 0 até 8.

[0014]Em uma outra modalidade da invenção, são providos com postos que apresenta a estrutura (II)

[0015]na qual

[0016]R1 até R3 são cada um independentemente -H, alquila, al quila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amina, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila;

[0017]cada R4 é independentemente alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída;

[0018]E1 até E4 são cada um, independentemente -O, -NR5, ou - S, em que R5 é -H ou C1-C6 alquila; e

[0019]x é de 0 até 8.

[0020]Em uma outra modalidade da invenção, são providos com postos que apresenta a estrutura (III)

[0021]na qual

[0022]R1 até R3 são cada um independentemente -H, alquila, al quila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amina, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila;

[0023]cada R4 é independentemente alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída;

[0024]E1 até E4 são cada um, independentemente -O, -NR5, ou - S, em que R5 é -H ou C1-C6 alquila; e

[0025]x é de 0 até 8.

[0026]Em ainda uma outra modalidade da invenção, são providos compostosque apresenta a estrutura (IV):

[0027]Em ainda uma outra modalidade da invenção, são providos compostos que apresenta a estrutura (V):

[0028]Em ainda uma outra modalidade da invenção, são providos compostos que apresenta a estrutura (VI):

[0029]Em uma outra modalidade, são providas composições far macêuticas que incluem pelo menos um composto das estruturas de I a VI em um veículo farmaceuticamente aceitável ao mesmo.

[0030]Em outra modalidade, são providos artigos de fabricação, que incluem material de embalagem e uma composição farmacêutica contida no interior do material de embalagem, em que o material de embalagem inclui um rótulo que indica que a composição farmacêutica pode ser usada para o tratamento de distúrbios de células proliferati- vas e em que a composição farmacêutica inclui, pelo menos um composto das estruturas de I a VI.

[0031]Em ainda uma outra modalidade, são providos métodos para o tratamento de um distúrbio de célula proliferativa em mamífero. Esse método pode ser executado, por exemplo, através da administração a um indivíduo que esteja necessitando da mesma de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que tenha uma das estruturas de I a VI.

[0032]Em uma modalidade adicional, são providos métodos para a produção de um composto das estruturas de I a VI que tenham a capacidade de inibir a proliferação de células hiperproliferativas em mamíferos. Um tal método pode ser executado, por exemplo através da cultivação de uma cultura das cepas CNB392 ou CNB476 (ATCC #PTA-5275, depositado em 20.6.2003, em conformidade com o Trata- do de Budapeste sobre o Depósito Internacional de Microrganismos para Fins de Procedimento de Patentes com o Depositário de Cultura de Patentes da American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 U.S.A.) da Salinospora sp.e isolando, a partir da cultura, pelo menos um composto da estrutura I.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0033]A Figura 1 mostra a estrutura química de um composto de exemplo da invenção, Salinosporamida A, com uma estereoquímica relativa.

[0034]A Figura 2 mostra uma árvore filogenética ilustrando a filo- genia da "Salinospora".

[0035]A Figura 3 mostra a estrutura química do Etoposido, um agente antineoplásico na terapia contra diversos cânceres humanos.

[0036]A figura 4 compara a atividade citotóxica e as curvas de resposta à dose da Salinosporamida A e do Etoposido.

[0037]A Figura 5 é um diagrama em bloco mostrando um esque ma de separação de exemplo, usado para o isolamento da Salinospo- ramida A.

[0038]As Figuras de 6 a 14 apresentam dados espectroscópicos de RMN,IR e UV usados para a elucidação da estrutura da Salinospo- ramida A.

[0039]A Figura 15 apresenta os nucleotídios de assinatura que as cepas CNB329 e CNB476 possuem com o seu 16S rDNA, que separa essas cepas de forma filogenética a partir de todos os outros membros de família da família das Micromonosporaceae.

[0040]A Figura 16 mostra a estrutura química de um composto de exemplo da invenção, a salinosporamida A (estrutura V) com uma es- tereoquímica absoluta.

[0041]A Figura 17 o gráfico ORTEP da estrutura final em raios X da salinosporamida A, mostrando a estereoquímica absoluta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0042]Em uma modalidade, são providos compostos que apresen ta a estrutura (I):

[0043]na qual

[0044]R1 até R3 são cada um independentemente -H, alquila, al quila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amina, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila;

[0045]Cada R4 é independentemente alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída;

[0046]E1 até E4 são cada um, independentemente -O, -NR5, ou - S, em que R5 é -H ou C1-C6 alquila; e

[0047]X é de 0 até 8.

[0048]Em uma outra modalidade da invenção, são providos com postos que apresenta a estrutura (II)

[0049]na qual

[0050]R1 até R3 são cada um independentemente -H, alquila, al quila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amina, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila;

[0051]cada R4 é independentemente alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída;

[0052]E1 até E4 são cada um, independentemente -O, -NR5, ou - S, em que R5 é -H ou C1-C6 alquila; e

[0053]x é de 0 até 8.

[0054]Em uma modalidade, são providos compostos que apresen ta a estrutura (III)

[0055]na qual

[0056]R1 até R3 são cada um independentemente -H, alquila, al quila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amina, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila;

[0057]cada R4 é independentemente alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída;

[0058]E1 até E4 são cada um, independentemente -O, -NR5, ou - S, em que R5 é -H ou C1-C6 alquila; e

[0059]x é de 0 até 8.

[0060]Em ainda uma outra modalidade da invenção, são providos compostos que apresenta a estrutura (IV):

[0061]Em ainda uma outra modalidade da invenção, são providos compostos que apresenta a estrutura (V):

[0062]Em ainda uma outra modalidade da invenção, são providos compostos que apresenta a estrutura (VI):

[0063]Conforme usado aqui, o termo "alquila" se refere a um gru po hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada que apresenta a partir de um até 12 átomos de carbono, e que inclui meti- la, etila, n-propila, n-butila, isobutila, terc-butila, n-hexila e os semelhantes.

[0064]Conforme usado aqui, "alquila substituída" se refere a gru pos alquila contendo também um ou mais substituintes selecionados a partir de hidróxi, alcóxi, mercapto, cicloalquila, cicloalquila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, arila, arila substituída, hetero- arila, heteroarila substituída, arilóxi, arilóxi substituído, halogênio, cia- no, nitro, amina, amido, -C(O)H, acila, carboxila, sulfonila, sulfonamida, sulfurila, e os semelhantes.

[0065]Conforme usado aqui, "alquila inferior" se refere a grupos alquila que apresenta a partir de 1 até cerca de 6 átomos de carbono.

[0066]Conforme usado aqui, "alquenila" se refere a grupos de hi- drocarbonetos de cadeia linear ou ramificada que tenham uma ou mais ligações duplas de carbono-carbono, e tendo na faixa de cerca de 2 até 12 átomos de carbono, e "alquenila substituída" se refere a grupos alquenila que também contenham um ou mais substituintes como os exibidos acima.

[0067]Conforme usado aqui, "alquinila" se refere a grupos de hi- drocarbonetos de cadeia linear ou ramificada que tenham, pelo menos uma ligação tripla de carbono-carbono, e que tenham na faixa de cerca de 2 até 12 átomos de carbono, e "alquinila substituída" se refere a grupos alquinila que também contenham um ou mais substituintes como os exibidos acima.

[0068]Conforme usado aqui, "arila" se refere a grupos aromáticos que tenham na faixa de 6 até 14 átomos de carbono e "arila substituída" se refere a grupos arila que também contenham um ou mais subs- tituintes como os exibidos acima.

[0069]Conforme usado aqui, "heteroarila" se refere a anéis aro máticos que contenham um ou mais hetero átomos (como por exemplo, N, O, S, ou os semelhantes) como parte da estrutura do anel, e que tenham na faixa de 3 até 14 átomos de carbono, e "heteroarila substituída" se refere a grupos heteroarila que contenham ainda um ou mais substituintes como os exibidos acima.

[0070]Conforme usado aqui, "alcóxi" se refere à parte -O-alquil-, na qual a alquila é como definida acima, e "alcóxi substituído" se refere a grupos alcóxi que contenham ainda um ou mais substituintes como os exibidos acima.

[0071]Conforme usado aqui, "tioalquila" se refere à parte -S-alquil- , na qual a alquila é como definida acima, e "tioalquila substituída" se refere a grupos tioalquila que contenham ainda um ou mais substituin- tes como os exibidos acima.

[0072]Conforme usado aqui, "cicloalquila" se refere a grupos al quila que contenham anéis, contendo na faixa de cerca de 3 até 8 átomos de carbono, e "cicloalquila substituída" de refere a grupos ci- cloalquila que contenham ainda um ou mais substituintes como os exibidos acima.

[0073]Conforme usado aqui, "heterocíclico" (isto é, que contém anel) se refere a grupos que contêm um ou mais hetero átomos (como por exemplo, N, O, S ou os semelhantes) como parte da estrutura do anel, e que tenham uma faixa de 3 até 14 átomos de carbono, e "hete- rocíclico substituído" se refere a grupos heterocíclicos que contenham ainda um ou mais substituintes como os exibidos acima.

[0074]Emdeterminadas modalidades, são providos compostos das estruturas de I a III, nos quais E1, E3 e E4 são -O, e E2 é -NH.

[0075]Emdeterminadas modalidades, são providos compostos das estruturas de I a III, nos quais R1 e R2 são -H, alquila ou alquila substituída, e R3 é hidróxi ou alcóxi. Em determinadas modalidades, R1 é alquila substituída. Os exemplos de alquilas substituídas contémpla- dos para serem usados incluem as alquilas halogenadas, tais como, por exemplo, alquilas cloradas.

[0076]Os compostos da invenção podem ser formulados em com posições farmacêuticas como em forma natural ou em forma de sal. Os sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de bases (formados com grupos de carboxila livres ou outros grupos aniônicos) que podem ser derivados a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e com tais bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, procaína, histidina e as semelhantes. Esses sais também podem ser formados como sais de adição ácidos com qualquer grupo catiônico livre, e serão formados, em geral, com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico, sulfúrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como os ácidos: acético, p- tolueno sulfônico, ácido metano sulfônico, ácidos oxálico, tartárico, mandélico os semelhantes. Os sais da invenção incluem os sais de amina formados através da protonação de um grupo amina com ácidos inorgânicos tais como o ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e os semelhantes. Os sais da invenção também incluem os sais formados através da protonação de um grupo amina com ácidos orgânicos adequados, tais como com o ácido p-tolueno sulfônico, ácido acético e os semelhantes. Os excipi- entes adicionais que são contémplados para serem usados na prática da presente invenção são aqueles disponíveis para as pessoas versadas na técnica, por exemplo, aqueles encontrados na United States Pharmacopeia Vol. XXII e National Formulary Vol. XVII, U. S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989), os conteúdos relevan-tes dos quais são incorporados aqui por referência.

[0077]Os compostos de acordo com esta invenção podem conter uma ou mais átomos de carbono assimétricos e, por esse motivo, ocorrer como racematos ou misturas racêmicas, enanciômeros individuais, misturas diastereoméricas e diastereômeros individuais. O termo "estereoisômero" se refere a compostos químicos que são diferentes um do outro somente na maneira pela qual os grupos diferentes nas moléculas estão orientados no espaço. Os estereoisômeros apresenta o mesmo peso molecular, composição química e constituição como os outros, porém com os átomos agrupados de modo diferente. Isto é, determinadas partes químicas idênticas estão em orientações diferentes no espaço e, por esse motivo, quando puras, têm a estabilidade de girar o plano da luz polarizada. No entanto, alguns estereoi- sômeros puros podem ter uma rotação ótica que é tão ligeira que ela não pode ser detectada com a instrumentação atual. Todas essas formas isoméricas desses compostos estão expressamente incluídas na presente invenção.

[0078]Cada um dos carbonos estereogênicos pode ser de confi guração R ou S. Embora os compostos específicos exemplificados neste requerimento de patente possam ser mostrados em uma configuração específica, os compostos que tenham tanto a estereoquímica oposta a qualquer centro quiral determinado ou misturas dos mesmos também estão previstos. Quando são encontrados centros quirais nos derivados desta invenção, deve ser entendido que esta invenção engloba todos os estereoisômeros possíveis. As expressões "composto oticamente puro" e "isômero oticamente puro" se referem a estereoi- sômeros únicos de um composto quiral, sem levar em consideração a configuração do composto.

[0079]Os compostos exemplares da invenção da estrutura I estão mostrados abaixo:

[0080]A salinosporamida A exibe uma estrutura molecular que apresenta uma variedade de grupos funcionais (lactona, halogeneto de alquila, amida, hidróxido) que podem ser modificados quimicamente para a produção de derivados sintéticos. Em conseqüência, o composto de exemplo da invenção Salinosporamida A proporciona um uma excelente estrutura inicial para o desenvolvimento de derivados sintéticos ou semi-sintéticos.Sem dúvida, a Salinosporamida A pode ser de- rivatizada para o aumento das propriedades farmacocinéticas e farma- codinâmicas, as quais facilitam a administração e aumentam a utilidade dos derivados como agentes antineoplásicos. Os procedimentos para a modificação dos compostos de salinosporamida da invenção para a produção de compostos adicionais dentro do âmbito da presente invenção estão disponíveis para as pessoas versadas na técnica.

[0081]A salinosporamida A exibe uma forte atividade citotóxica contra células de câncer do cólon humano nas análises de células HTC-116. O IC50 de 11 ng/ml excede a atividade do etoposido (ver a Figura 3, IC50 828 ng/mL), uma droga anticâncer usada para o tratamento de uma quantidade de cânceres, por quase duas ordens de magnitude (ver a Figura 4). Essa atividade elevada torna as salinospo- ramidas da invenção excelente candidatas para serem usadas no tratamento de diversos cânceres humanos, de modo especial os cânceres de crescimento lento, refratários para os quais não existem terapias. A salinosporamida A é especifica para a inibição de células de mamíferos e mostra pequena atividade antifúngica contra Candida albicans (IC50 de 250 μg/mL) e nenhuma atividade antibacteriana (Sta-phylococcus aureus, Enterococcus faescium). O IC50 da Salinospora- mida A bem mais baixo do que os agentes quimioterapêuticos mais fortes atualmente em uso ou em testes clínicos.

[0082]A Salinosporamida A é um produto da fermentação das ce pas CNB392 e CNB476 do actinomiceto marinho. Essas cepas são membros da ordem dos Actinomycetales, que são bactérias gram positivas G + C elevadas. A novidade da CNB392 e da CNB476 está no nível do gênero. Os compostos da invenção mostrados aqui são produzidos por determinadas "Salinospora" sp. Em determinadas modalidades, os compostos da invenção são produzidos pelas cepas CNB392 e CNB476 da "Salinospora" sp. Para esse fim, as cepas CNB392 e CNB476 da "Salinospora" sp foram depositadas em 20.6.2003, em conformidade com o Tratado de Budapeste sobre o Depósito Internacional de Microrganismos para Fins de Procedimento de Patentes com o Depositário de Cultura de Patentes da American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 U.S.A., sob o número de acesso ATCC #PTA-5275, respectivamente.

[0083]Como é o caso com outros organismos, as características da "Salinospora" sp. são objeto de variações. Por exemplo, recombi- nantes, variantes ou mutantes da cepa específica podem ser obtidos através de tratamento com os diversos mutagenos físicos e químicos conhecidos, tais como raios ultravioleta, raios -X, raios gama e N-metil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina. Todas as variantes, mutantes e recombi- nantes, naturais e induzidos da cepa específica e que retenham a característica de produzir um composto da invenção estão destinados a ficar dentro do âmbito da invenção reivindicada.

[0084]Os compostos da invenção podem ser preparados, por exemplo, através de fermentação bacteriana, que gera os compostos em quantidades suficientes para o desenvolvimento de drogas farmacêuticas e para testes clínicos. Em algumas modalidades, os compostos da invenção são produzidos através da fermentação das cepas CNB392 e CNB476 do actinomiceto em meio líquido A1Bfe+C ou CKA. Elementos traço essenciais que são necessários para o crescimento e o desenvolvimento da cultura também devem ser incluídos no meio de cultura. Esses elementos traços ocorrem comumente como impurezas em outros constituintes do meio em quantidades suficientes para satisfazer as necessidades de crescimento do organismo. Pode ser desejável a adição de pequenas quantidades (isto é, 0,2 m) de agente anti- formação de espuma tal como o propileno glicol (M. W. de cerca de 2000) para meios de cultura em larga escala se a formação de espu-ma se torna em um problema. Os metabólitos orgânicos são isolados através da absorção sobre a resina anberlite XAD-16. Por exemplo, a salinosporamida A é isolada através da decantação da resina XAD-16 com metanol diclorometano a 1:1, que produz cerca de 105 mg de extrato em bruto por litro de cultura. A salinosporamida A é em seguida isolada a partir do extrato bruto por cromatografia cintilante de fase reversa, seguida por HPLC de fase reversa e HPLC de fase normal, que rende 6,7 mg de salinosporamida A. A Figura 5 mostra um diagrama em bloco que descreve os protocolos de isolamento e de separação para os compostos da invenção.

[0085]A estrutura da salinosporamida A foi explicada através de uma variedade de técnicas de RMN, espectroscopia de massa, espec- troscopia de IR e de UV, como mostrado nas Figuras de 6 a 14.

[0086]A estrutura absoluta da salinosporamida A e a confirmação da estrutura total da salinosporamida A foi conseguida através de análise de difração de raios X com cristal único (ver Exemplo 3).

[0087]A presente invenção também proporciona artigos de fabri cação que incluem material de embalagens e uma composição farmacêutica contida no interior do material de embalagem, em que o material de embalagem, compreende um rótulo que indica que a composição farmacêutica pode ser usada para o tratamento de distúrbios e em que a composição farmacêutica inclui um composto de acordo com a presente invenção. Desse modo, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que inclui um composto da invenção, no qual o composto está presente em uma concentração eficaz para o tratamento de distúrbios de proliferação de células. A concentração pode ser determinada por uma pessoa versada na técnica de acordo com o regime padrão de tratamento ou como determinado por um ensaio animal in vivo, por exemplo.

[0088]As composições farmacêuticas empregadas como um componente dos artigos fabricados da invenção podem ser usadas na forma de um sólido, uma solução, uma emulsão, uma dispersão um micélio, um lipossoma e os semelhantes, em que a composição resultante contém um ou mais compostos da invenção como um ingrediente ativo, em mistura com um veículo ou excipiente adequado para as aplicações enterais ou parenterais. Os compostos empregados para serem usados como um composto dos artigos de fabricação da inven- ção podem ser combinados, por exemplo, com os veículos usuais não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis para comprimidos, péletes, cápsulas, supositórios, soluções, emulsões, suspensões e qualquer outra forma adequada para ser usada. Os veículos que podem ser usados incluem glicose, lactose, goma de acácia, gelatina, manitol, pasta de amido, trissilicato de magnésio, talco, amido de milho, queratina, sílica coloidal, amido de batata, uréia, triglicerídios de comprimento de cadeia médio, dextranos e outros veículos adequados para serem usados nas preparações de fabricação, em forma sólida, semissólida ou líquida. Além disso, podem ser usados agentes auxiliares de estabilização, de espessamento e de coloração, e perfumes.

[0089]As composições da presente invenção podem conter outros agentes terapêuticos como descrito abaixo, e podem ser formulados, por exemplo, através do emprego de veículos ou diluentes sólidos ou líquidos convencionais, bem como aditivos farmacêuticos de um tipo apropriado para o modo de administração desejado (por exemplo, ex- cipientes, aglutinantes, conservantes, estabilizadores, flavorizantes, etc.) de acordo com técnicas tais como aquelas bem conhecidas na técnica da formulação farmacêutica.

[0090]As composições farmacêuticas da invenção podem ser ad ministradas através de qualquer meio adequado, por exemplo por via oral, tal como na forma de comprimidos, cápsulas, grânulos ou pós; por via sublingual, por via bucal, por via parenteral, tal como por técnicas de injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intracistérni- ca ou de infusão (por exemplo, como soluções ou suspensões injetáveis aquosas ou não aquosas) ; pela via nasal tal como por sprays de inalação; topicamente, tal como na forma de um creme ou unguento; ou pela via retal tal como na forma de supositórios; em formulações de unidade de dosagem contendo veículos ou diluentes não tóxicos, far- maceuticamente aceitáveis. Os compostos da invenção podem, por exemplo, ser administrados em uma forma adequada para a liberação imediata ou para a liberação prolongada. A liberação imediata ou a liberação prolongada pode ser conseguida através de uso de composições farmacêuticas adequadas que compreendem os compostos da invenção, ou, especificamente no caso da liberação prolongada, através do uso de dispositivos tais como implantes subcutâneos ou bombas osmóticas. Os compostos da invenção também podem ser administrados através de lipossomas.

[0091]A invenção também proporciona métodos para a utilização dos compostos de salinosporamida de estruturas de (I) a (VI) para a inibição da proliferação de células de mamíferos através do contato de tais células com um composto de salinosporamida da invenção em uma quantidade suficiente para a inibição da proliferação das célula de mamífero. Uma modalidade, é um método para a inibição da proliferação de células de mamífero hiperproliferativas. Para a finalidade da presente invenção "células de mamífero hiperproliferativas" são células de mamífero que não estão submetidas às limitações características de crescimento, por exemplo, morte de célula programada (apoptose).Uma outra modalidade de preferência é quando a célula de mamífero é humana.A invenção ainda proporciona pôr a célula de mamífero em contato com pelo menos um composto de salinosporamida da invenção e pelo menos um agente antineoplásico adicional.

[0092]Em uma outra modalidade, são providos métodos para o tratamento de um distúrbio proliferativo de células em mamífero, que compreende a administração a um indivíduo que esteja necessitando da mesma de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto das estruturas de (I) a (VI). Os distúrbios de proliferação de células que podem ser tratados de forma eficaz pelos métodos da invenção incluem os distúrbios caracterizados por pela formação de neoplasmas. Como tal, os compostos da invenção são agentes antineoplási- cos. Como usado aqui, "neoplásico" diz respeito a um neoplasma, que é um crescimento anormal, esse crescimento ocorrendo devido à proliferação de células não submetidas às limitações usuais de crescimento. Como usado aqui "agente antineoplásico" é qualquer composto, composição, mistura, co-mistura ou combinação que iniba, elimine, retarde ou reverta o fenótipo neoplásico de uma célula. Em determinadas modalidades, os neoplasmas são selecionados a partir de neoplasmas mamários, da célula pequena do pulmão, de célula não pequena do pulmão, colorretal, leucemia, melanoma, adenocarcinoma pancreático, do sistema nervoso central (SNC),do ovário, da próstata, sarcoma de tecido mole ou de ossos, da cabeça e pescoço, gástrico que inclui da tireóide e de doença não de Hodgkin, do estômago, mi- eloma, da bexiga urinária, neuro endócrino que inclui da tireóide de doença não de Hodgkin e de doença de Hodgkin. Em uma modalidade, os neoplasmas são colorretais.

[0093]A quimioterapia, terapia de radiação, terapia com modifica dores de resposta biológica e imuno terapia são atualmente usadas no tratamento do câncer. Cada um dos modos de terapia apresenta indicações específicas que são conhecidas das pessoas versadas na técnica e um ou todos podem ser empregados em uma tentativa de alcançar a destruição total das células neoplásicas. A quimioterapia com a utilização de um ou mais compostos de salinosporamida da invenção é provida pela presente invenção. Além disso, a combinação de quimioterapia, quimioterapia com a utilização dos compostos de salinospo- ramida da invenção em combinação com outros agentes neoplásicos, também é provida pela invenção na medida em que, uma terapia de combinação é em geral mais eficaz do que a utilização de agentes an- tineoplásicos isolados. Dessa forma, um outro aspecto da presente invenção proporciona composições que contenham uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto de salinospora- mida da invenção em combinação com pelo menos um outro agente antineoplásico. Essas composições também podem ser providas em conjunto com veículos, diluentes, adjuvantes e excipientes líquidos em gel ou sólidos fisiologicamente toleráveis. Esses veículos, diluentes, adjuvantes e excipientes podem ser encontrados na United States Pharmacopeia Vol. XXII e National Formulary Vol. XVII, U. S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989), os conteúdos relevantes dos quais são incorporados aqui por referência. Os modos de tratamento adicionais estão providos na AHFS Drug Information, 1993 ed. pela American Hospital Formulary Service, páginas 522 a 660, o teor dos quais ficam incorporados aqui por referência.

[0094]Os agentes antineoplásicos que podem ser utilizados em combinação com um composto de salinosporamida da invenção incluem aqueles providos no The Merck Index, 11a. ed. Merck & Co., Inc. (1989) páginas Ther 16 e 17, os conteúdos das quais ficam incorporados a esta especificação por referência. Em uma outra modalidade da invenção, os agentes antineoplásicos podem ser anti metabólitos que podem incluir, porém não estão limitados a, metotrexato, 5-fluoruracil, 6-mercaptopurina, citosina arabinosidio, hidroxiuréia, e 2- clorodesoxiadenosina. Um uma outra modalidade da presente invenção, os agentes antineoplásicos contémplados são os agentes de al- quilação, que podem incluir, porém não estão limitados a, ciclofosfa- mida, melfalano, busulfano, paraplatina, clorambucil e mostarda de nitrogênio. Em uma outra modalidade da invenção, os agentes neoplá- sicos são alcalóides vegetais que podem incluir, porém não estão limitados a, viscristina, vinblastina, taxol e etoposido.Em uma outra modalidade da invenção, os agentes antineoplásicos contémplados são antibióticos que podem incluir, porém não estão limitados a, doxorubicina (adriamicina), daunorubicina, mitomicina c e bleomicina. Em uma modalidade adicional da invenção, os agentes antineoplásicos contém- plados são hormônios que podem incluir, porém não estão limitados a, calusterona, diomostavolona, propionato, epitiostanol, mepistiostano, testolactona, tamoxifeno, fosfato de poliestradiol, acetato de megeste- rol, flutamida, nilutamida e trilotano. Em uma outra modalidade da invenção, os agentes antineoplásicos contémplados incluem enzimas, as quais incluem, porém não estão limitadas a, derivados da L- Asparaginase ou da aminoacridina que podem incluir, porém não estão limitados a amsacrina.

[0095]Os agentes antineoplásicos adicionais incluem aqueles providos em Skeel, Roland T., "Antineoplastic Drugs and Biological Resonse Modifier: Classification, Use ans Toxicity of Clinical Useful Agents" Handbook of Câncer Chemotherapy (3a. ed.) Little Brown & Co. (1991), os teores dos quais ficam incorporados a esta especificação por referência.

[0096]Além dos primatas, tais como os seres humanos, uma vari edade de outros mamíferos pode ser tratada de acordo com o método da presente invenção. Por exemplo, mamíferos incluindo, porém não limitados a, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, porquinhos da índia, ratos ou outras espécies bovinas, ovinas, eqüinas, caninas, felinas, de roedores ou murinas podem ser tratadas.

[0097]A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade co composto em questão que irá provocar a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou ser humano que esteja sendo procurado pelo pesquisador, veterinário doutor médico ou outro clínico, como por exemplo diminuindo os efeitos/ sintomas dos distúrbios de proliferação de células.

[0098]Por "farmaceuticamente aceitável" é significado que o veí culo, diluente ou excipiente deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não deletério para o recebedor do mesmo.

[0099]As expressões "administração de" e ou "administrando um" composto devem ser entendidas como provendo um composto da invenção ao indivíduo que está necessitando de tratamento. A administração de compostos da invenção pode ser precedente a, de forma simultânea com, ou depois da administração de um outro agente terapêutico ou outro agente antineoplásico.

[00100] As composições farmacêuticas para a administração dos compostos desta invenção podem ser apresentadas de forma conveniente em forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Todos os métodos incluem a etapa de trazer o ingrediente ativo em associação com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições farmacêuticas são preparadas por trazer de modo uniforme e íntimo o ingrediente ativo para uma associação com um veículo líquido ou um veículo sólido finamente di-vidido ou ambos e, em seguida, se necessário, conformando o produto dentro das formulações desejadas. Na composição farmacêutica o composto objeto ativo é incluído em uma quantidade suficiente para a produção do efeito desejado com relação ao processo ou a condição da doença.

[00101] As composições farmacêuticas que contém o ingrediente ativo podem estar um uma forma adequada para uso oral, por exemplo como comprimidos, pílulas, losangos, suspensões aquosas ou oleosas, por dispersáveis ou grânulos, emulsões, cápsulas duram ou macias ou xaropes ou elixires.

[00102] As composições destinadas para uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos na técnica para a fabricação de composições farmacêuticas, e essas composições podem conter um ou mais agentes selecionados a partir do grupo que consiste em agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes corantes e agentes conservantes com a finalidade de prover prepara- ções farmaceuticamente elegantes e palatáveis. Os comprimidos contém o ingrediente ativo em mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos que sejam adequados para a fabricação de comprimidos. Esses excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes, tais como o carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e de desintegração, por exemplo, amido de milho ou ácido algínico; agentes de espessamento, por exemplo amido, gelatina ou acácia, e agentes de lubrificação, por exemplo o estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem ser não revestidos ou eles podem ser revestidos através de técnicas conhecidas para retardar a desintegração e a absorção no trato gastrointestinal e desse modo prover uma ação prolongada durante um período mais longo. Por exemplo, um material de retardo de tempo tal como o monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila pode ser empregado. Eles também podem ser revestidos para a formação de comprimidos terapêuticos osmóticos para a liberação controlada.

[00103] As formulações para uso oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura, nas quais o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim, ou como cápsulas de gelatina macia nas quais o ingrediente ativo é misturado com água ou com um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva.

[00104] As suspensões aquosas contêm os materiais ativos em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Esses excipientes são os agentes de suspensão, por exemplo a carboximetilcelulose, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinil pirrolidona, goma tragacanto e goma de acácia; os agentes de dispersão ou de umidificação podem ser um fos- fatídio de ocorrência natural, por exemplo à lecitina, ou um produtos da condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo estearato de polioxietileno, ou os produtos da condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo o heptadecaetileneoxicetanol, os produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados a partir de ácidos graxos e um hexitol tal como o monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos com anidridos de hexitol, por exemplo o monooleato de polietileno sorbitol. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo etila, ou n-propila, p- hidroxibenzoatos, um ou mais agentes de coloração, um ou mais agentes flavorizantes e um ou mais agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.

[00105] As suspensões oleosas podem ser formuladas através da suspensão do ingrediente ativo em um óleo vegetal, por exemplo óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim, ou óleo de coco, ou em um óleo mineral tal como a parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente de espessamento, por exemplo à cera de abelha, parafina sólida ou álcool de cetila. Os agentes adoçantes tais como aqueles mostrados acima e os agentes flavorizantes podem ser adicionados para prover uma preparação oral palatável. As composições podem ser preservadas através da adição de um antioxidante tal como o ácido ascórbico.

[00106] Os pós dispersáveis e os grânulos adequados para a preparação de uma suspensão aquosa através da adição de água proporcionam o ingrediente ativo em mistura com um agente de umede- cimento ou de dispersão, agente de suspensão, e um ou mais conservantes. Os agentes de dispersão ou de umedecimento adequados e os agentes de suspensão estão exemplificados por aqueles já menci- onados acima. Os excipientes adicionais, por exemplo, os agentes adoçantes, flavorizantes e corantes, também podem estar presentes.

[00107] Os xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçantes, por exemplo glicerol, propileno glicol, sorbitol ou sacarose.Essas formulações também podem conter um demulcente e agentes conservantes, flavorizantes e corantes.

[00108] As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma suspensão aquosa ou oleaginosa estéril injetável. Essa suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida com a utilização daqueles agentes de umidificação ou de dispersão e agentes de suspensão que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico aceitável pela via parenteral, por exemplo como uma solução em 1,3-butano diol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão a água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos fixos estéreis são empregados de forma convencional como um meio solvente ou de suspensão. Para essa finalidade, qualquer óleo suave fixado pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerídios sintéticos. Além disso, os ácidos graxos tais como o ácido oléico encontram utilidade na preparação de injetáveis.

[00109] Os compostos da presente invenção também podem ser administrados na forma de supositórios para a administração retal da droga. Essas composições podem ser preparadas através da mistura- ção da droga com um excipiente adequado não irritante que seja sólido em temperatura ordinária, porém líquido na temperatura retal e que irá por esse motivo de derreter no reto para a liberação da droga. Esses materiais são a manteiga de cacau e os polietilenoglicóis.

[00110]Para uso tópico, creme, óleos, géis, soluções ou suspen sões, etc, contendo os compostos da presente invenção são empre- gados.

[00111] Os compostos e as composições da invenção podem ser administrados a mamíferos para uso veterinário, tal como para animais domésticos e para uso clínico em seres humanos de uma maneira similar a outros agentes terapêuticos. Em geral, a dosagem requerida para a eficácia terapêutica irá variar de acordo com o tipo de uso e o modo de administração, bem como as necessidades especificadas dos pacientes individuais. De modo comum, as dosagens irão variar a partir de 0,001 até 1000 μg /kg, de modo mais usual de 0,01 até 10 μg/kg do peso do corpo do paciente. Alternativamente, as dosagens dentro dessas faixas podem ser administradas através de infusão constante durante um período de tempo prolongado, usualmente excedendo a 24 horas, até que os benefícios terapêuticos desejados tenham sido obtidos. No entanto, será entendido que o nível específico da dose e a frequência da dosagem para qualquer paciente específico pode ser variada e irá depender de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico empregado, a estabilidade metabólica e a duração da ação daquele composto, a idade, peso corporal , saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de drogas, a gravidade da condição específica e o paciente que está sendo submetido à terapia.

[00112] A invenção será descrita a seguir em maior detalhe por referência aos exemplos não limitativos que se seguem.

EXEMPLOS Métodos e Materiais

[00113] HPLC - A purificação dos compostos da invenção foi conseguida por RL-MPLC sobre fase sólida C-18 (Aldrich) com a utilização de um gradiente progressivo em colunas Kontes Flex (15 x 7 mm). A HPLC de semi preparação foi realizada em um sistema HPLC iso- crático com uma bomba Waters 6000H em uma coluna de fase normal Si-Dynamas-60Â (250 x 5 mm) ou uma coluna de fase reversa C-18- Dinamax-60Â, fluxo de 1 mL por minuto com um detectador refratomé- rico diferencial Waters R401.

[00114]LC-MS - A cromatografia LC-MS foi realizada em um siste ma Hewlett-Packard série HP 1100 com detecção DAD e MSD 1100. A separação foi completada am C 18 de fase reversa (Agilent Hypersil ODS 5 μm, dimensão da coluna 4,6 x 100 mm), taxa de fluxo 0,7 mL por minuto com a utilização de um gradiente padrão: 10% acetonitrila, 15 minutos; 98% de acetonitrila (solventes Burdick & Jackson de alta pureza). A detecção MS foi em modo ESI positivo, voltagem de capilar 3500 eV, voltagem de fragmentação 70 eV, faixa de massa m/z 100 - 1000. O modo APCI foi medido em uma velocidade de fluxo de 0,5 mL por minuto, detecção positiva, voltagem de capilar 3500 eV, voltagem de fragmentação 70 eV.

[00115] Os espectros RMN-RMN foram medidos em um espectrô- metro Varian 300 MHz de campo gradiente com modo inverso para os espectros 1H ou 2D-RMN.Os espectros 13C e DEPT foram medidos e, um instrumento Varian 400 MHz de banda larga. A referência é ajustada no padrão interno de tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm).

[00116] MS-EI - Os espectros MS-EI de baixa resolução foram executados em um espectrômetro de massa Hewlett-Packard com um dispositivo de campo de setor magnético, velocidade de aquecimento de 20 C por minuto até 320°C, entrada de injeção direta.

[00117] FTMS-MALDI - Os dados de MS de alta resolução foram obtidos através do modo de operação MALDI em um InoSpec Ultima FT Mass Spectrometer.

[00118] IR - Os espectros infravermelhos (IR) foram medidos em um espectrofotômetro Perkin-Elmer FT com a utilização de janelas de NaCl.

Exemplo 1 Isolamento e Caracterização da espécie " Salinospora", Culturas Nos. CNB392 e CNB476

[00119] As CNB392 e CNB476 possuem nucleotídios de assinatura no interior dos seis 16S rDNA, o que separa essas cepas filogenetica- mente de todos os outros membros da família das Micromonosporace- ae (ver a Figura 15). Esses nucleotídios de assinatura apresenta sido determinados como sendo um marcador definitivo para os membros desse grupo que também apresenta uma necessidade fisiológica de crescimento de sódio. Os nucleotídios de assinatura foram alinhados para as posições 27 - 1492 do E.coli com a utilização de todos os membros existentes das Micromonosporaceae no Ribosomal Database Project (Projeto de Base de Dados Ribossômicos) de 31-1-01. Para o grupo de organismos da "Salinospora", 45 morfotipos parcialmente sequenciados mostraram todos os nucleotídios de assinatura a partir as posições 207 a 468.Os setes isolados da "Salinospora" sequencia- dos quase em sua totalidade (ver a figura 2) exibiram todas as assinaturas da Figura 15.

[00120] As cepas CNB392 e CNB476 formam colônias de cor laranja brilhante até preta sobre ágar e não possuem micelas aéreas. São produzidos pigmentos marrons escuro e laranja brilhante que podem ser difundidos dependendo o estágio de crescimento celular.Os esporos escurecem a superfície da colônia e são cultivados sobre o substrato da micela.As micelas vegetativas são finamente ramificadas e não se fragmentam.Os esporos são produzidos de forma isolada ou em agrupamentos.Não foram observadas para essas cepas nem es- porângios ou mobilidade de esporos.As CNB392 e CNB476 apresenta uma exigência de crescimento de obligato com relação ao sódio e não irão crescer em meio típico usado para a manutenção de outros membros genéricos das Micromonosporaceae. As CNB392 e CNB476 foram avaliadas como crescendo otimamente em meio sólido TCG ou MI a 30°C.

Fermentação

[00121] As CNB392 e CNB476 são cultivadas em meio A1Bfe+C ou CKA agitado, 1 litro a 35° C durante 9 dias. Depois de 4 dias, são adi- cionados 20 gramas de resina Amberlite XAD-16 (Sigma, absorvente polimérico não iônico).

Extração

[00122] A resina XAD-16 e o extrato orgânico são decantados com um litro de acetato de etila seguido por 1 litro de metanol. O filtrado é em seguida extraído com acetato de etila (3 x 200 mL). O extrato em bruto a partir da absorção da XAD é de 105 mg. A citoxidez no ensaio HCT-116 sobre a célula do câncer de cólon humano é IC50 < 0,076 μg/mL.

Isolamento da Salinosporamida A a partir da CNB392.

[00123] O extrato em bruto foi cromatografado por cintilação cobre C18 de fase reversa (RP) com a utilização de um gradiente progressivo (Figura 5). A análise HCT-116 resultou em duas frações ativas, CNB392-5 e CNB392-6. As frações ativas combinadas (53,7 mg), HCT-116 < 0.076 μg/mL, foram em seguida cromatografadas em um RP-HPLC isocrático, com a utilização de 85% de metanol em um fluxo de 2 mL por minuto como o decantador e usando a detecção através de índice de refração. A fração ativa CNB392-5/6 (7,6 mg, HCT-116 < 0,076μg/mL) foi purificada em um HPLC isocrático de fase normal sobre sílica-gel com acetato de etila:isooctano (9:1) a 2 mL por minuto. A Salinosporamida A (Figura 1) foi isolada como um sólido amorfo incolor em um rendimento de 6.7 mg por litro (6.4%). O TLC sobre sílica- gel (diclorometano: metanol 9:1) mostra a Salinosporamida A a rr = 0,6, nenhuma extinção por UV ou fluorescência a 256 nm, amarelo com H2SO4/ etanol, vermelho amarronzado escuro com reagente de Godin (vanilina/ H2SO4/HClO4). A Salinosporamida A é solúvel em CHCl3, metanol e outros solventes polares tais como o DMSO, acetona, acetonitrila, benzeno, piridina, N,N-dimetilformamida e os semelhantes. 1H RMN: (d5-piridina, 300 MHz) 1,37 - 1,66 (2H, m, CH2), 1,70 - 2,29 (2H, m, CH2), 1,91 (2H, largo, CH2), 2,07 (3H, s, CH3), 2,32 - 2,48 (2H, ddd, 3J = 7,0 Hz, CH2), 2,85 (1H, largo, m, CH), 3,17 (1H, dd, 3J = 10,0 Hz, CH), 4,01 - 4,13 (2H, m, CH2), 4,25 (1H, d, 3J = 9,0 Hz, CH), 4,98 (1H, largo, OH), 5,88 (1H, ddd, 3J = 10 Hz, CH), 6,41 (1H, d largo, 3J = 10 Hz, CH), 10,62 (1H, s, NH). 13C RMN/DEPT: (d5-piridina, 400 MHz), 176,4 (COOR), 169,0 (CONH), 128,8 (=CH), 128,4 (=CH), 86,1 (Cq), 80,2 (Cq),, 70,9 (CH), 46,2 (CH), 43,2 (CH2), 39,2 (CH), 29,0 (CH2), 26,5 (CH2), 25,3 (CH2), 21,7 (CH2), 20,0 (CH3). LC-MS (ESI) tr = 10,0 minutos, fluxo 0,7 mL por minuto m/z: (M+H)+ 314, (M+Na)+, 336; fragmentos: (M+H+CO2) 229, (M+H-CO2-H2O)+ 270, 252, 204. Padrão Cl : (M+H, 100%)+ 314, (M+H, 30%)+ 316. LC MS (APCI): tr = 11,7 minutos, fluxo 0,5 mL por minuto. m/z: (M+H)+ 314; fragmentos: (M+H-CO2-H2O)+ 270, 252, 232, 216, 160. Padrão Cl : (M+H, 100%)+ 314, (M+H, 30%)+ 316. EI: m/z: 269, 251, 235, 217, 204, 188, (100%), 160, 152, 138, 126, 110,81 FTMS - MALDI: m/z: (M+H)+ 314,1144 FT-IR: (cm-1) 2920, 2344, s, 1819 m, 1702 s, 1255, 1085 s, 1020 s, 797 s. Fórmula molecular: C15H20ClNO4.

Exemplo 2 Análises de Bioatividade

[00124] A Salinosporamida A exibe uma forte atividade contra células do câncer de cólon humano com um IC50 de 0,011 μg/mL (ver a Figura 4). A projeção com relação à atividade antibacteriana ou anti- fúngica não mostra uma atividade significativa, ver a Tabela 1.TABELA 1

[00125] A cristalização de um composto da estrutura I a partir de acetato de etila/ isooctano resultou em cristais cúbicos, isolados, que exibiram uma difração como a de um sistema monoclínico P2(1). O volume não usual elevado de unidade de célula de 3009 Â abrigou quatro moléculas independentes em que foram observadas diferentes posições de conformação com relação ao substituinte flexível cloroeti- la. A designação da estrutura absoluta a partir da anisotropia de difra- ção do substituinte de cloro resolveu a estereoquímica absoluta da Sa- linosporamida A como 2R,3S,4R,5S,6S (Figuras 16 e 17) com um pa-râmetro de Flack de 0,01 e um esd de 0,03.

[00126] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos acima, ficará entendido que modificações e variações estão englobadas dentro do espírito e do âmbito da invenção. Por conse- qüência, a invenção está limitada somente pelas reivindicações que se seguem.

Claims (6)

1.Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um veículo farmaceuticamente aceitável e de um composto apresentando a estrutura do composto (V):

sendo que a dita composição compreende ainda sacarose.

2.Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está na forma de uma solução injetável estéril ou de um sólido.

3.Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a solução injetável estéril é uma solução injetável estéril aquosa.

4.Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente adicional.

5.Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de um distúrbio de proliferação de uma célula de mamífero, sendo que o distúrbio é selecionado do grupo que consiste em adeno-carcinoma pancreático, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), sarcoma de tecido mole, sarcoma de ossos, neoplasma da cabeça, neoplasma do pescoço, neoplasma gástrico, neoplasma da tireóide, neoplasma do estômago, mieloma, neoplasma da bexiga urinária, ne-oplasma neuro endócrino, neoplasma de doença não de Hodgkin e neoplasma de doença de Hodgkin.

6.Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a célula de mamífero é humana.

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