BRPI0309918B1 - Aplicação aperfeiçoada para ácidos de lúpulo como agentes antimicrobianos - Google Patents

Description

"APLICAÇÃO APERFEIÇOADA PARA ÁCIDOS DE LÚPULO COMO AGENTES ANTIMICROBIANOS" Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provi-sional U.S. N° 60/381.659, depositado em 17 de maio, de 2002. A presente invenção se refere ao uso de extratos de β-ácidos derivados de lúpulo em propileno glicol para controlar o crescimento bacteriano. A invenção tem utilidade particular junto com o controle das bactérias em indústrias de processamento de alimentos brutos, tal como indústrias de processamento de aves e processamento de açúcar, e também tem aplicação em cosméticos e farmacêuticos embora outras utilidades sejam contempladas.

Os lúpulos são principalmente empregados na fermentação da cerveja. Sabe-se que os compostos derivados das flores da planta de lúpulo fêmea (Humulus lupulus L.) contribuem com um sabor amargo desejável da cerveja. Este amar-gor deriva dos então chamados α-ácidos, uma série de homólogos de ácidos orgânicos que são convertidos durante a ebulição do mosto de cerveja do cervejeiro, em α-ácidos isomeri-zados, altamente amargos (iso-a-ácidos) Os lúpulos também contêm uma série de análogos de β-ácidos. Essas substâncias, que têm solubilidade aquosa muito baixa, são de pouco valor na fermentação e são quase totalmente eliminadas do mosto de cerveja por precipitação no "trub" proteináceo que se forma durante a ebulição. Muitos cervejeiros atualmente usam os extratos de lúpulo que são convenientes e muito mais estáveis do que os lúpulos secos tradicionais. Tais produtos são feitos extraindo-se os lúpulos com solvente orgânico (quase exclusivamente etanol) ou, mais comumente, com dióxido de carbono ou no estado líquido ou supercrítico. Esses extratos contêm altos teores de α-ácido e β-ácido, a maioria do resíduo consistindo em óleo de lúpulo, ceras e resinas não caracterizadas. Tipicamente, o teor de α-ácidos de um extrato de lúpulo está na faixa de 35-65% em peso, enquanto ο β-ácido 15-40%. As companhias de processamento de lúpulo têm durante muitos anos também oferecido aos cervejeiros uma escolha de produtos mais refinados os quais sejam preparados dos extratos de lúpulo através de fracionamento e conversão mecânica, muitos dos quais podem ser adicionados no processo de fermentação após a fermentação do mosto de cerveja. Tais produtos incluem preparações aquosas de iso-a-ácido purificados, e seus derivados quimicamente reduzidos, especialmente tetraidroiso-a-ácidos. No curso da preparação desses produtos, o processador de lúpulo tipicamente obterá uma fração de subproduto que compreende principalmente uma mistura de β-ácidos e óleos de lúpulo, mais alguns componentes menores incluindo ceras e pequenas quantidades de iso-a-ácidos. Esta fração, comumente conhecida como "β-fração", "Extrato de A-roma Beta" ou "Extrato Base" é freqüentemente vendido aos cervejeiros para a adição à caldeira do mosto de cerveja, onde o componente do óleo de lúpulo transmite sabores aromáticos. Entretanto, é também comum separar os óleos dos β-ácidos, possibilitando um "Extrato de Aroma" mais potente a ser oferecido e liberação dos β-ácidos para outros usos.

Além de ser empregado com o propósito de contribu- ir com os sabores aromáticos e amargos da cerveja, os lúpulos são conhecidos por serem úteis para controlar o crescimento bacteriano durante o processo de fermentação. Tem sido demonstrado que os ácidos de resina de lúpulo (α-ácidos, β-ácidos, iso-a-ácidos e iso-a-ácidos quimicamente reduzidos tal como tetraidroiso-a-ácidos) têm atividade anti-microbiana e são especialmente ativos contra bactérias positivas Gram. Conseqüentemente, vários usos para os ácidos de resina de lúpulo em aplicações de processamento de alimentos, cosméticos e farmacêuticos têm sido descritos. Os β-ácidos são geralmente considerados serem agentes naturais particularmente eficazes. Na WO 00/52212 é observado que "certos ácidos de lúpulo exibem efeitos anti-bacterianos em veículos aquosos contendo açúcar. Por exemplo, o Pedido de Patente Europeu N° 681 029 A2 divulga um processo para a i-nibíção termofílica de micro-organismos na presença de veículo aquoso de sacarose, no qual um produto com base em lúpulo é adicionado a um veículo aquoso de sacarose em temperaturas entre 50°C e 80°C. E, a Patente U.S. N° 5.286.506 divulga um processo de aplicação de uma solução contendo beta ácidos a um produto alimentício sólido para prevenir o crescimento de Listeria. De acordo com Arch. Mikrobiol. 94 (1973), p. 159-171, os beta ácidos exibem o efeito bacterio-estático superior, em comparação com os alfa ácidos e isoal-fa ácidos; entretanto, por causa de sua fraca solubilidade, certas concentrações de beta-ácidos não podem ser excedidas". Os ácidos de resina de lúpulo, especialmente β-ácidos, também têm sido reivindicados como agentes antibac- terianos eficazes em processamento de alimentos na Patente Provisional U.S. N° 2002/0197366, Patente U.S. N° 6.251.461 e Patente U.S. N° 6.475.537, e também foram recentemente mostrados por terem atividade útil contra o crescimento de algas em sistemas de água (Patente U.S. N° 6.379.720 e Pedido PCT N° WO 02/078450), protozoa (Patente U.S. N° 6.352.726 e Patente U.S. N° 6.423.317) e foram propostos como agentes ativos contra mastite em vacas, onde o composto de lúpulo pode ser aplicado ao úbere e tetas das vacas (Pedido de Patente U.S. N° 2003/0013773. A possibilidade de usar ácidos de lúpulo em anticépticos bucais e pastas de dente para suprimir a atividade de Streptococcus mutans e desse modo ajudar a prevenir as cáries foi descrita na Patente U.S. N° 5.370.863. O mecanismo geral pelo qual os ácidos de lúpulo são acreditados atuarem contra bactérias susceptíveis (Gram + ve) foi discutido por Simpson e Smith (Simpson, W.J. e Smith, A.R.W., 1992 em Factors affecting antimicrobial acti-vity of hop compounds and their derivatives". The Journal of Applied Bacteriology 72 (4) :327-334) .

Por causa da maioria dos produtos agrícolas virem do campo, a contaminação bacteriana é inevitável. Similarmente, a contaminação bacteriana de carnes frescas é difícil de evitar.

Recentemente, a indústria de açúcar de beterraba começou a usar β-ácidos em um nível de ppm baixo como um a-gente para o controle do crescimento bacteriano no processamento do açúcar de beterraba. Mais particularmente, a indústria de açúcar tem empregado β-ácido em soluções alcalinas, aquosas como um aditivo durante o processamento de açúcar de beterrabas. Entretanto, uma vez que as preparações de β-ácido são frequentemente um pouco amargas (provavelmente na maior parte devido a contaminação com pequenas quantidades de iso-a-ácido altamente amargo), elas são empregadas muito moderadamente. WO 00/52212 ensina que uma solução alcalina aquosa de β-ácidos pode ser preparada em uma concentração de cerca de 10% em peso e que desta forma a atividade anti-bacteriana é melhor do que aquela de uma quantidade similar de β-ácidos aplicados como uma emulsão ou dissolvidos em um solvente orgânico. Entretanto, uma desvantagem prática considerável de tais soluções é sua tendência, durante o armazenamento, de precipitar a cera ou matéria resinosa o que pode sujar o oleoduto e as bombas de dosagem. As soluções devem também ser impedidas de congelar e desse modo podem requerer aquecimento durante o transporte e armazenamento em tempos frios do ano. Entretanto, tais soluções são relativamente instáveis. Em contraste, nós constatamos que os β-ácidos, quando dissolvidos em propileno glicol na forma de seus sais de metal de álcali, têm estabilidade química e física sobre uma ampla faixa de temperatura e podem ser preparados em concentrações substancialmente e vantajosamente mais elevadas. 0 uso de propileno glicol como um solvente para muitas substâncias orgânicas é bem conhecido, e também tem sido empregado como um ajudante na solubilização de os α-ácidos isomerizados, quimicamente reduzidos e isomeriza-dos. Por exemplo, Paul Todd, Jr. na Patente U.S. N° 3.486.906 descreve a preparação de iso-a-ácidos dissolvidos em sua forma de ácido livre. A presente invenção divulga que certos extratos de lúpulo, isto é, β-ácidos na forma de sal de metal de álcali são solúveis e estáveis quando dissolvidos em propileno gli-col (1,1-propanodiol), e são portanto especialmente úteis como agentes antibacterianos para o tratamento de uma ampla variedade de produtos alimentício, incluindo a adição aos fluxos do processo líquido rico em açúcar tal como ocorre nas indústrias de destilação e processamento de açúcar, como agentes no tratamento de água e em aplicações cosméticas e farmacêuticas apropriadas. Os sais de metal de álcali, que preferivelmente compreendem sais de sódio e potássio, são mais convenientemente preparados pelas combinação com propileno glicol de β-ácidos que foram preparados em sua forma de ácido livre, insolúvel em água e liquefeitos por aquecimento acima de cerca de 40°C, preferivelmente cerca de 60°C, e a adição simultânea ou seqüencial de solução de hidróxido de metal de álcali aquosa, concentrada. Deste modo, uma solução estável homogênea é obtida, a qual tem somente um pequeno teor de água (tipicamente cerca de 5%). Alternativamente, embora métodos um pouco menos satisfatórios para a preparação de tais soluções incluam a dissolução direta dos sais de metal de álcali dos β-ácidos (preparado, por exemplo, pelo método da Patente U.S. N° 5.624.701) ou a adição de hidróxido de metal de álcali sólido â mistura de β-ácidos e propileno glicol.

Outras características e vantagens da presente invenção serão observadas a partir da seguinte descrição deta- lhada, tomada em conjunto com a FIGURA 1, que ilustra um processo para a produção dos sais de metal de álcali de β-ácidos em propileno glicol útil de acordo com a presente invenção. A presente invenção emprega os sais de metal de álcali de β-ácidos no propileno glicol. 0 propileno glicol, que tem paladar doce, potencialmente ajuda a mascarar qualquer amargor residual das preparações de β-ácidos, surgindo a partir da presença de pequenas quantidades do iso-a-ácido altamente amargo. Surpreendentemente, nós temos constatado que os sais de metal de álcali dos β-ácidos são mais solúveis em propileno glicol do que são os ácidos livres sozinhos, e mais solúveis também do que eles são na água. Eles são também notavelmente estáveis e não desperdiçam qualquer precipitado mesmo em temperaturas de armazenamento bem abaixo de 0°C. Essas características permitem que soluções mais concentradas, estáveis e eficazes, sejam preparadas, transportadas e empregadas melhor do que foi obtido até agora. Convenientemente, eles são miscíveis com água, facilitando a fácil dosagem em concentrações reduzidas. 0 propileno glico é portando especialmente valioso em seu uso como um solvente ou portador para β-ácido de acordo com a presente invenção.

Os β-ácidos como empregados aqui podem ser preparados de lúpulos extraídos de solvente orgânico, lúpulos extraídos de C02 líquido ou lúpulos extraídos de C02 supercrí-tico. Preferida é a fração de β-ácido obtida pela extração de C02 líquido de lúpulos. Os extratos de β-ácidos de lúpulo contêm três homólogos principais- colupulona, lupulona e ad-lupulona. Todos os três homólogos são acreditados serem ati- vos como agentes anti-microbianos. Os β-ácidos em propileno glicol podem ser vaporizados sobre os materiais alimentícios, ou os materiais alimentícios podem ser imersos em uma solução contendo os β-ácidos, dosados em fluxos de processos como um agente anti-microbiano ou então adicionados como ingredientes na formulação de produtos farmacêuticos ou cosméticos .

Os β-ácidos são tipicamente dissolvidos em propileno glicol como seus sais de metal de álcali para fornecer uma solução contendo 1-30% de β-ácidos, preferivelmente cerca de 5-25%, mais preferivelmente cerca de 20% em peso de β-ácídos. As soluções estáveis, úteis dos sais de metal de álcali de certos outros ácidos de resina de lúpulo também podem ser preparadas. O propileno glicol é considerado como um material GRAS (geralmente com respeito â segurança), muito seguro que é amplamente empregado como um portador para ingredientes alimentícios, sendo geralmente permitido para uso em produtos alimentícios em níveis que não excedam a boa prática de preparação. Sob os regulamentos do FDA dos Estados Unidos, ele é especificamente permitido em até 2,5% em produtos de laticínio congelados, 5% em bebidas com álcool, 24% em confeitos e glacês, e 97% em temperos.

Uma vantagem e característica particular para a presente invenção é que o propileno glicol tem um sabor doce que pode ser esperado parcialmente mascarar o sabor normal-mente levemente amargo das preparações de β-ácidos quando empregados em aplicações de processamento de alimentos.

Os seguintes exemplos são pretendidos ilustrar, porém não limitar, o escopo da invenção.

Exemplo 1 (Processo para a produção de β-ácido na forma de sal de potássio em propileno glicol) Este Exemplo ilustra um processo para a produção de beta ácidos em propileno glicol.

Referindo-se a Fig. 1, 1,00 kg de um "Extrato de Aroma Beta" obtido como um subproduto da preparação de iso-α-ácidos são adicionados a 3,365 kg de água desmineralizada, agitados e aquecidos a 60°C. 0 hidróxido de potássio concentrado (45% em peso na solução aquosa) é adicionado â solução agitada até que um pH de cerca de 10,6 seja alcançado, fazendo com que a maioria dos β-ácidos dissolva. Após a agitação durante vários minutos, as camadas aquosas e oleosas (orgânicas) são permitidas separar-se. A camada aquosa contendo o volume dos β-ácidos é coletada e 50% (em peso) de ácido sulfúrico na solução aquosa é adicionado até que o pH de cerca de 6,5 seja alcançado, os β-ácidos em seguida foram na maior parte precipitados da solução. Após agitação durante uns poucos minutos, as camadas orgânicas e aquosas são permitidas separar-se. A camada aquosa é em seguida removida. Finalmente, a fase orgânica móvel rica em β-ácido, de lúpulo é adicionada a uma quantidade calculada de propileno glicol, uma solução aquosa de hidróxido de potássio (45% peso/ peso) suficiente para converter os β-ácidos em sua forma de sal de potássio é agitada nesta mistura, sendo simultaneamente resfriada a 40°C e produzindo uma solução de β-ácidos (20% peso/peso) em propileno glicol. As pessoas versadas na técnica apreciarão que uma preparação mais pura de β-ácidos em propileno glicol possa ser feira alterando-se as condições do estágio de purificação inicial ou adicionando-se outra extração aquosa e estágios de separação ao processo antes do estágio de formulação final. Tal purificação extra foi aplicada a produção das resinas de β-ácidos empregadas como o material bruto no próximo exemplo.

Exemplo 2 (Produção de β-ácidos na forma de sal de potássio em propileno glicol) Uma mistura de 46,35 g de β-ácidos, preparação da forma de resina de ácido livre contendo 71,7% em peso de β-ácidos por HPLC (empregando ICE-2 padrão) e 100,0 g de propileno glicol (grau USP) foi aquecida a 60°C e combinada junto em um béquer de vidro em 500 rpm empregando um impul-sor de 6 cm de diâmetro. Em seguida 8,5 mL de 45% (peso/ peso) de solução de hidróxido de potássio foram adicionados. O produto resultante foi um fluído levemente viscoso, marrom claro contendo 19,9% em peso de β-ácidos (HPLC, ICE-2 padrão) . Uma alíquota de 5 g desta amostra foi diluída com 10 mL de água e teve um pH de 10,7. Esta amostra quando resfriada em temperatura ambiente permaneceu translucente e permaneceu como um fluído essencialmente homogêneo, embora um tanto mais viscosa que a outra, mesmo quando submetida a esfriamento a cerca de -15°C em um congelador.

Exemplo 3 (Processo para a preparação de 15% de Beta (Sal de Sódio) em Propileno Glicol) 33,2 g de uma preparação de β-ácidos na forma de ácidos livres (67,6% de beta ácidos por HPLC empregando ICE-2 padrão) e 71,9 g de propileno glicol (grau USP) foram a- quecidos a 60°C e agitados e em seguida 3,6 mL de 50% (peso/ peso) de solução de hidróxido de sódio aquosa foram adicionados. Uma alíquota de 4 g, com 8 g de água, teve um pH de 11,1. Uma alíquota desta amostra transformou-se em gel sob resfriamento em temperatura ambiente. Um total de outros 33 g de propileno glicol adicionado foi requerido para prevenir a formação de gel sob resfriamento em temperatura ambiente. Esta amostra consistiu em 14,8% de β-ácidos (HPLC, ICE-2 padrão) . Uma alíquota de 5 g diluída com 10 mL de água teve um pH de 10,8.

Exemplo 4 (Comparação da Estabilidade de 10% de flácidos em aquosos com 20% de β-ácidos em propileno glicol) A 193,6 g de "extrato de aroma beta" (47,1% de β-ácidos por HPLC empregando ICE-2 padrão)foram adicionados 550 mL de água deionizada. Com agitação, e a 60°C, 18,2 mL de 45% de KOH foram adicionados para levar o pH para 10,3. Após permitir que as fases se separassem durante 1,5 hora em um funil separador mantido em um forno a 60°C, a fase aquosa turva reduzida foi removida. Após resfriamento em temperatura ambiente, esta fase aquosa foi filtrada através de um papel N° 1 Whatman; o filtrado sendo translucente e consistindo em 10,7% de beta-ácidos (peso/ peso, por HPLC). Este filtrado foi permitido descansar durante a noite em um refrigerador a cerca de 3°C e a maioria do precipitado foi removida por uma segunda filtração através de papel N° 1 Whatman. O filtrado foi completamente diluído com água para 10,1% de β-ácidos (HPLC, ICE-2 padrão) e o pH levado para 11,1 com uma pequena quantidade de 45% de KOH. Uma alíquota desta solução foi armazenada em uma garrafa PETG em temperatura ambiente durante 6 meses. A concentração dos β-ácidos na solução diminuiu para 9,0% e houve uma camada de resina no fundo da garrafa. Por comparação, após um ano de armazenamento em temperatura ambiente na garrafa PETG os β-ácidos a 20% em propileno glicol do Exemplo 2 não tiveram nenhuma resina visível sedimentada e tiveram uma concentração de β-ácidos de 20,2% (HPLC, ICE-2 padrão); indicando nenhuma alteração sig-nificante na concentração de β-ácidos. Este exemplo mostra a estabilidade superior da solução a 20% de β-ácidos em propileno glicol, por meio da qual a precipitação indesejada do β-ácído e outras substâncias de cera que ocorrem por um tempo prolongado nos β-ácidos a 10% na solução de água, são completamente eliminadas.

Exemplo 5 (Estabilidade térmica de β-ácidos em propileno glicol) Uma amostra do produto de solução de β-ácido a 20% (sal de potássio) do Exemplo 2, foi colocada em um frasco de vidro e armazenada a 60°C durante 4 semanas antes do exame e de outra análise por HPLC. A solução foi constatada ter permanecido livre de precipitado e o teor de β-ácido foi inalterado em 19,9%, indicando que a solução de β-ácido na forma de sais de potássio foi estável durante o período do teste.

Exemplo 6 (Atividade anti-bacteriana do β-ácido na forma de sal de potássio no propileno glicol) Uma alíquota da solução do produto de β-ácido a 20% do Exemplo 2 foi diluída em água para produzir as concentrações necessárias para determinar a quantidade mínima de inibidor para o crescimento bacteriano quando adicionado ao molho de soja trypticase inoculado. As amostras nas concentrações mostradas nas Tabelas 1 & 2 foram testadas em duas experiências separadas nos seguintes micróbios Gm + ve: Bacíslus subtilis, Bacillus megaterium, Staphylococcus sa-prophyticus e Streptococcus salivaris. Pode ser observado que a inibição total foi alcançada em 10 a 100 pg/mL, dependendo dos microorganismos particulares.

Tabela 1: Teste experimental da potência antibac-teriana dos β-ácidos na forma de sal de potássio em propile-no glicol ++++ = nenhuma inibição Tabela 2: 2o Teste experimental da potência anti-bacteriana dos β-ácidos na forma de sal de potássio em pro-píleno glicol ++++ = nenhuma inibição Exemplo 7 Uma alíquota da solução do produto de β-ácido a 20% do Exemplo 2 foi adicionada a um ungüento em 2 mg/g de ungüento, representando uma adição de 400 ppm de β-ácido. Após combinar cuidadosamente os ingredientes juntos em um pilão, a atividade do inibidor foi determinada contra o organismo Bacilus subtilis em um teste de difusão, como segue.

Uma suspensão bacteriana tendo uma densidade de inóculo de aproximadamente 1 x 108 CFU/mL (unidade de formação de colônia por mL) foi adicionada a 10 mL de agar de soja trypticase fundido a 46°C. Após a inoculação com o organismo teste o agar foi misturado cuidadosamente e em seguida derramado em um prato petri de plástico. Após o enrijecimen-to do Agar, cavidades foram feitas empregando um perfurador de cortiça (7 mm de diâmetro). Cada cavidade foi então carregada ou com ungüento básico (controle) ou com o ungüento contendo β-ácidos adicionados.

As placas em duplicata foram preparadas e os dois pratos incubados durante 24 horas a 37°C, tempo pelo qual uma relva homogênea das bactérias se desenvolveu sobre a superfície do agar, excluindo uma tal zona clara que podia ser observada ao redor das cavidades que continham o ungüento teste. 0 raio das zonas de inibição foi medido próximo de 0,1 cm e cada tempo da zona de inibição mediu 0,2 cm, demonstrando a eficácia de pequenas quantidades de β-ácido que foram adicionadas ao ungüento teste na forma de sua solução de sal de potássio em propileno glicol.

Ao mesmo tempo em que a invenção foi descrita a-través de exemplos e em termos da modalidade preferida, é para ser entendido que a invenção não é limitada às modalidades divulgadas. Ao contrário, é pretendido abranger várias modificações e disposições similares como seria aparente por aqueles versados na técnica. Portanto, o escopo das reivindicações anexas deveria estar de comum acordo com a ampla interpretação a fim de abranger todas tais modificações e disposições similares.

Claims (4)

1. Processo para a preparação de uma solução de β-ácidos derivados de lúpulo adequada para uso na prevenção ou restrição do desenvolvimento bacteriano, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: (a) aquecer uma mistura de 1 a 30 por cento em peso de β-ácidos derivados de lúpulo e propileno qlicol; (b) simultaneamente ou sequencialmente, adicionar uma solução concentrada aquosa de um hidróxido de metal alcalino à mistura aquecida o suficiente para obter uma solução homoqênea tendo um pH de pelo menos cerca de 9,0, conforme medição após 3 x de diluição em áqua, sendo o metal alcalino potássio ou sódio; e (c) resfriar a mistura resultante.

2. Unquento ou creme farmacêutico ou cosmético, CARACTERIZADO pelo fato de que contém os sais de metal alcalino de β-ácidos derivados de lúpulo em propileno qlicol preparados através do processo conforme definido na reivindicação 1, em quantidade suficiente para prevenir ou retardar o crescimento de bactérias.

3. Preparação, CARACTERIZADA pelo fato de ser dos sais de metal alcalino dos β-ácidos derivados de lúpulo em propileno qlicol preparados através do processo conforme definido na reivindicação 1, e na qual a concentração dos β-ácidos varia de 10 a 20 por cento em peso.

4. Preparação, CARACTERIZADA pelo fato de ser dos sais de metal alcalino dos β-ácidos derivados de lúpulo em propileno qlicol preparados através do processo conforme de- finido na reivindicação 1, e na qual o teor de água é de 0% a 7%.