BR112021004447A2

BR112021004447A2 - método de produção de etanol

Info

Publication number: BR112021004447A2
Application number: BR112021004447-7A
Authority: BR
Inventors: Yuichi Takahashi; Kohei Ide; Masahiro Niwa; Miyuki Kanezawa; Shoichi Ikemizu; Atsushi Furujo; Naoya Azumi; Akira Tsukamoto; Shingo Sekizawa
Original assignee: Oji Holdings Corporation; Eneos Corporation
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2021-05-25
Also published as: JP2020039295A; EP3851538A4; JP7092626B2; US20220049278A1; CN112930401A; US11773415B2; US20230407347A1; WO2020054716A1; EP3851538A1; AU2019340161A1

Abstract

método de produção de etanol. a presente invenção fornece um método de produção eficiente de etanol a partir de material de partida lignocelulósico. mais especificamente, a presente invenção fornece um método de produção de etanol a partir de um material de partida lignocelulósico, que compreende uma etapa de realização de múltiplas fermentações paralelas, mediante adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional a um líquido de fermentação que compreende um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura, de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja mantido dentro de uma faixa previamente definida.

Description

“MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido de patente reivindica a prioridade do Pedido de Patente Japonês n° 2018-169163, depositado em 10 de setembro de 2018, cujo teor completo é incorporado ao presente como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a um método de produção de etanol a partir de material de partida lignocelulósico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Uma tecnologia de produção de sacarídeos a partir de materiais de partida lignocelulósicos não comestíveis é uma tecnologia extremamente benéfica para a formação de uma sociedade orientada à reciclagem, pois pode produzir álcoois que podem ser utilizados como combustível substituto da gasolina, utilizando, como substratos de fermentação para micro-organismos, os sacarídeos produzidos e também podem evitar competição com alimentos.

[004] É conhecido, como método de produção de sacarídeos tais como monossacarídeos e oligossacarídeos que servem de substratos de fermentação a partir de polissacarídeos em materiais de partida lignocelulósicos, um método de sacarificação enzimática que se hidrolisa utilizando enzimas de sacarificação tais como enzimas celulolíticas e micro-organismos que produzem as enzimas de sacarificação.

[005] Além disso, múltiplas fermentações paralelas são conhecidas como um método de produção de etanol a partir de lignocelulose por meio da aplicação de um método de sacarificação enzimática. Na fermentação paralela múltipla, permite-se a coexistência de micro-organismos de fermentação de etanol com as enzimas de sacarificação acima e realiza-se simultaneamente uma reação de sacarificação enzimática e fermentação de etanol.

[006] A produção de etanol a partir de materiais de partida lignocelulósicos por meio de múltiplas fermentações paralelas apresenta o problema de alto custo em comparação com o método de produção que utiliza amido, melaços e similares como materiais de partida. Vem sendo estudado, portanto, um método de produção eficiente de etanol a partir de material de partida lignocelulósico.

[007] O Documento de Patente 1 descreve um método que compreende a recuperação de material de lignocelulose não reagido e uma enzima de sacarificação de uma solução de reação contínua, em que, utilizando material de lignocelulose submetido a operação de remoção de lignina como substrato, a razão entre a quantidade de todos os substratos e a quantidade da enzima de sacarificação em uma dispersão alimentada para um tanque de reação de sacarificação contínua é mantida em razão na qual pelo menos 96% em massa de todos os substratos são sacarificados dentro de um tempo de retenção, de forma a realizar continuamente uma reação de sacarificação, evitando ao mesmo tempo o acúmulo de lignocelulose não reagida.

[008] Existe ainda, entretanto, a necessidade de produção eficiente de etanol a partir de materiais de partida lignocelulósicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[009] Literatura de patentes: Literatura de Patente 1: JP 2006-087319 A.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0010] Um objeto da presente invenção é a produção eficiente de etanol. Particularmente, um objeto da presente invenção é a manutenção da concentração de etanol a ser produzido acima de um certo nível.

[0011] Os inventores do presente descobriram recentemente que a concentração de etanol produzida em líquido de fermentação que compreende um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura pode ser mantida acima de um certo nível caso sejam realizadas múltiplas fermentações paralelas, com a adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional ao líquido de fermentação. Além disso, eles também descobriram que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação acima pode ser utilizado como índice de adição da enzima de sacarificação adicional. A presente invenção é baseada nessas descobertas.

[0012] A presente invenção inclui [1] a [15] a seguir:

1. Método de produção de etanol a partir de um material de partida lignocelulósico, que compreende: - uma etapa de realização de múltiplas fermentações paralelas, mediante adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional a um líquido de fermentação que compreende um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura, de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja mantido dentro de uma faixa previamente definida.

2. Método de acordo com [1], em que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação é concentração de etanol e/ou viscosidade.

3. Método de acordo com [1] ou [2], em que a enzima de sacarificação adicional é agregada de forma que a concentração de etanol do líquido de fermentação seja mantida a 80% ou mais com relação à concentração de etanol no momento de assumir estado estável após o início da fermentação.

4. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [3], em que a enzima de sacarificação adicional é agregada de forma que uma unidade básica de enzima no líquido de fermentação seja mantida a 0,1 a 30% com relação à unidade básica de enzima em 1 a 12 horas após o início da fermentação.

5. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [4], em que a razão em massa entre a quantidade de adição da enzima de sacarificação adicional por dia e o teor inicial da enzima de sacarificação no líquido de fermentação (quantidade de adição da enzima de sacarificação adicional por dia: teor inicial de enzima de sacarificação no líquido de fermentação) é de 1:10 a 1:100.

6. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [5], em que a enzima de sacarificação adicional é agregada ao líquido de fermentação em quantidade de 20 U/l ou menos.

7. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [6], em que a enzima de sacarificação adicional é agregada intermitentemente a cada 2 a 192 horas.

8. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [7], em que a enzima de sacarificação adicional é agregada ao líquido de fermentação quando a viscosidade do líquido de fermentação exceder 140 cP.

9. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [8], em que a concentração do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação é ajustada de forma a ser mantida dentro de uma faixa previamente determinada.

10. Método de produção de etanol de acordo com [9], em que a concentração do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação é ajustada de forma a ser mantida em 5 a 30% em massa.

11. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [10], em que as múltiplas fermentações paralelas são realizadas em pelo menos dois tanques de reação conectados entre si.

12. Método de produção de etanol de acordo com [11], em que os pelo menos dois tanques de reação são conectados em série.

13. Método de produção de etanol de acordo com [11] ou

[12], em que os pelo menos dois tanques de reação compreendem primeiro tanque de reação que armazena o líquido de fermentação, no qual o material de partida lignocelulósico adicional é alimentado continuamente.

14. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [11] a [13], em que os pelo menos dois tanques de reação compreendem segundo tanque de reação ao qual uma parte do líquido de fermentação é transferida continuamente do primeiro tanque de reação.

15. Método de produção de etanol de acordo com qualquer um dentre [1] a [14], que compreende adicionalmente a etapa a seguir: - uma etapa de separação de sólidos e líquidos de uma solução aquosa de etanol do líquido de fermentação; em que a etapa compreende a transferência de um líquido de fermentação com teor de sólido concentrado para o tanque de reação após a separação da solução aquosa de etanol.

[0013] Segundo a presente invenção, etanol pode ser produzido eficientemente por meio da realização de múltiplas fermentações paralelas, mediante adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional, de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja mantido dentro de uma faixa previamente definida. A presente invenção é vantajosa porque a concentração de etanol produzida pode ser mantida acima de um certo nível.

Além disso, a presente invenção é vantajosa porque o custo de fabricação pode ser reduzido por meio de extensão do tempo de operação contínua.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] A Fig. 1 exibe alteração da viscosidade com o tempo do Exemplo 1 e do Exemplo Comparativo 1. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0015] A Fig. 2 exibe alteração da concentração de etanol (valor relativo) com o tempo do Exemplo 1 e do Exemplo Comparativo 1. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0016] A Fig. 3 exibe alteração da viscosidade de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo Comparativo 2. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0017] A Fig. 4 exibe alteração da concentração de etanol (valor relativo) de um primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo Comparativo 2. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0018] A Fig. 5 exibe alteração da unidade básica da enzima (valor relativo) de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo Comparativo 2.

A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0019] A Fig. 6 exibe alteração da viscosidade de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo 2. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0020] A Fig. 7 exibe alteração da concentração de etanol (valor relativo) de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo 2. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0021] A Fig. 8 exibe alteração da unidade básica da enzima (valor relativo) de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo 2. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0022] A Fig. 9 exibe alteração da viscosidade de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo 3. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0023] A Fig. 10 exibe alteração da concentração de etanol (valor relativo) de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo 3. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

[0024] A Fig. 11 exibe alteração da unidade básica da enzima (valor relativo) de primeiro tanque de reação com o tempo do Exemplo 3. A linha pontilhada indica o momento de início da adição de enzima de sacarificação adicional.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0025] O método de produção de etanol a partir de um material de partida lignocelulósico de acordo com a presente invenção é caracterizado por compreender uma etapa de realização de múltiplas fermentações paralelas, mediante adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional a um líquido de fermentação que compreende um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura, de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja mantido dentro de uma faixa previamente definida.

MÉTODO DE PRODUÇÃO

[0026] O método de produção de etanol a partir de um material de partida lignocelulósico de acordo com a presente invenção compreende uma etapa de realização de múltiplas fermentações paralelas, mediante adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional a um líquido de fermentação que compreende um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura, de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja mantido dentro de uma faixa previamente definida.

[0027] O método de produção de etanol a partir de material de partida lignocelulósico de acordo com a presente invenção pode incluir as etapas a seguir:

1. uma etapa de múltiplas fermentações paralelas que permite a coexistência das enzimas de sacarificação acima com micro-organismos de fermentação de etanol e realização simultânea de reação de sacarificação enzimática e fermentação de etanol;

2. uma etapa de separação de sólidos e líquidos;

3. uma etapa de concentração de etanol; e

4. uma etapa de remoção do teor de sólidos.

ETAPA DE MÚLTIPLAS FERMENTAÇÕES PARALELAS

[0028] Em primeiro lugar, um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura são alimentados para um tanque de reação. Na presente invenção, o material de partida lignocelulósico, a enzima de sacarificação e a levedura podem ser misturados antecipadamente e alimentados em seguida para o tanque de reação ou cada qual pode ser alimentado separadamente para o tanque de reação. É preferível, entretanto, adicionar a enzima de sacarificação e a levedura ao material de partida lignocelulósico alimentado antecipadamente ao tanque de reação. O material de partida lignocelulósico é sacarificado pela enzima de sacarificação e os sacarídeos produzidos são convertidos em etanol por meio de fermentação com a levedura.

MATERIAL DE PARTIDA LIGNOCELULÓSICO

[0029] O material de partida lignocelulósico é polpa ou material de partida que contém lignocelulose diferente da polpa. O material de partida lignocelulósico pode ser utilizado isoladamente ou pode ser utilizada uma mistura de dois ou mais destes.

[0030] Exemplos da polpa incluem polpas de madeira obtidas a partir de madeira macia, madeira dura, resíduos florestais, resíduos de construção etc.; polpas não de madeira, tais como linter de algodão, fiapos de algodão, cânhamo, palha e bagaço; polpas recicladas feitas de papel usado; e polpas descoloridas. O método de fabricação de polpa é preferencialmente um método de alta remoção de lignina, tal como um método de fabricação de polpa química, tal como extração de álcali ou cozimento de álcali. Dentre as polpas produzidas por meio do método de fabricação de polpa química, polpa para fabricação de papel é preferível devido à disponibilidade. Exemplos de polpa de fabricação de papel incluem polpas kraft de madeira dura (por exemplo, polpa kraft branqueada de folhas (LBKP), polpa kraft não branqueada de folhas (LUKP), polpa kraft branqueada de oxigênio de folhas (LOKP)); polpas kraft de madeira mole (por exemplo, polpa kraft branqueada com agulhas (NBKP), polpa kraft não branqueada com agulhas (NUKP), polpa kraft branqueada de oxigênio com agulhas (NOKP)); polpas químicas, tais como polpa de sulfito (SP) e polpa de soda (AP); e polpas semiquímicas tais como polpa semiquímica (SCP) e polpa de madeira quimiomecânica (CGP). A polpa é preferencialmente polpa kraft de madeira dura, polpa kraft de madeira macia, polpa de sulfito (SP) ou polpa semiquímica (SCP) e, de maior preferência, polpa kraft branqueada de folhas (LBKP) ou polpa kraft branqueada de oxigênio com agulhas (NOKP).

[0031] Exemplos do material de partida lignocelulósico diferente de polpa, com base em madeira, incluem flocos ou cascas geradas de árvores de fabricação de papel, resíduos florestais e madeira desbastada; brotos gerados a partir de tocos de plantas lenhosas; serragem ou serragem gerada por serrarias; e folhas e ramos podados de arborização pública e resíduos de construção. É possível utilizar, como material de partida lignocelulósico com base em madeira, plantas do gênero Eucalyptus (Eucalyptus), plantas do gênero Salix (Salix), plantas do gênero álamo, plantas do gênero Acacia (Acacia), plantas do gênero Cryptomeria (Cryptomeria) e similares. Destas, plantas do gênero Eucalyptus, plantas do gênero Acacia e plantas do gênero Salix são preferíveis, por serem de fácil coleta em grandes quantidades como materiais de partida. Exemplos do material de partida herbáceo incluem resíduos agrícolas, tais como kenaf, palha de arroz, palha, espigas de milho e bagaço; resíduos e sobras de safras industriais, tais como safras oleaginosas e borracha (por exemplo, resíduo sólido produzido (EFB)); e safras de energia herbáceas, tais como Erianthus, Miscanthus e capim elefante.

[0032] O material de partida lignocelulósico diferente da polpa pode ser biomassa. Exemplos da biomassa incluem papel derivado de madeira, papel usado, lodo de polpa, lodo, lodo de esgoto, resíduos alimentícios e similares. Essas biomassas podem ser utilizadas isoladamente ou uma série delas pode ser utilizada em combinação. A biomassa pode ser um sólido seco, sólido que contém umidade ou calda.

[0033] Os materiais de partida lignocelulósicos diferentes da polpa mencionada acima são preferencialmente utilizados depois de submetidos a tratamento prévio (tratamento de delignina etc.).

[0034] A concentração do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação no tanque de reação é de preferencialmente 5 a 30% em massa, de maior preferência 10 a 20% em massa. A definição da concentração do material de partida lignocelulósico a 5% em massa ou mais é conveniente para evitar o problema de que a concentração do produto seja finalmente baixa demais, gerando aumento do custo da concentração de etanol. A definição da concentração do material de partida lignocelulósico a 30% em massa ou menos é conveniente para evitar o problema de dificuldade de agitação do material de partida à medida que a concentração aumento, gerando baixa produtividade.

ENZIMA DE SACARIFICAÇÃO

[0035] A enzima de sacarificação não é particularmente limitada, desde que seja enzima celulolítica ou hemicelulolítica. Exemplos da enzima celulolítica incluem a chamada celulase, que possui atividade de celobio-hidrolase, atividade de endoglucanase, atividade de beta-glicosidase e similares.

[0036] Cada enzima celulolítica pode ser adicionada em quantidade apropriada de uma enzima que possui cada atividade. Como a maior parte da enzima celulolítica disponível comercialmente possui as diversas atividades de celulase mencionadas acima, bem como atividade de hemicelulase, pode ser utilizado o agente de enzima celulolítica disponível comercialmente.

[0037] Exemplos de agente de enzima celulolítica disponível comercialmente incluem agentes de enzima celulolítica derivados do gênero Trichoderma (Trichoderma), gênero Acremonium (Acremonium), gênero Aspergillus (Aspergillus), gênero Phanerochaete (Phanerochaete), gênero Trametes (Trametes), gênero Humicola (Humicola), gênero Bacillus (Bacillus), gênero Irpex (Irpex) e similares. Exemplos de produtos comerciais dessa enzima celulolítica incluem celulase Leucina Celular T2 (fabricada pela HPI Co., Ltd.), Novozyme 188 (fabricada pela Novozymes A/S), Multifect CX10L (fabricada pela Genencor International, Inc.) e GC220 (fabricada pela Genencor International, Inc.) (todos nomes comerciais).

[0038] A enzima de sacarificação utilizada pode ser empregada isoladamente ou em combinação, considerando as propriedades do agente de enzima celulolítica. Na presente invenção, existem dois tipos de enzimas: uma enzima de sacarificação adicionada no estágio inicial de múltiplas fermentações paralelas e uma enzima de sacarificação adicional agregada contínua ou intermitentemente após um certo período de tempo. Os tipos dessas enzimas de sacarificação podem, entretanto, ser idênticos ou diferentes.

[0039] A atividade da enzima de sacarificação na presente invenção é definida conforme segue.

[0040] Realizou-se reação a 33 °C por quatro horas em um total de 10 ml de sistema, em que 375 µl de uma solução de enzima e 0,5 g de polpa kraft branqueada de folhas (LBKP) foram adicionados a 8 ml de uma solução aquosa (pH 4,8) que contém 1,5 ml de 1 M tampão de acetato. A reação foi suspensa em seguida por meio de aquecimento a 95 °C por dez minutos. Este produto de reação é analisado por meio de cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC) (Prominence, fabricada pela Shimadzu Corporation), utilizando um detector de índice de refração (RI) diferencial e a concentração de glicose é medida. Com base nos resultados de medição, a quantidade de proteína de enzima que produz 1 µmol de glicose por minuto é definida como 1 unidade (U).

[0041] As condições de medição para HPLC são as seguintes: - Coluna: 80 Shodex AÇÚCAR SP0810 (fabricada pela Showa Denko K. K.) - Fase móvel: água ultrapura - Velocidade de fluxo: 0,8 ml/min - Temperatura: 80 °C

[0042] O teor inicial da enzima de sacarificação no líquido de fermentação do tanque de reação não é particularmente limitado e é preferencialmente de 50 a 500 U/l, de maior preferência 100 a 300 U/l.

[0043] A razão entre o teor inicial da enzima de sacarificação e o teor inicial do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação do tanque de reação (teor inicial (U) da enzima de sacarificação/teor inicial (kg) do material de partida lignocelulósico) é preferencialmente de 500 a 50.000 U/kg e, de maior preferência, 1000 a 30.000 U/kg.

LEVEDURA

[0044] A levedura não é particularmente limitada e é preferencialmente capaz de fermentar sacarídeos (hexose e pentose).

Especificamente, exemplos da levedura incluem leveduras do gênero Saccharomyces, tais como Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), leveduras do gênero Pichia, tais como Pichia stipitis (Pichia stipitis), leveduras do gênero Candida, tais como Candida shihatae (Candida shihatae), leveduras do gênero Pachysolen, tais como Pachysolen tannophilus (Pachysolen tannophilus), e leveduras do gênero Isachenkia, tais como Issatchenkia orientalis (Issatchenkia orientalis). Destas, leveduras pertencentes ao gênero Saccharomyces e ao gênero Issatchenkia são preferíveis e Saccharomyces cerevisiae e Issatchenkia orientalis são de maior preferência. É também possível utilizar uma levedura geneticamente modificada preparada utilizando-se tecnologia de recombinação genética. É possível utilizar, como levedura geneticamente modificada, uma levedura capaz de fermentar simultaneamente hexose e pentose sem limitação específica.

[0045] É preferível utilizar líquido de cultivo de levedura como a levedura utilizada na etapa de múltiplas fermentações paralelas. Esse líquido de cultivo de levedura pode ser obtido por meio de cultivo de forma escalonada, utilizando tanques de cultivo com tamanhos diferentes, de forma que a quantidade de adição seja apropriada para a etapa acima. O cultivo, por exemplo, é primeiramente realizado em quantidade de 100 a 300 ml, o cultivo é realizado em seguida na quantidade de 10 a 30 l, utilizando o líquido de cultivo obtido, e o cultivo é realizado em seguida na quantidade de 500 a 1000 l, utilizando o líquido de cultivo obtido desta forma, e o líquido de cultivo assim obtido pode ser utilizado na etapa de múltiplas fermentações paralelas.

[0046] O pH do líquido de fermentação no tanque de reação na etapa de múltiplas fermentações paralelas não é particularmente limitado e é preferencialmente mantido na faixa de 3 a 10, de maior preferência 4 a 8.

[0047] A temperatura do líquido de fermentação no tanque de reação na etapa de múltiplas fermentações paralelas não é particularmente limitada, desde que se encontre dentro da faixa de temperatura ideal da enzima de sacarificação e/ou da levedura e é preferencialmente de 20 a 40 °C, de maior preferência 30 a 40 °C.

[0048] A quantidade de células bacterianas no tanque de reação na etapa de múltiplas fermentações paralelas não é particularmente limitada e é preferencialmente de 107 células/ml ou mais, de maior preferência 108 células/ml ou mais. A faixa da quantidade de células bacterianas é preferencialmente de 107 a 109 células/ml, de maior preferência de 108 a 109 células/ml.

[0049] A velocidade de aumento do teor de sólidos (sólidos suspensos (SS)) do líquido de fermentação na etapa de múltiplas fermentações paralelas não é particularmente limitada e pode estar na faixa de -1 a 5 kg/h e, preferencialmente, 0 a 5 kg/h. Neste ponto, SS indica um sólido suspenso existente no líquido de fermentação.

[0050] A concentração de glicose na etapa de múltiplas fermentações paralelas não é particularmente limitada e pode estar na faixa de 0 a 0,2% massa/volume.

[0051] A etapa de múltiplas fermentações paralelas é preferencialmente um sistema contínuo e pode ser um sistema de semibateladas ou um sistema de bateladas. Neste ponto, o sistema contínuo designa, por exemplo, uma realização na qual a alimentação de materiais de partida e a produção de etanol prosseguem. O tempo de reação varia de acordo com a concentração de enzima e é preferencialmente de 12 a 240 horas, de maior preferência 24 a 120 horas, no caso do sistema de bateladas. No caso do sistema de semibateladas e do sistema contínuo, o tempo de retenção médio é preferencialmente de 12 a 240 horas e, de maior preferência, 24 a 120 horas. O tempo de retenção médio designa no presente tempo de retenção médio em que o material de partida lignocelulósico permanece no tanque de reação do tempo em que ele é alimentado para o tanque de reação até o tempo em que é transferido para fora do tanque de reação.

[0052] A presente invenção inclui, na etapa de múltiplas fermentações paralelas, adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional a um líquido de fermentação que compreende um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura, de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja mantido dentro de uma faixa previamente definida. O valor de propriedade física não é particularmente limitado e é preferencialmente a concentração de etanol e/ou a viscosidade do líquido de fermentação do ponto de vista de manutenção da quantidade de enzima necessária por quantidade de produção de etanol em nível constante.

[0053] Quando o valor da propriedade física do líquido de fermentação for a concentração de etanol, é preferível adicionar uma enzima de sacarificação adicional, de forma que a concentração de etanol (valor relativo) do líquido de fermentação seja mantida em 80% ou mais com relação à concentração de etanol no momento de assumir estado estável após o início da fermentação. A concentração de etanol, de maior preferência, é de 85% ou mais.

O momento de medição da concentração de etanol não é particularmente limitado e é adequadamente, por exemplo, de 300 a 500 horas após o início da fermentação. A concentração de etanol do líquido de fermentação pode ser medida por meio da amostragem de pelo menos 1 ml do líquido de fermentação do tanque de reação, suspensão da reação e, em seguida, análise do sobrenadante por meio de HPLC. Essa medição pode ser facilmente realizada utilizando-se Prominence (Shimadzu Corporation).

[0054] Neste ponto, o “momento de assumir estado estável após o início da fermentação” mencionado acima é o momento em que a concentração de etanol atinge em primeiro lugar o valor máximo após o início da fermentação e indica preferencialmente o momento em que a faixa de flutuação da concentração de etanol permanece em menos de 20% em seguida. É possível alterar adequadamente o momento de assumir estado estável após o início da fermentação de acordo com as condições de reação e similares. O momento é, por exemplo, de 12 a 240 horas, preferencialmente 24 a 120 horas, após o início da fermentação.

[0055] Segundo uma realização da presente invenção, a quantidade da enzima de sacarificação adicional a ser adicionada é preferencialmente tal que a unidade básica de enzima (U/l) no líquido de fermentação seja mantida em 0,1 a 30% como valor relativo à unidade básica de enzima, por exemplo, após 1 a 12 horas, preferencialmente 1 a 8 horas, a partir do início da fermentação. A unidade básica de enzima designa no presente a quantidade de enzima necessária para produzir uma unidade de volume de etanol. A unidade básica de enzima é utilizada como índice do custo da enzima e pode ser preferencialmente calculada a partir da fórmula a seguir: Unidade básica de enzima (U/l) = quantidade total (U) de enzima de sacarificação/quantidade total (U) de etanol produzido (l)

[0056] Do ponto de vista de supressão do custo da enzima, é particularmente conveniente que seja possível produção de etanol eficiente para realizar reação enzimática, de forma que a unidade básica de enzima seja continuamente reduzida. A quantidade da enzima de sacarificação adicional é preferencialmente definida de forma que a unidade básica de enzima (quantidade relativa) do líquido de fermentação seja, por exemplo, de 0,1 a 30%, preferencialmente 0,1 a 10% e, de maior preferência, 0,1 a 2%, com relação à unidade básica de enzima após 1 a 12 horas a partir do início da fermentação.

O momento de cálculo da unidade básica de enzima não é particularmente limitado e é adequadamente definido, por exemplo, em 300 a 500 horas.

[0057] A quantidade da enzima de sacarificação adicional a ser adicionada pode ser definida, por exemplo, em 20 U ou menos, preferencialmente 1 U ou mais e 15 U ou menos, de maior preferência 3 U ou mais e 10 U ou menos, por 1 l do líquido de fermentação. A quantidade da enzima de sacarificação adicional a ser agregada pode ser calculada no presente na forma de quantidade de adição da enzima de sacarificação adicional a ser agregada por dia. Além disso, a quantidade da enzima de sacarificação adicional pode ser adequadamente definida de acordo com a temperatura, pH, tempo, propriedades e combinações das enzimas e similares da etapa de múltiplas fermentações paralelas.

[0058] A razão em massa entre a quantidade de adição da enzima de sacarificação adicional por dia e o teor inicial da enzima de sacarificação no líquido de fermentação (quantidade de adição da enzima de sacarificação adicional por dia: teor inicial de enzima de sacarificação no líquido de fermentação) não é particularmente limitada, sendo preferencialmente de 1:10 a 1:100, de maior preferência de 1:15 a 1:80 e, de preferência ainda maior, 1:15 a 1:50.

[0059] A adição da enzima de sacarificação adicional é realizada de forma contínua ou intermitente. Quando a adição da enzima de sacarificação adicional for realizada intermitentemente no presente, a adição da enzima de sacarificação adicional é preferencialmente realizada a cada 2 a 192 horas, de maior preferência a cada 6 a 96 horas e, de preferência ainda maior, a cada 12 a 48 horas.

[0060] É preferível iniciar a adição da enzima de sacarificação adicional de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja medido e o valor medido seja mantido dentro de uma faixa previamente definida.

[0061] A viscosidade do líquido de fermentação pode ser também utilizada como índice para adição da enzima de sacarificação adicional.

Pode-se considerar o uso da viscosidade como índice relativo ao grau de progresso de sacarificação do material de partida lignocelulósico. Quando o valor de propriedade física do líquido de fermentação for a viscosidade do líquido de fermentação, a viscosidade pode ser adequadamente determinada de acordo com as condições de agitação, condições de reação e similares.

Quando a viscosidade exceder 140 cP, entretanto, a enzima de sacarificação adicional é preferencialmente adicionada ao líquido de fermentação. O índice de viscosidade pode ser utilizado de forma particularmente conveniente quando a reação na etapa de múltiplas fermentações paralelas for um sistema contínuo.

Quando a etapa de múltiplas fermentações paralelas for um sistema de semibateladas ou sistema de bateladas, a viscosidade do líquido de fermentação pode ser adequadamente determinada de acordo com as condições de agitação, condições de reação e similares. Quando a viscosidade exceder 4 cP, entretanto, a enzima de sacarificação adicional é preferencialmente adicionada ao líquido de fermentação.

[0062] Quando o valor de propriedade física do líquido de fermentação for a viscosidade, a viscosidade pode ser adequadamente determinada de acordo com as condições de agitação, condições de reação e similares. A faixa previamente definida mencionada acima é, entretanto, preferencialmente de 300 cP ou menos como viscosidade do líquido de fermentação. A viscosidade é, de maior preferência, 250 cP ou menos. A faixa de viscosidade pode ser convenientemente utilizada quando a reação na etapa de múltiplas fermentações paralelas for um sistema contínuo. Quando a reação na etapa de múltiplas fermentações paralelas for um sistema de semibateladas ou sistema de bateladas, é preferível agregar uma enzima de sacarificação adicional ao líquido de fermentação, de forma que a viscosidade do líquido de fermentação seja de 20 cP ou menos.

[0063] A viscosidade do líquido de fermentação pode ser medida por meio da amostragem de pelo menos 10 ml do líquido de fermentação do tanque de reação e sua submissão direta à medição da viscosidade com um viscosímetro. Essa medição pode ser facilmente realizada utilizando-se um viscosímetro (Viscosímetro LV-T tipo B analógico, Brookfield). A medição da viscosidade é realizada sob temperatura de 25 °C.

[0064] Na etapa de múltiplas fermentações paralelas, é preferível ajustar a concentração do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação de forma a mantê-la dentro de uma faixa previamente determinada.

A faixa previamente determinada é de 5 a 30% em massa, preferencialmente de 10 a 20% em massa. O ajuste é realizado, por exemplo, por meio da alimentação de material de partida lignocelulósico ao tanque de reação. Neste ponto, a velocidade de alimentação do material de partida lignocelulósico ao tanque de reação não é particularmente limitada. Quando a etapa de múltiplas fermentações paralelas for um sistema contínuo e o líquido de fermentação for descarregado do tanque de reação, entretanto, é preferível que a velocidade de alimentação do material de partida lignocelulósico para o tanque de reação e a velocidade de descarga do líquido de fermentação do tanque de reação estejam no mesmo nível. Conforme exibido abaixo, na etapa de separação de sólidos e líquidos, quando o líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado for recuperado após a separação da solução aquosa de etanol e transferido em seguida para o tanque de reação, é preferível que a velocidade total de alimentação do líquido de fermentação com concentração do teor de sólidos e do material de partida lignocelulósico para o tanque de reação e a velocidade de descarga do líquido de fermentação do tanque de reação estejam no mesmo nível.

[0065] Segundo uma realização da presente invenção, do ponto de vista de crescimento de leveduras ou do ponto de vista de evitar o risco de transferência de materiais de partida do tanque de reação em estado não reagido, os tanques de reação nos quais são realizadas múltiplas fermentações paralelas são pelo menos dois tanques conectados entre si. É preferível que pelo menos dois tanques de reação sejam conectados em série. Nesta realização, por exemplo, os tanques de reação correspondentes podem ser conectados em série, de forma que o primeiro líquido de fermentação descarregado de um primeiro tanque de reação seja injetado em um segundo tanque de reação por meio de uma parte de linha.

[0066] É preferível no presente que o primeiro tanque de reação armazene o líquido de fermentação e alimente continuamente o material de partida lignocelulósico adicional. A quantidade de alimentação do material de partida lignocelulósico é preferencialmente ajustada de forma que a concentração do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação no primeiro tanque de reação seja mantida dentro de uma faixa previamente determinada e a faixa previamente determinada mencionada acima é de 5 a 30% em massa, preferencialmente 10 a 20% em massa.

[0067] Além disso, é preferível que o líquido de fermentação no segundo tanque de reação seja um no qual uma parte do líquido de fermentação é transferida continuamente do primeiro tanque de reação.

[0068] Quando pelo menos dois tanques conectados entre si forem utilizados como tanques de reação para múltiplas fermentações paralelas, o valor de propriedade física do líquido de fermentação que é um índice da adição da enzima de sacarificação adicional utiliza preferencialmente o valor de propriedade física do líquido de fermentação no primeiro tanque de reação. O líquido de fermentação no primeiro tanque de reação possui grande proporção do material de partida de lignocelulose não reagido e redução da atividade enzimática tende a afetar o valor de propriedades físicas, cujo uso é conveniente como índice preciso de adição da enzima de sacarificação adicional. A enzima de sacarificação adicional é, portanto, preferencialmente adicionada ao primeiro tanque de reação.

ETAPA DE SEPARAÇÃO DE SÓLIDOS E LÍQUIDOS

[0069] O líquido de fermentação descarregado do tanque de reação pode ser separado em um líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado e uma solução aquosa, tal como um líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado e uma solução aquosa de etanol, por meio de um aparelho de separação tal como aparelho de destilação a vácuo ou aparelho de separação de membranas na etapa de separação de sólidos e líquidos. Quando houver dois tanques de reação, é preferível que o líquido de fermentação seja descarregado do segundo tanque de reação e transferido em seguida para um separador de etanol. É possível utilizar, como aparelho de destilação a vácuo, um evaporador giratório, evaporador por ignição ou similar. Como etanol pode ser separado sob baixa temperatura e pressão reduzida, pode-se evitar a desativação da enzima. A solução aquosa de etanol obtida desta forma pode ser concentrada na etapa de concentração de etanol a seguir.

[0070] O líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado pode ser recuperado após separação da solução aquosa de etanol e transferido em seguida para o tanque de reação como se encontra ou pode ser separado em resíduo e sobrenadante por meio de um dispositivo de remoção do teor de sólidos conforme exibido abaixo. Quando os tanques de reação forem pelo menos dois tanques, o tanque de reação a ser transferido é preferencialmente primeiro tanque de reação.

ETAPA DE CONCENTRAÇÃO DE ETANOL

[0071] A solução aquosa de etanol obtida na etapa de separação de sólidos e líquidos pode ser adicionalmente concentrada por meio de tratamento de destilação ou diversas membranas de separação, tais como membrana de zeólito, de forma a permitir a produção de etanol com alta pureza.

A solução aquosa de etanol pode ser transferida para o tanque de reação após a remoção do etanol.

ETAPA DE REMOÇÃO DO TEOR DE SÓLIDOS

[0072] O líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado após a separação da solução aquosa de etanol na etapa de separação de sólidos e líquidos pode ser transferido para um dispositivo de remoção do teor de sólidos e separado em seguida em um resíduo e um sobrenadante. O sobrenadante obtido desta forma pode ser transferido para um tanque de reação. Quando os tanques forem pelo menos dois tanques, o tanque de reação a ser transferido é preferencialmente primeiro tanque de reação. É possível utilizar, como dispositivo de remoção do teor de sólidos, uma centrífuga do tipo de disco, prensa de rosca, peneira, prensa de filtro, prensa de correia, prensa giratória e similares. O resíduo separado contém uma enzima, lignina e levedura. A enzima adsorvida sobre o resíduo pode ser isolada, recuperada e reutilizada. Lignina pode ser também recuperada na forma de material de partida de combustão e utilizada como energia ou lignina pode ser também recuperada e efetivamente utilizada. A levedura pode ser também separada do resíduo e reutilizada na etapa de múltiplas fermentações paralelas.

[0073] Segundo o método de produção de etanol de acordo com a presente invenção, etanol pode ser eficientemente produzido a partir de material de partida lignocelulósico. O etanol obtido por meio do método de produção de etanol pode ser adequadamente utilizado, por exemplo, como etanol para combustível, etanol para uso industrial, etanol para aditivos alimentícios e similares.

EXEMPLOS

[0074] A presente invenção será descrita com mais detalhes em forma dos Exemplos a seguir, mas a presente invenção não se limita a eles. A menos que especificado em contrário, as unidades e métodos de medição descritos no presente relatório descritivo são baseados nos Padrões Industriais Japoneses (JIS).

MÉTODO DE MEDIÇÃO DA VISCOSIDADE

[0075] A viscosidade de cada líquido de fermentação obtido nos Exemplos e Exemplos Comparativos correspondentes foi medida utilizando-se um viscosímetro (viscosímetro LV-T do tipo B analógico, Brookfield). A medição foi realizada utilizando-se fuso n° 27 em velocidade de rotação de 60 rpm e temperatura de 25 °C.

MÉTODO DE MEDIÇÃO DA TURVAÇÃO

[0076] A turvação SS de cada líquido de fermentação obtido nos Exemplos e Exemplos Comparativos correspondentes foi medida utilizando-se um medidor da turvação (medidor de turvação portátil 2100Q, HACH). A diferença entre a turvação de SS obtida desta forma e a turvação de SS medida antes de 12 horas foi então determinada e a taxa de aumento de SS foi calculada dividindo-se por 12 horas, que é o tempo decorrido entre os dois momentos.

MÉTODO DE MEDIÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS

[0077] O número de células bacterianas em cada líquido de cultivo e cada líquido de fermentação obtido nos Exemplos e Exemplos Comparativos correspondentes foi observado e medido com microscópio óptico (ampliação de 400 vezes) utilizando um hemocitômetro Thoma.

MÉTODO DE MEDIÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE ETANOL E GLICOSE

[0078] Com relação à concentração de glicose e à concentração de etanol no líquido de fermentação, o líquido de fermentação foi aquecido a 95 °C por dez minutos para desativar uma levedura e uma enzima e realizou-se em seguida análise e medição por meio de HPLC (Prominence, fabricado pela

Shimadzu Corporation), utilizando um detector de refratômetro diferencial (RI).

[0079] As condições de medição para HPLC são as seguintes: - Coluna: 80 Shodex AÇÚCAR SP0810 (fabricada pela Showa Denko K. K.) - Fase móvel: água ultrapura - Velocidade de fluxo: 0,8 ml/min - Temperatura: 80 °C

MÉTODO DE CÁLCULO DA UNIDADE BÁSICA DE ENZIMA

[0080] Com relação à unidade básica de enzima a partir do início de múltiplas fermentações paralelas nos Exemplos e Exemplos Comparativos correspondentes até um momento previamente determinado, a unidade básica de enzima (U/l) foi calculada por meio da fórmula de cálculo a seguir, com base na concentração de etanol contida no líquido de fermentação obtido nos Exemplos e Exemplos Comparativos correspondentes: Unidade básica de enzima (U/l) = quantidade total (U) de enzima de sacarificação/quantidade total (l) de etanol produzido

[0081] A unidade básica de enzima é um índice do custo da enzima e indica a quantidade de enzima necessária para produzir uma unidade de capacidade de etanol.

EXEMPLO 1 TESTE EM UM TANQUE DE REAÇÃO DE 5 L (COM ADIÇÃO REPETIDA DE PEQUENA QUANTIDADE DE ENZIMAS DE SACARIFICAÇÃO ADICIONAIS)

[0082] Em um frasco de 500 ml, foram preparados 200 ml de uma solução aquosa de 1% em massa/volume de CSL (milhocina) e 2% em massa/volume de glicose. Levedura Saccharomyces cerevisiae foi inoculada na solução aquosa assim obtida em concentração de 1 x 10 7 células/ml e cultivada por uma noite para preparar cultivo de levedura líquida.

[0083] Foi realizado em seguida um teste de múltiplas fermentações paralelas. Em um tanque de reação de 5 l, 300 g (peso seco total) de polpa kraft branqueada com oxigênio de agulhas (NOKP), 6,6 g de ureia, 395 U de uma enzima de sacarificação e cultivo de levedura líquido que possui concentração final de 1,0 x 107 células/ml foram adicionados e a quantidade do líquido foi ajustada com água estéril, de forma que o volume total fosse de 3 l. O pH foi ajustado em 4,8 com 5N ácido sulfúrico e solução aquosa de 5N hidróxido de sódio. O tanque de cultivo foi controlado para que permanecesse constante sob temperatura de 33 °C, velocidade de agitação de 206 rpm e pH 4,8. Após 48 horas, metade do líquido de fermentação foi extraída uma vez a cada 24 horas, centrifugada com uma centrífuga (Centrífuga Refrigerada de Mesa KUBOTA 5500) e etanol foi removido em seguida do sobrenadante obtido, utilizando um evaporador (Nihon BUCHI K.K., R-300). O sobrenadante do qual foi removido o etanol e o sólido recuperado por meio de centrifugação foram devolvidos para o tanque de reação. Nesse momento, NOKP que possui peso seco absoluto de 150 g, correspondente à metade da quantidade de adição inicial, também foi adicionado ao líquido de fermentação.

[0084] As condições da etapa de múltiplas fermentações paralelas são exibidas abaixo: TABELA 1 Item Valor Concentração de polpa seca, % (p/p) 10 Temperatura, °C 33 Quantidade de adição de enzima inicial, U 395 pH 4,8 Capacidade do sistema, l 3 Tempo de retenção, horas 48

[0085] A partir de 168 horas após o início da reação sob as condições acima, 22 U de uma enzima de sacarificação adicional foram adicionados uma vez a cada 24 horas.

[0086] O líquido de fermentação foi amostrado uma vez a cada 24 horas, seguido por medição da viscosidade, concentração de etanol e concentração de glicose, medição do número de células bacterianas e cálculo adicional da velocidade de aumento de SS.

[0087] Os resultados das medições da viscosidade são exibidos na Fig. 1 e os resultados de medição da concentração de etanol (valor relativo) são exibidos na Fig. 2. Na Fig. 2, a concentração de etanol no momento de assumir estado estável após o início do teste (48 horas após o início do teste) é definida em 1.

[0088] O número de células bacterianas do início até o final das múltiplas fermentações paralelas foi de 1 x 108 a 1 x 109 células/ml. A velocidade de aumento de SS foi de 0,00036 kg/h após 168 horas e 0,00057 kg/h após 288 horas. A concentração de glicose foi de 0,023% massa/volume após 168 horas e 0% massa/volume após 288 horas.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 TESTE EM UM TANQUE DE REAÇÃO DE 5 L (SEM ADIÇÃO DE ENZIMAS DE SACARIFICAÇÃO ADICIONAIS)

[0089] Realizou-se um teste de múltiplas fermentações paralelas por meio do método do Exemplo 1, exceto pela ausência de adição de enzima de sacarificação adicional depois de decorridas 168 horas após o início da reação.

[0090] Os resultados são exibidos nas Figs. 1 e 2.

[0091] O número de células bacterianas do início até o final das múltiplas fermentações paralelas foi de 1 x 108 a 1 x 109 células/ml. As concentrações de glicose foram de 0% massa/volume após 168 e 288 horas.

[0092] Embora a concentração de etanol fosse reduzida nos dois sistemas do Exemplo 1 e Exemplo Comparativo 1, o sistema do Exemplo 1 (com a adição de pequena quantidade de enzima de sacarificação adicional) exibiu redução moderada da concentração de etanol e da viscosidade,

aprimorando o comportamento em comparação com o sistema do Exemplo Comparativo 1 (sem agregar pequena quantidade de enzima de sacarificação adicional), de forma que se considera eficaz a adição de pequena quantidade da enzima de sacarificação adicional.

EXEMPLO COMPARATIVO 2 TESTE EM UM TANQUE DE REAÇÃO COM VOLUME DE 12.000 L (COM UMA ÚNICA ADIÇÃO DE ENZIMA DE SACARIFICAÇÃO ADICIONAL)

[0093] A levedura Saccharomyces cerevisiae utilizada para fermentação foi preparada em três estágios de (1) 200 ml de cultivo utilizando um frasco de 500 ml; (2) 20 l de cultivo utilizando um tanque de cultivo de 30 l; e (3) 800 l de cultivo utilizando um tanque de cultivo de 900 l. Em cada estágio, uma solução aquosa de 1% massa/volume de CSL e 2% massa/volume de glicose foi preparada, inoculada sob concentração de 1 x 10 7 células/ml e cultivada por 12 horas para preparar líquido de cultivo de levedura.

[0094] Foi realizado em seguida um teste de múltiplas fermentações paralelas. Primeiro tanque de reação que possui capacidade máxima de 12.000 l foi preenchido com água esterilizada e, após a adição de 12,6 kg de ureia, iniciou-se a alimentação de polpa kraft branqueada com oxigênio de agulhas (NOKP) em velocidade de 13,75 kg/h em termos de peso seco absoluto, de forma que a concentração de polpa seca fosse de 10% (p/p) depois de decorridas 48 horas após o tempo de retenção. Após o ajuste do pH em 4,8 por meio da adição de 3N ácido sulfúrico e uma solução aquosa de 3N hidróxido de sódio, 878.735 U de uma enzima de sacarificação e a quantidade total do líquido de cultivo de levedura preparado no tanque de cultivo de 900 l foram adicionados para iniciar a reação. O tanque de reação foi controlado para que permanecesse constante sob temperatura de 33 °C, velocidade de agitação de 24 rpm e pH 4,8. Depois de decorridas 48 horas, metade da quantidade do primeiro tanque de reação foi transferida para um segundo tanque de reação que possui, no máximo, 10.000 l. Após o término da transferência para o segundo tanque de reação, iniciou-se a transferência do líquido de fermentação do segundo tanque de reação para uma coluna de destilação a vácuo sob velocidade de 140 kg/h e, em seguida, as operações de destilação de uma solução aquosa de etanol sob velocidade de 45 kg/h e coleta de líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado para o primeiro tanque de reação sob velocidade de 95 kg/h prosseguiram até a suspensão da operação. Durante esse período, a alimentação para o primeiro tanque de reação de NOKP prosseguiu sob velocidade constante (45 kg/h).

[0095] As condições da etapa de múltiplas fermentações paralelas são exibidas abaixo: TABELA 2 Item Valor Concentração de polpa seca, % (p/p) 10 Temperatura, °C 33 Quantidade de adição de enzima inicial, U 878.735 pH 4,8 Capacidade total do sistema, l 6.600 Número de tanques 2 Tempo de retenção, horas 48

[0096] Depois de decorridas 222 horas após o início da reação, como a concentração de etanol no primeiro tanque de reação foi significativamente reduzida, foram novamente adicionadas 878.735 U da enzima.

[0097] O líquido de fermentação foi amostrado em primeiro lugar após 6 horas e amostrado em seguida uma vez a cada 12 horas, seguido por medição da viscosidade, concentração de etanol e concentração de glicose, medição do número de células bacterianas e cálculo adicional da velocidade de aumento de SS.

[0098] Os resultados da medição da viscosidade do primeiro tanque de reação são exibidos na Fig. 3, os resultados de medição da concentração de etanol (valor relativo) do primeiro tanque de reação são exibidos na Fig. 4 e os resultados da unidade básica de enzima (valor relativo) são exibidos na Fig. 5. Na Fig. 4, a concentração de etanol no momento de assumir estado estável após o início do teste (54 horas após o início do teste) é definida em 1. Na Fig. 5, a unidade básica de enzima (U/l) em 6 horas após o início do teste é definida em 1.

[0099] O número de células bacterianas no primeiro tanque de reação do início até o final das múltiplas fermentações paralelas foi de 1 x 10 8 a 1 x 109 células/ml. As velocidades de aumento de SS do primeiro tanque de reação foram de 0,335 kg/h em 222 horas e 0,0093 kg/h em 498 horas. As concentrações de glicose foram de 0,142% massa/volume após 222 horas e 0,075% massa/volume após 498 horas.

[00100] Embora 878.735 U da enzima fossem adicionados de uma vez, obteve-se efeito de aumento da produtividade apenas temporário.

Concluiu-se, portanto, que, mesmo se for adicionada grande quantidade de uma vez, não poderá ser obtido efeito proporcional à quantidade adicionada.

EXEMPLO 2 TESTE EM UM TANQUE DE REAÇÃO COM VOLUME DE 12.000 L (COM ADIÇÃO REPETIDA DE PEQUENA QUANTIDADE DE ENZIMAS DE SACARIFICAÇÃO ADICIONAIS)

[00101] A levedura Saccharomyces cerevisiae utilizada para fermentação foi preparada em três estágios de (1) 200 ml de cultivo utilizando um frasco de 500 ml; (2) 20 l de cultivo utilizando um tanque de cultivo de 30 l; e (3) 800 l de cultivo utilizando um tanque de cultivo de 900 l. Em cada estágio, uma solução aquosa de 1% massa/volume de CSL e 2% massa/volume de glicose foi preparada, inoculada sob concentração de 1 x 10 7 células/ml e cultivada por 12 horas para preparar líquido de cultivo de levedura.

[00102] Foi realizado em seguida um teste de múltiplas fermentações paralelas. Primeiro tanque de reação que possui capacidade máxima de 12.000 l foi preenchido com água esterilizada e, após a adição de 14 kg de ureia e 63 kg de CSL, iniciou-se a alimentação de polpa kraft branqueada com folha (LBKP) em velocidade de 15,2 kg/h em termos de peso seco absoluto, de forma que a concentração de polpa seca fosse de 10% (p/p) depois de decorridas 48 horas após o tempo de retenção. Após o ajuste do pH em 4,8 por meio da adição de 3N ácido sulfúrico e uma solução aquosa de 3N hidróxido de sódio, 966.608 U de uma enzima de sacarificação e a quantidade total do líquido de cultivo de levedura preparado no tanque de cultivo de 900 l foram adicionados para iniciar a reação. O tanque de reação foi controlado para que permanecesse constante sob temperatura de 33 °C, velocidade de agitação de 24 rpm e pH 4,8. Depois de decorridas 48 horas, metade da quantidade do primeiro tanque de reação foi transferida para um segundo tanque de reação que possui, no máximo, 10.000 l. Após o término da transferência para o segundo tanque de reação, iniciou-se a transferência do líquido de fermentação do segundo tanque de reação para uma coluna de destilação a vácuo sob velocidade de 150 kg/h e, em seguida, as operações de destilação de uma solução aquosa de etanol sob velocidade de 40 kg/h e coleta de líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado para o primeiro tanque de reação sob velocidade de 110 kg/h prosseguiram até a suspensão da operação.

Durante esse período, a alimentação do líquido que contém LBKP para o primeiro tanque de reação prosseguiu sob velocidade constante (40 kg/h).

[00103] As condições da etapa de dupla fermentação paralela são exibidas abaixo: TABELA 3 Item Valor Concentração de polpa seca, % (p/p) 10 Temperatura, °C 33 Quantidade de adição de enzima inicial, U 966.608 pH 4,8 Capacidade total do sistema, l 7.300

Item Valor Número de tanques 2 Tempo de retenção, horas 48

[00104] Depois de decorridas 354 horas após o início da reação, iniciou-se a adição de pequena quantidade da enzima de sacarificação adicional.

A enzima de sacarificação adicional foi agregada ao primeiro tanque de reação.

A enzima foi adicionada em quantidade de 49.210 U a cada 24 horas.

[00105] O líquido de fermentação foi amostrado em primeiro lugar após 6 horas e amostrado em seguida uma vez a cada 12 horas, seguido por medição da viscosidade, concentração de etanol e concentração de glicose, medição do número de células bacterianas e cálculo adicional da velocidade de aumento de SS.

[00106] Os resultados da medição da viscosidade do primeiro tanque de reação são exibidos na Fig. 6, os resultados de medição da concentração de etanol (valor relativo) do primeiro tanque de reação são exibidos na Fig. 7 e os resultados da unidade básica de enzima (valor relativo) são exibidos na Fig. 8. Na Fig. 7, a concentração de etanol no momento de assumir estado estável após o início do teste (54 horas após o início do teste) é definida em 1. Na Fig. 8, a unidade básica de enzima (U/l) em 6 horas após o início do teste é definida em 1.

[00107] O número de células bacterianas no primeiro tanque de reação do início até o final da fermentação dupla paralela foi de 1 x 108 a 1 x 109 células/ml. As velocidades de aumento de SS do primeiro tanque de reação foram de 0,16 kg/h após 354 horas e 0,24 kg/h após 546 horas. As concentrações de glicose foram de 0,079% massa/volume após 354 horas e 0,097% massa/volume após 546 horas.

[00108] Foi possível confirmar a retenção da concentração de etanol e o menor aumento da viscosidade devido à adição repetida de pequena quantidade da enzima de sacarificação adicional.

EXEMPLO 3 TESTE EM UM TANQUE DE REAÇÃO COM VOLUME DE 12.000 L (COM ADIÇÃO REPETIDA DE PEQUENA QUANTIDADE DE ENZIMAS DE SACARIFICAÇÃO ADICIONAIS)

[00109] A levedura Saccharomyces cerevisiae utilizada para fermentação foi preparada em três estágios de (1) 200 ml de cultivo utilizando um frasco de 500 ml; (2) 20 l de cultivo utilizando um tanque de cultivo de 30 l; e (3) 800 l de cultivo utilizando um tanque de cultivo de 900 l. Em cada estágio, uma solução aquosa de 1% massa/volume de CSL e 2% massa/volume de glicose foi preparada, inoculada sob concentração de 1 x 10 7 células/ml e cultivada por 12 horas para preparar líquido de cultivo de levedura.

[00110] Foi realizado em seguida um teste de múltiplas fermentações paralelas. Primeiro tanque de reação que possui capacidade máxima de 12.000 l foi preenchido com água esterilizada e, após a adição de 14 kg de ureia e 137 kg de CSL, iniciou-se a alimentação de polpa kraft branqueada com folhas (LBKP) em velocidade de 15,2 kg/h em termos de peso seco absoluto, de forma que a concentração de polpa seca fosse de 10% (p/p) depois de decorridas 48 horas após o tempo de retenção. Após o ajuste do pH em 4,8 por meio da adição de 3N ácido sulfúrico e uma solução aquosa de 3N hidróxido de sódio, 799.649 U de uma enzima de sacarificação e a quantidade total do líquido de cultivo de levedura preparado no tanque de cultivo de 900 l foram adicionados para iniciar a reação. O tanque de reação foi controlado para que permanecesse constante sob temperatura de 33 °C, velocidade de agitação de 24 rpm e pH 4,8. Depois de decorridas 48 horas, metade da quantidade do primeiro tanque de reação foi transferida para um segundo tanque de reação que possui, no máximo, 10.000 l. Após o término da transferência para o segundo tanque de reação, iniciou-se a transferência do líquido de fermentação do segundo tanque de reação para uma coluna de destilação a vácuo sob velocidade de 150 kg/h e, em seguida, as operações de destilação de uma solução aquosa de etanol sob velocidade de 40 kg/h e coleta de líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado para o primeiro tanque de reação sob velocidade de 110 kg/h prosseguiram até a suspensão da operação.

[00111] As condições da etapa de dupla fermentação paralela são exibidas abaixo: TABELA 4 Item Valor Concentração de polpa seca, % (p/p) 10 Temperatura, °C 33 Quantidade de adição de enzima inicial, U 799.649 pH 4,8 Capacidade total do sistema, l 7.300 Número de tanques 2 Tempo de retenção, horas 48

[00112] Depois de decorridas 282 horas após o início da reação, iniciou-se a adição de pequena quantidade da enzima de sacarificação adicional.

A enzima foi adicionada em quantidade de 49.210 U a cada 24 horas.

[00113] O líquido de fermentação foi amostrado em primeiro lugar após 6 horas e amostrado em seguida uma vez a cada 12 horas, seguido por medição da viscosidade, concentração de etanol e concentração de glicose, medição do número de células bacterianas e cálculo adicional da velocidade de aumento de SS.

[00114] Os resultados da medição da viscosidade do primeiro tanque de reação são exibidos na Fig. 9, os resultados de medição da concentração de etanol (valor relativo) do primeiro tanque de reação são exibidos na Fig. 10 e os resultados da unidade básica de enzima (valor relativo) são exibidos na Fig. 11. Na Fig. 10, a concentração de etanol no momento de assumir estado estável após o início do teste (54 horas após o início do teste) é definida em 1. Na Fig. 11, a unidade básica de enzima (U/l) em 6 horas após o início do teste é definida em 1.

[00115] O número de células bacterianas no primeiro tanque de reação do início até o final da fermentação dupla paralela foi de 1 x 10 8 a 1 x 109 células/ml. As velocidades de aumento de SS do primeiro tanque de reação foram de -0,31 kg/h após 282 horas e 0,83 g/h após 474 horas. As concentrações de glicose foram de 0,076% massa/volume após 282 horas e 0,039% massa/volume após 474 horas.

[00116] Foi possível confirmar a retenção da concentração de etanol e o menor aumento da viscosidade devido à adição repetida de pequena quantidade da enzima de sacarificação adicional.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL a partir de um material de partida lignocelulósico, caracterizado por compreender: - uma etapa de realização de múltiplas fermentações paralelas, mediante adição contínua ou intermitente de uma enzima de sacarificação adicional a um líquido de fermentação que compreende um material de partida lignocelulósico, uma enzima de sacarificação e uma levedura, de forma que o valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação seja mantido dentro de uma faixa previamente definida.

2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo valor de propriedade física do próprio líquido de fermentação ser a concentração de etanol e/ou viscosidade.

3. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pela enzima de sacarificação adicional ser adicionada de forma que a concentração de etanol do líquido de fermentação seja mantida em 80% ou mais com relação à concentração de etanol no momento de assumir estado estável após o início da fermentação.

4. MÉTODO de produção de etanol de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela enzima de sacarificação adicional ser adicionada de forma que uma unidade básica de enzima no líquido de fermentação seja mantida em 0,1 a 30% com relação à unidade básica de enzima em 1 a 12 horas após o início da fermentação.

5. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela razão em massa entre a quantidade de adição da enzima de sacarificação adicional por dia e o teor inicial da enzima de sacarificação no líquido de fermentação (quantidade de adição da enzima de sacarificação adicional por dia: teor inicial de enzima de sacarificação no líquido de fermentação) ser de 1:10 a 1:100.

6. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela enzima de sacarificação adicional ser adicionada ao líquido de fermentação em quantidade de 20 U/l ou menos.

7. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela enzima de sacarificação adicional ser agregada intermitentemente a cada 2 a 192 horas

8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela adição da enzima de sacarificação adicional ao líquido de fermentação ser iniciada quando a viscosidade do líquido de fermentação exceder 140 cP.

9. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela concentração do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação ser ajustada de forma a ser mantida dentro de uma faixa previamente determinada.

10. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela concentração do material de partida lignocelulósico no líquido de fermentação ser ajustada de forma a ser mantida em 5 a 30% em massa.

11. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelas múltiplas fermentações paralelas serem realizadas em pelo menos dois tanques de reação conectados entre si.

12. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por pelo menos dois tanques de reação serem conectados em série.

13. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12, caracterizado por pelo menos dois tanques de reação compreenderem primeiro tanque de reação que armazena o líquido de fermentação, no qual o material de partida lignocelulósico adicional é alimentado continuamente.

14. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, caracterizado por pelo menos dois tanques de reação compreenderem segundo tanque de reação ao qual uma parte do líquido de fermentação é transferida continuamente do primeiro tanque de reação.

15. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa a seguir: - uma etapa de separação de sólidos e líquidos de uma solução aquosa de etanol do líquido de fermentação; em que a etapa compreende a transferência do líquido de fermentação com teor de sólidos concentrado para o tanque de reação após a separação da solução aquosa de etanol.