BRPI0209085B1 - construto de dna, sistema de expressão e célula hospedeira ou vírus relacionados com o amadurecimento de mamão papaia, bem como métodos para promover ou retardar o amadurecimento de fruto de mamão papaia - Google Patents

Abstract

"moléculas de ácido nucléico relacionadas com o amadurecimento de mamão papaia". a presente invenção refere-se a moléculas de dna e constructos de dna que promovem o amadurecimento do fruto de mamão papaia. a presente invenção é também dirigida a métodos para promover ou retardar o amadurecimento de plantas de mamão papaia através da transformação de mamão papaia com os constructos de dna contendo os ácidos nucléicos que codificam proteínas ou polipeptídeos envolvidos no amadurecimento de mamão papaia. a invenção também refere-se a sistemas de expressão, células hospedeiras, e plantas contendo estes constructos de dna.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONS-TRUTO DE DNA, SISTEMA DE EXPRESSÃO E CÉLULA HOSPEDEIRA OU VÍRUS RELACIONADOS COM O AMADURECIMENTO DE MAMÃO PAPAIA, BEM COMO MÉTODOS PARA PROMOVER OU RETARDAR O AMADURECIMENTO DE FRUTO DE MAMÃO PAPAIA".

[001] A presente invenção reivindica benefício de pedido provisório de patente US número de série 60 /283 008, depositado em 11 de abril de 2001, e que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico envolvidas no amadurecimento de fruta de mamão papaia, e métodos para controlar o amadurecimento de mamão papaia por transformação das plantas com estas moléculas de ácido nucléico, e plantas transgêni-cas e sementes transformadas com estas moléculas de ácido nucléico. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] O mamão papaia (Carica papaya L.) ("CP") é uma cultura de frutas importante cultivada amplamente em áreas de planícies tropicais e subtropicais. Brasil, índia e México são os principais produtores de mamão papaia. Hawai é o maior produtor de mamão papaia nos Estados Unidos, Cerca de 66% da produção total de mamão papaia havaiano são exportados, primariamente para o território americano e Japão (Gonsalves, D. "Control of Papaya Ringspot Virus in Papaya: A Case Study", Ann. Rev. Phvtopathol. 36: 415-37 (1998)). Infe-lizmente, a fruta é frágil, uma característica limitando a exportação em larga escala de mamão papaia maduro em países em regiões temperadas. Para minimizar este problema, a prática corrente tem sido coletar os frutos para exportação em fases muito precoces de maturação com a conseqüência de adulteração das características organolépticas deste fruto. Esta coleta prematura dos frutos, projetada para evitar dano em subseqüente manipulação, pode resultar em uma falha para desenvolver o sabor e cor ótimos do fruto. [004] Outra tática empregada para retardar o processo de amadurecimento em trânsito é expedir e armazenar o mamão papaia em temperaturas frias. Esta prática resulta, por fim, em significante dano ao fruto também, como o fruto de mamão papaia é susceptível a dano provocado por resfriamento, com temperatura crítica na faixa entre 10-15^. Em mamão papaia, os sintomas de dano pelo resfriamento são mais evidentes quando do retorno do fruto a maiores temperaturas de amadurecimento, que resulta em excesso amaciamento e a melhora associada com susceptibilidade a patógenos (Chan et al, "Electrolyte Leakage and Ethylene Production Induced by Chiiling Injury of papayas", Hort. Science 20:1070-1072 (1985), Lyons et al, "Chiiling Injury11 em Weich-mann ed., Fostharvest Phvsioloqy of Veqetabies. NY, Marcell Dekker Inc. p. 305-326, (1987). Em um esforço para resolver os problemas associados com expedição de frutos a longa distância, os pesquisadores têm concentrado na elucidação do papel de enzimas envolvidas no processo de amadurecimento. Três enzimas que demonstraram ser vitais para o amadurecimento de frutos são a família de pectinmetiiesterase ("PME"), β-glucuronidase ("β-Gal"), e poiigalacturonase ("PG"). [005] PME é uma enzima pectolítica que tem sido implicada em amadurecimento de frutos (Bacic et al, "Structure and Functíon of Plant Cell Walls. In Biochemistry of Plant: A Comprehensive Treatise", ed. T Preiss. 14: 297-371, NY: Aeademic (1988)}. Esta enzima metabolizando a parede celular é responsável pela desmetilação de resíduos de ácido galacturônico em pectina de alto peso molecular, cada grupo metila sendo convertido em um próton e metanol (Hall et al, "Molecular Cha-racterization of cDNA Clones Representing Pectin Esterase Isozymes from To mato", Plant Mol. Biol. 25 (2): 313-318 (1994)}. A atividade PME foi relatada como aumentando durante o desenvolvimento de banana (Brady, "The Pecti neste rase of Pulp Banana Fruít", Aust. J. Plant Phvsi- oL 3: 163-172 (1976)), maçã (Knee M„ "Metabolism of Polygalac-turonase in Apple Fruit Cortical Tissue During Ripening”, Phytochemistry 17: 1262-1264 (1979), abacate (Awad et al, "Postharvest Variation in Cellulase, Polygalacturonase and Pectin Methyl este rase ín Avocado Persea americana) Fruit in Relation to Respiration and Ethylene Produc-tion", Plant Phvsiol. 64: 306-308 (1979)), e papaia (Paul! et al, "Posthar-vest Variation in Cell Wall Degrading Enzymes of Papaya (Carica Papa-ya) During Ripening", Plant Phvsiol. 72-382-385 (1983). O papel exato de PME no desenvolvimento e amadurecimento de frutos ainda deve ser determinado. No entanto, foi formulada a hipótese de que a deses-terificação de pectina por PME e outra despolimerização por PG são envolvidos no amolecimento de frutos. Esta hipótese é baseada na observação de que a desmetilação de pectina por PME causa um aumento de várias vezes em solubilização de parede celular por PG (Pressey et al, "Solubilization of Cell Wall by Tomato Polygalacturonase Effects of Pectinesterase", J. Food Biochem. 6:57-74 (1982)). [006] Uma ampla faixa de enzimas é conhecida como catalisando aspectos de modificação e des montagem de pectina. Dentre as melhores caracterizadas, estão as exo- e endopoligalacturonases ("PGs") que estão implicadas na desmontagem de pectina que acompanha muitos estágios do desenvolvimento da planta, particular mente os requerendo separação celular. Apesar de ser evidente que PG participa em uma ampla faixa dos processos de desenvolvimento, a maior parte da pesquisa foi focalizada em seu papel no amadurecimento de frutos. [007] A desmontagem dependente de PG foi mais extensivamente estudada no amadurecimento de tomates. Seguindo as experiências de supressão de expressão de gene PG em tomate de tipo selvagem, e em expressão ectópica de PG no amadurecimento de inibidor de amadurecimento mutante pleiotrópico com prejuízo ao amadurecimento (urin“), foi considerado que a despolimerização de pectina mediada por PG não é necessária para o amadurecimento e o amolecimento normais. (Sheehy et al, "Reduction of Poiygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RN A", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8805-8809 (1988); Smith et al» "Antisense RNA Inhibition of Poiygalacturonase Gene Ex-pression in Transgenic Tomatoes" Nature 334: 724-726 (1988), Giovan-noní et al» "Expression of a Chimeric Poiygalacturonase Gene in Transgenic Rin (Ripening Inhibitor) Tomato Fruit Results in Polyuronide Deg-radation But Not Fruit Softening". Plant Cell 1:53-63 (1989)). A pesquisa realizada com tomates transgênicos sentido e anti-sentido sugere que a desmontagem de pectina mediada por PG não contribui para o amadurecimento prematuro de frutos, mas contribui para a deterioração do tecido nos estágios tardios de amadurecimento de frutos (Hadfield et al, "Poiygalacturonase Gene Expression in Ripe Melon Fruit Supports a Role for Poiygalacturonase in Ripening-Associated Pectin Disassembly", Plant Phvsiol. 117: 363-373 (1998)). A análise de paredes celulares de frutos transgênicos com níveis alterados de atividade PG leva à conclusão que a despolimerização de pectina e a solubilização de pectina são devido a distintos determinantes enzimáticos (Hadfield et al, "Polygalac-turonase: Many Genes in Search of a Funetion" Plant Phvsiol. 117: 337-343 (1998). De acordo com os mesmos autores, a solubilização de pectina é primariamente devido à ação de PG. O fato que pectinas em fruto rin complementado com PG são tanto solubilizadas como despolimeri-zadas leva à conclusão de que a atividade PG é necessária e suficiente para a despolimerização de pectina, mas pode ser uma dentre múltiplas atividades de solubilização de pectina redundantes. (Hadfield et al, "Poiygalacturonase: Many Genes in Search of a Funetion", Plant Phvsiol. 117: 337-343(1998)). [008] Em mamão papaia, a perda de firmeza gradual do fruto é associada com um aumento na atividade PG discernível, apesar de muito limitado. (Ali et al, "The Biochemical Basis of Accelerated Soften- ing in Papaya Following Storage at Low Temperatura", Acla Horticul-ture 343 (1993)). Em contraste, outros frutos como morango (Fragaria ananassa) (Huber, "Strawberry Fruit Softening: The Potential Roles of Polyuronides and Hemicelluloses’’, J. Food Sei. 49: 1310-1315 (1984), melão (Cucumis melo), (McColIum et al, "Modification of Polyrunides and Hemicelluloses Duríng Muslanelon Fruif Softening", Physiol. PI. 76: 303-308 (1989)), e caqui (Diospyrus kakí) (Cutillas-lturralde et al, "Me-tabolísm of Cell Wall Polysaccharides from Persimmon Fruit: Solubili-zation During Fruit Ripening Occurs in Apparent Absence of Polygalac-turonase Activity", Physiol. Plant. 89: 369-375 (1993) foi registrado como faltando atividade endo-PG. Recentemente, foi demonstrado que o acúmulo de PG mRNA pode ocorrer em estágios tardios de amadurecimento em níveis bem menores do que os observados no amadurecimento de tomate, somente detectáveis pelo uso de métodos muito precisos (Wu et al, "Endopolygalacturonase in Apples {Malus domestica) and íts Expression During Fruit Ripening" Plant Physiol. 102: 219-225 (1993)), Também foi registrado que três genes codificando PGs de melão, um dos mesmos (MPG1) codifica um endo-PG com o potencial para despolimerizar pectina da parede de célula do fruto de melão (Hadfield et al, "Polygalacturonase Gene Expression in Ripe Melon Fruit Supports a Role for Polygalacturonase in Ripening-Associated Pectin Disassembly", Plant Physiol. 117, 363-373 (1998)). Assim, é possível que em alguns frutos a desmontagem de pectinas em estágios posteriores de amadurecimento seja dependente de PG, mesmo em frutos com níveis muito baixos de atividade PG (Hadfield et al, "Polygalacturonase: Many Genes in Search of a Function", Plant Physiol. 117:337-343 (1998)). [009] Outra enzima que foi implicada no amadurecimento de frutos é β-Gal, uma enzima envolvida no amolecimento da parede celular e conhecida como existindo em três isoformas (β-Gal I, β-Gal II, e β-Gal III). Em "β-galactosidases in Ripening Tom atoes'1, Plant Phvsiol. 71: 132-135 (1983), Pressey et al, relataram o aumento de atividade de uma das três isozimas β-galactosidases durante o amadurecimento de tomate, sugerindo que estas isozimas podem desempenhar um papel na degradação de galactano na parede celular, que pode considerar o envolvimento de β-Gal no amolecimento de frutos. O envolvimento de β-Gal no amadurecimento do fruto de tomate foi confirmado {Watkins et al, "Activities of Polygalacturonase α-D Mannosidase and a-D and β-D Galactosidases in Ripening Tom ato,11, HortScience 23: 192-94 (1988). Mais recente mente, o aumento de β-Gal durante o amadurecimento de fruta de kiwi (Wegrzyn et al, "Pecti neste rase, Polygalacturonase and β-Galactosidase During Softening of Ethylene-Treated Kiwi Fruit", HortScience, 27: 900-902 (1992)), mango e mamão papaia (Lazan et al, "Cell Wall Hydrolases and The ir Potential in the Manipulation of Ripen-ing of Tropical Fruits", Asean Food J. 8: 47-53 (1993}}, abacate {De Veau et al, "Degradation and Solubilization of Pectin by β-Galactosidases Purified from Avocado Mesocarp", Physio. Plant 87: 279-285 (1993)), e café (Golden et al, "β-Galactosidase from Coffea arabica and its Role in Fruit Ripening", Fhvtochemistrv 34: 355-360 (1993) foi relatado. Em maçãs, a perda de firmeza do fruto durante o amadurecimento foi associada com aumentada atividade de β-galactosidase e uma diminuição no teor de Gal da parede celular (Bar-tley, "β-Galactosidase Activity in Ripening Apples”, Phvtochemistrv 13: 2107-2111 (1974), Wallner, "Apple Fruit β-galactosidase and Softening in Storage", J. Am. Soe. Hort. Sei. 103: 364 (1978). Além disso, Kang et al, ΊΜ-Terminal Amino Acid Seque π ce of Persimmon Fruit β-galactosidase" Plant Phvsiol. 105:975-979 (1994) purificou duas isozimas (uma com 34 kD e a outra com 44 kD) de fruto de caqui. Um aspecto característico durante o amadurecimento de fruto de mamão pa- paia é o amolecimento- β-galactosidase pode contribuir de modo significa nte para a modificação de pectina e hemicelulose e, assim, para o amolecimento do fruto (Lazan et ai, β-galactosidase, Polygalacturonase and Pectinesterase ín Differential Softeníng and Cell Wall Modífícation Duríng Papaya Fruit Ripening", Phvsiol Plant. 95: 106-112 (1995)}. [0010] De acordo com Ali et al, "The Biochemícal Basis of Accelera-ted Softening in Papaya Following Storage at Low Temperatura", Acta Horticultura 343 ¢1993), as isoformas PME, PG e β-Gal podem desempenhar, coletiva mente, um papel significante no desenvolvimento de sintomas de danos provocado por resfriamento de aumentada susceptibilidade a doenças comumente observadas em mamão papaia quando do retorno dos frutos armazenados com frio para ambientes mais quentes, [0011] As tentativas para entregar frutos de mamão papaia maduros, com ótimo sabor e sem adulterações para o consumidor após um transporte em longas distâncias tem sido concentradas assim em medidas com uma realização de difícil sucesso como a colheita prematura e armazenamento em baixa temperatura. Necessita-se , assim, de uma solução que utilize e adapte o processo de maturação natural do mamão papaia de modo que o fruto possa tolerar as tensões da exportação para longas distâncias. [0012] A presente invenção é dirigida para superar estas e outras deficiências na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0013] A presente invenção refere-se a moléculas isoladas de ácido nucléico que codificam para uma proteína ou polipeptídeo β~ galactosidase e à seqüência de aminoácidos codificada por estas moléculas de ácido nucléico. [0014] A presente invenção também refere-se aos construtos de DNA contendo uma ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína ou polipeptídeo que regula o amadurecimento do fruto de mamão papaia. Este construto também inclui um promotor heterólogo 5' ligado de modo operativo e uma região 3' ligada de modo operativo. [0015] A presente invenção também refere-se a um método de promoção do amadurecimento em fruto de mamão papaia. Este envolve a transformação de uma célula de planta de mamão papaia com um construto de DNA da presente invenção em que uma ou mais moléculas de ácido nucléico do construto foram inseridas em uma orientação sentido (5' -» 3'). Uma planta de mamão papaia é então regenerada da célula de mamão papaia transformada sob condições efetivas para promover o amadurecimento do fruto de mamão papaia. [0016] A presente invenção também refere-se a um método para retardar o amadurecimento do fruto de mamão papaia. Isto envolve transformar uma célula de planta de mamão papaia com um construto de DNA da presente invenção em que uma ou mais moléculas de ácido nucléico do construto foi inserida na orientação anti-sentido (3' -» 5' ). Uma planta de mamão papaia é então regenerada da célula de mamão papaia transformada sob condições efetivas para promover o amadurecimento do fruto de mamão papaia. [0017] A presente invenção também refere-se a um método para retardar o amadurecimento de fruto de mamão papaia que envolve a transformação de uma célula de planta de mamão papaia com um construto de DNA da presente invenção em que uma ou mais das moléculas de ácido nucléico do construto foram manipuladas para codificar um RNA não traduzível. Uma planta de mamão papaia é então regenerada da célula de mamão papaia transformada sob condições efetivas para retardar o amadurecimento do fruto de mamão papaia. [0018] A presente invenção também refere-se a uma célula hospedeira, sistemas de expressão, e plantas transgênicas transformadas com construto de DNA contendo uma ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam para uma proteína ou polipeptídeo que controla o amadurecimento do fruto de mamão papaia.

[0019] O plantio de mamão papaia é uma indústria de importância econômica em várias áreas tropicais e sub-tropicais do mundo. O crescimento da indústria é impedido pela incapacidade de expedir o fruto de mamão papaia para consumidores distantes sem dano ao fruto. A presente invenção supera estas e outras deficiências na técnica. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A figura 1 mostra um Northern blot de RNA total de fruto de mamão papaia em diferentes estágios de amadurecimento. A hibridi-zação foi realizada com uma sonda CP β-Gal.41 rotulada com um kit Ridiprimer (Amersham, UK). [0021] A figura 2 mostra um Northern blot de RNA total de fruto de mamão papaia em diferentes estágios de amadurecimento. A hibridi-zação foi realizada com uma sonda CPfi-GaL45 rotulada com um kit Ridiprimer (Amersham, UK). [0022] A figura 3 mostra um Northern blot de RNA total de fruto de mamão papaia em diferentes estágios de amadurecimento. A hibridi-zação foi realizada com uma sonda CP β-Gal.64 rotulada com um kit Ridiprimer (Amersham, UK). [0023] As figuras 4A-B são árvores filogenéticas demonstrando a homologia de CPp-Gal e CPPG para a proteína respectiva de outras fontes. A figura 4A mostra a árvore filogenética gerada usando o alinhamento de seqüências de aminoácidos deduzidas de isoformas β-Gal de Cari-ca papaya com 12 outros homólogos de aminoácido β-Gal de outras espécies de plantas. A figura 4B mostra o filograma gerado usando o alinhamento da seqüência de aminoácido deduzida de CPPG com 10 outros homólogos de aminoácidos PG de outras espécies de plantas. [0024] A figura 5 é um diagrama de vetor de expressão pEPJ usado como o "cassete de gene" em que um gene de amadurecimento pode ser incorporado. [0025] A figura 6 é um diagrama do vetor de transformação pGA482G. [0026] A figura 7 mostra um construto de gene de amadurecimento exemplar "C6" criada no vetor pEPJ por inserção do ácido nucléico ATL -fiGai 41 (anti-sentido-traduzível) para o gene de amadurecimento β Gal.41 inserido no sítio de múltipla clonagem entre a seqüência líder e a seqüência de terminação 35S.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0027] A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada codificando uma proteína ou polipeptídeo que controla o amadurecimento do fruto de mamão papaia. Preferivelmente, esta proteína ou polipeptídeo é uma β-galactosidase, uma pectinmetilesterase ou uma poligalacturonase. [0028] Uma forma da molécula de ácido nucléico da presente invenção é identificada aqui como p~Gal.45, e tem uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a SEQ ID NO: 1 como a seguir: agacgtacgt gttttggaat gggcatgagc cttcacccgg caaatactac tttggaggaa G0 actatgatct ggttagattc attaagccgg tgaagcaagc aggcctctat gttcatctca 120 ggattggtcc atatgtttgt gccgagtgga actttggggg ttttcctgcc cggcttaagt 180 acattccagg catcgctttc agaacgaaca atggacccct caaggcarac atgcaaagat 240 ttacaaagaa aactgttgat acgatgaaag ctgaagggct gcttgaatct cagggtggCc 300 caataatctt atcccagatt gaaaatgaat atggacccat ggagtacgaa cttggtgcag 360 ccgggcgtgc ttacgctcaa tgggeagctc agatggctgt gggattcggt actggtgtcc 420 cgtgggccat gtgcaagcaa gatgatgcac ctgatcctat tattaacact tgcaatggtt 480 tctactgtga ttacttttct ccaaacaaag catacaagcc caagatgtgg actgaagctt 540 ggactggtcg gtttactgga tttggaggtg cagttcctta ccgaccagtg gaagacttgg 600 cattttcagt tgcaaggttt atacagaatg gagggtcgtt cattaactat tataegtgnc 660 atggaggaac aaattttggc cgcactgctg gtggcccctt cattgccact agctacgatt 720 atgatgctcc tcttgatgaa tatggactgg tgaggcaacc taaatggggt catCtgaaag 7B0 atttacatcg agcaataaaa ctgtgtgaac cagcactggt gtctggtgat ccttctgtca 840 tgccacttgg acgctttcaa gaggctcatg tettcaaatc aaaatatggg cattgtgctg 900 cattecttgc aaattacaat ccaagatctt ttgctaaagt tgcctttggg aatatgcatt 960 acaacctgcc tcettggtct atcagcattc ttcccgactg taaaaacact gtttataaca 1020 ctgcaagggt tggtgctcaa agtgctagga tgaagatggt tcctgttcct attcatggag 1080 cattctcttg gcaggcttat aatgaagagg caccttcctc aaatggtgaa aggtcattca 1140 cgacggtagg atcggtggaa cagataaata caactagaga tgtctctgac tatttatggt 1200 actcaacgga tgttaagatt gatcctgatg aaggattctt gaagactgga aagtacccca 1260 cactcactgt tttatctgct ggtcatgctt tacatgtatt tgtcaacgac caactatcag 1320 gaactgccta tggaagctta gaatttccaa agataacttt cagtaaaggt gtaaatctga 13Θ0 gagctggcat caacaagatt tcaattctaa gcattgctgt tggtcttccg aacgtcggtc 1440 ctcattttga gacatggaat gctggagttc ttggtcctgt aacattgaat ggtcttaacg 1500 agggaagaag ggacttatca tggcagaaat ggtcttacaa ggrtggtgtt gaaggagaag 1560 caatgagtct tcattcactc agtgggagtt cctcagttga gtggactgca gggtcttttg 1620 tagcaagaag gcagcccctt acttggttca aaactacttt caatgctccg gctggaaatt 1680 ctccattggc tctggatatg aatagtatgg gtaaaggaca aatatggata aatggaaaga 1740 gtatcgggcg gcactggcct gcatataaag catctggttc ttgtggttgg tgtgattatg 1800 ctggaacatt taatgagaag aagtgcttaa gtaattgtgg agaggcttct caaagatggt 1860 atcacgttcc tcgctcatgg ctcaacccaa cagggaattt gttggttgtt tttgaagaat 1920 ggggtggaga tcctaatgga atatccttgg ttagaagaga agtagacagt gcttgtgctg 1980 atatttatga gtggcaacca actctgatga attatcaaat gcaagcatct ggaaaggtaa 2040 acaaaccact gcggcctaat aaagctcatt tacagtgtgg ccctgggcag aagttctcat 2100 cagtcaagtt tgccagtttt ggcactccag aaggggcttg tggaagctac cggagggaag 2160 ctgccacgca catcattctt atgatgcttt tgagaggctc tgtgctgggc agaactggtg 2220 ctcagtaaca gtagcacccg aaatgttcgg tggagatccc tgccccagtg tcatgaagaa 2280 actcgcggtg gaggttgttt gcagctgaag aactgtaaca tcagaaaagt gatggaagcg 2340 aaggaaatcg tggactgatt ctttttttta caagtcatca gttatattat ttcttggata 2400 aattaagtct acacatcgaa gtttgcagcc attctgttcc agctttcaaa tggtgaagtt 2460 gtacaaatat acagcacaca ccatggatgg ctggcatctc ttacaagcaC tgtcaaagcg 2520 tttgtccatt ggaaaaatgt acataaagca atgattcgtt gcctgcatgc tatatggaag 2580 tttaaggatg gaatctgtcg aagcacagtg agaeggcggt aacccagtcc atgtgccaga 2640 tattttagct tttatagggt atggaaatcc cctgatttct agteatttta agtggtacat 2700 tctctttcaa gtttcttgag aagcaaaatt gtttacactg ctttgttctt gcaagaaaaa 2760 aggaacaaag gcctcaaatg gccataatat atttactctt tttagttcaa agaaaaaaaa 2620 aaaaaaa 2827 [0029] p~Ga!.45, isolado de Carica papaya ("mamão papaia") tem uma matriz de leitura aberta ("ORF") de 1998 bp, se estendendo entre nucleotídeos 231-2228. O códon de partida "ATG" é identificado em 231-234 bp, com o códon de parada "TAA" encontrado entre nucleotídeos 2225-2228. [0030] A seqüência de ácido nucléico correspondendo a SEQ ID NO: 1 codifica uma isoforma de β-galactosidase isolada de Carica papaya , identificada aqui como p-Gal.45, que tem uma seqüência de aminoácidos deduzida correspondendo a SEQ ID NO: 2, como a seguir: Met Gin Arg Phe Thr Lys Lys Ile vai Asp Met Met Lys Ala Glu Gly 15 10 15 Leu Phe Glu Ser Gin Gly Gly Pro Ile Ile Leu Ser Gin Ile Glu Asn 20 25 30 Glu Tyr Gly Pro Met Glu Tyr Glu Leu Gly Ala Ala Gly Arg Ala Tyr 35 40 45 Ala Gin Trp Ala Ala Gin Met Ala Vai Gly Phe Gly Thr Gly Vai Pro 50 55 60 Trp Vai Met Cys Lys Gin Asp Asp Ala Pro Asp Pro Ile Ile Asn Thr 65 70 75 80 Cys Asn Gly Phe Tyr cys Asp Tyr Phe Ser Pro Asn Lys Ala Tyr Lys 85 90 95 Pro Lys Met Trp Thr Glu Ala Trp Thr Gly Trp Phe Thr Gly Phe Gly 100 105 110 Gly Ala Vai Pro Tyr Arg Pro Vai Glu Asp Leu Ala Phe Ser vai Ala 115 120 125 Arg Phe Ile Gin Asn Gly Gly Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Met Xaa His 130 135 140 Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ala Gly Gly Pro Phe lie Ala Thr 145 150 155 160 Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr Gly Leu vai Arg Gin 165 170 175 Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Asp Leu His Arg Ala Ile Lys Leu Cys 180 185 190 Glu Pro Ala Leu Vai Ser Gly Asp Pro Ser Vai Met Pro Leu Gly Arg 195 200 205 Phe Gin Glu Ala His Vai Phe Lys Ser Lys Tyr Gly His Cys Ala Ala 210 215 220 Phe Leu Ala Asn Tyr Asn Pro Arg Ser Phe Ala Lys Vai Ala Phe Gly 225 230 235 240 Asn Met His Tyr Asn Leu Pro Pro Trp Ser Ile Ser Ile Leu Pro Asp 245 250 255 Cys Lys Asn Thr Vai Tyr Asn Thr Ala Arg Vai Gly Ala Gin Ser Ala 260 265 270 Arg Met Lys Met Vai Pro Vai Pro Ile His Gly Ala Phe Ser Trp Gin 275 280 285 Ala Tyr Asn Glu Glu Ala Pro Ser Ser Asn Gly Glu Arg Ser Phe Thr 290 295 300 Thr Vai Gly Leu Vai Glu Gin Ile Asn Thr Thr Arg Asp Vai Ser Asp 305 310 315 320 Tyr Leu Trp Tyr Ser Thr Asp Vai Lys Ile Asp Pro Asp Glu Gly Phe 325 330 335 Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Pro Thr Leu Thr Vai Leu Ser Ala Gly His 340 345 350 Ala Leu His Vai Phe Vai Asn Asp Gin Leu Ser Gly Thr Ala Tyr Gly 355 360 365 Ser Leu Glu Phe Pro Lys Ile Thr Phe Ser Lys Gly Vai Asn Leu Arg 370 375 380 Ala Gly Ile Asn Lys Ile Ser Ile Leu Ser Ile Ala Vai Gly Leu Pro 385 390 395 400 Asn Vai Gly Pro His Phe Glu Thr Trp Asn Ala Gly Vai Leu Gly Pro 405 410 415 Vai Thr Leu Asn Gly Leu Asn Glu Gly Arg Arg Asp Leu Ser Trp Gin 420 425 430 Lys Trp Ser Tyr Lys Vai Gly Vai Glu Gly Glu Ala.Met Ser Leu His 435 440 445 Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Vai Glu Trp Thr Ala Gly Ser Phe Vai 450 455 460 Ala Arg Arg Gin Pro Leu Thr Trp Phe Lys Thr Thr Phe Asn Ala Pro 465 470 475 480 Ala Gly Asn Ser Pro Leu Ala Leu Asp Met Asn Ser Met Gly Lys Gly 485 490 495 Gin Ile Trp Ile Asn Gly Lys Ser Ile Gly Arg His Trp Pro Ala Tyr 500 505 510 Lys Ala Ser Gly Ser Cys Gly Trp Cys Asp Tyr Ala Gly Thr Phe Asn 515 520 525 Glu Lys Lys Cys Leu Ser Asn Cys Gly Glu Ala Ser Gin Arg Trp Tyr 530 535 540 His Vai Pro Arg Ser Trp Leu Asn Pro Thr Gly Asn Leu Leu Vai Vai 545 550 555 560 Phe Glu Glu Trp Gly Gly Asp Pro Asn Gly Ile Ser Leu Vai Arg Arg 565 570 575 Glu Vai Asp Ser Vai Cys Ala Asp Ile Tyr Glu Trp Gin Pro Thr Leu 580 585 590 Met Asn Tyr Gin Met Gin Ala Ser Gly Lys Vai Asn Lys Pro Leu Arg 595 600 605 Pro Asn Lys Ala His Leu Gin Cys Gly Pro Gly Gin Lys Phe Ser Ser 610 615 620 Vai Lys Phe Ala Ser Phe Gly Thr Pro Glu Gly Ala Cys Gly Ser Tyr 625 630 635 640 Arg Arg Glu Ala Ala Met His Ile Ile Leu Met Met Leu Leu Arg Gly 645 650 655 Ser Vai Leu Gly Arg Thr Gly Ala Gin 660 665 [0031] Outra molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção isolada de Carica papaya é identificada aqui como β- Gal.64 e tem uma seqüência de ácido nucléico correspondendo a SEQ ID NO: 3, como a seguir: gaatggaatt atggggggtt ccggtttggc tgaagtatgt ccctggaatc agctttagaa 60 cagacaatga gcctttcaag agagctatgc aagggttcac agagaagatt gc.gggact.ac 120 naagagtgaa aacttgtttg agtcccaggg tggccccatt atcctctctc agattgagaa 180 tgagtacggg aaacagagca agttattngg cgccgatgga tataattata tnagttgggc 240 agcaaaaatg gctgttgaaa caggaacagg cgtcccctgg gtcatgtgca aagaagacga 300 tgcaccagat ccggtnatan acacgtgcaa atggttttac tgtgaagcat tctctcctaa 360 caaaccttac aagcccaaga tctggacgga ggcatggagt ggctggttca cagactttgg 420 tggccccatc caccagcggc cagttcagga tcttgcattt gcagttgcta agttcataca 480 aaaaggaggg tcctttgtca actattacat gtatcatggc ggcaccaact ttgg 534 [0032] A seqüência de ácido nucléico correspondendo a SEQ ID NO: 3 codifica uma isoforma de β- galactosidase isolada de Carica papaya identificada aqui como β- Gal.64, que tem uma seqüência de aminoácido deduzida correspondendo a SEQ ID NO: 4, como a seguir: Met Glu Leu Trp Gly Vai Pro Vai Trp Leu Lys Tyr Vai Pro Gly Ile 15 10 15 Ser Phe Arg Thr Asp Asn Glu Pro Phe Lys Arg Ala Met Gin Gly Phe 20 25 30 Thr Glu Lys Ile Vai Gly Leu Xaa Arg Vai Lys Thr Cys Leu Ser Pro 35 40 45 Arg Vai Ala Pro Leu Ser Ser Leu Arg Leu Arg Met Ser Thr Gly Asn 50 55 60 Arg Ala Ser Tyr Xaa Ala Pro Met Asp Ile Ile Ile Xaa Vai Gly Gin 65 70 75 80 Gin Lys Trp Leu Leu Lys Gin Glu Gin vai Ser Pro Gly Ser Cys Ala BS 90 95 Lys Lys Thr Met His Gin Ile Arg Xaa Xaa Thr Arg Ala Asn Gly Phe 100 105 lio Thr vai Lys His Ser Leu Leu Thr Asn Leu Thr Ser Pro Arg Ser Gly 115 120 125 Arg Arg His Gly Vai Ala Gly Ser Gin Thr Leu Vai Ala Pro Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gin Phe Arg Ile Leu His Leu Gin Leu Leu Ser Ser Tyr Lys 145 150 155 160 Lys Glu Gly Pro Leu Ser Thr Ile Thr Cys Ile Met Ala Ala Pro Thr 165 170 175 Leu [0033] Outra molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção isolada de Carica papaya é identificada aqui como β- Gal.41, que tem uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a SEQ ID NO: 5, como a seguir: ggcacgagaa acacactcaa ctcctccatt aatgtcctct ttaacaaaaa tctaaatttc 60 cttccttctc ttctactaaa cagcattgaa ggagtaaaca attatttgat attttcattt 120 gctatcatgt tgaagacaaa cctggtcttg ttcttgttgt tttgttcatg gctttggtct 180 gttgaagcta ctgtgtctta cgaccataaa gctataatca ttaatggccg cagaaggatt 240 cttatttctg gctccattca ttatcccaga agcactcctc agatgtggcc tgatcttata 300 caaaatgcta aagaaggagg gttagatgtc atacagactt atgttttttg gaacggacat 360 gagccctctc ctggaaatta ttattttgaa gacaggtatg atcttgtaaa gttcatcaag 420 ttggtgcatc aagctggtct gtatgttcat ctcagaataa gtccttatat ttgtggtgaa 480 tggaattttg ggggttttcc tgtttggctc aaatacgttc ctggtattca attcagaaca 540 gacaatggac ctttcaaggc acaaatgcaa aaatttacag agaaaatagt caacatgatg 600 aaggcagaaa agttatttga acctcaaggg ggtccaataa ttatgtcaca gatagagaat 660 gagtatggac ctattgagtg ggaaattgga gcaccgggga aagcttatac aaaatgggca 720 gcacaaatgg cagtgggtct tggcactgga gtcccatgga ttatgtgcaa gcaagaggat 780 gctcctgacc caattattga cacttgcaat ggtttctatt gtgaaaattt catgccaaac 840 gccaactaca aaccaaaaat gtttacagag gcctggactg gctggtacac ggaatttggc 800 ggtccagttc cttatagacc tgcagaagac atggcttact ccgttgcaag gttcattcag 960 aataggggat cattcattaa ttattatatg taccatggag gaaeaaattt tggcagaact 1020 gctggaggtc ctttcattgc tactagctat gattacgatg cccctcttga tgagtatgga 1080 ctaaggaggg agccaaaatg ggggcactCg agggatttgc ataaaaccat caaattatgt 1140 gaàccatctt tagtttctgt tgatcctaaa gtgacatcgt taggaagtaa ccaagaggct 1200 catgtgtttt ggacaaaaac eccttgtgct gcattccttg ctaactacga tctgaagtac 1260 tcagttagag tcacctttca aaacctgcct tatgacctac ctccttggtc tgtcagcatt 1320 cttcctgact gcaaaactgt agttttcaac actgcaaagg ttgtttcaca aggctcgcta 1380 gcaaagatga ttgctgtcaa cagtgcattc ccttggcagt cgtacaacga agaaacacct 1440 tccgcaaatt atgatgctgt atttaccaaa gatgggctgt gggaaeagat aagtgtcacc 1500 agagatgcca cagatcacnt gtggtatatg acagatgtga caataggtec tgatgaagca 1560 tccttgaaga atgggeaaga tcccattttg acagtcatgt cagcaggcca tgetttgeat 1620 gtttttgtga atggtcaact atcaggaact gtatatggac aattggaaaa tcccaaacta 16ΘΟ gcctttagtg gcaaggtgaa accgagagca ggagtcaaca aggtttcttt actaagtatc 1740 gctgttggcc ttccgaatgt tggcttacac tttgaaacat ggaatgctgg ggttctgggc 1800 ccagtgacat tgaaaggggt gaattcagga acatgggata tgtcaaaatg gaaatggtct 1860 tacaagattg gtctgaaagg cgaagccttg agccttcata cagttagtgg cagttcgtct 1920 gtcgagtggg ttgaaggate attactagct caaagacaac ccctcatttg gtacaagact 1980 acttttaacg caccagtagg taatgatcca ttagctttag atatgaacag tatgggaaaa 2040 ggtcagatat ggataaatgg tcaaagtatt ggacgccact ggcctggata taaagctcgt 2100 ggaagttgtg gtgcttgcaa ctatgctgga atatatgatg agaaaaaatg tcatagtaac 2160 tgtggaaagg cttctcagag atggtaccat gttcctcgct cgtggctcaa cccaactgcg 2220 aacctattag ttgCttttga agaatggggt ggtgatccaa caaagatttc tctggcgaaa 2280 agagttgtgt agttagtttt cagaaagcta aaatgggtaa aggtttatag tttaacccta 2340 ataaatgaag tccccagtta ggtcaaattt agcacagaaa atagtttgga agaatccaag 2400 tgactttttg tccttagggg tgatacaagc ttaaacgaag cagattgccc agaattgcca 2460 aagggaatgg atatggtaga atatcacaac atttttatgt gcagagacaa gctattgcta 2520 cacctccata cctcatacat taggccaact agaagagtat agttttaata tatatacaca 2580 cgcacacaca cacacacagt atatcttgat aattattaag gatatacata cctctagcta 2640 gctggggttc caatctaagt attcagggaa aataaacctc atgccttctt atttgcaaga 2700 acaaatcagg aagtattatt aataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2746 [0034] A matriz de leitura aberta ("ORF") de Carica papaya β- Gal. 41 é 2166bp, se estendendo entre nucleotídeos 127- 2292. O códon de partida "ATG" é identificado em 127- 130 bp, com o códon de parada "TAG" entre os nucleotídeos 2289- 2292. [0035] A seqüência de ácido nucléico correspondendo a SEQ ID NO: 5 codifica uma terceira isoforma de β- galactosidase identificada aqui como β- Gal.41, isolada de Carica papaya , que tem uma seqüência de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 6, como a seguir: Met Leu Lys Thr Asn Leu Vai Leu Phe Leu Leu Phe Cys Ser Trp Leu 1 5 io 15 Trp Ser Vai Glu Ala Thr Vai Ser Tyr Asp His Lys Ala Ile Ile Ile 20 25 30 Asn Gly Arg Arg Arg Ile Leu Ile Ser Gly Ser He His Tyr Pro Arg 35 40 45 Ser Thr Pro Gin Met Trp Pro Asp Leu Ile Gin Asn Ala Lys Glu Gly 50 55 60 Gly Leu Asp Vai Ile Gin Thr Tyr Vai Phe Trp Asn Gly His Glu Pro 65 70 75 80 Ser Pro Gly Asn Tyr Tyr Phe Glu Asp Arg Tyr Asp Leu Vai Lys Phe 85 90 95 Ile Lys Leu Vai His Gin Ala Gly Leu Tyr Vai His Leu Arg Ile Ser 100 105 110 Pro Tyr Ile Cys Gly Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Vai Trp Leu 115 120 125 Lys Tyr Vai Pro Gly Ile Gin Phe Arg Thr Asp Asn Gly Pro Phe Lys 130 135 140 Ala Gin Met Gin Lys Phe Thr Glu Lys Ile Vai Asn Met Met Lys Ala 145 150 155 160 Glu Lys Leu Phe Glu Pro Gin Gly Gly Pro Ile Ile Met Ser Gin Ile 165 170 175 Glu Asn Glu Tyr Gly Pro Ile Glu Trp Glu Ile Gly Ala Pro Gly Lys 180 185 190 Ala Tyr Thr Lys Trp Ala Ala Gin Met Ala Vai Gly Leu Gly Thr Gly 195 200 205 Vai Pro Trp Ile Met Cys Lys Gin Glu Asp Ala Pro Asp Pro Ile Ile 210 215 220 Asp Thr Cys Asn Gly Phe Tyr Cys Glu Asn Phe Met Pro Asn Ala Asn 225 230 235 240 Tyr Lys Pro Lys Met Phe Thr Glu Ala Trp Thr Gly Trp Tyr Thr Glu 245 250 255 Phe Gly Gly Pro Vai Pro Tyr Arg Pro Ala Glu Asp Met Ala Tyr Ser 260 265 270 Vai Ala Arg Phe lie Gin Asn Arg Gly Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Met 275 280 285 Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ala Gly Gly Pro Phe Ile 290 295 300 Ala Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr Gly Leu Arg 305 310 315 320 Arg Glu Pro Lys Trp Gly His Leu Arg Asp Leu His Lys Thr Ile Lys 325 330 335 Leu Cys Glu Pro Ser Leu Vai Ser Vai Asp Pro Lys Vai Thr Ser Leu 340 345 350 Gly Ser Asn Gin Glu Ala His Vai Phe Trp Thr Lys Thr Ser Cys Ala 355 360 365 Ala Phe Leu Ala Asn Tyr Asp Leu Lys Tyr Ser Vai Arg Vai Thr Phe 370 375 380 Gin Asn Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Pro Trp Ser Vai Ser Ile Leu Pro 365 390 395 400 Asp Cys Lys Thr Vai Vai Phe Asn Thr Ala Lys Vai Vai Ser Gin Gly 405 410 415 Ser Leu Ala Lys Met Ile Ala Vai Asn Ser Ala Phe Ser Trp Gin Ser 420 425 430 Tyr Asn Glu Glu Thr Pro Ser Ala Asn Tyx Asp Ala Vai Phe Thr Lys 435 440 445 Asp Gly Leu Trp Glu Gin Ile Ser Vai Thr Arg Asp Ala Thr Asp Tyr 450 455 460 Leu Trp Tyr Met Thr Asp Vai Thr Ile Gly Pro Asp Glu Ala Phe Leu 465 470 475 480 Lys Asn Gly Gin Asp Pro Ile Leu Thr Vai Met Ser Ala Gly His Ala 485 490 495 Leu His Vai Phe vai Asn Gly Gin Leu Ser Gly Thr Vai Tyr Gly Gin 500 505 510 Leu Glu Asn Pro Lys Leu Ala Phe Ser Gly Lys Vai Lys Leu Arg Ala 515 520 525 Gly Vai Asn Lys Vai Ser Leu Leu Ser Ile Ala Vai Gly Leu Pro Asn 530 535 540 Vai Gly Leu His Phe Glu Thr Trp Asn Ala Gly Vai Leu Gly Pro vai 545 550 555 560 Thr Leu Lys Gly Vai Asn Ser Gly Thr Trp Asp Met Ser Lys Trp Lys 565 570 575 Trp Ser Tyr Lys Ile Gly Leu Lys Gly Glu Ala Leu Ser Leu His Thr 580 585 590 Vai Ser Gly Ser Ser Ser Vai Glu Trp Vai Glu Gly Ser Leu Leu Ala 595 600 605 Gin Arg Gin Pro Leu Ile Trp Tyr Lys Thr Thr Phe Asn Ala Pro Vai 610 615 620 Gly Asn Asp Pro Leu Ala Leu Asp Met Asn Ser Met Gly Lys Gly Gin 625 630 635 640 Ile Trp Ile Asn Gly Gin Ser Ile Gly Arg His Trp Pro Gly Tyr Lys 645 650 655 Ala Arg Gly Ser Cys Gly Ala Cys Asn Tyr Ala Gly Ile Tyr Asp Glu 660 665 670 Lys Lys Cys His Ser Asn Cys Gly Lys Ala Ser Gin Arg Trp Tyr His 675 680 685 Vai Pro Arg Ser Trp Leu Asn Pro Thr Ala Asn Leu Leu Vai Vai Phe 690 695 700 Glu Glu Trp Gly Gly Asp Pro Thr Lys Ile Ser Leu Vai Lys Arg Vai 705 710 715 720 Vai [0036] Outra molécula de ácido nucléico apropriada de acordo com a presente invenção codifica para uma proteína ou polipeptídeo tendo uma atividade como uma pectinmetilesterase (PME) isolada de Carica papaya, que tem uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a SEQ ID NO: 7, como a seguir: gcagtggcgg caaaagatgg aacgggaaac tttcagacgg tgaaagaggc catggatgcg 60 gctgatggga aaaaaaggtt tgtgatttac gtgaaagcag gagtttataa ggagaaaatt 120 cacagtaaca aagacgggat tactttgatc ggagacggta aatattccac catcattgtc 180 ggtgatgata gtgttgctgg aggCtccacc atgccaggct ctgcaactat tacaatgaca 240 ggggatggat tcatagcccg cgacattggg tttcagaaca cagcagggcc acaaggagag 300 caagctttag ctctaaacat agettctgat cactctgttc tttacaggtg cagcattgcg 360 ggttaccagg atactctcta cgcacacgct ccccgtcaat tctacagaga atgcgacatc 420 tacggcaccg tcgatttcat tttcggaaac gccgccgcgg ttttccaaaa ctgctacttg 480 gttcttcgtc ttcctcggaa aaaaggctac aacgttattc tagcaaacgg aagatccgac 540 ccgggacaga acacgggttt ctctgttcac aactgcagaa tcgtacccag ctccgaattt 600 tctccggtaa aacacaaata cgaatcgtat cttggtaggc catggaaaa 649 [0037] A seqüência de ácido nucléico correspondendo a SEQ ID NO: 7 codifica uma pectinmetilesterase isolada de Carica papaya, identificada aqui como PME, que tem uma seqüência de aminoácidos deduzida correspondendo a SEQ ID NO: 8, como a seguir: Ala Vai Vai Ala Lys Asp Gly Thr Gly Asn Phe Gin Thr Vai Lys Glu 15 10 15 Ala Met Asp Ala Ala Asp Gly Lys Lys Arg Phe Vai Ile Tyr Vai Lys 20 25 30 Ala Gly Vai Tyr Lys Glu Lys Ile His Ser Asn Lys Asp Gly Ile Thr 35 40 45 Leu Ile Gly Asp Gly Lys Tyr Ser Thr Ile Ile Vai Gly Asp Asp Ser 50 55 60 Vai Ala Gly Gly Ser Thr Met Pro Gly Ser Ala Thr Ile Thr Met Thr 65 70 75 80 Gly Asp Gly Phe Ile Ala Arg Asp Ile Gly Phe Gin Asn Thr Ala Gly 85 90 95 Pro Gin Gly Glu Gin Ala Leu Ala Leu Asn Ile Ala Ser Asp His Ser 100 105 110 Vai Leu Tyr Arg Cys Ser Ile Ala Gly Tyr Gin Asp Thr Leu Tyr Ala 115 120 125 His Ala Leu Arg Gin Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Ile Tyr Gly Thr Vai 130 135 140 Asp Phe Ile Phe Gly Asn. Ala Ala Ala Vai Phe Gin Asn Cys Tyr Leu 145 150 155 160 val Leu Arg Leu Pro Arg Lys Lys Gly Tyr Asn Vai Ile Leu Ala Asn 165 170 175 Gly Arg Ser Asp Pro Gly Gin Asn Thr Gly Phe Ser Val His Asn Cys 180 185 190 Arg Ile Val Pro Ser Ser Glu Phe Ser Pro Val Lys His Lys Tyr Glu 195 200 205 Ser Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Lys 210 215 [0038] Outra molécula de ácido nucléico apropriada de acordo com a presente invenção codifica para uma proteína ou polipeptídeo tendo atividade como uma poligalacturonase (PG) isolada de Carica papaya, que tem uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a SEQ ID NO: 9, como a seguir: gggacggggg atgattgtat ctcgttgagt ggtggctctg gaaatatcaa tgtcacaggt 60 gtccagtgtg gccccggtca cggcattagt atcggtagtc ttggaaagtt gaggaatgag 120 gaaaatgtgg ctgggatttt ggtccaaaat tgcgtgtttg aaggtaccac taacggcgtc 180 agcatcaaaa cctgg 195 [0039] A seqüência de ácido nucléico correspondendo a SEQ ID NO: 9 codifica uma polígalacturonase isolada de Carica papaya, identificada aqui como PG que tem uma seqüência de aminoácidos deduzida correspondendo a SEQ ID NO: 10, como a seguir: Gly Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Leu Ser Gly Gly Ser Gly Asa Ile 1 5 10 IS

Asn Vai Thr Gly Vai Gin Cys Gly Pro Gly His Gly Ile Ser Ile Gly 20 25 30 Ser Leu Gly Lys Leu Arg Asm Glu Glu Agn Vai Ala Gly Ile Leu Vai 35 40 45 Gin Aan Cys Vai Phe Glu Gly Thr Thr Asn Gly Vai Ser lie Lys Thr 50 55 £0 Trp £5 [0040] Também são apropriadas na presente invenção outras formas de moléculas de ácido nucléico mostradas acima, Um exemplo de um ácido nucléico apropriado na presente invenção é uma molécula de ácido nucléico que é capaz de hibridizar a pelo menos 20 nucleotí-deos de molécula de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 9, sob condições estringentes caracterizadas por um tampão de hibridização compreendendo 5x SSC a uma temperatura de cerca de 42- 650, preferivelmente 450. Um versado na técnica irá notar que condições para hibridização de ácido nucléico, incluindo temperatura, sal, e a presença de solventes orgânicos são variáveis dependendo do tamanho (isto é, número de nucleotídeos) e o teor em G-C dos ácidos nu-cléicos envolvidos, assim como o teste de hibridização empregado, (ver, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Gloninq: A Laboratorv Manual. Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), Nu-cleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames and Higgins, Ed.

Oxford: IRL Press (1988), Hvbridization with cDNA Probes User Manual, Clonetech Laboratories, CA (2000), que se incorporam aqui por referência em sua totalidade), [0041] Os fragmentos de genes de amadurecimento de mamão papaia também são utilizáveis na presente invenção. Os fragmentos capazes de uso na presente invenção podem ser produzidos por vários meios. Em um método, subclones de gene codificando as enzimas de amadurecimento da presente invenção são produzidos por manipulação genética molecular convencional por subclonagem dos fragmentos de genes. Os subclones então são expresssos in vitro ou in vivo em células bacterianas para dar uma proteína ou peptídeo menor que pode ser testada para atividade enzimática de acordo com o procedimento descrito abaixo. [0042] Em outra abordagem, com base no conhecimento da estrutura primária da proteína, fragmentos de gene codificando enzima de amadurecimento de mamão papaia podem ser sintetizados usando a técnica de PCR junto com conjuntos específicos de iniciadores escolhidos para representar porções particulares da proteína. Estes fragmentos devem então ser clonados em um vetor apropriado na orientação sentido para aumentada expressão de um peptídeo ou proteína truncado (a), ou uma orientação anti-sentido para diminuída expressão ou possível silenciamento do gene. [0043] A presente invenção refere-se a um construto de DNA contendo um ou mais ácidos nucléicos que codificam para proteínas ou polipeptídeos de amadurecimento de mamão papaia. Isto envolve a incorporação de uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção em células hospedeiras usando tecnologia de DNA re-combinante convencional. Geral mente, isto envolve inserir a molécula de ácido nucléico em um sistema de expressão em que a molécula de ácido nucléico é heteróloga (isto é, não presente normal mente). A mo- lécula de ácido nucléico heteróloga é inserida no sistema de expressão que inclui os elementos necessários para a transcrição e tradução das seqüências de codificação de proteína inseridas. [0044] As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser inseridas em qualquer um dos muitos vetores de expressão disponíveis e sistemas de células usando reagentes que são bem conhecidos na técnica. Os vetores apropriados incluem, mas não são limitados aos seguintes vetores virais como sistema de vetor lambda gt11, gt WES.tB, Charon 4, e vetores de plasmídeo como pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC1084, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101, SV 40, pBluescript II SK + / - ou KS + / - (Ver "Stratagene Cloning Systems", Catálogo (1993) de Stratage-ne, La Jolla Ca, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), série pQE, plH821, pGEX, pET (ver F.W. Studier et al. "Use of T7 RN A Polymerase to Dírect Expression of Cloned Genes", Gene Ex-pression Technoloav. vol. 185 (1990), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade) e quaisquer derivados dos mesmos. As moléculas recombinantes podem ser introduzidas em células via transformação, particularmente transdução, conjugação, mobilização ou eletroporação. As seqüências de DNA são clonadas no vetor usando procedimentos de clonagem padrões na técnica, como descrito por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Segunda edição, Cold Spring Harbor, Press NY (1989) e Ausubel F.M. et al (1989) Current Protocols in Molecular Bioloqy, John Wíley & Sons, New York, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade. [0045] Na preparação de um vetor de DNA para expressão, as várias seqüências de DNA podem ser inseridas normal mente ou substituídas em um plasmídeo bacteriano. Qualquer plasmídeo conveniente pode ser empregado, que será caracterizado por ter um sistema de replicação bacteriano, um marcador que permite a seleção em uma bactéria e geralmente um ou mais sítios de restrição singulares, convenientemente localizados. Numerosos plasmídeos, referidos como vetores de transformação, são disponíveis para transformação de plantas. A seleção de um vetor irá depender da técnica de transformação preferida e espécies de marcação para transformação. Vários vetores são disponíveis para transformação estável usando Agrobacte-rium tumefaciens, uma bactéria de origem no solo que causa escoriação na coroa. As escoriações na coroa são caracterizadas por tumores ou escoriações que se desenvolvem na haste inferior e raízes principais da planta infectada. Estes tumores são devido à transferência e incorporação de parte do DNA plasmídeo de bactéria no DNA cromos-sômico da planta. Este DNA de transferência (T- DNA) é expresso junto com os genes normais da célula de planta. O DNA plasmídeo, pTi, ou Ti- DNA, para "plasmídeo indutor de tumor", contém os genes vir necessários para o movimento do T-DNA na planta. O T- DNA transporta genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de fatores reguladores de plantas, e nutrientes bacterianos (opinos). O T-DNA é delimitado por duas seqüências de repetição direta imperfeitas de 25 bp chamadas as "seqüências de borda". Por remoção do onco-gene e genes opino, e substituindo os mesmos com um gene de interesse, é possível transferir DNA estranho na planta sem a formação de tumores ou a multiplicação de Agrobacterium tumefaciens, (Fraley et ai, "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells" Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 4803- 4807 (1983), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). [0046] Outra melhora desta técnica leva ao desenvolvimento do sistema vetor binário (Bevan, M., "Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation", Nucleic Acids Res. 12:8711- 8721 (1984), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade) . Neste sistema, todas as seqüências de T- DNA (incluindo as bordas) são removidas de pTi, e um segundo vetor contendo T-DNA é introduzido em Agrobacterium tumefaciens. Este segundo vetor tem a vantagem de ser replicável em E. coli, assim como em A. tumefaciens, e contém um sítio multiclonal que facilita a clonagem de um transgene. Um exemplo de um vetor comumente usado é pBin 19 (Frisch et ai, "Complete Se-quence of the Binary Vector Bin19", Plant Molec. Biol. 27: 405- 409 (1995), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Quaisquer vetores apropriados agora conhecidos ou depois descritos para transformação genética são apropriados para uso com a presente invenção. [0047] A patente US 4 237 224 expedida para Cohen e Boyer, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade, descreve a produção de sistemas de expressão na forma de plasmídeos recombinantes usando divagem de enzima de restrição e ligação com DNA ligase. Estes plasmídeos recombinantes são então introduzidos por meio de transformação e replicados em culturas unicelulares incluindo organismos procarióticos e células eucarióticas cultivadas em cultura de tecido. [0048] Alguns "elementos de controle" ou "seqüências regulató-rias" também são incorporados no construto do vetor. Estes incluem regiões não traduzidas de vetor, promotores, e regiões 5' e 3' não traduzidas que interagem com proteínas celulares hospedeiras para transportar transcrição e tradução. Estes elementos podem variar em sua resistência e especificidade. Dependendo do sistema vetor e hospedeiro usados, qualquer número de elementos de transcrição e tradução apropriados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, podem ser usados. [0049] Um promotor constitutivo é um promotor que dirige expressão de um gene em todo o desenvolvimento e vida de um organismo. Exemplos de alguns promotores constitutivos que são amplamente usados para induzir expressão de transgenes incluem o promotor de gene nopolina sintase (NOS), de Agrobacterium tumefaciens, (patente US N° 5 034 322 expedida para Rogers et ai, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), os promotores 35S e 19S de vírus mosaico da couve- flor (CaMv) (patente US N° 5 352 605 expedida para Fraley et ai, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), os derivados de qualquer um dos vários genes actina, que são conhecidos como sendo expressos na maior parte dos tipos celulares (patente US N° 6 002 068, expedida para Privalle et ai, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), e o promotor de ubiquitina, que é um produto de gene conhecido como acumulando-se em muitos tipos celulares. [0050] Um promotor indutível é um promotor que é capaz de ativar diretamente ou indiretamente a transcrição de uma ou mais seqüên-cias de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as seqüências ou genes de DNA não serão transcritas. O indutor pode ser um agente químico, como um metabólito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico, ou um estresse fisiológico diretamente imposto sobre a planta como frio, calor, sal, toxinas, ou através da ação de um patógeno ou agente de doença como um vírus ou fungo. Uma célula de planta contendo um promotor indutível pode ser exposta a um indutor por aplicação externa do indutor à célula ou planta como por pulverização, aguada, aquecimento ou pela exposição ao patógeno operativo. Um exemplo de um promotor indutível apropriado para uso na presente invenção é um promotor indutível por gluco-corticóide (Schena et ai, "A Steroid- Inducible Gene Expression System for Plant Cells", Proc. Natl. Acad. Sei. 88; 10421- 5 (1991), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). A expressão de proteína codificada no transgene é induzida nas plantas transformadas quando as plantas transgênicas são levadas ao contato com concen- trações nanomolares de um glucocorticóide, ou por contato com de-xametasona, um análogo de glucocorticóide. Schena et ai, "A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells", Proc. Natl. Acad· Sei. 88; 10421- 5 (1991), Aoyama et ai, "A Glucocorticoid- Mediated Transcriptional Induction System in Transgenic Plants", Plant J. 11: 605- 612 (1997), and McNellis et al, "Glucocorticoid- Inducible Expression of a Bacterial Avirulence Gene in Transgenic Arabidopsis Induces Hypersensitive Cell Death, Plant J. 14 (2): 247- 57 (1998), que são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Além disso, "promotores específicos para tecido podem ser usados, são promotores que funcionam em um modo específico para tecido para regular o gene de interesse dentro de tecidos selecionados da planta. Exemplos de promotores específicos para tecido incluem promotores específicos para semente, flor, ou raiz, como são bem conhecidos no campo (por exemplo, patente US N° 5 750 385 para Shewmaker et al, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Na modalidade preferida da presente invenção, um promotor heterólogo é ligado ao ácido nucléico do construto, onde "promotor heterólogo" é definido como um promotor ao qual o ácido nucléico do construto não é ligado na natureza. [0051] O construto de DNA da presente invenção também inclui uma região regulatória 3' operável, selecionada dentre as que são capazes de prover uma corrente terminação de transcrição e poliadenila-ção de mRNA para expressão na célula hospedeira de escolha, ligada de modo operativo a uma molécula de DNA que codifica para uma proteína de escolha. Várias regiões regulatórias 3' são conhecidas como operáveis em plantas. As regiões regulatórias 3' exemplares incluem, sem limitação, a região regulatória 3' de nopalina sintase ("nos") (Fra-ley et al, "Expression of Bacterial Genes in Plant Cells" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4803- 4807 (1983), que se incorpora aqui por refe- rencla em sua totalidade) e a região regulatória 3' de vírus mosaico da couve- flor ("CaMV") (Odell et al, "Identification of DNA Sequences Required for Activity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter", Nature, 313 (6005), 810- 812 (1985), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Virtual mente, qualquer região regulatória 3' conhecida como operável em planta deve ser suficiente para expressão apropriada da seqüência de codificação do ácido nucléico da presente invenção, [0052] Uma vez que o construto de DNA da presente invenção foi preparado, esse está pronto para ser incorporado em uma célula hospedeira. Conseqüentemente, outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula recombinante, ou célula "hospedeira11 contendo uma ou mais dos construtos de DNA da presente invenção. Basicamente, este método é realizado por transformação de uma célula hospedeira com um construto de DNA da intermediário sob condições efetivas para dar transcrição da molécula de DNA na célula hospedeira, usando procedimentos de clonagem padrões conhecidos na técnica, como descrito por Sambrook et al, Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. Segunda Edição Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989) que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. As células hospedeiras apropriadas incluem, mas não são limitadas a bactérias, vírus, leveduras, células de mamíferos, insetos, plantas e outros. Preferivelmente, as células hospedeiras são ou uma célula bactéria na ou uma célula de planta. [0053] Preferivelmente, o construto de DNA da presente invenção é inserido de modo estável no genoma da célula hospedeira como resultado da transformação. [0054] Uma abordagem à transformação de células hospedeiras com um construto de DNA da presente invenção é o bombardeio de partículas (também conhecido como transformação biolística) da célula hospedeira. Isto pode ser obtido em vários modos. O primeiro envolve propelir partículas inertes ou biologicamente ativas nas células. Esta técnica é descrita na patente US N°s. 4 945 050, 5 036 006 e 5 100 792, todas para Sanford et ai, que são t incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Geralmente, este procedimento envolve propelir partículas inertes ou biologicamente ativas nas células sob condições eficazes para penetrar na superfície externa da célula e ser incorporadas dentro do interior das mesmas. Quando se usam partículas inertes, o vetor pode ser introduzido na célula por revestimento da partícula com o vetor contendo o DNA heterólogo. Alternativamente, a célula de marcação pode ser circundada pelo vetor de modo que o vetor é transportado na célula quando a partícula se torna ativa. As partículas biologicamente ativas (por exemplo, células bacterianas secas contendo o vetor e DNA heterólogo) também podem ser propelidas em células de plantas. Para mamão papaia, o método preferido é o procedimento de bombardeio de partículas que usa uma "pistola de genes" (Fitch, M.M. "Stable Transformation of Papaya via Micro- Projectile Bombardment", Plant Cell Reo. 9: 189 (1990), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Outras variações de bombardeio de partícula, agora conhecidas ou a seguir desenvolvidas, também podem ser usadas. [0055] A expressão transiente em protoplastos permite estudos quantitativos de expressão de genes, porque a população de células é muito elevada (da ordem de 106). Para liberar DNA dentro dos protoplastos, várias metodologias foram propostas, mas a mais comum é a eletroporação (Fromm et ai, "Expression of Genes Transferred into Monocot and Dicot Plants by Electroporation", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 5824- 5828 (1985), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade) e absorção de DNA mediada por polietileno glicol (PEG) (Krens et ai, "In Vitro Transformation of Plant Protoplasts with Ti- Plasmid DNA", Nature, 296: 72- 74 (1982), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Durante a eletroporação, o DNA é introduzido na célula por meio de uma mudança reversível na permeabilidade da membrana celular devido à exposição a um campo elétrico. A transformação PEG introduz o DNA por mudança da elasticidade das membranas. Diferente da eletroporação, a transformação PEG não requer qualquer equipamento especial e as eficiências de transformação podem ser igualmente elevadas. Outro método apropriado de introdução do construto de DNA da presente invenção em uma célula hospedeira é fusão de protoplastos com outras entidades, ou mini-células, células, lissosomas, ou outros corpos de superfície de lipídeo fundível que contém o gene quimérico (Fraley et ai, "Entrapment of a Bacterial Plasmid in Phospholipid Vesicles: Potential for Gene Trans-fer" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3348- 52 (1979), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). [0056] Os transformantes estáveis são preferíveis para os métodos da presente invenção. Um método apropriado de introduzir de modo estável o construto de DNA em células de plantas consiste em infectar uma célula de planta com Agrobacterium tumefaciens, ou Agrobacterium rhizogenes previamente transformado com o construto de DNA. Sob condições apropriadas conhecidas na técnica, as células de plantas transformadas são cultivadas para formar brotos ou raízes, e se desenvolver ainda em plantas. [0057] Os tecidos de plantas apropriados para transformação incluem sem limitação, botões florais, tecido de folha, tecido de raiz, me-ristemas, embriões zigóticos e somáticos, megaesporos e anteros. [0058] Após transformação, as células de plantas transformadas podem ser selecionadas e regeneradas. Preferivelmente, as células transformadas são primeiro identificadas usando um marcador de seleção simultaneamente introduzido nas células hospedeiras junto com o construto de DNA da presente invenção. O gene repórter mais amplamente usado para experiências de fusão de genes foi uidA, um gene de Escherichia coli que codifica a proteína β- glucuronidase, também conhecida como GUS (Jefferson et ai, "GUS Fusions: β- glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants", EMBO J. 6: 3901- 3907 (1987), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). GUS é uma proteína de 68,2 kd que atua como um tetrâmero em sua forma nativa. Ela não requer co- fatores ou condições iônicas especiais, apesar de poder ser inibida por cátions divalentes como Cu2+ ou Zn2+. GUS é ativo na presença de agentes redutores de tiol como β- mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT). [0059] A fim de avaliar a atividade GUS, vários substratos são disponíveis. Os mais comumente usados são 5- bromo-4-cloro-3-indolil glucuronídeo (X-Gluc) e 4-metil- umbeliferil - glucuronideo (MUG). A reação com X- Glue gera uma cor azul que é utilizável na detecção histoquímica da atividade de gene. Para fins de quantificação, MUG é preferido, porque o radical umbeliferila emite fluorescência sob estímulo de UV, assim provendo melhor sensibilidade e medida fácil por fu-orometrila (Jefferson et ai, "GUS Fusions: β-glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants", EMBO J. 6: 3901- 3907 (1987), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Outros marcadores de seleção apropriados incluem, sem limitação, marcadores codificando para resistência a antibióticos, como o gene nptll que confere resistência a canamicina (Fraley et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4803- 4807 (1983), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), o gene dhfr, que confere resistência a metotrexato (Bourouis et ai, EMBO J. 2: 1099- 1104 (1983), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), ou gentamicina, G418, higromicina, estreptomicina, espectinomicina, tetraciclina, clo-ranfenicol, e outros. Vários dos marcadores de resistência a antibióti- cos são conhecidos na técnica e outros estão sendo continuamente identificados. Qualquer marcador de resistência a antibiótico conhecido pode ser usado para transformar e selecionar células hospedeiras transformadas de acordo com a presente invenção. As células ou tecidos são cultivados em meio de seleção contendo um antibiótico, pelo que geralmente somente os transformantes expressando o marcador de resistência a antibióticos continua a crescer. Similarmente, enzimas provendo a produção de um composto identificável por luminescência, como luciferase, são utilizáveis. O marcador de seleção empregado irá depender de espécie de marcação; para algumas espécies de marcação, diferentes antibióticos, herbicidas, ou marcadores de seleção de biossíntese são preferidos. [0060] Uma vez obtido um tecido ou célula de planta recombinan-te, é possível regenerar uma planta de crescimento completo a partir dai. Meios para regeneração variam de espécie a espécie de plantas, mas geralmente uma pasta fluida de protoplastos transformados ou uma placa de petri contendo explantes transformados é primeiramente provida. O tecido de calo é formado e brotos podem ser induzidos de calos e subseqüentemente criados em raiz. Alternativamente, a formação de embriões pode ser induzida no tecido do calo. Estes embriões germinam como embriões naturais para formar plantas. O meio de cultura irá geralmente conter vários aminoácidos e hormônios, como au-xina e citoquininas. Também é vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para espécies como milho e alfafa. A regeneração eficiente irá depender do meio, no genótipo, e na história da cultura. Se estas variáveis forem controladas, então a regeneração é geralmente reprodutível e repetível. O procedimento como descrito em Cai et ai, "A Protocol for Efficient Transformation and Regeneration of Carica papaya L. In Vitro" Cell Devei. Biol- Plant 35: 61- 69 (1999), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade, é apropriado para transgênicos de mamão papaia, [0061] A regeneração de plantas de protoplastos cultivados é descrita em Evans, et ai, Handbook of Plant Cell Cultures, vol. 1 (MacMil-lan Publishing Co. New York, 1983), e Vasil I.R. (Ed). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad, Press, Orlando vol. 1, 1984, e Vol, III (1986), que são incorporados aqui por referência em sua totalidade, para mamão papaia, ver também Fitch et al, "Somatic Embryo-genesís and Plant Regeneration from Immature Zygotic Embryos of Papaya (Carica papaya L)"' Plant Cell Representa. 9: 320 (1990), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. [0062] Após o construto de DNA ser incorporado de modo estável em plantas transgênicas, ela pode ser transferida para outras plantas por cruzamento sexual ou por preparação de cultivares. Com relação ao cruzamento sexual, qualquer uma dentre várias técnicas de criação padrões pode ser usada dependendo da espécie a ser cruzada. Os cultivares podem ser propagados de acordo com procedimentos agrícolas comuns conhecidos dos versados na técnica. Alternativamente, as sementes transgênicas ou propãgulos (por exemplo mudas) são recuperadas das plantas transgênicas. As sementes podem então ser plantadas no solo e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir plantas transgênicas. Estas sementes podem então ser plantadas no solo e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir plantas transgênicas. [0063] Em um aspecto da presente invenção, um ou mais dos ácidos nucléicos da presente invenção são inseridos em um vetor na direção sentido (isto é, 5' —> 3’), de modo que a matriz de leitura aberta é orientada de modo apropriado para a expressão da proteína codificada sob o controle de um promotor de escolha. Os ácidos nucléicos únicos ou múltiplos da presente invenção podem ser ligados em um vetor apropriado deste modo, sob o controle de um ou mais promotores. [0064] Em um aspecto da presente invenção, as moléculas de ácido nucléico individuais ou múltiplas da presente invenção são incorporadas em um vetor apropriado sob o controle de promotor heterólogo apropriado e outros elementos regulatórios 5' e 3'. Isto envolve a inserção de uma ou mais seqüências e ácido nucléico da presente invenção nos sítios de restrição de um vetor único, como descrito acima. Um promotor único é apropriado, com as moléculas de DNA ligadas de modo operativo 3' ao promotor. As seqüências podem ser ligadas em um vetor apropriado em ou uma orientação de sentido (5' -»3'), ou em uma orientação anti-sentido (3' -» 5'). O uso de RNA anti-sentido para regular a expressão de genes de planta específicos é bem conhecido (van der Krol et ai, Nature 333: 866-869 (1988) e Smith et ai, Nature 334: 724-726 (1988), que são incorporados aqui por referência em sua totalidade). Os ácidos nucléicos anti-sentido são moléculas de DNA ou RNA que são complementares a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica (Weintraub, "Antisense RNA and DNA" Scientific American 262: 40 (1990) que se incorpora aqui por referência em sua totalidade) A metodologia anti-sentido leva vantagem do fato de que os ácidos nucléicos tendem formar par com as seqüências "complementares". Por complementar, significa-se que os polinucleotí-deos são capazes de formar pares de bases de acordo com as regras de Watson-Crick padrões. Na célula de marcação, os ácidos nucléicos anti-sentido hibridizam para um ácido nucléico de marcação e interferem com a transcrição transgênica processamento de RNA, transporte, tradução e/ou estabilidade. O efeito global desta interferência com a função de ácido nucléico de marcação é a ruptura de expressão de proteína. [0065] Conseqüentemente, ambas as formas anti-sentido e sentido dos ácidos nucléicos da presente invenção são apropriadas para uso nos construtos de DNA da invenção. Um único construto pode conter ambas as formas de sentido e anti-sentido de um ou mais genes de amadurecimento de mamão papaia. [0066] Alternativamente, o construto de DNA da presente invenção pode ser configurada de modo que a molécula de DNA codifica um mRNA que não é traduzível, isto é, não resulta na produção de uma proteína ou polipeptídeo. Isto é obtido, por exemplo, por introdução na sequência de ácido nucléico desejada da presente invenção de um ou mais códons de parada prematuros, adicionando uma ou mais bases (exceto múltiplos de 3 bases) para deslocar o quadro de leitura, e remover o códon de iniciação de tradução {patente US 5 583 021 para Dougherty et al, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Isto pode envolver o uso de um iniciador para o qual um códon de parada, como TAATGA, é inserido no iniciador PCR sentido (ou "dianteiro") para amplificação do ácido nucléico completo, entre a extremidade 5' deste iniciador, que corresponde ao sítio de enzima de restrição apropriado do vetor em que o ácido nucléico deve ser inserido, e a extremidade 3' do iniciador, que corresponde à sequência 5’ do ácido nucléico codificando enzima. [0067] Os genes podem ser eficazes como silenciadores nas formas anti-sentido não traduzíveis, assim como na forma sentido não traduzível (Baulcombe, D.C. "Mechanisms of Pathogen-Derived Re-sistance to Viruses in Transgenic Plants", Plant Cell 8: 1833-44 (1996), Dougherty, W.G. et al, "Transgenes and Gene Suppression: Telling us Something New:" Current Qpinion in Cell Bioloqy 7: 399-05 (1995), Lomonossoff, G.P. "Pathogen-Deríved Resistance to Plant Viruses", Ann. Rev. Phvtopathol. 33: 323-43 (1995), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Conseqüentemente, um aspecto da presente invenção envolve construtos de DNA que contêm uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção como um DNA que codifica um mRNA não traduzível, esta molécula de ácido nucléico sendo inserida no construto em orientação de sentido ou anti-sentido. [0068] Outro aspecto da presente invenção é um método para promover o amadurecimento de plantas de mamão papaia. Isto é obtido por transformação de uma célula de planta de mamão papaia com um ou mais construtos de ácido nucléico da presente invenção. Os construtos contendo a molécula de DNA na orientação de sentido dentro do construto de DNA são preferíveis para este método, como expressão das proteínas e polipeptídeos responsáveis pelo amadurecimento de mamão papaia podem ser controladas por ligação do promotor apropriado com este construto. Por exemplo, o amadurecimento de mamão papaia transgênico contendo um ou mais genes de amadurecimento de mamão papaia pode ser regulado por ligação de um promotor indutível para o construto, como um promotor de glucocorticói-de. A exposição do agente indutor irá resultar na expressão dos trans-genes, aumentando o conteúdo de enzimas de amadurecimento no mamão papaia transgênico, e promovendo o amadurecimento. Alternativamente, usando um promotor constitutivo irá permitir que o amadurecimento ocorra no estágio normal do desenvolvimento da planta, mas bem mais rapidamente porque o nível de proteínas de amadurecimento pode ser reforçado sobre níveis endógenos normais. [0069] Outro aspecto da presente invenção é um método para retardar o amadurecimento de plantas de mamão papaia. Isto pode ser obtido por transformação de uma célula de planta de mamão papaia com um construto de DNA da presente invenção que contém um ou mais dos ácidos nucléicos da presente invenção. Em uma modalidade, uma célula de planta de mamão papaia é transformada com um ou mais dos ácidos nucléicos da presente invenção colocados em um vetor apropriado na orientação anti-sentido (3'-5'). No contexto de amadurecimento retardado, as plantas são levadas a expressar uma molécula RNA anti-sentido correspondendo a um RNA de proteína de ama- durecimento endógeno (isto é, o RNA anti-sentido é uma molécula de RNA que é complementar a uma espécie de RNA de sentido codificada pela seqüência de ácido nucléico orientada sentido). O RNA anti-sentido pode bloquear potencialmente a expressão da proteína codificada pelo gene marcado. Assim, uma planta de mamão papaia transformada com um ou mais genes de amadurecimento de mamão papaia da presente invenção, inserida na orientação anti-sentido, pode ser esperada para suprimir níveis endógenos de enzimas de amadurecimento e, assim, retardar o amadurecimento. [0070] Alternativamente, um ácido nucléico da presente invenção engenheirado para codificar para um RNA não traduzível, que é então inserido em uma orientação sentido ou anti-sentido, é apropriado para transformação de mamão papaia para efetuar amadurecimento retardado. Como descrito acima, o RNA não-traduzível efetua uma desre-gulagem ou supressão da proteína ou polipeptídeo normalmente produzida pelo gene endógeno codificando para um gene de amadurecimento particular. Após transformação com uma ou mais das seqüên-cias de ácido nucléico desejadas da presente invenção, a célula de planta é regenerada e cultivada como descrito acima. Plantas de mamão papaia que possam ser cultivadas em um tamanho maduro, mas deixadas amadurecer e amolecer após a expedição, seriam altamente benéficas para a indústria de produção de mamão papaia. [0071] Em outro aspecto da presente invenção, o amadurecimento é retardado por transformação de uma célula de mamão papaia com um construto incluindo um ou mais ácidos nucléicos codificando uma proteína ou polipeptídeo que controla o amadurecimento de mamão papaia inserida no vetor de modo a ser traduzível. O construto inclui um promotor escolhido para acionar a expressão das proteínas de amadurecimento em um ponto posterior no desenvolvimento do fruto de mamão papaia do que as proteínas endógenas são normalmente expressas na natureza, Este construto também pode incluir ácidos nu-cléicos anti-sentido ou não traduzíveis sob o controle de um promotor constitutivo "normal". Nesta modalidade, a expressão do construto anti-sentido provoca a desregulagem dos genes de amadurecimento en-dógenos em tal momento no desenvolvimento do fruto que a planta expressa de modo constitutivo os genes de amadurecimento. As proteínas normais são assim "silenciadas" e o amadurecimento não ocorre. Em um tempo posterior, no crescimento e desenvolvimento, a mesma planta, agora sob o controle do promotor constitutivo "mais tarde no tempo", dispara a expressão dos genes de amadurecimento do construto, e ocorre o amadurecimento.

Exemplo 1; Extração de Enzima e Determinação da Atividade Relativa ao Amadurecimento de Frutos [0072] Após coleta, mamões papaia verdes maduros da Guiné-Bissau foram levados ao laboratório e deixados amadurecer a 25°C. Nos diferentes estágios de amadurecimento (dias 1, 3, 5, 7, 9 e 11), o fruto foi amostrado, cortado transversal mente em duas partes e as sementes foram removidas. O mesocarpo interno foi separado do me-socarpo externo e cada tecido foi homogeneizado separadamente em nitrogênio líquido usando um misturador Waring. A polpa homogeneizada foi congelada imediatamente a -80°C. [0073] PME foi extraído e a atividade de PME testada como em Fayyaz et ai., "Pecti neste rase Extraction From Papaya," Food Chem. 47; 183-185 (1993), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. [0074] A extração de β-galactosidades foi como descrita em Ran-wala et a!., "The Role of β-Galactosidases in the Modification of Cell Wall Components During Muskmelon Fruit Ripening," Plant Physiol. 100: 1318-1325 (1992), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. Os dois volumes de tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) contendo 2-mercaptoetanol 1 mM foram adicionados à polpa homogeneizada (peso novo de 300 g de tecidos do mesocarpo) recuperada em cada estágio de amadurecimento (dias 1, 3, 5, 7, 9 e 11). O homoge-nado foi mantido durante 1 h em temperatura ambiente e então espremido através de três camadas de tecido de algodão para separar os extratos solúveis brutos das paredes das células. Sulfato de amônio sólido foi adicionado aos extratos brutos com 80% de saturação. As proteínas precipitadas foram coletadas por centrifugação a 13.000 rpm durante 20 minutos e dissolvidas em um pequeno volume de tampão fosfato 5 mM (pH 7,4) contendo 2-mercaptoetanol 1 mM. A solução resultante, designada como "fração de fosfato", foi dialisada contra o mesmo tampão. Material insolúvel foi removido por centrifugação, e o sobrenadante aplicado em uma coluna de DEAE-celulose (2,5 x 25 cm) que foi pré-equilibrada com o mesmo tampão. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCI 0 a 0,3M em 1000 ml de tampão. [0075] As paredes das células obtidas após extração da fração solúvel em fosfato foram homogeneizadas em 1000 ml de água filtrada em MilliQ, lavadas cinco vezes, colocadas em pasta fluida em 150 ml de tampão de homogeneização que continha NaCI 2 M, e a pasta fluida foi mantida a 4°C durante 48 h. Os extratos foram coletados por filtração a vácuo através de duas camadas de tecido de algodão e designados a "fração de NaCI." As proteínas no extrato foram precipitadas pela adição de sulfato de amônio sólido em 80% de saturação. As proteínas foram peletizadas por centrifugação a 13.000 rpm durante 20 min e o pélete obtido após centrifugação foi dissolvido em um pequeno volume de tampão acetato 5 mM (pH 5,6) que continha 2-mercaptoetanol 1 mM. A solução resultante foi dialisada contra o mesmo tampão com duas trocas. O dialisado foi centrifugado e o so- brenadante aplicado a uma coluna de CM-celulose (2,5 cm x 30 cm) pré-equilibrada com o mesmo tampão como usado para diálise. As proteínas adsorvidas foram eluídas com um gradiente linear de NaCI 0 a 0,5 M em 1000 ml de tampão. [0076] Após a extração com NaCI, as paredes das células foram homogeneizadas em 1000 ml de água MilliQ, lavadas cinco vezes e coletadas por centrifugação a 13,000 rpm x 15 min. As paredes das células foram colocadas em pasta fluida em 0,5% (p/v) de EDTA em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 6,8) e a pasta fluida mantida a 30°C durante 48 h. Os extratos foram coletados sob filtração a vácuo e designados a fração de EDTA. As proteínas no extrato foram precipitadas por 80% de saturação com sulfato de amônio e outra purificação foi realizada do mesmo modo como a purificação de β-galactosidase solúvel em uma coluna de DEAE-celulose, com exceção de que as proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCI a 0 a 0,5 M. [0077] A atividade de β-galactosidade foi testada usando o método de Ranwala et al,, "The Role of β-Galactosidases In the Modificação of Cell Wall Components During Muskmelon Fruit Ripening,” Plant Phvsi- ol. 100: 1318-1325 (1992), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade, A estimativa de proteína total foi como descrita em Fayyaz et al,, "Pectinesterase Extration From Papaya," Food Chem. 47: 183-185 (1993), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. [0078] A purificação de Caríca Papaya PG foi como descrita em Chan et al., "Partial Separation and Characterization of Papaya Endo-and Exo-Poligalacturonase," J. Food Sei. 47: 1479-1483, (1982), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. Após coleta, mamões papaia verdes maduros da Guiné-Bissau foram levados ao laboratório e deixados amadurecer a 25°C, Nos diferentes estágios de amadurecimento (dias 1, 5 e 11), o fruto foi amostrado, cortado trans- versalmente em duas partes, as sementes descartadas e o tecido do mesocarpo colocado em um béquer resfriado. O tecido (200 g) foi ma-cerado com 500 ml de acetona fria (-18°C) em um misturador Waring durante 2 min e o homogenado filtrado em vácuo. O resíduo foi extraído duas vezes pelo procedimento acima e filtrado até quase secura na última extração. O resíduo foi então seco sob nitrogênio e armazenado a -80°C. O rendimento foi aproximadamente 10 g de pó de acetona por 200 g de mesocarpo novo. [0079] Experiências preliminares separaram Endo-PG (PG I) de Exo-PG (PG II) na base de sua solubilidade em tampões contendo concentrações de NaCI altas ou baixas. PG I é solúvel em acetato 0,03 M em pH 4,6 contendo NaCI 0,96 M (tampão com alto teor de sal) e é insolúvel no mesmo tampão contendo NaCI 0,06 M (tampão com baixo teor de sal). PG II é solúvel em ambos os tampões com alto teor de sal e baixo teor de sal. Todas as enzimas foram purificadas a 4°C. [0080] PG I foi extraído de pó de acetona (7 g) com 150 ml de tampão com alto teor de sal. A pasta fluida foi agitada durante 5 min, misturada em um ultra Turrax. (Tekmar, Inc.) durante 1 min, e espremida através de um tecido Nitex com furos de 30 mícrons (Tobler, Er-nest, Troble, Inc.). Os sucos expressados foram centrifugados durante 30 min, 15.000 rpm. As enzimas foram precipitadas do sobrenadante adicionando-se sulfato de amônio sólido em 80% de saturação. A mistura final foi centrifugada a 15.000 rpm durante 30 min. O precipitado foi dissolvido em tampão com baixo teor de sal e dialisado durante a noite no mesmo tampão. O dialisado foi centrifugado a 15.000 rpm durante 30 min para remover o precipitado de PG I. O sobrenadante, um extrato semi-puro de PG II com quantidades menores de PG I, foi designado sobrenadante I. O precipitado contendo PG I foi enxaguado duas vezes com tampão com baixo teor de sal, redissolvido em 12 ml de tampão com alto teor de sal e centrifugado durante 30 min a 15.000 rpm. O sobrenadante contendo PG I foi designado sobrenadante II, carregado em uma coluna Sephadex G 200 e eluído com tampão com alto teor de sal. Somente a fração de pico de enzima eluída foi mantida para outra caracterização. [0081] PG II foi extraído e purificado através do uso de tampão com baixo teor de sal. As etapas de purificação foram iguais às etapas para PG I, com exceção do uso exclusivo de tampão com baixo teor de sal. O sobrenadante III (equivalente ao sobrenadante I), rotulado extrato com baixo teor de sal e contendo PG II, foi colocado em camadas em uma coluna Sephadex G-200 e eluído com tampão com baixo teor de sal. A fração de pico de enzima eluída foi armazenada a -20°C para outra caracterização. A atividade de poligalacturonase foi medida usando o método de Gross (Gross, K.C., "A Rapid and Sensitive Spec-trophotometric Method for Assaying Polygalacturonase Using 2-Cyanoacetamide," Hort. Science 17 (6)": 933-34 (1982), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). [0082] Em mamão papaia da Guiné, os níveis de atividades de PG I (Endo-PG) e PG II (Exo-PG) aumentam gradualmente com maturação. Quando estimada, a atividade de cada isoforma para cada dia exato de maturação mostra que Endo-PG sempre apresenta a atividade mais alta do que Exo-PG. No dia um de amadurecimento, endo- e exo-PGs apresentam valores diferentes, a atividade de endo-PG sendo maior do que a de exo-PG. No dia 11 de amadurecimento, a atividade de endo-PG alcança cerca de 3x a atividade do dia um, enquanto a atividade de exo-PG, mesmo mais baixa do que a de endo-PG, apresenta um aumento maior quando comparada ao dia um de amadurecimento (cerca de 4x o valor obtido durante o dia um de amadurecimento). De acordo com Lazan et ai., "Cell Wall Hydrolases and Their Potential in the Manipulation of Ripening of Tropical Fruits," Asean Food J.. 8: 47-53, (1993), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade, no fruto mamão papaia Eksotika, exo-PG parece predominar. O aumento de atividade é paralelo aos valores de proteína total que aumenta com o amadurecimento. Os padrões das atividades de exo-PG e endo-PG são muito diferentes de acordo com as diferentes espécies. Apesar de frutos de abacate apresentarem altos níveis de atividades de PG junto com o amadurecimento (Huber et al., "Polyu-ronides in Avocado (Persea americana) and To mato {Lycopersicon es-culentum) Fruits Exhibít Markedly Different Patterns of Molecular Weight Downshifts During Ripening," Plant Physiol., 102: 473-480 (1993) que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), de-screvem-se outros frutos desprovidos de atividade endo-PG (Huber, "Strawberry Fruit Softening: The Potential Roles of Polyuronides and Hemicelluloses," J. Food Sei. 49: 1310-1315, (1984); Giovannoni et al., "Expression of A Chimeric Polygalacturonase Gene in Transgenic rín Ripening Inhíbitor Tomato Fruits Results in Polyurnide Degradation But Not Softening," Plant Cell 1: 54-64 (1989); Cutillas-lturralde et al,, "Me-tabolísm of Cell Wall Polysaccharides from Persimmon Fruit: Solubili-zation During Fruit Ripening Occurs in Apparent Absence of Polygalacturonase Activity," Physiol, Plant. 89: 369-375, (1993), que são aqui incorporados por referência em sua totalidade), enquanto outros apresentando 3 isoformas de PG (2 exo-PG e uma endo-PG) serem descritos (Nogata et al., "Polygalacturonase in Strawberry Fruit," Phytoche-mistrv, 34: 617-620, (1993), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Em mamões papaia, o padrão de atividade de poliga-lacturonase é similar ao das atividades de PME e β-gal., o que sugere que PME pode desempenhar um papel importante na determinação da extensão em que pectina é acessível à degradação por PG (Koch et al., "Tomato Fruit Cell Wall. Use of Purified Tomato Polygalacturonase and Pectinesterase to Identify Developmental Changes in Pectin," Plant Physioloqy, 91: 816-822, (1989), que se incorpora aqui por refe- rencla em sua totalidade). À medida que o fruto amadurece, a solubili-dade de pectina e despolimerização aumentam (Lazan et al., "β-galactosidade, Polygalacturonase and Pectinesterase ín Differential Softening and Cell Wall Modification Duríng Papaya Fruit Ripening," Phvsiol. Plant. 95: 106-112, (1995), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade).

Exemplo 2 - Isolamento de RNA [0083] RNA foi obtido de mamão papaia em vários estágios de maturação usando o seguinte método. Tecidos de mamão papaia foram moídos em um pó fino em nitrogênio liquido em um misturador Waring. Usando uma espátula de metal resfriada em nitrogênio líquido, o pó foi rapidamente transferido para tubos contendo uma mistura (1:1) de tampão de extração (acetato de sódio 200 mM, EDTA 10 mM e 1% de SDS): fenol equilibrado (pH 4,3), pré-aquecida a 65°C durante 5 min. Após homogeneização com vórtice durante 5 min, um volume de 0,5x de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) foi adicionado. Após submeter a vórtice durante 5 min, o homogenado foi centrifugado a 10.000 rpm durante 10 min a 4°C. Usando uma pipeta de vidro estéril, a fase aquosa superior foi transferida para tubos de polipropíleno e volume igual de clorofórmio álcool isoamílico (24:1) foi adicionado. O vórtice durante 5 min e a centrifugação durante 10 min a 10.000 rpm a 4°C foram repetidos. Usando uma pipeta de vidro estéril, a fase aquosa superior foi novamente transferida para tubos de polipropíleno e volume igual de clorofórmio: álcool isoamílico foi adicionado e submetido a vórtice durante 5 min. A amostra foi transferida para tubos de vidro e centrifugada a 10.000 rpm durante 10 min a 4°C, A fase aquosa superior foi transferida para tubos de vidro novos e 1/3 volume de Lí Cl 8M foi adicionado e a precipitação realizou-se durante a noite a 4°C. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 min a 4Ό. O pélete resultante foi dissolvido com Li Cl 2 M submetendo-se a vórti- ce e centrifugado 10 min a 10,000 rpm a 4°G, A etapa anterior foi repetida. O pélete foi dissolvido em acetato de sódio 3 M com vórtice e centrifugada 10 min a 10,000 rpm a 4°C. A etapa anterior foi repetida. O pélete foi lavado duas vezes com 70% de etanol, seco em ar e dissolvido em 100 xi de água (tratada com DEPC). [0084] O fruto de mamão papaia em vários estágios de maturação (dias 1, 3, 5, 7, 9 e 11) produziu rendimentos de RN A purificado na faixa de 300-450 *g de RNA por g/FW de tecido de fruto em amadurecimento e 150 - 200 ocg por g/FW de tecido de fruto não amadurecido. Os valores de Α2&ο/Α28ο foram geral mente cerca de 1,9-2,0, o que indica uma preparação de RNA com alto teor de pureza. A quantidade de RNA total no fruto maduro (estágios 9 e 11) duplicou a quantidade de RNA total no fruto verde (estágios 1 e 3). Em todos os estágios de amadurecimento de frutos, a quantidade de RNA total no mesocarpo interno e externo foi similar.

Exemplo 3 - Construção da Biblioteca de cDNA e Método de Varredura [0085] Uma biblioteca de cDNA foi construída usando 5 ocg de RNA poli (A+) preparado do fruto de mamão papaia maduro usando um kit de síntese de cDNA expressado em ΖΑΡΑ (Stratagene, La Jol-la, CA). O cDNA foi clonado no vetor ZAPA-Lambda (Stratagene, La Jolla, CA) e acondicionado em Gígapack Gold III (Stratagene, La Jolla, CA). Â biblioteca primária foi amplificada de acordo com os protocolos do fabricante. Porções retiradas de placas em duplicada de 1x106 re-combinantes amplificados foram hibridizadas com ínsertos radiorrotu-lados de clones de cDNA CPSPE1, GP/?Ga/., ou PG RT-PCR ou RA-CE 573’ purificados com gel (preparados como descrito abaixo), usando o protocolo de Stratagene. Filtros hibridizados foram lavados duas vezes em 2x SSC e 0,1 % (p/v) de SDS a 65°C e duas vezes em 0,1 x SSC e 0,1% (p/v) de SDS a 65°C e expostos a filme a -80°C. Placas positivas foram conduzidas através de dois ciclos adicionais de varredura durante purificação e então excisadas in vivo para liberar o DNA do fagemídeo. Os clones de cDNA positivos correspondentes a qualquer uma das sondas de cDNA de enzima de amadurecimento foram seqüenciados usando um seqüenciador de DNA automático. Os alinhamentos de seqüências de aminoácidos deduzidas foram gerados usando software DNAStar.

Exemplo 4 - Projeto de Oligonucleotídeo [0086] Para cada uma das enzimas de amadurecimento, oligonu-cleotídeos degenerados foram preparados sinteticamente seguindo a determinação de seqüências apropriadas como a seguir. [0087] Oligonucleotídeos degenerados para PME foram projetados com base em regiões de alta homologia entre seqüências de aminoá-ci d os-PME de Lycopersicon escuientum (Hall et al., "Molecular Cha-racterization of cDNA Clones Representing Pectin Este rase Isozymes from Tomato," Plant. Mol. Biol, 25(2), 313-318, (1994); Pear et al„ "Simultaneous Inhibition of Two Tomato Fruit Cell Wall Hydrolases, Pectinmethylesterase and Polygalacturonase, With Antisense Gene Constructs," Antisense Res. Dev. 3(2), 181-190, (1993); patente EP n-0271988-A322 para Bridges et al.; Ray et al., "Identification and Se-quence Determination of a cDNA Clone for Tomato Pectin Este rase," Eur. J. Biochem. 174 (1), 119-124, (1988), que são aqui incorporados por referência em sua totalidade); Phaseolus vulgarís (Recourt et al., "Molecular Cloning of Bean Pectinesterases, Direct Submission," Sub-mitted (Q5-AUG-1992) to the EMBUGenBankIDDBJ databases. (1992), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade) e Petunia infia-ta (Um et al., "Characterization of a Pollen-Expressed Gene Encoding a Putative Pectin Esterase of Petunia inffata," Plant Mol. Biol. 25, 539-544 (1994), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). [0088] Para PG, oligonucleotídeos degenerados foram projetados com base em regiões de alta homologia entre sequências de aminoá-cidos deduzidas de PG alinhadas de Lycopersicon esculentum (Sheehy et al, "Molecular Characterization of Tomato Polygalacturo-nase," Mol. Gen. Genet. 298: 30-36, (1987), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), Brassica napus e Persea americana (Dopico et al., "Cloning and Charaterization of Avocado Fruit mRNAs and Their Expression During Ripeníng and Low Temperature Storage," Plant MoLBiol. 21 (3): 437-449 (1992), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade) e foram usados para amplificar cDNA de comprimento parcial de mamão papaia de RNA de transcrição reversa de mesocarpo de frutos (70% amarelos) maduros de mamão papaia. [0089] Para β-Gal., oligonucleotídeos degenerados foram projetados com base em regiões de alta homologia entre seqüências de ami-noácidos deduzidas de β-Gal. Alinhadas de Lycopersicon esculentum (Carey et al., "Tomato Exo-(1-4) p-D-galactanase. Isolation, Changes During Ripening ín Normal and Mutant Tomato Fruit, and Chatacteriza-tíon of a Related cDNA Clone," Plant Physiol. 108: 1099-1107 (1995), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), Asparagus officinaiis (Davies, "Cloning of a Harvest-lnduced β-Gal. From Ti ps of Harvested Asparagus Spears," Plant Physiol. 108 (1): 419-420 (1995), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade) e Aspergillus niger (Parenicova et al., "PgaA and PgaB Encode Two Constitutively Expressed Endopolygalacturonases of Aspergillus niger," Biochem. J. 345: 637-644 (2000); Parenicova et al,, "Characterization of A Novel Endopolygalacturonase from Aspergillus niger with Unique Kinetic Properties," FEBS Lett. 467: 333-36 (2000).

Exemplo 5 - Amplificação de cDNA por RT-PCR [0090] cDNA de filamento único foi sintetizado a partir de RNA total, extraído como acima de fruto mamão papaia maduro. 2 ocg de RNA total foram desnaturados durante 10 min a 65°C em 10 xg de água, incubados em gelo, e então incubados em 20 od de 1x tampão de primeiro filamento (Tris-HCI 50 mM, pH 8,3, KCI 75 mM e MgCI2 3 mM), 0,5 mM de cada dNTP e 100 ng de oligo (dt) 17, DTT 10 mM e 20 unidades de RNase a 65°C durante 10 min e então colocados novamente em gelo. 1 od de MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) (Stratagene, La Jolla, CA) (200 unidades/ od) foi adicionado e a reação foi incubada a 37°C durante 1 h. O tubo de reação foi então aquecido a 95°C durante 5 min e colocado em gelo ou armazenado a -20°C até uso posterior. 1 od da reação de primeiro filamento foi usado como um gabarito em PCR. A mistura de reação foi composta de Tris-HCI 10 mM, pH 8,3, KCI 50 mM, MgCI2 1 mM, dNTPs 0,2 mM, 100 pM de iniciador apropriado (iniciadores dirigidos CPSPE1, CPGal. 1 ou CPPG) e 0,2 od de polimerase Taq. As condições para amplificação foram 94°C durante 4 min e 35 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min, 72°C durante 1 min e então 72°C durante 7 min. Os produtos de RT-PCR foram submetidos a eletroforese com gel e DNA foi purificado com gel usando Qiaexll (Qiagen, Alemanha) e clonados em pBluescript KS II (Stratagene, La Jolla, CA). Os fragmentos de PCR clonados foram seqüenciados e analisados usando software DNAStar. [0091] RT-PCR resultou em um produto amplificado de 649 bp para PME, que foi como previsto das seqüências de PMEs conhecidos. A biblioteca de cDNA construída de mRNA de fruto mamão papaia foi variada usando o cDNA de comprimento parcial (649 bp) obtido por RT-PCR. A varredura resultou em um clone de cDNA aparentemente de comprimento completo de 1620 bp de comprimento contendo um matriz de leitura aberta ininterrupto.

Exemplo 6: Amplificação de cDNA usando RACE 573’ [0092] Três clones de cDNA para β-galactosidade de mamão papaia, correspondentes às isoformas β-Gal. 41 (679 bp), β-Gal. 45 (680 bp) e β-Gai 64 (535 bp), foram isolados por RT-PCR, nenhum dos quais pareceu ser um cDNA de comprimento completo. Fragmentos de RT-PCR foram clonados em pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) e seqüenciados usando o iniciador universal M13. Usando os fragmentos RT-PCT de β-Gai de comprimento parcial, a biblioteca de cDNA de fruto mamão papaia foi variada, mas nenhum β-Gai de comprimento completo foi obtido. Os fragmentos amplificados foram então usados como seqüências específicas para a técnica RACE 573’ usando um kit RACE 573’ (Boehringer, Roche Molecular Biochemicals, Alemanha), pelo protocolo do fabricante. Três clones de cDNA para isoformas de β-galactosidade de mamão papaia foram isolados. As três isoformas são referidas aqui como β-galactosidase 45 ("β-Gai 45"), com uma seqüência de nucleotídeo de 2827 bp, correspondente à SEQ ID NO: 1; β-galactosidase 64 ("β-Gai 64"), com uma seqüência de nucleotídeo de 534 bp, correspondente à SEQ ID NO: 3, e β-galactosidase 45 ("β-Gal. 41") com uma seqüência de nucleotídeo de 2746 bp, correspondente à SEQ ID NO: 5. Todos os cDNAs de β-Gai obtidos por RACE 573’ continham matrizes de leitura aberta completos. O comprimento dos clones de cDNA corresponde ao tamanho do mRNA correspondente mais abundante, e presume-se que eles representam mRNAs de comprimento completo. [0093] Os iniciadores de oligonucleotídeos degenerados usados para obter o comprimento completo de β-Gai 41 e β-Gai 45 são como a seguir: SEQ ID NO: 11 PR3 5’AGACITATCGTITTCTTGGAATG 3’ SEQ ID NO: 12 PR5 5’GAAGTGGAATCTTATCGGIGGITTCC 3’ SEQ ID NO: 13 PR11 5’CACAGTAAGAAACCATTGCAAG 3’ SEQ ID NO: 14 PR7C 5’CCAGAAAGTTIGTICCICCAGTG 3’ Iniciadores específicos usados para RACE 573’ para obter cDNAs da isoforma β-Gal. de comprimento completo são os seguintes: [0094] Para β-Gal. 41: SEQ ID NO: 15 5’-TGGTCTCCCTCCTTAGTCCATACTC 3’ SEQ ID NO: 16 5-GCTTACTCCGTTGCAAGGTTCATT-3’ Para β-Gal. 45: SEQ ID NO: 17 5’-AAGGGAGGGTCGTTCATTAACTAT-3’ [0095] RT-PCR resultou em um produto PG amplificado de 195 bp de comprimento parcial, que foi clonado em pBluescript, seqüenciado e usado para varrer a biblioteca de cDNA do fruto mamão papaia. Nenhum clone de comprimento completo foi obtido. Conseqüentemente, RACE 573’ foi usado para o isolamento de regiões de flanco desconhecidas do cDNA de comprimento parcial, resultando em um cDNA de 1330 bp, designado CPPG. O cDNA de 1330 bp corresponde ao tamanho do mRNA de PG mais abundante e presume-se que ele representa um cDNA de comprimento parcial.

Exemplo 7 - Análise Southern Blot [0096] DNA genômico total foi isolado pelo método CTAB (Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1," Massachusetts General Hospital, Harvard Medicai School, U.S.A., (1978), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), 10 <xg de DNA foram digeridos com enzimas de restrição BamHI, EcoRI e Hindlll (Boehrin-ger, Roche Molecular Biochemicals, Alemanha), separados em 0,8% de géis agarose e transferidos para membranas de nitro-celulose de acordo com instruções do fabricante (Amersham, Reino Unido). As membranas foram sondadas com DNA de inserto rotulado [a-32P] dCTP purificado com gel de clones de RT-PCR de comprimento parcial CPSPE1, CPpGal ou CPPG, nas condições descritas acima para hibridização com mancha de RNA, lavadas em 5x SSC e 0,1% de SDS a 65°C e 0,2x SSC e 0,1 SDS a 65°C e expostas a filme com uma varredura intensa a -80°C durante a noite.

Exemplo 8 - Análise Northern Blot [0097] Análise Northern Blot foi realizada para examinar o nível de expressão de mRNA no fruto em diferentes estágios de amadurecimento. 20 ocg de RNA total de fruto mamão papaia foram separados por eletroforese de gel agarose com desnaturação glioxal e transferidos para membrana de náilon (Hybond-N, Amersham, Reino Unido), de acordo com as instruções do fabricante. Cada membrana foi sondada com um DNA de inserto rotulado [a-32P] dCTP purificado com gel do clone apropriado. CPSPE-1, o clone derivado de PCR de comprimento parcial, foi usado para sondar PME; para as isoformas pGal, o clone RT-PCR de comprimento parcial CPfiGal. foi usado como uma sonda. As sondas foram rotuladas usando o kit rotulado DNA Ridipri-mer (Amersham, Reino Unido). Manchas foram hibridizadas durante a noite a 65°C em 7% (p/v) de SDS, tampão fosfato 0,5 M, 2% (p/v), re-agente de bloqueio (Boehringer) com aproximadamente 50 ng de sonda rotulada, lavados duas vezes em 2x SSC e 0,1% (p/v) de SDS a 65°C, então duas vezes em 0,1x SSC e 0,1% (p/v) de SDS a 65°C e expostas a filme durante a noite a -80°C. [0098] O nível de expressão de PME foi similar aos tecidos do me-socarpo interno e externo durante os diferentes estágios de amadurecimento do fruto. No entanto, a expressão de mRNA foi a mais alta para os estágios de amadurecimento 1 a 4, tornando paralelo o aumento mostrado na atividade de PME e diminuindo depois (nos estágios 5 e 6) a níveis muito baixos de expressão. [0099] Todas as três isoformas de β-Gal (ΟΡβ-Gal 41, ΟΡβ-Gal. 45 e ΟΡβ-Gal. 64) são expressadas no mesocarpo de mamão papaia e aumentam durante o amadurecimento do fruto, com níveis mais altos medidos no dia 11 após coleta do fruto, que corresponde a fruto maduro (>70% amarelo). Isto é visto nas figura 1, figura 2, figura 3, que mostram Northern blots de RNA de CP total, realizados como descrito logo acima, de diferentes estágios de amadurecimento rotulados com sondas ΟΡβ-Gal 41, ΟΡβ-Gal. 45 e ΟΡβ-Gal. 64, respectivamente. O aumento na tradução de mRNA de ΟΡβ-Gal 41, ΟΡβ-Gal. 45, como detectado por análise Northern, torna paralelo o aumento na atividade destas isoformas de β-Gal. No entanto, a tradução da isoforma ΟΡβ-Gal. 64, demonstra um padrão diferente. Para ΟΡβ-Gal. 64, somente uma reação como pavio foi detectada e não houve nenhuma diferença observada entre o mesocarpo interno e externo.

Exemplo 9 - Análise Filogenética [00100] A seqüência de aminoácidos deduzida de CPSPE1 (EMBL/ GeneBank acesso Y07899) (Gouveia, M. et ai., "Characterization of Pectinase cDNAs in Fruit of Carica Papaya L," submissão direta (CPSPE 1; número de acesso Y07899), submetido (14 de Outubro de 1996) ao EMBL GeneBank/bases de dados DDBJ (1996)) e CPSPE2 (seqüência completa da biblioteca de cDNA, submetida a EMBL/ GeneBank/ bases de dados DDBJ, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade), foi alinhada a 10 seqüências de aminoácidos do gene pectinmetilesterase. Homologias entre as seqüências de aminoácidos deduzida de PME foram determinadas usando software de alinhamento de seqüências múltiplas Clustal V. As seqüências foram: 6 de fruto PME tomate, 3 de PME Phaseolus vulgaris e 1 de PME Petunia inflata. A árvore filogenética de PME foi deduzida de seqüências alinhadas usando o algoritmo de parcimônia máximo do software DNAStar. [00101] As seqüências de aminoácidos deduzidas dos clones ΟΡβ-Gal. foram alinhadas a 12 seqüências de aminoácidos dos genes β-Gal de outras espécies, e homologias foram determinadas usando software de alinhamento de seqüências múltiplas Clustal V. Seqüências de ΟΡβ-Gal foram alinhadas com o fruto de: 3 β-Gal. de Lycopersicon esculen-tum; 1 β-Gal de mangifera indica; 2 β-Gal. de Asparagus officinalis·, 2 β-Gal. de Cicer arietinum-, 1 β-Gal. de Vitis vinifera; 1 β-Gal. de Aspergillus niger, 1 β-Gal. de Lactobacillus sp.; e 1 β-Gal. lisossômico. O filograma gerado mostra que isoformas de β-galactosidase 41, 45 e 64 de frutos mamão papaia têm mais alta similaridade à manga (Mangifera indica) β-galactosidase e asparagus (Asparagus ofTicinaiis) β-galactosidase. Similaridades altas também são verificadas entre as três isoformas dep-Gal, de mamão papaia e β-Gal, e β-Gal.l de tomate. A árvore filogenética de β-Gal., mostrada na figura 4A, foi deduzida de sequências alinhadas usando o algoritmo de parcimônia máximo do software DNAStar. [00102] A figura 4B mostra o alinhamento de sequências de aminoá-cidos deduzidas de PG de mamão papaia e as sequências de aminoá-cidos primárias de 10 PGs de outras espécies de planta: Arabidopsis thaiiana (Torki et al., Univ. J. Fourier. Grenoble, França, (1993); Torki et al.t "Sequence Analysís of an 81 kb Contig from Arabidopsis thaiiana Chromosome III," Nucleic Acids Res. 24 (21): 43134318, (1996) que são aqui incorporados por referência em sua totalidade); Persea americana (Dopíco et al., "Cloníng and Characterízation of Avocado Fruit mRNAs and Their Express to n During Ripening and Low Temperature Storage," Plant. Mol. Biol.. 21 (3): 437-449, (1993) que se incorpora aqui por referência em sua totalidade); Brassica napus (GenBank número de acesso AJ250919, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade); Zea mays (Rogers et al., "Pollen Specífic cDNA Clones from Zea Mays," Bi-ochem. Biophvs. Acta 1089 (3): 411-413, (1991), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade); Sheehy et al., "Molecular Characteri-zation of Tom ato Polygalacturonase," Mol. Gen. Genet 298: 30-36, (1987); Barakate et al,, "Characterízation of a Multigene Family Encod-ing an Exopolygalacturonase in Maize," J, Mol, Biol. 2293: 797-801, (1993), que são aqui incorporados por referência em sua totalidade); Lycopersicon escuientum (Ju et al., "Cloning of Polygalacturonase (PG) cDNA, and Inhibition Effects of Its Antisense RIMA on the Expression of PG Gene in Transgenic Tom ato Plants," Chin. J. Biotechnol. 10 (2): 67-74, (1994); Pearet al., "Simultaneous Inhibition of Two Tomato Fruit Cell Wall Hydrolases, Pectinmethylesterase and Polygalacturonase, with An-tisense Gene Constructs," Antisense Res. Dev. 3 (2), 181-190, (1993), que são aqui incorporados por referência em sua totalidade); e Citrus sinensis (GenBank número de acesso Y08616, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). A árvore filogenética de PG foi inserida das seqüências alinhadas usando um algoritmo de parcimônia máximo do software DNAStar. O filograma gerado deste alinhamento mostra que poligalacturonase do fruto Carica papaya apresenta alta homo-logia com um PG de Lycopersicon esculentum (83%). Com outro PG de L. esculentum somente homologia (54%) foi obtida e com os outros, a saber de Zea mays, (48%) a homologia é ainda menor.

Exemplo 10 - Hibridização in situ [00103] Análise de hibridização in situ foi usada para correlacionar estágios de amadurecimento com a localização de genes de amadurecimento expressados durante vários estágios de amadurecimento de fruto mamão papaia. [00104] Hibridização in situ foi realizada em mesocarpo de fruto carica papaya em três estágios de amadurecimento. Tecido de cada estágio foi fixado em 4% de paraformaldeído, 0,25% de glutaraldeído em tampão fosfato 10 mM (pH 7,2-7,4). O tecido foi cortado em pedaços pequenos (1-5 mm) usando um estilete fino e afiado, em um prato petri contendo um filme de água e imediatamente transferidos para fixador durante 3-6 h. Os tecidos fixados foram desidratados e embebidos em parafina (Paraffin Blockform, Erstarr.-P. 51-53°C, Merck, Darmstadt), de acordo com o protocolo de Kouchi et ai., "Dis-tinct Classes of Mitotic Cyclins Are Differentially Expressed in the Soybean Shoot Apex During the Cell Cycle," Plant Cell 7: 1143-1155, (1995), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. Seções de oito ocm preparadas usando um micrôtomo Yung (Alemanha) foram montadas em lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina (Sigma Biochemical, St. Louis, MO) e pré-tratadas para hibridização de acordo com Kouchi et al., "Distinct Classes of Mitotic Cyclins Are Differentially Expressed In The Soybean Shoot Apex During The Cell Cycle," Plant Cell 7 1143-1155, (1995), que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. O kit de rotulação DIG-11-rUTP (Boehrin-ger, Roche Molecular Biochemicals, Alemanha) foi usado para gerar sondas de RNA sentido e anti-sentido por transcrição run-off com po-limerase de RNA T3 e T7. Sondas de RNA rotuladas foram hidrolisa-das em um comprimento médio de 300 nucleotídeos. Os procedimentos de pré-hibridização, hibridização e detecção foram realizados usando o protocolo fornecido com o kit de detecção e rotulação comercialmente disponível (Boehringer, Roche Molecular Biochemicals, Alemanha). Após detecção e lavagem, as lâminas de vidro foram preparadas e fotografias foram tiradas em um microscópio de luz Leitz Wetzlar Dialux sob luz de tungstênio de 12 volts. [00105] Análise de hibridização in situ para PME revelou que RNA anti-sentido de mamão papaia é expressado em todas as células de mesocarpo do fruto mamão papaia. No entanto, no estágio 3 de amadurecimento, a expressão é mais alta no mesocarpo externo. Nos estágios 7-9 (75% e 90% do fruto amadurecido, respectivamente), a expressão de PME é mais alta do que nos estágios anteriores e é similar em células do mesocarpo interno e externo. [00106] Análise de hibridização in situ para isoforma ΟΡβ-Gal. 41 revelou que RNA anti-sentido de mamão papaia é expressado em todas as células do mesocarpo do fruto mamão papaia. No estágio 3 de amadurecimento, a expressão é muito baixa. No estágio 9 de amadurecimento, a expressão de ΟΡβ-Gal. 41 é mais alta do que nos estágios anteriores e é similar em células do mesocarpo interno e externo. Além disso, no estágio 11 de amadurecimento, a expressão de ΟΡβ-Gal. 41 é ainda mais alta e não há nenhuma diferença entre o meso- carpo interno e externo.

Exemplo 11 - Construção de cassetes de genes de amadurecimento de frutos [00107] Como um exemplo dos construtos da presente invenção, cDNAs de β-Gai 41 (SEQ ID NO: 5) e β-Gai 45 (SEQ ID NO: 1), clo-nados, isolados e seqüenciados como descrito nos exemplos acima, foram usados para construir cassetes de genes de amadurecimento de frutos múltiplos. [00108] O vetor pEPJ, mostrado na figura 5, foi projetado especificamente como um cassete de expressão de planta. Como mostrado na figura 5, pEPJ consiste em duas regiões melhoradoras 35S, um promotor CaMV 35S, seguido por uma seqüência líder ("A1MV") do vírus mosaico a1, e um sítio de enzima de restrição múltiplo que é imediatamente 5’ em uma região de terminação de 35S. Os sítios de restrição Hindlll e Kpnl permitem ligação em vários outros vetores, como pUC18 e o vetor de transformação pGA482G, mostrados na figura 6. Como mostrado na figura 6, pGA4482G tem um sítio de clonagem Hindlll-Kpnl, e contém marcador de transformação de planta NPTII comumente usado. O cassete pEPJ foi digerido com Hindlll-Kpnl e ligado no vetor de transformação pGA482G. A enzima de restrição Apal/BamHI digeriu fragmentos de traduzível (TL), não-traduzível (NTL) e um fragmento anti-sentido digeriu Smal-Apal de formas TL ("ATL") de β-Gai 41 e β-Gai 45 foram ligados ao vetor pEPJ. As enzimas de restrição Xhol-Kpnl (Kpnl parcial) digeriram fragmentos do vetor de expressão e foram então ligadas no vetor de transformação pGA482G e resultaram em cassetes de genes de amadurecimento do fruto de mamão papaia, "C1" a "C6". A tabela 1 mostra os iniciadores de amplificação (com sítios de enzimas de restrição indicados por itálicos) e o tamanho do produto esperado para β-GaA 41 e β-GaA 45. TABELA 1 TABELA 1 (Continuação) [00109] Um exemplo de cassete de genes construído é mostrado na figura 7. A figura 7 mostra o vetor pEPJ com o ácido nucléíco (anti-sentido traduzível) ATL-β-Gaf. 41 para o gene de amadurecimento β-Gai 41 ("C6") inserido no sítio de clonagem múltiplo entre a sequência líder e a sequência de terminação 35S. Como descrito na Descrição Detalhada, supra, um ou mais ácidos nucléicos da presente invenção pode ser inserido no sítio de clonagem para uso na realização dos métodos da presente invenção. Combinações de variações sentido, antí-sentido, traduzíveis e não-traduzíveis de genes de amadurecimento codificando ácidos nucléicos são apropriadas para a presente invenção, [00110] Apesar das formas de realização preferidas serem representadas e descritas com detalhes aqui, será evidente aos versados na técnica relevante que várias modificações, adições, substituições e similares podem ser feitas sem sair do espírito da invenção e que são, assim, consideradas como estando dentro do escopo da invenção como definido nas reivindicações que se seguem.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Cornell Research Foundation, Inc.

Marie Salome Soares Pais <120> CONSTRUTO DE DNA, SISTEMA DE EXPRESSÃO E CÉLULA HOSPEDEIRA OU VÍRUS RELACIONADOS COM O AMADURECIMENTO DE MAMÃO PAPAIA, BEM COMO MÉTODOS PARA PROMOVER OU RETARDAR O AMADURECIMENTO DE FRUTO DE MAMÃO PAPAIA <130> 29543.3553 <140> PI0209085-6 <141> 11.04.2002 <150> US 60/283,008 <151> 11.04.2001 <160> 29 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 2827 <212> DNA <213> Carica papaya <220> <221> região de interesse biológico <222> (659)..(659) <223> N na posição 659 é a, c, g, ou t <400> 1 agacgtacgt gttttggaat gggcatgagc cttcacctgg caaatactac tttggaggaa 60 actatgatct ggttagattc attaagctgg tgaagcaagc aggcctctat gttcatctca 120 ggattggtcc atatgtttgt gccgagtgga actttggggg ttttcctgcc cggcttaagt 180 acattccagg catcgctttc agaacgaaca atggaccttt caaggcatac atgcaaagat 240 ttacaaagaa aattgttgat atgatgaaag ctgaagggtt gtttgaatct cagggtggtc 300 caataatttt atcccagatt gaaaatgaat atggacccat ggagtacgaa cttggtgcag 360 ccgggcgtgc ttacgctcaa tgggcagctc agatggctgt gggattcggt actggtgtcc 420 cgtgggtcat gtgcaagcaa gatgatgcac ctgatcctat tattaacact tgcaatggtt 480 tctactgtga ttacttttct ccaaacaaag catacaagcc caagatgtgg actgaagctt 540 ggactggttg gtttactgga tttggaggtg cagttcctta ccgaccagtg gaagacttgg 600 cattttcagt tgcaaggttt atacagaatg gagggtcgtt cattaactat tatatgtgnc 660 atggaggaac aaattttggc cgcactgctg gtggcccctt cattgccact agctatgatt 720 atgatgctcc tcttgatgaa tatggactgg tgaggcaacc taaatggggt catttgaaag 780 atttacatcg agcaataaaa ctgtgtgaac cagcactggt gtctggtgat ccttctgtca 840 tgccacttgg acgctttcaa gaggctcatg tcttcaaatc aaaatatggg cattgtgctg 900 cattccttgc aaattacaat ccaagatctt ttgctaaagt tgcctttggg aatatgcatt 960 acaacctgcc tccttggtct atcagcattc ttcccgactg taaaaacact gtttataaca 1020 ctgcaagggt tggtgctcaa agtgctagga tgaagatggt tcctgttcct attcatggag 1080 cattctcttg gcaggcttat aatgaagagg caccttcctc aaatggtgaa aggtcattca 1140 cgacggtagg attggtggaa cagataaata caactagaga tgtctctgac tatttatggt 1200 actcaacgga tgttaagatt gatcctgatg aaggattctt gaagactgga aagtacccca 1260 cactcactgt tttatctgct ggtcatgctt tacatgtatt tgtcaacgac caactatcag 1320 gaactgccta tggaagctta gaatttccaa agataacttt cagtaaaggt gtaaatctga 1380 gagctggcat caacaagatt tcaattctaa gcattgctgt tggtcttccg aacgtcggtc 1440 ctcattttga gacatggaat gctggagttc ttggtcctgt aacattgaat ggtcttaacg 1500 agggaagaag ggacttatca tggcagaaat ggtcttacaa ggttggtgtt gaaggagaag 1560 caatgagtct tcattcactc agtgggagtt cctcagttga gtggactgca gggtcttttg 1620 tagcaagaag gcagcccctt acttggttca aaactacttt caatgctccg gctggaaatt 1680 ctccattggc tctggatatg aatagtatgg gtaaaggaca aatatggata aatggaaaga 1740 gtatcgggcg gcactggcct gcatataaag catctggttc ttgtggttgg tgtgattatg 1800 ctggaacatt taatgagaag aagtgcttaa gtaattgtgg agaggcttct caaagatggt 1860 atcacgttcc tcgctcatgg ctcaacccaa cagggaattt gttggttgtt tttgaagaat 1920 ggggtggaga tcctaatgga atatccttgg ttagaagaga agtagacagt gtttgtgctg 1980 atatttatga gtggcaacca actctgatga attatcaaat gcaagcatct ggaaaggtaa 2040 acaaaccact gcggcctaat aaagctcatt tacagtgtgg ccctgggcag aagttctcat 2100 cagtcaagtt tgccagtttt ggcactccag aaggggcttg tggaagctac cggagggaag 2160 ctgccatgca catcattctt atgatgcttt tgagaggctc tgtgttgggc agaactggtg 2220 ctcagtaaca gtagcacccg aaatgttcgg tggagatccc tgccccagtg tcatgaagaa 2280 actcgcggtg gaggttgttt gcagctgaag aactgtaaca tcagaaaagt gatggaagtg 2340 aaggaaattg tggactgatt ctttttttta caagtcatca gttatattat ttcttggata 2400 aattaagtct acacatcgaa gtttgcagcc attctgttcc agctttcaaa tggtgaagtt 2460 gtacaaatat acagcacaca ccatggatgg ctggcatctc ttacaagcat tgtcaaagtg 2520 tttgtccatt ggaaaaatgt acataaagca atgattcgtt gcctgcatgt tatatggaag 2580 tttaaggatg gaatctgtcg aagcacagtg agacggcggt aacccagtcc atgtgccaga 2640 tattttagct tttatagggt atggaaatcc tctgatttct agtcatttta agtggtacat 2700 tctctttcaa gtttcttgag aagcaaaatt gtttacactg ctttgttctt gcaagaaaaa 2760 aggaacaaag gcctcaaatg gccataatat atttactctt tttagttcaa agaaaaaaaa 2820 aaaaaaa 2827 <210> 2 <211> 665 <212> PRT <213> Carica papaya <220> <221> INCERTO <222> (143)..(143) <223> Xaa na posição 143 é qualquer aminoácido <400> 2 Met Gin Arg Phe Thr Lys Lys Ile Vai Asp Met Met Lys Ala Glu Gly 15 10 15 Leu Phe Glu Ser Gin Gly Gly Pro Ile Ile Leu Ser Gin Ile Glu Asn 20 25 30 Glu Tyr Gly Pro Met Glu Tyr Glu Leu Gly Ala Ala Gly Arg Ala Tyr 35 40 45 Ala Gin Trp Ala Ala Gin Met Ala Vai Gly Phe Gly Thr Gly Vai Pro 50 55 60 Trp Vai Met Cys Lys Gin Asp Asp Ala Pro Asp Pro Ile Ile Asn Thr 65 70 75 80 Cys Asn Gly Phe Tyr Cys Asp Tyr Phe Ser Pro Asn Lys Ala Tyr Lys 85 90 95 Pro Lys Met Trp Thr Glu Ala Trp Thr Gly Trp Phe Thr Gly Phe Gly 100 105 110 Gly Ala Vai Pro Tyr Arg Pro Vai Glu Asp Leu Ala Phe Ser Vai Ala 115 120 125 Arg Phe Ile Gin Asn Gly Gly Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Met Xaa His 130 135 140 Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ala Gly Gly Pro Phe Ile Ala Thr 145 150 155 160 Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr Gly Leu Vai Arg Gin 165 170 175 Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Asp Leu His Arg Ala Ile Lys Leu Cys 180 185 190 Glu Pro Ala Leu Vai Ser Gly Asp Pro Ser Vai Met Pro Leu Gly Arg 195 200 205 Phe Gin Glu Ala His Vai Phe Lys Ser Lys Tyr Gly His Cys Ala Ala 210 215 220 Phe Leu Ala Asn Tyr Asn Pro Arg Ser Phe Ala Lys Vai Ala Phe Gly 225 230 235 240 Asn Met His Tyr Asn Leu Pro Pro Trp Ser Ile Ser Ile Leu Pro Asp 245 250 255 Cys Lys Asn Thr Vai Tyr Asn Thr Ala Arg Vai Gly Ala Gin Ser Ala 260 265 270 Arg Met Lys Met Vai Pro Vai Pro Ile His Gly Ala Phe Ser Trp Gin 275 280 285 Ala Tyr Asn Glu Glu Ala Pro Ser Ser Asn Gly Glu Arg Ser Phe Thr 290 295 300 Thr Vai Gly Leu Vai Glu Gin Ile Asn Thr Thr Arg Asp Vai Ser Asp 305 310 315 320 Tyr Leu Trp Tyr Ser Thr Asp Vai Lys Ile Asp Pro Asp Glu Gly Phe 325 330 335 Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Pro Thr Leu Thr Vai Leu Ser Ala Gly His 340 345 350 Ala Leu His Vai Phe Vai Asn Asp Gin Leu Ser Gly Thr Ala Tyr Gly 355 360 365 Ser Leu Glu Phe Pro Lys Ile Thr Phe Ser Lys Gly Vai Asn Leu Arg 370 375 380 Ala Gly Ile Asn Lys Ile Ser Ile Leu Ser Ile Ala Vai Gly Leu Pro 385 390 395 400 Asn Vai Gly Pro His Phe Glu Thr Trp Asn Ala Gly Vai Leu Gly Pro 405 410 415 Vai Thr Leu Asn Gly Leu Asn Glu Gly Arg Arg Asp Leu Ser Trp Gin 420 425 430 Lys Trp Ser Tyr Lys Vai Gly Vai Glu Gly Glu Ala Met Ser Leu His 435 440 445 Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Vai Glu Trp Thr Ala Gly Ser Phe Vai 450 455 460 Ala Arg Arg Gin Pro Leu Thr Trp Phe Lys Thr Thr Phe Asn Ala Pro 465 470 475 480 Ala Gly Asn Ser Pro Leu Ala Leu Asp Met Asn Ser Met Gly Lys Gly 485 490 495 Gin Ile Trp Ile Asn Gly Lys Ser Ile Gly Arg His Trp Pro Ala Tyr 500 505 510 Lys Ala Ser Gly Ser Cys Gly Trp Cys Asp Tyr Ala Gly Thr Phe Asn 515 520 525 Glu Lys Lys Cys Leu Ser Asn Cys Gly Glu Ala Ser Gin Arg Trp Tyr 530 535 540 His Vai Pro Arg Ser Trp Leu Asn Pro Thr Gly Asn Leu Leu Vai Vai 545 550 555 560 Phe Glu Glu Trp Gly Gly Asp Pro Asn Gly Ile Ser Leu Vai Arg Arg 565 570 575 Glu Vai Asp Ser Vai Cys Ala Asp Ile Tyr Glu Trp Gin Pro Thr Leu 580 585 590 Met Asn Tyr Gin Met Gin Ala Ser Gly Lys Vai Asn Lys Pro Leu Arg 595 600 605 Pro Asn Lys Ala His Leu Gin Cys Gly Pro Gly Gin Lys Phe Ser Ser 610 615 620 Vai Lys Phe Ala Ser Phe Gly Thr Pro Glu Gly Ala Cys Gly Ser Tyr 625 630 635 640 Arg Arg Glu Ala Ala Met His Ile Ile Leu Met Met Leu Leu Arg Gly 645 650 655 Ser Vai Leu Gly Arg Thr Gly Ala Gin 660 665 <210> 3 <211> 534 <212> DNA <213> Carica papaya <220> <221> região de interesse biológico <222> (121)..(121) <223> N na posição 121 é a, c, g, ou t <220> <221> região de interesse biológico <222> (208)..(208) <223> N na posição 208 é a, c, g, ou t <220> <221> região de interesse biológico <222> (232)..(232) <223> N na posição 232 é a, c, g, ou t <220> <221> região de interesse biológico <222> (316)..(316) <223> N na posição 316 é a, c, g, ou t <220> <221> região de interesse biológico <222> (320)..(320) <223> N na posição 320 é a, c, g, ou t <400> 3 gaatggaatt atggggggtt ccggtttggc tgaagtatgt ccctggaatc agctttagaa 60 cagacaatga gcctttcaag agagctatgc aagggttcac agagaagatt gtgggactat 120 naagagtgaa aacttgtttg agtcccaggg tggccccatt atcctctctc agattgagaa 180 tgagtacggg aaacagagca agttattngg cgccgatgga tataattata tnagttgggc 240 agcaaaaatg gctgttgaaa caggaacagg tgtcccctgg gtcatgtgca aagaagacga 300 tgcaccagat ccggtnatan acacgtgcaa atggttttac tgtgaagcat tctctcctaa 360 caaaccttac aagcccaaga tctggacgga ggcatggagt ggctggttca cagactttgg 420 tggccccatc caccagcggc cagttcagga tcttgcattt gcagttgcta agttcataca 480 aaaaggaggg tcctttgtca actattacat gtatcatggc ggcaccaact ttgg 534 <210> 4 <211> 177 <212> PRT <213> Carica papaya <220> <221> INCERTO <222> (40)..(40) <223> Xaa na posição 40 é qualquer aminoácido <220>

Claims (17)

1. Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: uma ou mais moléculas de ácido nucléico ligadas de modo operativo, em que a molécula de ácido nucléico apresentam uma sequência de nucleotídeos correspondente a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1,3, 5, 7 e 9, um promotor de DNA heterólogo ligado de modo operativo, e uma região regulatória 3' ligada de modo operativo.

2. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucléico são selecionadas dentre o grupo consistindo em um gene de β-galactosidase, um gene de pectinmetilesterase, um gene de poligalacturonase, e combinações dos mesmos.

3. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das moléculas de ácido nucléico estão na orientação sentido (5' -»3').

4. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das moléculas de ácido nucléico é inserida na orientação (3' -»5') anti-sentido.

5. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico codifica um RN A não-traduzível.

6. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico codifica um RNA anti-sentido.

7. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico apresenta uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

8. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico apresenta uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3.

9. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico apresenta uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5.

10. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico apresenta uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7.

11. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico apresenta uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9.

12. Sistema de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o construto de DNA, como definido na reivindicação 1, em que o sistema de expressão é um plasmídeo recombinante.

13. Célula hospedeira ou vírus, caracterizado pelo fato de que é transduzida(o) com o construto de DNA, como definido na reivindicação 1, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula de levedura.

14. Método para promover o amadurecimento de fruto de mamão papaia, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) transformar uma célula de planta de mamão papaia com o Construto de ácido nucléico como definido na reivindicação 3, e (ii) regenerar uma planta de mamão papaia da célula transformada sob condições eficazes para promover o amadurecimento de fruto de mamão papaia.

15. Método para retardar o amadurecimento de fruto de mamão papaia, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) transformar uma célula de planta de mamão papaia com o Construto de DNA como definido na reivindicação 4, e (ii) regenerar uma planta de mamão papaia da célula transformada sob condições eficazes para retardar o amadurecimento de fruto de mamão papaia.

16. Método para retardar o amadurecimento de fruto de mamão papaia, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) transformar uma célula de planta de mamão papaia com o Construto de DNA como definido na reivindicação 5, e (ii) regenerar uma planta de mamão papaia da célula transformada sob condições eficazes para retardar o amadurecimento do fruto de mamão papaia.

17. Método para retardar o amadurecimento de fruto de mamão papaia, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) transformar uma célula de planta de mamão papaia com o Construto de DNA como definido na reivindicação 6, e (ii) regenerar uma planta de mamão papaia da célula transformada sob condições eficazes para retardar o amadurecimento do fruto de mamão papaia.