BR112020026704A2 - Processo para produzir isolados de beta-lactoglobulina e métodos e usos relacionados - Google Patents

Processo para produzir isolados de beta-lactoglobulina e métodos e usos relacionados Download PDF

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liquid
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Kasper Bøgelund Lauridsen
Søren Bang Nielsen
Kåre Søndergaard
Guilherme De Moura Maciel
Hans Bertelsen
Behnaz Razi Parjikolaei
Tanja Christine Jæger
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Arla Foods Amba
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Abstract

processo para produzir isolados de betalactoglobulina e métodos e usos relacionados. a presente invenção se refere a novos isolados de beta-lactoglobulina (blg) assim como a um método para produzir tais isolados e se refere aos usos dos pós, por exemplo, em aplicações em bebidas.

Description

1 / 172 PROCESSO PARA PRODUZIR ISOLADOS DE BETA-
LACTOGLOBULINA E MÉTODOS E USOS RELACIONADOS Campo da Invenção
[001] A presente invenção se refere a novos isolados de beta- lactoglobulina (BLG) assim como a um método para produzir tais isolados e a usos dos pós, por exemplo, em aplicações em bebidas. Fundamentos
[002] A BLG é conhecida como o componente formador de gel da proteína de soro de queijo (whey) e é propensa a agregação e a formação de gel indesejáveis até mesmo à temperatura de pasteurização. Os isolados de BLG são percebidos como mais termicamente sensíveis do que os isolados de proteína de soro de queijo tradicionais que contêm as proteínas mais termicamente resistentes alfa-lactalbumina (ALA) e caseinomacropeptídeo (CMP) além da BLG. Usos alimentícios industriais de isolados de BLG foram anteriormente limitados devido a um alto preço dos isolados de BLG e ao manuseio problemático dos isolados de BLG secados por congelamento.
[003] O isolamento de beta-lactoglobulina (BLG) do soro do leite ou soro de queijo é tema de diversas publicações e tipicamente envolve múltiplas etapas de separação e muitas vezes técnicas cromatográficas para chegar a um produto de beta-lactoglobulina purificado.
[004] Por exemplo, de Jongh et al (Mild Isolation Procedure Discloses New Protein Structural Properties of β-Lactoglobulin [Procedimento de isolamento leve revela novas propriedades estruturais proteicas da β-lactoglobulina], J Dairy Sci., vol. 84(3), 2001, páginas 562- 571) descreveu a purificação de BLG a partir de leite recentemente ordenhado por meio de coagulação ácida a baixa temperatura de caseína e submetendo-se o soro de queijo ácido obtido a uma combinação de cromatografia de afinidade (DEAE Sepharose) e cromatografia de permeação em gel. A composição de BLG obtida foi declarada como contendo 0,985 g de beta-
2 / 172 lactoglobulina por 1 g de proteína. A composição de BLG foi secada por secagem por congelamento.
[005] Vyas et al (Scale-Up of Native β-Lactoglobulin Affinity Separation Process [Escalamento do processo de separação por afinidade da β-lactoglobulina nativa], J. Dairy Sci. 85:1639–1645, 2002) revelou um método escalado para produzir BLG nativa com base em cromatografia de afinidade. A composição de BLG foi secada por secagem por congelamento.
[006] O documento US2790790A1 descreveu um processo para isolar BLG do soro de queijo por adição de NaCl em pH 3,6-4,0, mas não descreveu que a BLG isolada era secada.
[007] Palmer (Crystalline Globulin from Cow's Milk [Globulina cristalina do leite da vaca], J. Biol. Chem., Vol. 104, 1934, páginas 359-372) relatou um processo laborioso e demorado para produzir cristais de proteína com base em soro de queijo ácido usando várias sequências de precipitação de sal de proteínas indesejadas, ajustes de pH e diálise para remover outras proteínas indesejadas. Finalmente, quando uma solução de BLG altamente purificada havia sido obtida, a BLG foi cristalizada. O processo durou mais de 12 dias e requereu a adição de tolueno. Os procedimentos revelados em Palmer são, portanto, incompatíveis com uma produção segura de alimentos e provê produtos que claramente não são comestíveis. Palmer relatou que os cristais de BLG poderiam ser secados por meio de álcool e éter.
[008] O documento EP 0 604 684 A1 revelou um processo para a recuperação de concentrado de proteína de soro de queijo enriquecido com alfa-lactalbumina e/ou beta-lactoglobulina proveniente de um produto de proteína de soro de queijo. O processo compreendia a) incubar uma solução que compreende o dito produto de proteína de soro de queijo com uma resina de troca iônica lidadora de cálcio em sua forma ácida para iniciar a desestabilização de alfa-lactalbumina, b) ajustar o pH da solução de produto de proteína tratada a um valor entre 4,3 e 4,8, após a separação da dita resina,
3 / 172 c) incubar a dita solução de produto de proteína a uma temperatura entre 10 e 50 graus C para promover a floculação de alfa-lactalbumina, d) fracionar as proteínas na dita solução de produto de proteína em pH 4,3-4,8, provendo uma fração enriquecida com alfa-lactalbumina e uma fração enriquecida com beta-lactoglobulina, e) elevar o pH da fração enriquecida com alfa- lactalbumina suficientemente para solubilizar a fração de alfa-lactalbumina e f) elevar opcionalmente o pH da fração enriquecida com beta-lactoglobulina suficientemente para neutralizar a fração de beta-lactoglobulina.
[009] O documento WO2010/037736 A1 revelou o isolamento de proteínas de soro de queijo e a preparação de um produto de soro de queijo e um isolado de soro de queijo e, em particular, o isolamento de um produto de beta-lactoglobulina e o isolamento de um isolado de proteína de soro de queijo enriquecido com alfa-lactalbumina do soro de queijo obtido de um animal. O isolado de proteína de soro de queijo enriquecido com alfa- lactalbumina provido pela presente invenção, além de ter um baixo nível de beta-lactoglobulina, tem também um alto nível de alfa-lactalbumina e imunoglobulina G.
[0010] O documento WO2011/112695 (A1) revelou composições nutricionais contendo micelas e leucina de proteína de soro de queijo. As composições nutricionais proveem uma quantidade suficiente de leucina para melhorar a síntese proteica em seres humanos, mantendo, ao mesmo tempo, uma matriz de fluido de baixa viscosidade e propriedades organolépticas aceitáveis. Sumário da Invenção
[0011] Os presentes inventores constataram que pós de isolado de BLG de alta funcionalidade podem ser obtidos secando-se, e preferivelmente por secagem por pulverização, um isolado de BLG líquido com alto nível de BLG que tem uma faixa de pH de i) 2-4,9 ou ii) 6,1-8,5, ou iii) 5,0-6,0.
[0012] Assim, um aspecto da invenção se refere a um pó de isolado de
4 / 172 BLG, preferivelmente preparado por secagem por pulverização, que tem um pH na faixa de i) 2,5-4,9, ii) 6,1-8,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - proteína total em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 10% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo um ou mais dos seguintes itens: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 200 NTU e - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g.
[0013] Um outro aspecto da invenção se refere a um isolado de BLG líquido que tem um pH na faixa de i) 2-4,9, ii) 6,1-8,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - proteína total em uma quantidade de pelo menos 10% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína o dito pó de isolado de BLG tendo um ou mais dos seguintes itens: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 200 NTU e - no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia/g.
5 / 172
[0014] Ainda um aspecto da invenção se refere a um método para produzir um pó de isolado de BLG secado contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, o método compreendendo as etapas de: prover um isolado de BLG líquido que tem i) um pH na faixa de 2-4,9, ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, ou iii) um pH na faixa de 5,0-6,0 o dito isolado de BLG líquido contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, opcionalmente, submeter o isolado de BLG líquido a uma redução microbiana física, secar o isolado de BLG líquido, preferivelmente por secagem por pulverização.
[0015] Um aspecto adicional da invenção se refere ao uso do pó de isolado de BLG ou do isolado de BLG líquido como definido no presente documento como um ingrediente para a produção de um produto alimentício, por exemplo, uma bebida ou um pó de bebida instantânea, com um pH na faixa de 2-4,7 e que adicionalmente tem um ou mais dos seguintes itens: - um nível reduzido de sensação de boca seca, - transparência melhorada e/ou - teor de proteína aumentado, preferivelmente bebidas tratadas termicamente contendo um teor de proteína em uma quantidade de pelo menos 3-45% p/p, mais preferivelmente 11-40% p/p, ainda mais preferivelmente 15-38% p/p e, o mais preferivelmente, 20-36% p/p. Breve Descrição das Figuras
[0016] A Figura 1 provê uma visão geral esquemática do método da invenção para produzir pó de isolado de BLG.
[0017] A Figura 2 provê uma visão geral esquemática do método da
6 / 172 invenção para produzir pó de isolado de BLG partindo de um alimento de proteína de soro de queijo e ilustra a terminologia usada na descrição da patente.
[0018] A Figura 3 é uma foto microscópica dos cristais de BLG.
[0019] A Figura 4 mostra uma foto microscópica dos cristais de BLG, tanto inteiros quanto fragmentados.
[0020] A Figura 5 demonstra que os isolados de BLG secados por pulverização têm uma densidade aparente mais alta do que WPIs comparáveis secados nas mesmas condições.
[0021] A Figura 6 demonstra que os isolados de BLG líquidos com alto nível de proteína têm uma viscosidade mais baixa do que uma solução de WPI comparável. Descrição Detalhada Definições
[0022] No contexto da presente invenção, os termos “beta- lactoglobulina” ou “BLG” se referem à beta-lactoglobulina de espécies mamíferas, por exemplo, em formas nativas, desdobradas e/ou glicosiladas e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural. Os termos incluem ainda BLG agregada, BLG precipitada e BLG cristalina. Ao se referir à quantidade de BLG, é feita referência à quantidade total de BLG incluindo BLG agregada. A quantidade total de BLG é determinada de acordo com o Exemplo 1.31. A expressão “BLG agregada” se refere à BLG que esteja pelo menos parcialmente desdobrada e que, adicionalmente, tenha se agregado com outras moléculas de BLG desnaturadas e/ou outras proteínas de soro de queijo desnaturadas, tipicamente <qpor meio de interações hidrofóbicas e/ou ligações covalentes.
[0023] A BLG é a proteína mais predominante no soro de queijo e soro de leite bovinos e existe em várias variantes genéticas, as principais no leite de vaca sendo identificadas como A e B. A BLG é uma proteína
7 / 172 lipocalina e pode ligar muitas moléculas hidrofóbicas, sugerindo um papel no seu transporte. A BLG também se mostrou capaz de ligar ferro através de sideróforos e pode ter um papel no combate de patógenos. Falta um homólogo de BLG no leite humano.
[0024] A BLG bovina é uma proteína relativamente pequena de aproximadamente 162 resíduos de aminoácido com peso molecular de aproximadamente 18,3-18,4 kDa. Sob condições fisiológicas, ela é predominantemente dimérica, mas se dissocia a um monômero abaixo de cerca de pH 3, preservando seu estado nativo como determinado usando Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear. Por outro lado, a BLG também ocorre em forma tetramérica, octamérica e outras formas de agregação multimérica sob uma variedade de condições naturais.
[0025] No contexto da presente invenção, as expressões “beta- lactoglobulina não agregada” ou “BLG não agregada” também se referem à beta-lactoglobulina de espécies mamíferas, por exemplo, nas formas nativas, desdobradas e/ou glicosiladas, e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural. No entanto, as expressões não incluem BLG agregada, BLG precipitada ou BLG cristalizada. A quantidade ou concentração de BLG não agregada é determinada de acordo com o Exemplo 1.6.
[0026] A porcentagem de BLG não agregada em relação à BLG total é determinada pelo cálculo (mBLG total - mBLG não agregada)/mBLG total *100%. mBLG total é a concentração ou quantidade de BLG determinada de acordo com o Exemplo 1.31 e mBLG não agregada é a concentração ou quantidade de BLG não agregada determinada de acordo com o Exemplo 1.6.
[0027] No contexto da presente invenção, o termo “cristal” se refere a um material sólido cujos constituintes (tais como átomos, moléculas ou íons) são dispostos em uma estrutura microscópica altamente ordenada, formando uma retícula de cristal que se estende em todas as direções.
[0028] No contexto da presente invenção, a expressão “cristal de
8 / 172 BLG” se refere a cristais de proteína que primariamente contêm BLG não agregada e preferivelmente nativa disposta em uma estrutura microscópica altamente ordenada, formando uma retícula de cristal que se estende em todas as direções. Os cristais de BLG podem, por exemplo, ser monolíticos ou policristalinos e podem, por exemplo, ser cristais intactos, fragmentos de cristais, ou uma combinação dos mesmos. Fragmentos de cristal são, por exemplo, formados quando cristais intactos são submetidos a cisalhamento mecânico durante o processamento. Fragmentos de cristais também têm a estrutura microscópica altamente ordenada do cristal, mas podem não ter a superfície uniforme e/ou bordas ou cantos uniformes de um cristal intacto. Consultar, por exemplo, a Figura 3 para um exemplo de muitos cristais de BLG intactos e a Figura 4 para um exemplo de fragmentos de cristais de BLG. Em ambos os casos, o cristal de BLG ou os fragmentos de cristal podem ser identificados visualmente como estruturas bem definidas, compactas e coerentes usando microscopia de luz. Fragmentos de cristal de BLG ou de cristal são muitas vezes pelo menos parcialmente transparentes. Cristais de proteína são, ainda, conhecidos por serem birrefringentes e essa propriedade óptica pode ser usada para identificar partículas desconhecidas que tenham uma estrutura de cristal. Agregados de BLG não cristalinos, por outro lado, aparecem muitas vezes como pouco definidos, não transparentes, e como massas abertas ou porosas de tamanho irregular.
[0029] No contexto da presente invenção, o termo “cristalizar” se refere à formação de cristais de proteína. A cristalização pode, por exemplo, ocorrer espontaneamente ou ser iniciada pela adição de sementes de cristalização. “Licor-mãe”
[0030] No contexto da presente invenção, o termo “licor-mãe” se refere à solução de proteína de soro de queijo que resta após a BLG ter sido cristalizada e os cristais de BLG terem sido pelo menos parcialmente
9 / 172 removidos. O licor-mãe pode ainda conter alguns cristais de BLG, mas normalmente apenas cristais de BLG que escaparam da separação.
[0031] No contexto da presente invenção, a expressão “composição comestível” se refere a uma composição que é segura para o consumo humano e uso como um ingrediente alimentício e que não contenha quantidades problemáticas de componentes tóxicos, tais como tolueno ou outros solventes orgânicos indesejados.
[0032] No contexto da presente invenção, os termos “ALA” ou “alfa- lactalbumina” se referem à alfa-lactalbumina de espécies mamíferas, por exemplo, em formas nativas e/ou glicosiladas e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural. Os termos incluem ainda ALA agregada e BLG precipitada. Ao se referir à quantidade de ALA, é feita referência à quantidade total de ALA incluindo, por exemplo, ALA agregada. A quantidade total de ALA é determinada de acordo com o Exemplo 1.31. A expressão “ALA agregada” se refere à ALA que tipicamente esteja pelo menos parcialmente desdobrada e que, adicionalmente, tenha se agregado com outras moléculas de ALA desnaturadas e/ou outras proteínas de soro de queijo desnaturadas, tipicamente por meio de interações hidrofóbicas e/ou ligações covalentes.
[0033] A alfa-lactalbumina (ALA) é uma proteína presente no leite de quase todas as espécies mamíferas. A ALA forma a subunidade regulatória do heterodímero de lactose sintase (LS) e a β-1,4-galactosiltransferase (beta4Gal- T1) forma o componente catalítico. Juntas, essas proteínas possibilitam que a LS produza lactose transferindo porções de galactose para glicose. Uma das principais diferenças estruturais com relação à beta-lactoglobulina é que a ALA não tem nenhum grupo tiol livre que possa servir como o ponto de partida para uma reação de agregação covalente.
[0034] No contexto da presente invenção, a expressão “ALA não agregada” também se refere à ALA de espécies mamíferas, por exemplo, nas formas nativas, desdobradas e/ou glicosiladas, e incluem as variantes
10 / 172 genéticas de ocorrência natural. No entanto, a expressão não inclui ALA agregada ou ALA precipitada. A quantidade ou concentração de BLG não agregada é determinada de acordo com o Exemplo 1.6.
[0035] A porcentagem de ALA não agregada em relação à ALA total é determinada pelo cálculo (mALA total - mALA não agregada)/mALA total *100%. mALA total é a concentração ou quantidade de ALA determinada de acordo com o Exemplo 1.31 e mALA não agregada é a concentração ou quantidade de ALA não agregada determinada de acordo com o Exemplo 1.6.
[0036] No contexto da presente invenção, os termos “caseinomacropeptídeo” ou “CMP” se referem ao peptídeo hidrofílico, resíduo 106-169, originado da hidrólise de “k-CN” ou “kappa-caseína” de espécies mamíferas, por exemplo, nas formas nativas e/ou glicosiladas, e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural, por uma proteinase aspártica, por exemplo, quimosina.
[0037] No contexto da presente invenção, a expressão “isolado de BLG” significa uma composição que contenha BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína. Um isolado de BLG preferivelmente tem um teor total de proteína de pelo menos 30% p/p e, preferivelmente, pelo menos 80% p/p em relação ao total de sólidos.
[0038] No contexto da presente invenção, a expressão “pó de isolado de BLG” se refere a um isolado de BLG na forma de pó e, preferivelmente, um pó de fluxo livre.
[0039] No contexto da presente invenção, a expressão “líquido de isolado de BLG” se refere a um isolado de BLG na forma líquida e, preferivelmente, um líquido aquoso.
[0040] A expressão “soro de queijo” se refere à fase líquida que fica após a caseína do leite ter sido precipitada e removida. A precipitação de caseína pode, por exemplo, ser realizada pela acidificação do leite e/ou pelo uso da enzima rennet. Existem vários tipos de soro de queijo, tais como “soro
11 / 172 de queijo doce”, que é o produto de soro de queijo produzido pela precipitação à base de rennet da caseína, e “soro de queijo ácido” ou “soro de queijo azedo”, que é o produto de soro de queijo produzido pela precipitação à base de ácido da caseína. A precipitação à base de ácido da caseína pode, por exemplo, ser realizada pela adição de ácidos alimentícios ou por meio de culturas bacterianas.
[0041] A expressão “soro de leite” se refere ao líquido que resta quando a caseína e os glóbulos de gordura do leite foram removidos do leite, por exemplo, por microfiltração ou ultrafiltração de poros grandes. O soro de leite também pode ser chamado de “soro de queijo ideal”.
[0042] Os termos “proteína do soro do leite” ou “proteína de soro” se referem à proteína que está presente no soro de leite.
[0043] No contexto da presente invenção, a expressão “proteína de soro de queijo” se refere à proteína que é encontrada no soro de queijo ou no soro de leite. A proteína de soro de queijo pode ser um subconjunto da espécie de proteína encontrada no soro de queijo ou soro de leite e até mesmo uma única espécie de proteína de soro de queijo, ou pode ser o conjunto completo da espécie de proteína encontrada no soro de queijo e/ou soro de leite.
[0044] No contexto da presente invenção, as principais proteínas não BLG de um concentrado de proteína de soro de queijo padrão do soro de queijo doce são ALA, CMP, albumina sérica bovina, imunoglobulina, osteopontina, lactoferrina e lactoperoxidase. No contexto da presente invenção, as porcentagens de peso das principais proteínas de soro de queijo não BLG de um concentrado de proteína de soro de queijo padrão do soro de queijo doce são: ALA em uma quantidade de 18% p/p em relação ao total de proteína, CMP em uma quantidade de 18% p/p em relação ao total de
12 / 172 proteína, BSA em uma quantidade de 4% p/p em relação ao total de proteína, espécies de caseína em uma quantidade de 5% p/p em relação ao total de proteína, imunoglobulina em uma quantidade de 6% p/p em relação ao total de proteína, osteopontina em uma quantidade de 0,5% p/p em relação ao total de proteína, lactoferrina em uma quantidade de 0,1% p/p em relação ao total de proteína e lactoperoxidase em uma quantidade de 0,1% p/p em relação ao total de proteína.
[0045] O termo caseína se refere à proteína de caseína encontrada no leite e abrange tanto a caseína micelar nativa tal como encontrada no leite cru, quanto a espécie de caseína individual, e caseinatos.
[0046] No contexto da presente invenção, um líquido que é “supersaturado” ou “supersaturado no que se refere à BLG” contém uma concentração de BLG dissolvida não agregada que está acima do ponto de saturação da BLG não agregada nesse líquido nas determinadas condições físicas e químicas. O termo “supersaturado” é bem conhecido no campo da cristalização (consultar, por exemplo, Gérard Coquerela, “Crystallization of molecular systems from solution: phase diagrams, supersaturation and other basic concepts”, Chemical Society Reviews, págs. 2.286-2.300, edição 7, 2014) e a supersaturação pode ser determinada por inúmeras técnicas de medição diferentes (por exemplo, por espectroscopia ou análise de tamanho de partícula). No contexto da presente invenção, a supersaturação no que se refere à BLG é determinada mediante o seguinte procedimento. Procedimento para testar se um líquido em um conjunto de condições
13 / 172 específico está supersaturado no que se refere à BLG: transferir uma amostra de 50 ml do líquido a ser testado a um tubo de centrifugação (VWR catálogo nº 525-0402) com uma altura de 115 mm, um diâmetro interno de 25 mm e uma capacidade de 50 mL. Deve-se tomar cuidado para manter a amostra e as frações subsequentes da mesma nas condições físicas e químicas originais do líquido durante as etapas a) - h).
[0047] A amostra é imediatamente centrifugada a 3.000 g por 3,0 minutos com uma aceleração de no máximo 30 segundos e uma desaceleração de no máximo 30 segundos.
[0048] Imediatamente após a centrifugação, transferir o máximo possível do sobrenadante (sem perturbar a pelota se uma pelota tiver sido formada) a um segundo tubo de centrifugação (mesmo tipo da etapa a).
[0049] Colher uma subamostra de 0,05 mL do sobrenadante (subamostra A).
[0050] Adicionar 10 mg de cristais de BLG (pelo menos 98% de BLG pura e não agregada em relação ao total de sólidos) com um tamanho de partícula de no máximo 200 mícron a um segundo tubo de centrifugação e agitar a mistura.
[0051] Deixar o segundo tubo de centrifugação ficar por 60 minutos na temperatura original.
[0052] Imediatamente após a etapa f), centrifugar o segundo tubo de centrifugação a 500 g por 10 minutos e então colher outra subamostra de 0,05 mL do sobrenadante (subamostra B).
[0053] Recuperar a pelota de centrifugação da etapa g) caso haja alguma, ressuspendê-la em água Milli-Q e imediatamente inspecionar a suspensão para ver se há presença de cristais que sejam visíveis por microscopia.
[0054] Determinar a concentração de BLG não agregada nas subamostras A e B usando o método delineado no Exemplo 1.6 - os resultados
14 / 172 são expressos como % p/p de BLG em relação ao peso total das subamostras. A concentração de BLG não agregada da subamostra A é chamada de CBLG, A, e a concentração de BLG não agregada da subamostra B é chamada de C BLG, B.
[0055] O líquido do qual a amostra da etapa a) foi colhida foi supersaturado (nas condições específicas) se cBLG, B for mais baixa do que a cBLG, A e se os cristais forem observados na etapa i).
[0056] No contexto da presente invenção, os termos “líquido” e “solução” abrangem tanto composições que são livres de matéria particulada quanto composições que contêm uma combinação de partículas líquidas e sólidas e/ou semissólidas, tais como, por exemplo, cristais de proteína ou outras partículas proteicas. Um “líquido” ou uma “solução” podem, portanto, ser uma suspensão ou até mesmo uma pasta fluida. No entanto, um “líquido” e uma “solução” são preferivelmente bombeáveis.
[0057] No contexto da presente invenção, os termos “concentrado de proteína de soro de queijo” (WPC) e “concentrado de proteína de soro” (SPC) se referem a composições secas ou aquosas que contêm uma quantidade total de proteína de 20-89% p/p em relação ao total de sólidos.
[0058] Um WPC ou um SPC preferivelmente contêm: 20-89% p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 15-70% p/p de BLG em relação ao total de proteína, 8-50% p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% p/p de CMP em relação à proteína.
[0059] Alternativamente, mas também de forma preferida, um WPC ou um SPC podem conter: 20-89% p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 15-90% p/p de BLG em relação ao total de proteína, 4-50% p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% p/p de CMP em relação à proteína.
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[0060] Preferivelmente, um WPC ou um SPC contêm: 20-89% p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 15-80% p/p de BLG em relação ao total de proteína, 4-50% p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% p/p de CMP em relação à proteína.
[0061] Mais preferivelmente, um WPC ou um SPC contêm: 70-89% p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 30-90% p/p de BLG em relação ao total de proteína, 4-35% p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-25% p/p de CMP em relação à proteína.
[0062] O SPC tipicamente não contém CMP ou apenas traços de CMP.
[0063] Os termos “isolado de proteína de soro de queijo” (WPI) e “isolado de proteína de soro” (SPI) se referem a composições secas ou aquosas que contêm uma quantidade total de proteína de 90-100% p/p em relação ao total de sólidos.
[0064] Um WPI ou um SPI preferivelmente contêm: 90-100% p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 15-70% p/p de BLG em relação ao total de proteína, 8-50% p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% p/p de CMP em relação ao total de proteína.
[0065] Alternativamente, mas também de forma preferida, um WPI ou um SPI podem conter: 90-100% p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 30-95% p/p de BLG em relação ao total de proteína, 4-35% p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-25% p/p de CMP em relação ao total de proteína.
[0066] Mais preferivelmente, um WPI ou um SPI podem conter: 90-100% p/p de proteína em relação ao total de sólidos,
16 / 172 30-90% p/p de BLG em relação ao total de proteína, 4-35% p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-25% p/p de CMP em relação ao total de proteína.
[0067] O SPI tipicamente não contém CMP ou apenas traços de CMP.
[0068] No contexto da presente invenção, a expressão “proteína adicional” significa uma proteína que não é BLG. A proteína adicional que está presente na solução de proteína de soro de queijo tipicamente compreende uma ou mais dentre as proteínas não BLG que são encontradas no soro de leite ou de queijo. Exemplos não limitantes de tais proteínas são alfa-lactalbumina, albumina sérica bovina, imunoglobulinas, caseinomacropeptídeo (CMP), osteopontina, lactoferrina e proteínas da membrana do glóbulo de gordura.
[0069] Os termos “consiste essencialmente em” e “consistindo essencialmente em” significam que a reivindicação ou o atributo em questão abrangem os materiais ou etapas especificados e os que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada.
[0070] No contexto da presente invenção, a frase “Y e/ou X” significa “Y” ou “X” ou “Y e X”. Na mesma linha de pensamento, a frase “n1, n2, ..., ni- 1, e/ou ni” significa “ n1” ou “ n2” ou ... ou “ni-1” ou “ni” ou qualquer combinação dos componentes: n1, n2,...ni-1, e ni.
[0071] No contexto da presente invenção, os termos “seco” ou “secado” significam que a composição ou o produto em questão compreendem no máximo 10% p/p de água, preferivelmente no máximo 6% p/p e, mais preferivelmente, menos ainda.
[0072] No contexto da presente invenção, a expressão “redução microbiana física” se refere à interação física com uma composição que resulta na redução da quantidade total de micro-organismos viáveis da composição. O termo não abrange a adição de produtos químicos que
17 / 172 resultam na morte de micro-organismos. O termo também não abrange a exposição ao calor ao qual as gotículas atomizadas de líquido são expostas durante a secagem por pulverização, mas inclui um possível pré-aquecimento antes da secagem por pulverização.
[0073] No contexto da presente invenção, o pH de um pó se refere ao pH de 10 g do pó misturados em 90 g de água desmineralizada e é medido de acordo com o Exemplo 1.16.
[0074] No contexto da presente invenção, a porcentagem de peso (% p/p) de um componente de uma certa composição, produto, ou material, significa a porcentagem de peso desse componente em relação ao peso da composição, produto, ou material específicos, a não ser que outra referência (por exemplo, total de sólidos ou total de proteína) seja especificamente mencionada.
[0075] No contexto da presente invenção, a etapa de processo “concentração” e o verbo “concentrar” se referem à concentração proteica e abrangem tanto a concentração proteica no que se refere ao total de sólidos quanto a concentração proteica no que se refere ao peso total. Isso significa, por exemplo, que a concentração não necessariamente requer que a concentração absoluta p/p de proteína de uma composição aumente desde que o teor de proteína aumente em relação ao total de sólidos.
[0076] No contexto da presente invenção, a expressão “razão de peso” entre o componente X e o componente Y significa o valor obtido pelo cálculo mx/mY, em que mx é a quantidade (peso) de componentes X e mY é a quantidade (peso) de componentes Y.
[0077] No contexto da presente invenção, a expressão “pelo menos pasteurização” se refere a um tratamento térmico que tem um efeito de morte microbiana igual a ou maior que um tratamento térmico de 70 graus C por 10 segundos. A referência para determinar o efeito de morte de bactérias é E. coli O157:H7.
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[0078] No contexto da presente invenção, a expressão “alimento de proteína de soro de queijo” se refere à fonte de proteína de soro de queijo da qual o isolado de BLG líquido é derivado. O alimento de proteína de soro de queijo tem um teor mais baixo de BLG em relação ao total de proteína do que o isolado de BLG líquido e é tipicamente um WPC, um WPI, um SPC ou um SPI.
[0079] No contexto da presente invenção, a expressão “composição enriquecida com BLG” se refere à composição enriquecida com BLG resultante de isolar BLG do alimento de proteína de soro de queijo. A composição enriquecida com BLG tipicamente compreende as mesmas proteínas de soro de queijo que o alimento de proteína de soro de queijo, mas a BLG está presente em uma concentração significativamente maior do que no alimento de proteína de soro de queijo. A composição enriquecida com BLG pode, por exemplo, ser preparada a partir do alimento de proteína de soro de queijo por cromatografia, cristalização de proteína e/ou fracionamento de proteína com base em membrana. A composição enriquecida com BLG compreende BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína e, preferivelmente, pelo menos 90% p/p. Em alguns casos, a composição enriquecida com BLG pode ser usada diretamente como o isolado de BLG líquido. No entanto, muitas vezes é necessário processamento adicional para converter a composição enriquecida com BLG no isolado de BLG líquido.
[0080] No contexto da presente invenção, a expressão “solução de proteína de soro de queijo” é usada para descrever a composição de proteína de soro de queijo aquosa especial que é supersaturada no que se refere à BLG no modo salting-in e útil para preparar cristais de BLG.
[0081] No contexto da presente invenção, o termo “estéril” significa que a composição ou o produto estéril em questão não contêm qualquer micro-organismo viável e, portanto, não possui crescimento microbiano
19 / 172 durante o armazenamento à temperatura ambiente. Uma composição que foi esterilizada é estéril.
[0082] Quando um líquido, tal como uma preparação de bebida, é esterilizado e embalado assepticamente em um recipiente estéril, ele tipicamente tem uma vida útil de pelo menos seis meses à temperatura ambiente. O tratamento de esterilização mata esporos e micro-organismos que podem causar a deterioração do líquido.
[0083] No contexto da presente invenção, a expressão “fração de proteína” se refere a proteínas da composição em questão, por exemplo, as proteínas de um pó ou uma preparação de bebida.
[0084] No contexto da presente invenção, a expressão “sensação de boca seca” se refere a uma sensação na boca, que parece que a boca e os dentes estão ressecados e resulta na minimização da produção de saliva.
[0085] Assim, a sensação de boca seca não é bem um gosto, mas uma sensação bucal física e dependente do tempo.
[0086] No contexto da presente invenção, o termo “minerais” como usado no presente documento, a não ser que especificado em contrário, se refere a qualquer um dentre macrominerais, microminerais ou minerais menores, outros minerais, e combinações dos mesmos. Macrominerais incluem cálcio, fósforo, potássio, enxofre, sódio, cloro, magnésio. Microminerais ou minerais menores incluem ferro, cobalto, cobre, zinco, molibdênio, iodo, selênio, manganês, e outros minerais incluem cromo, flúor, boro, lítio e estrôncio.
[0087] No contexto da presente invenção, os termos “lipídio”, “gordura” e “óleo” como usados no presente documento, a não ser que especificado em contrário, são usados de forma intercambiável para se referir a materiais lipídicos derivados ou processados de plantas ou animais. Esses termos incluem também materiais lipídicos sintéticos desde que tais materiais sintéticos sejam adequados ao consumo humano.
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[0088] No contexto da presente invenção, o termo “transparente” abrange uma preparação de bebida com uma aparência visivelmente límpida e que permita que a luz passe e através da qual apareçam imagens distintas. Uma bebida transparente tem uma turvação de no máximo 200 NTU.
[0089] No contexto da presente invenção, o termo “opaco” abrange uma preparação de bebida com uma aparência visivelmente embaçada e que tem uma turvação de mais que 200 NTU.
[0090] Um aspecto da invenção se refere a um pó de isolado de beta- lactoglobulina (BLG), preferivelmente preparado por secagem por pulverização, que tem um pH na faixa de i) 2-4,9, ii) 6,1-8,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - proteína total em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, - BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína e - água em uma quantidade de no máximo 10% p/p.
[0091] O pó de isolado de BLG tem preferivelmente um ou mais dos seguintes itens: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 200 NTU e - no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia/g.
[0092] O pó de isolado de BLG é preferivelmente uma composição comestível.
[0093] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 2-4,9. Tais pós são particularmente úteis para produtos alimentícios ácidos e particularmente bebidas ácidas.
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[0094] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 6,1-8,5.
[0095] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende um total de proteína em uma quantidade de pelo menos 40% p/p, preferivelmente pelo menos 50% p/p, pelo menos 60% p/p, mais preferivelmente pelo menos 70% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% p/p.
[0096] Teores de proteína ainda mais altos podem ser necessários e, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende um total de proteína em uma quantidade de pelo menos 85% p/p, preferivelmente pelo menos 90% p/p, pelo menos 92% p/p, mais preferivelmente pelo menos 94% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95% p/p.
[0097] O total de proteína é medido de acordo com o Exemplo 1.5.
[0098] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende BLG em uma quantidade de pelo menos 96% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 96,5% p/p, mais preferivelmente pelo menos 97% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% e, o mais preferivelmente, BLG em uma quantidade de pelo menos 99,5% p/p em relação ao total de proteína.
[0099] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende BLG em uma quantidade de pelo menos 97,5% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 98,0% p/p, mais preferivelmente pelo menos 98,5% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 99,0% e, o mais preferivelmente, BLG em uma quantidade de pelo menos 99,7% p/p em relação ao total de proteína, tal como aproximadamente 100,0% p/p em relação ao total de proteína.
[00100] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a soma de alfa-lactalbumina (ALA) e caseinomacropeptídeo (CMP) compreende pelo
22 / 172 menos 40% p/p da proteína não BLG do pó, preferivelmente pelo menos 60% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 70% p/p e, o mais preferivelmente, pelo menos 90% p/p da proteína não BLG do pó.
[00101] Em outras modalidades preferenciais da invenção, cada proteína de soro de queijo não BLG principal está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 15%, mais preferivelmente no máximo 10%, ainda mais preferivelmente no máximo 6%, o mais preferivelmente no máximo 4%.
[00102] Concentrações ainda mais baixas das proteínas de soro de queijo não BLG podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, cada proteína de soro de queijo não BLG principal está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00103] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a ALA compreende no máximo 80% p/p da proteína não BLG do pó de isolado de BLG, preferivelmente no máximo 60% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 40% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 30% p/p da proteína não BLG do pó de isolado de BLG.
[00104] Teores ainda mais baixos de ALA podem ser preferíveis, assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a ALA compreende no máximo 20% p/p da proteína não BLG do pó de isolado de BLG, preferivelmente no máximo 15% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 10% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 5% p/p da proteína
23 / 172 não BLG do pó de isolado de BLG.
[00105] Os inventores viram indicações de que a redução de lactoferrina e/ou lactoperoxidase é particularmente vantajosa para se obter um produto de proteína de soro de queijo com cor neutra.
[00106] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a lactoferrina está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%. Concentrações ainda mais baixas de lactoferrina podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a lactoferrina está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00107] Similarmente, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a lactoperoxidase está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%. Concentrações ainda mais baixas de lactoperoxidase podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a lactoperoxidase está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação
24 / 172 a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00108] A lactoferrina e a lactoperoxidase são quantificadas de acordo com o Exemplo 1.29.
[00109] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um teor de água em uma quantidade de no máximo 10% p/p, preferivelmente no máximo 7% p/p, mais preferivelmente no máximo 6% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 4% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 2% p/p.
[00110] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende carboidrato em uma quantidade de no máximo 60% p/p, preferivelmente no máximo 50% p/p, mais preferivelmente no máximo 20% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 10% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 1% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1%. O pó de isolado de BLG pode, por exemplo, conter carboidratos, tais como, por exemplo, lactose, oligossacarídeos e/ou hidrólise produtos de lactose (isto é glicose e galactose), sacarose, e/ou maltodextrina.
[00111] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende lipídio em uma quantidade de no máximo 10% p/p, preferivelmente no máximo 5% p/p, mais preferivelmente no máximo 2% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,1% p/p.
[00112] A quantidade de lipídio é determinada de acordo com o ISO 1211:2010 (Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method).
[00113] Os presentes inventores constataram que pode ser vantajoso controlar o teor de mineral para alcançar algumas das propriedades desejadas do pó de isolado de BLG.
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[00114] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do pó de isolado de BLG é no máximo 10 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do pó de isolado de BLG é no máximo 6 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 4 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 2 mmol/g de proteína.
[00115] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do pó de isolado de BLG é no máximo 1 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do pó de isolado de BLG é no máximo 0,6 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 0,4 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,2 mmol/g de proteína e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1 mmol/g de proteína.
[00116] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Mg e Ca do pó de isolado de BLG é no máximo 5 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Mg e Ca do pó de isolado de BLG é no máximo 3 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 1,0 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 mmol/g de proteína.
[00117] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Mg e Ca da primeira composição é no máximo 0,3 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Mg e Ca do pó de isolado de BLG é no máximo 0,2 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 0,1 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,03 mmol/g de proteína e, o mais preferivelmente, no máximo 0,01 mmol/g de proteína.
[00118] Os inventores constataram que é possível produzir variantes com baixo nível de fósforo/potássio do pó de isolado de BLG que são particularmente úteis para pacientes com doenças renais. Para produzir tal
26 / 172 produto, o pó de isolado de BLG precisa ter um teor igualmente baixo de fósforo e potássio.
[00119] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um teor total de fósforo de no máximo 100 mg por 100 g de proteína. Preferivelmente, o pó de isolado de BLG tem um teor total de no máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG tem um teor total de no máximo 50 mg de fósforo por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG tem um teor total de fósforo de no máximo 20 mg de fósforo por 100 g de proteína. O pó de isolado de BLG tem um teor total de fósforo de no máximo 5 mg de fósforo por 100 g de proteína.
[00120] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 600 mg de potássio por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 500 mg de potássio por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 400 mg de potássio por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 300 mg de potássio por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 200 mg de potássio por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 100 mg de potássio por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 50 mg de potássio por 100 g de proteína e, ainda mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 10 mg de potássio por 100 g de proteína.
[00121] O teor de fósforo se refere à quantidade total de fósforo elementar da composição em questão e é determinado de acordo com o Exemplo 1.19. Similarmente, o teor de potássio se refere à quantidade total de potássio elementar da composição em questão e é determinado de acordo com
27 / 172 o Exemplo 1.19.
[00122] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 100 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 700 mg de potássio/100g de proteína, preferivelmente no máximo 80 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 600 mg de potássio/100 g de proteína, mais preferivelmente no máximo 60 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 500 mg de potássio/100 g de proteína, mais preferivelmente no máximo 50 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 400 mg de potássio/100 g de proteína, ou mais preferivelmente no máximo 20 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 200 mg de potássio/100 g de proteína, ou ainda mais preferivelmente no máximo 10 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 50 mg de potássio/100 g de proteína. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 100 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 340 mg de potássio/100 g de proteína.
[00123] As composições com baixo nível de fósforo e/ou com baixo nível de potássio de acordo com a presente invenção podem ser usadas como um ingrediente alimentar para a produção de um produto alimentício para grupos de pacientes que tenham função renal reduzida.
[00124] Os presentes inventores constataram que, para algumas aplicações, por exemplo, produtos alimentícios ácidos e particularmente bebidas ácidas, é particularmente vantajoso ter um pó de isolado de BLG ácido com um pH de no máximo 4,9 e, ainda mais preferivelmente, no máximo 4,3. Isso é especialmente verdade para bebidas ácidas transparentes com alto nível de proteína.
[00125] No contexto da presente invenção, um líquido transparente tem uma turvação de no máximo 200 NTU medida de acordo com o Exemplo 1.7.
[00126] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 2-4,9. Preferivelmente, o pó de
28 / 172 isolado de BLG tem um pH na faixa de 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8-4,3, ainda mais preferivelmente 3,2-4,0 e, o mais preferivelmente, 3,4-3,9. Alternativamente, mas também preferível, o pó de isolado de BLG pode ter um pH na faixa de 3,6-4,3.
[00127] Os presentes inventores constataram que, para algumas aplicações, por exemplo, produtos alimentícios de pH neutro e particularmente bebidas de pH neutro, é particularmente vantajoso ter um pó de isolado de BLG com pH neutro. Isso é especialmente verdade para bebidas de pH neutro transparentes ou opacas com alto nível de proteína.
[00128] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 6,1-8,5. Preferivelmente, o pó tem um pH na faixa de 6,1-8,5, mais preferivelmente 6,2-8,0, ainda mais preferivelmente 6,3-7,7 e, o mais preferivelmente, 6,5-7,5.
[00129] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 5,0-6,0. Preferivelmente, o pó tem um pH na faixa de 5,1-5,9, mais preferivelmente 5,2-5,8, ainda mais preferivelmente 5,3-5,7 e, o mais preferivelmente, 5,4-5,6.
[00130] Vantajosamente, o pó de isolado de BLG da presente invenção pode ter uma densidade aparente de pelo menos 0,20g/cm3, preferivelmente pelo menos 0,30 g/cm3, mais preferivelmente pelo menos 0,40 g/cm3, ainda mais preferivelmente pelo menos 0,45 g/cm3, ainda mais preferivelmente pelo menos 0,50 g/cm3 e, o mais preferivelmente, pelo menos 0,6 g/cm3.
[00131] Pós de baixa densidade tais como isolados de BLG secados por congelamento são fofos e facilmente atraídos para o ar do local de produção durante o uso. Isso é problemático visto que aumenta o risco de contaminação cruzada do pó secado por congelamento para outros produtos alimentícios, e sabe-se que um ambiente poeirento é a causa de problemas de higiene. Em casos extremos, um ambiente poeirento também aumenta o risco de explosões de poeira.
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[00132] As variantes de alta densidade da presente invenção são mais fáceis de manusear e menos propensas a fluírem para o ar circundante.
[00133] Uma vantagem adicional das variantes de alta densidade da presente invenção é que elas ocupam menos espaço durante o transporte e, portanto, aumentam o peso do pó de isolado de BLG que pode ser transportado em uma unidade de volume.
[00134] Uma outra vantagem das variantes de alta densidade da presente invenção é que elas são menos propensas à segregação quando usadas em misturas de pó com outros ingredientes alimentícios em pó, tais como, por exemplo, açúcar em pó (densidade aparente de aproximadamente 0,56 g/cm3), açúcar granulado (densidade aparente de aproximadamente 0,71 g/cm3), ácido cítrico em pó (densidade aparente de aproximadamente 0,77 g/cm3).
[00135] O pó de isolado de BLG da presente invenção pode, por exemplo, ter uma densidade aparente na faixa de 0,2-1,0 g/cm3, preferivelmente na faixa de 0,30-0,9 g/cm3, mais preferivelmente na faixa de 0,40-0,8 g/cm3, ainda mais preferivelmente na faixa de 0,45-0,75 g/cm3, ainda mais preferivelmente na faixa de 0,50-0,75 g/cm3 e, o mais preferivelmente, na faixa de 0,6-0,75 g/cm3.
[00136] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem uma densidade aparente na faixa de 0,45-1,2 g/cm3, preferivelmente na faixa de 0,46-1,0 g/cm3, mais preferivelmente na faixa de 0,47-0,8 g/cm3, ainda mais preferivelmente na faixa de 0,48-0,75 g/cm3, ainda mais preferivelmente na faixa de 0,48-0,6 g/cm3 e, o mais preferivelmente, na faixa de 0,50-0,6 g/cm3.
[00137] A densidade aparente de um pó é medida de acordo com o Exemplo 1.17.
[00138] Os presentes inventores constataram que é vantajoso manter a conformação nativa da BLG e viram indicações de que o desdobramento
30 / 172 aumentado da BLG ocasiona um nível aumentado de sensação de boca seca quando a BLG é usada para bebidas ácidas.
[00139] A razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) é uma medida do grau de desdobramento da BLG e os inventores constataram que a altas razões de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca, que são correlacionadas a baixo desdobramento ou a nenhum desdobramento da BLG, foi observada menos sensação de boca seca. A razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) é medida de acordo com o Exemplo 1.1.
[00140] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11.
[00141] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,12, preferivelmente pelo menos 1,13, mais preferivelmente pelo menos 1,15, ainda mais preferivelmente pelo menos 1,17 e, o mais preferivelmente, pelo menos 1,19.
[00142] Se o pó de isolado de BLG contiver quantidades consideráveis de matéria não proteica, é preferível isolar a fração de proteína antes de medir a razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca. Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a fração de proteína do pó de isolado de BLG tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca de pelo menos 1,11.
[00143] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a fração de proteína do pó de isolado de BLG tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,12, preferivelmente pelo menos 1,13, mais preferivelmente pelo menos 1,15, ainda mais preferivelmente pelo menos 1,17 e, o mais preferivelmente, pelo menos 1,19.
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[00144] A fração de proteína pode, por exemplo, ser separada do pó de isolado de BLG dissolvendo-se o pó de isolado de BLG em água desmineralizada e submetendo-se a solução a diálise ou diafiltração baseada em ultrafiltração usando um filtro que retém a proteína. Se o pó de isolado de BLG contiver níveis interferentes de lipídio, tal lipídio pode, por exemplo, ser removido por microfiltração. As etapas de microfiltração e ultrafiltração/diafiltração podem ser combinadas para remover tanto lipídio quanto pequenas moléculas da fração de proteína.
[00145] É muitas vezes preferível que uma quantidade substancial de BLG do pó de isolado de BLG seja BLG não agregada. Preferivelmente, pelo menos 50% da BLG são BLG não agregada. Mais preferivelmente, pelo menos 80% da BLG são BLG não agregada. Ainda mais preferível, pelo menos 90% da BLG são BLG não agregada. O mais preferível, pelo menos 95% da BLG são BLG não agregada. Ainda mais preferível, aproximadamente 100% da BLG do pó de isolado de BLG são BLG não agregada.
[00146] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, ainda mais preferivelmente no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 1% e, o mais preferivelmente, no máximo 0,2%.
[00147] No entanto, pode também ser preferível que o pó de isolado de BLG tenha um nível significativo de desnaturação de proteína, por exemplo, se uma bebida opaca for desejada. Assim, em outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um grau de desnaturação de proteína de pelo menos 11%, preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos 75% e, o mais preferivelmente, pelo menos 90%.
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[00148] Se o pó de isolado de BLG tiver um nível significativo de desnaturação de proteína, é muitas vezes preferível manter um nível baixo de matéria proteica insolúvel, isto é, matéria proteica precipitada que se assentaria em uma bebida durante o armazenamento. O nível de matéria insolúvel é medido de acordo com o Exemplo 1.10.
[00149] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG compreende no máximo 20% p/p de matéria proteica insolúvel, preferivelmente no máximo 10% p/p de matéria proteica insolúvel, mais preferivelmente no máximo 5% p/p de matéria proteica insolúvel, ainda mais preferível no máximo 3% p/p de matéria proteica insolúvel e, o mais preferível, no máximo 1% p/p de matéria proteica insolúvel. Pode até mesmo ser preferível que o pó de isolado de BLG não contenha nenhuma matéria proteica insolúvel.
[00150] Os presentes inventores constataram que a estabilidade térmica em pH 3,9 de um pó de isolado de BLG é uma boa indicadora de sua utilidade para bebidas com alto nível de proteína transparentes. A estabilidade térmica em pH 3,9 é medida de acordo com o Exemplo 1.2.
[00151] É particularmente preferível que o pó de isolado de BLG tenha uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 200 NTU, preferivelmente no máximo 100 NTU, mais preferível no máximo 60 NTU, ainda mais preferível no máximo 40 NTU e, o mais preferível, no máximo 20 NTU. Estabilidades térmicas ainda melhores são possíveis e o pó de isolado de BLG preferivelmente tem uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 10 NTU, preferivelmente no máximo 8 NTU, mais preferível no máximo 4 NTU, ainda mais preferível no máximo 2 NTU.
[00152] O teor de micro-organismos do pó de isolado de BLG é preferivelmente mantido mínimo. No entanto, é um desafio obter tanto um alto grau de estado nativo de proteína e um baixo teor de micro-organismo, visto que os processos para redução microbiana tendem a levar a
33 / 172 desdobramento e desnaturação de proteína. A presente invenção possibilita se obter um teor bem baixo de micro-organismo enquanto ao mesmo tempo se mantém um alto nível do estado nativo de BLG.
[00153] Em algumas modalidades da invenção, o isolado de BLG líquido contém no máximo 500.000 CFU/g, preferivelmente no máximo
100.000 CFU/g, mais preferivelmente no máximo 50.000 CFU/g, ainda mais preferivelmente no máximo 25.000 CFU/g.
[00154] Teores ainda mais baixos de micro-organismos podem ser preferíveis, assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG contém no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia (CFU)/g. Preferivelmente, o pó de isolado de BLG contém no máximo 10.000 CFU/g. Mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG contém no máximo 5.000 CFU/g. Ainda mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG contém no máximo 1.000 CFU/g. Ainda mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG contém no máximo 300 CFU/g. O mais preferivelmente, o pó de isolado de BLG contém no máximo 100 CFU/gm, tal como, por exemplo, no máximo 10 CFU/g. Em uma modalidade particularmente preferencial, o pó é estéril. Um pó de isolado de BLG estéril pode, por exemplo, ser preparado combinando-se vários processos de redução microbiana física durante a produção do pó de isolado de BLG, tal como, por exemplo, microfiltração e tratamento térmico em pH ácido. A secagem é preferivelmente realizada em um sistema de secagem asséptico, tal como, por exemplo, um secador por pulverização asséptico.
[00155] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 2-4,9, ii) 6,1-8,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, preferivelmente pelo menos 80% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 90% p/p
34 / 172 - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 2% p/p, preferivelmente no máximo 0,5% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 200 NTU.
[00156] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 2-4,9 ou ii) 6,1-8,5 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, preferivelmente pelo menos 80% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 90% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 2% p/p, preferivelmente no máximo 0,5% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 5% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 70 NTU,
35 / 172 preferivelmente no máximo 50 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 40 NTU.
[00157] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 2-4,9 ou ii) 6,1-8,5 e compreende: - proteína total em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 200 NTU.
[00158] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 2-4,9 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 80% p/p, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 2% p/p, preferivelmente no máximo 0,5% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3,
36 / 172 preferivelmente pelo menos 0,3 g/cm3 e, mais preferivelmente, pelo menos 0,4 g/cm3, - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 50 NTU, preferivelmente no máximo 30 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU.
[00159] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 3,0-4,3, preferivelmente na faixa de 3,6-4,1 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 80% p/p, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 90% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 92% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 2% p/p, preferivelmente no máximo 0,5% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, preferivelmente pelo menos 0,3 g/cm3 e, mais preferivelmente, pelo menos 0,4 g/cm3, - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, preferivelmente pelo menos 1,13 - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%,
37 / 172 preferivelmente no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 50 NTU, preferivelmente no máximo 30 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU.
[00160] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 6,1-8,5 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 80% p/p, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 2% p/p, preferivelmente no máximo 0,5% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, preferivelmente pelo menos 0,3 g/cm3 e, mais preferivelmente, pelo menos 0,4 g/cm3, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 50 NTU, preferivelmente no máximo 30 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU.
[00161] Em modalidades preferenciais adicionais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 6,1-8,5 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 80% p/p, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo
38 / 172 menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 2% p/p, preferivelmente no máximo 0,5% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, preferivelmente pelo menos 0,3 g/cm3 e, mais preferivelmente, pelo menos 0,4 g/cm3, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 50 NTU, preferivelmente no máximo 30 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU.
[00162] Em modalidades preferenciais adicionais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 80% p/p, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 2% p/p, preferivelmente no máximo 0,5% p/p,
39 / 172 o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, preferivelmente pelo menos 0,3 g/cm3 e, mais preferivelmente, pelo menos 0,4 g/cm3, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 50 NTU, preferivelmente no máximo 30 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU e - preferivelmente, uma cristalinidade de BLG de menos do que 10%.
[00163] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3, ii) 6,5-7,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 90% p/p, preferivelmente pelo menos 92% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 92% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 94% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU e - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g,
40 / 172 preferivelmente no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia/g, mais preferivelmente no máximo 100 unidades formadoras de colônia/g e, o mais preferivelmente, o dito pó de isolado de BLG é estéril.
[00164] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3, ii) 6,5-7,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 90% p/p, preferivelmente pelo menos 92% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 92% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 94% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU e - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g, preferivelmente no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia/g, mais preferivelmente no máximo 100 unidades formadoras de colônia/g e, o mais preferivelmente, o dito pó de isolado de BLG é estéril.
[00165] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3, ii) 6,5-7,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 90% p/p, preferivelmente pelo menos 92% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo
41 / 172 menos 92% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 94% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU e - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g, preferivelmente no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia/g, mais preferivelmente no máximo 100 unidades formadoras de colônia/g e, o mais preferivelmente, o dito pó de isolado de BLG é estéril.
[00166] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3, ii) 6,5-7,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 90% p/p, preferivelmente pelo menos 92% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 92% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 94% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5% e
42 / 172 - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g, preferivelmente no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia/g, mais preferivelmente no máximo 100 unidades formadoras de colônia/g e, o mais preferivelmente, o dito pó de isolado de BLG é estéril.
[00167] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3, ii) 6,5-7,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 90% p/p, preferivelmente pelo menos 92% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 92% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 94% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU.
[00168] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3, ii) 6,5-7,5, ou iii) 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 90% p/p, preferivelmente pelo menos 92% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 92% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos
43 / 172 94% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU e - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g, preferivelmente no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia/g, mais preferivelmente no máximo 100 unidades formadoras de colônia/g e, o mais preferivelmente, o dito pó de isolado de BLG é estéril.
[00169] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3 ou ii) 6,3-7,5 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, preferivelmente pelo menos 50% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 80% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 90% p/p e, mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5%, preferivelmente no máximo 2% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU,
44 / 172 preferivelmente no máximo 20 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU.
[00170] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de i) 3,0-4,3 ou ii) 6,3-7,5 e compreende: - proteína total em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p, - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU.
[00171] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 3,0-4,3 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de no máximo 90% p/p e, preferivelmente, no máximo 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 94% p/p e, preferivelmente, pelo menos 96% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de 0,45-0,8 g/cm3, preferivelmente 0,50-0,6 g/cm3, - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15,
45 / 172 - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 30 NTU e preferivelmente no máximo 10 NTU.
[00172] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 6,3-7,5 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de no máximo 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 94% p/p - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 94% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 96% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de 0,45-0,8 g/cm3, preferivelmente 0,50-0,6 g/cm3, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2% e - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 50 NTU, preferivelmente no máximo 30 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU.
[00173] Em modalidades preferenciais adicionais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um pH na faixa de 5,0-6,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de no máximo 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 94% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína
46 / 172 - água em uma quantidade de no máximo 6% p/p, - lipídio em uma quantidade de no máximo 0,5% p/p, preferivelmente no máximo 0,1% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo: - uma densidade aparente de 0,45-0,8 g/cm3, preferivelmente 0,50-0,6 g/cm3, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, preferivelmente no máximo 5% e, mais preferivelmente, no máximo 2%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 50 NTU, preferivelmente no máximo 30 NTU e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 NTU e - preferivelmente, uma cristalinidade de BLG de menos do que 10% e, mais preferivelmente, no máximo 1%.
[00174] Ainda um aspecto da invenção se refere a um método para produzir um pó de isolado de BLG secado contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, o método compreendendo as etapas de: prover um isolado de BLG líquido que tem i) um pH na faixa de 2-4,9, ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, ou iii) um pH na faixa de 5,0-6,0 o dito isolado de BLG líquido contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, opcionalmente, submeter o isolado de BLG líquido a uma redução microbiana física, secar o isolado de BLG líquido, preferivelmente por secagem por pulverização.
[00175] O isolado de BLG líquido é preferivelmente uma composição comestível.
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[00176] O isolado de BLG líquido é preferivelmente preparado a partir de leite mamífero e, preferivelmente, do leite de um ruminante, tal como, por exemplo, de vaca, ovelha, cabra, búfalo, camelo, lhama, cavalo e/ou veado. Proteína derivada de leite bovino é particularmente preferível. A BLG é, portanto, preferivelmente BLG bovina.
[00177] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende BLG em uma quantidade de pelo menos 92% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 95% p/p, mais preferivelmente pelo menos 97% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% e, o mais preferivelmente, BLG em uma quantidade de pelo menos 99,5% p/p em relação ao total de proteína.
[00178] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende BLG em uma quantidade de pelo menos 97,5% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 98,0% p/p, mais preferivelmente pelo menos 98,5% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 99,0% e, o mais preferivelmente, BLG em uma quantidade de pelo menos 99,7% p/p em relação ao total de proteína, tal como aproximadamente 100,0% p/p em relação ao total de proteína.
[00179] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende total de proteína em uma quantidade de pelo menos 5% p/p, preferivelmente pelo menos 10% p/p, mais preferivelmente pelo menos 15% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 20% e, o mais preferivelmente, total de proteína em uma quantidade de pelo menos 30% p/p.
[00180] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende total de proteína em uma quantidade na faixa de 5-40% p/p, preferivelmente na faixa de 10-35% p/p, mais preferivelmente na faixa de 15-30% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 20-25% p/p.
[00181] Os presentes inventores observaram que uma concentração de BLG crescente no isolado de BLG líquido ocasiona pós secados por
48 / 172 pulverização com uma densidade aparente mais alta, e é, portanto, preferível ter uma concentração de BLG relativamente alta no isolado de BLG líquido.
[00182] Assim, em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende total de proteína em uma quantidade na faixa de 10-40% p/p, preferivelmente na faixa de 20-38% p/p, mais preferivelmente na faixa de 24-36% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 28-34% p/p.
[00183] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a soma de alfa-lactalbumina (ALA) e caseinomacropeptídeo (CMP) compreende pelo menos 40% p/p da proteína não BLG do isolado de BLG líquido, preferivelmente pelo menos 60% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 70% p/p e, o mais preferivelmente, pelo menos 90% p/p da proteína não BLG do isolado de BLG líquido.
[00184] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a ALA compreende no máximo 80% p/p da proteína não BLG do isolado de BLG líquido, preferivelmente no máximo 60% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 40% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 30% p/p da proteína não BLG do isolado de BLG líquido.
[00185] Teores ainda mais baixos de ALA podem ser preferíveis, assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a ALA compreende no máximo 20% p/p da proteína não BLG do isolado de BLG líquido, preferivelmente no máximo 15% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 10% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 5% p/p da proteína não BLG do isolado de BLG líquido.
[00186] Em outras modalidades preferenciais da invenção, cada proteína de soro de queijo não BLG principal do isolado de BLG líquido está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente
49 / 172 do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%.
[00187] Concentrações ainda mais baixas das proteínas de soro de queijo não BLG podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, cada proteína de soro de queijo não BLG principal do isolado de BLG líquido está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00188] Os inventores viram indicações de que um nível baixo de lactoferrina e/ou lactoperoxidase é particularmente vantajoso para se obter um produto de proteína de soro de queijo com cor neutra.
[00189] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a lactoferrina está presente no isolado de BLG líquido em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%. Concentrações ainda mais baixas de lactoferrina podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a lactoferrina está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
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[00190] Similarmente, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a lactoperoxidase está presente no isolado de BLG líquido em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%. Concentrações ainda mais baixas de lactoperoxidase podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a lactoperoxidase está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00191] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende um teor total de sólidos em uma quantidade na faixa de 5-50% p/p, preferivelmente na faixa de 10-40% p/p, mais preferivelmente na faixa de 15-35% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 20-30% p/p.
[00192] A fração do isolado de BLG líquido que não contribui para o total de sólidos preferivelmente consiste essencialmente em, ou mesmo consiste em, água.
[00193] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende um teor de água em uma quantidade na faixa de 50-95% p/p, preferivelmente na faixa de 60-90% p/p, mais preferivelmente na faixa de 65-85% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 70-80% p/p.
[00194] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende carboidrato em uma quantidade de no máximo
51 / 172 60% p/p, preferivelmente no máximo 50% p/p, mais preferivelmente no máximo 20% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 10% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 1% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1%. O isolado de BLG líquido pode, por exemplo, conter carboidratos, tais como, por exemplo, lactose, oligossacarídeos e/ou produtos de hidrólise da lactose (isto é, glicose e galactose), sacarose, e/ou maltodextrina.
[00195] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende lipídio em uma quantidade de no máximo 10% p/p, preferivelmente no máximo 5% p/p, mais preferivelmente no máximo 2% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,1% p/p.
[00196] Os presentes inventores constataram que pode ser vantajoso controlar o teor de mineral para alcançar algumas das propriedades desejadas do isolado de BLG líquido.
[00197] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 10 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 6 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 4 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 2 mmol/g de proteína.
[00198] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 1,0 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 0,6 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 0,4 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,2 mmol/g de proteína e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1 mmol/g de proteína.
[00199] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Mg e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 5 mmol/g de
52 / 172 proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Mg e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 3 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 1,0 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 mmol/g de proteína.
[00200] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Mg e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 0,3 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Mg e Ca do isolado de BLG líquido é no máximo 0,2 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 0,1 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,03 mmol/g de proteína e, o mais preferivelmente, no máximo 0,01 mmol/g de proteína.
[00201] Os inventores constataram que é possível produzir variantes com baixo nível de fósforo/potássio do pó de isolado de BLG que são particularmente úteis para pacientes com doenças renais. Para produzir tal produto, o isolado de BLG líquido precisa ter um teor igualmente baixo de fósforo e potássio.
[00202] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um teor total de fósforo de no máximo 100 mg por 100 g de proteína. Preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor total de no máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor total de no máximo 50 mg de fósforo por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor total de fósforo de no máximo 20 mg de fósforo por 100 g de proteína. O isolado de BLG líquido tem um teor total de fósforo de no máximo 5 mg de fósforo por 100 g de proteína.
[00203] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 600 mg de potássio por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 500 mg de potássio por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o
53 / 172 isolado de BLG líquido compreende no máximo 400 mg de potássio por 100 g de proteína. Mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 300 mg de potássio por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido no máximo 200 mg de potássio por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 100 mg de potássio por 100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 50 mg de potássio por 100 g de proteína e, ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 10 mg de potássio por 100 g de proteína.
[00204] O teor de fósforo se refere à quantidade total de fósforo elementar da composição em questão e é determinado de acordo com o Exemplo 1.19. Similarmente, o teor de potássio se refere à quantidade total de potássio elementar da composição em questão e é determinado de acordo com o Exemplo 1.19.
[00205] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 100 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 700 mg de potássio/100g de proteína, preferivelmente no máximo 80 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 600 mg de potássio/100 g de proteína, mais preferivelmente no máximo 60 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 500 mg de potássio/100 g de proteína, mais preferivelmente no máximo 50 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 400 mg de potássio/100 g de proteína, ou mais preferivelmente no máximo 20 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 200 mg de potássio/100 g de proteína, ou ainda mais preferivelmente no máximo 10 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 50 mg de potássio/100 g de proteína. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 100 mg de fósforo/100 g de proteína e no máximo 340 mg de potássio/100 g de proteína.
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[00206] As composições com baixo nível de fósforo e/ou com baixo nível de potássio de acordo com a presente invenção podem ser usadas como um ingrediente alimentar para a produção de um produto alimentício para grupos de pacientes que tenham função renal reduzida.
[00207] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um pH na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8-4,4, ainda mais preferivelmente 3,0-4,0 e, o mais preferivelmente, 3,4-3,9.
[00208] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente 6,2-8,0, mais preferivelmente 6,3-7,7 e, ainda mais preferivelmente, 6,5-7,5.
[00209] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um pH na faixa de 5,0-6,0, preferivelmente 5,1- 5,9, mais preferivelmente 5,2-5,8 e, ainda mais preferivelmente, 5,3-5,7. Quando o isolado de BLG líquido é na faixa de pH 5,0-6,0, é muitas vezes preferível que o isolado de BLG líquido não contenha nenhum cristal de BLG. Isso pode ser conseguido certificando-se de que o isolado de BLG líquido esteja abaixo do ponto de saturação para BLG, por exemplo, aumentando-se a temperatura e/ou adicionando-se sal. Alternativamente, é possível manter o isolado de BLG líquido livre de cristais mesmo se estiver supersaturado no que se refere à BLG desde que ele seja mantido na zona metaestável e nenhum agente promotor de cristalização seja colocado em contato com o isolado de BLG líquido.
[00210] O isolado de BLG líquido preferivelmente tem um baixo teor de micro-organismos e isso é particularmente possível se a composição enriquecida com BLG já tenha um baixo nível de micro-organismos.
[00211] Em algumas modalidades da invenção, o isolado de BLG líquido contém no máximo 500.000 CFU/g, preferivelmente no máximo
100.000 CFU/g, mais preferivelmente no máximo 50.000 CFU/g, ainda mais
55 / 172 preferivelmente no máximo 10.000 CFU/g.
[00212] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido contém no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia (CFU)/g. Preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém no máximo 600 CFU/g. Mais preferível, o isolado de BLG líquido contém no máximo 300 CFU/g. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém no máximo 100 CFU/g. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém no máximo 50 CFU/g. O mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém no máximo 20 CFU/gm, tal como, por exemplo, no máximo 10 CFU/g. Em uma modalidade particularmente preferencial, o pó é estéril. Um isolado de BLG líquido estéril pode, por exemplo, ser preparado combinando-se vários processos de redução microbiana física durante a produção do pó de isolado de BLG, tal como, por exemplo, microfiltração e tratamento térmico em pH baixo (por exemplo, no máximo pH 4,0).
[00213] A preparação de um pó de isolado de BLG com um baixo grau de desdobramento de proteína requer que o isolado de BLG líquido já tenha um baixo grau de desdobramento de proteína, já que o desdobramento da BLG parece ser um processo irreversível.
[00214] Se um pó de isolado de BLG ou um isolado de BLG líquido com um baixo grau de desdobramento de BLG for necessário, o isolado de BLG líquido preferivelmente tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11.
[00215] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,12, preferivelmente pelo menos 1,13, mais preferivelmente pelo menos 1,15, ainda mais preferivelmente pelo menos 1,17 e, o mais preferivelmente, pelo menos 1,19.
[00216] Se o isolado de BLG líquido contiver quantidades consideráveis de matéria não proteica, é preferível isolar a fração de proteína
56 / 172 antes de medir a razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca. Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a fração de proteína do isolado de BLG líquido tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11.
[00217] Preferivelmente, a fração de proteína do isolado de BLG líquido pode ter uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,12, mais preferivelmente pelo menos 1,13, ainda mais preferivelmente pelo menos 1,15, ainda mais preferivelmente pelo menos 1,17 e, o mais preferivelmente, pelo menos 1,19.
[00218] A fração de proteína pode, por exemplo, ser separada do pó de isolado de BLG submetendo-a a diálise ou diafiltração baseada em ultrafiltração usando um filtro que retém a proteína.
[00219] A preparação de um pó de isolado de BLG com um baixo grau de desdobramento de proteína requer que o isolado de BLG líquido já tenha um baixo grau de desnaturação de proteína, já que a desnaturação de proteína parece ser um processo irreversível. Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10% p/p, preferivelmente no máximo 6% p/p, mais preferivelmente no máximo 4% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 2% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 1% p/p.
[00220] É muitas vezes preferível que uma quantidade substancial de BLG do isolado de BLG líquido seja BLG não agregada. Preferivelmente, pelo menos 50% da BLG são BLG não agregada. Mais preferivelmente, pelo menos 80% da BLG são BLG não agregada. Ainda mais preferível, pelo menos 90% da BLG são BLG não agregada. O mais preferível, pelo menos 95% da BLG são BLG não agregada. Ainda mais preferível, aproximadamente 100% da BLG do isolado de BLG líquido são BLG não agregada.
[00221] No entanto, pode também ser preferível que o isolado de BLG
57 / 172 líquido tenha um nível significativo de desnaturação de proteína, por exemplo, se uma bebida opaca for desejada. Assim, em outras modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG tem um grau de desnaturação de proteína de pelo menos 11%, preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos 75% e, o mais preferivelmente, pelo menos 90%.
[00222] Se o isolado de BLG líquido tiver um nível significativo de desnaturação de proteína, é muitas vezes preferível manter um nível baixo de matéria proteica insolúvel, isto é, matéria proteica precipitada que se assentaria em uma bebida durante o armazenamento. O nível de matéria insolúvel é medido de acordo com o Exemplo 1.10.
[00223] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido compreende no máximo 20% p/p de matéria proteica insolúvel, preferivelmente no máximo 10% p/p de matéria proteica insolúvel, mais preferivelmente no máximo 5% p/p de matéria proteica insolúvel, ainda mais preferível no máximo 3% p/p de matéria proteica insolúvel e, o mais preferível, no máximo 1% p/p de matéria proteica insolúvel. Pode até mesmo ser preferível que o isolado de BLG líquido não contenha nenhuma matéria proteica insolúvel.
[00224] Como mencionado acima, os presentes inventores constataram que a estabilidade térmica em pH 3,9 de um isolado de BLG líquido é uma boa indicadora de sua utilidade para bebidas com alto nível de proteína transparentes. A estabilidade térmica em pH 3,9 é medida de acordo com o Exemplo 1.2.
[00225] É particularmente preferível que o isolado de BLG líquido tenha uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 200 NTU, preferivelmente no máximo 100 NTU, mais preferível no máximo 60 NTU, ainda mais preferível no máximo 40 NTU e, o mais preferível, no máximo 20
58 / 172 NTU. Estabilidades térmicas ainda melhores são possíveis e o isolado de BLG líquido preferivelmente tem uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 10 NTU, preferivelmente no máximo 8 NTU, mais preferível no máximo 4 NTU, ainda mais preferível no máximo 2 NTU.
[00226] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma turvação de no máximo 200 NTU, preferivelmente no máximo 100 NTU, mais preferivelmente no máximo 50 NTU, ainda mais preferivelmente no máximo 20 NTU, ainda mais preferivelmente no máximo 10 NTU e, o mais preferivelmente, no máximo 2 NTU.
[00227] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma turvação de mais de 200 NTU, preferivelmente pelo menos 400 NTU, mais preferivelmente pelo menos 800 NTU, ainda mais preferivelmente pelo menos 1.000 NTU, ainda mais preferivelmente pelo menos 2.000 NTU e, o mais preferivelmente, pelo menos 5.000 NTU. Tais isolados de BLG líquidos são particularmente preferíveis para a produção de bebidas opacas.
[00228] Os presentes inventores observaram que o presente isolado de BLG líquido tem surpreendentemente uma viscosidade mais baixa do que um WPI líquido comparável. Os inventores constataram que isso torna o isolado de BLG líquido particularmente adequado como uma bebida com alto nível de proteína visto que possibilita obter um alto teor de proteína sem experimentar uma viscosidade alta desagradável.
[00229] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma viscosidade de 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 de visc(p) ± 50%, mais preferivelmente visc(p) ± 40%, ainda mais preferivelmente visc(p) ± 30% e, o mais preferivelmente, visc(p) ± 25%. visc(p) é definida como: visc(p) = Para p≤23%: 0,3556e0,1262*p ; Para p>23%:
59 / 172 0,0254*e0,24*p p é o teor total de proteína do isolado de BLG líquido expresso em % p/p, então, se o teor de proteína for, por exemplo, 31% p/p, então p é
31.
[00230] Isso significa que, se o isolado de BLG líquido (com um teor de proteína p) tiver, por exemplo, uma viscosidade a 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 de visc(p) ± 25%, então a viscosidade do isolado de BLG líquido é pelo menos visc(p)-25% e no máximo visc(p)+25%. Se o teor de proteína,p, do isolado de BLG líquido for, por exemplo, 31% p/p, as viscosidades mínima e máxima desse exemplo são: Viscosidade mínima (em cP): 0,0254*e0,24*31 - 25% = 43 cP - 25% = 32 cP Viscosidade máxima (em cP): 0,0254*e0,24*31 + 25% = 43 cP - 25% = 54 cP
[00231] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma viscosidade de 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 de visc(p) ± 20%, mais preferivelmente visc(p) ± 15%, ainda mais preferivelmente visc(p) ± 10% e, o mais preferivelmente, visc(p) ± 5%.
[00232] A viscosidade de um isolado de BLG líquido é medida de acordo com com o Exemplo 1.8, usando, no entanto, uma temperatura de 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1.
[00233] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma viscosidade a 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 de: pelo menos visc(p) - 20% e no máximo viscmáx(p) - 20%.
[00234] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma viscosidade a 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 de: pelo menos visc(p) - 10% e no máximo viscmáx(p) - 40%.
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[00235] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma viscosidade a 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 de: pelo menos visc(p) - 10% e no máximo viscmáx(p) - 50%.
[00236] Viscmáx(p) é definida como: viscmax(p) ≤ 0,611*e(0,1494*p)cP.
[00237] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma viscosidade a 15 graus C e uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 de no máximo viscmáx(p) – 10%, mais preferivelmente no máximo viscmáx(p) – 20%, ainda mais preferível viscmáx(p) – 30% e, o mais preferível, viscmáx(p) – 50%.
[00238] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um pH na faixa de 2,8-4,3 e, preferivelmente, 3,0-4,0 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de 20-34% p/p, mais preferivelmente na faixa de 24-32% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 28-32% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 90% p/p em relação ao total de proteína, mais preferivelmente pelo menos 94% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo preferivelmente um ou mais dos seguintes itens: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 2%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 20 NTU, - é estéril e - uma viscosidade a 15 graus C de visc(p) ± 25%, em que p é o teor de proteína na unidade % p/p e visc(p) = Para p≤23%: 0,3556e0,1262*p ;
61 / 172 Para p>23%: 0,0254*e0,24*p.
[00239] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um pH na faixa de 6,3-8,0 e, mais preferivelmente, 6,5-7,5 e compreende: - total de proteína em uma quantidade de 20-34% p/p, mais preferivelmente na faixa de 24-32% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 28-30% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 90% p/p em relação ao total de proteína, mais preferivelmente pelo menos 94% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo preferivelmente um ou mais dos seguintes itens: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,15, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 5%, - uma estabilidade térmica em pH 3,9 de no máximo 40 NTU, - é estéril e - uma viscosidade a 15 graus C de visc(p) ± 25%, em que p é o teor de proteína na unidade % p/p e visc(p) = Para p≤23%: 0,3556e 0,1262*p ; Para p>23%: 0,0254*e0,24*p.
[00240] Tais isolados de BLG líquidos ácidos com alto nível de proteína são particularmente úteis para a produção de pós de isolado de BLG de alta qualidade e têm ambos uma viscosidade surpreendentemente baixa em relação a WPIs comparáveis, o que faz o processamento tal como microfiltração consumir menos energia. Os isolados de BLG líquidos ácidos com alto nível de proteína possibilitam ainda produzir pó de proteína de soro de queijo ácido com uma densidade aparente muito mais alta do que a que pode ser alcançada para um WPI tradicional com o mesmo teor de proteína (consultar, por exemplo, o Exemplo 7).
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[00241] O isolado de BLG líquido pode ser provido de diversas maneiras.
[00242] Tipicamente, a provisão do isolado de BLG líquido envolve, ou mesmo consiste em, isolar a BLG de um alimento de proteína de soro de queijo para prover uma composição enriquecida com BLG por um ou mais dos seguintes métodos: - cristalização ou precipitação de BLG por salting-in, - cristalização ou precipitação de BLG por salting-out, - cromatografia por troca iônica e - fracionamento de proteínas de soro de queijo por ultrafiltração.
[00243] Uma maneira particularmente preferível de prover a composição enriquecida com BLG é por cristalização de BLG, preferivelmente por salting-in ou, alternativamente, por salting-out.
[00244] O alimento de proteína de soro de queijo é preferivelmente um WPC, um WPI, um SPC, um SPI, ou uma combinação dos mesmos.
[00245] A expressão “alimento de proteína de soro de queijo” se refere à composição da qual a composição enriquecida com BLG e, subsequentemente, o isolado de BLG líquido são derivados. Os atributos químicos e as modalidades descritos no contexto da solução de proteína de soro de queijo também se aplicam ao alimento de proteína de soro de queijo, com a exceção de que o alimento de proteína de soro de queijo tipicamente não é supersaturado no que se refere à BLG e de que o pH do alimento não é limitado à faixa 5-6.
[00246] Em algumas modalidades da invenção, a preparação da composição enriquecida com BLG inclui, ou mesmo consiste em, cristalização de BLG com alto nível de sal na faixa de pH 3,6-4,0 de acordo com o documento US 2.790.790 A1.
[00247] Em outras modalidades da invenção, a preparação da
63 / 172 composição enriquecida com BLG inclui, ou mesmo consiste no, método descrito por de Jongh et al (Mild Isolation Procedure Discloses New Protein Structural Properties of β-Lactoglobulin [Procedimento de isolamento leve revela novas propriedades estruturais proteicas da β-lactoglobulina], J Dairy Sci., vol. 84(3), 2001, páginas 562-571) ou por Vyas et al (Scale-Up of Native β-Lactoglobulin Affinity Separation Process [Escalamento do processo de separação por afinidade da β-lactoglobulina nativa], J. Dairy Sci. 85:1639– 1645, 2002).
[00248] No entanto, em modalidades particularmente preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG é preparada por cristalização em pH 5-6 sob condições de salting-in como descrito no pedido PCT PCT/EP2017/084553, que é incorporado ao presente documento a título de referência para todos os fins.
[00249] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG é uma composição de BLG comestível de acordo com o PCT/EP2017/084553 que contém pelo menos 90% de BLG em relação ao total de proteína e que, preferivelmente, contém cristais de BLG.
[00250] Preferivelmente, a composição enriquecida com BLG é preparada por um processo que compreende as etapas de prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda BLG não agregada e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, cristalizar BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada e separar os cristais de BLG da solução de proteína de soro de queijo restante, lavar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 5) e
64 / 172 recristalizar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 4).
[00251] Esse processo para preparar a composição enriquecida com BLG compreende as etapas obrigatórias 1), 2) e 3) e nessa sequência e pode, opcionalmente, conter as etapas 4) e/ou 5) em qualquer sequência e número de iterações. No entanto, as etapas 4) e 5) muitas vezes seguem a etapa 3). Alternativa ou adicionalmente, água de lavagem pode ser adicionada à solução de proteína de soro de queijo contendo cristais antes da separação.
[00252] O processo pode, adicionalmente, compreender uma etapa de secagem da composição enriquecida com BLG. No entanto, é presentemente preferido usar a composição enriquecida com BLG sem secá-la, para evitar o risco de danificar a proteína durante a secagem.
[00253] Como dito, a etapa 1) do processo de cristalização envolve prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreende BLG não agregada e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional.
[00254] A solução de proteína de soro de queijo preferivelmente contém pelo menos uma proteína de soro de queijo não agregada adicional selecionada do grupo que consiste em alfa-lactalbumina, albumina sérica bovina, imunoglobulinas, caseinomacropeptídeo (CMP), osteopontina, lactoferrina, lactoperoxidase, proteínas da membrana do glóbulo de gordura, e combinações dos mesmos.
[00255] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo compreende no máximo 10% p/p de caseína em relação à quantidade total de proteína, preferivelmente no máximo 5% p/p, mais preferivelmente no máximo 1% p/p e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% de caseína em relação à quantidade total de proteína. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo não contém qualquer quantidade detectável de caseína.
[00256] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução
65 / 172 de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 5% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 10% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 15% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.
[00257] Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 20% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender pelo menos 30% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.
[00258] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 1% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 2% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 3% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender pelo menos 4% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.
[00259] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 35% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 40% p/p de proteína de soro de queijo adicional
66 / 172 em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode, por exemplo, compreender pelo menos 45% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 50% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.
[00260] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 5-90% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender na faixa de 10-80% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode, por exemplo, compreender na faixa de 20- 70% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 30-70% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.
[00261] Como dito, os presentes inventores constataram que é possível cristalizar BLG não agregada sem o uso de solventes orgânicos. Essa abordagem de purificação pode também ser usada para refinar preparações contendo proteína de soro de queijo, preparações essas que já foram submetidas a alguma purificação de BLG, e provê um processo simples para aumentar a pureza de BLG não agregada ainda mais. Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 1-20% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender na faixa de 2-15% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro
67 / 172 de queijo da etapa 1) pode, por exemplo, compreender na faixa de 3-10% p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.
[00262] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 5% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 10% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 15% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender pelo menos 20% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00263] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 25% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 30% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende preferivelmente pelo menos 35% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender pelo menos 40% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00264] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 5-95% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 5-70% p/p de ALA não agregada em relação à
68 / 172 quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender na faixa de 10-60% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende preferivelmente na faixa de 12-50% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender na faixa de 20-45% p/p de ALA não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00265] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada de pelo menos 0,01. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada de pelo menos 0,5. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada de pelo menos 1, tal como, por exemplo, pelo menos 2. Por exemplo, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode ter uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada de pelo menos 3.
[00266] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada na faixa de 0,01-20. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada na faixa de 0,2-10. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada na faixa de 0,5-4. Por exemplo, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode ter uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA não agregada na faixa de 1-3.
[00267] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 1% p/p de
69 / 172 BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 2% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 5% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender pelo menos 10% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00268] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 12% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Por exemplo, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 15% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode, por exemplo, compreender pelo menos 20% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender pelo menos 30% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00269] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende no máximo 95% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender no máximo 90% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode, por exemplo, compreender no máximo 85% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode, por exemplo, compreender no máximo 80% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de
70 / 172 proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender no máximo 78% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender no máximo 75% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00270] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 1-95% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender na faixa de 5-90% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 10-85% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 10-80% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender na faixa de 20-70% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00271] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 10-95% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode compreender na faixa de 12-90% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 15-85% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 15-80% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) pode
71 / 172 compreender na faixa de 30-70% p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.
[00272] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende pelo menos 0,4% p/p de BLG não agregada em relação ao peso da solução de proteína de soro de queijo. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 1,0% p/p de BLG não agregada. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 2,0% p/p de BLG não agregada. É ainda mais preferível que a solução de proteína de soro de queijo compreenda pelo menos 4% p/p de BLG não agregada.
[00273] Concentrações mais altas de BLG não agregada são ainda mais preferidas e, preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 6% p/p de BLG não agregada. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 10% p/p de BLG não agregada. É ainda mais preferível que a solução de proteína de soro de queijo compreenda pelo menos 15% p/p de BLG não agregada.
[00274] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 0,4-45% p/p de BLG não agregada em relação ao peso da solução de proteína de soro de queijo. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende na faixa de 1-35% p/p de BLG não agregada. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende na faixa de 4-30% p/p de BLG não agregada. É ainda mais preferível que a solução de proteína de soro de queijo compreenda na faixa de 10-25% p/p de BLG não agregada.
[00275] Teores mais altos de BLG são particularmente preferíveis, assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende na faixa de 10-45% p/p de BLG não agregada em relação ao peso da solução de proteína de soro de queijo. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende
72 / 172 na faixa de 15-40% p/p de BLG não agregada. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende na faixa de 20-39% p/p de BLG não agregada. É ainda mais preferível que a solução de proteína de soro de queijo compreenda na faixa de 25-38% p/p de BLG não agregada.
[00276] É muitas vezes preferível que uma quantidade substancial de BLG da solução de proteína de soro de queijo seja BLG não agregada. Preferivelmente, pelo menos 50% da BLG são BLG não agregada. Mais preferivelmente, pelo menos 80% da BLG são BLG não agregada. Ainda mais preferível, pelo menos 90% da BLG são BLG não agregada. O mais preferível, pelo menos 95% da BLG são BLG não agregada. Ainda mais preferível, aproximadamente 100% da BLG da solução de proteína de soro de queijo são BLG não agregada.
[00277] Qualquer fonte de proteína de soro de queijo adequada pode ser usada para preparar a solução de proteína de soro de queijo. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo compreende, ou até mesmo consiste em, um concentrado de proteína de soro de leite, concentrado de proteína de soro de queijo, isolado de proteína de soro de leite, isolado de proteína de soro de queijo, ou uma combinação dos mesmos.
[00278] É preferível que a solução de proteína de soro de queijo seja uma solução de proteína de soro de queijo desmineralizada.
[00279] Neste contexto, o termo desmineralizado significa que a condutividade da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 15 mS/cm e, preferivelmente, no máximo 10 mS/cm e, ainda mais preferivelmente, no máximo 8 mS/cm. A condutividade de permeado de UF de uma solução de proteína de soro de queijo desmineralizada é preferivelmente no máximo 7 mS/cm, mais preferivelmente no máximo 4 mS/cm e, ainda mais preferivelmente, no máximo 1 mS/cm.
[00280] É particularmente preferível que a solução de proteína de soro
73 / 172 de queijo seja um concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado, um isolado de proteína de soro de leite desmineralizado, um concentrado de proteína de soro de queijo desmineralizado, ou um isolado de proteína de soro de queijo desmineralizado.
[00281] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo compreende, ou até mesmo consiste em, um concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado e com pH ajustado, concentrado de proteína de soro de queijo, isolado de proteína de soro de leite, isolado de proteína de soro de queijo, ou uma combinação dos mesmos.
[00282] A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, compreender, ou até mesmo consistir em, um concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo pode compreender, ou até mesmo consistir em, um concentrado de proteína de soro de queijo desmineralizado. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo pode compreender, ou até mesmo consistir em, um isolado de proteína de soro de leite desmineralizado. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo pode compreender, ou até mesmo consistir em, um isolado de proteína de soro de queijo desmineralizado.
[00283] A composição enriquecida com BLG é preferivelmente preparada a partir de leite mamífero e, preferivelmente, do leite de um ruminante, tal como, por exemplo, de vaca, ovelha, cabra, búfalo, camelo, lhama, égua e/ou veado. Proteína derivada de leite bovino é particularmente preferível.
[00284] A proteína da solução de proteína de soro de queijo é preferivelmente o mais próximo possível de seu estado nativo e, preferivelmente, somente foi submetida a tratamentos térmicos delicados, se foi submetida a algum.
[00285] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução
74 / 172 de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 80 mg/100 g de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 40 mg/100 g de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 20 mg/100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 10 mg/100 g de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 5 mg/100 g de proteína, tal como, por exemplo, preferivelmente um valor de furosina de 0 mg/ 100 g de proteína.
[00286] A solução de proteína de soro de queijo tipicamente contém outros componentes além de proteína. A solução de proteína de soro de queijo pode conter outros componentes que são normalmente encontrados no soro de queijo ou no soro de leite, tais como, por exemplo, minerais, carboidrato, e/ou lipídio. Alternativa ou adicionalmente, a solução de proteína de soro de queijo pode conter componentes que não sejam nativos ao soro de queijo ou ao soro de leite. No entanto, tais componentes não nativos devem preferivelmente ser seguros para uso na produção de alimentos e, preferivelmente, também para o consumo humano.
[00287] O presente processo é particularmente vantajoso para separar BLG de soluções de proteína de soro de queijo brutas que contenham outros sólidos além da BLG.
[00288] A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, conter carboidratos, tais como, por exemplo, lactose, oligossacarídeos e/ou produtos de hidrólise da lactose (isto é, glicose e galactose). A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, conter carboidrato na faixa de 0-40% p/p, tal como na faixa de 1-30% p/p, ou na faixa de 2-20% p/p.
[00289] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo contém no máximo 20% p/p de carboidrato,
75 / 172 preferivelmente no máximo 10% p/p de carboidrato, mais preferivelmente no máximo 5% p/p de carboidrato e, ainda mais preferivelmente, no máximo 2% p/p de carboidrato.
[00290] A solução de proteína de soro de queijo pode também compreender lipídio, por exemplo, na forma de triglicerídeo e/ou outros tipos de lipídio, tais como fosfolipídios.
[00291] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende uma quantidade total de lipídio de no máximo 15% p/p em relação ao total de sólidos. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende uma quantidade total de lipídio de no máximo 10% p/p em relação ao total de sólidos. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende uma quantidade total de lipídio de no máximo 6% p/p em relação ao total de sólidos. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende uma quantidade total de lipídio de no máximo 1,0% p/p em relação ao total de sólidos. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) compreende uma quantidade total de lipídio de no máximo 0,5% p/p em relação ao total de sólidos.
[00292] A quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é tipicamente pelo menos 1% p/p em relação ao peso da solução de proteína de soro de queijo. Preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é pelo menos 5% p/p. Mais preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é pelo menos 10% p/p. Ainda mais preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é pelo menos 15% p/p.
[00293] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 1-50% p/p. Preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução
76 / 172 de proteína de soro de queijo é na faixa de 5-40% p/p. Mais preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 10-30% p/p. Ainda mais preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 15-25% p/p.
[00294] A quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é determinada de acordo com o Exemplo 1.5.
[00295] A solução de proteína de soro de queijo é tipicamente preparada submetendo-se um alimento de proteína de soro de queijo a um ou mais ajustes que formam a solução de proteína de soro de queijo que é supersaturada no que se refere à BLG.
[00296] O alimento de proteína de soro de queijo é preferivelmente um WPC, um WPI, um SPC, um SPI, ou uma combinação dos mesmos.
[00297] A expressão “alimento de proteína de soro de queijo” se refere à composição da qual a composição enriquecida com BLG e, subsequentemente, o isolado de BLG líquido são derivados. O alimento de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser transformado na solução de proteína de soro de queijo supersaturada no que se refere à BLG. O alimento de proteína de soro de queijo é tipicamente um líquido aquoso que compreende BLG e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, mas normalmente não é supersaturado no que se refere à BLG.
[00298] As modalidades referentes à composição química da solução de proteína de soro de queijo aplicam-se igualmente ao alimento de proteína de soro de queijo. No entanto, tipicamente pelo menos um parâmetro do alimento de proteína de soro de queijo é definido para evitar supersaturação ou pelo menos cristalização espontânea.
[00299] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo supersaturada é preparada submetendo-se o alimento de proteína de soro de queijo a um ou mais dos seguintes ajustes: ajuste do pH,
77 / 172 redução da condutividade redução da temperatura aumento da concentração proteica adição de um agente que reduza a atividade da água modificação da composição iônica.
[00300] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve ajustar o pH do alimento de proteína de soro de queijo a um pH na faixa de 5-6.
[00301] Todos os valores de pH são medidos com o uso de um eletrodo de vidro de pH e são normalizados a 25 graus C. A normalização a 25 graus C é tipicamente realizada pelo medidor de pH. Alternativamente, a temperatura da amostra é ajustada para 25 graus C.
[00302] A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ter um pH na faixa de 4,9-6,1. O pH da solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser na faixa de 5,0-6,1. Alternativamente, o pH da solução de proteína de soro de queijo pode ser na faixa de 5.1-6.1. Preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,1-6,0.
[00303] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,0-6,0. Preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,1-6,0. Mais preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,1-5,9. Ainda mais preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo pode ser na faixa de 5.2-5.9. O mais preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,2-5,8.
[00304] O pH é preferivelmente ajustado com o uso de ácidos e/ou bases aceitáveis para uso em alimentos. Ácidos aceitáveis para uso em alimentos são particularmente preferíveis, tais como, por exemplo, ácidos carboxílicos. Exemplos úteis de tais ácidos são, por exemplo, ácido acético, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido butírico, ácido cítrico,
78 / 172 ácido fólico, ácido fumárico, ácido glucônico, ácido clorídrico, ácido lático, ácido málico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido sórbico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, e/ou misturas dos mesmos.
[00305] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pH é ajustado com o uso de uma lactona, tal como, por exemplo, D-glucono-delta- lactona, que lentamente hidrolisa e ao mesmo tempo reduz o pH do líquido aquoso que a contém. O pH-alvo após a hidrólise da lactona ter terminado pode ser calculado de maneira precisa.
[00306] Exemplos úteis de bases aceitáveis para uso em alimentos são, por exemplo, fontes de hidróxido tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, sais de ácidos alimentícios tais como, por exemplo, citrato trissódico, e/ou combinações dos mesmos.
[00307] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o pH é ajustado pela adição de material de troca de cátions em sua forma H+. Material de troca de cátions do tipo conta/partícula grande é facilmente removido da solução de proteína de soro de queijo antes da cristalização ou até mesmo após a cristalização. O ajuste do pH pela adição de material de troca de cátions na sua forma H+ é particularmente vantajoso na presente invenção visto que reduziu o pH sem adicionar contraíons negativos que afetam significativamente a condutividade do alimento de proteína de soro de queijo.
[00308] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve reduzir a condutividade do alimento de proteína de soro de queijo.
[00309] Os valores de condutividade mencionados no presente documento foram normalizados a 25 graus C a não ser que seja especificado em contrário.
[00310] Constatou-se que reduzir a condutividade da solução de proteína de soro de queijo leva a um rendimento mais alto de cristais de BLG.
79 / 172 A mínima condutividade obtenível da solução de proteína de soro de queijo depende da composição da fração proteica e da fração de lipídio (se houver). Algumas espécies de proteína, tais como, por exemplo, caseinomacropeptídeo (CMP), contribuem mais para a condutividade do que outras espécies de proteína. É, portanto, preferível que a condutividade do alimento de proteína de soro de queijo seja aproximada do nível em que a proteína e os contraíons da proteína são os principais contribuidores à condutividade. A redução de condutividade muitas vezes envolve a remoção de pelo menos uma parte dos íons pequenos e livres que estão presentes na fase líquida e não ligados firmemente às proteínas.
[00311] É muitas vezes preferível que a solução de proteína de soro de queijo tenha uma condutividade de no máximo 10 mS/cm. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 5 mS/cm. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 4 mS/cm.
[00312] Condutividades inferiores são ainda mais preferíveis e ocasionam rendimentos mais alto de cristais de BLG. Assim, a solução de proteína de soro de queijo preferivelmente tem uma condutividade de no máximo 3 mS/cm. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 1 mS/cm. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 0,5 mS/cm.
[00313] A condutividade do alimento de proteína de soro de queijo é preferivelmente reduzida por diálise ou diafiltração. Diafiltração por ultrafiltração é particularmente preferível visto que permite a lavagem de sais e pequenas moléculas carregadas enquanto as proteínas são retidas. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a mesma unidade de UF é usada para UF/diafiltração e subsequente concentração do alimento de
80 / 172 proteína de soro de queijo.
[00314] A razão entre a condutividade (expressa em mS/cm) e a quantidade total de proteína na solução de proteína de soro de queijo (expressa em % em peso do total de proteína em relação ao peso total da solução de proteína de soro de queijo) pode ser vantajosamente mantida em ou abaixo de um certo limiar para facilitar a cristalização de BLG.
[00315] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,3. Preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,25. Preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,20. Mais preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,18. Ainda mais preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,12. O mais preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,10.
[00316] É, por exemplo, preferível que a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo seja aproximadamente 0,07, ou até mesmo inferior.
[00317] Os presentes inventores constataram adicionalmente que o alimento de proteína de soro de queijo pode ser vantajosamente condicionado para prover uma solução de proteína de soro de queijo com uma condutividade de permeado de UF de no máximo 10 mS/cm. A condutividade de permeado de UF é uma medida da condutividade da fração de molécula pequena de um líquido. Quando o termo “condutividade” é usado no presente documento por si só, ele se refere à condutividade do líquido em questão.
81 / 172 Quando a expressão “condutividade de permeado de UF” é usada, ela se refere à condutividade da fração de molécula pequena de um líquido e é medida de acordo com o Exemplo 1.23.
[00318] Preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 7 mS/cm. Mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 5 mS/cm. Ainda mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 3 mS/cm.
[00319] Condutividades de permeado de UF ainda mais baixas podem ser usadas e são particularmente preferíveis se um alto rendimento de BLG dever ser obtido. Assim, preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 1,0 mS/cm. Mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,4 mS/cm. Ainda mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,1 mS/cm. O mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,04 mS/cm.
[00320] Condutividades de permeado de UF ainda mais baixas podem ser alcançadas, por exemplo, se for usada água Milli-Q como um diluente durante a diafiltração (a água Milli-Q tem uma condutividade de aproximadamente 0,06 µS/cm). Assim, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,01 mS/cm. Alternativamente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,001 mS/cm. Alternativamente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,0001 mS/cm.
[00321] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a
82 / 172 preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve reduzir a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo.
[00322] Por exemplo, a preparação da solução de proteína de soro de queijo pode envolver reduzir a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos 5 graus C, preferivelmente pelo menos 10 graus C e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 15 graus C. Por exemplo, a preparação da solução de proteína de soro de queijo pode envolver reduzir a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos 20 graus C.
[00323] A temperatura do alimento de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser reduzida a no máximo 30 graus C, preferivelmente no máximo 20 graus C e, ainda mais preferivelmente, a no máximo 10 graus C. Os inventores constataram que temperaturas ainda mais baixas proveem um maior grau de supersaturação e, assim, a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser reduzida a no máximo 5 graus C, preferivelmente no máximo 2 graus C e, ainda mais preferivelmente, a no máximo 0 graus C. A temperatura pode até mesmo ser inferior a 0 graus C. No entanto, preferivelmente a solução de proteína de soro de queijo deve permanecer bombeável, por exemplo, na forma de uma pasta fluida gelada.
[00324] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo é uma pasta fluida gelada antes da inicialização da cristalização de BLG. Alternativa ou adicionalmente, a cristalização da solução de proteína de soro de queijo pode ser convertida em ou mantida como uma pasta fluida gelada durante a cristalização de BLG da etapa 2).
[00325] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve aumentar a concentração total de proteína do alimento de proteína de soro de queijo. O alimento de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser submetido a uma ou mais etapas de concentração proteica, tais como
83 / 172 ultrafiltração, nanofiltração, osmose reversa, e/ou evaporação e, desse modo, concentrado para obter-se a solução de proteína de soro de queijo.
[00326] Ultrafiltração é particularmente preferível visto que permite concentração seletiva de proteína enquanto as concentrações de sais e carboidratos praticamente não são afetadas. Como mencionado acima, a ultrafiltração é preferivelmente usada tanto para diafiltração quanto para concentração do alimento de proteína de soro de queijo.
[00327] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a concentração de BLG na solução de proteína de soro de queijo é abaixo do nível em que a cristalização espontânea de BLG ocorre. É, portanto, muitas vezes preferível interromper as modificações do alimento de proteína de soro de queijo quando a solução de proteína de soro de queijo está na região metaestável, isto é, na região supersaturada em que os cristais de BLG podem crescer quando é usada semeadura, mas em que a cristalização não se inicia espontaneamente.
[00328] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve adição de um ou mais agente(s) redutor(es) de atividade de água ao alimento de proteína de soro de queijo.
[00329] Exemplos úteis, mas não limitantes, de tais agentes redutores de atividade de água são polissacarídeos e/ou polietilenoglicol (PEG).
[00330] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve modificar a composição iônica do alimento de proteína de soro de queijo, por exemplo, por troca iônica, pela adição de novas espécies iônicas, por diálise ou por diafiltração.
[00331] Tipicamente, a solução de proteína de soro de queijo é preparada combinando-se duas ou mais das etapas de processo acima para criar supersaturação.
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[00332] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos: - concentração, por exemplo, com o uso de ultrafiltração, nanofiltração ou osmose reversa, a uma temperatura acima de 10 graus C, e - subsequente resfriamento a uma temperatura abaixo de 10 graus C.
[00333] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos - concentração em um pH acima de 6,0, e - subsequente redução do pH pela adição de um ácido (por exemplo, GDL ou material de troca de cátions na forma H+)
[00334] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos: - redução da condutividade, por exemplo, por diafiltração com o uso de uma membrana que retenha pelo menos BLG não agregada.
[00335] Em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a uma combinação de pelo menos: - ajuste do pH a 5-6, - redução da condutividade por diafiltração com o uso de uma membrana que retenha pelo menos BLG não agregada, - concentração proteica, por exemplo, com o uso de ultrafiltração, nanofiltração ou osmose reversa, a uma temperatura acima de 10 graus C e - finalmente, resfriamento a uma temperatura abaixo de 10 graus C.
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[00336] Os presentes inventores constataram adicionalmente que o rendimento de BLG do presente processo pode ser melhorado controlando-se a razão molar entre a soma de sódio+potássio vs. a soma de cálcio e magnésio. Uma quantidade relativa mais alta de cálcio e magnésio surpreendentemente parece aumentar o rendimento de BLG não agregada e, portanto, aumenta a eficiência da recuperação de BLG do presente processo.
[00337] Em algumas modalidades preferenciais da presente invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 4. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 2. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 1,5 e, ainda mais preferivelmente, no máximo 1,0. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa 1) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 0,5, tal como, por exemplo, no máximo 0,2.
[00338] A razão molar entre Na + K e Ca + Mg é calculada como (mNa+mK)/(mCa+mMg) em que mNa é o teor de Na elementar em mol, mK é o teor de K elementar em mol, mCa é o teor de Ca elementar em mol, e mMg é o teor de Mg elementar em mol.
[00339] É particularmente preferível que a solução de proteína de soro de queijo tenha sido supersaturada no que se refere à BLG por meio de salting-in e que a BLG, portanto, possa ser cristalizada da solução de proteína de soro de queijo por meio de salting-in.
[00340] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo tem um teor baixo de proteína desnaturada, particularmente se o produto de BLG comestível da presente invenção dever ter também um grau de desnaturação de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um grau de desnaturação de proteína de no máximo 2%,
86 / 172 preferivelmente no máximo 1,5%, mais preferivelmente no máximo 1,0% e, o mais preferivelmente, no máximo 0,8%.
[00341] A etapa 2) do processo envolve cristalizar pelo menos uma parte da BLG da solução de proteína de soro de queijo supersaturada.
[00342] É particularmente preferível que a cristalização da etapa 2) aconteça por meio de salting-in, isto é, em um líquido que tenha uma baixa força iônica e condutividade. Isso é contrário ao modo salting-out, em que quantidades significativas de sais são adicionadas a uma solução a fim de provocar cristalização.
[00343] A cristalização de BLG da etapa 2) pode, por exemplo, envolver um ou mais dos seguintes itens: espera para que a cristalização aconteça, adição de sementes de cristalização, aumento dos graus de supersaturação de BLG ainda mais e/ou estimulação mecânica.
[00344] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa 2) envolve adicionar sementes de cristalização à solução de proteína de soro de queijo. Os inventores constataram que a adição de sementes de cristalização possibilita controlar quando e onde a cristalização de BLG acontece para evitar o súbito entupimento do equipamento de processo e interrupções não intencionais durante a produção. É, por exemplo, muitas vezes desejável evitar cristalização inicial enquanto se concentra o alimento de proteína de soro de queijo.
[00345] É particularmente preferível que a solução de proteína de soro de queijo não entre em contato com uma membrana de UF ou membrana de MF em operação durante a etapa 2) a não ser que membranas cerâmicas ou sistemas de alto cisalhamento, tais como DCF, sejam empregados.
[00346] Em princípio, pode ser usado qualquer material de semente que inicie a cristalização de BLG. No entanto, é preferível que cristais de
87 / 172 BLG hidratados ou cristais de BLG secados sejam usados para semeadura para evitar adicionar impurezas adicionais à solução de proteína de soro de queijo.
[00347] As sementes de cristalização podem ser na forma seca ou podem formar parte de uma suspensão quando adicionadas à solução de proteína de soro de queijo. Adicionar uma suspensão contendo as sementes de cristalização, por exemplo, cristais de BLG, é presentemente preferível visto que parece prover um início mais rápido de cristalização. É preferível que uma tal suspensão contenha sementes de cristalização com um pH na faixa de 5-6 e uma condutividade de no máximo 10 mS/cm.
[00348] Observa-se que a unidade de condutividade “mS/cm” significa milliSiemens por cm e 1,00 mS corresponde a 1.000 microS.
[00349] É particularmente preferível que as sementes de cristalização sejam adicionadas por meio de uma suspensão de cristais de BLG que não tenham sido secados após a cristalização de BLG. Uma tal suspensão poderia, por exemplo, ser uma porção de cristais de BLG e licor-mãe obtidos na etapa 2) de um lote anterior ou uma porção de cristais de BLG úmidos obtidos na etapa 3), 4) ou 5) de um lote anterior.
[00350] Os presentes inventores observaram que o uso de cristais de BLG úmidos para sementes de cristalização provê cristais de BLG muito maiores durante a etapa 2) do que se forem usados cristais de BLG secos ou mal hidratados, o que de novo torna a separação de BLG do licor-mãe mais eficiente. Em um experimento em que o alimento de proteína de soro de queijo, as condições de cristalização, o tamanho de massa e partícula do material de semeadura, o perfil de resfriamento, e o método de separação foram os mesmos, os inventores constataram que a semeadura com cristais de BLG não secados proveu um aumento de 100% no tamanho de partícula dos cristais obtidos (tamanho de partícula obtido: 100-130 mícrons) em relação aos cristais de BLG obtidos por semeadura com cristais de BLG secados e
88 / 172 reidratados (tamanho de partícula obtido: 40-60 mícrons).
[00351] Alternativamente, se as sementes de cristalização são baseadas em cristais de BLG secados, é preferível ressuspender os cristais em um líquido aquoso, por exemplo, água, e permitir que os cristais de BLG secados reidratem por pelo menos 30 minutos, preferivelmente pelo menos 1,0 hora e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 1,5 hora antes de a suspensão de cristal de BLG resultante ser usada para iniciar a cristalização.
[00352] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos algumas das sementes de cristalização se localizam em uma fase sólida que é colocada em contato com a solução de proteína de soro de queijo.
[00353] As sementes de cristalização preferivelmente têm um tamanho de partícula menor do que o tamanho desejado dos cristais de BLG. O tamanho das sementes de cristalização pode ser modificado removendo-se as sementes maiores por crivagem ou outros processos de fracionamento de tamanho. A redução de tamanho de partícula, por exemplo, por meio de moagem, pode também ser empregada antes do fracionamento de tamanho de partícula.
[00354] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos 90% p/p das sementes de cristalização têm um tamanho de partícula (medido por análise por crivagem) na faixa de 0,1-600 mícrons. Por exemplo, pelo menos 90% p/p das sementes de cristalização pode ter um tamanho de partícula na faixa de 1-400 mícrons. Preferivelmente, pelo menos 90% p/p das sementes de cristalização pode ter um tamanho de partícula na faixa de 5-200 mícrons. Mais preferivelmente, pelo menos 90% p/p das sementes de cristalização pode ter um tamanho de partícula na faixa de 5-100 mícrons.
[00355] O tamanho de partícula e a dosagem das sementes de cristalização podem adaptados para prover a cristalização de BLG ideal.
[00356] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, as sementes de cristalização são adicionadas ao alimento de proteína de soro de
89 / 172 queijo antes de se obter a supersaturação no que se refere à BLG, mas preferivelmente de modo que pelo menos algumas das sementes de cristalização ainda estejam presentes quando a supersaturação for alcançada. Isso pode, por exemplo, ser conseguido adicionando-se sementes de cristalização quando o alimento de proteína de soro de queijo está perto da supersaturação, por exemplo, durante o resfriamento, a concentração e/ou o ajuste de pH, e para alcançar a supersaturação antes de as sementes de cristalização serem completamente dissolvidas.
[00357] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa 2) envolve aumentar o grau de supersaturação de BLG ainda mais, preferivelmente a um grau em que a cristalização de BLG inicie imediatamente, isto é, em no máximo por 20 minutos e, preferivelmente, em no máximo por 5 minutos. Isso é também chamado de a zona de nucleação, em que cristalitos se formam espontaneamente e começam o processo de cristalização.
[00358] O grau de supersaturação pode, por exemplo, ser aumentado por um ou mais dos seguintes itens: aumentar mais a concentração proteica da solução de proteína de soro de queijo resfriar mais a solução de proteína de soro de queijo aproximar a solução de proteína de soro de queijo do pH ideal para cristalização de BLG reduzir a condutividade ainda mais.
[00359] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa 2) envolve esperar que os cristais de BLG se formem. Isso pode levar várias horas e é tipicamente para uma solução de proteína de soro de queijo que é apenas ligeiramente supersaturada no que se refere à BLG e à qual nenhuma semente de cristalização foi adicionada.
[00360] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a
90 / 172 provisão da solução de proteína de soro de queijo (etapa 1) e a cristalização de BLG (etapa 2) ocorrem como duas etapas separadas.
[00361] No entanto, em outras modalidades preferenciais da invenção, a etapa 2) envolve ajuste adicional da solução de proteína de soro de queijo em cristalização para elevar o grau de supersaturação de BLG, ou pelo menos manter a supersaturação. O ajuste adicional resulta em um aumento no rendimento de cristais de BLG.
[00362] Tal ajuste adicional pode envolver um ou mais de: aumentar ainda mais a concentração proteica da solução de proteína de soro de queijo em cristalização resfriar a solução de proteína de soro de queijo em cristalização a uma temperatura ainda mais baixa aproximar a solução de proteína de soro de queijo em cristalização ainda mais do pH ideal para a cristalização de BLG reduzir ainda mais a condutividade da solução de proteína de soro de queijo em cristalização.
[00363] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo em cristalização é mantida na zona metaestável durante a etapa 2) para evitar a formação espontânea de novos cristalitos.
[00364] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos durante a etapa 2) têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21.
[00365] Preferivelmente, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 (±5%) Å, b = 68,68 (±5%) Å, e c = 156,65 (±5%) Å; e ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.
[00366] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 (±2%)
91 / 172 Å, b = 68,68 (±2%) Å, e c = 156,65 (±2%) Å; e os ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.
[00367] Ainda mais preferível, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos podem ter um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 (±1%) Å, b = 68,68 (±1%) Å, e c = 156,65 (±1%) Å; e os ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.
[00368] O mais preferivelmente, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 Å, b = 68,68 Å, e c = 156,65 Å; e os ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.
[00369] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, o processo contém uma etapa 3) de separar pelo menos alguns dos cristais de BLG da solução de proteína de soro de queijo restante. Isso é especialmente preferível quando a purificação de BLG é desejada.
[00370] A etapa 3) pode, por exemplo, compreender separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 30% p/p. Preferivelmente, a etapa 3) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 40% p/p. Ainda mais preferivelmente, a etapa 3) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 50% p/p.
[00371] Os inventores constataram que o alto teor de sólidos é vantajoso para a purificação de BLG, visto que a porção aquosa que adere aos cristais de BLG separados tipicamente contém as impurezas que devem ser evitadas. Adicionalmente, o alto teor de sólidos reduz o consumo de energia para a conversão dos cristais de BLG separados a um produto seco, tal como, por exemplo, um pó, e aumenta o rendimento de BLG obtido de uma unidade de secagem com uma determinada capacidade.
[00372] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa 3) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 60%. Preferivelmente, a etapa 3) compreende separar os cristais de BLG a um
92 / 172 teor de sólidos de pelo menos 70%. Ainda mais preferivelmente, a etapa 3) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 80%.
[00373] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a separação da etapa 3) envolve uma ou mais das seguintes operações: centrifugação, decantação, filtração, sedimentação, combinações dos itens acima.
[00374] Essas operações unitárias são bem conhecidas pela pessoa versada na técnica e são facilmente implementadas. A separação por filtração pode, por exemplo, envolver o uso de filtração a vácuo, filtração de fluxo cruzado dinâmico (DCF), uma prensa de filtrado ou uma centrífuga de filtro.
[00375] Podem ser empregados diferentes tamanhos de poro para filtração com base no resultado desejado. Preferivelmente, o filtro permite que a proteína de soro de queijo nativa e pequenos agregados passem, mas retenham os cristais de BLG. O filtro preferivelmente tem um tamanho de poro nominal de pelo menos 0,1 mícron. O filtro pode, por exemplo, ter um tamanho de poro nominal de pelo menos 0,5 mícron. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro nominal de pelo menos 2 mícrons.
[00376] Filtros com tamanhos de poro maiores podem também ser usados e são, na verdade, preferíveis se principalmente os cristais grandes devam ser separados de um líquido contendo cristais de BLG. Em algumas modalidades da invenção, o filtro tem um tamanho de poro nominal de pelo menos 5 mícrons. Preferivelmente, o filtro tem um tamanho de poro nominal de pelo menos 20 mícrons. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro de pelo menos 40 mícrons.
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[00377] O filtro pode, por exemplo, ter um tamanho de poro na faixa de 0,03-5.000 mícrons, tal como, por exemplo, 0,1-5.000 mícrons. Preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 0,5-1.000 mícrons. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 5-800 mícrons, tal como, por exemplo, na faixa de 10-500 mícrons ou na faixa de 50-500 mícrons.
[00378] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o filtro tem um tamanho de poro na faixa de 0,03-100 mícrons. Preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 0,1-50 mícrons. Mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 4-40 mícrons. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 5-30 mícrons, tal como na faixa de 10-20 mícrons.
[00379] Uma vantagem de usar filtros com um tamanho de poro maior do que 1 mícron é que bactérias e outros micro-organismos também são pelo menos parcialmente removidos durante a separação e opcionalmente também durante a lavagem e/ou recristalização. O presente processo, portanto, possibilita produzir BLG de alta pureza com uma carga bacteriana bem baixa, evitando, ainda assim, o dano térmico da proteína.
[00380] Outra vantagem de usar filtros com um tamanho de poro maior do que 1 mícron é que a remoção de água e a subsequente secagem ficam mais fáceis e consomem menos energia.
[00381] A solução de proteína de soro de queijo restante que é separada dos cristais de BLG pode ser reciclada ao alimento de proteína de soro de queijo durante a preparação da solução de proteína de soro de queijo.
[00382] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa 3) emprega uma centrífuga de filtro. Em outras modalidades preferenciais da invenção, a etapa 3) emprega uma centrífuga decantadora. Os resultados iniciais mostraram que o uso de uma centrífuga de filtro e/ou uma centrífuga decantadora para separar cristais de BLG do licor-mãe provê uma operação
94 / 172 mais robusta do processo do que, por exemplo, filtração a vácuo.
[00383] Muitas vezes é preferível secar uma torta de filtro formada com um gás de secagem para reduzir o teor de umidade da torta de filtro e, preferivelmente, possibilitar destacar a torta de filtro do filtro. O uso de um gás de secagem pode formar parte da etapa de separação ou, alternativamente, da etapa de secagem final, se a torta de filtro for convertida diretamente a uma composição de BLG comestível seca.
[00384] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa 3) emprega uma unidade de filtração de fluxo cruzado dinâmico (DCF).
[00385] Os testes iniciais mostraram que o uso de uma unidade de DCF com um tamanho de poro de membrana na faixa de 0,03-5 mícrons e, preferivelmente, na faixa de 0,3-1,0 mícron, oferece uma separação eficiente de cristais de BLG, e os inventores observaram que a unidade de DCF pode ser colocada em funcionamento por uma duração suficiente para separar os cristais de até mesmo lotes grandes de solução de proteína de soro de queijo contendo cristais de BLG.
[00386] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa 3) é realizada com o uso de uma unidade de DCF equipada com uma membrana capaz de reter cristais de BLG, o permeado de DCF é reciclado para formar parte da solução de proteína de soro de queijo ou do alimento de proteína de soro de queijo, e o retentado de DCF pode ser recuperado ou devolvido ao tanque de cristalização. Preferivelmente, o permeado de DCF é tratado, por exemplo, por ultrafiltração/diafiltração para torná-lo supersaturado no que se refere à BLG antes de se misturá-lo com a solução de proteína de soro de queijo ou o alimento de proteína de soro de queijo.
[00387] Vantajosamente, essas modalidades não requerem que a temperatura das correntes líquidas seja elevada acima de 15 graus C e são, portanto, menos propensas a contaminação microbiana do que as variantes do processo que requerem temperaturas mais altas. Outra vantagem industrial
95 / 172 dessas modalidades é que o nível de supersaturação é facilmente controlado e pode ser mantido em um nível em que cristalização espontânea indesejada não ocorra. A temperatura das correntes líquidas durante essas modalidades do processo é, portanto, preferivelmente no máximo 15 graus C, mais preferivelmente no máximo 12 graus C e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 graus C e, o mais preferivelmente, no máximo 5 graus C.
[00388] Essas modalidades são exemplificadas no Exemplo 10 e ilustradas na Figura 26 do pedido PCT/EP2017/084553. Essas modalidades podem ser implementadas como um processo em batelada ou um processo contínuo.
[00389] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o processo compreende uma etapa 4) de lavagem cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados da 3). A lavagem pode consistir em uma única lavagem ou em múltiplas etapas de lavagem.
[00390] A lavagem da etapa 4) preferivelmente envolve colocar os cristais de BLG em contato com um líquido de lavagem sem completamente dissolver os cristais de BLG e, subsequentemente, separar os cristais de BLG restantes do líquido de lavagem.
[00391] O líquido de lavagem é preferivelmente selecionado para evitar a completa dissolução dos cristais de BLG e pode, por exemplo, compreender, ou até mesmo consistir essencialmente em, água desmineralizada fria, água de torneira fria, ou permeado de osmose reversa frio.
[00392] O líquido de lavagem pode, por exemplo, compreender, ou até mesmo consistir essencialmente em, água desmineralizada fria, água de torneira fria, ou permeado de osmose reversa frio.
[00393] O líquido de lavagem pode ter um pH na faixa de 5-6, preferivelmente na faixa de 5,0-6,0 e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 5,1-6,0, tal como por exemplo na faixa de 5,1-5,9.
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[00394] Alternativamente, o líquido de lavagem pode ter um pH na faixa de 6,1-8, preferivelmente na faixa de 6,4-7,6 e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 6,6-7,4, tal como por exemplo na faixa de 6,8- 7,2. Esse é tipicamente o pH do líquido de lavagem quando água desmineralizada, água de torneira, ou osmose reversa permeiam. É no geral preferível que o líquido de lavagem tenha um baixo nível de minerais e uma baixa capacidade de tamponamento.
[00395] O líquido de lavagem pode ter uma condutividade de no máximo 0,1 mS/cm, preferivelmente no máximo 0,02 mS/cm e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,005 mS/cm.
[00396] Podem ser usados líquidos de lavagem com condutividades ainda mais baixas. Por exemplo, o líquido de lavagem pode ter uma condutividade de no máximo 1 microS/cm. Alternativamente, o líquido de lavagem pode ter uma condutividade de no máximo 0,1 microS/cm, tal como, por exemplo, aproximadamente 0,05 microS/cm.
[00397] Uma etapa de lavagem é preferivelmente realizada em baixa temperatura para limitar a dissolução de BLG cristalizada. A temperatura do líquido de lavagem é preferivelmente no máximo 30 graus C, mais preferivelmente no máximo 20 graus C e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 graus C.
[00398] Uma etapa de lavagem pode, por exemplo, ser realizada a no máximo 5 graus C, mais preferivelmente a no máximo 2 graus C, tal como, por exemplo, aproximadamente 0 grau C. Temperaturas mais baixas do que 0 grau C podem ser usadas desde que o líquido de lavagem não congele nessa temperatura, por exemplo, devido à presença de um ou mais redutores de ponto de congelamento.
[00399] Em algumas modalidades da invenção, o líquido de lavagem contém BLG, por exemplo, em uma quantidade de pelo menos 1% p/p e, preferivelmente, em uma quantidade de pelo menos 3% p/p, tal como, por
97 / 172 exemplo, em uma quantidade de 4% p/p.
[00400] A lavagem da etapa 4) tipicamente dissolve no máximo 80% p/p da quantidade inicial de cristais de BLG, preferivelmente no máximo 50% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 20% p/p da quantidade inicial de cristais de BLG. Preferivelmente, a lavagem da etapa 4) dissolve no máximo 15% p/p da quantidade inicial de cristais de BLG, mais preferivelmente no máximo 10% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 5% p/p da quantidade inicial de cristais de BLG.
[00401] A razão de peso entre a quantidade total de líquido de lavagem e a quantidade inicial de cristais de BLG separados é muitas vezes pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 2 e, mais preferivelmente, pelo menos 5. Por exemplo, a razão de peso entre a quantidade de líquido de lavagem e a quantidade inicial de cristais de BLG separados pode ser pelo menos 10. Alternativamente, a razão de peso entre a quantidade total de líquido de lavagem e a quantidade inicial de cristais de BLG separados pode ser pelo menos 20, tal como, por exemplo, pelo menos 50 ou pelo menos 100.
[00402] A expressão “quantidade total de líquido de lavagem” se refere à quantidade total de líquido de lavagem usada durante todo o processo.
[00403] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, as uma ou mais sequências de lavagem ocorrem no mesmo conjunto de filtro ou em um conjunto de filtro similar que o da separação de cristal de BLG. A uma torta de filtro contendo principalmente cristais de BLG adiciona-se uma ou mais sequências de líquido de lavagem, que é removido através do filtro enquanto a parte restante dos cristais de BLG fica na torta de filtro.
[00404] Em modalidades particularmente preferenciais da invenção, a separação da etapa 3) é realizada com o uso de um filtro que retém cristais de BLG. Subsequentemente, a torta de filtro é colocada em contato com uma ou mais quantidades de líquido de lavagem que se move pela torta de filtro e pelo filtro. É muitas vezes preferível que cada quantidade de líquido de lavagem
98 / 172 seja no máximo 10 vezes o volume da torta de filtro, preferivelmente no máximo 5 vezes o volume da torta de filtro, mais preferivelmente no máximo 1 vez o volume da torta de filtro, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 vez o volume da torta de filtro, tal como, por exemplo, no máximo 0,2 vez o volume da torta de filtro. O volume da torta de filtro inclui tanto sólidos quanto fluidos (líquidos e gases) da torta de filtro. A torta de filtro é preferivelmente lavada desse modo pelo menos 2 vezes, preferivelmente pelo menos 4 vezes e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 6 vezes.
[00405] O líquido de lavagem usado da etapa 4) pode, por exemplo, ser reciclado ao alimento de proteína de soro de queijo ou à solução de proteína de soro de queijo em que a BLG lavada pode ser isolada de novo.
[00406] O processo pode compreender adicionalmente uma etapa que envolve uma etapa de recristalização que compreende: - dissolver os cristais de BLG separados em um líquido de recristalização, - ajustar o líquido de recristalização para obter supersaturação no que se refere à BLG, - cristalizar BLG no líquido de recristalização supersaturado e ajustado e - separar cristais de BLG do líquido de recristalização ajustado restante.
[00407] A etapa 5) pode compreender ou uma única sequência de recristalização ou múltiplas sequências de recristalização.
[00408] Em algumas modalidades da invenção, os cristais de BLG da etapa ou 3) ou 4) são recristalizados pelo menos 2 vezes. Por exemplo, os cristais de BLG podem ser recristalizados pelo menos 3 vezes, tal como, por exemplo, pelo menos 4 vezes.
[00409] As etapas de lavagem e recristalização podem ser combinadas em qualquer sequência e podem ser realizadas múltiplas vezes se necessário.
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[00410] Os cristais de BLG separados da etapa 3) podem, por exemplo, ser submetidos à sequência de processo: uma ou mais etapas de lavagem (etapa 4), seguidas de uma ou mais etapas de recristalização (etapa 5).
[00411] Alternativamente, os cristais de BLG separados da etapa 3) podem ser submetidos à sequência de processo: uma ou mais etapas de recristalização (etapa 5), seguidas de uma ou mais etapas de lavagem (etapa 4).
[00412] É também possível combinar múltiplas etapas de lavagem e recristalização, por exemplo, na sequência: uma ou mais etapas de lavagem (etapa 4), uma ou mais etapas de recristalização (etapa 5), uma ou mais etapas de lavagem (etapa 4) e uma ou mais etapas de recristalização (etapa 5).
[00413] Ou, por exemplo, na sequência: uma ou mais etapas de recristalização (etapa 5), uma ou mais etapas de lavagem (etapa 4), uma ou mais etapas de recristalização (etapa 5). uma ou mais etapas de lavagem (etapa 4)
[00414] Os presentes inventores notaram que o processo de cristalização incluindo a preparação da solução de proteína de soro de queijo é propenso a crescimento microbiano e constataram ser vantajoso modificar o processo para cuidar desse problema.
[00415] É particularmente preferível que a quantidade total de tempo que uma molécula de BLG fique a uma temperatura acima 12 graus C desde a provisão de alimento de proteína de soro de queijo até as moléculas de BLG terem sido separadas na etapa c) seja no máximo 24 horas, preferivelmente 20 horas, mais preferível no máximo 12, ainda mais preferivelmente no máximo
100 / 172 6 horas e, o mais preferivelmente, no máximo 3 horas.
[00416] É possível e muitas vezes preferível reduzir a duração ainda mais e, assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a quantidade total de tempo que uma molécula de BLG fica a uma temperatura acima 12 graus C desde a provisão de alimento de proteína de soro de queijo até as moléculas de BLG terem sido separadas na etapa c) é no máximo 2 horas, preferivelmente 1 hora, mais preferivelmente no máximo 0,5, ainda mais preferivelmente no máximo 0,3 hora e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1 hora.
[00417] Em algumas modalidades da invenção, o processo envolve ainda submeter a BLG separada a etapas adicionais de enriquecimento com BLG, por exemplo, baseadas em cromatografia ou filtração seletiva. No entanto, em outras modalidades preferenciais da invenção, o processo não contém etapas adicionais de enriquecimento de BLG após a etapa 2). Pela expressão “etapa adicional de enriquecimento de BLG” quer-se dizer uma etapa de processo que enriquece a BLG em relação à quantidade total de proteína, etapa essa que não está relacionada à cristalização da BLG ou ao manuseio de cristais de BLG. Um exemplo de tal etapa adicional de enriquecimento de BLG é uma cromatografia de troca iônica. A lavagem de cristais de BLG e/ou a recristalização da BLG não são considerados “etapas adicionais de enriquecimento de BLG”.
[00418] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o processo envolve uma etapa de secagem em que uma composição enriquecida com BLG derivada das etapas 3), 4) ou 5) é convertida em uma composição seca.
[00419] Em modalidades particularmente preferenciais da invenção, o processo para preparar a composição enriquecida com BLG compreende as etapas de: prover uma solução de proteína de soro de queijo que
101 / 172 compreenda BLG e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, a dita solução de proteína de soro de queijo compreendendo: - 70-100% p/p de proteína em relação ao total de sólidos, - 30-90% p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, e preferivelmente 30-70% - 4-50% p/p de ALA não agregada em relação ao total de proteína, e preferivelmente 8-35% - 0-25% p/p de CMP em relação ao total de proteína, - pelo menos 10% p/p de proteína em relação ao peso total da solução de proteína de soro de queijo, 2) cristalizar a BLG na solução de proteína de soro de queijo supersaturada, preferivelmente por adição de sementes de cristalização, 3) separar os cristais de BLG da solução de proteína de soro de queijo restante, 4) lavar, opcionalmente, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3), 5) recristalizar, opcionalmente, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 4).
[00420] A solução de proteína de soro de queijo é preferivelmente uma solução de proteína de soro de queijo desmineralizada e preferivelmente tem uma razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína de no máximo 0,3 e/ou uma condutividade de permeado de UF de no máximo 7 mS/cm.
[00421] Essas modalidades são particularmente úteis para produzir isolados de BLG com baixo nível de minerais e de fósforo.
[00422] Em algumas modalidades preferenciais, o processo é implementado como um processo em batelada. Alternativamente, e às vezes
102 / 172 preferivelmente, o processo pode ser implementado como um processo semi- batelada. Em outras modalidades preferenciais, o processo é implementado como um processo contínuo.
[00423] Uma vantagem do presente processo é que é bem mais rápido do que processos comparáveis para cristalização de BLG da técnica anterior. A duração desde o ajuste inicial do alimento de proteína de soro de queijo até a conclusão da separação da etapa 3) pode ser no máximo 10 horas, preferivelmente no máximo 4 horas, mais preferivelmente no máximo 2 horas e, ainda mais preferivelmente, no máximo 1 hora.
[00424] No geral, é preferível preparar a composição enriquecida com BLG usando temperaturas leves que não danifiquem o valor nutricional da BLG não agregada ou das outras proteínas de soro de queijo do alimento de proteína de soro de queijo.
[00425] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a BLG não agregada não é submetida a uma temperatura acima de 90 graus C durante o processo. Preferivelmente, a BLG não é submetida a uma temperatura acima de 80 graus C durante o processo. Ainda mais preferivelmente, a BLG não agregada não é submetida a uma temperatura acima de 75 graus C durante o processo. Deve-se observar que, embora a secagem por pulverização muitas vezes empregue temperaturas maiores que 150 graus C, o curto tempo de exposição e a evaporação concomitante da água significam que as proteínas secadas por pulverização não experimentam temperaturas acima de 50-70 graus C.
[00426] Independentemente de qual processo foi usado para preparar a composição enriquecida com BLG, ele pode conter uma etapa de secagem da composição enriquecida com BLG. No entanto, é presentemente preferido usar a composição enriquecida com BLG sem secá-la, a fim de evitar o risco de danificar a proteína durante a secagem.
[00427] Se já não tiver as características necessárias para ser usada
103 / 172 como isolado de BLG líquido, a composição enriquecida com BLG que foi isolada do alimento de proteína de soro de queijo pode ser submetida a uma ou mais etapas selecionadas do grupo de: - desmineralização, - adição de minerais - diluição, - concentração, - redução microbiana física e - ajuste de pH como parte da provisão do isolado de BLG líquido.
[00428] Exemplos não limitantes de desmineralização incluem, por exemplo, diálise, filtração em gel, UF/diafiltração, NF/diafiltração, e cromatografia por troca iônica.
[00429] Exemplos não limitantes de adição de minerais incluem adição de sais solúveis aceitáveis para uso em alimentos, tais como, por exemplo, sais de Na, K, Ca e/ou Mg. Tal sal pode, por exemplo, ser sais de fosfato, sais de cloreto ou sais de ácidos alimentícios, tais como, por exemplo, sais de citrato, lactobionato ou lactato. Os minerais podem ser adicionados em forma sólida, suspensa ou dissolvida.
[00430] Exemplos não limitantes de diluição incluem, por exemplo, adição de diluentes líquidos tais como água, água desmineralizada, ou soluções aquosas de minerais, ácidos ou bases.
[00431] Exemplos não limitantes de concentração incluem, por exemplo, evaporação, osmose reversa, nanofiltração, ultrafiltração e combinações dos mesmos.
[00432] Se a concentração precisar aumentar a concentração proteica em relação ao total de sólidos, é preferível usar etapas de concentração tais como ultrafiltração ou, alternativamente, diálise. Se a concentração não precisar aumentar a concentração proteica em relação ao total de sólidos,
104 / 172 métodos tais como, por exemplo, evaporação, nanofiltração e/ou osmose reversa podem ser úteis.
[00433] Exemplos não limitantes de redução microbiana física incluem, por exemplo, tratamento térmico, filtração de germe, radiação UV, tratamento de alta pressão, tratamento por campo elétrico pulsado, e ultrassom. Esses métodos são bem conhecidas pela pessoa versada na técnica.
[00434] A filtração de germe tipicamente envolve microfiltração ou ultrafiltração de poro grande e requer um tamanho de poro que seja capaz de reter micro-organismos, mas permitir que as proteínas e outros componentes de interesse passem. Tamanhos de poro úteis são tipicamente no máximo 1,5 mícron, preferivelmente no máximo 1,0 mícron, mais preferivelmente no máximo 0,8 mícron, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 mícron e, o mais preferivelmente, no máximo 0,2 mícron. O tamanho de poro para filtração de germe é normalmente pelo menos 0,1 mícron.
[00435] A filtração de germe pode, por exemplo, envolver uma membrana com um tamanho de poro de 0,02-1 mícron, preferivelmente 0,03- 0,8 mícron, mais preferivelmente 0,04-0,6 mícron, ainda mais preferivelmente 0,05-0,4 mícron e, o mais preferivelmente, 0,1-0,2 mícron.
[00436] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido é submetido a uma filtração de germe e subsequentemente ao tratamento térmico usando uma temperatura de no máximo 80 graus C e, preferivelmente, no máximo 75 graus C. A combinação de temperatura e duração desse tratamento térmico foi preferivelmente escolhida para prover uma preparação de bebida estéril.
[00437] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido é submetido a uma filtração de germe e subsequentemente ao tratamento térmico usando uma temperatura de pelo menos 150 graus C por uma duração de no máximo 0,2 segundo e, preferivelmente, no máximo 0.1 segundo. A combinação de temperatura e duração desse tratamento térmico
105 / 172 foi preferivelmente escolhida para prover uma preparação de bebida estéril.
[00438] Exemplos não limitantes de ajuste de pH incluem, por exemplo, adição de bases e/ou ácidos e, preferivelmente, bases e/ou ácidos aceitáveis para uso em alimentos. É particularmente preferível empregar ácidos e/ou bases que sejam capazes de quelar cátions de metal divalentes. Exemplos de tais ácidos e/ou bases são ácido cítrico, sal de citrato, EDTA, ácido lático, sal de lactato, ácido fosfórico, sal de fosfato, e combinações dos mesmos.
[00439] A seguir, várias modalidades preferenciais da provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) da composição enriquecida com BLG. As etapas de processo mencionadas nesse contexto são aplicadas à corrente de produto contendo BLG seguindo a composição enriquecida com BLG.
[00440] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, que, por exemplo, são úteis se a composição enriquecida com BLG compreender cristais de BLG do processo de salting-in descrito acima, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter a composição enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - ajuste de pH a i) 2-4,9 ou ii) 6,1-8,5, por exemplo, para dissolver os cristais de BLG da composição enriquecida com BLG - opcionalmente, desmineralização ou adição de mineral e - ou: - concentração no teor de proteína desejado seguida de redução microbiana física, ou - redução microbiana física seguida de concentração no teor de proteína desejado.
[00441] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, que, por exemplo, são úteis se a composição enriquecida com BLG compreender cristais de BLG do processo de salting-in descrito acima, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter a composição
106 / 172 enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - ajuste de pH a i) 2-4,9 ou ii) 6,1-8,5, por exemplo, para dissolver os cristais de BLG da composição enriquecida com BLG - opcionalmente, desmineralização ou adição de mineral, - concentração no teor de proteína desejado.
[00442] Em outras modalidades preferenciais da invenção, que, por exemplo, são úteis se a composição enriquecida com BLG compreender cristais de BLG do processo de salting-in descrito acima, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter a composição enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - adição de minerais e preferivelmente sais solúveis para dissolver os cristais de BLG da composição enriquecida com BLG, preferivelmente enquanto o pH está na faixa de 5,0-6,0 e ou: - concentração no teor de proteína desejado seguida de redução microbiana física, ou - redução microbiana física seguida de concentração no teor de proteína desejado.
[00443] É particularmente vantajoso usar tratamento térmico como redução microbiana física,ou sozinho ou em combinação com uma ou mais dos outros processos para redução microbiana física mencionados no presente documento, ao se manusear a composição enriquecida com BLG dissolvida ácida. Os presentes inventores constataram que o uso de tratamento térmico leve sob condições ácidas é especialmente benéfico visto que permite que a BLG fique em seu estado dobrado nativo, mas ainda assim contribui para a redução da carga microbiana das correntes processadas.
[00444] É particularmente preferível submeter a composição enriquecida com BLG dissolvida ácida a uma etapa de filtração de germe enquanto ela tem uma concentração de total de proteína de no máximo 27% p/p, preferivelmente no máximo 22% p/p e, ainda mais preferivelmente, no
107 / 172 máximo 17% p/p e, subsequentemente submeter a composição enriquecida com BLG e com os germes filtrados ou o isolado de BLG líquido a uma etapa de tratamento térmico.
[00445] É ainda mais preferível submeter a composição enriquecida com BLG dissolvida ácida a uma etapa de filtração de germe enquanto ela tem uma concentração de total de proteína de 5-27% p/p, preferivelmente 10- 22% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 12-17% p/p e, subsequentemente submeter a composição enriquecida com BLG e com os germes filtrados ou o isolado de BLG líquido a uma etapa de tratamento térmico.
[00446] A etapa de tratamento térmico é preferivelmente realizada no isolado de BLG líquido e preferivelmente como a etapa final antes da secagem por pulverização.
[00447] É muitas vezes preferível evitar ou pelo menos limitar o desdobramento da BLG durante a provisão do isolado de BLG líquido. Se o tratamento térmico for usado na faixa de pH 2-4,9, é preferível que a temperatura seja mantida em no máximo 82 graus C, preferivelmente em no máximo 80 graus C e, mais preferivelmente, em no máximo 78 graus C para limitar ou mesmo evitar o desdobramento da BLG.
[00448] O tratamento térmico é preferivelmente pelo menos pasteurização.
[00449] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a temperatura do tratamento térmico é na faixa de 70-80 graus C, preferivelmente na faixa de 70-79 graus C, mais preferivelmente na faixa de 71-78 graus C, ainda mais preferivelmente na faixa de 72-77 graus C e, o mais preferivelmente, na faixa de 73-76 graus C, tal como aproximadamente 75 graus C.
[00450] Preferivelmente, a duração do tratamento térmico, quando realizado na faixa de temperatura de 70-80, é de 1 segundo a 30 minutos. Os
108 / 172 tempos de exposição mais altos são mais adequados para as temperaturas mais baixas da faixa de temperatura e vice-versa.
[00451] Em modalidades particularmente preferenciais da invenção, o tratamento térmico provê 70-78 graus C por 1 segundo a 30 minutos, mais preferivelmente 71-77 graus C por 1 minuto a 25 minutos e, ainda mais preferivelmente, 72-76 graus C por 2 minutos a 20 minutos.
[00452] Temperaturas mais altas podem também ser preferíveis em algumas modalidades, especialmente se desdobramento e, opcionalmente, também agregação de BLG forem necessários antes da secagem. Por exemplo, a temperatura do tratamento térmico pode ser pelo menos 81 graus C, preferivelmente pelo menos 91 graus C, mais preferivelmente pelo menos 100 graus C, ainda mais preferivelmente pelo menos 120 graus C e, o mais preferivelmente, pelo menos 140 graus C.
[00453] O tratamento térmico pode, por exemplo, ser um tratamento do tipo UHT que tipicamente envolva uma temperatura na faixa de 135-144 graus C e uma duração na faixa de 2-10 segundos.
[00454] Alternativamente, mas também preferível, o tratamento térmico pode envolver uma temperatura na faixa de 145-180 graus C e uma duração na faixa de 0,01-1 segundos e, mais preferivelmente, uma temperatura na faixa de 150-180 graus C e uma duração na faixa de 0,01-0,2 segundo.
[00455] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter redução microbiana por tratamento térmico enquanto o pH está na faixa de 2- 4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8-4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0.
[00456] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) da composição enriquecida com BLG compreende redução microbiana física por tratamento térmico enquanto o pH
109 / 172 está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8-4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0.
[00457] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) da composição enriquecida com BLG compreende desmineralização enquanto o pH está na faixa de 6,1- 8,5, preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5. Os presentes inventores constataram que tal desmineralização é vantajosa para melhorar a estabilidade térmica do pó de isolado de BLG preparado pelo método.
[00458] Em modalidades particularmente preferenciais da invenção, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) da composição enriquecida com BLG compreende: - redução microbiana física por tratamento térmico enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8- 4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0 e - desmineralização enquanto o pH está na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5- 7,5.
[00459] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, que, por exemplo, são úteis se a composição enriquecida com BLG compreender cristais de BLG do processo de salting-in descrito acima, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter a composição enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - ajuste de pH a 2-4,9 para dissolver os cristais de BLG da composição enriquecida com BLG - opcionalmente, concentração no teor de proteína desejado enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,0 e, mais preferivelmente, 3,0-3,9 e - redução microbiana física por tratamento térmico enquanto o
110 / 172 pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8- 4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0.
[00460] Se a composição enriquecida com BLG já tiver um pH na faixa de 2-4,9, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) preferivelmente compreende submeter a composição enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - desmineralização enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8-4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0, - opcionalmente, concentração no teor de proteína desejado enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8-4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0 e - redução microbiana física por tratamento térmico enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8- 4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0.
[00461] Em outras modalidades preferenciais da invenção, que são particularmente adequadas para prover um isolado de BLG líquido com um pH na faixa de 5,0-8,5, preferivelmente na faixa de 6,1-8,5 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-8,0, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter a composição enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - ajuste de pH a 2-4,9, por exemplo, para dissolver os cristais de BLG da composição enriquecida com BLG, - opcionalmente, concentração no teor de proteína desejado, - redução microbiana física por tratamento térmico enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8- 4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0, - ajuste de pH a um pH na faixa de 5,0-8,5, preferivelmente na faixa de 6,1-8,5 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-8,0.
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[00462] Em outras modalidades preferenciais da invenção, que são particularmente adequadas para prover um isolado de BLG líquido com um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter a composição enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - ajuste de pH a 2-4,9, por exemplo, para dissolver os cristais de BLG da composição enriquecida com BLG, - opcionalmente, concentração no teor de proteína desejado enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8-4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0, - redução microbiana física por tratamento térmico enquanto o pH está na faixa de 2-4,9, preferivelmente 2,5-4,7, mais preferivelmente 2,8- 4,3 e, ainda mais preferivelmente, 3,2-4,0, - ajuste de pH a um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5 e - desmineralização em um pH de 6,1-8,5, preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5.
[00463] Em modalidades preferenciais adicionais da invenção, que são particularmente adequadas para prover um isolado de BLG líquido com um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente na faixa de 6,1-8,5 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-8,0, a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende submeter a composição enriquecida com BLG às seguintes etapas na seguinte sequência: - ajuste de pH a um pH de pelo menos 6,1 para dissolver os cristais de BLG da composição enriquecida com BLG, - desmineralização enquanto o pH está na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente 6,5-8,0 e, mais preferivelmente, 6,5-7,5, - opcionalmente, concentração no teor de proteína desejado
112 / 172 enquanto o pH é 6,1-8,5, preferivelmente 6,5-8,0 e, mais preferivelmente, 6,5- 7,5, - opcionalmente, redução microbiana física por tratamento térmico enquanto o pH está na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente 6,5-8,0 e, mais preferivelmente, 6,5-7,5.
[00464] A temperatura durante a conversão da composição enriquecida com BLG no isolado de BLG líquido é tipicamente na faixa 0-82 graus C e pode envolver temperaturas ainda mais altas para tratamento térmico. Se as correntes de BLG durante o processamento tiverem um pH acima de 4,9, é preferível que a temperatura esteja na faixa de 0-65 graus C e, mais preferivelmente, na faixa de 0-15 graus C ou na faixa de 50-65 graus C para reduzir o crescimento microbiano.
[00465] Se o isolado de BLG líquido tiver um pH de no máximo 4,9 e, ainda mais preferivelmente, no máximo 4,1, é preferível que a temperatura esteja na faixa de 0-82 graus C e, vantajosamente, na faixa de 0-15 graus C ou na faixa de 50-80 graus C para reduzir o crescimento microbiano. Os presentes inventores constataram que é particularmente vantajoso realizar o processo, ou pelo menos a etapa de concentração, se necessário, a uma temperatura na faixa de 50-80 graus C e, mais preferivelmente, na faixa de 60-80 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 65-78 graus C, visto que a alta temperatura aumenta a eficiência da etapa de concentração e, ao mesmo tempo, contribui para a redução microbiana. Essa modalidade possibilita produzir isolados de BLG líquidos com um alto teor de BLG e um teor microbiano bem baixo, mantendo ainda assim o estado nativo da BLG. O pó secado por pulverização resultante tem uma alta densidade aparente e um alto nível de estado nativo e um perfil microbiano bem favorável.
[00466] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o processo de converter a composição enriquecida com BLG no isolado de BLG líquido é realizado a uma temperatura na faixa de 0-15 graus C e,
113 / 172 preferivelmente, na faixa de 1-10 graus C.
[00467] Em outras modalidades preferenciais da invenção, pelo menos uma parte do processo de converter a composição enriquecida com BLG no isolado de BLG líquido, e preferivelmente o processo inteiro, é realizada a uma temperatura na faixa de 50-82 graus C e, preferivelmente, na faixa de 55- 80 graus C e, mais preferivelmente, na faixa de 60-78 graus C. Isso é particularmente preferível quando o pH da corrente de proteína durante o processamento é no máximo 4,9 e, preferivelmente, no máximo 4,3, mais preferivelmente no máximo 3,7 e, preferivelmente, na faixa 3,0-4,3.
[00468] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, pelo menos uma parte do processo de converter a composição enriquecida com BLG no isolado de BLG líquido, e preferivelmente o processo inteiro, é realizada a uma temperatura na faixa de 78-82 graus C enquanto o pH está na faixa 3,0-3,7. Em outras modalidades preferenciais da invenção, pelo menos uma parte do processo de converter a composição enriquecida com BLG no isolado de BLG líquido, e preferivelmente o processo inteiro, é realizada a uma temperatura na faixa de 60-78 graus C enquanto o pH está na faixa 3,7- 4,3.
[00469] A composição enriquecida com BLG preferivelmente tem uma composição proteica que é substancialmente a mesma do isolado de BLG líquido e, normalmente, não é necessário aplicar fração de proteína adicional enquanto se converte a composição enriquecida com BLG no isolado de BLG líquido.
[00470] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG compreende BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 88% p/p, mais preferivelmente pelo menos 90% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 92% e, o mais preferivelmente, BLG em uma quantidade de pelo menos 95% p/p em relação ao total de proteína. É às vezes
114 / 172 particularmente preferível que a composição enriquecida com BLG compreenda BLG em uma quantidade de pelo menos 97% p/p em relação ao total de proteína e, mais preferivelmente, pelo menos 99% p/p, tal como preferivelmente aproximadamente 100% p/p em relação ao total de proteína
[00471] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG compreende total de proteína em uma quantidade de pelo menos 5% p/p, preferivelmente pelo menos 10% p/p, mais preferivelmente pelo menos 15% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 20% e, o mais preferivelmente, total de proteína em uma quantidade de pelo menos 30% p/p em relação ao total de proteína.
[00472] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG compreende total de proteína em uma quantidade na faixa de 5-45% p/p, preferivelmente na faixa de 10-40% p/p, mais preferivelmente na faixa de 15-38% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 20-35% p/p.
[00473] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a soma de alfa-lactalbumina (ALA) e caseinomacropeptídeo (CMP) compreende pelo menos 40% p/p da proteína não BLG da composição enriquecida com BLG, preferivelmente pelo menos 60% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 70% p/p e, o mais preferivelmente, pelo menos 90% p/p da proteína não BLG da composição enriquecida com BLG.
[00474] Em outras modalidades preferenciais da invenção, cada proteína de soro de queijo não BLG principal da composição enriquecida com BLG está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%.
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[00475] Concentrações ainda mais baixas das proteínas de soro de queijo não BLG podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, cada proteína de soro de queijo não BLG principal da composição enriquecida com BLG está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00476] Os inventores viram indicações de que um nível baixo de lactoferrina e/ou lactoperoxidase é particularmente vantajoso para se obter um produto de proteína de soro de queijo com cor neutra.
[00477] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a lactoferrina está presente na composição enriquecida com BLG em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%. Concentrações ainda mais baixas de lactoferrina podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a lactoferrina está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00478] Similarmente, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a lactoperoxidase está presente na composição enriquecida com
116 / 172 BLG em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 25% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 20%, mais preferivelmente no máximo 15%, ainda mais preferivelmente no máximo 10%, o mais preferivelmente no máximo 6%. Concentrações ainda mais baixas de lactoperoxidase podem ser desejáveis. Assim, em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a lactoperoxidase está presente em uma porcentagem de peso em relação ao total de proteína que é no máximo 4% da sua porcentagem de peso em relação a um total de proteína em um concentrado de proteína de soro de queijo padrão proveniente do soro de queijo doce, preferivelmente no máximo 3%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 1%.
[00479] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG compreende um teor total de sólidos em uma quantidade na faixa de 5-50% p/p, preferivelmente na faixa de 10-45% p/p, mais preferivelmente na faixa de 15-40% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 20-35% p/p.
[00480] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG compreende um teor de água em uma quantidade na faixa de 50-95% p/p, preferivelmente na faixa de 55-90% p/p, mais preferivelmente na faixa de 60-85% p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 65-80% p/p.
[00481] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG compreende carboidrato em uma quantidade de no máximo 60% p/p, preferivelmente no máximo 50% p/p, mais preferivelmente no máximo 20% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 10% p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 1% p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1%.
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[00482] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG compreende lipídio em uma quantidade de no máximo 10% p/p, preferivelmente no máximo 5% p/p, mais preferivelmente no máximo 2% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,1% p/p.
[00483] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição enriquecida com BLG é usada diretamente como o isolado de BLG líquido, por exemplo, se ela já tiver o pH e a composição química desejados.
[00484] Embora algumas modalidades da invenção não requeiram a redução microbiana física da etapa b) e, portanto, somente requeiram as etapas a) e c), outras modalidades preferenciais requerem e, portanto, contêm todas as três etapas a), b) e c).
[00485] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido é submetido a redução microbiana física.
[00486] Exemplos úteis de redução microbiana física envolvem um ou mais dentre aquecimento, filtração de germe, radiação UV, tratamento de alta pressão, tratamento por campo elétrico pulsado, e ultrassom.
[00487] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a redução microbiana física envolve ou até mesmo consiste em tratamento térmico.
[00488] Preferivelmente, o tratamento térmico envolve pelo menos pasteurização.
[00489] Em modalidades particulares, o tratamento térmico envolve aquecer o isolado de BLG líquido a uma temperatura na faixa de 70-82 graus C.
[00490] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a temperatura do tratamento térmico é na faixa de 70-80 graus C, preferivelmente na faixa de 70-79 graus C, mais preferivelmente na faixa de 71-78 graus C, ainda mais preferivelmente na faixa de 72-77 graus C e, o
118 / 172 mais preferivelmente, na faixa de 73-76 graus C, tal como aproximadamente 75 graus C.
[00491] Preferivelmente, a duração do tratamento térmico, quando realizado na faixa de temperatura de 70-80, é de 1 segundo a 30 minutos. Os tempos de exposição mais altos são mais adequados para as temperaturas mais baixas da faixa de temperatura e vice-versa.
[00492] Em modalidades particularmente preferenciais da invenção, o tratamento térmico provê 70-78 graus C por 1 segundo a 30 minutos, mais preferivelmente 71-77 graus C por 1 minuto a 25 minutos e, ainda mais preferivelmente, 72-76 graus C por 2 minutos a 20 minutos.
[00493] Temperaturas mais altas podem também ser preferíveis em algumas modalidades, especialmente se desdobramento e, opcionalmente, também agregação para BLG forem necessários antes da secagem. Por exemplo, a temperatura do tratamento térmico pode ser pelo menos 81 graus C, preferivelmente pelo menos 91 graus C, mais preferivelmente pelo menos 100 graus C, ainda mais preferivelmente pelo menos 120 graus C e, o mais preferível, pelo menos 140 graus C.
[00494] O tratamento térmico pode, por exemplo, envolver uma temperatura na faixa de 90-130 graus C e uma duração na faixa de 5 segundos - 30 minutos. O tratamento térmico pode, por exemplo, envolver aquecimento a uma temperatura na faixa de 90-95 graus C por uma duração de 1-30 minutos, por exemplo, aproximadamente 120 graus C por aproximadamente 20 segundos. Alternativamente, o tratamento térmico pode envolver aquecimento a uma temperatura na faixa de 115-125 graus C por uma duração de 5-30 segundos, por exemplo, aproximadamente 120 graus C por aproximadamente 20 segundos.
[00495] Alternativamente, o tratamento térmico pode, por exemplo, ser um tratamento do tipo UHT que tipicamente envolva uma temperatura na faixa de 135-144 graus C e uma duração na faixa de 2-10 segundos.
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[00496] Alternativamente, mas também preferível, o tratamento térmico pode envolver uma temperatura na faixa de 145-180 graus C e uma duração na faixa de 0,01-2 segundos e, mais preferivelmente, uma temperatura na faixa de 150-180 graus C e uma duração na faixa de 0,01-0,3 segundo.
[00497] A implementação do tratamento térmico pode envolver o uso de equipamento convencional tal como um trocador de calor de placa ou tubular, um trocador de calor de superfície raspada ou um sistema de retorta. Alternativamente, e particularmente preferível para tratamentos térmicos acima de 95 graus C, pode ser empregado aquecimento direto à base de vapor, por exemplo, com o uso de injeção direta de vapor, infusão direta de vapor, ou cozimento por pulverização. Adicionalmente, tal aquecimento direto à base de vapor é preferivelmente usado em combinação com resfriamento instantâneo. Exemplos adequados de implementação de cozimento por pulverização são encontrados no documento WO2009113858A1, que é incorporado ao presente documento para todos os fins. Exemplos adequados de implementação de injeção direta de vapor e infusão direta de vapor são encontrados nos documentos WO2009113858A1 e WO 2010/085957 A3, que são incorporados ao presente documento para todos os fins. Os aspectos gerais de tratamento de alta temperatura são, por exemplo, encontrados em “Thermaltechnologies in food processing” ISBN 185573558 X, que é incorporado ao presente documento a título de referência para todos os fins.
[00498] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a redução microbiana física da etapa b) é uma esterilização resultando em um isolado de BLG líquido estéril. Uma esterilização como essa pode, por exemplo, ser obtida combinando-se filtração de germe e pasteurização.
[00499] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido, preferivelmente com um pH na faixa de 2-4,9, é submetido a uma filtração de germe e subsequentemente ao tratamento térmico usando
120 / 172 uma temperatura de no máximo 80 graus C e, preferivelmente, no máximo 75 graus C. A combinação de temperatura e duração desse tratamento térmico foi preferivelmente escolhida para prover um isolado de BLG líquido.
[00500] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido é submetido a uma filtração de germe e subsequentemente ao tratamento térmico usando uma temperatura de pelo menos 150 graus C por uma duração de no máximo 0,2 segundo e, preferivelmente, no máximo 0.1 segundo. A combinação de temperatura e duração desse tratamento térmico foi preferivelmente escolhida para prover um isolado de BLG líquido estéril.
[00501] A etapa c) do método preferivelmente envolve secagem por pulverização ou secagem por congelamento. A secagem por pulverização é particularmente preferida.
[00502] Os inventores constataram que é particularmente vantajoso evitar expor o isolado de BLG líquido a um regime de tratamento térmico que desdobra ou desnatura uma quantidade significativa da BLG. Assim, se o pré- aquecimento do isolado de BLG líquido for usado antes da pulverização, é preferível controlar cuidadosamente a carga térmica.
[00503] Em algumas modalidades da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma temperatura de no máximo 70 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização (por exemplo, um bocal ou um atomizador), preferivelmente no máximo 60 graus C, mais preferivelmente no máximo 50 graus C. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem uma temperatura de no máximo 40 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização, preferivelmente no máximo 30 graus C, mais preferivelmente no máximo 20 graus C, ainda mais preferivelmente no máximo 10 graus C e, o mais preferivelmente, no máximo 5 graus C.
[00504] O dispositivo de pulverização do secador por pulverização é o dispositivo, por exemplo, o bocal ou o atomizador, que converte a solução ou
121 / 172 suspensão a ser secada em gotículas que entram na câmara de secagem do secador por pulverização.
[00505] Em algumas modalidades da invenção, é particularmente preferível que o isolado de BLG líquido tenha uma temperatura na faixa de 0- 60 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização, preferivelmente na faixa de 2-40 graus C, mais preferivelmente na faixa de 4- 35 graus C e, o mais preferivelmente, na faixa de 5-10 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização.
[00506] A temperatura de entrada de gás do secador por pulverização é preferivelmente na faixa de 140-220 graus C, mais preferivelmente na faixa de 160-200 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 170-190 graus C, tal como, por exemplo, preferivelmente cerca de 180 graus C. A temperatura de saída do gás do secador por pulverização é preferivelmente na faixa de 50-95 graus C, mais preferivelmente na faixa de 70-90 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 80-88 graus C, tal como, por exemplo, preferivelmente cerca de 85 graus C. Via de regra, diz-se que os sólidos que são submetidos a secagem por pulverização são aquecidos a uma temperatura que é 10-15 graus C menos do que a temperatura de saída do gás.
[00507] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a temperatura de saída do secador por pulverização é preferivelmente na faixa de 50-85 graus C, mais preferivelmente na faixa de 60-80 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 65-75 graus C, tal como por exemplo preferivelmente cerca de 70 graus C.
[00508] Uma vantagem do presente método é que o isolado de BLG líquido a ser secado pode ter um teor de sólidos bem alto antes da etapa de secagem e, portanto, menos água precisa ser removida e menos energia é consumida na operação de secagem.
[00509] Os inventores constataram que, quanto mais baixo o grau de desdobramento da BLG, mais alta a concentração de BLG que pode ser
122 / 172 manuseada antes da secagem por pulverização.
[00510] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos de pelo menos 10% p/p. Preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos de pelo menos 20% p/p. Mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos de pelo menos 25% p/p. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos de pelo menos 30% p/p. O mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos de pelo menos 35% p/p.
[00511] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos na faixa de 10-60% p/p. Preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos na faixa de 15-50% p/p. Mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos na faixa de 20-45% p/p. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido tem um teor de sólidos na faixa de 25-40% p/p, tal como, por exemplo, aproximadamente 35% p/p.
[00512] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína de pelo menos 10% p/p. Preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína de pelo menos 20% p/p. Mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína de pelo menos 25% p/p. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína de pelo menos 30% p/p. O mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína de pelo menos 35% p/p.
[00513] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína na faixa de 10-50% p/p. Preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína na faixa de 15-45% p/p. Mais preferivelmente, o isolado de BLG
123 / 172 líquido contém uma quantidade total de proteína na faixa de 20-40% p/p. Ainda mais preferivelmente, o isolado de BLG líquido contém uma quantidade total de proteína na faixa de 25-38% p/p, tal como, por exemplo, aproximadamente 35% p/p.
[00514] Os inventores constataram que o teor de proteína reduz o consumo de energia para converter o isolado de BLG líquido em um pó e aumenta o rendimento de BLG obtido de uma unidade de secagem com uma determinada capacidade.
[00515] O método da presente invenção é preferivelmente operado usando temperaturas leves que não danifiquem o valor nutricional da BLG não agregada ou das outras proteínas de soro de queijo da solução de proteína de soro de queijo.
[00516] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a BLG não agregada não é submetida a uma temperatura acima de 90 graus C durante o método. Preferivelmente, a BLG não agregada não é submetida a uma temperatura acima de 80 graus C durante o método. Ainda mais preferivelmente, a BLG não agregada não é submetida a uma temperatura acima de 75 graus C durante o método. Deve-se observar que, embora a secagem por pulverização muitas vezes empregue temperaturas maiores que 150 graus C, o curto tempo de exposição e a evaporação concomitante da água significam que as proteínas secadas por pulverização não experimentam temperaturas acima de 40-70 graus C.
[00517] Os inventores viram indicações de que o aquecimento estendido durante a etapa de secagem reduz a quantidade de BLG que está na forma não desnaturada. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a exposição ao calor durante a etapa de secagem é mantida suficientemente baixa a fim de prover um grau de desnaturação de BLG de no máximo 5%, preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 2%, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% e, ainda mais preferivelmente, no
124 / 172 máximo 0,1%. O mais preferivelmente, a etapa de secagem não resulta em nenhuma desnaturação detectável de BLG.
[00518] A etapa de secagem pode envolver adicionalmente secagem de leito fluidizado, por exemplo, integrada no dispositivo de secagem por pulverização ou como uma operação unitária separada realizada após a secagem por pulverização.
[00519] A combinação de secagem por pulverização e secagem de leito fluidizado possibilita reduzir a quantidade de água que é removida enquanto a gotícula de líquido a ser secado move a câmara de secagem por pulverização e, em vez disso, remove água residual do pó úmido por secagem de leito fluidizado. Essa solução requer menos energia para secagem do que somente secagem por pulverização e, além disso, possibilita modificar o pó, por exemplo, por instantização e/ou aglomeração. A instantização é preferivelmente realizada aplicando-se lecitina ou outro agente umectante útil à superfície do pó. Quando instantização é aplicada, o agente de instantização, por exemplo, lecitina dissolvida em um óleo comestível, é tipicamente adicionado em uma quantidade na faixa de 0,5-2% p/p em relação ao peso de pó final total e, preferivelmente, na faixa de 1,0-1,5% p/p em relação ao peso de pó final total.
[00520] O método compreende ainda preferivelmente uma etapa de embalar o pó de isolado de BLG. Um produto de pó de isolado de BLG embalado que compreende um recipiente contendo o pó de isolado de BLG como descrito no presente documento e, preferivelmente, um recipiente vedado.
[00521] Em algumas modalidades da invenção, o pó de isolado de BLG é hermeticamente vedado no recipiente, opcionalmente embalado com um gás inerte.
[00522] Uma ampla gama de diferentes recipientes pode ser usado para armazenar o pó de isolado de BLG. Recipientes preferíveis são, por exemplo,
125 / 172 uma sacola, um barril, uma bolsa, uma caixa, uma lata, e um sachê.
[00523] Uma modalidade particularmente preferencial da invenção se refere a um método para produzir um pó de isolado de BLG contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína, o método compreendendo as etapas de: prover um isolado de BLG líquido que tem i) um pH na faixa de 2-4,9, ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, ou iii) um pH na faixa de 5,0-6,0, o dito isolado de BLG líquido contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína, opcionalmente, submeter o isolado de BLG líquido a uma redução microbiana física, secar o isolado de BLG líquido, preferivelmente com secagem por pulverização, em que a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) envolve - preparar a composição enriquecida com BLG por um processo que compreende as etapas de prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda BLG não agregada e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo é supersaturada no que se refere à BLG e tem um pH na faixa de 5-6, cristalizar BLG na solução de proteína de soro de queijo supersaturada e separar os cristais de BLG da solução de proteína de soro de
126 / 172 queijo restante, lavar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 5) e recristalizar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 4) e - processar a composição enriquecida com BLG para pelo menos dissolver os cristais de BLG, obtendo, assim, o isolado de BLG líquido.
[00524] Na modalidade acima, a composição enriquecida com BLG contém os cristais de BLG separados da etapa 3) que são subsequentemente dissolvidos por um ajuste de pH apropriado ou, alternativamente, pelo aumento da condutividade e/ou aumento da temperatura.
[00525] Uma modalidade particularmente preferencial da invenção se refere a um método para produzir um pó de isolado de BLG contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína, o método compreendendo as etapas de: prover um isolado de BLG líquido com um pH na faixa de 2,5- 4,9, preferivelmente 2,5-4,0 e, ainda mais preferivelmente, 3,0-3,9 o dito isolado de BLG líquido contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína, opcionalmente, submeter o isolado de BLG líquido a uma redução microbiana física, secar o isolado de BLG líquido, preferivelmente por secagem por pulverização, em que a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a)
127 / 172 compreende: - preparar uma composição enriquecida com BLG por um processo que compreende as etapas de prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda BLG não agregada e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, cristalizar BLG na solução de proteína de soro de queijo supersaturada e separar os cristais de BLG da solução de proteína de soro de queijo restante, lavar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 5) e recristalizar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 4) e - pelo menos ajustar o pH da composição enriquecida com BLG a um pH na faixa de 2,5-4,9, preferivelmente 2,5-4,0 e, ainda mais preferivelmente, 3,0-3,9.
[00526] Outra modalidade particularmente preferencial da invenção se refere a um método para produzir um pó de isolado de BLG contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína, o método compreendendo as etapas de: prover um isolado de BLG líquido com um pH na faixa de 6,1- 8,5, preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5, o dito isolado de BLG líquido contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína,
128 / 172 preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína, opcionalmente, submeter o isolado de BLG líquido a uma redução microbiana física, secar o isolado de BLG líquido, preferivelmente por secagem por pulverização, em que a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende: - preparar uma composição enriquecida com BLG por um processo que compreende as etapas de prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda BLG não agregada e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, cristalizar BLG na solução de proteína de soro de queijo supersaturada e separar os cristais de BLG da solução de proteína de soro de queijo restante, lavar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 5) e recristalizar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 4) e - pelo menos ajustar o pH da composição enriquecida com BLG a um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5.
[00527] Modalidades alternativas porém preferenciais da invenção se referem a um método para produzir um pó de isolado de BLG contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo
129 / 172 menos 94% p/p em relação ao total de proteína, o método compreendendo as etapas de: prover um isolado de BLG líquido com um pH na faixa de 5,0- 8,5, preferivelmente 6,1-8,5, mais preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5, o dito isolado de BLG líquido contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94% p/p em relação ao total de proteína, opcionalmente, submeter o isolado de BLG líquido a uma redução microbiana física, secar o isolado de BLG líquido, preferivelmente por secagem por pulverização, em que a provisão do isolado de BLG líquido da etapa a) compreende as seguintes etapas na seguinte sequência: - preparar uma composição enriquecida com BLG por um processo que compreende as etapas de prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda BLG não agregada e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, cristalizar BLG na solução de proteína de soro de queijo supersaturada e separar os cristais de BLG da solução de proteína de soro de queijo restante, lavar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 5) e recristalizar, opcionalmente, os cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados obtidos na etapa 3) ou 4) e
130 / 172 - ajustar o pH da composição enriquecida com BLG a um pH na faixa de 2,5-4,9, preferivelmente 2,5-4,0 e, ainda mais preferivelmente, 3,0-3,9, - redução microbiana física que envolve pelo menos pasteurização, preferivelmente usando uma temperatura na faixa de 70-82 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 70-80 graus C, enquanto o pH está na faixa de 2,5-4,9, preferivelmente 2,5-4,0 e, ainda mais preferivelmente 3,0-3,9, - ajuste de pH a um pH na faixa de 5,0-8,5, preferivelmente 6,1-8,5, mais preferivelmente na faixa de 6,3-8,0 e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 6,5-7,5, - opcionalmente, desmineralização.
[00528] Em algumas modalidades preferenciais, o método da presente invenção é implementado como um processo em batelada. Alternativamente, e às vezes preferivelmente, o método pode ser implementado como um processo semibatelada. Em outras modalidades preferenciais, o método é implementado como um processo contínuo.
[00529] Ainda um aspecto da invenção se refere ao isolado de BLG líquido como descrito no presente documento. O isolado de BLG líquido é particularmente útil para obter pós de isolado de BLG secados por pulverização e pode, ainda, ser usado como um ingrediente líquido na produção de produtos alimentícios líquidos ou não líquidos. Alternativamente, mas também preferível, o isolado de BLG líquido pode ser usado como uma bebida em si.
[00530] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pó de isolado de BLG da presente invenção é obtenível pelo método descrito no presente documento.
[00531] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o isolado de BLG líquido da presente invenção é obtenível pelo método descrito no
131 / 172 presente documento com a exceção de que a etapa de secagem é omitida.
[00532] Um aspecto da invenção se refere ao uso do pó de isolado de BLG ou do isolado de BLG líquido como definidos no presente documento como um ingrediente para a produção de um produto alimentício. O produto alimentício pode, por exemplo, ser uma bebida ou um pó de bebida instantânea.
[00533] O uso do pó de isolado de BLG ou o isolado de BLG líquido preferivelmente proveem um a mais dos seguintes efeitos: nível reduzido de sensação de boca seca transparência melhorada do líquido obtido contendo o pó de isolado de BLG ou o isolado de BLG líquido viscosidade reduzida possibilidade de aumentar a concentração proteica dos produtos alimentícios que são bebidas tratadas termicamente tem uma contribuição de cor menor (os inventores observaram que o isolado de BLG presente provê menos cor a, por exemplo, bebidas de proteína do que a solução de WPI correspondente)
[00534] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o uso de pó de isolado de BLG é como um ingrediente para preparar uma bebida com um teor de proteína de pelo menos 10-36% p/p, mais preferivelmente pelo menos 15-35% p/p, ainda mais preferivelmente 20-34% p/p e, o mais preferivelmente, 25-33% p/p, e em que o pó de isolado de BLG contribui com pelo menos 90% p/p do total de proteína da bebida, mais preferivelmente pelo menos 95% p/p e, o mais preferivelmente, com toda a proteína da bebida.
[00535] Os pós de BLG da presente invenção são, ainda, particularmente adequados para bebidas com alto nível de proteína, ou pós para shake para preparar bebidas com alto nível de proteína, visto que os presentes pós de BLG contribuem menos para a viscosidade do que WPIs tradicionais e, portanto, proveem mais bebidas bebíveis.
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[00536] O produto alimentício pode, por exemplo, ser uma bebida ou um pó de bebida instantânea, que tem um pH na faixa de 2-4,7 e, ainda, um ou mais dos seguintes itens: - um nível reduzido de sensação de boca seca, - transparência melhorada e/ou - teor de proteína aumentado, preferivelmente bebidas tratadas termicamente contendo um teor de proteína em uma quantidade de pelo menos 3-45% p/p, mais preferivelmente 11-40% p/p, ainda mais preferivelmente 15-38% p/p e, o mais preferivelmente, 20-36% p/p.
[00537] Deve-se observar que as modalidades e os atributos descritos no contexto de um dos aspectos da presente invenção também se aplicam aos outros aspectos da invenção.
[00538] Todas as referências patentárias e não patentárias citadas no presente pedido são incorporadas ao mesmo a título de referência em sua totalidade.
[00539] A invenção será agora descrita em mais detalhes nos seguintes exemplos não limitantes. Exemplos Exemplo 1: Métodos de análise Exemplo 1.1: Determinação do estado nativo da proteína por fluorescência de triptofano intrínseca
[00540] A espectroscopia de fluorescência de triptofano (Trp) é uma ferramenta bem descrita para monitorar o dobramento e desdobramento proteico. Resíduos de Trp enterrados nas proteínas nativas exibem tipicamente emissão de fluorescência mais alta por volta de 330 nm do que quando presentes em posições mais expostas por solvente tais como proteínas desdobradas. Em proteínas desdobradas, os comprimentos de onda para emissão de fluorescência de Trp tipicamente mudam para comprimentos de onda mais altos e são muitas vezes medidos por volta de 350 nm. Aqui
133 / 172 explora-se essa transição para monitorar o desdobramento termicamente induzido calculando-se a razão entre emissão de fluorescência a 330 nm e 350 nm para investigar a influência da temperatura de aquecimento.
[00541] A análise compreende as seguintes etapas: Composições de bebida foram diluídas a 0,6 mg/ml em água MQ.
[00542] Uma amostra de 300µl foi transferida a uma placa de 96 cavidades evitando bolhas ou 3mL foram transferidos a uma cubeta de quartzo de 10 mm.
[00543] A intensidade de emissão de fluorescência de triptofano entre 310 e 400 nm foi registrada de cima por meio de excitação a 295 com o uso de fendas de 5 nm.
[00544] As amostras foram medidas a 22°C usando um espectrofotômetro de fluorescência Cary Eclipse equipado com um acessório leitor de placa (G9810A) ou um suporte de cubeta simples.
[00545] A razão de intensidade de emissão foi calculada dividindo-se a intensidade de emissão de fluorescência a 330 nm com a intensidade de emissão a 350 nm, R = I330/I350, e usada como uma medida do estado nativo da proteína.
[00546] R de pelo menos 1,11 descreve uma conformação de BLG nativa predominante e
[00547] R de menos do que 1,11 relata desdobramento e agregação pelo menos parciais. Exemplo 1.2: Estabilidade térmica em pH 3,9. Estabilidade térmica em pH 3,9:
[00548] A estabilidade térmica em pH 3,9 é uma medida da capacidade da composição proteica de manter-se límpida mediante pasteurização prolongada em pH 3,9.
[00549] A estabilidade térmica em pH 3,9 é determinada formando-se
134 / 172 uma solução aquosa com um pH de 3,9 e que compreende 6,0% p/p de proteína misturando-se uma amostra do pó ou líquido a ser testado com água (ou alternativamente concentrando-a por meio de evaporação a baixa temperatura se for um líquido diluído) e ajustando-se o pH a 3,9 com a quantidade mínima de 0,1 M de NaOH ou 0,1 M de HCl necessária.
[00550] A mistura com pH ajustado é deixada descansando por 30 minutos, após os quais 25 mL da mistura são transferidos a um tubo de ensaio de vidro de paredes finas de 30 mL. Ela é aquecida a 75,0 graus C por 300 segundos por imersão em banho-maria com uma temperatura de 75,0 graus C. Imediatamente após o aquecimento, o tubo de ensaio de vidro é resfriado a 1- 5 graus C transferindo-o a um banho de gelo, e a turvação da amostra tratada termicamente é medida de acordo com o Exemplo 1.7. Exemplo 1.3: Determinação do grau de desnaturação de proteína de uma composição de proteína de soro de queijo
[00551] Sabe-se que a proteína de soro de queijo desnaturada tem uma solubilidade mais baixa em pH 4,6 do que em valores de pH abaixo de ou acima de pH 4,6, portanto, o grau de desnaturação de uma composição de proteína de soro de queijo é determinado medindo-se a quantidade de proteína solúvel em pH 4,6 em relação à quantidade total de proteínas em um pH em que as proteínas na solução são estáveis.
[00552] Mais especificamente para proteínas de soro de queijo, a composição de proteína de soro de queijo a ser analisada (por exemplo, um pó ou uma solução aquosa) é convertida em: - uma primeira solução aquosa contendo 5,0% (p/p) de total de proteína e com um pH de 7,0 ou 3,0 e - uma segunda solução aquosa contendo 5,0% (p/p) de total de proteína e com um pH de 4,6.
[00553] Ajustes de pH são feitos usando 3% (p/p) de NaOH (aq) ou 5% (p/p) de HCl (aq).
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[00554] O teor total de proteína (PpH 7,0 ou 3,0) da primeira solução aquosa é determinado de acordo com o exemplo 1.5.
[00555] A segunda solução aquosa é armazenada por 2 h à temperatura ambiente e subsequentemente centrifugada a 3.000 g por 5 minutos. Uma amostra do sobrenadante é recuperada e analisada de acordo com o Exemplo
1.5 para fornecer a concentração proteica no sobrenadante (SpH4,6).
[00556] O grau de desnaturação de proteína, D, da composição de proteína de soro de queijo é calculado como:
[00557] D = ((PpH 7,0 ou 3,0-SpH 4,6)/ PpH 7,0 ou 3,0)*100% Exemplo 1.4 Determinação da desnaturação de proteína (com precipitação ácida em pH 4,6) usando análise por UPLC de fase reversa.
[00558] Amostras de BLG (tais como composições de bebida de BLG aquecidas e de referência não aquecidas) foram diluídas a 2% em água MQ. 5mL de solução de proteína, 10mL de Milli-Q, 4mL de ácido acético 10% e 6mL de 1,0M de NaOAc são misturados e agitados por 20 minutos para permitir aglomeração de precipitação de proteína desnaturada em por volta de pH 4,6. A solução é filtrada em um filtro de 0,22µm para remover aglomerados e proteínas não nativas.
[00559] Todas as amostras foram submetidas ao mesmo grau de diluição adicionando-se água polida.
[00560] Para cada amostra, o mesmo volume foi carregado em um sistema de UPLC com uma coluna de UPLC (proteína BEH C4; 300Å; 1,7 µm; 150 x 2,1 mm) e detectado a 214 nm.
[00561] As amostras foram rodadas usando-se as seguintes condições: Tampão A: Água Milli-Q, 0,1% p/p de TFA Tampão B: Acetonitrila de grau HPLC, 0,1% p/p de TFA Fluxo: 0,4ml/min Gradiente: 0-6,00 minutos 24-45% B; 6,00-6,50 minutos 45- 90% B; 6,50-7,00 minutos 90% B; 7,00-7,50 minutos 90-24% B e 7,50-10,00
136 / 172 minutos 24% B.
[00562] A área de picos de BLG contra um padrão de proteína (Sigma L0130) foi usada para determinar a concentração de BLG nativa em amostras (curva de calibração de nível 5)
[00563] As amostras foram adicionalmente diluídas e reinjetadas se estavam fora da faixa linear. Exemplo 1.5: Determinação do total de proteína
[00564] O teor total de proteína (proteína verdadeira) de uma amostra é determinado: determinando-se o total de nitrogênio da amostra seguindo o ISO 8968-1/2|IDF 020-1/2- Determination of nitrogen content - Part 1/2: Determination of nitrogen content using the Kjeldahl method (Leite - Determinação de teor de nitrogênio - Parte 1/2: Determinação de teor de nitrogênio com o uso do método de Kjeldahl.
[00565] Determinando-se o nitrogênio não proteína da amostra seguindo o ISO 8968-4|IDF 020-4- Milk - Determination of nitrogen content - Part 4: Determination of non-protein-nitrogen content (Leite - Determinação de teor de nitrogênio - Parte 4: Determinação de teor de nitrogênio não proteína.
[00566] Calculando-se a quantidade total de proteína como (mtotal de nitrogênio – mnitrogênio não proteína)*6,38. Exemplo 1.6: Determinação de BLG, ALA e CMP não agregados
[00567] O teor de alfa-lactalbumina (ALA), beta-lactoglobulina (BLG) e caseinomacropeptídeo (CMP) não agregados, respectivamente, foi analisado por análise por HPLC a 0,4mL/min. Uma amostra filtrada de 25 microL é injetada em 2 colunas TSKgel3000PWxl (7,8 mm 30 cm, Tosohass, Japão) conectadas em série com pré-coluna PWxl afixada (6 mm x 4 cm, Tosohass, Japão) equilibradas no eluente (consistindo em 465g de água Milli-Q, 417,3 g de acetonitrila e 1mL de ácido trifluoroacético) e com o uso de um detector
137 / 172 por UV a 210nm.
[00568] A determinação quantitativa dos teores de alfa-lactalbumina (Calfa), beta-lactoglobulina (Cbeta) e caseinomacropeptídeo (CCMP) nativos foi realizada comparando-se as áreas pico obtidas para as proteínas padrão correspondentes com as das amostras.
[00569] A quantidade total de adicional proteína (proteína não BLG) foi determinada subtraindo-se a quantidade de BLG da quantidade de total de proteína (determinada de acordo com o Exemplo 1.5) Exemplo 1.7: Determinação de turvação
[00570] A turvação é a nebulosidade ou a turvação de um fluido causadas por um grande número de partículas que são no geral invisíveis ao olho humano, similar a fumaça no ar.
[00571] A turvação é medida em unidades nefelométricas de turvação (NTU).
[00572] Bebidas/amostras de 20mL foram adicionadas a um vidro de NTU e colocadas no turbidímetro Turbiquant® 3000 IR. O valor de NTU foi medido após a estabilização e repetido duas vezes. Exemplo 1.8: Determinação da viscosidade
[00573] A viscosidade de um líquido é medida com o uso de um viscosímetro Viscoman da Gilson ou um viscosímetro comparável e relatada a uma taxa de cisalhamento de 300s-1. A não ser que declarado em contrário, as amostras são equilibradas a 15°C antes da medição e medidas nessa temperatura.
[00574] A viscosidade é apresentada na unidade centipoise (cP) a uma taxa de cisalhamento de 300 s-1 a não ser que afirmado em contrário. Quanto mais altos os valores de cP medidos, mais alta a viscosidade. Exemplo 1.9: Determinação da cor
[00575] A cor foi medida usando um medidor de croma (Konica Minolta, CR-400). Uma amostra de 15 g foi adicionada a uma pequena placa
138 / 172 de Petri (55x14,2 mm, VWR nº de cat 391-0895) evitando-se formação de bolha. O teor de proteína das amostras foi padronizado a 6,0% p/p de proteína ou menos.
[00576] O medidor de croma foi calibrado a uma placa de calibração branca (nº 19033177). O iluminante foi definido em D65 e o observador em 2 graus. A cor (espaço de cores CIELAB, valores a*, b*, L*) foi medida com tampas cobrindo a suspensão, como a média de três leituras individuais em diferentes locais da placa de Petri.
[00577] A referência de água desmineralizada foi os seguintes valores: L* 39,97±0,3 a* 0,00 ± 0,06 b* -0,22±0,09
[00578] As medições foram convertidas em valores de delta/diferença com base na medição de água desmineralizada. delta L* = Lamostra padronizada a 6,0 % p/p de proteína* - Lágua desmin.* , medido à temperatura ambiente. delta a* = aamostra padronizada a 6,0% p/p de proteína* - aágua desmin.* , medido à temperatura ambiente. delta b* = bamostra padronizada a 6,0% p/p de proteína* - bágua desmin.* , medido à temperatura ambiente.
[00579] As amostras são padronizadas a 6,0% p/p de proteína ou abaixo.
[00580] O espaço de cores L*a*b* (também chamado de o espaço CIELAB) é um dos espaços de cores uniformes definidos pela Comissão Internacional de Iluminação (CIE) em 1976 e foi usado para relatar quantitativamente luz e tonalidade (ISO 11664-4:2008(E)/CIE S 014- 4/E:2007).
[00581] Nesse espaço, L* indica luz (valor de 0-100), o preto mais escuro em L* = 0, e o branco mais claro em L* = 100.
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[00582] Os canais de cor a* e b* representam valores de cinza neutro verdadeiros em a* = 0 e b* = 0. O eixo a* representa o componente verde- vermelho, com o verde na direção negativa e o vermelho na direção positiva. O eixo b* representa o componente azul-amarelo, com o azul na direção negativa e o amarelo na direção positiva. Exemplo 1.10 Teste de estabilidade de bebida/matéria proteica insolúvel
[00583] Composições de bebida de proteína de soro de queijo foram consideradas estáveis se menos do que 15% do total de proteína em amostras aquecidas precipitaram mediante a centrifugação a 3.000 g por 5 minutos: amostras de aproximadamente 20 g foram adicionadas a tubos de centrifugação e centrifugadas a 3.000 g 5 min.
[00584] A análise de Kjeldahl da proteína antes da centrifugação e do sobrenadante após a centrifugação foi usada para quantificar a recuperação proteica. Consultar exemplo 1.5.
[00585] A perda de proteína é calculada: esse parâmetro é também às vezes chamado de o nível de matéria proteica insolúvel e pode ser usado para analisar amostras líquidas e em pó. Se a amostra é um pó, 10 g do pó são suspensos em 90 g de água desmineralizada e deixados hidratando a 22 graus C sob agitação leve por 1 hora. Aproximadamente 20 g de amostra (por exemplo, amostra líquida ou a amostra em pó suspensa) em tubos de centrifugação e centrifugados a 3.000 g 5 min. Análise de Kjeldahl da proteína antes da centrifugação (P total) e do sobrenadante após a centrifugação (P3.000xg) foi usada para quantificar a recuperação proteica de acordo com o Exemplo 1.5.
[00586] A quantidade de matéria proteica insolúvel é calculada:
140 / 172 Exemplo 1.11: Avaliação sensorial
[00587] As preparações de bebida tratadas termicamente passaram por uma avaliação sensorial descritiva. As preparações de bebida haviam sido submetidas ao calor com o uso de trocadores de calor a placas.
[00588] Uma amostra de 1 volume foi misturada com água de 1 volume e comparada com isolado de proteína de soro de queijo não aquecido, ácido lático e ácido cítrico também são usados para formar uma lista de atributos antes da última sessão de degustação: Categoria Atributos: Aroma Soro de queijo, ácido (produto de leite azedo) Gosto básico Ácido, amargo Sabor Soro de queijo, ácido cítrico, ácido lático Sensação bucal Seca, adstringência
[00589] Biscoitos, chá branco, melão e água foram usados para limpar o paladar dos participantes entre cada amostra.
[00590] Uma amostra de ensaio de 15 mL à temperatura ambiente (20- 25°C) foi servida em copos pequenos.
[00591] As amostras de ensaio foram, cada uma, servidas a 10 indivíduos três vezes em três blocos diferentes em ordem aleatória.
[00592] Os atributos (consultar tabela acima) foram classificados em uma escala de 15 cm com 0 = baixa intensidade e 15 = alta intensidade.
[00593] A análise estatística foi conduzida no software “Panelcheck” usando um teste ANOVA de 3 vias para múltiplas réplicas. As amostras foram fixadas e o painel foi definido em aleatório.
[00594] A correção de Bonferroni sugerindo valores de diferença de mínima significância (comparações em pares de grupos associados a uma letra) foi usada para avaliar diferenças significativas entre as amostras. Exemplo 1.12: Determinação de transparência por imageamento
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[00595] Fotografias de preparações de bebida foram conduzidas colocando-se amostras em frascos de medição de NTU de turvação encostados em um pedaço de papel com texto “lorem ipsum”. Os frascos foram fotografados com o uso de um smartphone, e os inventores avaliaram se o texto podia ser claramente observado através do frasco. Exemplo 1.13: Determinação de teor de cinzas
[00596] O teor de cinzas de um produto alimentício é determinado de acordo com NMKL 173:2005 “Ash, gravimetric determination in foods” (Cinzas, determinação gravimétrica nos alimentos). Exemplo 1.14: Determinação da condutividade
[00597] A “condutividade” (às vezes chamada de a “condutância específica”) de uma solução aquosa é uma medida da capacidade da solução de conduzir eletricidade. A condutividade pode, por exemplo, ser determinada medindo-se a resistência de CA da solução entre dois eletrodos e o resultado é tipicamente determinado na unidade milliSiemens por cm (mS/cm). A condutividade pode, por exemplo, ser medida de acordo com o método nº
120.1 da EPA (a Agência de Proteção Ambiental dos EUA).
[00598] Os valores de condutividade mencionados no presente documento foram normalizados a 25 graus C a não ser que seja especificado em contrário.
[00599] A condutividade é medida em um condutivímetro (cond. WTW 3210 com um eletrodo tetracon 325).
[00600] O sistema é calibrado como descrito no manual antes do uso. O eletrodo é totalmente enxaguado no mesmo tipo de meio em que a medição é conduzida, a fim de evitar diluições locais. O eletrodo é abaixado ao meio de modo que a área em que a medição ocorre seja completamente submergida. O eletrodo é então agitado de modo que qualquer ar preso no eletrodo seja removido. O eletrodo é então mantido imóvel até que um valor estável possa ser obtido e registrado a partir do visor.
142 / 172 Exemplo 1.15: Determinação do total de sólidos de uma solução
[00601] O total de sólidos de uma solução pode ser determinado de acordo com o NMKL 110 2ª edição, 2005 (total de sólidos (água) - determinação gravimétrica no leite e em produtos lácteos). NMKL é uma abreviação para “Nordisk Metodikkomité for Næringsmidler”.
[00602] O teor de água da solução pode ser calculado como 100% menos a quantidade relativa do total de sólidos (% p/p). Exemplo 1.16: Determinação do pH
[00603] Todos os valores de pH são medidos com o uso de um eletrodo de vidro de pH e são normalizados a 25 graus C.
[00604] O eletrodo de vidro de pH (com compensação de temperatura) é cuidadosamente enxaguado antes e calibrado antes do uso.
[00605] Quando a amostra está na forma líquida, o pH é medido diretamente na solução líquida a 25 graus C.
[00606] Quando a amostra é um pó, 10 gramas de um pó são dissolvidos em 90 ml de água desmineralizada à temperatura ambiente enquanto é agitada vigorosamente. O pH da solução é então medido a 25 graus C. Exemplo 1.17: Determinação de densidade solta e densidade aparente
[00607] A densidade de um pó seco é definida como a relação entre peso e volume do pó que é analisado usando um medidor de volume Stampf especial (isto é, um cilindro de medição) sob condições especificadas. A densidade é tipicamente expressa em g/ml ou kg/L.
[00608] Nesse método, uma amostra de pó secado é enfiada em um cilindro de medição. Após um número específico de batidas, o volume do produto é lido e a densidade é calculada.
[00609] Três tipos de densidades podem ser definidos por esse método:
143 / 172
[00610] Densidade despejada (poured density), que é a massa dividida com o volume de pó após ter sido transferido ao cilindro de medição especificado.
[00611] Densidade solta, que é a massa dividida com o volume de pó após 100 batidas de acordo com as condições especificadas nesse padrão.
[00612] Densidade aparente, que é a massa dividida com o volume de pó após 625 batidas de acordo com as condições especificadas nesse padrão.
[00613] O método usa um cilindro de medição especial, 250 ml, graduado 0-250 ml, peso 190±15 g (J. Engelsmann A. G. 67059 Ludwigshafen/Rh) e um medidor de volume Stampf, e.g. J. Engelsmann A. G.
[00614] A densidade solta e a densidade aparente do produto secado são determinadas pelo seguinte procedimento. Pré-tratamento:
[00615] A amostra a ser medida é armazenada à temperatura ambiente.
[00616] A amostra é então completamente misturada rotando-se e virando-se o recipiente repetidamente (evitar esmagar as partículas). O recipiente não é preenchido em mais do que 2/3. Procedimento:
[00617] Pesar 100,0 ± 0,1 grama de pó e transferi-los para o cilindro de medição. O volume V0 é lido em ml.
[00618] Se 100 g de pó não couberem no cilindro, a quantidade deve ser reduzida a 50 ou 35 gramas.
[00619] Fixar o cilindro de medição ao medidor de volume Stampf e deixar que ele dê 100 batidas. Nivelar a superfície com a espátula e ler o volume V100 em ml.
[00620] Mudar o número de batidas para 625 (incl. as 100 batidas). Após as batidas, nivelar a superfície e ler o volume V625 em ml. Cálculo das densidades:
[00621] Calcular as densidades solta e aparente expressas em g/ml de
144 / 172 acordo com a seguinte fórmula:
[00622] Densidade aparente = M/V
[00623] em que M designa a amostra pesada em gramas e V designa o volume após 625 batidas em ml. Exemplo 1.18: Determinação do teor de água de um pó
[00624] O teor de água de um produto alimentício é determinado de acordo com o ISO 5537:2004 (Dried milk - Determination of moisture content [Leite secado - determinação de teor de umidade] (método de referência)). NMKL é uma abreviação para “Nordisk Metodikkomité for Næringsmidler”. Exemplo 1.19: Determinação das quantidades de cálcio, magnésio, sódio, potássio, fósforo (método ICP-MS)
[00625] As quantidades totais de cálcio, magnésio, sódio, potássio e fósforo são determinadas com o uso de um procedimento em que as amostras são primeiro decompostas com o uso de digestão por micro-ondas e, então, a quantidade total de mineral(is) é determinada com o uso de um aparelho ICP. Aparelho:
[00626] O micro-ondas é da Anton Paar e o ICP é um Optima 2000DV da PerkinElmer Inc. Materiais:
[00627] HNO3 1M
[00628] Ítrio em HNO3 2%
[00629] Padrões adequados para cálcio, magnésio, sódio, potássio e fósforo em HNO3 5% Pré-tratamento:
[00630] Pesar uma certa quantidade de pó e transferir o pó a um tubo de digestão por micro-ondas. Adicionar 5 mL de HNO3 1M. Digerir as amostras no micro-ondas de acordo com as instruções do micro-ondas. Colocar os tubos de digestão em uma capela de exaustão, remover a tampa e
145 / 172 deixar os gases voláteis evaporarem. Procedimento de medição:
[00631] Transferir amostra pré-tratada ao DigiTUBE usando uma quantidade conhecida de água Milli-Q. Adicionar uma solução de ítrio em HNO3 2% ao tubo de digestão (cerca de 0,25 mL por 50 mL de amostra diluída) e diluir ao volume conhecido usando água Milli-Q. Analisar as amostras no ICP usando o procedimento descrito pelo fabricante.
[00632] Uma amostra cega é preparada diluindo-se uma mistura de 10 mL de HNO3 1M e 0,5 mL de solução de ítrio em HNO3 2% a um volume final de 100 mL com o uso de água Milli-Q.
[00633] Pelo menos 3 amostras padrão são preparadas com concentrações que estão dentro das concentrações esperadas de amostra. Exemplo 1.20: Determinação do valor de furosina:
[00634] O valor de furosina é determinado como descrito em “Maillard Reaction Evaluation by Furosine Determination During Infant Cereal Processing” (Avaliação da reação de Maillard por determinação de furosina durante o processamento de cereal infantil), Guerra-Hernandez et al, Journal of Cereal Science 29 (1999) 171–176, e a quantidade total de proteína é determinada de acordo com o Exemplo 1.5. O valor de furosina é relatado na unidade mg furosina por 100 g de proteína. Exemplo 1.21: Determinação da cristalinidade de BLG em um líquido
[00635] O método a seguir é usado para determinar a cristalinidade de BLG em um líquido com um pH na faixa de 5-6.
[00636] Transferir uma amostra de 10 mL do líquido em questão a um filtro Maxi-Spin com uma membrana CA com um tamanho de poro de 0,45 mícron.
[00637] Imediatamente girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos mantendo a centrífuga a 2 graus C
[00638] Adicionar 2 mL de água Milli-Q fria (2 graus C) ao lado de
146 / 172 retentado do filtro giratório e, imediatamente, girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos enquanto mantém a centrífuga resfriada a 2 graus C, coletar o permeado (permeado A), medir o volume e determinar a concentração de BLG através de HPLC usando o método delineado no Exemplo 1.6.
[00639] Adicionar 4 mL de 2M NaCl ao lado de retentado do filtro, agitar rapidamente e deixar a mistura ficar por 15 minutos a 25 graus C.
[00640] Imediatamente girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos e coletar o permeado (permeado B)
[00641] Determinar o peso total de BLG no permeado A e no permeado B usando o método delineado no Exemplo 1.6 e converter os resultados ao peso total de BLG em vez do percentual de peso. O peso de BLG no permeado A é chamado de mPermeadoA e o peso de BLG no permeado B é chamado de mPermeado B.
[00642] A cristalinidade do líquido no que se refere à BLG é determinada como: cristalinidade = mPermeado B/(mPermeado A+mPermeado B)*100% Exemplo 1.22: Determinação da cristalinidade da BLG em um pó seco
[00643] Esse método é usado para determinar a cristalinidade da BLG em um pó seco.
[00644] 5,0 gramas da amostra de pó são misturadas com 20,0 gramas de água Milli-Q fria (2 graus C) e deixadas ficar por 5 minutos a 2 graus C.
[00645] Transferir a amostra do líquido em questão a um filtro Maxi- Spin com uma membrana CA de 0,45 mícron.
[00646] Imediatamente girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos mantendo a centrífuga a 2 graus C
[00647] Adicionar 2 mL de água Milli-Q fria (2 graus C) ao lado de retentado do filtro giratório e, imediatamente, girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos, coletar o permeado (permeado A), medir o volume e determinar a concentração de BLG através de HPLC usando o método delineado no
147 / 172 Exemplo 1.6 e converter os resultados ao peso total da BLG em vez do percentual de peso. O peso da BLG no permeado A é chamado de mpermeadoA
[00648] A cristalinidade da BLG no pó é, então, calculada com o uso da seguinte fórmula: em que mBLG total é a quantidade total de BLG na amostra de pó da etapa a).
[00649] Se a quantidade total de BLG da amostra de pó não for conhecida, ela pode ser determinada suspendendo-se outros 5 g de amostra de pó (da mesma fonte de pó) em 20,0 gramas de água Milli-Q, ajustando-se o pH a 7,0 pela adição de NaOH aquoso, permitindo-se que a mistura fique por 1 hora a 25 graus C sob agitação e, finalmente, determinando-se a quantidade total de BLG da amostra de pó com o uso do Exemplo 1.6. Exemplo 1.23: Determinação da condutividade do permeado de UF
[00650] Uma amostra de 15 mL é transferida a unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 com um ponto de corte (cut off) de 3 kDa (3.000 NMWL) e centrifugada a 4.000 g por 20-30 minutos ou até um volume suficiente de permeado de UF para medir a condutividade seja acumulado na parte inferior das unidades de filtro. A condutividade é medida imediatamente após a centrifugação. O manuseio e a centrifugação da amostra são realizados à temperatura da fonte da amostra. Exemplo 1.24: Detecção de cristais de BLG secados em um pó
[00651] A presença de cristais de BLG secados em um pó pode ser identificada da seguinte maneira:
[00652] a amostra do pó a ser analisada é ressuspensa e delicadamente misturada em água desmineralizada com uma temperatura de 4 graus C em uma razão de peso de 2 partes de água para 1 parte de pó e deixada reidratando por 1 hora a 4 graus C.
148 / 172
[00653] A amostra reidratada é inspecionada por microscopia para identificar a presença de cristais, preferivelmente com o uso de luz polarizada plana para detectar birrefringência.
[00654] Matéria semelhante a cristal é separada e submetida a cristalografia de raio X a fim de verificar a existência de estrutura de cristal e, preferivelmente, também verificar que a retícula de cristal (grupo de espaço e dimensões de célula de unidade) corresponde à de um cristal de BLG.
[00655] A composição química da matéria semelhante a cristal separada é analisada para verificar que seus sólidos consistem principalmente em BLG. Exemplo 1.25: Determinação da quantidade total de lactose
[00656] A quantidade total de lactose é determinada de acordo com o ISO 5765-2:2002 (IDF 79-2: 2002) “Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese – Determination of lactose content – Part 2: Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose”. Exemplo 1.26: Determinação da quantidade total de carboidrato:
[00657] A quantidade de carboidrato é determinada pelo uso do kit para ensaio de total de carboidratos Sigma Aldrich (Cat MAK104-1KT) em que os carboidratos são hidrolisados e convertidos a furfurais e hidroxifurfurais que são convertidos a um cromogênio que é monitorado espectrofotometricamente a 490nm. Exemplo 1.27: Determinação da quantidade total de lipídios
[00658] A quantidade de lipídio é determinada de acordo com o ISO 1211:2010 (Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method). Exemplo 1.28: Determinação de brix
[00659] Medições de brix foram conduzidas com o uso de um refratômetro PAL-α digital portátil (Atago) calibrado contra água polida (água filtrada por osmose reversa para obter uma condutividade de no máximo 0,05
149 / 172 mS/cm).
[00660] Aproximadamente 500µl de amostra foram transferidos à superfície de prisma do instrumento e a medição foi iniciada. O valor medido foi lido e registrado.
[00661] O Brix de uma solução de proteína de soro de queijo é proporcional ao teor de total de sólidos (TS) e o TS (% p/p) é aproximadamente Brix * 0,85.
[00662] O Brix é também às vezes chamado de graus Brix ou Brix. Exemplo 1.29 Determinação de lactoferrina e lactoperoxidase
[00663] A concentração de lactoferrina é determinada por um imunoensaio ELISA como delineado por Soyeurt 2012 (Soyeurt et al; Mid- infrared prediction of lactoferrin content in bovine milk:potential indicator of mastitis; Animal (2012), 6:11, págs. 1830–1838)
[00664] A concentração de lactoperoxidase é determinada usando um kit de lactoperoxidase bovina disponível comercialmente. Exemplo 1.30: Determinação do número de unidades formadoras de colônia
[00665] A determinação do número de unidades formadoras de colônia por grama de amostra é realizada de acordo com o ISO 4833-1:2013(E): Microbiology of food and animal feeding stuffs - horizontal method for the enumeration of microorganisms - Colony-count technique at 30°C (Microbiologia do alimento e substâncias de alimentação animal - método horizontal para a enumeração de micro-organismos - técnica de contagem de colônia a 30°C). Exemplo 1.31: Determinação da quantidade total de BLG, ALA e CMP
[00666] Esse procedimento é um método de cromatografia líquida (HPLC) para a análise quantitativa de proteínas tais como ALA, BLG e CMP e, opcionalmente, também outras espécies de proteína em uma composição. Contrariamente ao método do Exemplo 1.6, o presente método também mede
150 / 172 proteínas que estão presentes em agregados e, portanto, provê uma medida da quantidade total das espécies de proteína na composição em questão.
[00667] O modo de separação é cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e o método usa tampão de HCI de guanidina de 6M tanto como solvente da amostra e fase móvel de HPLC. Mercaptoetanol é usado como um agente redutor para reduzir o dissulfeto (S-S) nas proteínas ou nos agregados de proteína para criar estruturas monoméricas desdobradas.
[00668] A preparação de amostra é facilmente alcançada dissolvendo- se 10 mg de equivalente de proteína na fase móvel.
[00669] Duas colunas TSK-GEL G3000SWXL (7,7 mm x 30,0 cm) (colunas GPC) e uma pré-coluna são colocadas em série para alcançar separação adequada das proteínas maiores em matérias-primas.
[00670] Os analitos eluídos são detectados e quantificados por detecção por UV (280 nm). Equipamentos /Materiais:
[00671] 1. Bomba de HPLC 515 com lavagem de vedação manual ( Waters )
2. Módulo de controle II de bomba de HPLC (Waters)
3. Autoamostrador 717 (Waters)
4. Detector duplo de absorbância 2487 (Waters)
5. Programa de computador capaz de gerar relatórios quantitativos ( Empower 3, Waters )
6. Coluna analítica: Duas TSK-GEL G3000SWXL (7,8 x 300 mm, P/N: 08541). Pré-coluna: Pré-coluna TSK SWxL (6,0 x 40 mm, P/N: 08543).
7. Banho ultrassônico ( Branson 5200 )
8. Filtro para seringa de 25 mm com membrana de acetato de celulose de 0,2 µm. ( 514-0060, VWR )
151 / 172 Procedimento: Fase móvel:
[00672] Solução tampão estoque.
1. Pesar 56,6 g de Na2HPO4, 3,5 g de NaH2PO4, e 2,9 g de EDTA em um béquer de 1.000 mL. Dissolver em 800 mL de água.
2. Medir o pH e ajustar a 7,5 ± 0,1, se necessário, com HCl (diminuir o pH) ou NaOH (aumentar o pH).
3. Transferir a um balão volumétrico de 1.000 mL e diluir ao volume com água. B. Fase móvel de HCl de guanidina de 6M.
[00673] 1. Pesar 1.146 g de HCl de guanidina em um béquer de 2.000 mL e adicionar 200 mL da solução tampão estoque (A)
2. Diluir essa solução a cerca de 1.600 mL com água enquanto se mistura com uma barra de agitação magnética (50°C)
3. Ajustar o pH a 7,5 ± 0,1 com NaOH.
4. Transferir a um balão volumétrico de 2.000 mL e diluir ao volume com água.
5. Filtrar usando o aparelho de filtração solvente com o filtro de membrana de 0,22 μm. Padrões de calibração.
[00674] Os padrões de calibração de cada proteína a ser quantificada são preparados da seguinte maneira:
1. Pesar com exatidão (em 0,01 mg) cerca de 25mg do padrão de referência de proteína em um balão volumétrico de 10mL e dissolver em 10 mL de água. Essa é a solução padrão estoque de proteína (S1) da proteína
2. Pipetar 200 µl de S1 em um balão volumétrico de 20 ml e diluir ao volume com fase móvel.
152 / 172 Essa é a solução padrão de trabalho baixa WS1.
3. Pipetar 500 µl de S1 em um balão volumétrico de 10 ml e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão WS2.
4. Pipetar 500 µl de S1 em um frasco volumétrico de 5 mL e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão WS3.
5. Pipetar 750 µl de S1 em um frasco volumétrico de 5 mL e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão WS4.
6. Pipetar 1,0 mL de S1 em um balão volumétrico de 5 mL e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão de trabalho alta WS5.
7. Usando pipetas descartáveis graduadas, transferir 1,5 mL de WS1-5 em frascos separados. Adicionar 10 μL de 2-mercaptoetanol a cada frasco e tampar. Turbilhonar as soluções por 10 segundos. Deixar as soluções padrão ficarem à temperatura ambiente por cerca de 1 hora.
8. Filtrar as soluções padrão com o uso de filtros para seringa de acetato de celulose de 0,22 µm.
[00675] A pureza da proteína é medida com o uso de Kjeldahl ( N x 6,38 ) e a % de área da solução padrão WS5 com o uso da HPLC. proteína (mg) = “peso padrão da proteína” (mg) x P1 x P2 P1 = % de P (Kjeldahl) P2 = % de área de proteína (HPLC) Preparação de amostra
[00676] 1. Pesar o equivalente de 25 mg de proteína da amostra original em um balão volumétrico de 25 mL.
153 / 172
2. Adicionar aproximadamente 20 mL de fase móvel e deixar a amostra dissolver por cerca de 30 min.
3. Adicionar fase móvel ao volume e adicionar 167 μL de 2- mercaptoetanol à solução de amostra de 25 ml.
4. Sonicar por cerca de 30 min. e depois deixar a amostra ficar à temperatura ambiente por cerca de 1½ hora.
5. Misturar a solução e filtrar usando filtros para seringa de acetato de celulose de 0,22 µl. Sistema/colunas de HPLC Equilibração de coluna
[00677] 1. Conectar a pré-coluna GPC e as duas colunas analíticas GPC em série. Novas colunas são no geral enviadas em um tampão de sal de fosfato.
2. Escorrer água por uma nova coluna gradualmente de 0,1 a 0,5 mL/min em 30 a 60 minutos. Continuar lavando por cerca de 1 hora.
3. Gradualmente diminuir a vazão de 0,5 mL/min a 0,1 mL/min e substituir com fase móvel no reservatório.
4. Aumentar a vazão da bomba gradualmente de 0,1 a 0,5 mL/min em 30 a 60 minutos para evitar choque de pressão e deixar em 0,5 mL/min.
5. Injetar dez amostras para permitir que a coluna seja saturada e esperar os picos eluírem. Isso auxiliará no condicionamento da coluna. Essa etapa é feita sem a necessidade de esperar que cada injeção esteja completa antes de injetar a próxima.
6. Equilibrar com a fase móvel pelo menos 1 hora. Cálculo dos resultados
154 / 172
[00678] A determinação quantitativa dos teores das proteínas a ser quantificados, por exemplo alfa-lactalbumina, beta-lactoglobulina, e caseinomacropeptídeo, é realizada comparando-se as áreas de pico obtidas para as proteínas padrão correspondentes com as das amostras. Os resultados são relatados como g de proteína específica/100 g da amostra original ou porcentagem de peso da proteína específica em relação ao peso da amostra original. Exemplo 2: Produção de um pó de isolado de BLG ácido secado por pulverização Alimento de proteína de soro de queijo
[00679] O retentado de UF esgotado de lactose derivado do soro de queijo doce de um processo padrão de produção de queijo foi filtrado por um filtro de 1,2 mícron e havia tido sua gordura reduzida por meio de uma membrana Synder FR antes de ser usado como alimento para o processo de cristalização de BLG. A composição química do alimento pode ser vista na Tabela 1. Observe-se que todas as porcentagens de peso de proteínas específicas, tais como BLG, ALA, mencionadas nesse Exemplo se referem à porcentagem de peso das proteínas não agregadas em relação ao total de proteína. Condicionamento
[00680] O alimento de soro de queijo doce foi condicionado em uma aparelhagem de ultrafiltração a 20 graus C, usando uma membrana do tipo Koch HFK-328 (membrana de 70 m2) com um espaçador de 46 mill, pressão de alimentação de 1,5-3,0 bars, a uma concentração de alimento de 21% de total de sólidos (TS) ±5, e usando água polida (água filtrada por osmose reversa para obter uma condutividade de no máximo 0,05 mS/cm) como meio de diafiltração. O pH foi, então, ajustado adicionando-se HCl de modo que o pH fosse aproximadamente 5,5. A diafiltração continuou até que a queda na condutividade do retentado foi abaixo de 0,1 mS/cm por um período de 20
155 / 172 minutos. O retentado foi então concentrado até o fluxo de permeado estivesse abaixo de 1,43 L/h/m2. Uma primeira amostra de retentado concentrado foi colhida e submetida a centrifugação a 3.000 g por 5 minutos. O sobrenadante da primeira amostra foi usado para a determinação do rendimento de BLG. Cristalização
[00681] O retentado concentrado foi transferido para um tanque de cristalização de 300 L, onde ele foi semeado com material de cristal de BLG puro feito de cristais de BLG secados por pulverização e reidratados. Subsequentemente, a solução de proteína de soro de queijo semeada foi resfriada de 20 graus C para aproximadamente 6 graus C por aproximadamente 10 horas para permitir que os cristais de BLG se formassem e crescessem.
[00682] Após o resfriamento, uma amostra da solução de proteína de soro de queijo contendo cristal (a segunda amostra) foi colhida, e os cristais de BLG foram separados por centrifugação a 3.000 g por 5 minutos. O sobrenadante e as pelotas de cristal da segunda amostra foram submetidos a análise por HPLC como descrito abaixo. O rendimento da cristalização foi calculado como delineado abaixo e determinado em 57%. Tabela 1 Composição química do alimento Alimento padronizado a 95% de total de sólidos Composição de proteína (% p/p do total de proteína) ALA 10,2 BLG 59,6 Outras proteínas 30,2 Outros componentes selecionados % p/p Ca 0,438 K 0,537 Mg 0,077 Na 0,131 P 0,200 Gordura 0,220 concentração proteica 87 Determinação de rendimento de BLG com o uso de HPLC:
156 / 172
[00683] Os sobrenadantes da primeira e segunda amostras foram submetidos ao mesmo grau de diluição adicionando-se água polida e os sobrenadantes diluídos foram filtrados através de um filtro de 0,22 µm. Para cada sobrenadante filtrado e diluído, o mesmo volume foi carregado em um sistema de HPLC com um PhenomenexJupiter® 5 µm C4 300 Å, coluna de LC 250 x 4,6 mm, Ea. e detectado em 214 nm.
[00684] As amostras foram rodadas usando-se as seguintes condições: Tampão A: Água Milli-Q, 0,1% p/p de TFA Tampão B: Acetonitrila de grau HPLC, 0,085% p/p de TFA Fluxo: 1 mL/min Temperatura da coluna: 40 graus C Gradiente: 0-30 minutos 82-55% A e 18-45% B; 30-32 minutos 55-10% A e 45-90% B; 32,5-37,5 minutos 10% A e 90% B; 38-48 minutos 10-82% A e 90-18% B. Tratamento dos dados:
[00685] Visto que ambos sobrenadantes foram tratados da mesma maneira, pode-se comparar diretamente a área dos picos de BLG para calcular um rendimento relativo. Visto que os cristais somente contêm BLG e todas as amostras foram tratadas da mesma maneira, a concentração de alfa- lactalbumina (ALA) e, logo, a área de ALA devem ser as mesmas em todas as amostras. Portanto, a área de ALA antes e após a cristalização é usada como um fator de correção (cf) ao se calcular o rendimento relativo.
[00686] O rendimento relativo é calculado pela seguinte equação:
157 / 172 Dissolução ácida dos cristais de BLG
[00687] O restante do material do tanque de cristalização foi separado usando um decantador a 350 g, 2.750 RPM, dif. de 150 RPM com um espaçador de 64 e um fluxo de alimentação de 75 L/h, antes da separação o alimento foi misturado 1:2 com água polida. O cristal de BLG/a fase sólida do decantador foi então misturado(a) com água polida a fim de torná-lo(a) uma pasta fluida mais fina antes de um ácido fosfórico ser adicionado para baixar o pH a aproximadamente 3,0 para dissolver rapidamente os cristais.
[00688] Após dissolver os cristais de BLG, o líquido de proteína BLG puro foi concentrado a 15 Brix na mesma aparelhagem de UF usada para preparar o alimento para cristalização e o pH foi ajustado ao pH final de aproximadamente 3,8. O isolado de BLG líquido foi então aquecido a 75 graus por 5 minutos e subsequentemente resfriado a 10 graus C. Constatou-se que o tratamento térmico reduz a carga microbiana de 137.000 CFU/g antes do tratamento térmico para <1.000 CFU/g após o tratamento térmico. O tratamento térmico não causou nenhuma desnaturação de proteína e a razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (330 nm/350 nm) foi determinada em 1,20, indicando conformação nativa das moléculas de BLG.
[00689] A BLG foi secada em um secador por pulverização de planta piloto com uma temperatura de entrada de 180 graus C e uma temperatura de saída de 75 graus C. O pó resultante amostrado na saída tinha um teor de água de aproximadamente 4% p/p, a composição química do pó é mostrada na Tabela 2. Uma amostra do pó secado foi dissolvida e o grau de desnaturação de proteína foi determinado em 1,5% e a razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) foi medida em 1,20.
158 / 172 Tabela 2 A composição do pó de isolado de BLG (BDL= abaixo do limite de detecção [below the detection limit]) Pó de isolado de BLG padronizado a 95% do total de sólidos Composição de proteína (% p/p do total de proteína) ALA 0,4 BLG 98,2 Outra proteína 1,4 Outros componentes selecionados (% p/p) Ca BDL
K BDL Mg BDL Na BDL P 0,781 gordura 0,09 concentração proteica 90
[00690] A densidade aparente (625 batidas) do pó secado por pulverização foi estimada em 0,2-0,3 g/cm3. Conclusão:
[00691] Usando o processo descrito acima, foi-se possível produzir um produto de BLG de alta pureza que pode ser tratado termicamente sem substancialmente nenhuma desnaturação de proteína ou desdobramento de proteína durante o processamento. O tratamento térmico diminuiu consideravelmente os níveis de bactérias sem danificar o produto de proteína.
[00692] Os inventores viram indicações de que uma densidade aparente ainda mais alta pode ser obtida aumentando-se o teor de proteína antes da secagem por pulverização. Os inventores observaram ainda que graus ainda mais baixos de desnaturação são obtidos se as temperaturas de entrada e/ou saída usadas para a secagem por pulverização forem reduzidas. Exemplo 3: Produção de um pó de isolado de BLG com pH neutro secado por pulverização
[00693] Ao usar o mesmo protocolo e configuração experimental como
159 / 172 no Exemplo 2, o isolado de proteína de soro de queijo com lactose reduzida mostrado na Tabela 3 foi condicionado e usado para alimentação para cristalização. O rendimento da cristalização foi determinado como sendo 68%.
[00694] Observe-se que todas as porcentagens de peso de proteínas específicas, tais como BLG e ALA, mencionadas nesse Exemplo se referem à porcentagem de peso das proteínas não agregadas em relação ao total de proteína. Tabela 3 Composição do alimento Alimento padronizado a 95% de total de sólidos Composição de proteína (% p/p do total de proteína) ALA 9,1 BLG 59,1 Outras proteínas incl. CMP 31,6 Outros componentes selecionados (% p/p) Ca 0,445 K 0,574 Mg 0,074 Na 0,128 P 0,211 gordura 0,513 concentração proteica 84
[00695] O restante do material do tanque de cristalização foi separado em um decantador a 350 g, 2.750 RPM, dif. de 150 RPM com um espaçador de 64 e um fluxo de alimentação de 75 L/h, antes da separação o alimento foi misturado 1:2 com água polida. O cristal de BLG/a fase sólida do decantador foi então misturado(a) com água polida a fim de torná-lo(a) uma pasta fluida mais fina antes de 0,1 M de hidróxido de potássio ser adicionado para ajustar o pH a aproximadamente 7 para dissolver rapidamente os cristais.
[00696] Após dissolver os cristais, o líquido de proteína BLG puro foi concentrado a 15 brix na mesma configuração de UF usada para preparar a solução de proteína de soro de queijo para cristalização e o pH foi ajustado ao pH final de 7,0. A BLG foi secada em um secador por pulverização de planta
160 / 172 piloto com uma temperatura de entrada de 180 graus C e uma temperatura de saída de 75 graus C. O pó resultante amostrado na saída tinha um teor de água de aproximadamente 4% p/p. A composição do pó é mostrada na Tabela 4. Após a secagem, uma parte do pó foi dissolvida em água desmineralizada e o grau de desnaturação de proteína foi determinado em 9,0% e a razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (330 nm/350 nm) era 1,16. Tabela 4 Composição química do pó de isolado de BLG Pó de isolado de BLG padronizado a 95% do total de sólidos Composição de proteína (% p/p do total de proteína) ALA 0,2 BLG 98,9 Outra proteína 0,9 Outros componentes selecionados (% p/p) Ca 0,003 K 2,343 Mg BDL Na BDL P 0,629 gordura 0,329 concentração proteica 88
[00697] A densidade aparente (625 batidas) do pó secado por pulverização foi estimada em 0,2-0,3 g/cm3. Conclusão:
[00698] Usando o processo descrito acima, é possível produzir um produto de BLG de alta pureza e pH neutro com o mínimo ou nenhuma desnaturação de proteína durante o processamento. Os inventores viram indicações de que uma densidade aparente ainda mais alta pode ser obtida aumentando-se o teor de proteína antes da secagem por pulverização. Os inventores observaram ainda que graus ainda mais baixos de desnaturação são obtidos se as temperaturas de entrada e/ou saída usadas para a secagem por pulverização forem reduzidas. O nível de desnaturação pode adicionalmente
161 / 172 ser reduzido reduzindo-se o teor de mineral antes da secagem por pulverização. Exemplo 4: Molhabilidade dos pós de isolado de BLG secados por pulverização
[00699] A molhabilidade dos pós de isolado de BLG secados por pulverização ácidos ou com pH neutro preparados de acordo com o Exemplo 2 e o Exemplo 3 foi comparada com a molhabilidade de um isolado de proteína de soro de queijo (WPI) comum secado por pulverização. A molhabilidade foi medida como o tempo que leva antes de toda a amostra de pó estar molhada. 0,5 grama do pó foi medida e colocada sobre a superfície de 100 g de água desmineralizada (10 graus C) em um recipiente cilíndrico com um diâmetro de 5 cm. Foi medido o tempo desde colocar os pós sobre a superfície da água até o pó ser dissolvido ou ter atravessado a superfície da água. Os resultados são apresentados abaixo. Nº da Tempo até dissolver Pó Comentários amostra (minutos) 5-10% do pó ainda restavam sobre 1 WPI +55 a superfície após 55 minutos isolado de BLG Completamente molhado e 2 27 ácido (pH 3,7) dissolvido isolado de BLG Completamente molhado e 3 15 neutro (pH 7) dissolvido
[00700] Conclusão: Foi surpreendente que pó de isolado de BLG não revestido (amostras 2, 3) molharam muito melhor do que um WPI padrão (amostra 1). Isso indica que os pós de isolado de BLG da presente invenção são ingredientes úteis para pós de bebida instantânea, nos quais a molhabilidade e a dissolução rápidas são importantes. Os pós de isolado de BLG oferecem, ainda, uma utilidade melhorada em relação ao WPI comum na produção de bebidas de proteína visto que são molhados e dissolvidos com muito mais rapidez e, portanto, são mais facilmente dispersos e dissolvidos durante a produção. No fim das contas, isso pode reduzir o tempo que leva para produzir uma bebida com alto nível de proteína e melhorar a capacidade de produção por hora de uma fábrica de produção de bebidas.
162 / 172 Exemplo 5: Isolados de BLG ácidos com um nível reduzido de sensação de boca seca
[00701] Duas bebidas de proteína, A e B, contendo o pó de isolado de BLG secado por pulverização ácido preparado no Exemplo 2 em uma quantidade suficiente para prover um total de proteína de 6,0%, tiveram o pH ajustado a pH 3,7 e foram submetidas a tratamento térmico de A: 75 graus C por 15 segundos ou B: 120 graus C por 20 segundos. Ambas bebidas foram resfriadas imediatamente e armazenadas em um refrigerador a 5 graus C. Foi confirmado, medindo-se a razão de emissão de fluorescência intrínseca (I330/I350), que a proteína da Bebida A ainda estava na conformação nativa, enquanto que haviam ocorrido significativos desdobramento e desnaturação na Bebida B.
[00702] A turvação da bebida A e B foi medida de acordo com o Exemplo 17 e ambas bebidas tinham turvações de menos que 40 NTU, enquanto que WPIs padrão comparáveis tinham turvações acima de 200 NTU. Os isolados de BLG ácidos da presente invenção são, portanto, claramente bastante adequados para a produção de bebidas com alto nível de proteína ácidas e transparentes.
[00703] Menos de uma semana depois da produção, ambas bebidas foram submetidas a testes sensoriais com um painel de teste sensorial treinado que constatou que a sensação de boca seca, que é característica para bebidas de proteína de soro de queijo ácidas tratadas termicamente, era mais de 100% mais alta na Bebida B (classificação de sensação de boca seca: aproximadamente 10,5 em uma escala de 0 a 12) do que na Bebida A (classificação de sensação de boca seca: aproximadamente 5,0 em uma escala de 0 a 12).
[00704] Essa constatação demonstra que a desnaturação de proteína contribui para a sensação de boca seca da bebida de proteína ácida e que a sensação de boca seca pode ser reduzida significativamente limitando-se ou
163 / 172 mesmo evitando-se a desnaturação de proteína. Exemplo 6: Produção de isolados de BLG neutros com teor microbiano ultrabaixo
[00705] Os inventores constataram que a presente invenção possibilita obter pós de BLG com pH neutro que têm um teor bacteriano bem baixo e um estado nativo de proteína alto. Isso é demonstrado no presente exemplo no qual o tempo de processo total foi estendido inserindo-se 6 dias de armazenamento a 10 graus C durante as etapas finais do processo de condicionamento para desafiar a qualidade microbiana do produto.
[00706] Alimento de proteína de soro de queijo:
[00707] Retentado de UF esgotado de lactose derivado do soro de queijo doce de um processo padrão de produção de queijo foi filtrado por um filtro de 1,2 mícron e havia tido sua gordura reduzida por meio de uma membrana Synder FR antes de ser usado como alimento para o processo de cristalização de BLG. A composição química do alimento pode ser vista na Tabela 5. Observe-se que todas as porcentagens de peso de proteínas específicas, tais como BLG, ALA, mencionadas nesse Exemplo se referem à porcentagem de peso das proteínas não agregadas em relação ao total de proteína. Tabela 5 Composição do alimento de proteína de soro de queijo usado no Exemplo 6. Alimento padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% p/p em relação ao total de proteína) ALA 10,6 BLG 59,3 Outra proteína 30,1 Outros componentes (% p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,407 K 0,567 Mg 0,075 Na 0,231 P 0,196 gordura 0,220
164 / 172 proteína 87 Condicionamento:
[00708] O alimento de soro de queijo doce foi condicionado em uma aparelhagem de ultrafiltração a por volta de 10 graus C, usando uma membrana do tipo Alfa Laval GR82PE com um espaçador de 30 mill, pressão de alimentação de 1,5-3,0 bars, a uma concentração de alimento de 21% de total de sólidos (TS) ±5, e usando água polida (água filtrada por osmose reversa para obter uma condutividade de no máximo 0,05 mS/cm) como meio de diafiltração. O pH foi ajustado a por volta de 5,9 usando um ácido clorídrico diluído e diafiltrado em uma configuração de ultrafiltração em batelada. A diafiltração continuou até que a queda na condutividade do retentado foi abaixo de 0,1 mS/cm por um período de 20 minutos.
[00709] O alimento de proteína de soro de queijo diafiltrado foi então armazenado por 6 dias a 10 graus C para desafiar a qualidade microbiana do produto obtido.
[00710] Após o armazenamento, o alimento de proteína de soro de queijo foi aquecido a 20 graus c e o pH foi, então, ajustado adicionando-se HCl de modo que o pH ficou aproximadamente 5,5 usando um ácido clorídrico diluído.
[00711] O alimento de proteína de soro de queijo foi condicionado em uma aparelhagem de ultrafiltração a 20 graus C, usando uma membrana do tipo Alfa Laval GR82PE com um espaçador de 30 mill, pressão de alimentação de 1,5-3,0 bars, a uma concentração de alimento de 21% de total de sólidos (TS) ±5, e usando água polida como meio de diafiltração.A ultrafiltração foi rodada como uma configuração de ultrafiltração contínua, e foi adicionada diafiltração de modo que o retentado final tivesse uma condutividade de entre 1,9 e 2,2 mS/cm e um TS de 22 ±5. O retentado foi coletado em um tanque de 800 L com manta e agitação. Quando o tanque estava cheio, uma primeira amostra de retentado concentrado foi colhida para análise por HPLC. A análise por HPLC nesse exemplo foi executada como
165 / 172 descrito no Exemplo 2. Cristalização:
[00712] O retentado concentrado foi transferido a um tanque de cristalização de 800 L, onde foi semeado com material de cristal de BLG puro feito de cristais de BLG secados por pulverização e reidratados. Os cristais foram adicionados a 1 L de WPI condicionado e rapidamente resfriados em gelo a abaixo de 5 graus C. Subsequentemente, a solução de proteína de soro de queijo semeada foi resfriada de 20 graus C para aproximadamente 6 graus C por aproximadamente 4 horas para permitir que os cristais de BLG se formassem e crescessem.
[00713] Após o resfriamento, uma amostra da solução de proteína de soro de queijo contendo cristal (a segunda amostra) foi colhida, e os cristais de BLG foram separados por centrifugação a 3.000 g por 5 minutos. O sobrenadante e as pelotas de cristal da segunda amostra foram submetidos a análise por HPLC como descrito abaixo. O rendimento da cristalização foi calculado como delineado abaixo e determinado em %. Separação em decantador:
[00714] Os cristais produzidos no tanque de 800 L foram separados do licor-mãe em um decantador (LEMITECH MD80) a 600 g, dif. de 2.750 RPM, com um espaçador de 64 mil (mil significa 0,00254 centímetro [1/1.000 polegada]), o fluxo de alimentação era 150 L/h e era uma mistura de água polida e alimentação do tanque em uma razão de 1 volume de alimentação do tanque para 2 volumes de água polida. Dissolvendo os cristais:
[00715] Os cristais coletados do decantador foram diluídos com água polida a uma concentração de total de sólidos de por volta de 10% antes de o pH ser ajustado a pH 3 com o uso de ácido clorídrico diluído. A solução de BLG acidificada foi mantida em pH 3 por aproximadamente 16-48 horas a aproximadamente 6 graus C.
166 / 172 Ajuste de pH da solução de BLG acidificada:
[00716] A solução de BLG acidificada teve, então, seu pH ajustado a pH 7 usando uma mistura diluída de hidróxido de potássio e hidróxido de sódio e adicionalmente condicionada em uma configuração de ultrafiltração a por volta de 10 graus C, usando uma membrana do tipo Alfa Laval GR82PE com um espaçador de 30 mill, pressão de alimentação de 1,5-3,0 bars, a uma concentração de aproximadamente 16% de TS. Microfiltração:
[00717] Uma porção da solução de BLg concentrada foi submetida a microfiltração com o uso de uma membrana Membralox EP-1940-GL-UTP com um tamanho de poro nominal de 0,8 mícron. A microfiltração foi operada a aproximadamente 10 graus C com uma pressão de alimentação de 3,5. O permeado de MF foi coletado e estava agora pronto para secagem.
[00718] Uma amostra de permeado de MF foi analisada no que se refere à sua composição química (consultar os resultados na Tabela 6) e microbiologia (Exemplo 1.30) e constatou-se, surpreendentemente, que ele tinha menos de 10 CFU/g (significando basicamente que nenhuma colônia foi identificada e que as amostras testadas pareciam estar quase estéreis). A esterilidade pode, por exemplo, ser obtida usando-se uma membrana de microfiltração ainda mais justa e assegurando-se condições assépticas no lado da membrana com o permeado.
[00719] Um processo comparável sem a acidificação e a microfiltração poderia facilmente resultar em uma solução de BLG que contivesse mais de
1.000.000 cfu/g. Tabela 6: Composição do permeado de microfiltração da solução de BLG concentrada. Permeado de microfiltração padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% p/p em relação ao total de proteína) ALA 0,5 BLG 97,5
167 / 172 Outra proteína 2 Outros componentes (% p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,015 K 0,652 Mg BDL Na 0,273
P BDL gordura BDL proteína 93 Conclusão:
[00720] Mesmo sob uma carga microbiológica pesada, a presente invenção possibilita prover um produto de BLG com pH neutro estéril ou quase estéril que tem um alto grau de estado nativo de proteína. Exemplo 7: Comparação de concentração de osmose reversa e densidade aparente de pó de BLG ácida e neutra com um WPI neutro padrão.
[00721] Os presentes inventores constataram que é possível produzir preparações secadas por pulverização de BLG nativa purificada e prover pó com uma densidade aparente mais alta do que isolados de proteína de soro de queijo comparáveis que são secados por pulverização sob as mesmas condições.
[00722] Os inventores constataram, ainda, que preparações líquidas com alto nível de proteína de BLG nativa purificada têm uma viscosidade mais baixa do que isolados de proteína de soro de queijo comparáveis. Essa constatação possibilita concentrar isolados de BLG em uma concentração total de proteína mais alta (e um teor de água mais baixo) antes da secagem e, portanto, requer a remoção de menos água e, logo, menos consumo de energia por kg de proteína secada do que um pó de WPI comparável. A viscosidade reduzida também possibilita realizar filtração por membrana, por exemplo, microfiltração, com consumo de energia reduzido, visto que a energia necessária para filtração por membrana diminui com a diminuição da viscosidade.
[00723] As constatações supracitadas foram demonstradas no
168 / 172 experimento a seguir. Matéria-prima para osmose reversa e secagem: BLG neutra:
[00724] O retentado de MF produzido no Exemplo 6 foi concentrado em uma membrana Alfa Laval RO98pHt com uma pressão de alimentação de até 52 bars e a temperatura foi mantida sob 15 graus C durante o condicionamento. A concentração continuou até um brix de 32,2. Durante a concentração, as amostras foram colhidas para medições de viscosidade e Brix como descrito nos Exemplos 1.8C e 1.28. O Brix de cada amostra foi convertido em proteína (% p/p) usando a equação abaixo:
[00725] O 0,85 é uma conversão obtida empiricamente fornecendo uma boa relação entre graus Brix e total de sólidos. Os resultados são mostrados na Fig. 6.
[00726] O teor total de sólidos de uma solução de proteína de soro de queijo é aproximadamente BRIX*0,85. BLG ácida:
[00727] A solução de BLG ácida produzida como no Exemplo 6 (com a exceção de que a ultrafiltração não foi conduzida em pH 5,92 antes da microfiltração contínua em pH 5,5 e de que a ultrafiltração foi conduzida em pH 3). A composição do alimento pode ser vista na Tabela 7. O permeado de BLG ácido submetido a uma etapa de MF como descrito no Exemplo 6 foi, então, concentrado em uma membrana Alfa Laval RO98pHt de osmose reversa (RO) com uma pressão de alimentação de até 52 bars e a temperatura foi mantida sob 15 graus C durante o condicionamento. A concentração continuou até um brix de 40,0 ser obtido. Durante a concentração, as amostras foram colhidas para medição de viscosidade e medições de Brix como descrito nos exemplos 1.8B e 1.28. Os valores Brix foram convertidos em
169 / 172 concentração proteica e os resultados estão retratados na Fig. 6. Antes da secagem, a BLG foi diluída a brix 35,5 com água polida. Tabela 7: Composição do alimento de RO ácido Alimento padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% p/p em relação ao total de proteína)
ALA BDL BLG 100 Outra proteína BDL Outros componentes (% p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca BDL
K BDL Mg BDL Na BDL
P BDL gordura BDL proteína 91 Referência de WPI:
[00728] Para comparar o produto de BLG ácido e o produto de BLG com pH neutro com um produto de WPI com pH neutro tradicional, um WPI concentrado líquido padrão baseado em soro de queijo doce foi colhido da produção da Arla Foods Danmark Protein e secado no mesmo secador por pulverização de planta piloto e usando as mesmas condições que as amostras de BLG ácida e com pH neutro. A composição do WPI concentrado líquido é mostrada na Tabela 8.
[00729] A viscosidade do WPI concentrado foi medida inicialmente, e subsequentemente o WPI concentrado foi gradualmente diluído com água polida para mostrar a correlação entre WPI brix e viscosidade para comparar com as medições da BLG. Curvas de viscosidade:
[00730] As temperaturas das amostras colhidas durante a RO e da referência de WPI diluída foram ajustadas à temperatura de 15 graus C antes de fazer as medições de viscosidade (feitas em triplo) como descrito no exemplo 1.8B. O Brix foi medido como descrito no exemplo 1.28.
170 / 172
[00731] O WPI concentrado líquido foi secado com um brix de 36,0. Tabela 8: Composição da referência de WPI. Referência de WPI padronizada a 95% de TS Composição de proteína (% p/p em relação ao total de proteína) ALA 9,6 BLG 59,1 cGMP 21,6 Outra proteína 9,7 Outros componentes (% p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,072 K 1,159 Mg 0,010 Na 0,489 P 0,210 gordura 0,100 proteína 89 Secagem por pulverização:
[00732] Após a concentração por osmose reversa (RO), todas as amostras foram secadas em um secador por pulverização de planta piloto com uma temperatura de entrada de 85 graus C sem qualquer pré-aquecimento. A temperatura de todas as amostras foi mantida abaixo de 12 graus C até a secagem por pulverização. As densidades aparentes dos pós secados por pulverização foram, então, medidas como descrito no exemplo 1,17, sem batidas, com 100 batidas, e com 625 batidas. Surpreendentemente tanto o pó de BLG ácido quanto o com pH neutro tiveram uma densidade aparente significativa e consistentemente mais alta do que a referência de WPI. Em média, a densidade aparente da BLG com pH neutro foi 18,4 por cento mais alta do que o pó da referência de WPI e a ácida foi 22,2 por cento mais alta. Os resultados das medições de densidade aparente são mostrados na Tabela 9 e são ilustrados na Fig. 5.
171 / 172 Tabela 9: Densidades aparentes dos pós obtidos de uma solução de BLG ácida, uma solução de BLG com pH neutro, e uma solução de WPI de referência, que têm o mesmo teor de proteína e foram secados por pulverização sob condições idênticas.
Amostra Batidas Densidade aparente Diferença em relação à (g/mL) referência de WPI secada (%) Referência de WPI 0 0,27 Referência de WPI 100 0,34 Referência de WPI 625 0,41 BLG neutra 0 0,32 19 BLG neutra 100 0,39 15 BLG neutra 625 0,5 22 BLG ácida 0 0,33 22 BLG ácida 100 0,4 18 BLG ácida 625 0,52 27 Conclusão:
[00733] Tanto o tipo de isolado de BLG ácido quanto o com pH neutro tiveram uma viscosidade mais baixa em comparação com a referência de WPI e foram mais fáceis de concentrar na RO. Essa constatação possibilita concentrar isolados de BLG em uma concentração total de proteína mais alta (e um teor de água mais baixo) antes da secagem e, portanto, requer a remoção de menos água e, logo, menos consumo de energia por kg de proteína secada do que um pó de WPI comparável. A viscosidade reduzida também possibilita realizar filtração por membrana, por exemplo, microfiltração, com consumo de energia reduzido, visto que a energia necessária para filtração por membrana diminui com a diminuição da viscosidade.
[00734] Os pós de BLG da presente invenção são, ainda, particularmente adequados para bebidas com alto nível de proteína, ou pós para shake para preparar bebidas com alto nível de proteína, visto que os presentes pós de BLG contribuem menos para a viscosidade do que WPIs
172 / 172 tradicionais e, portanto, proveem mais bebidas bebíveis.
[00735] Surpreendentemente, os pós de BLG secados por pulverização tiveram, ainda, uma densidade aparente mais alta em comparação com a referência de WPI mesmo quando a BLG foi secada em uma quantidade ligeiramente mais baixa de total de sólidos, como descrito pelo valor brix. Uma densidade aparente de pó mais alta significa menos volume de envio por peso durante o envio, e partículas mais densas também tendem a criar menos poeira ao serem manuseadas.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Pó de isolado de BLG, preferivelmente preparado por secagem por pulverização, caracterizado pelo fato de que tem um pH na faixa de i) 2,5 a 4,9 e compreende: - proteína total em uma quantidade de pelo menos 30% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína - água em uma quantidade de no máximo 10% p/p, o dito pó de isolado de BLG tendo um ou mais dos seguintes itens: - uma densidade aparente de pelo menos 0,2 g/cm3, - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, - uma estabilidade térmica no pH 3,9 de no máximo 200 NTU e - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g.
2. Pó de isolado de BLG, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um total de proteína em uma quantidade de pelo menos 40% p/p, preferivelmente pelo menos 50% p/p, mais preferivelmente pelo menos 70% p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% p/p e, o mais preferivelmente, pelo menos 92% p/p.
3. Pó de isolado de BLG, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que compreende BLG em uma quantidade de pelo menos 88% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 90% p/p em relação ao total de proteína.
4. Pó de isolado de BLG, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o pó compreende lipídeo em uma quantidade de no máximo 10% p/p, preferivelmente no máximo 5% p/p, mais preferivelmente no máximo 2% p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,1% p/p.
5. Pó de isolado de BLG, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que tem uma densidade aparente de pelo menos 0,20 g/cm3, preferivelmente pelo menos 0,30 g/cm3.
6. Pó de isolado de BLG, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11.
7. Pó de isolado de BLG, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que tem um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%.
8. Pó de isolado de BLG, caracterizado pelo fato de que tem um pH na faixa de 2 a 4,9 e compreende: - proteína total em uma quantidade de pelo menos 10% p/p, - beta-lactoglobulina (BLG) em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína o dito pó de isolado de BLG tendo um ou mais dos seguintes itens: - uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11, - um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10%, - uma estabilidade térmica no pH 3,9 de no máximo 200 NTU e - no máximo 15.000 unidades formadoras de colônia/g, preferivelmente no máximo 1.000 de unidades formadores de colônia/g.
9. Método para produzir um pó de isolado de BLG seco como definido na reivindicação 1 contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, o método caracterizado pelo de que compreende as etapas de: a) prover um isolado de BLG líquido que tem um pH na faixa de 2-4,9, o dito isolado de BLG líquido contendo BLG em uma quantidade de pelo menos 85% p/p em relação ao total de proteína, b) opcionalmente, submeter o isolado de BLG líquido a uma redução microbiana física, c) secar o isolado de BLG líquido por secagem por pulverização.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o isolado de BLG líquido compreende um teor total de sólidos em uma quantidade na faixa de 5 a 50% p/p.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que a fração de proteína do isolado BLG líquido tem uma razão de emissão de fluorescência de triptofano intrínseca (I330/I350) de pelo menos 1,11.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a proteína do isolado de BLG líquido tem um grau de desnaturação de proteína de no máximo 10% p/p.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a provisão do isolado de BLG líquido envolve isolar BLG do alimento de proteína de soro de queijo e, opcionalmente, submeter a composição enriquecida com BLG resultante a uma ou mais etapas selecionadas do grupo de: - desmineralização, - adição de minerais, - diluição, - redução microbiana física - concentração e
- ajuste de pH.
14. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o isolado de BLG líquido é submetido a redução microbiana física, que preferivelmente envolve ou até mesmo consiste em tratamento térmico.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que o isolado de BLG liquido é um isolado de BLG líquido de acordo com a reivindicação 8.
16. Uso de um pó de isolado de BLG como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou do isolado de BLG líquido como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser como um ingrediente para a produção de um produto alimentício, por exemplo, uma bebida ou um pó de bebida instantânea, com um pH na faixa de 2 a 4,7 e que adicionalmente tem um ou mais dos seguintes itens: - um nível reduzido de sensação bucal seca, - transparência melhorada e/ou - teor de proteína aumentado, preferivelmente bebidas termotratadas contendo um teor de proteína em uma quantidade de pelo menos 3 a 45% p/p, mais preferivelmente 11 a 40% p/p, ainda mais preferivelmente 15 a 38% p/p e, o mais preferivelmente, 20 a 36% p/p.
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