JP7451543B2 - Ｋｃｎｑ増強剤としての１－（（２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）ピリジン－４－イル）メチル）尿素誘導体 - Google Patents

Ｋｃｎｑ増強剤としての１－（（２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）ピリジン－４－イル）メチル）尿素誘導体 Download PDF

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Description

本発明は医療の分野にある。特に本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる他の神経疾患、例えば限定されないが原発性側索硬化症、仮性球麻痺、進行性球麻痺、進行性筋萎縮およびてんかんなどを処置するための化合物、方法、および医薬組成物に関する。
ＡＬＳ（「ルー・ゲーリック病」と呼ばれることがある）は、１年当たり１００，０００人に約１．５～３人が罹る致命的な神経疾患である。それは運動ニューロンの進行性の喪失によって特徴付けられ、典型的には診断から２～３年以内に死に至る。研究は続いているが、ＡＬＳ症例の大多数は既知の原因がない散発性のようである。
ＡＬＳ患者は典型的には、線維束性収縮、筋痙攣および痙縮をもたらす、末梢および中枢運動ニューロンの興奮性の増大を示す。ニューロン興奮性の増大はカルシウム過負荷および細胞死をもたらすと考えられる。実際、運動ニューロン興奮性はＡＬＳ患者における生存と負に相関した（K. Kanai et. al., J. Neurol.Neurosurg.Psychiatry, 83, 734-738 (2012)を参照されたい）。
研究は、なぜＡＬＳ患者における運動ニューロンが興奮性を変えたか（非ＡＬＳ患者と比較して）に関する機序および原因を調べてきた（K. Kanai et. al., Brain, 129, 953-962 (2006)を参照されたい）。研究の結果は、疾患関連過剰興奮性の主な誘因として、ニューロンにおけるカリウムチャネル活性の低下を示唆している（同書を参照されたい）。さらに、ＡＬＳ患者からの多能性幹細胞に由来する運動ニューロンも過剰興奮性を示した。（B.J.Wainger et. al., Cell Rep., 7, 1-11 (2014)を参照されたい）。これらの幹細胞由来ニューロンは遅延整流カリウム電流の減少を示し、実際、薬剤であるレチガビンおよびフルピルチン（これらは公知のＫｖ７カリウムチャネル増強剤である）がこれらの幹細胞由来ニューロンに添加された場合、運動ニューロンの過剰興奮性が正常化され、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生存が増加した（同書を参照されたい）。別の研究では、ラットの舌下運動ニューロンを使用するＡＬＳのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてＫｖ７増強剤レチガビンは興奮毒性の症状を減少させ、生存を増加させた（F. Ghezzi et. al., J. Physiol., 596, 2611-2629 (2018)を参照されたい）。
現在、ＡＬＳを処置するために承認されている唯一の薬物はリルゾールであり、これは生存を２～３カ月延ばすことが示されている。より有効で、より良好な、より長く持続する処置が明らかに必要とされている。
公知のＫｖ７増強剤レチガビンはＫｖ７．２～７．５（ＫＣＮＱ２～ＫＣＮＱ５）カリウムチャネルに作用する。それは薬物抵抗性てんかんを有する患者における補助療法として承認された。それは欧州および米国において２０１１年に承認されたが、２０１７年に自主的に回収された。臨床使用からのレチガビンの回収は、薬物の非常に限られた使用に至るいくつかの忍容性の問題に基づくと考えられた。忍容性の問題は、傾眠およびめまいのよくあるおそらく作用機序に基づく発生、ならびに尿閉と網膜および皮膚における色素沈着変化の稀な発生を含む。網膜変化、および失明の潜在性は、レチガビンのラベルに枠付き警告され、作用機序に基づかないと考えられている。尿閉は膀胱Ｋｖ７．３／７．５チャネルの増強の結果である可能性が最も高い。しかし、その副作用を考慮すると、新しいＫｖ７増強剤を開発する必要がある。
ＡＬＳ患者においてリルゾール（例えば、ＡＬＳのための承認された処置）およびレチガビンの運動ニューロン興奮性に対する効果を比較する最近の研究は、Ｋｖ７チャネルの増強剤がリルゾールより優れた有効性を有し得ることを示唆している（M. Kovalchuk et. al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 104, 1136-1145 (2018)を参照されたい）。したがって、レチガビンよりも良好な忍容性を有する改善された増強剤は、ＡＬＳおよび他の過剰興奮性関連障害の臨床処置に有益になるであろう。（B. Kalappa, et al.,The Journal of Neuroscience, 35(23):8829-8842を参照されたい）(2015)。今日までＫｖ７に作用する薬剤はＡＬＳの処置のために承認されず、したがって、治療利益をもたらす別のＫｖ７増強剤などのＫｖ７に作用する薬剤が依然として必要とされている。さらに、そのような増強剤を、他のＫｖ７チャネルよりもＫｖ７．２／７．３に選択的にさせることは有益であり得る。望ましくない副作用を回避し、特に末梢および中枢運動ニューロンの興奮性の処置のために、安全性、効力、有効性、および忍容性を含む改善された薬理学的特性の組合せをもたらし得る、新しいＫｖ７薬剤も必要とされている。
本実施形態は、運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされるＡＬＳおよび他の神経疾患の処置において有用であるカリウムチャネル増強剤（例えばＫｖ７増強剤、ＫＣＮＱ増強剤とも呼ばれる）である化合物を提供する。
具体的には、以下の式（「式Ｉ」と表される）の化合物がＫｖ７増強剤として使用され得る：
式中、Ｒ１は、
であり、式Ｉ中、Ｒ２はＨまたはＯＨである。式Ｉの化合物に加えて、１種または複数の薬学的に許容される塩が式Ｉの化合物から作製され、そのような薬学的に許容される塩もＫｖ７増強剤として作製され、使用され得る。
一部の実施形態では、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、Ｒ１が、
であり、Ｒ２がＨであるように作製される。
他の実施形態では、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）は、Ｒ１が、
であり、Ｒ２がＯＨであるように作製される。さらに、そのような実施形態では、Ｒ２がＯＨである場合、ＯＨ基が結合する炭素は立体中心である。したがって、一部の実施形態では、式Ｉの化合物（または薬学的に許容される塩）は、２種類の鏡像異性体のラセミ混合物であり得る。他の実施形態では、以下の鏡像異性体：
のいずれかを含む特定の鏡像異性体が使用され得る。当業者は、前述の鏡像異性体の１つだけを使用する実施形態をどのように構築するかを理解するであろう。他の実施形態は、各成分について異なるパーセンテージを有する異なる鏡像異性体の混合物を用いて設計され得る。
他の実施形態では、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）は、Ｒ１が、
であり、Ｒ２がＨであるように作製される。
さらに追加の実施形態では、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）は、Ｒ１が、
であり、Ｒ２がＯＨであるように作製される。さらに、そのような実施形態では、Ｒ２がＯＨである場合、ＯＨ基が結合する炭素は立体中心である。したがって、一部の実施形態では、式Ｉの化合物（または薬学的に許容される塩）は、２種類の鏡像異性体のラセミ混合物であり得る。他の実施形態では、以下の鏡像異性体：
のいずれかを含む特定の鏡像異性体が使用され得る。当業者は、前述の鏡像異性体の１つだけを使用する実施形態をどのように構築するかを理解するであろう。他の実施形態は、各成分について異なるパーセンテージを有する異なる鏡像異性体の混合物を用いて設計され得る。
本実施形態は、式Ｉの化合物または薬学的に許容される塩および１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。そのような医薬組成物は、疾患を処置する方法を提供し得る。具体的には、本実施形態は、必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）を投与するステップを含む、運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患を処置するための方法を提供する。一部の特に好ましい実施形態では、運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患はＡＬＳである。
他の実施形態は、運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）を投与するステップを含む、方法を提供する。一部の特に好ましい実施形態では、運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患はＡＬＳである。
本実施形態は、治療での使用のための式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）も提供する。とりわけ、本実施形態は、運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患の処置での使用のための式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）を提供する。一部の実施形態では、そのような疾患はＡＬＳであり得る。
さらに、本実施形態は、運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患の処置のための医薬の製造での式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩）の使用を提供する。一部のそのような実施形態では、疾患はＡＬＳである。
本明細書で使用される場合、用語「運動ニューロン興奮性の変化に関連する疾患」または「運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患」は、ＡＬＳ、原発性側索硬化症、仮性球麻痺、進行性球麻痺、てんかんおよび進行性筋萎縮からなる群から選択される疾患を含む。これらの用語はA. Verma, et al., "Atypical Motor Neuron Disease and Related Motor Syndromes," Seminars in Neurology, Volume 21, Number 2, 2001に記載されている疾患の全ても含む。そのような用語はＰＮＨ（末梢神経過剰興奮性）障害も含む。ＰＮＨ障害についての情報はC. Kucukali et al., "Peripheral nerve hyperexcitability syndromes" Rev Neurosci. 2015;26(2):239-51で見つけることができる。したがって、本明細書の化合物および薬学的に許容される塩は、これらの疾患の１つまたは複数を処置するために使用され得る。
本明細書において互換的に使用される場合、用語「患者」、「対象」、および「個体」は、ヒト、とりわけ、必要とする患者を指す。ある特定の実施形態では、患者は、Ｋｖ７の増強から利益を得る疾患、障害、または状態（例えば、ＡＬＳまたは別の疾患）によりさらに特徴付けられる。別の実施形態では、患者は、上記の状態、またはＫｖ７の増強から利益を得る状態を発症するリスクがあるとさらに特徴付けられる。
有効量は、公知の技術の使用によって、および類似の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者によって決定され得る。患者の有効量の決定において、限定されないが、そのサイズ、年齢、および全体的な健康；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の関与度または重症度；個々の患者の反応；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物のバイオアベイラビリティ特性；選択された用量レジメン；併用薬の使用；ならびに他の関連する状況を含むいくつかの因子が考慮される。有効量は、一部の実施形態では、末梢および中枢運動ニューロンの興奮性の臨床的に有意な低下をもたらす。
本発明の化合物は、化合物を生体利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような医薬組成物およびそれを調製するための方法は、当技術分野において周知である（例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V.Allen, Editor, 22nd Edition, Pharmaceutical Press, 2012を参照されたい）。
式Ｉの化合物およびその薬学的に許容される塩は、本発明の処置方法において特に有用であり、ある特定の構成が好ましい。本発明の化合物の以下のリストは、そのような構成を記載している。これらの好ましいものは、本発明の処置方法および化合物の両方に適用可能であることが理解されるであろう。
本実施形態の化合物（Ｒ２はＯＨである）は、
を含む。Ｒ２がＯＨであるこれらの化合物では、上の「平面結合」を有する化合物は、ラセミであり、および／または存在する両方の鏡像異性体を（５０／５０混合物またはある他の比で）有する。上のくさび形および破線結合を有する化合物は特定の鏡像異性体を描写する。「波線」結合を有する化合物は、それが存在する単一の鏡像異性体であるが、この単一の鏡像異性体の正確な立体配置が不明であることを示し、したがってそのような鏡像異性体はそれらの旋光度（例えば、それらが光を（＋）方向に回転させるか、または（－）方向に回転させるか）によって区別される。
本実施形態の化合物は以下の分子（Ｒ２はＨである）も含む：
Ｒ２としてＯＨ基を有する上の化合物は「上向き」の配置にＯＨを有する（くさび形の突起によって示される）ものであり得る。ＯＨ基が「下向き」の配置である他の実施形態が設計され得る。当業者は、例えば、異なる出発物質を使用するおよび／または異なる反応を使用することなどによって、この他の鏡像異性体をどのように作製するかを理解するであろう。そのような鏡像異性体は以下の構造を有し、本願で特許請求される実施形態の一部である：
本発明は全ての個々の鏡像異性体およびジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む前記化合物の鏡像異性体の混合物を企図するが、上で挙げた化合物およびその薬学的に許容される塩が特に好ましい。
個々の鏡像異性体は、選択的結晶化技術、キラルクロマトグラフィー（例えば、J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981、およびE.L.Eliel and S.H.Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994を参照されたい）、または超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）（例えばT. A.Berger; "Supercritical Fluid Chromatography Primer," Agilent Technologies, July 2015を参照されたい）などの方法によって、本発明の化合物の合成中の任意の都合のよい時点で当業者によって分離または分割され得る。
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当技術分野で周知の標準条件下の適した溶媒中での本発明の化合物の適切な遊離塩基および適切な薬学的に許容される酸の反応によって形成され得る。例えば、Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33:201-217 (1986)；Bastin, R.J., et al."Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4:427-435 (2000)；およびBerge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66:1-19, (1977)を参照されたい。
本発明の化合物またはその塩は、当業者に公知の様々な手順によって調製することができ、その手順の一部は以下のスキーム、調製法、および実施例に例示されている。以下のスキームにおける各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当技術分野で周知の従来の方法によって回収され得る。以下のスキームでは、全ての置換基は、特に他の指示がない限り、前に定義された通りである。試薬および出発物質は、当業者に容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、以下のスキーム、調製法、および実施例は、本発明の態様をさらに例示するために提供される。さらに、当業者は、対応する所望の立体化学配置を有し、当業者が調製できる出発物質または中間体を使用することによって、式Ｉの化合物を調製し得ることを理解している。
ある特定の略語が以下で使用され得る。これらの略語は以下の通りを意味する：「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し；「Ａｃ」はアセチルを指し；「ＡｃＯＨ」は酢酸を指し；「Ａｃ２Ｏ」は無水酢酸を指し；「ＡＰ５」は（２Ｒ）－アミノ－５－ホスホノペンタン酸を指し；「ＢＤＮＦ」は脳由来神経栄養因子を指し；「ＢＯＣ」はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルを指し；「ＣＡＳ＃」はＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ登録番号を指し；「ＣＭＡＰ」は複合筋活動電位を指し；「ＤＣＭ」は塩化メチレンまたはジクロロメタンを指し；「ＤＩＰＥＡ」はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを指し；「ＤＭＥＡ」はジメチルエチルアミンを指し；「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを指し；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し；「Ｄ－ＰＢＳ」はダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し；「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸を指し；「ＥＳ／ＭＳ」はエレクトロスプレー質量分析を指し；「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを指し；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し；「ＥｔＯＨ」はエタノールまたはエチルアルコールを指し；「ｈ」は時間（hour）または時間（hours）を指し；「ＨＥＰＥＳ」は４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を指し；「ＩＰＡ」はイソプロパノールまたはイソプロピルアルコールを指し；「ＩＰＡｍ」はイソプロピルアミンを指し；「ｉＰｒＯＡｃ」は酢酸イソプロピルを指し；「ＬＣ／ＭＳＭＳ」はタンデム質量分析を伴う液体クロマトグラフィーを指し；「ＬｉＨＭＤＳ」はリチウムビス（トリメチルシリル）アミドを指し；「ＫＯｔＢｕ」はカリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシドを指し；「Ｍｅ」はメチルを指し；「ｍｓｅｃ」は時間の単位としてのミリ秒（millisecond）またはミリ秒（milliseconds）を指し；「ＭＴＢＥ」はメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルを指し；「ｍｉｎ」は分（minute）または分（minutes）を指し；「ＮａＯｔＢｕ」はナトリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシドを指し；「ｎ－ＢｕＬｉ」はｎ－ブチルリチウムを指し；「ＮＢＱＸ」は（２，３－ジヒドロキシ－６－ニトロ－７－スルファモイル－ベンゾ［ｆ］キノキサリンを指し；「ＯＡｃ」はアセテートまたはアセトキシを指し；「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＲＴ」は室温を指し；「ＳＣＸ」は強カチオン交換基を指し；「ＳＤ」は標準偏差を指し；「ｓｅｃ」は時間の単位としての秒（second）または秒（seconds）を指し；「ＳＥＭ」は標準誤差を指し；「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーを指し；「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し；「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し；「ＴＭＡ」はトリメチルアミンを指し；「ＴＭＥＤＡ」はテトラメチルエチレンジアミンを指し；「Ｔｒｉｓ」はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオールを指し；「［α］Ｄ ２０」は２０℃および５８９ｎｍでの比旋光度を指し、ｃはｇ／ｍＬ単位の濃度である（これは通常ｇ／１００ｍＬである）。
一般的なスキーム
スキーム１は式Ｉ（式中、Ｒ１は上記の通り定義される）の化合物の調製を例示する。適切に置換されたアミン（またはその対応する塩、例えばＨＣｌ）の活性化エステル形成は、例えばカルボニルジイミダゾールを使用して、当技術分野において十分に文書で実証されており、適した有機塩基と共に前記活性化中間体を用いる（２－エトキシ－４－ピリジル）メタンアミン（またはその対応する塩形態、例えばＨＣｌ）のＯ－カルボニル化に対する選択的Ｎ－カルボニル化は、本発明の所望の尿素を生成し得る（ステップ１）。当業者は、当技術分野で周知のように、立体化学を含む式Ｉの化合物が、単一の鏡像異性体を得るためのキラル置換アミンを介して、またはＳＦＣなどのキラルクロマトグラフィー技術を使用する、もしくはキラル塩調製物などのキラル補助剤の使用による、式Ｉの化合物のキラル分割によって、調製され得ることを認識するであろう。
スキーム２はｒａｃ－２－アミノ－１－［１－（トリフルオロメチル）－シクロプロピル］エタノール塩酸塩の調製を描写する。（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボン酸からのワインレブ型アミド調製（ステップ２）は、当技術分野で十分に記載されている様々な条件下で達成することができる。ＴＨＦまたはＥｔ２Ｏなどの適した有機溶媒中での、標準的な還元剤を用いる（ステップ３ａ）、例えば水素化アルミニウムリチウムを使用するワインレブ型アミドの還元、続いてアルデヒドの単離およびＮａＨまたはＫＯｔＢｕなどの強塩基の存在下で生成したニトロメタンのアニオンの対応するアルデヒドへの添加（ステップ３ｂ）による、ニトロ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノールを調製するための２ステッププロセスは、所望のラセミ２－ニトロ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノールを与え得る。ニトロ基（ステップ４）の対応するアミンへのその後の還元は、当技術分野で十分に記載されている様々な条件下で達成することができ、得られたアミンは、使用しやすくするために適切な塩形態、例えばＨＣｌに変換され得る。当業者は、キラルクロマトグラフィー、またはキラル塩補助剤を使用する調製などの当技術分野で周知の標準技術を使用して、アミンのラセミ混合物がその２種類のキラル鏡像異性体に分割され得ることを認識するであろう。
スキーム３は必要な（２Ｓ）－１－アミノ－３，３－ジメチル－ブタン－２－オールまたはその対応する塩の調製を描写する。Ｃｏ３＋に活性化されているＣｏ２＋などのキラル遷移金属触媒を使用する２－ｔｅｒｔ－ブチルオキシランの速度論的光学分割（ステップ５）は、JACS 9 VOL.124, NO.7, 2002, 1307に報告されている文献に基づいて達成され得る。得られた立体化学は、キラル触媒の立体化学に依存して割り当てられ得る。したがって、（２Ｓ）－２－ｔｅｒｔ－ブチルオキシランはＳ，Ｓ－（サレン）Ｃｏ３＋ＯＡｃを使用して調製され得る（JACS 9 VOL.124, NO.7, 2002, 1307を参照されたい）。さらに、Ｓ－立体化学の検証はTetrahedron: Asymmetry 13 (2002) 1209-1217における報告されたデータとの比較によって達成され得る。立体制御エポキシド開環は、当業者に周知の条件下で、ＭｅＯＨ中でＮＨ３などの窒素求核剤を使用して達成され得る（ステップ６）。得られたアミノアルコールは、当技術分野における周知の条件下で適した塩形態に変換され得る。
調製１
Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチル－１－（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボキサミド
ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中の市販の１－（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボン酸［ＣＡＳ＃２７７７５６－４６－４］（４．８ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（４．６５ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）の混合物を０℃に冷却し、２，４，６－トリプロピル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリホスホラン－２，４，６－トリオキシド溶液の溶液（ＤＭＦ中５０質量％、２８ｍＬ、４７．５ｍｍｏｌ）を添加漏斗により滴下添加する。反応混合物を室温で２０時間撹拌する。反応混合物を０℃に冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液に注ぐことによってクエンチする。得られた相を分離し、水性層をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発乾固して、表題化合物を得る（４．４ｇ、６７％収率）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.74 (s, 3H), 3.29 (s, 3H), 1.33-1.25 (m, 4H).ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ１９８［Ｍ＋Ｈ］。
調製２
（±）－２－ニトロ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノール
ＴＨＦ（２０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）中の水素化アルミニウムリチウムの１Ｍ溶液をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）中のＮ－メトキシ－Ｎ－メチル－１－（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボキサミド（４．３ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）の０℃溶液に滴下添加し、得られた混合物を１時間撹拌する。水（０．８１ｍＬ）、次いで２Ｍ水性ＮａＯＨ（０．８１ｍＬ）、次いで追加の水（２．４３ｍＬ）の滴下添加によって反応をクエンチする。ＭｇＳＯ４（５ｇ）を添加し、得られた混合物を最低真空で珪藻土のパッドを通して濾過して、Ｅｔ２Ｏ中の１－（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボアルデヒドの溶液と考えられるものを得る。この溶液をニトロメタン（６０ｍＬ、１．１ｍｏｌ）およびＫＯｔＢｕ（３６０ｍｇ、３．１７ｍｍｏｌ）の０℃の急速撹拌溶液に滴下添加する。約１時間後、反応物を室温に温め、終夜撹拌する。フラスコ内の褐色ゴム状物から溶媒をデカントし、減圧下で濃縮する。得られた残留物を０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲル上で精製して、表題化合物を無色油状物として得る（２．９ｇ、６７％収率）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.97-0.91 (m, 1H), 1.13-0.99 (m, 3H), 2.66 (d, J= 5.1 Hz, 1H), 4.41-4.36 (ddd, J= 9.8, 5.1, 2.4 Hz, 1H), 4.59-4.53 (dd, J= 9.8, 13.8 Hz, 1H), 4.68 (dd, J= 2.4, 13.8 Hz, 1H).
調製３
（±）－２－アミノ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノール塩酸塩
ＴＨＦ（３７ｍＬ、３７ｍｍｏｌ）中の水素化アルミニウムリチウムの１Ｍ溶液をＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）中の（±）－２－ニトロ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノール（２．９ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の０℃溶液に滴下添加し、得られた反応混合物を室温に終夜撹拌する。混合物を０℃に冷却し、ＴＨＦ（１５ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）中の水素化アルミニウムリチウムの追加の１Ｍ溶液を滴下添加する。反応混合物を室温に温め、４時間撹拌する。水（１．９６ｍＬ）、次いで２Ｍ水性ＮａＯＨ（１．９６ｍＬ）、次いで水（５．８８ｍＬ）の滴下添加によって、０℃で反応混合物をクエンチする。ＭｇＳＯ４（５ｇ）を添加し、得られた混合物を１０分間撹拌し、珪藻土の床を通して濾過する。濾液をジオキサン（２０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）中の４Ｍ ＨＣｌで処理し、減圧下で濃縮する。得られた残留物をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）中に急速撹拌により懸濁する。得られた白色固体を濾過によって単離して、表題化合物を得る（１．５２ｇ、４７％収率）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１７０［Ｍ＋Ｈ］。
調製３の別の手順
ＰＡＲＲフラスコに酸化白金（ＩＶ）（２４２ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（２４ｍＬ）中の（±）－２－ニトロ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノール（２．４２ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）の溶液および酢酸（４．９６ｍＬ）を添加する。フラスコを５５ｐｓｉの水素雰囲気下に置き、室温で５時間振盪する。反応物を珪藻土の床を通して濾過し、減圧下で濃縮する。残留物を１，４－ジオキサン（１７．２ｍＬ）中でスラリーにし、１，４－ジオキサン（１０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）中の４Ｎ ＨＣｌを滴下添加し、２時間撹拌する。混合物を濾過し、ケーキを１，４－ジオキサンで洗浄し、１５分間真空引きで乾燥する。得られた固体を真空オーブン内４５℃で３時間乾燥させて、表題化合物を得る（２．２１ｇ、８０％収率）。
調製４（これは実施例２を与える）
（±）－１－［２－ヒドロキシ－２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］－３－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］尿素
ＤＣＭ（４ｍＬ）中の［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メタンアミン塩酸塩［ＣＡＳ＃２０４４７０４－６９－８］（２００ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（５８０μＬ、３．３ｍｍｏｌ）および１，１’－カルボニルジイミダゾール（１４９ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加する。得られた反応物を０℃で１５分間激しく撹拌し、（±）－２－アミノ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノール塩酸塩（２３２ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を添加する。得られた混合物を室温で終夜撹拌する。水の添加によってクエンチし、ＤＣＭで希釈し、疎水性フリットを通す。有機層を蒸発させ、得られた残留物を０～１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲル上で精製して、表題化合物を得る（１９８ｍｇ、５７％収率）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０２［Ｍ＋Ｈ］。
調製４の別の手順
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中で［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メタンアミン二塩酸塩（５００ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２６ｍＬ、７．１６ｍｍｏｌ）を撹拌して、清澄な溶液を得る。１，１’－カルボニルジイミダゾール（３１１ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌する。（±）－２－アミノ－１－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタノール塩酸塩（４６５ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で４８時間撹拌する。水を添加し、有機相を分離し、硫酸ナトリウムで脱水する。有機物を濾過し、蒸発させ、得られた残留物を０～１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲル上で精製して、表題化合物を得る（６８０ｍｇ、９０％収率）。
この分子のキラル部分は、速度論的光学分割および開環化学を使用して合成し得る。
調製５
（２Ｓ）－１－アミノ－３，３－ジメチル－ブタン－２－オール塩酸塩
（２Ｓ）－２－ｔｅｒｔ－ブチルオキシランを商業的に（ＣＡＳ＃４０１０２－５５－４）またはＲ配置エポキシドがＲＲ触媒から得られ、したがってＳエポキシドがＳＳ触媒から得られることが報告されているJ. AM.CHEM.SOC.9 VOL.124, NO.7, 2002 1307に報告されている速度論的光学分割により得る：
ＥｔＯＨ（４２７ｍＬ）中の（２Ｓ）－２－ｔｅｒｔ－ブチルオキシラン（１０７ｇ、１．０１モル）およびＮＨ４ＯＨ（１．３Ｌ、１０．７モル）の混合物を密閉容器内で、１００℃で４時間加熱する。減圧下で冷却し、濃縮する。得られた残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）中に０℃で溶解し、ジオキサン（２６７ｍＬ、１．１モル）中のＨＣｌの４Ｍ溶液を１０分にわたりゆっくり添加するうちに、白色沈殿物が形成される。得られた固体を濾過し、冷たいＤＣＭで洗浄し、真空吸引によって乾燥させて、表題化合物を得る（１０３ｇ；６２．９％収率）。1H NMR (300.1 MHz, MeOD): δ 0.94 (s, 9H), 2.76 (dd, J= 11.1, 12.6 Hz, 1H), 3.09 (dd, J= 2.5, 12.6 Hz, 1H), 3.41 (dd, J= 2.5, 11.1 Hz, 1H).［α］Ｄ ２０＝＋３２．３８°（ｃ＝０．８ｇ／１００ｍＬ、ＥｔＯＨ）。Tetrahedron:Asymmetry 13 (2002) 1209-1217において報告された文献［α］Ｄ ２０＝＋２５．９°（ｃ＝０．４７ｇ／１００ｍＬ、ＥｔＯＨ）。
調製５の別の手順
ＡおよびＢのラベルを付けた２つのＩＳＣＯ２～１０００ｍｌシリンジポンプを用意する：
ポンプＡにＭｅＯＨ中のＮＨ３の７Ｍ溶液を充填する。ポンプＢにＭｅＯＨ（９９５ｍＬ）中のＮＨ３の７Ｍ溶液に（２Ｓ）－２－ｔｅｒｔ－ブチルオキシラン（２５ｇ、２３２ｍｍｏｌ）を溶解した溶液を充填する。それらのポンプをオーブン内の５００ｍＬステンレス製管型反応器（ＯＤ＝１／８インチ）に接続し、次いで出口である、熱交換器として作用する、オーブンの外に位置する７ｍＬステンレス製管型反応器（ＯＤ＝１／１６インチ）に接続し、１２００ｐｓｉに設定されたＥＱＵＩＬＩＢＡＲ（登録商標）背圧レギュレーターを熱交換器の後ろに接続する。
ポンプＡを使用して管型反応器にＭｅＯＨ中のＮＨ３の７Ｍ溶液を５ｍＬ／分で充填する。オーブン温度を２００℃に設定する。これらの管型反応器が満たされたら、１０ｍＬ／分で１００分間ポンプＢに切りかえ、次いでポンプＡに切りかえてＭｅＯＨ中のＮＨ３の７Ｍ溶液を同じ流速でさらに１時間供給する。
収集した溶液を減圧下室温で濃縮して、粗製（２Ｓ）－１－アミノ－３，３－ジメチル－ブタン－２－オール（２４．４ｇ）を得る。粗製物質をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（１５０ｍＬ）に溶解し、ＩＰＡ（４６．４ｍＬ、２５５ｍｍｏｌ）中のＨＣｌの５．５Ｍ溶液を激しく撹拌しながら５分にわたり滴下添加する。得られた白色固体を濾過し、ＭＴＢＥ（４×２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、表題化合物を得る（２３ｇ、７２％収率）。
調製６
［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メタンアミン二塩酸塩
２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）ピリジン－４－カルボニトリル［ＣＡＳ＃６１８４４６－３０－３］（８２．５ｇ、３６７ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中で撹拌し、溶液を溶解していない固体からデカントし、毎回溶液をデカントしながら固体をＥｔＯＨ（３×５０ｍＬ）で洗浄する。ＥｔＯＨ溶液を合わせ、追加のＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）で希釈し、濃ＨＣｌの水溶液（１２５ｍＬ）を添加する。約１０ｍＬ ＥｔＯＨ中の１０％パラジウム炭素（３．７ｇ）のスラリーを添加する。得られた反応混合物を６０ｐｓｉのＨ２の雰囲気下、室温で終夜振盪する。混合物を珪藻土のパッドを通して濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して、白色固体を残す。得られた固体をＭＴＢＥ中４５℃で３０分間スラリーにし、混合物を室温に冷却し、濾過して、固体を得る。固体を水（４００ｍＬ）中に溶解し、ＭＴＢＥ（４００次いで２００ｍｌ）で２回抽出する。水性相を減圧下で濃縮して、クリーム色の固体を得、これをＴＨＦ（１００ｍＬ）中でスラリーにし、濾過する。濾過ケーキをＴＨＦ（２×３０ｍｌ）で洗浄し、真空吸引下で乾燥させて、表題化合物を得る（４６．１６ｇ、４４％収率）。濾液を減圧下でさらに濃縮し、真空オーブン内で終夜乾燥させる。得られた固体をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で３０分間スラリーにし、濾過して、表題化合物の追加の収穫物を得る（３４ｇ、３２．５％収率）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ３０７［Ｍ＋Ｈ］。塩化物イオン分析（ＩＣ）はモル比２：１の塩化物イオン：親を示した。
[実施例１]
１－［（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－３，３－ジメチル－ブチル］－３－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］尿素
［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メタンアミン塩酸塩（８．０６ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）中で撹拌し、ＤＩＰＥＡ（２９ｍＬ、１６６ｍｍｏｌ）を添加する。得られた混合物を５分間撹拌し、１，１’－カルボニルジイミダゾール（５．７ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を１０分間撹拌し、（２Ｓ）－１－アミノ－３，３－ジメチル－ブタン－２－オール塩酸塩（５ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を週末にかけて撹拌する。反応混合物を水で洗浄し、有機相を分離し、減圧下で濃縮する。得られた残留物をＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨで溶出するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、溶媒蒸発後に表題化合物を得る（８．１６ｇ、７２％収率）。
物質を上記の通り調製した別のロットの表題化合物（４．３７ｇ）と合わせ、ｉＰｒＯＡｃ（４５ｍｌ）から再結晶化して、１１．２９ｇの表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ３５０［Ｍ＋Ｈ］。［α］Ｄ ２０＝＋２９．８４５°（ｃ＝０．２ｇ／１００ｍＬ、ＭｅＯＨ）。
[実施例２]
キラル分割による（＋）－１－［２－ヒドロキシ－２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］－３－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］尿素および（－）１－［２－ヒドロキシ－２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］－３－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］尿素
３５℃、１００ｂａｒで、１５２ｍＬ／分の９２：８ＣＯ２／０．２％Ｎ，Ｎ－ジメチルエチルアミンを含むエタノールで溶出し、２２０ｎｍで検出するＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＤ－Ｈ（２５０×３０ｍｍ、５μ）カラムを使用するＳＦＣキラル精製に（±）－１－［２－ヒドロキシ－２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］－３－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］尿素（６８０ｍｇ）を供し、各画分を蒸発させ、４５℃の真空オーブン内で乾燥させて、
鏡像異性体１（第１の溶出ピーク、２８５．４ｍｇ）：（－）－１－［２－ヒドロキシ－２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］－３－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］尿素；［α］Ｄ ２０＝－２１．０°（ｃ＝０．２０ｇ／１００ｍＬ、ＭｅＯＨ）；
鏡像異性体２（第２の溶出ピーク、２８９．５ｍｇ）を得る。上記の方法を使用して鏡像異性体２を２回目のＳＦＣ精製に供し、各画分を蒸発させ、４５℃の真空オーブン内で乾燥させて、（＋）－１－［２－ヒドロキシ－２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］－３－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］尿素（２３６ｍｇ）を得る；［α］Ｄ ２０＝＋１５．０°（ｃ＝０．２０ｇ／１００ｍＬ、ＭｅＯＨ）。
[実施例３]
１－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］－３－［２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］尿素
丸底フラスコにおいて、２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタンアミン塩酸塩（５００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ；国際公開第２０１３／１３４２５２号パンフレットを参照されたいが、市販もされている［ＣＡＳ＃：１４５４６９０－８０－２］）をＤＣＭ（５ｍＬ）中で撹拌し、ＤＩＰＥＡ（１．４ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を添加する。清澄な溶液が得られたら、１，１’－カルボニルジイミダゾール（４２８ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で３０分間撹拌する。［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メタンアミン二塩酸塩（８１０ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を一度に添加し、室温で３０分間撹拌する。反応物を４０℃に３時間温め、室温で１６時間撹拌する。反応物をマイクロ波バイアルに移し、１００℃で３０分間加熱する。得られた混合物をＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーよって精製して、表題化合物を得る（８９２ｍｇ、８８％収率）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ３８６［Ｍ＋Ｈ］
実施例３の別の手順
マイクロ波反応容器に市販の２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エタンアミン塩酸塩（７５８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、ＣＡＳ＃５６１２９７－９３－６）、ＤＣＭ（２ｍＬ）、ＤＩＰＥＡ（６９８μＬ、０．４ｍｍｏｌ）および１，１’－カルボニルジイミダゾール（６４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加する。室温で５時間振盪する。室温のＤＣＭ（０．８ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ）中の市販の［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メタンアミン（ＣＡＳ＃１４５４６９０－８０－２；代わりに国際公開第２０１３／１３４２５２号パンフレットを参照されたい）の０．５Ｍ調製溶液を添加する。得られた混合物をマイクロ波中、１００℃で３０分間加熱する。反応混合物をより大きな丸底フラスコにデカントし、水（５ｍＬ）およびＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈する。室温で１５分間撹拌し、疎水性フリットを通して有機相を分離する。濾液を減圧下で濃縮し、水性相として５％ＭｅＯＨを含有する１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ約１０）中２３～５７％のＡＣＮで溶出する、ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）－ＮＸ Ｃ１８ １５×３０ｍｍガード付き７５×３０ｍｍ ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）－ＮＸ Ｃ１８カラム、５μ粒子径、１１０Ａ、ＡＸＩＡカラムを使用する高ｐＨ逆相クロマトグラフィーによって、得られた残留物を精製して、１－［［２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－４－ピリジル］メチル］－３－［２－［１－（トリフルオロメチル）シクロプロピル］エチル］尿素（９０．６ｍｇ、５９％収率）を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ３８６［Ｍ＋Ｈ］
アッセイ
本実施形態の化合物がＫｖ７の増強において活性であることを示す生物学的アッセイデータが下に提供される。
アッセイ＃１
ＡＬＳ患者ｉＰＳＣ株由来の運動ニューロンにおける実施例１のＯｐｔｏｐａｔｃｈ興奮性アッセイ
皮質ニューロンおよび下位運動ニューロンの変化した興奮性は、ＡＬＳの病態生理学における重要な因子である（例えば、K. Kanai, et. al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 83, 734-738 (2012)；P. Menon, et. al., Eur J Neurol., 24, 816-824 (2017)を参照されたい）。全光型電気生理学的手法（「Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ」）を使用して、異なる病原性変異を有する２人のＡＬＳ患者からのｉＰＳＣ株に由来する培養した運動ニューロンにおける興奮性を評価した。
細胞培養：２種類のｉＰＳＣ株はそれぞれ、ＴＡＲＤＢＰにおける病原性変異を有する１人の患者、およびＣ９ｏｒｆ７２における病原性リピート伸長変異を有する１人の患者から得る。運動ニューロンは、運動ニューロン形態形成因子を含めることによって、二重ＳＭＡＤ阻害ニューロンパターニングプロトコール（S.M.Chambers, et. al., Nat Biotechnol., 27, 275-280 (2009)を参照されたい）を適応した２Ｄ分化方法によってこれらの株から作製する。分化は、目視検査、核型分析ならびにベータ－ＩＩＩ－チューブリンおよび核運動ニューロンマーカーＩＳＬ１の染色によって検証する。ニューロンは１０ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦを補充したｍＴｅＳＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてマウスグリア細胞の単層上で培養する。イメージングの４８時間前に、１００ｎＭトランス－レチナールを培地に添加した。
Ｏｐｔｏｐａｔｃｈベクターによる形質導入：ｉｎ ｖｉｔｒｏで１５日目に、培養した運動ニューロンにレンチウイルスベクターで形質導入し、アクチュエーターＣｈｅＲｉｆｆ－ｍＯｒａｎｇｅ２および電圧インジケーターＱｕａｓＡｒ３－Ｃｉｔｒｉｎｅの共発現を駆動する（詳細についてはD.R.Hochbaum, et. al., Nat.Methods, 11, 825-833 (2014)を参照されたい）。イメージングの４８時間前に、１００ｎＭトランス－レチナールを培地に添加した。
溶液：記録は３ｍＭカリウムを含むＢｒａｉｎｐｈｙｓ（商標）イメージング緩衝液中で行う。ギャップ結合遮断剤２－ホウ酸アミノエトキシジフェニル（５０μＭ）を添加して、細胞間の電気的結合を排除し、ＮＢＱＸ（１０μＭ）、ガバジン（２０μＭ）、およびＡＰ５（２５μＭ）を使用して、シナプス伝達を遮断した。
Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ記録：形質導入の５日後、Ｏｐｔｏｐａｔｃｈイメージングを室温でカスタム超広視野蛍光顕微鏡で行う。運動ニューロンを赤色レーザー励起（２００Ｗ／ｃｍ２；６３５ｎｍ）で照射してＱｕａｓＡｒ蛍光の変化をモニタリングし、青色ＬＥＤ励起（０～１２７ｍＷ／ｃｍ２、４７０ｎｍ）で照射してＣｈｅＲｉｆｆを有する細胞膜を脱分極する。ｉ）自発活動をモニタリングするためだけの２秒間の赤色照射、ｉｉ）青色光強度を増加させる５×５００ミリ秒ステップ、およびｉｉｉ）それぞれ異なる最大青色強度を有する２×２秒の青色光ランプを直線的に増加させることからなるカスタム青色光刺激プロトコールを使用する。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈデータは、１ｋＨｚフレームレートを有するＨａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０ｓＣＭＯＳカメラを使用して記録する。視野サイズは４ｍｍ×０．５ｍｍである。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）に書かれているカスタム制御ソフトウェアを使用して、照射プロトコールを制御し、全ての動画を記録する。Ｋｖ７．２／７．３増強剤の急性効果を調べるために、ニューロンを試験化合物とイメージング前に１５分間インキュベートする。
データ分析：個々のニューロンを単離するために時間的主成分分析および空間－時間的独立成分分析を使用してイメージセグメント化分析を行う。スパイク発見アルゴリズムを使用して活動電位を見つけ、データは、平均発火頻度、順化、基電流および活動電位波形に対する化合物の効果についてビヒクル対照と比較することによって分析する（詳細についてはC.A.Werley, et. al., Curr.Protoc.Pharmacol., 78, 11.20.1-11.20.24.(2017)を参照されたい）。
上記のプロトコールに供し、実施例１の主な効果は、低強度青色光照射に応答した活動電位発火頻度に対する。５．１ｍＷ／ｃｍ２の青色ＬＥＤ照射強度で、化合物は活動電位頻度を濃度依存的に減少させた。
４－パラメーターロジスティック方程式をデータに当てはめることを使用して、活動電位頻度に対する実施例１の効果の効力（ＥＣ５０）を決定することができる。結果は、それぞれＴＡＲＤＢＰおよびＣ９ｏｒｆ７２変異を有する患者に由来する株についての２つの別々の分化の成果について表１に示す。観察された効果は質的に類似しているが、公知のＫｖ７．２／７．３増強剤フルピルチンで見られるよりも強力であり、患者由来運動ニューロンの興奮性を低下させることによってＡＬＳを処置することへの実施例１の潜在的な有用性を実証している。
アッセイ＃２
哺乳動物発現系におけるＫｖ７増強剤によるＫｖ７．２／７．３コンダクタンスの変調
Ｋｖ７増強剤の効力および有効性は、ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｂａｒｒａｃｕｄａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）プラットフォームで、機器のポピュレーションパッチクランプモードを使用して、自動電気生理学的手法によって評価する。
細胞培養：ｈＫｖ７．２（テトラサイクリン誘導下）およびｈＫｖ７．３を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞（カタログ＃ＣＴ６１４７、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）をこれらの研究のために使用する。５％テトラサイクリンスクリーニング済みウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２９．２ｍｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミン、１００μｇ／ｍＬゼオシン、および５μｇ／ｍＬブラストサイジンを補充したダルベッコ変法イーグル培地／栄養物混合物のＨａｍ’ｓ Ｆ－１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞を維持する。ｈＫｖ７．２の発現を、記録の２４時間前に１μｇ／ｍＬドキシサイクリンの添加によって誘導する。
細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｔ－１５０フラスコ内で８５％～９５％の集密度まで培養する。実験の開始時に、細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＤ－ＰＢＳで１回洗浄し、次いで３７℃で８分間３ｍｌの０．２５％トリプシン中でインキュベートすることによって分離する。細胞を培地中で再懸濁し、穏やかに粉砕し、１，０００ｒｐｍで４分間遠心分離する。細胞を外液に２．５～３．５Ｍ細胞／ｍＬの最終濃度まで再懸濁する。
溶液：外液は（ｍＭで）、１４０ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１０ＨＥＰＥＳ、１０グルコース、ｐＨ７．４で構成される。内液は（ｍＭで）、９０グルコン酸Ｋ、４０ＫＣｌ、３．２ＥＧＴＡ、３．２ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２５で構成される。膜穿孔剤アンホテリシンＢをＤＭＳＯ中２７ｍｇ／ｍＬ保存溶液として毎日調製し、次いで内液に０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加する。被験物質希釈物を１０ｍＭ ＤＭＳＯ保存溶液から３８４ウェルプレートに調製し、アコースティック分注（Ｌａｂｃｙｔｅ ＥＣＨＯ（登録商標））を使用して、最終ＤＭＳＯ濃度が０．１％になるように希釈する。
電気生理学的記録：再懸濁した細胞をＩＯＮＷＯＲＫＳ（登録商標）ＢＡＲＲＡＣＵＤＡ（商標）（ＩＷＢ）機器に入れ、外液を３８４ウェルパッチプレートに添加し、ホールテストを行って塞がったウェルを判定し、電圧を相殺する。次いで細胞を機器によってパッチプレート（ウェル当たり９μＬ）に添加する。２回のシールテストを行った後に穿孔剤アンホテリシンを内液に導入し、約８分かけて電気的接触を得、これは３回目のシール試験で検証する。コマンド電圧プロトコールは－８０ｍＶの保持電位から－８０ｍＶ～＋４０ｍＶの１秒間の電圧ステップのファミリーからなり、被験物質添加前（ベースライン）および被験物質添加の６分後に適用する。
データ分析：ＩＷＢソフトウェアを使用して、データを取得し、リークを差し引く。各電圧ステップの最後の１０ミリ秒間の電流振幅の平均を求め、エクスポートする。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してさらなる分析を行う。電流振幅を以下の式によってコンダクタンス（Ｇ）に変換する：Ｇ＝Ｉ／（Ｖ－Ｅｋ）（式中、Ｉ＝電流、Ｖ＝ステップ電位、Ｅｋ＝カリウム逆転電位（－８４ｍＶ））。被験物質の存在下でのコンダクタンスを、同じウェルの＋４０ｍＶでのベースラインコンダクタンスに正規化する。コンダクタンス－電圧（Ｇ－Ｖ）曲線にボルツマン方程式ｙ＝ボトム＋（トップ－ボトム）／（１＋ＥＸＰ（（Ｖｍ－Ｖ０．５／ｋ））を当てはめる。
実施例１～３についてコンダクタンス曲線（Ｖ０．５）の中点の被験物質媒介シフトを表２に示す。
４－パラメーターロジスティック方程式をデータに当てはめることを使用して、各試験化合物の効力（ＥＣ５０）および有効性（最大シフト）を決定することができる。結果は実施例１～３について表３に示す。
アッセイ＃３
末梢神経興奮性に対する３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ ＩＰの実施例１の効果を測定するための閾値追跡
閾値追跡は、その膜電位およびイオンチャネル機能についての情報を提供することによって末梢軸索の興奮性の測定を可能にする非侵襲性技術である。
方法
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒからの３０７～４４６ｇの重さの１６匹のオスのＷｉｓｔａｒラットを使用した。動物を標準飼育条件でグループ飼育する（ケージ当たり４匹、０７：００時～１９：００時の明期、一定温度（２１℃）および湿度、ならびに食物および水への自由アクセス、ならびに環境エンリッチメント）。
ラットにイソフルランで麻酔をかけ（２～２．５％、０．５Ｌ／分のＯ２）、次いで加熱パッドの上に仰向けに置き、尾の温度を３２℃より上に維持する。リング電極の配置を区切り、尾のマークを付けた区間を刃物でこすって、毛および皮膚の上層を除去する。この部位を水できれいにし、乾燥させ、皮膚と粘着性電極の間の良好な伝導を可能にする。
粘着性リング刺激電極（＋ｖｅ陽極）を足の周りに巻く。２つ目の粘着性リング刺激電極（－ｖｅ陰極）を尾の付け根から１．５ｃｍに巻く。針記録電極を尾の付け根の刺激陰極から６ｃｍ先端側の尾の上部に少し中心を外して置く。針参照電極を記録電極から２ｃｍ先端側の尾の上部に少し中心を外して置く。粘着性の接地電極を記録電極から２ｃｍ基端側の尾の周りに巻く。
研究プロトコール
・マルチ追跡プログラム（下の記載）およびスパイクを開始する。
・１５分の安定なベースラインを記録する
・１５分後、実施例１またはＨＥＣを投薬する
・以下の時点でＰＫのために血液スポットを採取する：
○投薬後１０分
○投薬後２０分
○投薬後３０分
○投薬後４０分
・実施例１のＩＰ（腹腔内）投薬から４５分後に、ＸＥ－９９１（ＸＥ－９９１はｉｎ ｖｉｖｏでホルマリンアッセイにおいてＫＣＮＱ増強剤効果を遮断する市販の化合物であり、Y. Zheng, et al., "Activation of peripheral KCNQ channels relieves gout pain," Pain, 156 (2015) 1025-1035；およびR. Zaczek, et al., "Two New Potent Neurotransmitter Release Enhancers, 10,10-Bis(4-Pyridinylmethyl)-9(10H)-Anthracenone and 10,10-Bis(2-Fluoro-4-Pyridinylmethyl)-9(10H)-Anthracenone:Comparison to Linopirdine" The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 285:724-730, 1998を参照されたい）を投薬する。
○（ＸＥ－９９１は３０ｍｇ／ｋｇの実施例１の後にのみ投与される）
・以下の時点でＰＫのために血液スポットを採取する：
・投薬後１０分（実施例１の投与後５５分）
・投薬後２０分（実施例１の投与後６５分）
・投薬後３０分（実施例１の投与後７５分）
・投薬後４０分（実施例１の投与後８５分）
ラットにおける末梢軸索研究の興奮性を測定するための閾値追跡アッセイにおいて、１％ヒドロキシエチルセルロース：０．２５％ポリソルベート８０：０．０５％消泡剤：精製水（ＨＥＣ）の配合を使用して３、１０または３０ｍｇ／ｋｇでＩＰによって化合物を投与する。乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を投薬後約１０、２０、３０および最終４０分に採取する。ＤＢＳ試料を室温で約２時間乾燥させる。脳試料を最終時点で得、分析まで凍結させる。ＤＢＳ試料を室温で輸送し、保存する。
実施例１の１ｍｇ／ｍＬ保存溶液を調製し、プールしたラット血液に連続希釈して１～１００００ｎｇ／ｍＬの範囲の標準を調製する。血液を白紙のＤＢＳカードにスパイクして、標準を作製する。ＤＢＳ標準の１つの３ｍｍの押し抜いたものまたは試料を９６ウェルプレートに添加し、１：１のＡＣＮ：ＭｅＯＨ中の１８０μＬの内部標準（ＩＳ）を添加する。４５分間振盪し、抽出溶液を水で２倍希釈し、薬物濃度分析のためにＬＣ／ＭＳＭＳによって分析する。
１．１４ｍＬのＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（２：８）を使用して脳試料をホモジナイズする。保存溶液を一連のブランク脳ホモジネートに５～５００００ｎｇ／ｍＬの範囲でスパイクすることによって標準を調製する。２５μＬの標準または試料を９６ウェルプレートにピペットで入れ、１：１のＡＣＮ：ＭｅＯＨ中の１８０μＬの内部標準（ＩＳ）を添加し、混合する。試料を４０００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離する。上清みを水で１５倍希釈し、ＬＣ／ＭＳＭＳによって分析する。
島津ＨＰＬＣシステム（ＬＣ－ＩＯＡＤ、島津製作所）およびＧｉｌｓｏｎ２１５オートサンプラーに接続したＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００トリプル四重極質量分析計（Ｓｃｉｅｘ、ＭＤＳ Ｉｎｃ．の事業部、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）で試料および標準を分析する。試料（０．０１ｍＬ）を５μｍ Ｂｅｔａｓｉｌ Ｃ－１８、２０×２．１ｍｍ Ｊａｖｅｌｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ＃７０１０５－０２２１０６）のＨＰＬＣカラムに注入し、勾配で溶出させる。クロマトグラフィー条件は、水／１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３（２０００：１０、ｖ／ｖ）の移動相Ａおよび２．５分にわたる勾配、１．５ｍＬ／分の流速で流れるＭｅＯＨ／１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３（２０００：１０、ｖ／ｖ）の移動相Ｂからなる。ターボスプレーでの陽イオンモードおよび７４０℃のイオン供給源温度を質量分析検出に利用する。以下の遷移において多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して定量を行う。以下の遷移において多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して定量を行う。実施例１（ｍ／ｚ３５０．２～ｍ／ｚ２３３．０）および類似内部標準（ｍ／ｚ２６３．１～ｍ／ｚ１４８．１）。内部標準に対する化合物のピーク面積比対薬物濃度の線形回帰プロットを１／ｘ２二次式を用いて得る。内部標準に対する化合物のピーク面積比対薬物濃度の線形回帰プロットを１／ｘ２二次式を用いて得る。
使用した類似内部標準は２－（ジメチルアミノ）－Ｎ－ペンチル－３－フェニル－プロパンアミド２，２，２－トリフルオロ酢酸（１：１）であり、以下の構造：
を有する。
この類似内部標準は、Ｋａｄｉｊｋ ３、９７４７ ＡＴ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓの住所を有するオランダの会社であるＳｙｎｃｏｍから購入される。
ラット血漿タンパク質および脳ホモジネートへの薬物結合は、薬物をこれらのマトリックスにスパイクし、オービタル振盪しながら３７℃で４．５時間にわたりインキュベートした後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ透析方法を使用して決定する。ＨＴ透析マイクロ平衡デバイスおよび透析膜ストリップ（ＭＷＣＯ１２～１４ｋ）を使用してアッセイを行う。４．５時間のインキュベーション後にタンパク質マトリックスおよび試料を膜のタンパク質側および緩衝液側の両方から採取した後に時間０試料を採取する。０および４５分の両方の時点でＬＣ－ＭＳＭＳによって親を定量する。緩衝液側の濃度をタンパク質側の濃度で割ることによって、未結合分率を算出する。４．５時間後に緩衝液およびタンパク質各チャンバーの合計を時間０の濃度で割ることによって、回収率も算出する。総濃度＊未結合分率を使用して、未結合の化合物の濃度を算出する。
結果：絶対閾値に対する実施例１の効果を表４に示す。
ＣＭＡＰ＝複合筋活動電位
（このアッセイに関する追加の情報についてはR. Sittl et al. "The Kv7 potassium channel activator flupirtine affects clinical excitability parameters of myelinated axons in isolated rat sural nerve," Journal of the Peripheral Nervous System 15:63-72 (2010)；M. Kovalchuk, et al., "Acute Effects of Riluzole and Retigabine on Axonal Excitability in Patients With Amyotrophic Lateral Sclerosis:A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Crossover Trial," Received 7 March 2018; accepted 13 April 2018; advance online publication 00 Month 2018. doi:10.1002/cpt.1096, CLINICAL PHARMACOLOGY & THERAPEUTICS, VOLUME 00 NUMBER 00, MONTH 2018；およびJ. Fleckenstein et al., "Activation of axonal Kv7 channels in human peripheral nerve by flupirtine but not placebo -therapeutic potential for peripheral neuropathies: results of a randomised controlled trial," Journal of Translational Medicine 2013, 11:34を参照されたい。）
時間および時間＊処置交互作用に有意な差異がある（二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ；時間効果Ｆ（２６，３１２）＝１３．１８、ｐ＝＜０．０００１；時間＊処置交互作用Ｆ（７８，３１２）＝２．８８８、ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ多重比較検定は、３０ｍｇ／ｋｇの実施例１が、ビヒクルと比較して絶対閾値を有意に上昇させること（興奮性の低下）を示した。ＸＥ－９９１はこの上昇を逆にする（興奮性を増大させる）ことができた。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
式：
（式中、Ｒ１は、
であり、
Ｒ２はＨまたはＯＨである）
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［２］
Ｒ１が、
である、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［３］
Ｒ２がＯＨである、［２］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［４］
メタノール中で（＋）旋光度を有する単一の鏡像異性体を含む式：
の、［３］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［５］
メタノール中で（－）旋光度を有する単一の鏡像異性体を含む式：
の、［３］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［６］
Ｒ２がＨである、［２］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［７］
Ｒ１が、
である、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［８］
Ｒ２がＨである、［７］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［９］
Ｒ２がＯＨである、［７］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１０］
式：
の、［９］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１１］
式：
の、［９］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１２］
［１］～［１１］のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
［１３］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、必要とする患者に有効量の［１］～［１１］のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
［１４］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる前記疾患がＡＬＳである、［１３］に記載の方法。
［１５］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、必要とする患者に［１２］に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
［１６］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる前記疾患がＡＬＳである、［１５］に記載の方法。
［１７］
治療での使用のための、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１８］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患の処置での使用のための、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１９］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる前記疾患がＡＬＳである、［１８］に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［２０］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患の処置のための医薬を製造するための、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
［２１］
運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる前記疾患がＡＬＳである、［２０］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
［２２］
医薬組成物を調製するための方法であって、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合するステップを含む、方法。
［２３］
式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
［２４］
メタノール中で（＋）旋光度を有する単一の鏡像異性体を含む式：
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［２５］
式：
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

Claims (21)

  1. 式：
    （式中、Ｒ１は、
    であり、
    Ｒ２はＨまたはＯＨである）
    の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  2. Ｒ１が、
    である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  3. Ｒ２がＯＨである、請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  4. メタノール中で（＋）旋光度を有する単一の鏡像異性体を含む式：
    の、請求項３に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  5. メタノール中で（－）旋光度を有する単一の鏡像異性体を含む式：
    の、請求項３に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  6. Ｒ２がＨである、請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  7. Ｒ１が、
    である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  8. Ｒ２がＨである、請求項７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  9. Ｒ２がＯＨである、請求項７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  10. 式：
    の、請求項９に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  11. 式：
    の、請求項９に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  12. 式：
    の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  13. メタノール中で（＋）旋光度を有する単一の鏡像異性体を含む式：
    の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  14. 式：
    の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
  16. 治療での使用のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  17. 運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患の処置での使用のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  18. 運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる前記疾患がＡＬＳである、請求項１７に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  19. 運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる疾患の処置のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
  20. 運動ニューロン興奮性の変化によって引き起こされる前記疾患がＡＬＳである、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 医薬組成物を調製するための方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合するステップを含む、方法。
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