BRPI0203172B1

BRPI0203172B1 - composição farmacêutica para acondroplasia

Info

Publication number: BRPI0203172B1
Application number: BRPI0203172A
Authority: BR
Inventors: Kazuwa Nakao
Original assignee: Kazuwa Nakao
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2002-08-13
Publication date: 2016-02-23
Also published as: US20030068313A1; CA2398030C; BRPI0203172B8; CA2398030A1; US6743425B2; US20040198665A1; BR0203172A; CA2918219A1

Abstract

"agentes terapêuticos para acondroplasia". a presente invenção visa fornecer novos agentes terapêuticos para acondroplasia causada por mutações em fgfr3. são divulgados agentes terapêuticos para acondroplasia causada pela inibição de crescimento da cartilagem resultante de mutações no gene para o receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (fgfr3), que compreende uma substância que ativa a guanilil ciclase b (gc-b) como um ingrediente ativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA ACONDROPLASIA".

Fundamentos da Invenção A presente invenção refere-se a agentes e a métodos para o tratamento da acondroplasia. A acondroplasia é uma das doenças congênitas mais comuns responsáveis pelo nanismo micromélico caracterizado pelos membros curtos em relação ao tronco. Esta é diagnosticada por fotografias de raios X além de insuficiência de crescimento nos eixos principais dos ossos longos das extremidades e por características físicas típicas, tais como um crânio grande que se projeta frontal mente e um nariz curto. Diz-se que a doença ocorre a uma incidência de uma a 10.000 - 25.000 pessoas. Esta doença é uma desordem hereditária autossômica dominante, porém descobriu-se que 80-90% dos casos são esporádicos. As terapias correntes incluem cirurgias ortopédicas, tais como reposição de junta artificial do quadril ou alongamento da perna e terapia com hormônio do crescimento. O alongamento da perna envolve o corte de ossos na idade de 10 anos ou depois e o aumento gradual da altura do corpo usando-se um dispositivo especial (dispositivo para alongamento da perna) durante diversos períodos de tempo de aproximadamente seis meses. No entanto, este procedimento inflige uma dor muito grande nos pacientes. A terapia com hormônio do crescimento aumenta a altura do corpo por meio de injeções periódicas de hormônio do crescimento a começar na infância. No entanto, o crescimento cessa quando as injeções são interrompidas. Nenhuma terapia é curativa e nenhuma é considerada ideal do ponto de vista do QOL dos pacientes (American Journal of Medicai Genetics 72: 71-76, 1997; European Journal of Endocrinology 138: 275-280, 1998. Consequentemente, deseja-se desenvolver uma terapia para a acondroplasia baseada em um novo mecanismo.

Relatórios recentes demonstram que os pacientes acondroplãsi-cos têm mutações no receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3) localizado no cromossomo 4p16.3 e são conhecidas corrente mente duas mutações. Destas mutações, 97% representam G1138A (mudança de 1138° G a A) e 2,5% representam G1138C (mudança de 1138° G a C), resultando em uma mudança do aminoácido Gly na posição 380 a Arg (G380R) (Nature 371: 252-254, 1994; Cell 78: 335-342, 1994). Para examinar a relação desta mutação com a acondroplasia, foram reproduzidos ca-mundongos transgênicos G380R FGFR3 (às vezes denominados aqui FGFR3ach) para fornecer um modelo animal para acondroplasia humana. Os camundongos apresentaram membros curtos e hipoplasia craniofacial (De-velopment. 125:4977-4988,1998).

Por outro lado, a família de peptídeo natriurético (NP) consiste em três peptídeos, ANP (peptídeo natriurético atrial), BNP (peptídeo natriurético cerebral) e CNP (peptídeo natriurético do tipo C) e acredita-se que esta apresente atividade biológica pelo aumento de cGMP intracelular através de dois receptores acoplados de guanilil ciclase (receptor GC-A para ANP e BNP e receptor GC-B para CNP) (Annu. Rev. Biochem. 60: 229-255, 1991). Foi relatado que os NPs representam importantes papéis na regula-gem de homeostase de fluido corpóreo e no controle da pressão sangüínea (J. Clin. Invest. 93: 1911-1921, 1987; J. Clin. Invest. 87: 1402-1412, 1994), porém, estes também são conhecidos por sua expressão e atividade fisiológica em vários tecidos sem ser no sistema cardiovascular (Endocrinology. 129: 1104-1106, 1991; Annu. Rev. Biochem. 60: 553-575, 1991). Entre estes, eles têm um papel como fator de crescimento dos ossos. Em culturas de órgão de tíbias provenientes de camundongos fetais, o CNP promove significativamente o crescimento longitudinal do osso (J. Biol. Chem. 273: 11695-11700, 1998). O CNP é mais potente do que o ANP e o BNP na produção de cGMP em culturas de órgão de tíbias provenientes de camundongos fetais, de condrócitos cultivados e de osteoblastos cultivados (J. Biol. Chem. 269: 10729-10733, 1994; Biochem. Biophys. Res. Commun. 223: 1-6. 1996; Biochem. Biophys. Res. Commun. 215: 1104-1110, 1995). O CNP e seu receptor GC-B são expressos nas placas de crescimento de ossos (J. Biol. Chem. 273: 11695-11700, 1998; Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95: 2337-2342, 1998). Foi descoberto também que o CNP representa um papel no espessamento da camada de cartilagem da placa de crescimento em camundongos trans- gênicos que expressam CNP especificamente em cartilagem (Yasoda e outros, Abstracts of the 72nd meeting of the Japan Endocrinology Society, 1999). A relação do CNP com nanismo também foi indicada porque camundongos nocauteados por CNP desenvolveram nanismo (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 98: 4016-4021,2001), porém nada foi descrito a respeito de sua relação com acondroplasia causada por mutações de FGFR3 e nenhuma prova positiva foi demonstrada de que o CNP fosse eficaz para acondroplasia causada por mutações de FGFR3. Ou seja, sabe-se que as mutações de FGFR3 estão relacionadas à acondroplasia e que o CNP está envolvido na condrogênese, porém não soube-se até agora a respeito da relação entre os mesmos, particularmente qual de FGFR3 e CNP está localizado a montante no percurso regulador de ossificação endocondral e se ou não o CNP tem um efeito terapêutico para acondroplasia.

Um objetivo da presente invenção é fornecer novos agentes e métodos para tratamento de acondroplasia causada por mutações em FGFR3.

Sumário da Invenção Na hipótese de que uma substância (por exemplo, CNP) que ativa a guanilil ciclase B (GC-B) possa ser aplicada a doenças que envolvam a condrogênese, procurou-se um modelo adequado de acondroplasia e adaptou-se este modelo animal com camundongos CNP-transgênicos para preparar camundongos transgênicos duplos para testar se os sintomas de acondroplasia podem ser corrigidos. Como descrito acima, foram reproduzidos camundongos transgênicos G380R FGFR3 (FGFR3ach) como um modelo animal para acondroplasia humana, que apresentavam membros curtos e hipoplasia craniofacial (Development. 125: 4977-4988, 1988). Desse modo, foram obtidos tais camundongos transgênicos FGFR3ach e cruzamento dos mesmos com os camundongos CNP-transgênicos para preparar camundongos transgênicos CNP/FGFR3ach duplos, que descobriu-se que servem de remédio para a inibição de crescimento do osso causada por FGFR3ach, sendo que conseguiu-se a presente invenção referente a agentes e a métodos para o tratamento de acondroplasia com CNP.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece agentes terapêuticos para acondroplasia causada pela inibição de crescimento da cartilagem resultante de mutações no gene para o receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3) que contém uma substância que ativa a guanilil ciclase B (GC-B) como um ingrediente ativo, assim como métodos para o tratamento de acondroplasia que compreende a administração de uma substância que ativa a guanilil ciclase B (GC-B).

Como usado neste caso, a expressão "acondroplasia causada pela inibição de crescimento da cartilagem resultante de mutações no gene para o receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3)" significa acondroplasia causada por hiperatividade ou por deficiência do controle da função de FGFR3 ou superexpressão do gene FGFR3 resultante das mutações no gene FGFR3 e acondroplasia é sinônimo de desordem de condro-gênese. Como usado neste caso, FGFR3ach significa fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3) que contém uma mutação do aminoácido Gly na posição 380 substituído a Arg (G380R), que se sabe, induz a hiperatividade de FGFR3 (Development. 125: 4977-4988, 1998).

Como usada neste caso, a expressão "substância que ativa a guanilil ciclase B" significa uma substância (peptídeo ou composto de baixo peso molecular) capaz de se ligar a GC-B conhecido como um receptor para CNP (peptídeo natriurético do tipo C) para ativar o mesmo, de preferência uma substância (peptídeo ou composto de baixo peso molecular) que tem atividade de CNP semelhante a (peptídeo natriurético do tipo C), tal como CNP de mamífero (CNP-22 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 863-870, 1990, WO 91 /16342), CNP-53 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 973-979, 1990, JPA 1992-74198, JPA 1992-139199), CNP de aves (JPA 1992-120094), CNP de anfíbios (JPA 1992-120095) e peptídeos análogos a CNP (JPA 1994-9688), de preferência CNP de mamíferos, mais preferivelmente CNP-22. A identificação da "substância que ativa a guanilil ciclase B" é realizada, por exemplo, por expressão de receptor de GC-B em células cultivadas, tais como COS-7 que incuba o meio com uma substância candi- data (peptídeo ou composto de baixo peso molecular) a uma dada temperatura durante um dado período (por exemplo, 37°C, 5 minutos) e, então, determinando-se a concentração de cGMP nos extratos da célula (Science 252: 120-123, 1991).

Breve Descrição dos Desenhos A FIGURA 1 apresenta a geração de camundongos transgênicos que superexpressam CNP especialmente em cartilagem. A: Representação esquemática que apresenta a estrutura de um gene recombinante para gerar camundongos CNP-transgênicos. B: Fotografia que apresenta os resultados de hibridização de Southern usando-se o DNA da cauda de camundongos CNP-transgênicos. C: Fotografia que apresenta os resultados de análise de RT-PCR da expressão de Col ll-CNP em vários órgãos provenientes de camundongos CNP-transgênicos. A FIGURA 2 apresenta a aparência de camundongos CNP-transgênicos. A: Fotografias que apresentam os esqueletos de um camundon-go não-transgênico (superior) e de um camundongo CNP-transgênico (inferior) na idade de 1 dia. B: Gráficos que apresentam as curvas de crescimento de camundongos CNP-transgênicos machos (à esquerda) e de fêmeas (à direita) inclusive de heterozigotos (círculos fechados) e homozigotos (quadrados fechados) comparados com companheiros de gaiola não-transgênicos (círculos abertos). C: O painel à esquerda apresenta fotografias em raios X fracos do crânio (superior) e das extremidades inferiores (inferior) de companheiras de gaiola não-transgênicas fêmeas de 6 meses de idade (à esquerda) e de camundongos CNP-transgênicos fêmeas (à direita) e o painel à direita apresenta UM gráfico que mostra a comparação do comprimento de alguns ossos de companheiras de gaiola não-transgênicas fêmeas (barra aberta) e de camundongos CNP-transgênicos fêmeas (barra fechada) medidas nas fotografias no painel à esquerda. A FIGURA 3 apresenta a análise histológica da placa de crescimento de camundongos CNP-transgênicos. A-D: Fotografias que apresentam corante aplicado azul de Alcian e hematoxilina / eosina (3 semanas de idade), A: placa de crescimento da tíbia de companheiros de gaiola não-transgênicos (x50), B: placa de crescimento da tíbia de camundongos CNP-transgênicos (x50), C: placa de crescimento da tíbia de companheiros de gaiola não-transgênicos (x200), D: placa de crescimento da tíbia de camundongos CNP-transgênicos (x200). E-H: Fotografias que apresentam a análise de hibridização in situ com sondas de cDNA de colágeno (2 semanas de idade), E: placa de crescimento da tíbia de companheiros de gaiola não-transgênicos (colágeno do tipo II, x200), F: placa de crescimento da tíbia de camundongos CNP-transgênicos (colágeno do tipo II, x200), G: placa de crescimento da tíbia de companheiros de gaiola não-transgênicos (colágeno do tipo X, x200), H: placa de crescimento da tíbia de camundongos CNP-transgênicos (colágeno do tipo X, x200). I-J: Fotografias que apresentam corante de von Kossa aplicado (3 semanas de idade), I: ossos trabeculares epifiseais de companheiros de gaiola não-transgênicos (x50), J: ossos trabeculares epifiseais de camundongos CNP-transgênicos (x50), X-L: Fotografias que apresentam corante BrdUrd aplicado (2 semanas de idade), K: placa de crescimento da tíbia de companheiros de gaiola não-transgênicos (x50), L: placa de crescimento da tíbia de camundongos CNP-transgênicos (x50). A FIGURA 4 apresenta cultura de órgão das tíbias de camundongos CNP-transgênicos. A: O painel à esquerda mostra fotografias que apresentam a aparência das tíbias de camundongos fetais 16.5-d após cultura 4-d de companheiros de gaiola não-transgênicos (esquerda superior), de camundongos CNP-transgênicos (direita superior), de companheiros de gaiola não-transgênicos no meio que contém HS-142-1 (50 mg/litro) (esquerda inferior) e de camundongos CNP-transgênicos no meio que contém HS-142-1 (50 mg/litro) (direita inferior). O painel à direita mostra um gráfico que apresenta o período de tempo do crescimento do comprimento das tíbias desde o início até o término da cultura 4-d. Círculos abertos: companheiros de gaiola não-transgênicos, n = 6; quadrados abertos: camundongos CNP-transgênicos, n = 6; círculos fechados; companheiros de gaiola não-transgênicos (HS-142-1), n = 6; quadrados fechados: camundongos CNP transgênicos (HS-142-1), n = 6. *P < 0,05 camundongos CNP-transgênicos versus seus companheiros de gaiola não-transgênicos, **P < 0,05 companheiros de gaiola tratados com HS-142-1 versus companheiros de gaiola não-transgênicos não-tratados, ***P < 0,01 camundongos CNP-transgênicos tratados com HS-142-1 versus camundongos CNP-transgênicos não-tratados. B: Gráfico que apresenta o teor de cGMP das tíbias cultivadas dos camundongos CNP-transgênicos fetais (n = 5). *P < 0,01 camundongos CNP-transgênicos versus seus companheiros de gaiola não-transgênicos. C: Gráfico que apresenta a incorporação de 35SC>4 nas tíbias cultivadas dos camundongos CNP-transgênicos fetais (n = 6). *P < 0,05 camundongos CNP-transgênicos versus seus companheiros de gaiola não-transgênicos. A FIGURA 5 mostra fotografias que apresentam análise histo-química das tíbias cultivadas de camundongos CNP-transgênicos (corante aplicado azul de Alcian e hematoxilina / eosina), A: companheiros de gaiola não-transgênicos (x25); B: camundongos CNP-transgênicos (x25); C: camundongos CNP-transgênicos (tratados com HS-142-1) (x25); D: companheiros de gaiola não-transgênicos (x200); E: camundongos CNP-transgênicos (x200); F: camundongos CNP-transgênicos (tratados com HS-142-1) (x200). A FIGURA 6 apresenta fenótipos brutos de camundongos CNP-transgênicos, FGFR3ach-transgênicos e CNP/ FGFR3ach-duplos transgênicos. A: Fotografia que apresenta a aparência bruta de companheiros de gaiola não-transgênicos de 3 meses de idade, camundongos CNP-transgênicos, camundongos FGFR3ach-transgênicos e camundongos CNP/ FGFR3ach-duplos transgênicos do topo para o fundo. B: Gráfico que apresenta as curvas de crescimento do comprimento naso-anal de camundongos FGFR3ach-transgênicos (triângulos fechados), de camundongos CNP/ FGFR3ach transgênicos fêmeas (quadrados abertos) e de companheiros de gaiola não-transgênicos (círculos fechados) (n = 7). C: Fotografias que apresentam a detecção da expressão de Col ll-CNP por RT-PCR que usa RNA total proveniente da cartilagem de companheiros de gaiola não-transgênicos (pista 1), camundongos CNP-transgênicos (pista 2) e camundongos FGFR3ach-transgênicos (pista 3). D: O painel da esquerda mostra fotografias que apresentam a aparência do esqueleto de companheiros de gaiola não-transgênicos de 3 meses de idade, de camundongos CNP-transgênicos, de camundongos FGFR3ach-transgênicos e de camundongos CNP/ FGFR3ach-duplos transgênicos do topo para o fundo. O painel à direita apresenta um gráfico que mostra a comparação do comprimento de vários ossos de companheiros de gaiola não-transgênicos (barra aberta), camundongos CNP-transgênicos (barra fechada), camundongos FGFR3ach-transgênicos (barra hachuriada) e camundongos CNP/ FGFR3ach-duplos transgênicos (barra sombreada) (n = 4). *P < 0,05. São apresentados os comprimentos do crânio (naso-ocipital), do crânio (largura), do úmero, do fêmur e da vértebra. A FIGURA 7 apresenta fotografias que mostram a análise histo-química da placa de crescimento das tíbias de camundongos de 2 semanas de idade (corante aplicado azul de Alcian e hematoxilina / eosina). A: companheiros de gaiola não-transgênicos (x50), B: camundongos FGFR3ach-transgênicos (x50); C: camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos (x50); D: companheiros de gaiola não-transgênicos (x100); E: camundongos FGFR3ach- transgênicos (x100); F: camundongos CNP/FGFR3ach gransgêni-cos (x100).

Descrição Detalhada da Invenção Os camundongos CNP-transgênicos preparados tiveram seu comprimento do corpo aumentado com supercrescimento longitudinal dos ossos por meio de ossificação endocondral. Análise adicional dos camundongos CNP-transgênicos por análise histoquímica da placa de crescimento apresentou 1) maior espessura da placa de crescimento juntamente com o alongamento tanto da camada proliferativa como da camada hipertrófica de condrócito, 2) matriz extracelular aumentada na camada proliferativa de condrócito e 3) tamanho aumentado dos condrócitos hipertróficos maduros. Estes fatos demonstram que o CNP promove a expressão do traço de diferenciação de condrócitos em cada estágio de diferenciação da placa de crescimento, em vez de contribuir para o compromisso à diferenciação ou à proliferação de condrócitos da placa de crescimento, juntamente com o fato de que não foi observada alteração apreciável na proliferação de condrócitos como dosado por aplicação de corante Brdllrd nas camadas hipertróficas de condrócito da placa de crescimento dos camundongos CNP-transgênicos. Isto é confirmado pelo fato de que a expressão de mRNA de colágeno do tipo X nos condrócitos hipertróficos na placa de crescimento dos camundongos CNP-transgênicos tinha uma intensidade comparável àquela de seus companheiros de gaiola não-transgênicos embora aumentasse a área de expressão da célula. No entanto, a largura do crânio, que é obtida por ossifi-cação membranosa, não foi mudada nos camundongos CNP-transgênicos. Isto sugere que o CNP não é expresso no crânio ou não está envolvido no processo de ossificação membranosa.

Experimentos de cultura de órgão ex vivo forneceram mais informação a respeito do mecanismo de ação de CNP na placa de crescimento. O alongamento dos primórdios cartilaginosos com a matriz extrace-lular aumentada e o tamanho aumentado dos condrócitos hipertróficos em tíbias cultivadas partindo de camundongos CNP-transgênicos foi potente, como obtido em tíbias cultivadas de seus companheiros de gaiola não-transgênicos na presença de CNP 10'7 M. Esta variação histológica foi completamente abolida por adição de um antagonista receptor de NF não-peptídeo HS-142-1 (Circ. Res. 78: 606-614, 1996), como o caso em que HS-142-1 foi adicionado a tíbias cultivadas provenientes de seus companheiros de gaiola não-transgênicos incubados com CNP 10'7 M. Estes resultados demonstram que o transgene Col ll-CNP (o gene que contém um fragmento cDNA de CNP de camundongo inserido em um segmento de DNA do pro-colágeno a1 tipo II de camundongo (Col 2al) região promotora como descrito no Exemplo 1) funciona bem para alterar o fenótipo in vivo na cartilagem da placa de crescimento, juntamente com o fato de que a produção do segundo mensageiro de CNP, cGMP, aumenta nas tíbias cultivadas provenientes de camundongos CNP-transgênicos. O aumento da síntese da matriz extrace-lular, como demonstrado pelo aumento de incorporação de 35S nas tíbias cultivadas provenientes de camundongos CNP-transgênicos, é compatível com o aumento da matriz extracelular na placa de crescimento de camundongos CNP-transgênicos. Isto pode explicar o mecanismo de alongamento da placa de crescimento em camundongos CNP-transgênicos. O alongamento do osso canceroso metafiseal observado em camundongos CNP-transgênicos indica que a substituição da cartilagem a osso calcificado foi processada uniformemente. Estes experimentos revelaram a importância de CNP em ossificação endocondral. A seguir, foram obtidos camundongos transgênicos G380R FGFR3 (FGFR3ach) (pelo Professor David M. Ornitz da Washington Univer-sity, US) e foram acasalados com camundongos CNP-transgênicos para preparar camundongos transgênicos CNP/FGFR3ach duplos. Em camundongos transgênicos CNP/FGFR3ach duplos, tanto o gene de CNP-Tg como o gene de FGFR3ach-Tg são expressos na camada de condrócito em repouso e na camada proliferativa de condrócito da placa de crescimento e os sintomas de nanismo de camundongos FGFR3ach-transgênicos foram visivelmente melhorados. O CNP endógeno, GC-B e FGFR3 foram expressos na camada proliferativa de condrócito e na camada hipertrófica de condrócito. O efeito da presente invenção é mais bem apresentado na FIGURA 6. A FIGURA 6 apresenta a aparência no todo de companheiros de gaiola não-transgênicos de 3 meses de idade, de camundongos CNP-transgênicos, de camundongos FGFR3ach-transgênicos e de camundongos transgênicos CNP/FGFR3ach duplos desde o topo até o fundo e a FIGURA 6D apresenta a aparência de seu esqueleto. O comprimento naso-anal de camundongos transgênicos CNP/FGFR3ach duplos é quase comparável ao de companheiros de gaiola não-transgênicos, demonstrando que o encurtamento do comprimento dos membros observado em camundongos FGFR3ach-transgênicos pode ser readquirido pela superexpressão de CNP. O fato de que CNP melhorou os sintomas de nanismo de camundongos FGFR3ach-transgênicos sugere que CNP não está, pelo menos, na maior parte, localizado a montante de FGFR3 no percurso regulador de ossificação endocondral. A placa de crescimento encurtada em camundongos FGFRS^-transgênicos foi alongada pela superexpressão de CNP tanto nas camadas proliferativa como hipertrófica de condrócito, porém, alguns aspectos histológicos eram diferentes daqueles dos companheiros de gaiola não-transgênicos. As matrizes extracelulares tanto das camadas proliferativa como hipertrófica de condrócito aumentaram de modo que o alinhamento dos condrócitos hipertróficos foi desordenado ou os condrócitos hipertróficos aumentados. Considerando-se que CNP superexpresso não afetou a formação retardada do centro de ossificação secundário em camundongos FGFR3ach-transgênicos, CNP não parece estar envolvido no compromisso à diferenciação de condrócitos como faz o FGFR3, mas ao contrário parece promover a expressão de gene de condrócitos em cada estágio de diferenciação. Isto é, o percurso em que CNP regula ossificação endocondral pode ser diferente daquele de FGFR3.

Além disso, o estudo in vitro da interação entre CNP e FGFR3 usando-se uma linhagem de condrócito de camundongo demonstrou que os sistemas CNP / GC-B e os sistemas FGF / FGFR3 básicos (FGF básico é um ligando para FGFR3) juntos influenciam a transmissão intracelular de informação em condrócitos.

Sem ficar preso à teoria específica descrita acima, foi confirmado pelos resultados descritos acima que o retardamento de crescimento de camundongos FGFR3ach-transgênicos é recuperado pela superexpressão de CNP embora CNP e FGFR3 tenham diferentes mecanismos reguladores de ossificação endocondral. Isto sugeriu que o CNP tem um efeito terapêutico como uma droga para promover o crescimento de ossos longos com a finalidade de tratar pacientes acondroplásicos, sendo que conseguiu-se a presente invenção. Uma principal causa conhecida de acondroplasia é a hipe-ratividade de FGFR3 que resulta das mutações no gene FGFR3, porém os sintomas acondroplásicos também podem ser provocados por falha de controle da função de FGFR3 e expressão melhorada do gene FGFR3. Uma nova terapia pode ser fornecida para estes sintomas acondroplásicos por ativação de GC-B ou por promoção da expressão de gene, expressão de proteína e função da proteína ou de seu ligando CNP. Para promover a expressão de gene de CNP, a expressão do gene de CNP endógeno pode ser melhorada ou a terapia de gene também pode ser aplicada por transferência do gene de CNP exógeno para o corpo vivo.

Os agentes terapêuticos para acondroplasia da presente invenção são preparados partindo de uma substância que ativa GC-B como um ingrediente ativo em combinação com um veículo ou com um excipiente e outros aditivos usados para formulação ordinária.

Os veículos e excipientes adequados para formulação incluem, por exemplo, lactose, estearato de magnésio, amido, talco, gelatina, ágar, pectina, acácia, óleo de oliva, óleo de gergelim, manteiga de cacau, etileno glicol e outros aditivos comuns.

As composições sólidas adequadas para administração oral incluem tabletes, pílulas, cápsulas, pós e grânulos. Em tais composições sólidas, pelo menos um ingrediente ativo é misturado com pelo menos um dilu-ente inerte, tal como lactose, manitol, glicose, hidroxipropilcelulose, celulose microcristalina, amido, polivinilpirrolidona ou aluminometassilicato de magnésio. As composições podem convencionalmente conter aditivos sem ser diluentes inertes, por exemplo, lubrificantes, tais como estearato de magnésio, agentes desintegradores, tais como carboximetil celulose de cálcio e solubilizadores, tais como ácido glutâmico ou ácido aspártico. Os tabletes ou as pílulas podem, se desejado, ser revestidos com um revestimento de açúcar ou com um filme gástrico ou entérico que compreende sacarose, gelatina, ftalato de hidroxipropil metil celulose ou similares ou podem ser revestidos com duas ou mais camadas. Também são incluídas cápsulas de um material que pode ser absorvido tal como gelatina.

As composições líquidas para administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis e podem conter diluentes inertes comuns, tais como água purificada e etanol. Além dos diluentes inertes, estas composições podem conter adju-vantes, tais como agentes de molhamento ou agentes de suspensão, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes aromáticos e conservantes.

As injeções para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não-aquosas estéreis. As soluções aquosas e as suspensões contêm água para injeção e soro fisiológico para injeção, por exemplo. As soluções e as suspensões não-aquosas contêm propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, álcoois, tais como etanol e POLYSORBATE 80 (marca comercial registrada). Estas composições podem ainda conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes de molha-mento, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, estabilizadores (por exemplo, lactose e solubilizadores (por exemplo ácido glutâmico e ácido as-pártico). Estes podem ser esterilizados por métodos comuns de esterilização, tais como esterilização mecânica com uma membrana para microfiltra-ção, esterilização pelo calor tal como autoclavagem ou inclusão de um bac-tericida. As injeções podem ser formulações em solução ou formulações secas por congelamento para serem reconstituídas antes do uso. Os excipi-entes adequados para secagem por congelamento incluem, por exemplo, açúcar álcoois e açúcares, tais como manitol ou glicose.

Quando os agentes terapêuticos da presente invenção são usados para terapia de gene, estes podem conter uma substância que ativa GC-B, tal como ácido nucléico relacionado a CNP integrado a jusante de uma seqüência promotora que é funcional em células hospedeiras tal como promotor de Citomegalovírus (promotor de CMV) em um vetor de vírus, de preferência um vetor de lentivírus, um vetor de vírus adeno-associado, mais preferivelmente um vetor de adenovírus ou em um veículo conhecido adequado para terapia de gene, tal como um lipossoma sintetizado quimica-mente, um envoltório de vírus ou um complexo de um envoltório de vírus e um lipossoma químico.

Os agentes terapêuticos para acondroplasia da presente invenção são, de preferência administrados por vias farmaceuticamente comuns, tais como via oral ou parenteral. Quando o ingrediente ativo for um anticorpo agonista de GC-B, estes são normalmente administrados por vias parente-rais tais como injeção (injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal) ou administração percutânea, mucosal, nasal ou pulmonar, mas também podem ser administrados oralmente. A quantidade da substância que ativa GC-B contida como um ingrediente ativo em formulações da presente invenção, pode ser determinada dependendo do tipo de doença a ser tratada, da gravidade da doença, da idade do paciente e de outros fatores, mas geralmente pode ser administrada na faixa de 0,005 pg/kg - 100 mg/kg, de preferência 0,025 pg/kg - 5 mg/kg.

Os agentes terapêuticos para acondroplasia da presente invenção podem ser usados em combinação com terapias convencionais, tais como hormônios do crescimento ou cirurgias ortopédicas, tais como reposição de junta artificial do quadril ou encompridamento da perna. A presente invenção inclui, mas não está limitada, aos seguintes aspectos: (1) Um agente terapêutico para acondroplasia causada pela inibição de crescimento de cartilagem resultante de mutações no gene para receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3), contendo uma substância que ativa a guanilil ciclase B (GC-B) como um ingrediente ativo. (2) O agente como definido em (1) acima em que a inibição de crescimento de cartilagem é auxiliada pelo aumento dos condrócitos hiper-tróficos e pelo aumento da matriz extracelular da camada proliferativa de condrócito. (3) O agente como definido em (1) ou em (2) acima em que a substância que ativa a GC-B é um peptídeo. (4) O agente como definido em (3) acima em que o peptídeo é um peptídeo natriurético do tipo C (CNP). (5) O agente como definido em (4) acima em que o CNP é CNP-22 ou CNP-53. (6) O agente como definido em (1) ou em (2) acima em que a substância que ativa a GC-B é um composto de baixo peso molecular. (7) O agente como definido em (1) ou em (2) acima em que o agente que contém a substância que ativa a GC-B como um ingrediente ativo promove a expressão de gene, a expressão de proteína ou a função de proteína da substância que ativa a GC-B. (8) O agente como definido em (1) ou em (2) acima em que o agente que contém a substância que ativa a GC-B como um ingrediente ativo promove a expressão de um gene para CNP, a expressão de proteína de CNP ou a função de uma proteína de CNP. (9) Um método para o tratamento de acondroplasia causada pela inibição de crescimento de cartilagem resultante de mutações no gene para receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3), que compreende administrar uma substância que ativa a guanilil ciclase B (GC-B). (10) O método como definido em (9) acima, que compreende auxiliar a inibição de crescimento de cartilagem pelo aumento dos condróci-tos hipertróficos e pelo aumento da matriz extracelular da camada proliferati-va de condrócito. (11) 0 processo como definido em (9) ou em (10) acima em que a substância que ativa a GC-B é um peptídeo. (12) O processo como definido em (11) acima em que o peptídeo é um peptídeo natriurético do tipo C (CNP). (13) O processo como definido em (12) acima em que o CNP é CNP-22 ou CNP-53. (14) O método como definido em (9) ou em (10) acima em que a substância que ativa a GC-B é um gene (por exemplo, DNA) que codifica um peptídeo. (15) O método como definido em (14) acima em que o peptídeo é um peptídeo natriurético do tipo C (CNP). (16) O método como definido em (15) acima em que o CNP é CNP-22 ou CNP-53. (17) O método como definido em qualquer um de (14) a (16) acima, que compreende transferir um gene que codifica um peptídeo diretamente ou em um vetor (por exemplo, vetor derivado de adenovírus) ou um lipossoma adequado para terapia de gene. (18) Um uso da substância como definido em qualquer um de (3) a (6) acima para a preparação de um agente terapêutico para acondroplasia causada pela inibição de crescimento de cartilagem resultante de mutações no gene para receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3).

Os exemplos a seguir ilustram melhor a presente invenção.

Exemplos Exemplo 1: Preparação de um gene recombinante para gerar camundongos CNP-transgênicos Como apresentado na FIGURA 1A, um fragmento CNP cDNA de camundongo que codifica os resíduos de aminoácido 1-127 (489 bp; FEBS Lett. 276: 209-213, 1990) foi inserido em um segmento de DNA do procola-gênio da região promotora de camundongo a1 tipo II (Col 2a1) (6,5 kb; Dev. Dyn. 204: 202-210, 1995). Este segmento de DNA da região promotora foi fornecido por B. de Crombrugghe, M.D. Anderson Câncer Center, Houston. Este segmento de DNA da região promotora que contém um promotor, éxon 1, íntron 1 e um sítio aceitante de junção artificial foi fundido ao fragmento CNP cDNA a jusante. O códon de iniciação no éxon 1 deste segmento de DNA da região promotora foi inativado por mutagênese em ponto. Um segmento de DNA (0,3 kb) que contém um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino foi adicionado a jusante do CNP cDNA. O fragmento de DNA Notl/Notl (7,3 kb) como apresentado na FIGURA 1A foi purificado para injeção em oócitos fertilizados e usado como uma solução de col-CNP DNA.

Exemplo 2: Geração de camundongos CNP-transgênicos Os camundongos usados para a coleta de ovos fertilizados a serem microinjetados com a solução de col-CNP DNA (aqui a seguir denominada solução de injeção de DNA) foram camundongos C57BL/6J endó-gamos adquiridos de CLEA Japan, Inc. (camundongos para coleta de ovos). As fêmeas a 8 semanas de idade ou mais velhas foram superovuladas e acasaladas com machos a 8 semanas de idade ou mais velhos para coletar muitos ovos fertilizados, que foram transferidos para meio M2 e cultivados em uma incubadora com dióxido de carbono a 5% a 37°C. Então, foram injetados 2 pL da solução de injeção de DNA no pró-núcleo do macho de cada um dos ditos ovos fertilizados por microinjeção usando-se uma pipeta de injeção de DNA. Os ovos fertilizados injetados com a solução de injeção de DNA foram transferidos para meio M16 e cultivados durante toda a noite em uma incubadora com dióxido de carbono a 5% a 37°C. Os camundongos fêmeas usados para gravidez, parto e amamentação da prole proveniente dos ovos fertilizados injetados com a solução de injeção de DNA (camun-dongos mães adotivas) e os camundongos machos acasalados com as fêmeas eram camundongos endógamos ICR adquiridos de CLEA Japan, Inc. Os camundongos machos vasoligados a 8 semanas de idade ou mais velhos foram acasalados com fêmeas a 8 semanas de idade ou mais velhas, entre as quais aquelas que apresentam um tampão vaginal foram usadas como mães adotivas. Os ovidutos da esquerda e da direita de cada mãe adotiva foram expostos por cirurgia usando-se um anestésico injetado intraperitone-amente a 0,01 ml/g de peso do corpo contendo Nembutal (Dainabot Co., Ltd., 50 mg/mL de pentobarbital de sódio) diluído até 12% em um diluente (uma solução mista de 20 mL de propileno glicol, 10 mL de etanol e 70 mL de água esterilizada). Entre os ovos fertilizados cultivados durante toda a noite, foram coletados aqueles que se desenvolveram em embriões de 2 células e 10-15 destes foram introduzidos em cada oviduto, após o que o sítio incisado foi suturado. As mães de criação foram cuidadas durante 3 semanas e se estas deram a luz, a cauda de cada filho foi dissecada em torno de 1 cm 5 semanas após o nascimento para isolar e purificar o DNA cromossômico usando-se Easy-DNA Kit (Invitrogen). Neste DNA da cauda foi feito o controle da presença do transgene por PCR. Os camundongos nos quais foi confirmada a presença do transgene foram criados como camundongos transgênicos criadores até a idade de 7 semanas e, então, naturalmente acasalados com C57BL/6J não-transgênicos a 7 semanas de idade ou mais velhos para fornecer progenitura transgênica. O experimento de microinjeção de gene forneceu 5278 ovos de um total de 336 camundongos C57BL/6J para coleta de ovos e a solução de injeção de DNA foi injetada em 2280 ovos identificados como ovos fertilizados entre estes. No dia seguinte, 1600 ovos (70%) se desenvolveram em embriões de 2 células, 1476 dos quais foram implantados nos ovidutos de um total de 60 mães adotivas. Trinta a sete mães adotivas engravidaram e deram a luz a um total de 108 filhos (7%). Uma dosagem para o transgene por PCR no DNA da cauda mostrou que foi obtido um total de 4 camundon- gos transgênicos de criação (4%) (2 machos, 2 fêmeas). Estes camundon-gos transgênicos de criação foram naturalmente acasalados com C57BL/6J não-transgênicos para fornecer prole em que o transgene foi transmitido em duas linhagens (macho Tg-1055, fêmea Tg-1077).

Exemplo 3: Análise genética de camundongos CNP-transgênicos 3-1 Verificação de transferência de gene em camundongos transgênicos por PCR O transgene foi verificado por hibridização de Southern usando-se o DNA da cauda isolado e purificado, o DNA da cauda foi digerido com uma enzima de restrição Saci e sujeito à hibridização de Southern com um fragmento CNP cDNA marcado com 32P (526 pb) para fornecer uma faixa de 2,1 kb para o transgene e uma faixa de 3,0 kb para o gene endógeno (FIGURA 1B). O número de cópia foi avaliado comparando-se a concentração da faixa de 2,1 kb com a concentração da faixa endógena de 3,0 kb e a linhagem Tg-1055 de machos, que se demonstrou conter 10 cópias, foi usada para análise posterior.

3-2 Análise de expressão do gene lskD77N por PCR A análise de expressão do transgene foi realizada pelo método Tempo Real-PCR. A cartilagem das vértebras inferiores e a cauda e outros órgãos foram rapidamente dissecadas de camundongos recém-nascidos não-transgênicos e transgênicos e estocados em nitrogênio líquido. Estes foram homogeneizados por um Physcotoron homogenizer (NITION Medicai Supply, Chiba, Japão) e então, o RNA total foi isolado e purificado com um reagente ISOGEN. Foi usado um kit de síntese de primeiro fio de Superscript (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) para sintetizar cDNA com iniciadores oligo-DT e foi, então, realizada PCR usando-se o iniciador para adiante (em éxon 1) e o iniciador reverso (em cDNA) como apresentado na FIGURA 1 A. A reação de PCR envolveu 45 ciclos de uma reação em três etapas que consiste em 95°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto. Após a reação PCR, uma alíquota de 10 pL foi dosada por eletrofo-rese em gel de agarose a 1 %. A faixa positiva de 450-pb foi detectada apenas na cartilagem, mas não no cérebro, no coração, no pulmão, no fígado, nos rins, no intestino e no músculo. A faixa positiva de 450-pb não foi detectada na cartilagem e em outros órgãos de seus companheiros de gaiola não-transgênicos.

Exemplo 4: Determinação da curva de crescimento de camundongos CNP-transgênicos. A distância entre o nariz e o ânus (aqui a seguir denominada comprimento naso-anal) foi medida toda semana para se traçar uma curva de crescimento dos camundongos. No estágio perinatal, os camundongos CNP-transgênicos e os seus companheiros de gaiola não-transgênicos não eram distinguidos uns dos outros. A 1 dia após o nascimento, a aplicação de corante vermelho de Alzarin S e azul de Alcian de ossos e da cartilagem revelou supercresci mento longitudinal tanto dos ossos como da cartilagem em camundongos CNP-transgênicos, inclusive ossos longos de membros, vértebras e crânios (FIGURA 2A). Não foi observado atraso na ossificação na periferia dos membros neste estágio. Os centros de ossificação das falanges já tinham aparecido em camundongos CNP-transgênicos assim como em seus companheiros de gaiola não-transgênicos. Enquanto estes cresciam, os camundongos CNP-transgênicos apresentavam gradualmente um aumento proeminente no comprimento naso-anal (FIGURA 2B). Os camundongos CNP-transgênicos fêmeas de 10 semanas de idade eram 19% mais longos do que seus companheiros de gaiola não-transgênicos fêmeas (n = 7). Os camundongos CNP-transgênicos machos eram mais longos do que seus companheiros de gaiola não-transgênicos machos (n = 7), porém, até certo ponto menores do que os camundongos fêmeas (10%). Os camundongos CNP-transgênicos machos homozigotos eram mais longos do que os camundongos CNP-transgênicos machos heterozigotos (fêmea 6%, macho 4%, (n = 7). Análise em raios X fracos apresentaram um aumento significativo em camundongos CNP-transgênicos de 6 meses de idade comparados com seus companheiros de gaiola não-transgênicos no comprimento dos membros, vértebras e eixo longitudinal do crânio, todos formados por ossificação endocondral, embora a largura do crânio não aumentasse (FIGURA 2C). O aumento foi especialmente proeminente nas vértebras e nos ossos longos próximos (úmero e fêmur), que eram mais longos por 28%, 25% e 23% (n = 6) do que aqueles de seus companheiros de gaiola não-transgênicos, respectivamente.

Exemplo 5: Análise histológica de camundongos CNP-transgênicos Para microscopia com luz, as tíbias e as vértebras foram removidas e fixadas em formalina a 10% / PBS (pH 7,4). Os ossos calcificados foram desmineralizados em formalina a 10% / PBS (pH 7,4) contendo 20% de EDTA. Foram preparados blocos de parafina por procedimentos histoló-gicos padronizados. Foram preparadas seções (5-6 pm) a diversos níveis e coradas com azul de Alcian (pH 2,5) e então, contracoradas com hematoxili-na / eosina. O comprimento das camadas da placa de crescimento, o diâmetro dos condrócitos hipertróficos maturados e o índice de marcação de BrdUrd na camada proliferativa de condrócito foram analisados em um computador Macintosh usando-se um programa NIH Image. Para corar em BrdUrd, camundongos de 2 semanas de idade foram injetados intraperitone-amente com BrdUrd (100 pg/g de peso do corpo) e mortos após 1 hora. A aplicação de corante imunohistoquímico de BrdUrd incorporado em células na placa de crescimento das tíbias foi realizada por métodos padronizados. Para avaliar o estágio mineralizado de cada amostra, foi feita aplicação de corante de Von Kossa em seções não-descalcificadas.

Para análise de hibridização in situ, foram preparadas ribosson-das sentido e antissentido marcadas com digoxigenina partindo de um fragmento de cDNA de colágeno pro-a1(X) de rato e de um fragmento de cDNA de colágeno pro-a1 (II) de camundongo usando-se um kit de marcação de RNA digoxigenina (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). Não foi encontrada mudança histológica típica na cartilagem epi-fiseal em camundongos CNP-transgênicos no estágio pré-natal, porém quando estes crescem, a altura da placa de crescimento dos ossos longos das vértebras dos camundongos CNP-transgênicos aumentam significativamente pelo menos na idade de 3 semanas ou depois disso (FIGURA 3A, B). Entre as camadas de cartilagem da placa de crescimento das tíbias de camundongos de 3 semanas de idade, tanto a camada hipertrófica de condró- cito (234 ± 12 pm versus 207 ± 14 pm, n = 4, p < 0,05) como a camada pro-liferativa de condrócito (215 ± 3 pm versus 193 ±16 pm, n = 4, p < 0,05) de camundongos CNP-transgênicos eram mais longas do que aquelas dos companheiros de gaiola não-transgênicos. Foi demonstrado que a camada hipertrófica de condrócito e a camada proliferativa de condrócito expressam colágeno do tipo X ou colágeno do tipo II por análise de hibridização in situ (FIGURA 3 E-H). Um aumento maior revelou um aumento do tamanho de condrócitos (24,3 ± 1,2 pm versus 21,2 + 1,3 pm, n = 6, p < 0,05) (FIGURA 3 C, D). O comprimento da camada de condrócito em repouso não foi variado até mesmo em camundongos CNP-transgênicos. A faixa de condrócitos positivos a BrdUrd foi ampliada em camundongos CNP-transgênicos em relação a seus companheiros de gaiola não-transgênicos, embora o número de condrócitos positivos a BrdUrd fosse comparável (13,3 ± 3% versus 12,5 ± 9%, n = 4) (FIGURA 3 K, L). A placa de crescimento corada por Von Kossa das tíbias de camundongos com 3 semanas de idade revelou que os ossos trabeculares epifiseais formados pela camada hipertrófica de condrócito adjacente eram obviamente mais longos e o volume dos ossos trabeculares era maior nos camundongos CNP-transgênicos do que em seus camundongos CNP-transgênicos (FIGURA 3 I, J).

Exemplo 6: Efeitos da expressão cartilagem-específica de CNP sobre tíbias embriônicas cultivadas provenientes de camundongos CNP-transgênicos.

As tíbias dos fetos de camundongos CNP-transgênicos ou de seus companheiros de gaiola não-transgênicos foram dissecadas sobre 16,5-d pós-coito e cultivadas durante 4 dias em suspensão em um meio artificial. Para inibir o efeito do CNP endógeno, a cultura da tíbia foi realizada com um antagonista receptor NP não-peptídeo, HS-142-1 (Komatsu e outros, Circ Res. 78: 606-614. 1996) a uma concentração de 50 mg/litros no meio. No final do período de cultura, as tíbias cultivadas foram medidas para seu comprimento longitudinal e fixas e incrustadas para análise histológica. As seções de 5 pm de espessura foram cortadas do corpo de prova incrustado e coradas com azul de Alcian (pH 2,5) e contra-coradas com hematoxi-lina / eosina. O teor de cGMP das tíbias cultivadas foi medido por RIA no final do período de cultura de 4-d. A síntese de glicosaminoglican das tíbias cultivadas foi avaliado por medida da incorporação de 35S04 (Mericq e outros, Pediatr Res 47: 189-193, 2000). A saber, as tíbias cultivadas dos ca-mundongos CNP-transgênicos e de seus companheiros de gaiola não-transgênicos foram marcadas com 5 pCi/ml de Na235SC>4 (Amersham, atividade específica 100 mCi/mmol) durante 1 hora. As tíbias cultivadas foram então enxaguadas três vezes durante 10 minutos com solução salina de Pack (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e então digeridas em 1,5 ml de meio novo contendo 0,3% de papaína durante 24 horas a 60°C. Então, a cultura foi incubada com 0,5 ml de cloreto de cetil piridínio 10% (Sigma Chemical Co.) - NaCI 0,2 M a temperatura ambiente por 18 horas para precipitar o glicosaminoglican. O precipitado foi lavado três vezes com 1 ml de cloreto de cetil piridínio 0,1% (Sigma Chemical Co.) - NaCI 0,2 M e então dissolvida em 1 ml de ácido fórmico 23 N, após o qual o teor de 35S04 foi determinado por um contador de cintilação de líquido.

Até mesmo antes da incubação, os explantes de tíbias provenientes de camundongos CNP-transgênicos eram significativamente mais longos do que aqueles de seus companheiros de gaiola não-transgênicos (FIGURA 4A). Durante a incubação, os explantes de tíbias provenientes de camundongos CNP-transgênicos aumentaram proeminentemente em comprimento longitudinal e eram aproximadamente 35% mais longos do que aqueles provenientes de companheiros de gaiola não-transgênicos no final da cultura de 4 dias (n = 6, FIGURA 4a). O aumento do primórdio cartilaginoso era proeminente (aumento de 40%) entre todas as partes do explante de tíbia. HS-142-1 que sabe-se que inibe o efeito do CNP endógeno em cartilagem podia inibir o crescimento espontâneo dos explantes de tíbias provenientes de companheiros de gaiola não-transgênicos (FIGURA 4A). Além disso, o aumento no comprimento dos explantes de tíbias provenientes de camundongos CNP-transgênicos foi completamente abolido por HS-142-1 (50 mg/l) até a extensão do comprimento das tíbias provenientes de companheiros de gaiola não-transgênicos tratados com HS-142-1 (FIGURA 4A). O teor de cGMP nas tíbias cultivadas provenientes de camundongos CNP- transgênicos era aproximadamente 9 vezes mais alto do que aquele nas tíbias provenientes de companheiros de gaiola não-transgênicos (18,7 ±1,2 fmol/mg de proteína versus 2,1 ± 0,2 fmol/mg de proteína, n = 5, FIGURA 4B). A síntese de glicosaminoglican foi aumentada aproximadamente 25% em tíbias provenientes de camundongos CNP-transgênicos comparadas com aquelas provenientes de companheiros de gaiola não-transgênicos (2300 ± 170 cpm / tíbia versus 1840 ± 140 cpm / tíbia, n = 6, FIGURA 4C). Histologicamente, a cartilagem epifiseal dos explantes de tíbia provenientes de camundongos CNP-transgênicos aumentou na altura tanto da camada proliferativa de condrócito (369 ± 26 pm versus 287 ± 14 pm, n = 4, p < 0,05) como da camada hipertrófica de condrócito (450 ± 29 pm versus 294 ±16 pm, n = 4, p < 0,05), com o espaço extracelular aumentado corado por azul de Alcian como matriz cartilaginosa na camada proliferativa de condrócito (FIGURA 5A, B). Além disso, houve aumento da camada hipertrófica de condrócito (17,8 ± 0,8 pm versus 15,4 ± 1,4 pm, n = 6, p < 0,05, FIGURA 5D). A alteração induzida por HS-142-1 na mesma dose na cartilagem epifiseal das tíbias cultivadas provenientes de camundongos CNP-transgênicos também desapareceu.

Exemplo 7: Análise de camundongos transgênicos CNP/FGFR3ach duplos Camundongos CNP-transgênicos fêmeas e camundongos FGFR3ach-transgênicos machos foram acasalados (obtidos pelo Professor David M. Ornitz da Washington University, US). Como os camundongos FGFR3ach-transgênicos foram originalmente produzidos no fundo FVB/N, foram usados apenas os camundongos transgênicos F1 duplos em contraste com seus companheiros de gaiola CNP, FGFR3ach e não-transgênicos.

Na idade de 3 meses, os camundongos CNP-transgênicos eram mais compridos do que seus companheiros de gaiola não-transgênicos e os camundongos FGFR3ach-transgênicos eram menores do que seus companheiros de gaiola não-transgênicos correspondentes (FIGURA 6A). O comprimento naso-anal dos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos era quase comparável ao dos companheiros de gaiola não-transgênicos. O nível de expressão de CNP na cartilagem dos camundongos CNP/ FGFR3ach- transgênicos foi comparável com o nível de expressão nos camundongos CNP-transgênicos (FIGURA 6C). A curva de crescimento do comprimento naso-anal dos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos, dos camundongos FGFR3ach-transgênicos e de seus companheiros de gaiola não-transgênicos demonstrou que o retardamento de crescimento nos camundongos FGFR3ach-transgênicos foi resgatado pela superexpressão de CNP na cartilagem da placa de crescimento. Na idade de 10 semanas, o comprimento naso-anal dos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos era 94,7 ± 4,0 mm, que era 8% mais longo do que aquele dos camundongos FGFR3ach-transgênicos (87,7 ± 2,6 mm) e comparável ao de seus companheiros de gaiola não-transgênicos (97,0 ± 4,2 mm) (FIGURA 6B). A análise em raios X fracos revelou que o encurtamento do comprimento dos ossos observados nos camundongos FGFR3ach-transgênicos, inclusive o comprimento naso-occipital do crânio e o comprimento longitudinal do úmero, do fêmur e das vértebras (L1-7), também foi parcialmente recuperado nos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos. A largura do crânio não foi afetada nem nos camundongos FGFRS^-transgênicos nem nos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos (FIGURA 6D). A análise em microscópio da cartilagem da placa de crescimento das tíbias próximas provenientes de camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos de 2 semanas de idade, dos camundongos FGFR3ach-transgênicos e de seus companheiros de gaiola não-transgênicos, demonstrou que a altura da camada hipertrófica de condrócito de camundongos FGFR3ach-transgênicos diminuiu comparada com a de companheiros de gaiola não-transgênicos (169 ± 15 pm versus 220 ±15 pm). Esta foi recuperada nos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos (229 ± 21 pm, FIGURA 7A-C). No entanto, o alinhamento desordenado da coluna de condrócitos hipertróficos e da matriz extracelular aumentada nas camadas de condrócito prehipertrófico e hipertrófico superior foi observado em camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos em contraste com os camundongos FGFR3ach-transgênicos e seus companheiros de gaiola não-transgênicos (FIGURA 7D-F). O tamanho de cada condrócito hipertrófico nos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos era significativamente maior do que aquele dos camundongos FGFR3ach-transgênicos e de seus companheiros de gaiola não-transgênicos (20,1 ± 1,5 pm, 18,4 ± 1,2 pm, 19,0 ± 0,2 pm, n = 6, p < 0,05, FIGURA 7D-F). Nas tíbias próximas de camundongos de 10 semanas de idade, o centro secundário de ossificação não foi formado ainda nos camundongos FGFR3ach-transgênicos e nos camundongos CNP/ FGFR3ach-transgênicos, ao passo que estava bem organizado em seus companheiros de gaiola não-transgênicos (FIGURA 7A-C).

Exemplo 8: Estudo da interação entre CNP e FGFR3 usando-se uma linhagem de condrócito de camundongo Células da linhagem ATDC de condrócito de camundongo (J. Bone. Miner. Res., 12, 1174-1188, 1997; fornecidas pelo Professor Assistente Shukunami e pelo Professor Hiraki do Institute for Frontier Medicai Sciences, Universidade de Kyoto) foram pré-tratadas com 1-1 ng/ml de FGF básico (SIGMA), um ligando para FGFR3. Então, estas células foram estimuladas com CNP 10'9-10'7 M e dosadas para a produção de cGMP intracelular pelo método RIA (Kit de Dosagem de GMP cíclico disponível pela YAMASA CORPORATION). A fosforilação de p44 e p42 MAP quinases (ERK1/2) e a expressão de MAP quinase (MEK) e p44 MAP quinase (ERK1) após estimulação com FGF básico também foram dosadas por Western blo-tting usando-se anticorpos MAP-K fosforilados e anticorpos MAP-K (ambos disponíveis pela Cell Signaling Technology; MAP: proteína ativada por mito-gênio).

Os resultados demonstraram que a produção intracelular de cGMP após estimulação com CNP após o pré-tratamento com 1 ng/ml de FGF básico durante 1 hora diminuiu até 70% de controle. A fosforilação de ERK1/2 com FGF básico por pré-tratamento durante 1 hora foi inibida significativamente por CNP 10'7.

Isto revelou que os sistemas CNP/GC-B e FGF/FGFR3 básico influenciam juntos a transmissão intracelular de informação em condrócitos. Vantagens da Invenção Os agentes terapêuticos para acondroplasia fornecidos pela presente invenção, podem tratar a acondroplasia agindo como um gene para CNP, uma proteína de CNP ou um composto de baixo peso molecular que ativa GC-B em um sítio sem ser dirigido por hormônios do crescimento. Os agentes terapêuticos para acondroplasia da presente invenção podem oferecer uma excelente terapia com QOL melhorado de pacientes por alívio da carga e das dores nos pacientes quando comparada com cirurgias ortopédicas convencionais, tais como reposição artificial da junta do quadril ou en-compridamento das pernas. Além disso, os animais transgênicos aqui divulgados podem ser usados para testar a sua eficiência contra acondroplasia causada por mutações sem ser G380R em FGFR3.

Claims

1. Composição farmacêutica para acondroplasia causada pela inibição de crescimento da cartilagem resultante de mutações no gene para o receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3), caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo natriurético do tipo C (CNP) como um ingrediente ativo em combinação com pelo menos um veículo farmaceu-ticamente aceitável, em que o CNP é CNP-22 ou CNP-53 de mamíferos.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a inibição de crescimento da cartilagem é auxiliada pelo aumento de condrócitos hipertróficos e pelo aumento da matriz extracelular da camada proliferativa de condrócito.