BR112021015544A2

BR112021015544A2 - Derivados de 1-((2-(2,2,2-trifluoroetoxi)piridin-4-il)metil)ureia como potencializadores de kcnq

Info

Publication number: BR112021015544A2
Application number: BR112021015544-9A
Authority: BR
Inventors: Helen Jane Szekeres; Maria Ann Whatton; Andrew Caerwyn Williams
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2019-02-06
Filing date: 2020-02-04
Publication date: 2021-10-26
Also published as: SA521422733B1; JP2024063191A; AU2020218180A1; FI3921030T3; WO2020163268A1; JP7451543B2; RS65040B1; US11840516B2; US20200247752A1; MX2021009396A; PL3921030T3; DK3921030T3; ES2968807T3; US11208383B2; JP2022519744A; HUE064734T2; LT3921030T; EP3921030B1; SG11202108599SA; KR20210126040A

Abstract

derivados de 1-((2-(2,2,2-trifluoroetoxi)piridin-4- il)metil)ureia como potencializadores de kcnq. potencializadores de pequenas moléculas para canais de potássio (tais como potencializadores de kv7 - que também são chamados de potencializadores de kcnq), composições incluindo tais compostos e métodos de uso de tais compostos para o tratamento de esclerose lateral amiotrófica e outras doenças neurológicas causadas por alterações na excitabilidade do neurônio motor, incluindo, mas não se limitando a, esclerose lateral primária, paralisia pseudobulbar, paralisia bulbar progressiva, atrofia muscular progressiva e epilepsia.

Description

DERIVADOS DE 1-((2-(2,2,2-TRIFLUOROETOXI)PIRIDIN-4- IL)METIL)UREIA COMO POTENCIALIZADORES DE KCNQ

[001]A presente invenção está no campo da medicina. Particularmente, a presente invenção se refere a compostos, métodos e composições farmacêuticas para o tratamento de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) e outras doenças neurológicas causadas por alterações na excitabilidade do neurônio motor, incluindo, mas não se limitando a, esclerose lateral primária, paralisia pseudobulbar, paralisia bulbar progressiva, atrofia muscular progressiva e epilepsia.

[002]ELA (às vezes chamada de “Doença de Lou Gehrig”) é uma doença neurológica fatal que afeta aproximadamente 1,5- 3 em 100.000 pessoas por ano. É caracterizada por perda progressiva de neurônios motores, geralmente levando à morte em 2-3 anos a partir do diagnóstico. Embora a pesquisa continue, a maioria dos casos de ELA parecem ser esporádicos sem uma causa conhecida.

[003]Os pacientes com ELA tipicamente apresentam aumento da excitabilidade dos neurônios motores periféricos e centrais, levando a fasciculações, cãibras musculares e espasticidade. Pensa-se que o aumento da excitabilidade neuronal leva à sobrecarga de cálcio e morte celular. De fato, a excitabilidade do neurônio motor foi negativamente correlacionada com a sobrevivência em pacientes com ELA (Ver K. Kanai et. al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 83, 734- 738 (2012)).

[004]Estudos investigaram o mecanismo e a causa do motivo pelo qual os neurônios motores em pacientes com ELA alteraram a excitabilidade (em comparação com pacientes sem ELA). (Ver K. Kanai et. Aal., Brain, 129, 953-962 (2006)). Os resultados do estudo sugerem redução da atividade do canal de potássio nos neurônios como um dos principais contribuintes para a hiperexcitabilidade associada à doença (ver id.). Adicionalmente, os neurônios motores derivados de células tronco pluripotentes de pacientes com ELA também exibiram hiperexcitabilidade. (Ver B.J. Wainger et. Al., Cell Rep., 7, 1-11 (2014)). Esses neurônios derivados de células-tronco exibiram correntes para potássio com retificação retardada reduzidas e, de fato, quando os agentes retigabina e flupirtina (que são conhecidos potencializadores do canal de potássio Kv7) foram adicionados a esses neurônios derivados de células-tronco, a hiperexcitabilidade dos neurônios motores foi normalizada e a sobrevivência in vitro das células aumentou (ver id.). Em outro estudo, o potencializador retigabina de Kv7 reduziu os sintomas de excitotoxicidade e aumentou a sobrevivência em um modelo in vitro de ELA usando neurônios motores hipoglossais de rato (Ver F. Ghezzi et. al., J. Physiol., 596, 2611-2629 (2018)).

[005]Atualmente, o único medicamento aprovado para tratar ELA é o riluzol, que demonstrou aumentar a sobrevida em 2 a 3 meses. Há claramente uma necessidade de tratamentos mais eficazes, melhores e mais duradouros.

[006]O conhecido potencializador de retigabina de Kv7 atua nos canais de potássio Kv7.2-7.5 (KCNQ2-KCNQ5). Foi aprovado como terapia adjuvante em pacientes com epilepsia resistente a fármacos. Foi aprovado na Europa e nos Estados Unidos em 2011, mas retirado voluntariamente em 2017. Acreditava-se que a retirada da retigabina do uso clínico se baseava em uma série de questões de tolerabilidade, levando ao uso muito limitado do fármaco. Os problemas de tolerância incluem a ocorrência comum e presumivelmente baseada no mecanismo de sonolência e tontura e incidências menos comuns de retenção urinária e alterações de pigmentação na retina e na pele. As alterações retinianas e o potencial de perda de visão resultaram em uma caixa de advertência no rótulo da retigabina, e não se acredita que sejam baseados em mecanismos. A retenção urinária é provavelmente o resultado da potencialização dos canais Kv7.3/7.5 da bexiga. No entanto, devido aos seus efeitos colaterais, novos potencializadores de Kv7 precisam ser desenvolvidos.

[007]Um estudo recente, comparando os efeitos do riluzol (por exemplo, o tratamento aprovado para ELA) e retigabina na excitabilidade do neurônio motor em pacientes com ELA, sugere que os potencializadores dos canais Kv7 podem ter eficácia superior a riluzol (ver M. Kovalchuk et. al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 104, 1136-1145 (2018)). Assim, potencializadores melhorados, que têm melhor tolerabilidade do que a retigabina, seriam benéficos para o tratamento clínico de ELA e outros transtornos relacionados à hiperexcitabilidade. (Ver B. Kalappa, et al., The Journal of Neuroscience, 35(23):8829-8842) (2015). Até o momento, nenhum agente que atue no Kv7 foi aprovado para o tratamento de ELA e, portanto, permanece a necessidade de agentes que atuem no Kv7, tais como potencializadores alternativos do Kv7 que fornecem um benefício terapêutico. Adicionalmente, pode ser benéfico ter esses potencializadores mais seletivos para Kv7.2/7.3 em relação a outros canais Kv7. Há também a necessidade de um novo agente de Kv7 que evite efeitos colaterais indesejáveis e que possa fornecer uma combinação de propriedades farmacológicas melhoradas, incluindo segurança, potência, eficácia e tolerabilidade, em particular para o tratamento de excitabilidade de neurônios motores periféricos e centrais.

[008]As presentes modalidades fornecem compostos que são potencializadores do canal de potássio (tais como potencializadores de Kv7 - também chamados de potencializadores KCNQ) que são úteis no tratamento de ELA e outras doenças neurológicas causadas por alterações na excitabilidade do neurônio motor.

[009]Especificamente, os compostos da seguinte fórmula (que é designada como “FÓRMULA I”) podem ser usados como potencializadores de Kv7: em que R1 é (FÓRMULA I) em que, na FÓRMULA I, R2 é H ou OH. Além dos compostos para a FÓRMULA I, um ou mais de sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser feitos a partir dos compostos da FÓRMULA I, e tais sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser feitos e usados como potencializadores de Kv7.

[0010]Em algumas modalidades, os compostos da FÓRMULA I, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, são feitos de modo que R1 seja e R2 seja H.

[0011]Em outras modalidades, os compostos de FÓRMULA I (ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos) são feitos de modo que R1 seja e R2 seja OH. Além disso, em tais modalidades, quando R2 é OH, o carbono ao qual o grupo OH está ligado é um estereocentro. Por conseguinte, em algumas modalidades, os compostos (ou sais farmaceuticamente aceitáveis) de FÓRMULA I pode ser a mistura racêmica dos dois enantiômeros. Em outras modalidades, um enantiômero particular pode ser usado, incluindo qualquer um dos seguintes enantiômeros:

[0012]Os habilitados na técnica apreciarão como construir modalidades que usam apenas um dos enantiômeros anteriores. Outras modalidades podem ser projetadas com misturas dos diferentes enantiômeros com diferentes percentagens para cada componente.

[0013]Em outras modalidades, os compostos da FÓRMULA I (ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos) são feitos de modo que R1 seja e R2 seja H.

[0014]Em modalidades adicionais, ainda, os compostos de FÓRMULA I (ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos) são feitos de modo que R1 seja e R2 seja OH. Além disso, em tais modalidades, quando R2 é OH, o carbono ao qual o grupo OH está ligado é um estereocentro. Por conseguinte, em algumas modalidades, os compostos (ou sais farmaceuticamente aceitáveis) de FÓRMULA I podem ser a mistura racêmica dos dois enantiômeros. Em outras modalidades, um enantiômero particular pode ser usado, incluindo qualquer um dos seguintes enantiômeros:

[0015]Os habilitados na técnica apreciarão como construir modalidades que usam apenas um dos enantiômeros anteriores. Outras modalidades podem ser projetadas com misturas dos diferentes enantiômeros tendo diferentes percentagens para cada componente.

[0016]As presentes modalidades fornecem adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo um composto ou sal farmaceuticamente aceitável da FÓRMULA I e um ou mais de carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Essas composições farmacêuticas podem fornecer um método de tratamento de uma doença. Especificamente, as presentes modalidades fornecem um método para o tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor, compreendendo a administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um composto de FÓRMULA I (ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo). Em algumas modalidades particularmente preferidas, a doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor é ELA.

[0017]Outras modalidades fornecem um método de tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor, compreendendo a administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um composto de FÓRMULA I (ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo). Em algumas modalidades particularmente preferidas, a doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor é ELA.

[0018]As presentes modalidades também fornecem os compostos de FÓRMULA I (ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos) para uso em terapia. Mais particularmente, as presentes modalidades fornecem um composto de FÓRMULA I (ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo) para uso no tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor. Em algumas modalidades, tal doença pode ser ELA.

[0019]Além disso, as presentes modalidades fornecem o uso de um composto de FÓRMULA I (ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos) na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor. Em algumas dessas modalidades, a doença é ELA.

[0020]Como usado nesse documento, o termo “doença associada a alterações na excitabilidade do neurônio motor” ou uma “doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor” inclui uma doença selecionada do grupo que consiste em ELA, esclerose lateral primária, paralisia pseudobulbar, paralisia bulbar progressiva, epilepsia e atrofia muscular progressiva. Esses termos também incluem todas as doenças listadas em A. Verma, et al., “Atypical Motor Neuron Disease and Related Motor Syndromes”, Seminars in Neurology, Volume 21, Número 2, 2001. Esses termos também incluem distúrbios de PNFI (hiperexcitabilidade do nervo periférico). Informações sobre distúrbios de PNFI podem ser encontradas em C. Küçükali et al., “Peripheral nerve hyperexcitability syndromes” Rev Neurosci. 2015; 26(2):239-

51. Consequentemente, os compostos e sais farmaceuticamente aceitáveis nesse documento podem ser usados para tratar uma ou mais dessas doenças.

[0021]Como usado indistintamente nesse documento, o termo “paciente”, “indivíduo” e “ser” refere-se a um humano, mais particularmente, um paciente em necessidade do mesmo. Em certas modalidades, o paciente é adicionalmente caracterizado com uma doença, um distúrbio ou uma condição (por exemplo, ELA ou outra doença) que se beneficiaria de uma potencialização de Kv7. Em outra modalidade, o paciente é adicionalmente caracterizado como em risco de desenvolver uma condição descrita acima, ou condição que se beneficiaria da potencialização de Kv7.

[0022]Uma quantidade eficaz pode ser determinada por um habilitado na técnica, utilizando técnicas conhecidas e observando os resultados obtidos em circunstâncias análogas. Na determinação da quantidade eficaz para um paciente, vários fatores são considerados, incluindo, mas não se limitando a: seu tamanho, sua idade e sua saúde geral; a doença ou o distúrbio específica(o) envolvida(o); o grau de envolvimento ou a gravidade da doença ou do distúrbio; a resposta de cada paciente; o composto particular administrado; o modo de administração; as características de biodisponibilidade da preparação administrada; o regime de dosagem selecionado; o uso de medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes. Uma quantidade eficaz, em algumas modalidades, fornece uma redução clinicamente significativa na excitabilidade dos neurônios motores periféricos e centrais.

[0023]Os compostos da presente invenção são formulados como composições farmacêuticas administradas por qualquer via que torna o composto biodisponível. De preferência, tais composições são para administração oral. Tais composições farmacêuticas e processos para a preparação das mesmas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, Editora, 22a Edição, Pharmaceutical Press, 2012).

[0024]Os compostos de FÓRMULA I e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são particularmente úteis nos métodos de tratamento da invenção, sendo preferidas certas configurações. A seguinte lista de compostos da presente invenção descreve tais configurações. Será entendido que essas preferências são aplicáveis tanto aos métodos de tratamento como aos compostos da invenção.

[0025]Os compostos das presentes modalidades (em que R2 é OH) incluem:

Nesses compostos em que R2 é OH, os compostos com a “ligação plana” acima são racêmicos e/ou têm ambos os enantiômeros presentes (em uma mistura 50/50 ou em alguma outra razão). Os compostos com a ligação em cunha e tracejada acima representam o enantiômero particular. Os compostos com a ligação “ondulada” indicam que é um único enantiômero presente, mas a configuração exata deste único enantiômero é desconhecida e, portanto, tais enantiômeros são distinguidos por sua rotação óptica (por exemplo, se eles giram a luz na direção (+) ou (-).)

[0026]Os compostos das presentes modalidades também incluem as seguintes moléculas (em que R2 é H):

[0027]Os compostos acima que têm um grupo OH como R2 podem ser aqueles que têm o OH na configuração “para cima” (como indicado pela projeção em cunha). Outras modalidades podem ser projetadas nas quais o grupo OH está na configuração “para baixo”. Os habilitados na técnica apreciarão como fazer esse outro enantiômero, por exemplo, usando materiais de partida diferentes e/ou usando reações diferentes etc. Tais enantiômeros têm a seguinte estrutura e são parte das modalidades atualmente reivindicadas:

[0028]Embora a presente invenção contemple todos os enantiômeros e diastereômeros individuais, bem como misturas dos enantiômeros dos referidos compostos, incluindo racematos, os compostos citados acima e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são particularmente preferidos.

[0029]Os enantiômeros individuais podem ser separados ou resolvidos por um habilitado na técnica em qualquer ponto conveniente na síntese de compostos da invenção, por métodos tais como técnicas de cristalização seletiva, cromatografia quiral (ver, por exemplo, J. Jacques, et al., “Enantiomers, Racemates, and Resolutions”, John Wiley e Filhos, Inc., 1981, e E.L. Eliel e S.H. Wilen, “Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-lnterscience, 1994), ou cromatografia com fluido supercrítico (SFC) (Ver, por exemplo, T. A. Berger; “Supercritical Fluid Chromatography Primer,” Agilent Technologies, julho de 2015).

[0030]Um sal farmaceuticamente aceitável dos compostos da invenção pode ser formado, por exemplo, por reação de uma base livre apropriada de um composto da invenção e um ácido farmaceuticamente aceitável apropriado em um solvente adequado sob condições padrão bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. “Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities”, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); e Berge, S.M., et al., “Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977).

[0031]Os compostos da presente invenção, ou sais dos mesmos, podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos por um habilitado comum na técnica, alguns dos quais são ilustrados nos esquemas, nas preparações e nos exemplos abaixo. Os produtos de cada etapa nos esquemas abaixo podem ser recuperados por métodos convencionais bem conhecidos na técnica, incluindo extração, evaporação, precipitação, cromatografia, filtração, trituração e cristalização. Nos esquemas abaixo, todos os substituintes, salvo indicação em contrário, são como definidos anteriormente. Os reagentes e materiais de partida estão facilmente disponíveis para um habilitado na técnica. Sem limitar o escopo da invenção, o(a)s seguintes esquemas, preparações e exemplos são fornecidos para ilustrar ainda mais os aspectos da invenção. Além disso, um habilitado comum na técnica reconhece que os compostos de FÓRMULA I podem ser preparados usando material de partida ou intermediário com a configuração estereoquímica desejada correspondente que pode ser preparado por um habilitado na técnica.

[0032]Algumas abreviações podem ser usadas abaixo. Essas abreviaturas significam o seguinte: “ACN” refere-se a acetonitrila; “Ac” refere-se a acetila; “AcOH” refere- se a ácido acético; “AC2O” refere-se a anidrido acético; “AP5” refere-se a (2R)-amino-5-fosfonopentanoato; “BDNF” refere-se ao fator neurotrófico derivado do cérebro; “BOC” refere-se a terc-butoxicarbonil; “CAS#” refere-se ao número de registro do Chemical Abstracts; “CMAP” refere- se ao potencial de ação muscular do composto; “DCM” refere-se a cloreto de metileno ou diclorometano; “DIPEA” refere-se a N,N-di-isopropiletilamina; “DMEA” refere-se a dimetiletilamina; “DMF” refere-se a N,N-dimetilformamida;

“DMSO” refere-se a dimetilssulfóxido; “D-PBS” refere-se a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco; “EDTA” refere-se a ácido etilenodiaminotetra-acético; “EGTA” refere-se a ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetiléter)- N,N,N’,N’-tetra-acético; “ES/MS” refere-se a Espectrometria de Massa com Eletropulverização; “Et2O” refere-se a éter dietílico; “EtOAc” refere-se a acetato de etila; "EtOH” refere-se a etanol ou álcool etílico; “h” refere-se a hora ou horas; “HEPES” refere-se a ácido 4- (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico; “IPA” refere-se a isopropanol ou álcool isopropílico; “IPAm” refere-se a isopropil amina; “iPrOAc” refere-se a acetato de isopropila; “LC/MSMS” refere-se a cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem; “LiHMDS” refere-se a bis(trimetilsilil)amida de lítio; “KOiBu” refere-se a potássio-terc-butóxido; “Me” refere-se a metil; “ms” refere-se a milissegundo ou milissegundos como uma unidade de tempo; “MTBE” refere-se a éter metil-terc-butílico; “min” refere-se a minuto ou minutos; “NaOtBu” refere-se a terc-butóxido de sódio; “N-BuLi” refere-se a n-butil- lítio; “NBQX” refere-se a (2,3-di-hidroxi-6-nitro-7- sulfamoil-benzo[f]quinoxalina; “OAc” refere-se a acetato ou acetoxi; “PBS” refere-se a solução salina tamponada com fosfato; “TA” refere-se à temperatura ambiente; “SCX” refere-se a forte troca catiônica; “SD” refere-se ao desvio padrão; “s” refere-se a segundo ou segundos como uma unidade de tempo; “SEM” refere-se a Erro Padrão da Média; “SFC” refere-se a Cromatografia com Fluido Supercrítico; “TEA” refere-se a trietilamina; “TFA” refere-se ao ácido trifluoroacético; “THF” refere-se a tetra-hidrofurano; “TMA” refere-se a trimetilamina; “TMEDA” refere-se a tetrametiletilenodiamina; “Tris” refere-se a tris(hidroximetil)aminometano ou 2-amino-2- (hidroximetil)propano-1,3-diol; “[α]D20” refere-se a rotação óptica específica a 20 °C e 589 nm, em que c é a concentração em g/mL (que geralmente é g/100mL). Esquemas Gerais Esquema 1

[0033]O Esquema 1 ilustra a preparação de compostos de FÓRMULA I, em que R 1 é definido como descrito acima. A formação de éster ativado de uma amina apropriadamente substituída (ou seu sal correspondente, por exemplo, HCl) está bem documentada na técnica, usando, por exemplo, carbonildiimidazol e N- vs. O-carbonilação de (2-etoxi-4- piridil)metanamina seletiva (ou sua forma de sal correspondente, por exemplo, HCl) com o referido intermediário ativado com uma base orgânica adequada pode produzir as ureias desejadas da presente invenção (Etapa 1). O técnico habilitado reconhecerá que os compostos de FÓRMULA I contendo estereoquímica podem ser preparados por meio de uma amina substituída quiralmente para obter um único enantiômero, ou por resolução quiral do composto de FÓRMULA I, usando qualquer técnica de cromatografia quiral, tal como SFC, ou pelo uso de um auxiliar quiral, tal como uma preparação de sal quiral, como é bem conhecido na técnica.

Esquema 2

[0034]O Esquema 2 representa a preparação de cloridrato de rac-2-amino-1-[1-(trifluorometil)-ciclopropil]etanol. A preparação de amida do tipo Weinreb (Etapa 2) a partir de ácido (trifluorometil)ciclopropanocarboxílico pode ser realizada sob uma variedade de condições bem descritas na técnica. Um processo de duas etapas para preparar nitro-1- [1-(trifluorometil)ciclopropil]etanol via redução da amida do tipo Weinreb com agentes redutores padrão (Etapa 3a), usando, por exemplo, hidreto de alumínio e lítio em um solvente orgânico adequado, tais como THF ou Et2O, seguido pelo isolamento do aldeído e pela adição do ânion de nitrometano, gerado na presença de uma base forte, tal como NaH ou KOtBu, ao aldeído correspondente (Etapa 3b), pode resultar no desejado 2-nitro-1-[1-(trifluorometil)]etanol racêmico. A redução subsequente do grupo nitro (Etapa 4) para a amina correspondente pode ser realizada sob uma variedade de condições bem descritas na técnica e a amina resultante pode ser convertida em uma forma de sal apropriada, por exemplo, HCl, para facilidade de uso. O técnico habilitado na técnica reconhecerá que a mistura racêmica da amina pode ser resolvida em seus dois enantiômeros quirais usando técnicas padrão bem conhecidas na técnica, tal como cromatografia quiral ou preparação usando um auxiliar de sal quiral. Esquema 3

[0035]O Esquema 3 representa a preparação do (2S)-1- amino-3,3-dimetil-butan-2-ol requerido ou seu sal correspondente. A resolução cinética de 2-terc-butiloxirano (Etapa 5) usando um catalisador de metal de transição quiral, tal como Co+2 que foi ativado para Co+3, pode ser alcançada com base na literatura relatada em JACS 9 VOL. 124, NO. 7, 2002, 1307. A estereoquímica resultante pode ser atribuída dependendo da estereoquímica do catalisador quiral. Portanto, (2S)-2-terc-butiloxirano pode ser preparado usando S,S-(salen)Co+3OAc (ver JACS 9 VOL. 124, NO. 7, 2002, 1307). Adicionalmente, a verificação da estereoquímica S pode ser realizada por comparação com os dados relatados em Tetrahedron: Asymmetry 13 (2002) 1209-1217. A abertura do anel de epóxido estereocontrolado pode ser alcançada usando um nucleófilo de nitrogênio, tal como NH3 em MeOH, sob condições bem conhecidas do técnico habilitado (Etapa 6). O aminoálcool resultante pode ser convertido em uma forma de sal adequada sob condições bem conhecidas na técnica. Preparação 1 N-metoxi-N-metil-1-(trifluorometil)ciclopropanocarboxamida

[0036]Resfriar uma mistura de ácido 1- (trifluorometil)ciclopropanocarboxílico comercialmente disponível [CAS# 277756-46-4] (4,8 g, 31,4 mmol) e/V, cloridrato de N,O-dimetilhidroxilamina (4,65 g, 46,7 mmol) em EtOAc (50 mL) a 0°C e adicionar uma solução de solução de 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosforano-2,4,6- trióxido (50% em massa em DMF, 28 mL, 47,5 mmol) gota-a-gota através de um funil de adição. Agitar a mistura reacional em temperatura ambiente por 20 h. Resfriar a mistura reacional a 0°C e inativar vertendo-a em solução aquosa saturada de NH4Cl. Separar as fases resultantes e extrair a camada aquosa com EtOAc. Combinar os extratos orgânicos, secar em MgSO4, filtrar e evaporar até a secura para resultar no composto do título (4,4 g, rendimento de 67%). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ

3.74 (s, 3H), 3.29 (s, 3H), 1.33-1.25 (m, 4H). ES/MS: m/z 19 [M+H]. Preparação 2 (±)-2-nitro-1-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etanol

[0037]Adicionar uma solução 1 M de hidreto de alumínio e lítio em THF (20 ml, 20 mmol) a uma solução a 0°C de N- metoxi-N-metil-1-(trifluorometil)ciclopropanocarboxamida (4,3 g, 20,9 mmol) em Et2O (50 mL) gota-a-gota e agitar a mistura resultante por 1 h. Extinguir a reação por adição gota-a-gota de água (0,81 mL), depois NaOH aquoso 2 M (0,81 mL) e, em seguida, água adicional (2,43 mL). Adicionar MgSO4 (5g) e filtrar a mistura resultante através de uma almofada de terra de diatomáceas com vácuo mínimo para resultar, o que se acredita ser, em uma solução de 1- (trifluorometil)ciclopropanocarbaldeído em Et2O. Adicionar essa solução gota-a-gota a uma solução de nitrometano em agitação rápida (60 mL, 1,1 mol) e KOtBu (360 mg, 3,17 mmol) a 0°C. Após ~1 h, aquecer a reação em TA e agitar durante a noite. Decantar o solvente da goma castanha para o frasco e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante em sílica gel, eluindo com 0-10% de MeOH/DCM, para resultar no composto do título como um óleo incolor (2,9 g, 67% de rendimento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 0.97-

0.91 (m, 1 H), 1.13-0.99 (m, 3H), 2.66 (d, J=5.1 Hz, 1 H),

4.41-4.36 (ddd, J=9.8, 5.1, 2.4 Hz, 1 H), 4.59-4.53 (dd, J=9.8, 13.8 Hz, 1 H), 4.68 (dd, J=2.4, 13.8 Hz, 1 H). Preparação 3 Cloridrato de (±)-2-amino-1-[1-(trifluorometil) ciclopropil]etanol

[0038]Adicionar uma solução 1 M de hidreto de alumínio e lítio em THF (37 ml, 37 mmol) a uma solução a 0°C de (±)- 2-nitro-1-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etanol (2,9 g, 14,8 mmol) em Et2O (30 mL) gota-a-gota e agitar a mistura reacional resultante em TA durante a noite. Resfriar a mistura a 0°C e adicionar solução 1 M adicional de hidreto de alumínio e lítio em THF (15 mL, 15 mmol) gota-a-gota. Aquecer a mistura reacional em TA e agitar por 4h. Inativar a mistura reacional a 0°C por adição gota-a-gota de água (1,96 mL), depois NaOH aquoso 2 M (1,96 mL) e, em seguida, água (5,88 mL). Adicionar MgSO4 (5 g), agitar a mistura resultante por 10 min e filtrar através de um leito de terra de diatomáceas. Tratar o filtrado com HCl 4 M em dioxano (20 mL, 80 mmol) e concentrar sob pressão reduzida. Colocar em suspensão o resíduo resultante em Et2O (50 mL) com agitação rápida. Isolar o sólido branco resultante por filtração para resultar no composto do título (1,52 g, 47% de rendimento). ES/MS: m/z = 170 [M+H]. Procedimento alternativo para preparação 3

[0039]A um frasco de PARR adicionar óxido de platina (IV) (242 mg, 1,07 mmol), uma solução de (+)-2-nitro-1-[1- (trifluorometil) ciclopropil]etanol (2,42 g, 11,5 mmol) em EtOH (24 mL) e ácido acético (4,96 mL). Colocar o frasco sob uma atmosfera de hidrogênio a 55 psi (379,21 kPa) e agitar por 5h em TA. Filtrar a reação através de um leito de terras diatomáceas e concentrar sob pressão reduzida. Colocar em suspensão o resíduo em 1,4-dioxano (17,2 mL) e adicionar HCl 4N em 1,4-dioxano (10 mL, 40 mmol) gota-a-gota e agitar por 2h. Filtrar a mistura e lavar a torta com 1,4-dioxano e secar sob vácuo por 15 minutos. Secar o sólido resultante em um forno a vácuo a 45°C por 3 h para obter o composto do título (2,21 g, rendimento de 80%). Preparação 4 (que obtém o Exemplo 2) (±)-1-[2-hidroxi-2-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etil]-3- [[2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]ureia

[0040]Resfriar uma suspensão de cloridrato de [2- (2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metanamina [CAS# 2044704-69-8] (200 mg, 0,8 mmol) em DCM (4 mL) a 0° C, adicionar DIPEA (580 µ l, 3,3 mmol) e 1,1’-carbonildi- imidazol (149 mg, 0,9 mmol). Agitar a reação resultante vigorosamente a 0 °C por 15 min e adicionar cloridrato de (±)-2-amino-1-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etanol (232 mg, 1,01 mmol). Agitar a mistura resultante em TA durante a noite. Inativar pela adição de água, diluir com DCM e passar por uma frita hidrofóbica. Evaporar as camadas orgânicas e purificar o resíduo resultante em sílica gel, eluindo com 0-15% de MeOH/DCM, para resultar no composto do título (198 mg, 57% de rendimento). ES/MS: m/z = 402 [M+H]. Procedimento Alternativo para Preparação 4

[0041]Agitar dicloridrato de [2-(2,2,2- trifluoroetoxi)-4-piridil]metanamina (500 mg, 1,79 mmol) e DIPEA (1,26 mL, 7,16 mmol) em DCM (10 mL) para resultar em uma solução. Adicionar 1,1’-carbonildiimidazol (31 1 mg, 1,88 mmol) e agitar 30 minutos. Adicionar cloridrato de (±)-2-amino-1-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etanol (465 mg, 2,15 mmol) e agitar a reação em TA por 48 h. Adicionar água, separar a fase orgânica e secar em sulfato de sódio. Filtrar e evaporar os compostos orgânicos e purificar o resíduo resultante em sílica gel, eluindo 0-15% de MeOH/DCM, para resultar no composto do título (680 mg, 90% de rendimento).

[0042]A porção quiral dessa molécula pode ser sintetizada usando resolução cinética e química de abertura de anel.

Preparação 5 Cloridrato de (2S)-1-amino-3,3-dimetil-butan-2-ol

[0043]Obter (2S)-2-terc-butiloxirano comercialmente (CAS# 40102-55-4) ou por meio de uma resolução cinética, como relatado em J. AM. CHEM. SOC. 9 VOL. 124, NO. 7, 2002 1307, em que é relatado que o epóxido configurado em R é obtido a partir do catalisador RR, portanto, o epóxido S é obtido a partir do catalisador SS: Aquecer uma mistura de (2S)-2-terc-butiloxirano (107 g, 1,01 mols) e NH4OH (1,3 L, 10,7 mols) em EtOH (427 mL) em um recipiente selado a 100°C por 4 h. Resfriar e concentrar sob pressão reduzida. Dissolver o resíduo resultante em DCM (100 mL) a 0°C e adicionar uma solução de HCl 4 M em dioxano (267 mL, 1,1 mols) lentamente ao longo de 10 min enquanto um precipitado branco se forma. Filtrar o sólido resultante, lavar com DCM frio e secar por sucção a vácuo para obter o composto do título (103 g; rendimento de 62,9%). RMN 1H (300,1 MHz, MeOD): δ 0.94 (s, 9H), 2.76 (dd, J=11.1, 12.6 Hz, 1 H), 3.09 (dd, J=2.5, 12.6 Hz, 1 H), 3.41 (dd, J= 2.5,

11.1 Hz, 1 H). [α]D20 = +32.38° (c = 0,8 g/100 mL, EtOH). Literatura relatada em Tetrahedron: Assimetria 13 (2002) 1209-1217 [α]D20 = +25.9° (c = 0,47 g/100 mL, EtOH).

Procedimento Alternativo para a Preparação 5

[0044]Preparar duas bombas de seringa ISCO 2-1000 ml rotuladas A e B: Encher a Bomba A com uma solução 7 M de NH3 em MeOH. Encher a Bomba B com uma solução de (2S)-2-terc-butiloxirano (25 g, 232 mmol) dissolvido em uma solução 7 M de NH3 em MeOH (995 mL). Conectar as bombas a um reator de tubo de aço inoxidável de 500 mL (OD=1/8”) em um forno, em seguida, conectar à saída, um reator de tubo de aço inoxidável de 7 mL (DO = 1/16”) localizado fora do forno para atuar como um trocador de calor, e conectar um regulador de contrapressão EQUILIBAR ajustado para 1200 psi (8273,71 kPa) após o trocador de calor.

[0045]Usar a bomba A, encher o reator tubular com solução 7 M de NH3 em MeOH a 5 mL/min. Definir a temperatura do forno em 200°C. Uma vez que os reatores de tubo estão cheios, mudar para a bomba B a 10 mL/min por 100 min e, em seguida, mudar para a bomba A para fornecer solução 7 M de NH3 em MeOH na mesma vazão por 1 h adicional.

[0046]Concentrar a solução coletada sob pressão reduzida em temperatura ambiente para obter (2S)-1-amino-3,3-dimetil- butan-2-ol bruto (24,4 g). Dissolver o material bruto em éter terc-butil metílico (150 mL) e adicionar uma solução 5,5 M de HCl em IPA (46,4 mL, 255 mmol) gota-a-gota durante 5 min com agitação vigorosa. Filtrar o sólido branco resultante, lavar com MTBE (4 x 25 mL) e secar para obter o composto do título (23 g, 72% de rendimento). Preparação 6 Dicloridrato de [2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4- piridil]metanamina

[0047]Agitar 2-(2,2,2-trifluoroetoxi)piridina-4- carbonitrila [CAS# 618446-30-3] 82,5 g, 367 mmol) em EtOH (500 ml), decantar a solução do sólido não dissolvido e lavar o sólido com EtOH (3 x 50 mL) decantando a solução de cada vez.

Combinar as soluções de EtOH, diluir com EtOH adicional (150 mL) e adicionar uma solução aquosa de HCl conc. (125 mL). Adicionar uma pasta fluida de paládio a 10% em carbono (3,7 g) em cerca de 10 mL de EtOH.

Agitar a mistura reacional resultante sob uma atmosfera de H2 a 60 psi (413,69 kPa) em TA durante a noite.

Filtrar a mistura através de uma almofada de terra de diatomáceas, lavando com EtOH, e concentrar o filtrado sob pressão reduzida para deixar um sólido branco.

Colocar em suspensão o sólido resultante em MTBE a 45°C por 30 min, resfriar a mistura até a temperatura ambiente e filtrar para resultar em um sólido.

Dissolver o sólido em água (400 mL) e extrair duas vezes com MTBE (400 e depois 200 mL). Concentrar a fase aquosa sob pressão reduzida para obter um sólido de cor creme que é transformado em pasta fluida em THF (100 mL) e filtrado.

A torta de filtro é lavada com THF (2 x 30 ml) e seca sob sucção a vácuo para obter o composto do título (46,16 g, 44% de rendimento). O filtrado é adicionalmente concentrado sob pressão reduzida e seco em um forno a vácuo durante a noite.

O sólido resultante é transformado em pasta fluida em THF (50 mL) por 30 min e filtrado para obter uma colheita adicional do composto do título (34 g, rendimento de 32,5%). ES/MS: m/z 307 [M+H]. A análise do íon cloreto (IC) mostrou a razão molar 2:1 do íon cloreto:Precursor. Exemplo 1 1-[(2S)-2-hidroxi-3,3-dimetil-butil]-3-[[2-(2,2,2- trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]ureia

[0048]Agitar cloridrato de [2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4- piridil]metanamina (8,06 g, 33,2 mmol) em DCM (50 mL) e adicionar DIPEA (29 mL, 166 mmol). Agitar a mistura resultante por 5 min e adicionar 1,1’-carbonildiimidazol (5,7 g, 33,2 mmol). Agitar a mistura por 10 min e adicionar cloridrato de (2S)-1-amino-3,3-dimetil-butan-2-ol (5 g, 32,5 mmol) e agitar a mistura reacional resultante durante o fim de semana. Lavar a mistura reacional com água, separar a fase orgânica e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna flash em sílica gel, eluindo com MeOH a 0 a 10% em DCM, para obter o composto do título (8,16 g, 72% de rendimento) após evaporação do solvente.

[0049]Combinar o material com outro lote do composto do título (4,37 g) preparado como descrito acima e recristalizar a partir de iPrOAc (45 ml) para obter 11,29 g do composto do título. ES/MS: m/z 350 [M+H] [α]D20 = +29.845° (c = 0,2 g/100 mL, MeOH). Exemplo 2 (+)-1-[2-hidroxi-2-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etil]-3-

[[2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]ureia e (-)1-[2- hidroxi-2-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etil]-3-[[2- (2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]ureia via Resolução Quiral

[0050]Submeter (±)-1-[2-hidroxi-2-[1- (trifluorometil)ciclopropil]etil]-3-[[2-(2,2,2- trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]ureia (680 mg) à purificação quiral com SFC usando uma coluna CHIRALPAK AD-H (250 x 30 mm, 5 µ) a 35°C, 100 bar (10 MPa), eluindo 92:8 de CO2/etanol com N,N-dimetiletilamina a 0,2% @ 152 mL/min e detectando a 220 nm, evaporar as frações e secar em um forno a vácuo de 45°C para obter: Enantiômero 1 (1º pico de eluição, 285,4 mg): (-)-1-[2- hidroxi-2-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etil]-3-[[2- (2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]ureia; [α]D20 = - 21,0° (c = 0,20 g/100 mL, MeOH); Enantiômero 2 (2º pico de eluição, 289,5 mg). Submeter o enantiômero 2 à purificação de SFC uma segunda vez usando o método descrito acima; evaporar as frações e secar em um forno a vácuo a 45°C para obter (+)-1-[2-hidroxi-2-[1- (trifluorometil)ciclopropil]etil]-3-[[2-(2,2,2- trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]ureia (236 mg); [α]D20 = +15,0° (c = 0,20 g/100 ml, MeOH).

Exemplo 3 1-[[2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]-3-[2-[1- (trifluorometil)ciclopropil]etil]ureia

[0051]Em um frasco de fundo redondo, agitar cloridrato de 2-[1 -(trifluorometil)ciclopropil]etanamina (500 mg, 2,6 mmol; ver WO 2013/134252, mas também disponível comercialmente [CAS#: 1454690-80-2]) em DCM (5 mL) e adicionar DIPEA (1,4 mL, 8 mmol). Quando resultar uma solução límpida, adicionar 1,1’-carbonildiimidazol (428 mg, 2,6 mmol) e agitar a mistura resultante em TA por 30 min. Adicionar dicloridrato de [2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4- piridil]metanamina (810 mg, 2,9 mmol) em uma única porção e agitar em temperatura ambiente por 30 min. Aquecer a reação a 40°C por 3 h e agitar em temperatura ambiente por 16 h. Transferir a reação para um frasco de micro- ondas e aquecer a 100°C por 30 min. Purificar a mistura resultante por cromatografia por gel de sílica, eluindo com MeOH a 0-10% em DCM, para resultar no composto do título (892 mg, rendimento de 88%). ES/MS: m/z 386 [M+H]. Procedimento Alternativo para o Exemplo 3

[0052]A um recipiente de reação de micro-ondas adicionar cloridrato de 2-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etanamina comercialmente disponível (758 mg, 0,4 mmol, CAS# 561297-93- 6), DCM (2 mL), DIPEA (698 µl, 0,4 mmol) e 1,1’- carbonildiimidazol (649 mg, 0,4 mmol). Agitar em temperatura ambiente por 5 h. Adicionar uma solução preparada 0,5 M de [2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metanamina comercialmente disponível (CAS# 1454690-80-2; alternativamente, ver WO 2013/134252) em DCM (0,8 mL, 0,4 mmol) em TA. Aquecer a mistura resultante em micro-ondas a 100°C por 30 min. Decantar a mistura reacional em um balão de fundo redondo maior e diluir com água (5 mL) e DCM (5 mL). Agitar por 15 min em TA e passar por uma frita hidrofóbica para separar a fase orgânica. Concentrar o filtrado sob pressão reduzida e purificar o resíduo resultante por cromatografia em fase reversa de alto pH, usando uma coluna PHENOMENEX® GEMINI®-NX C18 75 x 30 mm, tamanho de partícula de 5µ, 110A, coluna AXIA com protetor de GEMINI®-NX C18 15 x 30 mm, eluindo com 23-57% de ACN em NH4HCO3 10 mM (pH ~ 10) contendo MeOH a 5% como a fase aquosa, para obter 1-[[2-(2,2,2-trifluoroetoxi)-4-piridil]metil]-3- [2-[1-(trifluorometil)ciclopropil]etil]ureia (90,6 mg, 59% de rendimento). ES/MS: m/z 386 [M+H]. Ensaios

[0053]Os dados de ensaio biológico que mostram que os compostos das presentes modalidades são ativos na potencialização de Kv7 são fornecidos abaixo. Ensaio# 1 Ensaio de excitabilidade Optopatch para o Exemplo 1 em neurônios motores derivados de linhas iPSC de pacientes com

ELA

[0054]A excitabilidade alterada dos neurônios corticais e do neurônio motor inferior é um fator importante na fisiopatologia de ELA (ver, por exemplo, K. Kanai, et. al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 83, 734-738 (2012); P. Menon, et. al., Eur J Neurol., 24, 816-824 (2017)). Eletrofisiologia totalmente óptica (“Optopatch”) foi usada para avaliar a excitabilidade em neurônios motores cultivados derivados de linhas iPSC de dois pacientes com ELA com diferentes mutações patogênicas.

[0055]Cultura de células: As duas linhas iPSC são derivadas de um paciente com uma mutação patogênica em TARDBP e um paciente com uma mutação de expansão de repetição patogênica em C9orf72, respectivamente. Os neurônios motores são gerados a partir dessas linhas por um método de diferenciação 2D adaptado do protocolo de padrão neuronal de inibição dual SMAD (Ver S.M. Chambers, et. al., Nat Biotechnol., 27, 275-280 (2009)) por inclusão de morfógenos de neurônio motor. A diferenciação é verificada por inspeção visual, cariótipo e coloração para beta-III-tubulina e o marcador de neurônio motor nuclear ISL1. Os neurônios são cultivados em uma monocamada de glia de camundongo em mTeSR (Stem Cell Technologies), suplementado com 10 ng/ml de BDNF. Quarenta e oito horas antes da geração de imagem, trans- retinal 100 nM foi adicionado ao meio.

[0056]Transdução com vetores Optopatch: Aos 15 dias in vitro, neurônios motores cultivados são transduzidos com um vetor lentiviral para conduzir a coexpressão do atuador CheRiff-mOrange2 e o indicador de voltagem QuasAr3-Citrino (para detalhes, ver D.R. Hochbaum, et. al., Nat. Methods, 11, 825-833 (2014)). Quarenta e oito horas antes da imagem, trans-retinal 100 nM foi adicionado ao meio.

[0057]Soluções: Os registros são realizados em tampão de geração de imagem Brainphys com potássio 3 mM. O bloqueador de junção de lacuna 2-aminoetoxidifenil borato (50 mM) é adicionado para eliminar o acoplamento elétrico entre as células, e NBQX (10 mM), gabazina (20 mM) e AP5 (25 mM) foram usados para bloquear a transmissão sináptica.

[0058]Registros Optopatch: Cinco dias após a transdução, a geração de imagem Optopatch é realizada em um microscópio de fluorescência de campo ultralargo personalizado em TA. Os neurônios motores são iluminados com excitação de laser vermelho (200 W/cm2; 635 nm) para monitorar alterações na fluorescência QuasAr e excitação de LED azul (0-127 mW/cm2, 470 nm) para despolarizar a membrana celular com CheRiff. Um protocolo de estímulo de luz azul personalizado é usado, consistindo em: i) 2 segundos de iluminação vermelha apenas para monitorar a atividade espontânea, ii) 5 x 500 etapas de ms de aumento da intensidade da luz azul e iii) 2 x 2 s de aumento linear em rampa de luz azul, cada com uma intensidade máxima de azul diferente. Os dados Optopatch são registrados usando uma câmera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 sCMOS com uma taxa de quadros de 1 kHz. O tamanho do campo de visão é 4 mm x 0,5 mm. O software de controle personalizado escrito em MATLAB é usado para controlar os protocolos de iluminação e registrar todos os filmes. Para examinar os efeitos agudos dos potencializadores de Kv7.2/7.3, os neurônios são incubados com o composto de teste por 15 min antes da geração de imagem.

[0059]Análise de dados: a análise de segmentação de imagem é realizada usando a análise de componente principal temporal e a análise de componente independente espaço-

temporal para isolar neurônios individuais. Um algoritmo de localização de pico é usado para encontrar potenciais de ação e os dados são analisados para efeitos compostos na taxa de disparo média, na adaptação, na reobase e no formato de forma de onda de potencial de ação comparando com os controles do veículo (para detalhes, VER C.A. Werley, et. al., Curr. Protoc. Pharmacol., 78, 11.20.1-11.20.24. (2017)).

[0060]Submetido ao protocolo descrito acima, o efeito primário do Exemplo 1 é sobre a taxa de disparo do potencial de ação em resposta à iluminação de luz azul de baixa intensidade. A uma intensidade de iluminação LED azul de 5,1 mW/cm2, o composto diminuiu a frequência do potencial de ação de uma maneira dependente da concentração.

[0061]O ajuste de uma equação logística de 4 parâmetros aos dados pode ser usado para determinar a potência (EC 50) do efeito do Exemplo 1 na frequência do potencial de ação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 para dois esforços de diferenciação separados, cada um para as linhas derivadas dos pacientes portadores das mutações TARDBP e C9orf72. Os efeitos observados são qualitativamente similares, mas mais potentes do que aqueles observados com o potencializador flupirtina de Kv7.2/7.3 conhecido, demonstrando a utilidade potencial do Exemplo 1 para o tratamento de ELA reduzindo a excitabilidade de neurônios motores derivados de pacientes. Tabela 1: Inibição de excitabilidade em neurônios motores derivados de pacientes com ELA (apresentados como média (intervalo de confiança de 95%))

Tabela 1: Inibição de excitabilidade em paciente com ELA derivada de neurônios motores como média (intervalo de confiança de 95%) TARDBP C9orf72 Dif 1 Dif 2 Dif 1 Dif 2 Exemplo 1 0,15 0,15 0,17 0,20 EC50 (µM) (0,05; 0,25) (0,06; 0,24) (0,09; 0,25) (0,14; 0,25) Flupirtina 1,15 0,15 1,66 1,35 EC50 (µM) (0,65; 1,66) (0,48; 1,21) (1,31; 2,01) (0,82; 1,88) Ensaio #2 Modulação da condutância de Kv7.2/7.3 por potencializadores de Kv7 em um sistema de expressão de mamífero

[0062]A potência e a eficácia dos potencializadores de Kv7 são avaliadas por eletrofisiologia automatizada na plataforma lonWorks Barracuda (Dispositivos moleculares) usando o modo de patch clamp de população do instrumento.

[0063]Cultura de células: células HEK293 expressando de forma estável hKv7.2 (sob indução de tetraciclina) e hKv7.3 (Catálogo #CT6147, Charles River) são usadas para esses estudos. As células são mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco/mistura de nutrientes Ham's F-12 (Sigma- Aldrich) suplementado com 5% de soro fetal bovino triado por tetraciclina (Sigma-Aldrich), HEPES 15 mM, 500 pg/mL de G418, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, 29,2 mg/mL de L-glutamina, 100 pg/mL de zeocina e 5 pg/mL de blasticidina. A expressão de hKv7.2 é induzida pela adição de 1 pg/mL de doxiciclina 24 h antes dos registros.

[0064]As células são cultivadas em frascos Corning T-150 até uma confluência de 85%-95%. No início de um experimento, as células são lavadas uma vez com D-PBS sem cálcio e magnésio e, em seguida, dissociadas por incubação em 3 ml de 0,25% de tripsina por 8 min a 37°C. As células foram recolocadas em suspensão em meio, trituradas suavemente e centrifugadas por 4 min a 1.000 rpm. As células são recolocadas em suspensão em solução externa para uma concentração final de células 2,5-3,5 M/mL.

[0065]Soluções: A solução externa era composta por (em mM): NaCl 140, KCl 5, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10, Glicose 10, pH 7,4. A solução interna é composta por (em mM): gluconato K 90, KCl 40, EGTA 3,2, MgCl2 3,2, HEPES 5, pH 7,25. O agente perfurante da membrana anfotericina B é preparado diariamente como uma solução padrão de 27 mg/mL em DMSO e, em seguida, adicionado à solução interna para uma concentração final de 0,1 mg/mL. As diluições do artigo de teste são preparadas em placas de 384 poços a partir de soluções padrão de DMSO 10 mM e diluídas usando dispensação acústica (Labcyte ECHO®), de forma que as concentrações finais de DMSO sejam de 0,1%.

[0066]Registros eletrofisiológicos: células recolocadas em suspensão são colocadas no instrumento IONWORKS BARRACUDA (IWB), a solução externa é adicionada a uma placa de patch de 384 poços e um teste de orifício é realizado para determinar poços bloqueados e tensões compensadas. As células são então adicionadas à placa de patch (9 µL por poço) pelo instrumento. Dois testes de vedação são realizados antes da introdução do agente perfurante anfotericina na solução interna e permitindo aproximadamente 8 minutos para obter acesso elétrico, que é verificado por um terceiro teste de vedação. O protocolo de tensão de comando consiste em uma família de etapas de voltagens de 1 segundo de -80 mV a +40 mV de um potencial de retenção de -80 mV e é aplicado antes (referência) e 6 min após a adição do artigo de teste.

[0067]Análise de dados: Os dados são adquiridos e o vazamento subtraído usando o software IWB. As amplitudes de corrente durante os últimos 10 ms de cada etapa de voltagem são calculadas em média e exportadas. Uma análise posterior é realizada usando Microsoft Excel e GraphPad Prism. A amplitude da corrente é convertida em condutância (G) pela seguinte fórmula: G=I/(V-Ek) em que I=corrente, V=potencial em etapa, Ek=potencial de reversão de potássio (-84 mV). A condutância na presença do artigo de teste é normalizada para a condutância da referência em +40 mV para o mesmo poço. As curvas de condutância-voltagem (G-V) são ajustadas com a equação de Boltzmann y = Fundo + (Topo-Fundo)/(1 + EXP ((Vm- V0,5/k)).

[0068]O deslocamento mediado pelo artigo de teste no ponto médio da curva de condutância (V0,5) é mostrado na Tabela 2 para os Exemplos 1-3. Tabela 2: Diferença do controle na voltagem à metade da condutância máxima na presença de concentrações variáveis do composto de teste. Deslocamento de Voltagem (∆V0,5) Exemplo 1 Exemplo 2 Exemplo 3 Concentração Média DP Média DP Média DP (µM) (n=9) (n=2) (n=4) 10 -38,0 3,7 -25,8 6,8 -21,9 1,3 3,33 -28,0 5,1 -23,0 4,5 -23,9 1,5 1,11 -13,2 3,2 -10,6 6,6 -21,9 1,8 0,37 -3,5 4,4 -1,9 4,1 -19,6 4,5 0,12 0,0 3,4 2,9 3,3 -11,0 2,4 0,04 1,3 2,4 7,4 5,2 -4,4 2,1 0,01 1,6 2,7 4,1 3,3 -1,8 0,5 0,005 3,0 2,9 5,0 1,8 1,9 1,8 0,0015 2,0 2,9 4,1 3,2 0,1 1,3 0,0005 2,6 4,4 6,1 0 3,9 1,4 (DP acima refere-se ao Desvio Padrão).

[0069]O ajuste de uma equação logística de 4 parâmetros aos dados pode ser usado para determinar a potência (EC50) e a eficácia (deslocamento máximo) para cada composto de teste. Os resultados são mostrados na Tabela 3 para os Exemplos 1-

3. Tabela 3: Potência e eficácia dos potencializadores DE Kv7.2/7.3 Exemplo 1 Exemplo 2 Exemplo 3 EC50 (µM) 2,0 1,1 0,10 Deslocamento -44 -28 -23 máximo Inclinação 1,2 1,3 1,1 Ensaio# 3 Rastreamento limiar para medir os efeitos do Exemplo 1 em 3, 10 e 30 mg/kg IP em excitabilidade do nervo periférico

[0070]O rastreamento limiar é uma técnica não invasiva que permite a medição das propriedades de excitabilidade dos axônios periféricos, fornecendo informações sobre seu potencial de membrana e sua função do canal iônico. Método

[0071]Utilizaram-se 16 ratos Wistar machos de Charles River, pesando entre 307-446g. Os animais são alojados em grupo com condições de alojamento padrão (4 por gaiola, fase leve das 07:00 h às 19:00 h, temperatura e umidade constantes (21°C) e livre acesso a comida e água, bem como enriquecimento ambiental).

[0072]Os ratos são anestesiados com isoflurano (2-2,5%, O2 a 0,5 L/min) e então colocados de costas em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura da cauda acima de 32°C. A colocação dos eletrodos de anel é marcada e as seções marcadas da cauda são raspadas com uma lâmina para remover os pelos e a camada superior da pele. Os sítios são limpos com água e secos, permitindo uma boa condução entre a pele e os eletrodos aderentes.

[0073]Um eletrodo estimulador em anel aderente (anodo +ve) é enrolado ao redor do pé. Um segundo eletrodo estimulador de anel aderente (catodo -ve) é envolvido a 1,5 cm da base da cauda.

Um eletrodo de registro em agulha é colocado logo fora do centro no topo da cauda, 6 cm distal ao catodo estimulador na base da cauda.

Um eletrodo de referência em agulha é colocado logo fora do centro no topo da cauda, 2 cm distal ao eletrodo de registro.

Um eletrodo de aterramento aderente é enrolado em torno da cauda 2 cm proximal do eletrodo de registro.

Protocolo de estudo • Iniciar o programa Multitrack (descrição abaixo) e Spike. • Registrar 15 min de referência estável • Após os 15 min, a dose com o Exemplo 1 ou HEC • Fazer uma coleta de sangue para PK no seguinte: o 10 min após a dose o 20 min após a dose o 30 min após a dose o 40 min após a dose • 45 min após a dosagem IP (intraperitoneal) com o Exemplo 1, a dose de XE-991 (XE-991 é um composto disponível comercialmente que bloqueia os efeitos do potencializador KCNQ em um ensaio de formalina in vivo - ver Y.

Zheng, et al., “Activation of peripherical KCNQ channels relieves gout pain,” Pain, 156 (2015) 1025-1035; e R.

Zaczek, et al., “Two New Potent Neurotransmitter Release Enhancers, 10,10-Bis(4- Pyridinylmethyl)-9(10H)-Anthracenone e 10,10-Bis(2-Fluoro- 4-Pyridinylmethyl)-9(10H)-Anthracenone: Comparison to Linopirdine” The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 285:724-730, 1998. o (XE-991 é apenas dosado após o Exemplo 1 a 30 mg/kg)

• Fazer uma coleta de sangue para PK no seguinte: • 10 min após a dose (55 min após a administração do Exemplo 1) • 20 min após a dose (65 min após a administração do Exemplo 1) • 30 min após a dose (75 min após a administração do Exemplo 1) • 40 min após a dose (85 min após a administração do Exemplo 1)

[0074]No ensaio de rastreamento limiar para medir as propriedades de excitabilidade de estudos de axônios periféricos em ratos, o composto é administrado por IP a 3, 10 ou 30 mg/kg usando hidroxietilcelulose a 1%: polissorbato 80 a 0,25%: antiespumante a 0,05%: formulação de água purificada (HEC). As coletas de sangue seco (DBS) são feitas em torno de 10, 20, 30 e no final de 40 minutos após a dose. As amostras de DBS são secas em temperatura ambiente por cerca de 2 h. As amostras do cérebro são obtidas no momento final e congeladas até a análise. As amostras de DBS são enviadas e armazenadas em TA.

[0075]Uma solução padrão de 1 mg/mL do Exemplo 1 é preparada e é diluída em série em sangue de rato reunido para preparar padrões que variam de 1 a 10.000 ng/mL. O sangue foi adicionado a cartões DBS em branco para fazer os padrões. Uma punção de 3 mm dos padrões ou das amostras de DBS é adicionado à placa de 96 poços e 180 µl do padrão interno (IS) em 1:1 de ACN:MeOH são adicionados. Agitar por 45 min, diluir a solução de extração duas vezes com água e analisar por LC/MSMS para análise de concentração de fármaco.

[0076]As amostras de cérebro são homogeneizadas usando

1,14 ml de MeOH:H2O (2:8). Os padrões são preparados por adição de solução padrão em uma série de homogenados de cérebro em branco na faixa de 5 a 50000 ng/mL. 25 µl do padrão ou da amostra são pipetados para uma placa de 96 poços e 180 µl do padrão interno (IS) em 1:1 de ACN:MeOH são adicionados e misturados. As amostras são centrifugadas a 4000 RPM a 4°C por 10 min. O sobrenadante é diluído 15 vezes com água e analisado por LC/MSMS.

[0077]Amostras e padrões são analisados com um Espectrômetro de Massa Sciex API 4000 Triplo Quadrupolo (Sciex, Divisão de MDS Inc., Toronto, Canadá) acoplado a um Sistema de HPLC Shimadzu (LC-IOAD, Shimadzu Corporation) e um Amostrador Automático Gilson 215. Amostras (0,01 mL) são injetadas em uma coluna de HPLC de 5 µm de Betasil C-18, 20 x 2,1 mm Javelin (Thermo Electron Corp. Cat# 70105-022106), e eluídas com um gradiente. As condições cromatográficas consistem em fase móvel A de água/NH4HCO3 1 M (2000:10, v/v) e fase móvel B de MeOH/NH4HCO3 1M (2000:10, v/v) que são executadas ao longo de gradiente de 2,5 min a uma vazão de 1,5 mL/min. Um modo de íon positivo com pulverização turbo e uma temperatura de fonte de íons de 740°C são utilizados para detecção por espectrometria de massa. A quantificação é realizada usando monitoramento de reação múltipla (MRM) nas seguintes transições: A quantificação é realizada usando monitoramento de reação múltipla (MRM) nas seguintes transições: Exemplo 1 (m/z 350.2 a m/z 233.0) e um padrão interno analógico (m/z 263.1 a m/z 148.1). As representações gráficas de regressão linear de compostos para razões de área de pico de padrão interno versus concentrações de fármaco são derivadas com 1/x2 Quadrático. As representações gráficas de regressão linear de compostos para razões de área de pico de padrão interno versus concentrações de fármaco são derivadas com 1/x2 Quadrático.

[0078]O padrão interno análogo usado é ácido 2,2,2- trifluoroacético de 2-(dimetilamino)-N-pentil-3-fenil- propanamida (1:1) e tem a seguinte estrutura: Esse padrão interno analógico adquirido da Syncom, que é uma empresa da Holanda com um endereço de Kadijk 3, 9747 AT Groningen, Países Baixos.

[0079]A ligação do fármaco às proteínas plasmáticas e homogenados cerebrais de rato é determinada usando o método de diálise in vitro após adicionar o fármaco a essas matrizes e incubar durante 4,5 h a 37°C, durante a agitação orbital. O ensaio é realizado usando um dispositivo de micro equilíbrio de diálise HT e tiras de membrana de diálise (MWCO 12-14k). Uma amostra de tempo 0 é coletada após a matriz de proteína e as amostras são coletadas tanto do lado da proteína quanto do lado do tampão da membrana após 4,5 h de incubação. O precursor é quantificado por LC-MSMS em pontos de tempo de 0 e 45 min. A fração não ligada é calculada dividindo a concentração do lado do tampão pela concentração do lado da proteína. A recuperação percentual também é calculada dividindo a soma do tampão e das câmaras de proteína pela concentração de tempo 0 após 4,5 h. As concentrações de compostos não ligados são calculadas usando a concentração total *Fração não ligada. Resultados: Os efeitos do Exemplo 1 no Limiar Absoluto são mostrados na Tabela 4 Tabela 4. Composto Dose Exposição não Rastreamento ligada em limiar ± Sangue, nM (± Limiar absoluto SEM) para CMAP a 40%, % e referência (±± SEM) Exemplo 1 3 mg/kg (IP) 145 (± 90) 121 (± 10) Exemplo 1 10 mg/kg (IP) 193 (± 50) 140 (± 8) Exemplo 1 30 mg/kg (IP) 352 (± 245) 160 (± 18) CMAP = Potencial de ação muscular do composto. (Para obter informações adicionais sobre este ensaio, ver R. Sittl et al. “The Kv7 potassium channel activator flupirtine affects clinical excitability parameters of myelinated axons in isolated rat sural nerve,” Journal of the Peripheral Nervous System 15:63-72 (2010); M. Kovalchuk, et al., “Acute Effects of Riluzole and Retigabine on Axonal Excitability in Patients With Amyotrophic Lateral Sclerosis: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Crossover Trial,” recebido em 7 de março de 2018; aceito em 13 de abril de 2018; publicação online avançada 00 Mês 2018. doi:10.1002/cpt.1096, CLINICAL PHARMACOLOGY & HERAPEUTICS, VOLUME 00 NÚMERO 00, MÊS 2018; e J. Fleckenstein et al., “Activation of axonal Kv7 channels in human peripheral nerve by flupirtine but not placebo – therapeutic potential for peripheral neuropathies: results of a randomized controlled trail,” Journal of Translational Medicine 2013, 11:34).

[0080]Há uma diferença significativa no tempo e tempo de interação do tratamento (RM ANOVA de dois fatores; efeito do tempo F(26, 312) = 13,18, p =<0,0001; tempo*interação do tratamento F(78, 312) = 2,888, p<0,0001. Um teste de comparações múltiplas de Bonferroni mostrou que o Exemplo 1 a 30 mg/kg aumentou significativamente o limiar absoluto (diminuição da excitabilidade) em comparação com o veículo.

XE-991 foi capaz de reverter esse aumento (aumentar a excitabilidade).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula: em que R1 é ou e em que R2 é H ou OH, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 é: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R2 é OH ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula:

em que o composto compreende um único enantiômero que tem a rotação óptica (+) em metanol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula: em que o composto compreende um único enantiômero que tem a rotação óptica (-) em metanol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R2 é H, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que R2 é H, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que R2 é OH ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-11, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, com um ou mais de carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

13. Método de tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor é ELA.

15. Método de tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente em necessidade do mesmo da composição farmacêutica como definida na reivindicação 12.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor é ELA.

17. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

18. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor.

19. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 18, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que a doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor é ELA.

20. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-11, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor.

21. Uso de um composto, de acordo com a reivindicação 20, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que a doença causada por alterações na excitabilidade do neurônio motor é ELA.

22. Processo para preparar uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-11, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, com um ou mais de carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

23. Composto, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

24. Composto, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula:

25. Composto, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.