JP2021530976A - ベータ−ラクトグロブリン単離物を製造するためのプロセス、並びに関連する方法及び使用 - Google Patents

ベータ−ラクトグロブリン単離物を製造するためのプロセス、並びに関連する方法及び使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）単離物と並んで、かかる単離物を製造する方法、及び例えば、飲料用途での粉末の使用に関する。

Description

本発明は、新規のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）単離物と並んで、かかる単離物を製造する方法、及び例えば、飲料用途での粉末の使用に関する。
ＢＬＧは、ホエイタンパク質のゲル形成成分として知られており、低温殺菌温度でも望ましくない凝集及びゲル形成を起こしやすい傾向がある。ＢＬＧ単離物は、ＢＬＧに加えてより耐熱性の高いタンパク質であるアルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及びカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含む従来のホエイタンパク質単離物よりも熱感受性が高いと認識されている。ＢＬＧ単離物の高価格及び凍結乾燥ＢＬＧ単離物の取り扱いの課題により、ＢＬＧ単離物の工業的な食品用の使用は以前は制限されていた。
乳清又はホエイからのベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の単離は、多くの出版物の主題であり、典型的には、精製されたベータ−ラクトグロブリン製品に到達するために、複数の分離工程及び多くの場合クロマトグラフィー技術を伴う。
例えば、ｄｅ Ｊｏｎｇｈ ｅｔ ａｌ（Ｍｉｌｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｅｓ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ β−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８４（３），２００１，ｐａｇｅｓ ５６２−５７１）は、カゼインの温度酸凝固による、及び得られた酸性ホエイをアフィニティークロマトグラフィー（ＤＥＡＥセファロース）とゲル浸透クロマトグラフィーとの組み合わせに供することによる、搾乳したての牛乳からのＢＬＧの精製について記載している。得られたＢＬＧ組成物は、１ｇのタンパク質あたり０．９８５ｇのベータ−ラクトグロブリンを含むと述べられた。ＢＬＧ組成物は凍結乾燥により乾燥されたた。
Ｖｙａｓ ｅｔ ａｌ（Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ β−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８５：１６３９−１６４５，２００２）は、アフィニティークロマトグラフィーに基づいてネイティブＢＬＧを生成するためのスケールアップされた方法を開示した。ＢＬＧ組成物は凍結乾燥により乾燥されたた。
米国特許第２７９０７９０号公報Ａ１は、ｐＨ３．６〜４．０でＮａＣｌを添加してホエイからＢＬＧを単離するプロセスについて記載したが、単離したＢＬＧを乾燥させたとは記載していない。
Ｐａｌｍｅｒ（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｏｗ’ｓ Ｍｉｌｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１０４，１９３４，ｐａｇｅｓ ３５９−３７２）は、幾つか連続する不要なタンパク質の塩析、タンパク質、ｐＨ調整、及び他の不要なタンパク質を除去するための透析を使用して、酸性ホエイに基づいてタンパク質結晶を製造するための面倒で時間のかかるプロセスを報告した。最終的に、高度に精製されたＢＬＧ溶液が得られた場合に、ＢＬＧが結晶化された。このプロセスは１２日以上続き、トルエンの添加が必要であった。したがって、Ｐａｌｍｅｒに開示されている手順は、安全な食品生産と両立できず、明らかに食べられない製品を提供する。Ｐａｌｍｅｒは、ＢＬＧ結晶をアルコール及びエーテルによって乾燥できると報告した。
欧州特許０ ６０４ ６８４号Ａ１は、ホエイタンパク質製品からアルファ−ラクトアルブミン及び／又はベータ−ラクトグロブリンに富むホエイタンパク質濃縮物を回収するためのプロセスを開示した。該プロセスは、ａ）当該ホエイタンパク質生成物を含む溶液をその酸形態でカルシウム結合イオン交換樹脂と共にインキュベートして、アルファ−ラクトアルブミンの不安定化を開始すること、ｂ）当該樹脂の分離後、処理されたタンパク質生成物溶液のｐＨを４．３〜４．８の値に調整すること、ｃ）アルファ−ラクトアルブミンの凝結を促進するため１０〜５０℃の温度で当該タンパク質産物溶液をインキュベートすること、ｄ）ｐＨ４．３〜４．８の当該タンパク質産物溶液中のタンパク質を分画して、アルファ−ラクトアルブミンに富む画分及びベータ−ラクトグロブリンに富む画分を提供すること、ｅ）アルファ−ラクトアルブミンに富む画分のｐＨを十分に上げてアルファ−ラクトアルブミン画分を可溶化すること、並びにｆ）任意に、ベータ−ラクトグロブリンに富む画分のｐＨを上げてベータ−ラクトグロブリン画分を十分に中和すること、を含んでいた。
国際公開第２０１０／０３７７３６号公報Ａ１は、ホエイタンパク質の単離、並びにホエイ生成物及びホエイ単離物の調製、特に動物から得られたホエイからのベータ−ラクトグロブリン生成物の単離及びアルファ−ラクトアルブミンに富むホエイタンパク質単離物の単離を開示した。本発明によって提供されるアルファ−ラクトアルブミンに富むホエイタンパク質単離物は、ベータ−ラクトグロブリンが低いことの他に、アルファ−ラクトアルブミン及び免疫グロブリンＧも高い。
国際公開第２０１１／１１２６９５号公報（Ａ１）は、ホエイタンパク質ミセル及びロイシンを含む栄養組成物を開示した。栄養組成物は、低粘度の流体マトリックス及び許容可能な感覚受容特性を維持しながら、ヒトにおけるタンパク質合成を改善するのに十分な量のロイシンを提供する。
本発明者らは、高機能性ＢＬＧ単離粉末が、ｉ）２〜４．９、又はｉｉ）６．１〜８．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有する高ＢＬＧ、液体ＢＬＧ単離物を乾燥し、好ましくは噴霧乾燥することによって得られることを発見した。
そのため、本発明の態様は、ＢＬＧ単離粉末であって、好ましくは噴霧乾燥によって調製され、ｉ）２．５〜４．９、ｉｉ）６．１〜８．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも３０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大１０％重量／重量の量の水と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末が、
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵの熱安定性、及び
−最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、の１つ又は２つ以上を有する、ＢＬＧ単離粉末に関する。
本発明の別の態様は、液体ＢＬＧ単離物であって、ｉ）２〜４．９、ｉｉ）６．１〜８．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも１０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵの熱安定性、及び
−最大１０００コロニー形成単位／ｇ、の１つ又は２つ以上を有する、液体ＢＬＧ単離物に関する。
本発明のさらなる態様は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のＢＬＧを含む、乾燥ＢＬＧ単離粉末を製造する方法に関し、
ａ）以下を有する液体ＢＬＧ単離物、
ｉ）２〜４．９の範囲のｐＨ、
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ、又は
ｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨ、を有する液体ＢＬＧ単離物を提供する工程であって、
当該液体ＢＬＧ単離物が、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のＢＬＧを含む工程、
ｂ）任意に、当該液体ＢＬＧ分離株を物理的微生物減少に供する工程、
ｃ）噴霧乾燥により当該液体ＢＬＧ単離物を乾燥させる工程、を含む、方法に関する。
本発明のさらなる態様は、食物製品、例えば、飲料又はインスタント飲料粉末であって、２〜４．７の範囲のｐＨを有し、さらに、
−乾いた口当たりのレベルの低下、
−透明性の向上、及び／又は
−タンパク質含有量の増加、の１つ又は２つ以上を有し、好ましくは少なくとも３〜４５％重量／重量、より好ましくは１１〜４０％重量／重量、さらにより好ましくは１５〜３８％重量／重量、最も好ましくは２０〜３６％重量／重量の量のタンパク質含有量を含む熱処理飲料の製造のための原料としての、本明細書に定義されるＢＬＧ単離粉末又は液体ＢＬＧ単離物の使用に関する。
図１は、ＢＬＧ単離粉末を製造するための本発明の方法の概略図を提供する。 図２は、ホエイタンパク質フィードから開始してＢＬＧ単離粉末を製造するための本発明の方法の概略図を提供し、特許の説明で使用される用語を示している。 図３はＢＬＧ結晶の顕微鏡写真である。 図４は、ＢＬＧ結晶全体とフラグメント化されたものの両方の顕微鏡写真を示している。 図５は、噴霧乾燥されたＢＬＧ単離物が、同じ条件で乾燥された同等のＷＰＩよりも高いかさ密度を持っていることを示している。 図６は、高タンパク質液体ＢＬＧ単離物の粘度が同等のＷＰＩ溶液よりも低いことを示している。
定義
本発明の文脈では、「ベータ−ラクトグロブリン」又は「ＢＬＧ」という用語は、哺乳動物種に由来し、例えば、ネイティブの、折りたたまれていない及び／又はグリコシル化された形態であり、天然に存在する遺伝的変異体を含むベータ−ラクトグロブリンに関する。該用語はさらに、凝集性ＢＬＧ、沈殿したＢＬＧ及び結晶性ＢＬＧを含む。ＢＬＧの量に言及する場合、凝集性ＢＬＧを含むＢＬＧの合計量が言及される。ＢＬＧの総量は、例１．３１に従って決定される。「凝集性ＢＬＧ」という用語は、少なくとも部分的に折りたたまれておらず、さらに、典型的には疎水性相互作用及び／又は共有結合によって、他の変性ＢＬＧ分子及び／又は他の変性ホエイタンパク質と凝集しているＢＬＧに関する。
ＢＬＧは、ウシホエイ及び乳清で最も優勢なタンパク質であり、幾つかの遺伝的変異体に存在し、牛乳の主なものはＡ及びＢと標識されている。ＢＬＧはリポカリンタンパク質であり、多くの疎水性分子に結合することができ、それらの輸送における役割を示唆している。ＢＬＧは、シデロホアを介して鉄に結合できることも示されており、病原体と戦う役割を果たしている可能性がある。ＢＬＧのホモログはヒトの母乳に欠けている。
ウシＢＬＧは、およそ１６２アミノ酸残基の比較的小さなタンパク質で、分子量はおよそ１８．３〜１８．４ｋＤａである。生理学的条件下では、ウシＢＬＧは主に二量体であるが、核磁気共鳴分光法を使用して決定されるように、そのネイティブ状態を保持しながら、約ｐＨ３未満の単量体に解離する。逆に、ＢＬＧはまた、様々な自然条件下で、四量体、八量体、及びその他の多量体の凝集形態でも発生する。
本発明の文脈では、「非凝集性ベータ−ラクトグロブリン」又は「非凝集性ＢＬＧ」という用語は、哺乳動物種に由来し、例えば、ネイティブの、折りたたまれていない及び／又はグリコシル化された形態であり、天然に存在する遺伝的変異体を含むベータ−ラクトグロブリンに関する。しかしながら、該用語には、凝集性ＢＬＧ、沈殿したＢＬＧ、又は結晶化ＢＬＧは含まれない。非凝集性ＢＬＧの量又は濃度は、例１．６に従って決定される。
総ＢＬＧに対する非凝集性ＢＬＧのパーセンテージは、計算（ｍ総ＢＬＧ−ｍ非凝集性ＢＬＧ）／ｍ総ＢＬＧ＊１００％によって決定される。ｍ総ＢＬＧは、例１．３１に従って決定されるＢＬＧの濃度又は量であり、ｍ非凝集性ＢＬＧは、例１．６に従って決定される非凝集性ＢＬＧの濃度又は量である。
本発明の文脈では、「結晶」という用語は、その構成要素（原子、分子、又はイオン等）が高度に秩序化された微視的構造に配置され、全ての方向に延びる結晶格子を形成する固体材料に関する。
本発明の文脈では、「ＢＬＧ結晶」という用語は、高度に秩序化された微視的構造に配置され、全ての方向に延びる結晶格子を形成する、主に非凝集性の好ましくはネイティブのＢＬＧを含むタンパク質結晶に関する。ＢＬＧ結晶は、例えば、モノリシック又は多結晶であり、例えば無傷の結晶、結晶のフラグメント、又はそれらの組み合わせである。結晶のフラグメントは、例えば、無傷の結晶が加工中に機械的剪断に供される場合に形成される。結晶のフラグメントはまた、結晶の高度に秩序化された微視的構造を有するが、無傷の結晶の均一な表面及び／又は均一な端若しくは角を欠いている場合がある。例えば、多くの無傷のＢＬＧ結晶の例については図３、ＢＬＧ結晶のフラグメントの例については図４を参照されたい。いずれの場合も、ＢＬＧ結晶又は結晶フラグメントは、光学顕微鏡を使用して、明確に定義されたコンパクトでコヒーレントな構造として視覚的に識別できる。ＢＬＧ結晶又は結晶フラグメントは、多くの場合、少なくとも部分的に透明である。タンパク質結晶はさらに複屈折性であることが知られており、この光学特性を使用して、結晶構造を有する未知の粒子を識別することができる。一方、非結晶性ＢＬＧ凝集物は、定義が不十分で不透明であり、不規則なサイズの開口した又は多孔性の塊として現れることがよくある。
本発明の文脈では、「結晶化」という用語は、タンパク質結晶の形成に関する。結晶化は、例えば、自発的に発生するか、結晶化シードの添加によって開始される。
「母液」
本発明の文脈では、「母液」という用語は、ＢＬＧが結晶化され、ＢＬＧ結晶が少なくとも部分的に除去された後に残るホエイタンパク質溶液に関する。母液にはまだ幾つかのＢＬＧ結晶が含まれている可能性があるが、通常は分離を免れた小さなＢＬＧ結晶のみが含まれている。
本発明の文脈では、「食用組成物」という用語はヒトの消費及び食品原料としての使用に安全であり、トルエン又は他の望ましくない有機溶媒等の問題のある量の有毒な成分を含まない組成物に関する。
本発明の文脈では、「ＡＬＡ」又は「アルファ−ラクトアルブミン」は、哺乳動物種に由来し、例えば、ネイティブ及び／又はグリコシル化された形態であり、天然に存在する遺伝的変異体を含むアルファ−ラクトアルブミンに関する。該用語はさらに、凝集性ＡＬＡ及び沈殿したＢＬＧを含む。ＡＬＡの量に言及する場合、例えば、凝集性ＡＬＡを含むＡＬＡの合計量が言及される。ＡＬＡの総量は、例１．３１に従って決定される。「凝集性ＡＬＡ」という用語は、典型的には少なくとも部分的に折りたたまれておらず、さらに、典型的には疎水性相互作用及び／又は共有結合によって、他の変性ＡＬＡ分子及び／又は他の変性ホエイタンパク質と凝集しているＡＬＡに関する。
アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）は、ほとんど全ての哺乳動物種の乳に含まれるタンパク質である。ＡＬＡはラクトースシンターゼ（ＬＳ）ヘテロダイマーの調節サブユニットを形成し、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ベータ４Ｇａｌ−Ｔ１）は触媒成分を形成する。一緒に、これらのタンパク質は、ＬＳがガラクトース部分をグルコースに転移することによってラクトースを生成することを可能にする。ベータ−ラクトグロブリンとの主な構造上の違いの１つは、ＡＬＡには共有結合性凝集反応の開始点として機能できる遊離チオール基がないことである。
本発明の文脈では、「非凝集性ＡＬＡ」もまた、哺乳動物種に由来し、例えば、ネイティブの、折りたたまれていない及び／又はグリコシル化された形態であり、天然に存在する遺伝的変異体を含むＡＬＡに関する。しかしながら、該用語には、凝集性ＡＬＡ又は沈殿したＡＬＡは含まれない。非凝集性ＢＬＧの量又は濃度は、例１．６に従って決定される。
総ＡＬＡに対する非凝集性ＡＬＡのパーセンテージは、計算（ｍ総ＡＬＡ−ｍ非凝集性ＡＬＡ）／ｍ総ＡＬＡ＊１００％によって決定される。ｍ総ＡＬＡは、例１．３１に従って決定されるＡＬＡの濃度又は量であり、ｍ非凝集性ＡＬＡは、例１．６に従って決定される非凝集性ＡＬＡの濃度又は量である。
本発明の文脈では、「カゼイノマクロペプチド」又は「ＣＭＰ」という用語は、例えば、ネイティブ及び／又はグリコシル化された形態であり、アスパラギン酸プロテイナーゼによる天然に存在する遺伝的変異体、例えばキモシを含む、哺乳動物種からの「κ−ＣＮ」又は「カッパーカゼイン」の加水分解に由来する親水性ペプチド、残基１０６〜１６９に関する。
本発明の文脈では、「ＢＬＧ単離物」という用語は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量でＢＬＧを含む組成物を意味する。ＢＬＧ単離物は、好ましくは、全固形分に対して少なくとも３０％重量／重量、好ましくは少なくとも８０％重量／重量の総タンパク質含有量を有する。
本発明の文脈では、「ＢＬＧ単離粉末」という用語は、粉末形態のＢＬＧ単離物、好ましくは自由流動性粉末に関する。
本発明の文脈では、「ＢＬＧ分離液」という用語は、液体形態、好ましくは水性液体のＢＬＧ単離物に関する。
「ホエイ」という用語は、乳のカゼインが沈殿して除去された後に残る液相に関する。カゼインの沈殿は、例えば乳の酸性化及び／又はレンネット酵素の使用によって達成され得る。カゼインのレンネットベースの沈殿によって生成されるホエイ製品である「スイートホエイ」と、カゼインの酸ベースの沈殿によって生成されるホエイ製品である「酸ホエイ」又は「サワーホエイ」等、幾つかのタイプのホエイが存在する。カゼインの酸ベースの沈殿は、例えば、食用酸の添加又は細菌培養によって達成され得る。
「乳清」という用語は、例えば、精密濾過又は大孔径限外濾過によってカゼイン及び乳脂肪球が乳から除去されたときに残る液体に関する。乳清は、「理想的なホエイ」と称されることもある。
「乳清タンパク質」又は「血清タンパク質」という用語は、乳清中に存在するタンパク質に関する。
本発明の文脈では、「ホエイタンパク質」という用語は、ホエイ又は乳清中に見られるタンパク質に関する。ホエイタンパク質は、ホエイ又は乳清に見られるタンパク質種のサブセットである場合、またさらには単一のホエイタンパク質種の場合もあり、又はホエイ又は／及び乳清に見られるタンパク質種の完全なセットである場合がある。
本発明の文脈では、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物の主要な非ＢＬＧタンパク質は、ＡＬＡ、ＣＭＰ、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、オステオポンチン、ラクトフェリン、及びラクトペルオキシダーゼである。本発明の文脈では、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物の主要な非ＢＬＧホエイタンパク質の重量パーセントは、以下のとおりである：
総タンパク質に対して１８％重量／重量の量のＡＬＡ、
総タンパク質に対して１８％重量／重量の量のＣＭＰ、
総タンパク質に対して４％重量／重量の量のＢＳＡ、
総タンパク質に対して５％重量／重量の量のカゼイン種、
総タンパク質に対して６％重量／重量の量の免疫グロブリン、
総タンパク質に対して０．５％重量／重量の量のオステオポンチン、
総タンパク質に対して０．１％重量／重量の量のラクトフェリン、及び
総タンパク質に対して０．１％重量／重量の量のラクトペルオキシダーゼ。
カゼインという用語は、乳に含まれるカゼインタンパク質に関し、個々のカゼイン種である生乳に見られるネイティブミセルカゼインとカゼインの両方を含む。
本発明の文脈では、「過飽和」又は「ＢＬＧに関して過飽和」である液体は、所与の物理的及び化学的条件で液体中の非凝集性ＢＬＧの飽和点を超える溶解した非凝集性ＢＬＧの濃度を含む。「過飽和」という用語は、結晶化の分野でよく知られており（例えば、Ｇｅｒａｒｄ Ｃｏｑｕｅｒｅｌａ，”Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｐｈａｓｅ ｄｉａｇｒａｍｓ，ｓｕｐｅｒｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂａｓｉｃ ｃｏｎｃｅｐｔｓ”，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｐ．２２８６−２３００，Ｉｓｓｕｅ ７，２０１４を参照されたい）、過飽和は、様々な測定手法（例えば、分光法又は粒子径分析）によって決定され得る。本発明の文脈では、ＢＬＧに関する過飽和を、以下の手順によって決定する。
特定の条件設定の液体がＢＬＧに関して過飽和であるかどうかを試験する手順：
ａ）試験する液体のサンプル５０ｍｌを、高さ１１５ｍｍ、内径２５ｍｍ、容量５０ｍＬの遠心管（ＶＷＲカタログ番号５２５−０４０２）に移す。工程ａ）〜ｈ）の間、サンプル及び後続する画分を液体の元の物理的及び化学的条件に保つように注意する必要がある：
ｂ）サンプルを直ちに３０００ｇで３．０分間、最大３０秒の加速及び最大３０秒の減速で遠心分離する。
ｃ）遠心分離の直後に、上清をできるだけ多く（ペレットが形成された場合にペレットを乱さずに）第２の遠心管（工程ａと同じタイプ）に移す。
ｄ）上清の０．０５ｍＬサブサンプルを採取する（サブサンプルＡ）
ｅ）粒子径が最大２００ミクロンのＢＬＧ結晶１０ｍｇ（全固形分に対して少なくとも９８％純粋、非凝集性ＢＬＧ）を第２の遠心管に加え、混合物を攪拌する。
ｆ）第２の遠心管を元の温度で６０分間放置する。
ｇ）工程ｆ）の直後に、第２の遠心管を５００ｇで１０分間遠心分離し、上清の別の０．０５ｍｌサブサンプル（サブサンプルＢ）を採取する。
ｈ）工程ｇ）の遠心分離ペレットを回収し、存在する場合は、ｍｉｌｌｉＱ水に再懸濁し、顕微鏡で見える結晶の存在について懸濁液を直ちに検査する。
ｉ）例１．６に概説されている方法を使用して、サブサンプルＡ及びＢの非凝集性ＢＬＧの濃度を決定する。結果を、サブサンプルの総重量に対する％ＢＬＧ重量／重量として表す。サブサンプルＡの非凝集性ＢＬＧの濃度はＣＢＬＧ，Ａと称され、サブサンプルＢの非凝集性ＢＬＧの濃度はＣＢＬＧ，Ｂと称される。
ｊ）工程ａ）のサンプルを採取した液体は、ＣＢＬＧ，ＢがＣＢＬＧ，Ａよりも低く、且つ工程ｉ）で結晶が観察された場合、（特定の条件で）過飽和であった。
本発明の文脈では、「液体」及び「溶液」という用語は、例えば、タンパク質結晶又は他のタンパク質粒子等の粒子状物質を含まない組成物と、液体及び固体及び／又は半固体粒子の組み合わせを含む組成物の両方を包含する。したがって、「液体」又は「溶液」は、懸濁液さらにはスラリーであってもよい。しかしながら、「液体」及び「溶液」は、好ましくはポンプ輸送可能である。
本発明の文脈では、「ホエイタンパク質濃縮物」（ＷＰＣ）及び「血清タンパク質濃縮物」（ＳＰＣ）という用語は、全固形分に対してタンパク質の総量が２０〜８９％重量／重量である乾燥又は水性組成物に関係する。
ＷＰＣ又はＳＰＣには、以下が含まれていることが望ましい：
全固形分に対して２０〜８９％重量／重量のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜７０％重量／重量のＢＬＧ、
総タンパク質に対して８〜５０％重量／重量のＡＬＡ、及び
タンパク質に対して０〜４０％重量／重量のＣＭＰ。
或いは、しかしまた好ましいことに、ＷＰＣ又はＳＰＣは以下を含み得る：
全固形分に対して２０〜８９％重量／重量のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜９０％重量／重量のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜５０％重量／重量のＡＬＡ、及び
タンパク質に対して０〜４０％重量／重量のＣＭＰ。
好ましくは、ＷＰＣ又はＳＰＣは以下を含む：
全固形分に対して２０〜８９％重量／重量のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜８０％重量／重量のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜５０％重量／重量のＡＬＡ、及び
タンパク質に対して０〜４０％重量／重量のＣＭＰ。
より好ましくは、ＷＰＣ又はＳＰＣは以下を含む：
全固形分に対して７０〜８９％重量／重量のタンパク質、
総タンパク質に対して３０〜９０％重量／重量のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜３５％重量／重量のＡＬＡ、及び
タンパク質と比較して０〜２５％重量／重量のＣＭＰ。
ＳＰＣには典型的には、ＣＭＰが含まれていないか、微量のＣＭＰのみが含まれている。
「ホエイタンパク質単離物」（ＷＰＩ）及び「血清タンパク質単離物」（ＳＰＩ）という用語は、全固形分に対して９０〜１００％重量／重量のタンパク質の総量を含む乾燥又は水性組成物に関係する。
ＷＰＩ又はＳＰＩには、以下が含まれていることが望ましい：
全固形分に対して９０〜１００％重量／重量のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜７０％重量／重量のＢＬＧ、
総タンパク質に対して８〜５０％重量／重量のＡＬＡ、及び
総タンパク質に対して０〜４０％重量／重量のＣＭＰ。
或いは、しかしまた好ましいことに、ＷＰＩ又はＳＰＩは以下を含み得る：
全固形分に対して９０〜１００％重量／重量のタンパク質、
総タンパク質に対して３０〜９５％重量／重量のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜３５％重量／重量のＡＬＡ、及び
総タンパク質に対して０〜２５％重量／重量のＣＭＰ。
より好ましくは、ＷＰＩ又はＳＰＩは以下を含み得る：
全固形分に対して９０〜１００％重量／重量のタンパク質、
総タンパク質に対して３０〜９０％重量／重量のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜３５％重量／重量のＡＬＡ、及び
総タンパク質に対して０〜２５％重量／重量のＣＭＰ。
ＳＰＩには典型的には、ＣＭＰが含まれていないか、微量のＣＭＰのみが含まれている。
本発明の文脈では、「追加のタンパク質」という用語は、ＢＬＧではないタンパク質を意味する。ホエイタンパク質溶液に存在する追加のタンパク質は、典型的には、乳清又はホエイに見られる非ＢＬＧタンパク質の１つ又は２つ以上を含む。かかるタンパク質の非限定的な例は、アルファ−ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）、オステオポンチン、ラクトフェリン、及び乳脂肪球膜タンパク質である。
「本質的にからなる」及び「本質的にからなっている」という用語は、問題の請求項又は特徴が、特定の材料又は工程、及び特許請求の範囲に記載された発明の基本的及び新規の特性（複数の場合がある）に実質的に影響を与えないものを包含することを意味する。
本発明の文脈では、「Ｙ及び／又はＸ」という句は、「Ｙ」又は「Ｘ」又は「Ｙ及びＸ」を意味する。同じ論理に沿って、「ｎ１、ｎ２、…、ｎｉ−１、及び／又はｎｉ」という句は、「ｎ１」又は「ｎ２」又は…又は「ｎｉ−１」若しくは「ｎｉ」、又は成分の任意の組み合わせ：ｎ１、ｎ２、…ｎｉ−１、及びｎｉを意味する。
本発明の文脈では、「乾燥する」又は「乾燥した」という用語は、問題の組成物又は生成物が、最大１０％重量／重量の水、好ましくは最大６％重量／重量、より好ましくはさらに少ない水を含むことを意味する。
本発明の文脈では、「物理的微生物減少」という用語は、組成物の生存可能な微生物の総量の減少をもたらす組成物との物理的相互作用に関する。該用語は、微生物を死滅させる結果となる化学物質の添加を含まない。該用語はさらに、噴霧乾燥中に噴霧された液滴がさらされる熱曝露を含まないが、噴霧乾燥前の可能な予熱を含む。
本発明の文脈では、粉末のｐＨは、９０ｇの脱塩水に混合した１０ｇの粉末のｐＨを指し、例１．１６に従って測定される。
本発明の文脈では、特定の組成物の成分、製品、又は材料の重量パーセント（％重量／重量）は、別の基準が具体的に言及されていない限り（例えば、全固形分又は総タンパク質）、特定の組成物、製品、又は材料の重量に対するその成分の重量パーセントを意味する。
本発明の文脈では、プロセスの工程である「濃縮」及び動詞「濃縮する」は、タンパク質の濃度に関するものであり、全固形分ベースのタンパク質の濃度及び総重量ベースのタンパク質の濃度の両方を包含する。これは、例えばその濃度は、タンパク質の含有量が全固形分に対して増加する限り、組成物のタンパク質の絶対濃度重量／重量が増加することを必ずしも必要としない。
本発明の文脈では、成分Ｘと成分Ｙとの間の「重量比」という用語は、計算ｍＸ／ｍＹによって得られる値を意味し、式中、ｍＸは、成分Ｘの量（重量）であり、ｍＹは、成分Ｙの量（重量）である。
本発明の文脈では、「少なくとも低温殺菌」という用語は、７０℃で１０秒間の熱処理以上の微生物死滅効果を有する熱処理に関する。殺菌効果を決定するための基準は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７である。
本発明の文脈では、「ホエイタンパク質フィード」という用語は、液体ＢＬＧ単離物が由来するホエイタンパク質源に関する。ホエイタンパク質フィードは、液体ＢＬＧ単離物よりも総タンパク質に比べてＢＬＧの含有量が少なく、典型的にはＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣ、又はＳＰＩである。
本発明の文脈では、「ＢＬＧ濃縮組成物」という用語は、ホエイタンパク質フィードからＢＬＧを単離することから生じるＢＬＧ濃縮組成物に関する。ＢＬＧ濃縮組成物は、典型的には、ホエイタンパク質フィードと同じホエイタンパク質を含むが、ＢＬＧは、ホエイタンパク質フィードよりも総タンパク質に対して有意に高い濃度で存在する。ＢＬＧ濃縮組成物は、例えば、クロマトグラフィー、タンパク質結晶化及び／又は膜ベースのタンパク質分画によってホエイタンパク質フィードから調製される。ＢＬＧ濃縮組成物は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量の量のＢＬＧを含む。場合によっては、ＢＬＧ濃縮組成物を液体ＢＬＧ単離物として直接使用することができる。ただし、ＢＬＧが豊富な組成物を液体ＢＬＧ単離物に変換するには、多くの場合、追加の処理が必要である。
本発明の文脈では、「ホエイタンパク質溶液」という用語は、塩溶様式でＢＬＧに関して過飽和であり、ＢＬＧ結晶を調製するのに有用である特殊な水性ホエイタンパク質組成物を説明するために使用される。
本発明の文脈では、「滅菌」という用語は、問題の滅菌組成物、又は製品が生存可能な微生物を含まず、したがって、室温での貯蔵中に微生物の増殖がないことを意味する。滅菌された組成物は無菌である。
飲料調製物等の液体を滅菌し、滅菌容器に無菌的に包装する場合、典型的には、室温で少なくとも６ヵ月の貯蔵寿命がある。滅菌処理は、液体の腐敗を引き起こす可能性のある胞子及び微生物を死滅させる。
本発明の文脈では、「タンパク質画分」という用語は、問題の組成物のタンパク質、例えば、タンパク質の粉末又は飲料製剤のタンパク質に関する。
本発明の文脈では、「乾いた口当たり」という用語は、口の中の感触に関し、口及び歯の乾燥しているように感じ、唾液生成が最小限に抑えられる。
したがって、乾いた口当たりは、それ自体が味ではなく、口の中での物理的な口当たり及び時間依存性の感覚である。
本発明の文脈では、本明細書で使用される「ミネラル」という用語は、別段の指定がない限り、主要なミネラル、微量又は少数のミネラル、他のミネラル、及びそれらの組み合わせのいずれか１つを指す。主なミネラルとしては、カルシウム、リン、カリウム、硫黄、ナトリウム、塩素、マグネシウムが挙げられる。微量又は少数のミネラルとしては、鉄、コバルト、銅、亜鉛、モリブデン、ヨウ素、セレン、マンガンが挙げられ、その他のミネラルとしては、クロム、フッ素、ホウ素、リチウム、及びストロンチウムが挙げられる。
本発明の文脈では、本明細書で使用される「脂質」、「脂肪」、及び「油」という用語は、別段の指定がない限り、植物若しくは動物に由来するか、又はそれらから加工される脂質材料を指すために同じ意味で使用される。これらの用語には、合成脂質材料がヒトの消費に適している限り、そのような合成脂質材料も含まれる。
本発明の文脈では、「透明」という用語は、視覚的に透明な外観を有し、光を通し、それを通して明瞭な画像が現れる飲料調製物を包含する。透明な飲料の濁度は最大２００ＮＴＵである。
本発明の文脈では、「不透明」という用語は、目に見えて不明瞭な外観を有する飲料調製物を包含し、それは２００ＮＴＵを超える濁度を有する。
本発明の一態様は、好ましくは噴霧乾燥によって調製され、ｉ）２〜４．９、ｉｉ）６．１〜８．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも３０％重量／重量の量の総タンパク質、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のＢＬＧ、及び
−最大１０％重量／重量の量の水、を含む、ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）単離粉末に関する。
ＢＬＧ単離粉末は、好ましくは、以下の１つ又は２つ以上を有する：
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵの熱安定性、及び
−最大１０００コロニー形成単位／ｇ。
ＢＬＧ単離粉末は、好ましくは食用組成物である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、２〜４．９の範囲のｐＨを有する。かかる粉末は、酸性食物製品、特に酸性飲料に特に有用である。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、６．１〜８．５の範囲のｐＨを有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、少なくとも４０％重量／重量、好ましくは少なくとも５０％重量／重量、少なくとも６０％重量／重量、より好ましくは少なくとも７０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも８０％重量／重量の量の総タンパク質を含む。
さらに高いタンパク質含有量が必要とされる場合があり、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、少なくとも９２％重量／重量、より好ましくは少なくとも９４％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９５％重量／重量の量の総タンパク質を含む。
総タンパク質は、例１．５に従って測定される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、総タンパク質に対して、少なくとも９６％重量／重量、好ましくは少なくとも９６．５％重量／重量、より好ましくは少なくとも９７％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９８％の量のＢＬＧ、最も好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９９．５％重量／重量の量のＢＬＧを含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、総タンパク質に対して、少なくとも９７．５％重量／重量、好ましくは少なくとも９８．０％重量／重量、より好ましくは少なくとも９８．５％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９９．０％の量のＢＬＧ、最も好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９９．７％重量／重量、例えば総タンパク質に対しておよそ１００．０％等の量のＢＬＧを含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及びカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）の合計は、粉末の非ＢＬＧタンパク質の少なくとも４０％重量／重量、好ましくは、粉末の非ＢＬＧタンパク質の少なくとも６０％重量／重量、より好ましくは少なくとも７０％重量／重量、最も好ましくは少なくとも９０％重量／重量を構成する。
本発明の他の好ましい実施形態では、各主要な非ＢＬＧホエイタンパク質は、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージで最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。
さらに低い濃度の主要な非ＢＬＧホエイタンパク質が望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、各主要な非ＢＬＧホエイタンパク質は、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージで最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＡＬＡは、ＢＬＧ単離粉末の非ＢＬＧタンパク質の最大８０％重量／重量、好ましくはＢＬＧ単離粉末の非ＢＬＧタンパク質の最大６０％重量／重量、さらにより好ましくは最大４０％重量／重量、及び最も好ましくは最大３０％重量／重量を構成する。
さらに低いＡＬＡ含有量が好ましい場合があり、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＡＬＡは、ＢＬＧ単離粉末の非ＢＬＧタンパク質の最大２０％重量／重量、好ましくはＢＬＧ単離粉末の非ＢＬＧタンパク質の最大１５％重量／重量、さらにより好ましくは最大１０％重量／重量、及び最も好ましくは最大５％重量／重量を構成する。
本発明者らは、ラクトフェリン及び／又はラクトペルオキシダーゼの還元が、無彩色の（ｃｏｌｏｕｒ−ｎｅｕｔｒａｌ）ホエイタンパク質生成物を得るのに特に有利であるという徴候を見てきた。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ラクトフェリンは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。さらに低濃度のラクトフェリンが望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、ラクトフェリンは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
同様に、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ラクトペルオキシダーゼは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。さらに低濃度のラクトペルオキシダーゼが望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、ラクトペルオキシダーゼは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
ラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼは、例１．２９に従って定量化される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大１０％重量／重量、好ましくは最大７％重量／重量、より好ましくは最大６％重量／重量、さらにより好ましくは最大４％重量／重量の量の含水量を有し、最も好ましいのは最大２％重量／重量である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大６０％重量／重量、好ましくは最大５０％重量／重量、より好ましくは最大２０％重量／重量、さらにより好ましくは最大１０％重量／重量、さらにより好ましくは最大１％重量／重量、最も好ましくは最大０．１％の量の炭水化物を含む。例えば、ＢＬＧ単離粉末は、例えば、ラクトース、オリゴ糖、及び／又はラクトースの加水分解生成物（すなわち、グルコース及びガラクトース）、スクロース、及び／又はマルトデキストリン等の炭水化物を含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大１０％重量／重量、好ましくは最大５％重量／重量、より好ましくは最大２％重量／重量、さらにより好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質を含む。
脂質の量は、ＩＳＯ １２１１：２０１０（脂肪含有量の決定−Ｒｏｓｅ−Ｇｏｔｔｌｉｅｂ重量分析法）に従って決定される。
本発明者らは、ＢＬＧ単離粉末の一部の所望の特性に達するようにミネラル含量を制御することが有利となり得ることを見出した。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大１０ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、ＢＬＧ単離粉末のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大４ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大２ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大１ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、ＢＬＧ単離粉末のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大０．６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大０．４ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大０．２ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、最も好ましくは最大０．１ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大５ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、ＢＬＧ単離粉末のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大３ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大１．０ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大０．５ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大０．３ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、ＢＬＧ単離粉末のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大０．２ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大０．１ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大０．０３ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、最も好ましくは最大０．０１ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明者らは、腎臓病の患者に特に有用な低リン／低カリウム変異体のＢＬＧ単離粉末を作製することが可能であることを見出した。かかる製品を製造するには、ＢＬＧ単離粉末のリン及びカリウムの含有量が等しく低くなければならない。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大１００ｍｇのリンの総リン含有量を有する。好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大８０ｍｇのリンの総含有量を有する。より好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大５０ｍｇのリンの総含有量を有する。さらにより好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大２０ｍｇのリンの総リン含有量を有する。ＢＬＧ単離粉末のリンの総含有量は、タンパク質１００ｇあたり最大５ｍｇである。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大６００ｍｇのカリウムを含む。より好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大５００ｍｇのカリウムを含む。より好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大４００ｍｇのカリウムを含む。より好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大３００ｍｇのカリウムを含む。さらにより好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大２００ｍｇのカリウムで粉末を単離する。さらにより好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、タンパク質１００ｇあたり最大１００ｍｇのカリウムを含む。さらにより好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、１００ｇタンパク質あたり最大５０ｍｇのカリウムを含み、さらにより好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、１００ｇタンパク質あたり最大１０ｍｇのカリウムを含む。
リンの含有量は、問題の組成物の元素リンの総量に関し、例１．１９に従って決定される。同様に、カリウムの含有量は、問題の組成物の元素カリウムの総量に関し、例１．１９に従って決定される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大リン１００ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム７００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、好ましくは最大リン８０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム６００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、より好ましくは最大リン６０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム５００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、より好ましくは最大リン５０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大４００ｍｇカリウム／タンパク質１００ｇ、又はより好ましくは最大リン２０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム２００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、又はさらにより好ましくは最大リン１０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム５０ｍｇ／１００ｇのタンパク質を含む。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）１００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、及び最大カリウム３４０ｍｇ／タンパク質１００ｇを含む。
本発明による低リン及び／又は低カリウム組成物は、腎機能が低下している患者群用の食物製品を製造するための食品原料として使用することができる。
本発明者らは、幾つかの用途について、例えば、酸性食物製品、特に酸性飲料の場合、ｐＨが最大４．９、さらにより好ましくは最大４．３の酸性ＢＬＧ単離粉末を有することが特に有利であることを見出した。これは、高タンパクで透明な酸性飲料に特に当てはまる。
本発明の文脈では、透明な液体は、例１．７に従って測定された最大２００ＮＴＵの濁度を有する。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、２〜４．９の範囲のｐＨを有する。好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０、最も好ましくは３．４〜３．９の範囲のｐＨを有する。或いは、しかしまた好ましいことに、ＢＬＧ単離粉末は、３．６〜４．３の範囲のｐＨを有し得る。
本発明者らは、幾つかの用途について、例えば、ｐＨ中性の食物製品、特にｐＨ中性の飲料では、ｐＨ中性のＢＬＧ単離粉末を使用することが特に有利であることを見出した。これは、高タンパク質で、透明又は不透明のｐＨ中性飲料に特に当てはまる。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、６．１〜８．５の範囲のｐＨを有する。好ましくは、粉末は、６．１〜８．５、より好ましくは６．２〜８．０、さらにより好ましくは６．３〜７．７、最も好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、５．０〜６．０の範囲のｐＨを有する。好ましくは、粉末は、５．１〜５．９、より好ましくは５．２〜５．８、さらにより好ましくは５．３〜５．７、及び最も好ましくは５．４〜５．６の範囲のｐＨを有する。
有利には、本発明のＢＬＧ単離粉末は、少なくとも０．２０ｇ／ｃｍ３、好ましくは少なくとも０．３０ｇ／ｃｍ３、より好ましくは少なくとも０．４０ｇ／ｃｍ３、さらにより好ましくは少なくとも０．４５ｇ／ｃｍ３、より好ましくは少なくとも０．５０ｇ／ｃｍ３、最も好ましくは少なくとも０．６ｇ／ｃｍ３のかさ密度を有し得る。
凍結乾燥したＢＬＧ単離物等の低密度粉末はふわふわしており、使用中に製造現場の空気中に容易に引き込まれる。これは、凍結乾燥粉末が他の食料製品に対する相互汚染のリスクを高め、ほこりの多い環境が衛生上の問題の原因であることが知られていることから、問題がある。極端な場合、ほこりの多い環境では粉塵爆発のリスクも高まる。
本発明の高密度変形物は、取り扱いがより容易であり、周囲の空気に流れ込みにくい。
本発明の高密度変異体の追加の利点は、それらが輸送中に占めるスペースが少なく、それにより、１つの体積単位で輸送することができるＢＬＧ単離粉末の重量を増加させることである。
しかしながら、本発明の高密度変異体の利点は、それらが他の粉末食物製品の原料、例えば、粉砂糖（かさ密度およそ０．５６ｇ／ｃｍ３）、グラニュー糖（かさ密度およそ０．７１ｇ／ｃｍ３）、クエン酸粉末（かさ密度およそ０．７７ｇ／ｃｍ３）等との粉末混合物で使用される場合、それらが分離しにくいことである。
本発明のＢＬＧ単離粉末は、例えば、かさ密度が０．２〜１．０ｇ／ｃｍ３の範囲、好ましくは０．３０〜０．９ｇ／ｃｍ３の範囲、より好ましくは０．４０〜０．８ｇ／ｃｍ３の範囲、さらにより好ましくは０．４５〜０．７５ｇ／ｃｍ３、さらにより好ましくは０．５０〜０．７５ｇ／ｃｍ３の範囲、最も好ましくは０．６〜０．７５ｇ／ｃｍ３の範囲の範囲を有し得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、０．４５〜１．２ｇ／ｃｍ３の範囲、好ましくは０．４６〜１．０ｇ／ｃｍ３の範囲、より好ましくは０．４７〜０．８ｇ／ｃｍ３の範囲、さらにより好ましくは、０．４８〜０．７５ｇ／ｃｍ３の範囲であり、さらにより好ましくは、０．４８〜０．６ｇ／ｃｍ３の範囲、最も好ましくは、０．５０〜０．６ｇ／ｃｍ３の範囲のかさ密度を有する。
粉末のかさ密度は、例１．１７に従って測定される。
本発明者らは、ＢＬＧのネイティブの立体構造を維持することが有利であることを見出し、ＢＬＧが酸性飲料に使用される場合、ＢＬＧのアンフォールディングの増加が乾いた口当たりのレベルの増加をもたらすという徴候を見てきた。
固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）は、ＢＬＧのアンフォールディングの程度の尺度であり、本発明者らは、ＢＬＧのアンフォールディングが低いか全くないことと相関する高い固有トリプトファン蛍光発光比では、乾いた口当たりが少ないと観察されたことを見出した。固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）は、例１．１に従って測定される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、少なくとも１．１２、好ましくは少なくとも１．１３、より好ましくは少なくとも１．１５、さらにより好ましくは少なくとも１．１７、及び最も好ましくは少なくとも１．１９の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する。
ＢＬＧ単離粉末にかなりの量の非タンパク質物質が含まれている場合は、固有トリプトファン蛍光発光比を測定する前にタンパク質画分を単離することが好ましい。そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末のタンパク質画分は、少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末のタンパク質画分は、少なくとも１．１２、好ましくは少なくとも１．１３、より好ましくは少なくとも１．１５、さらにより好ましくは少なくとも１．１７、及び最も好ましくは少なくとも１．１９の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する。
例えば、ＢＬＧ単離粉末を脱塩水に溶解し、タンパク質を保持するフィルターを使用して溶液を透析又は限外濾過ベースの透析に供することにより、ＢＬＧ単離粉末からタンパク質画分を分離する。ＢＬＧ単離粉末が干渉レベルの脂質を含む場合、かかる脂質は、例えば、精密濾過によって除去される。精密濾過と限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程を組み合わせて、タンパク質画分から脂質と小分子の両方を除去することができる。
ＢＬＧ単離粉末のかなりの量のＢＬＧが非凝集性ＢＬＧであることがしばしば好ましい。好ましくはＢＬＧの少なくとも５０％は、非凝集性ＢＬＧである。より好ましくは、ＢＬＧの少なくとも少なくとも８０％は、非凝集性ＢＬＧである。ＢＬＧの少なくとも９０％が非凝集性ＢＬＧであることがさらに好ましい。ＢＬＧの少なくとも９５％が非凝集性ＢＬＧであことが最も好ましい。ＢＬＧ単離粉末のＢＬＧのおよそ１００％が非凝集性ＢＬＧであることがさらにより好ましい。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、さらにより好ましくは最大３％、さらにより好ましくは最大１％、及び最も好ましくは最大０．２％のタンパク質変性度を有する。
しかしながら、例えば、不透明な飲料が必要な場合のように、ＢＬＧ単離粉末が有意なレベルのタンパク質変性を有することもまた好ましい場合がある。したがって、本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、少なくとも１１％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％のタンパク質変性度を有する。
ＢＬＧ単離粉末がかなりのレベルのタンパク質変性を有する場合、低レベルの不溶性タンパク質物質、すなわち、貯蔵中に飲料に沈殿する沈殿タンパク質物質を維持することがしばしば好ましい。不溶性物質のレベルは、例１．１０に従って測定される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大２０％重量／重量の不溶性タンパク質物質、好ましくは最大１０％重量／重量の不溶性タンパク質物質、より好ましくは最大５％重量／重量の不溶性タンパク質物質を含み、さらに好ましいのは最大３％重量／重量の不溶性タンパク質物質、最も好ましいのは最大１％重量／重量の不溶性タンパク質物質を含むことである。ＢＬＧ単離粉末が不溶性タンパク質物質を全く含まないことがさらに好ましい場合がある。
本発明者らは、ＢＬＧ単離粉末のｐＨ３．９での熱安定性が、透明な高タンパク質飲料に対するその有用性の良好な指標であることを見出した。ｐＨ３．９での熱安定性は、例１．２に従って測定される。
ＢＬＧ単離粉末が、ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵ、好ましくは最大１００ＮＴＵ、より好ましくは最大６０ＮＴＵ、さらにより好ましい最大４０ＮＴＵの熱安定性を有し、最も好ましいのは最大２０ＮＴＵである。さらにより良好な熱安定性が可能であり、ＢＬＧ単離粉末は、好ましくは、ｐＨ３．９で最大１０ＮＴＵ、好ましくは最大８ＮＴＵ、より好ましくは最大４ＮＴＵの熱安定性を有し、さらにより好ましいのは最大２ＮＴＵである。
ＢＬＧ単離粉末の微生物の含有量は、好ましくは最小限に保たれる。しかしながら、微生物減少プロセスはタンパク質のアンフォールディング及び変性につながる傾向があるため、高度なタンパク質のネイティブ性及び低含有量の微生物の両方を得ることは困難である。本発明は、非常に低い微生物の含有量を得ると同時に、高レベルのＢＬＧのネイティブ性を維持することを可能にする。
本発明の幾つかの実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大５００．０００ＣＦＵ／ｇ、好ましくは最大１００．０００ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは最大５０．０００ＣＦＵ／ｇ、さらにより好ましくは最大２５．０００ＣＦＵ／ｇを含む。
微生物のさらに低い含有量が好ましい場合があり、そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、最大１５０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇを含む。好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、最大１００００ＣＦＵ／ｇを含む。より好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、最大５０００ＣＦＵ／ｇを含む。さらにより好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、最大１０００ＣＦＵ／ｇを含む。さらにより好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、最大３００ＣＦＵ／ｇを含む。最も好ましくは、ＢＬＧ単離粉末は、最大１００ＣＦＵ／ｇ、例えば最大１０ＣＦＵ／ｇ等を含む。特に好ましい実施形態では、粉末は無菌である。無菌のＢＬＧ単離粉末は、例えば、酸性ｐＨでの精密濾過及び熱処理等のＢＬＧ単離粉末の製造中に幾つかの物理的微生物減少プロセスを組み合わせることによって調製され得る。乾燥は、好ましくは、例えば、無菌噴霧乾燥機等の無菌乾燥システムで実施される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）２〜４．９、ｉｉ）６．１〜８．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも３０％重量／重量、好ましくは少なくとも８０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大２％重量／重量、好ましくは最大０．５％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）２〜４．９、又はｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも３０％重量／重量、好ましくは少なくとも８０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、より好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大２％重量／重量、好ましくは最大０．５％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％、好ましくは最大５％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大７０ＮＴＵ、好ましくは最大５０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大４０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）２〜４．９、又はｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも３０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、２〜４．９の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも８０％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大２％重量／重量、好ましくは最大０．５％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３、好ましくは少なくとも０．３ｇ／ｃｍ３、より好ましくは少なくとも０．４ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％、好ましくは最大５％、より好ましくは最大２％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大５０ＮＴＵ、好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、３．０〜４．３の範囲、好ましくは３．６〜４．１の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも８０％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９２％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大２％重量／重量、好ましくは最大０．５％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３、好ましくは少なくとも０．３ｇ／ｃｍ３、及びより好ましくは少なくとも０．４ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−少なくとも１．１１、好ましくは少なくとも１．１３の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大１０％、好ましくは最大５％、より好ましくは最大２％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大５０ＮＴＵ、好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、６．１〜８．５の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも８０％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大２％重量／重量、好ましくは最大０．５％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３、好ましくは少なくとも０．３ｇ／ｃｍ３、及びより好ましくは少なくとも０．４ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−最大１０％、好ましくは最大５％、より好ましくは最大２％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大５０ＮＴＵ、好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、６．１〜８．５の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも８０％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大２％重量／重量、好ましくは最大０．５％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３、好ましくは少なくとも０．３ｇ／ｃｍ３、より好ましくは少なくとも０．４ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−最大１０％、好ましくは最大５％、より好ましくは最大２％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大５０ＮＴＵ、好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも８０％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大２％重量／重量、好ましくは最大０．５％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３、好ましくは少なくとも０．３ｇ／ｃｍ３、より好ましくは少なくとも０．４ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−最大１０％、好ましくは最大５％、より好ましくは最大２％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大５０ＮＴＵ、好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、及び
−好ましくは、１０％未満のＢＬＧ結晶化度を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３、ｉｉ）６．５〜７．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９２％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９２％重量／重量、好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−最大５％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵの熱安定性、及び
−最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、好ましくは最大１０００コロニー形成単位／ｇ、より好ましくは最大１００コロニー形成単位／ｇを有し、最も好ましくは当該ＢＬＧ単離粉末は無菌である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３、ｉｉ）６．５〜７．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９２％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９２％重量／重量、好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−最大５％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵの熱安定性、及び
−最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、好ましくは最大１０００コロニー形成単位／ｇ、より好ましくは最大１００コロニー形成単位／ｇを有し、最も好ましくは当該ＢＬＧ単離粉末は無菌である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３、ｉｉ）６．５〜７．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９２％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９２％重量／重量、好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵの熱安定性、及び
−最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、好ましくは最大１０００コロニー形成単位／ｇ、より好ましくは最大１００コロニー形成単位／ｇを有し、最も好ましくは当該ＢＬＧ単離粉末は無菌である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３、ｉｉ）６．５〜７．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９２％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９２％重量／重量、好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
−最大５％のタンパク質変性度、及び
−最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、好ましくは最大１０００コロニー形成単位／ｇ、より好ましくは最大１００コロニー形成単位／ｇを有し、最も好ましくは当該ＢＬＧ単離粉末は無菌である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３、ｉｉ）６．５〜７．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９２％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９２％重量／重量、好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
−最大５％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３、ｉｉ）６．５〜７．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９２％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９２％重量／重量、好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵの熱安定性、及び
−最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、好ましくは最大１０００コロニー形成単位／ｇ、より好ましくは最大１００コロニー形成単位／ｇを有し、最も好ましくは当該ＢＬＧ単離粉末は無菌である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３又はｉｉ）６．３〜７．５の範囲のｐＨを有し、以下：
−少なくとも３０％重量／重量、好ましくは少なくとも５０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも８０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９０％重量／重量、より好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
−最大５％、好ましくは最大２％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵ、好ましくは最大２０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、ｉ）３．０〜４．３、又はｉｉ）６．３〜７．５の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも３０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と
−最大６％重量／重量の量の水と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
−最大５％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、３．０〜４．３の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量、好ましくは少なくとも９６％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−０．４５〜０．８ｇ／ｃｍ３、好ましくは０．５０〜０．６ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
−最大５％、好ましくは最大２％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、６．３〜７．５の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９６％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−かさ密度０．４５〜０．８ｇ／ｃｍ３、好ましくは０．５０〜０．６ｇ／ｃｍ３、
−最大１０％、好ましくは最大５％、より好ましくは最大２％のタンパク質変性度、及び
−ｐＨ３．９で最大５０ＮＴＵ、好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、を有する。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、
−少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９４％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、
−最大６％重量／重量の量の水と、
−最大０．５％重量／重量、好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、
−かさ密度０．４５〜０．８ｇ／ｃｍ３、好ましくは０．５０〜０．６ｇ／ｃｍ３、
−最大１０％、好ましくは最大５％、より好ましくは最大２％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大５０ＮＴＵ、好ましくは最大３０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵの熱安定性、及び
−好ましくは１０％未満、より好ましくは多くても１％のＢＬＧ結晶化度、を有する。
本発明のさらなる態様は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のＢＬＧを含む、乾燥ＢＬＧ単離粉末を製造する方法に関し、
ａ）以下を有する液体ＢＬＧ単離物、
ｉ）２〜４．９の範囲のｐＨ、
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ、又は
ｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨ、を有する液体ＢＬＧ単離物を提供する工程であって、
当該液体ＢＬＧ単離物が、総タンパク質に対して少なくとも８５重量／重量の量のＢＬＧを含む工程、
ｂ）任意に、液体ＢＬＧ分離株を物理的微生物減少に供する工程、
ｃ）噴霧乾燥により液体ＢＬＧ単離物を乾燥する工程、を含む、方法に関する。
液体ＢＬＧ単離物は、好ましくは食用組成物である。
液体ＢＬＧ単離物は、好ましくは哺乳動物の乳から、好ましくは反芻動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、ウマ及び／又はシカの乳から調製される。ウシの乳由来のタンパク質が特に好ましい。したがって、ＢＬＧは好ましくはウシＢＬＧである。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、総タンパク質に対して、少なくとも９２％重量／重量、好ましくは少なくとも９５％重量／重量、より好ましくは少なくとも９７％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９８％の量のＢＬＧ、最も好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９９．５％重量／重量の量のＢＬＧを含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、総タンパク質に対して、少なくとも９７．５％重量／重量、好ましくは少なくとも９８．０％重量／重量、より好ましくは少なくとも９８．５％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９９．０％の量のＢＬＧ、最も好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９９．７％重量／重量、例えば総タンパク質に対しておよそ１００．０％等の量のＢＬＧを含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも５％重量／重量、好ましくは少なくとも１０％重量／重量、より好ましくは少なくとも１５％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも２０％の量の総タンパク質、最も好ましくは少なくとも３０％重量／重量の量の総タンパク質を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、５〜４０％重量／重量の範囲、好ましくは１０〜３５％重量／重量の範囲、より好ましくは１５〜３０％重量／重量の範囲、さらにより好ましくは２０〜２５％重量／重量の範囲の総タンパク質を含む。
本発明者らは、液体ＢＬＧ単離物中のＢＬＧ濃度の増加が、より高いかさ密度を有する噴霧乾燥粉末を生じさせ、したがって、液体ＢＬＧ単離物中に比較的高濃度のＢＬＧを有することが好ましいことを観察した。
そのため、本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、１０〜４０％重量／重量の範囲、好ましくは２０〜３８％重量／重量の範囲、より好ましくは２４〜３６％重量／重量の範囲、さらにより好ましくは２８〜３４％重量／重量の範囲の量の総タンパク質を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及びカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）の合計は、液体ＢＬＧ単離物の非ＢＬＧタンパク質の少なくとも４０％重量／重量、好ましくは、液体ＢＬＧ単離物の非ＢＬＧタンパク質の少なくとも６０％重量／重量、より好ましくは少なくとも７０％重量／重量、最も好ましくは少なくとも９０％重量／重量を構成する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＡＬＡは、液体ＢＬＧ単離物の非ＢＬＧタンパク質の最大８０％重量／重量、好ましくは液体ＢＬＧ単離物の非ＢＬＧタンパク質の最大６０％重量／重量、さらにより好ましくは最大４０％重量／重量、及び最も好ましくは最大３０％重量／重量を構成する。
さらに低いＡＬＡ含有量が好ましい場合があり、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＡＬＡは、液体ＢＬＧ単離物の非ＢＬＧタンパク質の最大２０％重量／重量、好ましくは液体ＢＬＧ単離物粉の非ＢＬＧタンパク質の最大１５％重量／重量、さらにより好ましくは最大１０％重量／重量、及び最も好ましくは最大５％重量／重量を構成する。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物の各主要な非ＢＬＧホエイタンパク質は、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。
さらに低い濃度の主要な非ＢＬＧホエイタンパク質が望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物の各主要な非ＢＬＧホエイタンパク質は、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
本発明者らは、低レベルのラクトフェリン及び／又はラクトペルオキシダーゼが、無彩色のホエイタンパク質生成物を得るのに特に有利であるという徴候を見てきた。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ラクトフェリンは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで液体ＢＬＧ単離物中に存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。さらに低濃度のラクトフェリンが望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、ラクトフェリンは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
同様に、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ラクトペルオキシダーゼは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで液体ＢＬＧ単離物中に存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。さらに低濃度のラクトペルオキシダーゼが望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、ラクトペルオキシダーゼは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、５〜５０％重量／重量の範囲、好ましくは１０〜４０％重量／重量の範囲、より好ましくは１５〜３５％重量／重量の範囲、さらにより好ましくは２０〜３０％重量／重量の範囲の全固形分を構成する。
全固形分に寄与しない液体ＢＬＧ単離物の画分は、好ましくは本質的に水からなるか、さらには水からなる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、５０〜９５％重量／重量の範囲、好ましくは６０〜９０％重量／重量の範囲、より好ましくは６５〜８５％重量／重量の範囲、さらにより好ましくは７０〜８０％重量／重量の範囲の含水量を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大６０％重量／重量、好ましくは最大５０％重量／重量、より好ましくは最大２０％重量／重量、さらにより好ましくは最大１０％重量／重量、さらにより好ましくは最大１％重量／重量、最も好ましくは最大０．１％の量の炭水化物を含む。例えば、液体ＢＬＧ単離物は、例えば、ラクトース、オリゴ糖、及び／又はラクトースの加水分解生成物（すなわち、グルコース及びガラクトース）、スクロース、及び／又はマルトデキストリン等の炭水化物を含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大１０％重量／重量、好ましくは最大５％重量／重量、より好ましくは最大２％重量／重量、さらにより好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質を含む。
本発明者らは、液体ＢＬＧ単離物の一部の所望の特性に達するようにミネラル含量を制御することが有利となり得ることを見出した。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大１０ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大４ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大２ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大１．０ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大０．６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大０．４ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大０．２ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、最も好ましくは最大０．１ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大５ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物のＭｇ、及びＣａの量の合計は、最大３ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大１．０ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大０．５ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物のＭｇ、及びＣａの量の合計は、最大０．３ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大０．２ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは最大０．１ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、さらにより好ましくは最大０．０３ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、最も好ましくは最大０．０１ｍｍｏｌ／ｇタンパク質である。
本発明者らは、腎臓病の患者に特に有用な低リン／低カリウム変異体のＢＬＧ単離粉末を作製することが可能であることを見出した。かかる製品を製造するには、液体ＢＬＧ単離物のリン及びカリウムの含有量が等しく低くなければならない。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり、リン最大１００ｍｇの総リン含有量を有する。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり、リン最大８０ｍｇの総リン含有量を有する。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり、リン最大５０ｍｇの総リン含有量を有する。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり、リン最大２０ｍｇの総リン含有量を有する。液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり、リン最大５ｍｇの総リン含有量を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり最大６００ｍｇのカリウムを含む。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり最大５００ｍｇのカリウムを含む。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり最大４００ｍｇのカリウムを含む。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり最大３００ｍｇのカリウムを含む。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり最大２００ｍｇのカリウムを含む。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、タンパク質１００ｇあたり最大１００ｍｇのカリウムを含む。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、１００ｇタンパク質あたり最大５０ｍｇのカリウムを含み、さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、１００ｇタンパク質あたり最大１０ｍｇのカリウムを含む。
リンの含有量は、問題の組成物の元素リンの総量に関し、例１．１９に従って決定される。同様に、カリウムの含有量は、問題の組成物の元素カリウムの総量に関し、例１．１９に従って決定される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大リン１００ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム７００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、好ましくは最大リン８０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム６００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、より好ましくは最大リン６０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム５００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、より好ましくは最大リン５０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大４００ｍｇカリウム／タンパク質１００ｇ、又はより好ましくは最大リン２０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム２００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、又はさらにより好ましくは最大リン１０ｍｇ／タンパク質１００ｇ及び最大カリウム５０ｍｇ／タンパク質１００ｇを含む。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）１００ｍｇ／タンパク質１００ｇ、及び最大カリウム３４０ｍｇ／タンパク質１００ｇを含む。
本発明による低リン及び／又は低カリウム組成物は、腎機能が低下している患者群用の食物製品を製造するための食品原料として使用することができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．４、さらにより好ましくは３．０〜４．０、最も好ましくは３．４〜３．９の範囲のｐＨを有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、６．１〜８．５、好ましくは６．２〜８．０、より好ましくは６．３〜７．７、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、５．０〜６．０、好ましくは５．１〜５．９、より好ましくは５．２〜５．８、さらにより好ましくは５．３〜５．７の範囲のｐＨを有する。液体ＢＬＧ単離物が５．０〜６．０のｐＨ範囲にある場合、液体ＢＬＧ単離物はＢＬＧ結晶を含まないことがしばしば好ましい。これは、例えば、温度を上げることによって、及び／又は塩を加えることによって、液体ＢＬＧ単離物がＢＬＧの飽和点を下回っていることを確認することで達成できる。或いは、準安定ゾーンに保持され、結晶化促進剤が液体ＢＬＧ単離物と接触しない限り、液体ＢＬＧ単離物がＢＬＧに対して過飽和であっても、結晶を含まない状態に保つことが可能である。
液体ＢＬＧ単離物は、好ましくは微生物の含有量が低く、これは、ＢＬＧ濃縮組成物が既に微生物が少ない場合に特に可能である。
本発明の幾つかの実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大５００．０００ＣＦＵ／ｇ、好ましくは最大１００．０００ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは最大５０．０００ＣＦＵ／ｇ、さらにより好ましくは最大１０．０００ＣＦＵ／ｇを含む。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇを含む。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、最大６００ＣＦＵ／ｇを含む。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は最大３００ＣＦＵ／ｇを含む。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、最大１００ＣＦＵ／ｇを含む。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、最大５０ＣＦＵ／ｇを含む。最も好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、最大２０ＣＦＵ／ｇｍ、例えば、最大１０ＣＦＵ／ｇ等を含む。特に好ましい実施形態では、粉末は無菌である。無菌の液体ＢＬＧ単離物は、例えば、低いｐＨ（例えば、最大ｐＨ４．０）での精密濾過及び熱処理等のＢＬＧ単離粉末の製造中に幾つかの物理的微生物減少プロセスを組み合わせることによって調製され得る。
ＢＬＧのアンフォールディングは不可逆的なプロセスであるように見えるため、タンパク質のアンフォールディングの程度が低いＢＬＧ単離粉末の調製には、液体ＢＬＧ単離物のタンパク質のアンフォールディングの程度が既に低いことが必要である。
ＢＬＧアンフォールディングの程度が低いＢＬＧ単離粉末又は液体ＢＬＧ単離物が必要とされる場合、液体ＢＬＧ単離物は、好ましくは、少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも１．１２、好ましくは少なくとも１．１３、より好ましくは少なくとも１．１５、さらにより好ましくは少なくとも１．１７、及び最も好ましくは少なくとも１．１９の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する。
液体ＢＬＧ単離物にかなりの量の非タンパク質物質が含まれている場合は、固有トリプトファン蛍光発光比を測定する前にタンパク質画分を単離することが好ましい。そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物のタンパク質画分は、少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する。
好ましくは、液体ＢＬＧ単離物のタンパク質画分は、少なくとも１．１２、より好ましくは少なくとも１．１３、さらにより好ましくは少なくとも１．１５、さらにより好ましくは少なくとも１．１７、及び最も好ましくは少なくとも１．１９の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）をし得る。
例えば、タンパク質を保持するフィルターを使用して溶液を透析又は限外濾過ベースの透析にかけることにより、ＢＬＧ単離粉末からタンパク質画分を分離する。
ＢＬＧのタンパク質変性は不可逆的なプロセスであると思われるため、タンパク質のアンフォールディングの程度が低いＢＬＧ単離粉末の調製には、液体ＢＬＧ単離物のタンパク質変性度が既に低いことが必要である。そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大１０％重量／重量、好ましくは最大６％重量／重量、より好ましくは最大４％重量／重量、さらにより好ましくは最大２、及び最も好ましくは最大１％重量／重量のタンパク質変性度を有する。
液体ＢＬＧ単離物の実質量のＢＬＧが非凝集性ＢＬＧであることがしばしば好ましい。好ましくは、ＢＬＧの少なくとも５０％が非凝集性ＢＬＧである。より好ましくは、ＢＬＧの少なくとも少なくとも８０％が非凝集性ＢＬＧである。さらに好ましいのは、ＢＬＧの少なくとも９０％が非凝集性ＢＬＧである。最も好ましいのは、ＢＬＧの少なくとも９５％が非凝集性ＢＬＧである。さらにより好ましいのは、液体ＢＬＧ単離物のＢＬＧのおよそ１００％が非凝集性ＢＬＧである。
しかしながら、例えば、不透明な飲料が必要な場合といった、液体ＢＬＧ単離物末が有意なレベルのタンパク質変性を有することもまた好ましい場合がある。したがって、本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、少なくとも１１％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％のタンパク質変性度を有する。
液体ＢＬＧ単離物がかなりのレベルのタンパク質変性を有する場合、低レベルの不溶性タンパク質物質、すなわち、貯蔵中に飲料に沈殿する沈殿タンパク質物質を維持することがしばしば好ましい。不溶性物質のレベルは、例１．１０に従って測定される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大２０％重量／重量の不溶性タンパク質物質、好ましくは最大１０％重量／重量の不溶性タンパク質物質、より好ましくは最大５％重量／重量の不溶性タンパク質物質を含み、さらにより好ましいのは最大３％重量／重量の不溶性タンパク質物質であり、最も好ましいのは最大１％重量／重量の不溶性タンパク質である。液体ＢＬＧ単離物が不溶性タンパク質物質を全く含まないことがさらに好ましい場合がある。
上記のように、本発明者らは、液体ＢＬＧ単離物のｐＨ３．９での熱安定性が、透明な高タンパク質飲料に対するその有用性の良好な指標であることを見出した。ｐＨ３．９での熱安定性は、例１．２に従って測定される。
液体ＢＬＧ単離物が、ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵ、好ましくは最大１００ＮＴＵ、より好ましくは最大６０ＮＴＵの熱安定性を有し、さらにより好ましいのは最大４０ＮＴＵ、最も好ましいのは最大２０ＮＴＵである。さらにより良好な熱安定性が可能であり、液体ＢＬＧ単離物は、好ましくは、ｐＨ３．９で最大１０ＮＴＵ、好ましくは最大８ＮＴＵの熱安定性を有し、より好ましいのは最大４ＮＴＵ、さらにより好ましいのは最大２ＮＴＵである。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大２００ＮＴＵ、好ましくは最大１００ＮＴＵ、より好ましくは最大５０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大２０ＮＴＵ、さらにより好ましくは最大１０ＮＴＵ、最も好ましくは最大２ＮＴＵの濁度を有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、２００ＮＴＵ超、好ましくは少なくとも４００ＮＴＵ、より好ましくは少なくとも８００ＮＴＵ、さらにより好ましくは少なくとも１０００ＮＴＵ、さらにより好ましくは少なくとも２０００ＮＴＵ、最も好ましくは少なくとも５０００ＮＴＵの濁度を有する。かかる液体ＢＬＧ単離物は、不透明な飲料の製造に特に好ましい。
本発明者らは、本発明の液体ＢＬＧ単離物が、驚くべきことに、同等の液体ＷＰＩよりも低い粘度を有することを観察した。本発明者らは、これにより、不快な高粘度を経験することなく高タンパク質含有量を得ることが可能になるため、液体ＢＬＧ単離物が高タンパク質飲料として特に適していることを見出した。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、粘度（ｐ）±５０％、より好ましくは粘度（ｐ）±４０％、さらにより好ましくは粘度（ｐ）±３０％、最も好ましくは粘度（ｐ）±２５％の摂氏１５度での粘度及び３００ｓ−１の剪断速度を有する。
粘度（ｐ）は次のように定義される。
粘度（ｐ）＝ｐ≦２３％の場合：０．３５５６ｅ０．１２６２＊ｐ；ｐ＞２３％の場合：０．０２５４＊ｅ０．２４＊ｐ
ｐは、％重量／重量で表される液体ＢＬＧ単離物の総タンパク質含有量でることから、タンパク質含有量が３１％重量／重量であれば、ｐは３１である。
これは、液体ＢＬＧ単離物（タンパク質含有量ｐを有する）が、例えば、粘度（ｐ）±２５％の摂氏１５度での粘度及び３００ｓ−１の剪断測度を有する場合、液体ＢＬＧ単離物の粘度は少なくとも粘度（ｐ）−２５％であり、最大粘度（ｐ）＋２５％であることを意味する。液体ＢＬＧ単離物のタンパク質含有量ｐが、例えば３１％重量／重量である場合、この例の最小粘度と最大粘度は以下のとおりである：
最小粘度（ｃＰ）：０．０２５４＊ｅ０．２４＊３１−２５％＝４３ｃＰ−２５％＝３２ｃＰ
最大粘度（ｃＰ）：０．０２５４＊ｅ０．２４＊３１＋２５％＝４３ｃＰ−２５％＝５４ｃＰ
本発明の他の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、粘度（ｐ）±２０％、より好ましくは粘度（ｐ）±１５％、さらにより好ましくは粘度（ｐ）±１０％、最も好ましくは粘度（ｐ）±５％の摂氏１５度での粘度及び３００ｓ−１の剪断速度を有する。
液体ＢＬＧ単離物の粘度は、例１．８に従って測定されるが、摂氏１５度の温度及び３００ｓ−１の剪断速度を使用する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、以下の摂氏１５度での粘度及び３００ｓ−１の剪断速度を有する：
−少なくとも粘度（ｐ）−２０％、及び
−最大粘度最大（ｐ）−２０％。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、以下の摂氏１５度での粘度及び３００ｓ−１の剪断速度を有する：
−少なくとも粘度（ｐ）−１０％、及び
−最大粘度最大（ｐ）−４０％。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、以下の摂氏１５度での粘度及び３００ｓ−１の剪断速度を有する：
−少なくとも粘度（ｐ）−１０％、及び
−最大粘度最大（ｐ）−５０％。
粘度最大（ｐ）は次のように定義される：粘度最大（ｐ）≦０．６１１＊ｅ（０．１４９４＊ｐ）ｃＰ。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、最大粘度最大（ｐ）−１０％、より好ましくは最大粘度最大（ｐ）−２０％の摂氏１５度での粘度及び３００ｓ−１の剪断測度を有し、粘度最大（ｐ）−３０％がさらにより好ましく、粘度最大（ｐ）−５０％が最も好ましい。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、２．８〜４．３、好ましくは３．０〜４．０範囲のｐＨを有し、以下：
−２０〜３４％重量／重量、より好ましくは２４〜３２％重量／重量、さらにより好ましくは２８〜３２％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９０％重量／重量、より好ましくは少なくとも９４％重量／重量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、好ましくは以下：
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
−最大２％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大２０ＮＴＵの熱安定性、
−無菌である、及び
−粘度（ｐ）±２５％の摂氏１５度での粘度であって、ここで、ｐは単位％重量／重量のタンパク質含有量であり、粘度（ｐ）＝ｐ≦２３％の場合、０．３５５６ｅ０．１２６２＊ｐ；ｐ＞２３％の場合、０．０２５４＊ｅ０．２４＊ｐ、の１つ又は２つ以上を有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、６．３〜８．０、好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨを有し、以下：
−２０〜３４％重量／重量、より好ましくは２４〜３２％重量／重量、さらにより好ましくは２８〜３０％重量／重量の量の総タンパク質と、
−総タンパク質に対して少なくとも９０％重量／重量、より好ましくは少なくとも９４％重量／重量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と、を含み、
当該ＢＬＧ単離粉末は、好ましくは以下：
−少なくとも１．１５の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
−最大５％のタンパク質変性度、
−ｐＨ３．９で最大４０ＮＴＵの熱安定性、
−無菌である、及び
−粘度（ｐ）±２５％の摂氏１５度での粘度であって、ここで、ｐは単位％重量／重量のタンパク質含有量であり、粘度（ｐ）＝ｐ≦２３％の場合、０．３５５６ｅ０．１２６２＊ｐ；ｐ＞２３％の場合、０．０２５４＊ｅ０．２４＊ｐ、の１つ又は２つ以上を有する。
かかる酸性の高タンパク質液体ＢＬＧ単離物は、高品質のＢＬＧ単離粉末の製造に特に有用であり、同等のＷＰＩと比較して驚くほど粘度が低いため、精密濾過等の処理のエネルギー消費を少なくする。酸性で高タンパクの液体ＢＬＧ単離物はさらに、同じタンパク質含有量を有する従来のＷＰＩで達成できるよりもはるかに高いかさ密度を有する酸性ホエイタンパク質粉末を製造することを可能にする（例えば、例７を参照）。
液体ＢＬＧ単離物は、幾つかの異なる方法で提供され得る。
典型的には、液体ＢＬＧ単離物の提供は、以下の方法のうちの１つ又は２つ以上によってＢＬＧ濃縮組成物を提供するために、ホエイタンパク質フィードからＢＬＧを分離することを含むか、さらにはそれからなる：
−塩溶によるＢＬＧの結晶化又は沈殿、
−塩析によるＢＬＧのＢＬＧの結晶化又は沈殿、
−イオン交換クロマトグラフィー、及び
−限外濾過によるホエイタンパク質の分画。
ＢＬＧ濃縮組成物を提供するための特に好ましい方法は、ＢＬＧの結晶化によるものであり、好ましくは塩溶によるか、或いは塩析によるものである。
ホエイタンパク質フィードは、好ましくは、ＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣ、ＳＰＩ、又はそれらの組み合わせである。
「ホエイタンパク質フィード」という用語は、ＢＬＧ濃縮組成物及びその後の液体ＢＬＧ単離物が由来する組成物に関する。ホエイタンパク質溶液の文脈で記載される化学的特徴及び実施形態は、ホエイタンパク質フィードが典型的にはＢＬＧに関して過飽和ではなく、フィードのｐＨが５〜６の範囲に限定されないことを除いて、ホエイタンパク質フィードにも適用される。
本発明の幾つかの実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物の調製は、米国特許第２，７９０，７９０号公報Ａ１によるｐＨ範囲３．６〜４．０での高塩ＢＬＧ結晶化を含むか、さらにはそれからなる。
本発明の他の実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物の調製は、ｄｅ Ｊｏｎｇｈ ｅｔ ａｌ（Ｍｉｌｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｅｓ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ β−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８４（３），２００１，ｐａｇｅｓ ５６２−５７１）、又はＶｙａｓ ｅｔ ａｌ（Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ β−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８５：１６３９−１６４５，２００２）によって記載される方法を含むか、さらにはそれからなる。
しかしながら、本発明の特に好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４５５３号明細書に記載されている塩溶条件下でｐＨ５〜６での結晶化によって調製され、これは、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、総タンパク質に対して少なくとも９０％のＢＬＧを含み、好ましくはＢＬＧ結晶を含む、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４５５３による食用ＢＬＧ組成物である。
好ましくは、ＢＬＧ濃縮組成物は、以下：
１）非凝集性ＢＬＧ及び少なくとも１つの追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供する工程であって、当該ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、５〜６の範囲のｐＨを有する工程、
２）過飽和ホエイタンパク質溶液中で非凝集性ＢＬＧを結晶化する工程、
３）残りのホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離する工程、
４）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば、工程３）又は５）から得られたＢＬＧ結晶を洗浄する工程、並びに
５）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば、工程３）又は４）で得られたＢＬＧ結晶を再結晶化する工程、を含むプロセスによって調製される。
ＢＬＧ濃縮組成物を調製するためのこのプロセスは、必須の工程１）、２）、及び３）をその順序で含み、任意の順序及び反復回数で工程４）及び／又は５）を任意に含むことができる。しかしながら、工程４）及び５）は、多くの場合、工程３）の後に続く。或いは、又はさらに、分離の前に、洗浄水を結晶含有ホエイタンパク質溶液に加えることができる。
このプロセスはさらに、ＢＬＧ濃縮組成物を乾燥させる工程を含み得る。しかしながら、現在、乾燥中にタンパク質を損傷するリスクを回避するため、乾燥させずにＢＬＧ濃縮組成物を使用することが好ましい。
前述のように、結晶化プロセスの工程１）は、非凝集性ＢＬＧ及び少なくとも追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供することを含む。
ホエイタンパク質溶液は、好ましくは、アルファ−ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）、オステオポンチン、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、乳脂肪球膜タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の非凝集性ホエイタンパク質を含む。
本発明の幾つかの実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大１０％重量／重量、好ましくは最大５％重量／重量、より好ましくは最大１％重量／重量のカゼイン、さらにより好ましくはタンパク質の総量に対して最大０．５％のカゼインを含む。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、検出可能な量のカゼインを全く含まない。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。より好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。
さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。最も好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明の他の好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。最も好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３５％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。より好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して少なくとも４５％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜９０％重量／重量の範囲の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜８０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。工程１）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して、２０〜７０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して３０〜７０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含む。
前述のように、本発明者らは、有機溶媒を使用せずに非凝集性ＢＬＧを結晶化することが可能であることを見出した。この精製アプローチは、ホエイタンパク質を含む調製物の精製にも使用でき、この調製物は既にＢＬＧ精製に供されており、非凝集性ＢＬＧの純度をさらに高める単純なプロセスを提供する。そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１〜２０％重量／重量の範囲の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２〜１５％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して、３〜１０％重量／重量の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明の幾つかの実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含む。或いは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２０％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２５％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含む。工程１）のホエイタンパク質溶液は、好ましくは、タンパク質の総量に対して少なくとも３５％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４０％重量／重量の非凝集性ＡＬＡを含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜９５％重量／重量の範囲の非凝集性ＡＬＡを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜７０％重量／重量の範囲の非凝集性ＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜６０％重量／重量の範囲の非凝集性ＡＬＡを含み得る。工程１）のホエイタンパク質溶液は、好ましくは、タンパク質の総量に対して１２〜５０％重量／重量の範囲の非凝集性ＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２０〜４５％重量／重量の範囲の非凝集性ＡＬＡを含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比が少なくとも０．０１である。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比が少なくとも０．５である。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比が少なくとも１、例えば少なくとも２等である。例えば、工程１）のホエイタンパク質溶液は、非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比が少なくとも３であり得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、０．０１〜２０の範囲の非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比を有する。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、０．２〜１０の範囲の非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比を有する。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、０．５〜４の範囲の非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比を有する。例えば、工程１）のホエイタンパク質溶液は、１〜３の範囲の非凝集性ＢＬＧと非凝集性ＡＬＡとの間の重量比を有し得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１２％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。例えば、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。工程１）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して、少なくとも２０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。或いは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。
本発明の幾つかの特に好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大９５％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大９０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。より好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して最大８５％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して、最大８０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大７８％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大７５％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１〜９５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜９０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含み得る。より好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜８５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜８０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。最も好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２０〜７０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含み得る。
本発明の他の好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜９５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１２〜９０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含み得る。より好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１５〜８５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１５〜８０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。最も好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して３０〜７０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質溶液の重量に対して少なくとも０．４％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、少なくとも１．０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、少なくとも２．０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。ホエイタンパク質溶液が少なくとも４％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
より高濃度の非凝集性ＢＬＧがさらに好ましく、好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、少なくとも６％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、少なくとも１０％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含む。ホエイタンパク質溶液が少なくとも１５％重量／重量の非凝集性ＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質溶液の重量に対して、０．４〜４５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、１〜３５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、４〜３０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。ホエイタンパク質溶液が１０〜２５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
ＢＬＧのより高い含有量が特に好ましく、そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質溶液の重量に対して、１０〜４５％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、１５〜４０％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、２０〜３９％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含む。ホエイタンパク質溶液が２５〜３８％重量／重量の範囲の非凝集性ＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
ホエイタンパク質溶液の実質量のＢＬＧが非凝集性ＢＬＧであることがしばしば好ましい。好ましくは、ＢＬＧの少なくとも５０％が非凝集性ＢＬＧである。より好ましくは、ＢＬＧの少なくとも少なくとも８０％が非凝集性ＢＬＧである。さらに好ましいのは、ＢＬＧの少なくとも９０％が非凝集性ＢＬＧである。最も好ましいのは、ＢＬＧの少なくとも９５％が非凝集性ＢＬＧである。さらにより好ましいのは、ホエイタンパク質溶液のＢＬＧのおよそ１００％が非凝集性ＢＬＧである。
任意の適切なホエイタンパク質源を使用して、ホエイタンパク質溶液を調製することができる。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、ホエイタンパク質単離物、又はそれらの組み合わせを含むか、さらにはそれらからからなる。
ホエイタンパク質溶液は、脱塩ホエイタンパク質溶液であることが好ましい。
この文脈において、脱塩という用語は、ホエイタンパク質溶液の導電率が最大１５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは最大１０ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大８ｍＳ／ｃｍであることを意味する。脱塩ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、好ましくは最大７ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは最大４ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大１ｍＳ／ｃｍである。
ホエイタンパク質溶液は、脱塩乳清タンパク質濃縮物、脱塩乳清タンパク質単離物、脱塩ホエイタンパク質濃縮物、又は脱塩ホエイタンパク質単離物であることが特に好ましい。
本発明の幾つかの特に好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、脱塩及びｐＨ調整された乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、乳清タンパク質単離物、又はそれらの組み合わせを含むか、さらにはそれらからなる。
ホエイタンパク質溶液は、例えば、脱塩乳清タンパク質濃縮物を含み得るか、さらにはそれからなり得る。或いは、ホエイタンパク質溶液は、脱塩ホエイタンパク質濃縮物を含み得るか、さらにはそれからなり得る。或いは、ホエイタンパク質溶液は、脱塩乳清タンパク質単離物を含み得るか、さらにはそれからなり得る。或いは、ホエイタンパク質溶液は、脱塩ホエイタンパク質単離物を含み得るか、さらにはそれからなり得る。
ＢＬＧ濃縮組成物は、好ましくは哺乳動物の乳から、好ましくは反芻動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、ウマ及び／又はシカの乳から調製される。ウシの乳由来のタンパク質が特に好ましい。
ホエイタンパク質溶液のタンパク質は、好ましくはそのネイティブ状態に可能な限り近く、好ましくは、もしあったとしても、穏やかな熱処理のみに供されたものである。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、最大８０ｍｇ／１００ｇタンパク質のフロシン値を有する。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、最大４０ｍｇ／１００ｇタンパク質のフロシン値を有する。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、最大２０ｍｇ／１００ｇタンパク質のフロシン値を有する。さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、最大１０ｍｇ／１００ｇタンパク質のフロシン値を有する。最も好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、最大５ｍｇ／１００ｇタンパク質のフロシン値、例えば、好ましくは０ｍｇ／１００ｇタンパク質のフロシン値等を有する。
ホエイタンパク質溶液には、典型的には、タンパク質に加えて他の成分が含まれている。ホエイタンパク質溶液は、例えば、ミネラル、炭水化物、及び／又は脂質等のホエイ又は乳清に通常見られる他の成分を含む場合がある。代替的又は追加的に、ホエイタンパク質溶液は、ホエイ又は乳清に固有ではない成分を含み得る。ただし、かかる非ネイティブ成分は、好ましくは食物製品生産での使用に対して、及び好ましくはヒトの消費にとっても安全でなければならない。
本プロセスは、ＢＬＧ以外の固形物を含む粗ホエイタンパク質溶液からＢＬＧを分離するために特に有利である。
ホエイタンパク質溶液は、例えば、ラクトース、オリゴ糖、及び／又はラクトースの加水分解生成物（すなわち、グルコース及びガラクトース）等の炭水化物を含み得る。ホエイタンパク質溶液は、例えば、１〜３０％重量／重量の範囲、又は２〜２０％重量／重量の範囲等、０〜４０％重量／重量の範囲の炭水化物を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、最大２０％重量／重量の炭水化物、好ましくは最大１０％重量／重量の炭水化物、より好ましくは最大５％重量／重量の炭水化物、さらにより好ましくは最大２％重量／重量炭水化物を含む。
ホエイタンパク質溶液はまた、例えば、トリグリセリド及び／又はリン脂質等の他の脂質タイプの形の脂質を含み得る。
本発明の幾つかの実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、全固形分に対して最大１５％重量／重量の脂質の総量を含む。好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、全固形分に対して最大１０％重量／重量の脂質の総量を含む。より好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、全固形分に対して最大６％重量／重量の脂質の総量を含む。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、全固形分に対して最大１．０％重量／重量の脂質の総量を含む。最も好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、全固形分に対して最大０．５％重量／重量の脂質の総量を含む。
ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、典型的には、ホエイタンパク質溶液の重量に対して少なくとも１％重量／重量である。好ましくは、ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも５％重量／重量である。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも１０％重量／重量である。さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも１５％重量／重量である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、１〜５０％重量／重量の範囲である。好ましくは、ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、５〜４０％重量／重量の範囲である。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、１０〜３０％重量／重量の範囲である。さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、１５〜２５％重量／重量の範囲である。
ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、例１．５に従って決定される。
ホエイタンパク質溶液は、典型的には、ホエイタンパク質フィードを１つ又は２つ以上の調整に供することによって調製され、ＢＬＧに関して過飽和であるホエイタンパク質溶液を形成する。
ホエイタンパク質フィードは、好ましくは、ＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣ、ＳＰＩ、又はそれらの組み合わせである。
「ホエイタンパク質フィード」という用語は、ＢＬＧ濃縮組成物及びその後の液体ＢＬＧ単離物が由来する組成物に関する。ホエイタンパク質フィードは、例えば、ＢＬＧに関して過飽和のホエイタンパク質溶液に変換される。ホエイタンパク質フィードは、典型的には、ＢＬＧと少なくとも１つの追加のホエイタンパク質を含む水性液体であるが、典型的には、ＢＬＧに関して過飽和ではない。
ホエイタンパク質溶液の化学組成に関する実施形態は、ホエイタンパク質フィードにも同様に適用される。しかしながら、典型的には、ホエイタンパク質フィードの少なくとも１つのパラメーターは、過飽和又は少なくとも自発的な結晶化を回避するように設定される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、過飽和ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質フィードを以下の調整の１つ又は２つ以上に供することによって調製される：
−ｐＨを調整する
−導電率を下げる
−温度を下げる
−タンパク質濃度を増加させる
−水分活性を低下させる薬剤を添加する
−イオン組成の変更。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードのｐＨを５〜６の範囲のｐＨに調整することを含む。
全てのｐＨ値は、ｐＨガラス電極を使用して測定され、２５℃に正規化される。２５℃への正規化は、典型的には、ｐＨメーターによって行われる。或いは、サンプルの温度を２５℃に調整する。
ホエイタンパク質溶液は、例えば、４．９〜６．１の範囲のｐＨを有し得る。ホエイタンパク質溶液のｐＨは、例えば、５．０〜６．１の範囲であり得る。或いは、ホエイタンパク質溶液のｐＨは５．１〜６．１の範囲であり得る。好ましくは、ホエイタンパク質溶液のｐＨは５．１〜６．０の範囲である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．０〜６．０の範囲である。好ましくは、ホエイタンパク質溶液のｐＨは５．１〜６．０の範囲である。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液のｐＨは５．１〜５．９の範囲である。さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液のｐＨは５．２〜５．９の範囲であり得る。最も好ましくは、ホエイタンパク質溶液のｐＨは５．２〜５．８の範囲である。
ｐＨは、食物製品に許容可能な酸及び／又は塩基を使用して調整することが好ましい。例えば、カルボン酸等の食物製品に許容可能な酸が特に好ましい。かかる酸の有用な例は、例えば、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、安息香酸、酪酸、クエン酸、葉酸、フマル酸、グルコン酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、リン酸、プロピオン酸、ソルビン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、及び／又はそれらの混合物である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ｐＨは、例えば、ゆっくりと加水分解すると同時に、それを含む水性液体のｐＨを低下させる、Ｄ−グルコノ−デルタ−ラクトン等のラクトンを使用して調整される。ラクトンの加水分解終了後の目標ｐＨを正確に計算することができる。
例えば、食物製品に許容される塩基の有用な例は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の水酸化物源、例えばクエン酸三ナトリウム等の食用酸の塩、及び／又はそれらの組み合わせである。
本発明の他の好ましい実施形態では、ｐＨは、そのＨ＋型に対して陽イオン交換材料を添加することによって調整される。ビーズタイプ／大粒子タイプの陽イオン交換材料は、結晶化前又は結晶化後でもホエイタンパク質溶液から簡単に除去することができる。そのＨ＋型に対して陽イオン交換材料を添加することによるｐＨの調整は、ホエイタンパク質フィードの導電率に著しく影響する負の対イオンを添加することなくｐＨを低下させるので、本発明において特に有利である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードの導電率を低下させることを含む。
本明細書に記載されている導電率の値は、別段の指定がない限り、２５℃に正規化されている。
ホエイタンパク質溶液の導電率を下げると、ＢＬＧ結晶の収率が高くなることがわかっている。ホエイタンパク質溶液の得られる最小導電率は、タンパク質画分及び脂質画分（もしあれば）の組成に依存する。幾つかのタンパク質種、例えばカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）等は、他のタンパク質種よりも導電性に寄与する。したがって、ホエイタンパク質フィードの導電率を、タンパク質及びタンパク質の対イオンが導電率の主な要因であるレベルに近づけることが好ましい。導電率の低下には、液相に存在し、タンパク質にしっかりと結合していない小さな遊離イオンの少なくとも一部の除去が含まれることがしばしばある。
ホエイタンパク質溶液は、最大１０ｍＳ／ｃｍの導電率を有することがしばしば好ましい。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、最大５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、最大４ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
より低い導電率がさらにより好ましく、より高い収率のＢＬＧ結晶を生じさせる。したがって、ホエイタンパク質溶液は、好ましくは最大３ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、最大１ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、最大０．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
ホエイタンパク質フィードの導電率は、好ましくは、透析又はダイアフィルトレーションによって低下する。限外濾過によるダイアフィルトレーションは、タンパク質を保持しながら塩及び小さな荷電分子を洗い流すことができるため、特に好ましい。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、同じＵＦユニットを、ＵＦ／ダイアフィルトレーション及びその後のホエイタンパク質フィードの濃縮に使用する。
ホエイタンパク質溶液中の導電率（ｍＳ／ｃｍで表される）とタンパク質の総量（ホエイタンパク質溶液の総重量に対する総タンパク質の重量％で表される）との間の比率を、有利には、ＢＬＧの結晶化を促進するための特定の閾値未満に保つことができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．３である。好ましくは、ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．２５である。好ましくは、ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．２０である。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．１８である。さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．１２である。最も好ましくは、ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．１０である。
例えば、ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、およそ０．０７であるか、さらにはそれよりも低いことが好ましい。
本発明者らはさらに、ホエイタンパク質フィードを有利に調整して、最大１０ｍＳ／ｃｍのＵＦ透過導電率を有するホエイタンパク質溶液を提供できることを見出した。ＵＦ透過導電率は、液体の小分子画分の導電率の尺度である。「導電率」という用語が本明細書でそのように使用される場合、それは問題の液体の導電率を指す。「ＵＦ透過導電率」という用語が使用される場合、それは液体の小分子画分の伝導率を指し、例１．２３に従って測定される。
好ましくは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、最大７ｍＳ／ｃｍである。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、最大５ｍＳ／ｃｍであり得る。さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、最大３ｍＳ／ｃｍであり得る。
さらに低いＵＦ透過導電率を使用することもでき、高収率のＢＬＧを得る必要がある場合は特に好ましい。そのため、好ましくは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、最大１．０ｍＳ／ｃｍである。より好ましくは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、最大０．４ｍＳ／ｃｍであり得る。さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、最大０．１ｍＳ／ｃｍであり得る。最も好ましくは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は、最大０．０４ｍＳ／ｃｍであり得る。
例えば、ダイアフィルトレーション中にＭｉｌｌｉＱ水を希釈剤として使用する場合（ＭｉｌｌｉＱ水はおよそ０．０６μＳ／ｃｍの導電率を持つ）、さらに低いＵＦ透過導電率に達する可能性がある。そのため、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は最大０．０１ｍＳ／ｃｍになる可能性がある。或いは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は最大０．００１ｍＳ／ｃｍであり得る。或いは、ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過導電率は最大０．０００１ｍＳ／ｃｍであり得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードの温度を下げることを含む。
例えば、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードの温度を少なくとも５℃、好ましくは少なくとも１０℃、さらにより好ましくは少なくとも１５℃に下げることを含み得る。例えば、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質フィードの温度を少なくとも２０℃に下げることを含み得る。
ホエイタンパク質フィードの温度を、例えば、最大３０℃、好ましくは最大２０℃、さらにより好ましくは最大１０℃に低下させてもよい。本発明者らは、さらに低い温度がより高い程度の過飽和を提供することを見出し、そのためホエイタンパク質の温度を例えば、最大５℃、好ましくは最大２℃、さらにより好ましくは最大０℃に低下させてもよい。温度は０℃よりも低くてもよい。しかしながら、好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、例えば氷のスラリーの形態で、ポンプ輸送可能であり続けなければならない。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧ結晶化の開始前の氷スラリーである。或いは又はさらに、結晶化ホエイタンパク質溶液は、工程２）のＢＬＧ結晶化中に氷スラリーに変換されるか、又は氷スラリーとして維持され得る。
本発明の幾つかの特に好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードの総タンパク質濃度を増加させることを含む。ホエイタンパク質フィードは、例えば、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透、及び／又は蒸発等の１つ又は２つ以上のタンパク質濃縮工程に供され、それによって濃縮されて、ホエイタンパク質溶液が得られる。
限外濾過は、塩及び炭水化物の濃度がほとんど影響を受けずに、タンパク質の選択的濃縮を可能にするため、特に好ましい。上述のように、限外濾過は、好ましくは、ホエイタンパク質フィードのダイアフィルトレーション及び濃縮の両方に使用される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液中のＢＬＧの濃度は、ＢＬＧの自発的な結晶化が起こるレベルよりも低い。したがって、ホエイタンパク質溶液が準安定領域にあるとき、すなわち、シーディングが使用される際にＢＬＧ結晶は成長できるが、結晶化が自発的に開始しない過飽和領域にあるとき、ホエイタンパク質フィードの修飾を停止することがしばしば好ましい。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、１つ又は２つ以上の水分活性低下剤（複数の場合がある）をホエイタンパク質フィードに添加することを含む。
かかる水分活性低下剤の有用であるが非限定的な例は、多糖及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、例えば、イオン交換、新たなイオン種の追加、透析、又はダイアフィルトレーションによる、ホエイタンパク質フィードのイオン組成を変更することを含む。
典型的には、ホエイタンパク質溶液は、過飽和を生成するための上記のプロセス工程の２つ以上を組み合わせることによって調製される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードを少なくとも：
−例えば、１０℃を超える温度での限外濾過、ナノ濾過又は逆浸透を使用する、濃縮、及び
−その後、１０℃未満の温度に冷却すること、を含む。
本発明の他の好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードを少なくとも
−６．０を超えるｐＨでの濃縮、及び
−その後、酸（ＧＤＬ又はＨ＋型の陽イオン交換物質等）を添加することによってｐＨを低下させることに供することを含む。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードを少なくとも
−例えば、少なくとも非凝集性ＢＬＧを保持する膜を使用したダイアフィルトレーションによって導電率を低下させることに供することを含む。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の調製は、ホエイタンパク質フィードを少なくとも
−ｐＨを５〜６に調整すること、
−少なくとも非凝集性ＢＬＧを保持する膜を使用したダイアフィルトレーションによって導電率を低下させること、
−例えば、１０℃を超える温度で限外濾過、ナノ濾過又は逆浸透を使用する、タンパク質の濃縮、
−最後に、１０℃未満の温度に冷却すること、の組み合わせに供することを含む。
本発明者らはさらに、ナトリウム＋カリウムの合計対カルシウムとマグネシウムの合計の間のモル比を制御することによって、本プロセスのＢＬＧ収率が改善され得ることを見出した。カルシウム及びマグネシウムの相対量が多いと、驚くべきことに、非凝集性ＢＬＧの収量が増加し、したがって、本発明のプロセスのＢＬＧ回収の効率が向上するようである。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程１）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大４である。より好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大２である。さらにより好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大１．５、さらにより好ましくは最大１．０である。最も好ましくは、工程１）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大０．５、例えば、最大０．２等である。
Ｎａ＋ＫとＣａ＋ｍｇのモル比は（ｍＮａ＋ｍＫ）／（ｍＣａ＋ｍＭｇ）として計算され、式中、ｍＮａは元素Ｎａのモル単位の含有量、ｍＫは元素Ｋのモル単位の含有量、ｍＣａは元素Ｃａのモル単位の含有量、及びｍＭｇは元素Ｍｇのモル単位の含有量である。
ホエイタンパク質溶液は、塩溶によってＢＬＧに関して過飽和であり、したがって、塩溶によってホエイタンパク質溶液からそのＢＬＧを結晶化できることが特に好ましい。
本発明の幾つかの実施形態では、特に本発明の食用ＢＬＧ生成物がある程度のタンパク質変性も有するはずであれば、ホエイタンパク質溶液は低い変性タンパク質の含有量を有する。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、最大２％、好ましくは最大１．５％、より好ましくは最大１．０％、最も好ましくは最大０．８％のタンパク質変性度を有する。
プロセスの工程２）は、過飽和ホエイタンパク質溶液のＢＬＧの少なくとも一部を結晶化することを含む。
工程２）の結晶化は、塩溶によって、すなわち、イオン強度及び導電率が低い液体中で行われることが特に好ましい。これは、結晶化を引き起こすためにかなりの量の塩が溶液に加えられる塩析様式とは対照的である。
工程２）のＢＬＧの結晶化は、例えば、次の１つ又は２つ以上が含まれる：
−結晶化が起こるのを待つこと、
−結晶化シードの添加、
−ＢＬＧの過飽和度をさらに上げること、及び／又は
−機械的刺激。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程２）は、結晶化シードをホエイタンパク質溶液に加えることを含む。本発明者らは、結晶化シードの添加により、ＢＬＧ結晶化がいつどこで行われるかを制御して、プロセス機器の突然の目詰まり及び製造中の意図しない停止を回避できることを見出した。例えば、ホエイタンパク質フィードを濃縮している間、結晶化の開始を回避することがしばしば望ましい。
セラミック膜又はＤＣＦ等の高剪断システムが使用されない限り、ホエイタンパク質溶液は、工程２）の操作中にＵＦ膜又はＭＦ膜に接触しないことが特に好ましい。
原則として、ＢＬＧの結晶化を開始する任意のシード材料を使用することができる。しかしながら、ホエイタンパク質溶液に不純物が添加されるのを避けるために、水和ＢＬＧ結晶又は乾燥ＢＬＧ結晶をシーディングに使用することが好ましい。
結晶化シードは、乾燥形態であっても、ホエイタンパク質溶液に添加されたときに懸濁液の一部を形成していてもよい。結晶化シード、例えば、ＢＬＧ結晶を含む懸濁液を添加することは、結晶化のより速い開始を提供するようであるため、目下のところ好ましい。このような懸濁液は、ｐＨが５〜６の範囲であり、導電率が最大１０ｍＳ／ｃｍである結晶化シードを含むことが好ましい。
本発明者らは、導電率の単位「ｍＳ／ｃｍ」は１ｃｍあたりのミリジーメンスを意味し、１．００ｍＳは１０００マイクロＳに対応することを認識している。
結晶化シードは、ＢＬＧ結晶化後に乾燥されていないＢＬＧ結晶の懸濁液を介して添加されることが特に好ましい。かかる懸濁液は、例えば、前のバッチの工程２）から得られたＢＬＧ結晶及び母液の一部、又は前のバッチの工程３）、４）又は５）から得られた湿ったＢＬＧ結晶の一部であり得る。
本発明者らは、結晶化シードに湿潤ＢＬＧ結晶を使用すると、乾燥した又は不十分に水和されたＢＬＧ結晶が使用される場合よりもはるかに大きなＢＬＧ結晶が工程２）中に提供され、これもまた母液からのＢＬＧの分離をより効率的にすることを観察した。ホエイタンパク質フィード、結晶化条件、シード材料の質量及び粒子径、冷却プロファイル、並びに分離方法が同じである実験で、発明者らは、未乾燥のＢＬＧ結晶を用いてシーディングすると、再水和され、乾燥されたＢＬＧ結晶をシーディングすることによって得られたＢＬＧ結晶（得られた粒子径：４０〜６０ミクロン）と比較して、得られた結晶の粒子径（得られた粒子径：１００〜１３０ミクロン）が１００％増加することを見出した。
或いは、結晶化シードが乾燥ＢＬＧ結晶に基づいている場合、結晶を水性液体、例えば水に再懸濁して、得られたＢＬＧ結晶懸濁液を結晶化の開始に使用する前に、乾燥ＢＬＧ結晶を少なくとも３０分間、好ましくは少なくとも１．０時間、さらにより好ましくは少なくとも１．５時間再水和させることが好ましい。
本発明の幾つかの実施形態では、結晶化シードの少なくとも幾つかは、ホエイタンパク質溶液と接触させられる固相上に位置する。
結晶化シードは、好ましくは、ＢＬＧ結晶の所望のサイズよりも小さい粒子径を有する。結晶化シードのサイズを、ふるい分け又は他のサイズ分別プロセスによって最も大きなシードを除去することによって修正することができる。例えば、粉砕による、粒子径の縮小を、粒子径分別の前に使用することもできる。
本発明の幾つかの実施形態では、結晶化シードの少なくとも９０％重量／重量は、０．１〜６００ミクロンの範囲の粒子径（ふるい分け分析によって測定される）を有する。例えば、結晶化シードの少なくとも９０％重量／重量は、１〜４００ミクロンの範囲の粒子径を有し得る。好ましくは、結晶化シードの少なくとも９０％重量／重量は、５〜２００ミクロンの範囲の粒子径を有し得る。より好ましくは、結晶化シードの少なくとも９０％重量／重量は、５〜１００ミクロンの範囲の粒子径を有し得る。
結晶化シードの粒子径及び投与量は、ＢＬＧの最適な結晶化を提供するように調整することができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、結晶化シードは、ＢＬＧに関して過飽和を得る前にホエイタンパク質フィードに添加されるが、好ましくは、過飽和に達したときに少なくとも幾つかの結晶化シードが依然として存在する方法である。これは、ホエイタンパク質フィードが過飽和に近いとき、例えば、冷却、濃縮、及び／又はｐＨ調整中に結晶化シードを追加して、結晶化シードが完全に溶解する前に過飽和にすることによって達成され得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程２）は、ＢＬＧの過飽和の程度をさらに、好ましくはＢＬＧの結晶化が直ちに、すなわち最大２０分間、好ましくは最大５分間で開始する程度まで増加させることを含む。これはまた、結晶子が自発的に形成され、結晶化プロセスを開始する核形成ゾーンとも称される。
過飽和の程度を、例えば、
−ホエイタンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに上げること、
−ホエイタンパク質溶液をさらに冷却すること、
−ホエイタンパク質溶液をＢＬＧ結晶化に最適なｐＨに近づけること、
−導電率をさらに下げること、の１つ又は２つ以上によって増加することができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程２）は、ＢＬＧ結晶が形成されるのを待つことを含む。これには数時間かかる場合があり、典型的には、ＢＬＧに対してわずかに過飽和であり、結晶化シードが添加されていないホエイタンパク質溶液の場合である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液の提供（工程１）及びＢＬＧの結晶化（工程２）は、２つの別個の工程として行われる。
しかしながら、本発明の他の好ましい実施形態では、工程２）は、ＢＬＧの過飽和度を上げるか、又は少なくとも過飽和を維持するために、結晶化ホエイタンパク質溶液の追加の調整を含む。追加の調整により、ＢＬＧ結晶の収率が向上する。
かかる追加の調整には、以下：
−結晶化ホエイタンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに上げること、
−結晶化ホエイタンパク質溶液をさらに低い温度に冷却すること、
−結晶化ホエイタンパク質溶液をＢＬＧ結晶化に最適なｐＨにさらに近づけること、
−結晶化ホエイタンパク質溶液の導電率をさらに低下させること、の１つ又は２つ以上を含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、結晶化ホエイタンパク質溶液は、新たな結晶子の自発的形成を回避するために、工程２）の間、準安定ゾーンに維持される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程２）の間に得られたＢＬＧ結晶の少なくとも幾つかは、斜方晶系空間群Ｐ ２１ ２１ ２１を有する。
好ましくは、得られたＢＬＧ結晶の少なくとも幾つかは、斜方晶系空間群Ｐ ２１ ２１ ２１を有し、単位格子寸法ａ＝６８．６８（±５％）Å、ｂ＝６８．６８（±５％）Å、及びｃ＝１５６．６５（±５％）Å；並びに単位格子の積分角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、得られたＢＬＧ結晶の少なくとも幾つかは、斜方晶系空間群Ｐ ２１ ２１ ２１を有し、単位格子寸法ａ＝６８．６８（±２％）Å、ｂ＝６８．６８（±２％）Å、及びｃ＝１５６．６５（±２％）Å；並びに単位格子の積分角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°。
得られたＢＬＧ結晶の少なくとも幾つかは、斜方晶系空間群Ｐ ２１ ２１ ２１を有し、単位格子寸法ａ＝６８．６８（±１％）Å、ｂ＝６８．６８（±１％）Å、及びｃ＝１５６．６５（±１％）Å；並びに単位格子の積分角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°がさらにより好ましい。
最も好ましくは、得られたＢＬＧ結晶の少なくとも幾つかは、斜方晶系空間群Ｐ ２１ ２１ ２１を有し、単位格子寸法ａ＝６８．６８Å、ｂ＝６８．６８Å、及びｃ＝１５６．６５Å；並びに単位格子の積分角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°。
本発明の幾つかの特に好ましい実施形態では、プロセスは、残りのホエイタンパク質溶液から少なくとも幾つかのＢＬＧ結晶を分離する工程３）を含む。これは、ＢＬＧの精製が望まれる場合に特に好ましい。
工程３）は、例えば、ＢＬＧ結晶を少なくとも３０％重量／重量の固形分に分離することを含み得る。好ましくは、工程３）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも４０％重量／重量の固形分に分離することを含む。さらにより好ましくは、工程３）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも５０％重量／重量の固形分に分離することを含む。
本発明者らは、分離されたＢＬＧ結晶に付着する水性部分は、典型的には、避けるべき不純物を含むため、高い固形分がＢＬＧの精製に有利であることを見出した。さらに、高い固形分は、分離されたＢＬＧ結晶を、例えば、粉末等の乾燥生成物に変換するためのエネルギー消費を削減し、所与の容量の乾燥ユニットから得られるＢＬＧ収量を増加させる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程３）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも６０％の固形分に分離することを含む。好ましくは、工程３）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも７０％の固形分に分離することを含む。さらにより好ましくは、工程３）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも８０％の固形分に分離することを含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程３）の分離は、以下の操作の１つ又は２つ以上を含む：
−遠心分離、
−デカンテーション、
−濾過、
−沈降、
−上記の組み合わせ。
これらの単位操作は当業者によく知られており、容易に実施される。濾過による分離は、例えば、真空濾過、ダイナミッククロスフロー濾過（ＤＣＦ）、濾液プレス又はフィルター遠心分離機の使用を含み得る。
濾過には、所望の結果に基づいて異なる細孔サイズを使用することができる。好ましくは、フィルターは、ネイティブのホエイタンパク質及び小さな凝集物を通過させるが、ＢＬＧ結晶を保持する。フィルターは、好ましくは、少なくとも０．１ミクロンの公称孔径を有する。フィルターは、例えば、少なくとも０．５ミクロンの公称孔径を有し得る。さらにより好ましくは、フィルターは、少なくとも２ミクロンの公称孔径を有し得る。
より大きな孔径を有するフィルターも使用することができ、実際、主に大きな結晶をＢＬＧ結晶を含む液体から分離する必要がある場合に好ましい。本発明の幾つかの実施形態では、フィルターは、少なくとも５ミクロンの公称孔径を有する。好ましくは、フィルターは、少なくとも２０ミクロンの公称孔径を有する。さらにより好ましくは、フィルターは、少なくとも４０ミクロンの孔径を有し得る。
フィルターは、例えば、孔径が０．０３〜５０００ミクロン、例えば、０．１〜５０００ミクロン等の範囲である。好ましくは、フィルターは、０．５〜１０００ミクロンの範囲の孔径を有し得る。さらにより好ましくは、フィルターは、例えば、５〜８００ミクロンの範囲、１０〜５００ミクロンの範囲、又は５０〜５００ミクロンの範囲の孔径を有し得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、フィルターは、０．０３〜１００ミクロンの範囲の孔径を有する。好ましくは、フィルターは、０．１〜５０ミクロンの範囲の孔径を有し得る。より好ましくは、フィルターは、４〜４０ミクロンの範囲の孔径を有し得る。さらにより好ましくは、フィルターは、１０〜２０ミクロンの範囲等、５〜３０ミクロンの範囲の孔径を有し得る。
１ミクロンより大きい孔径を有するフィルターを使用することの利点は、細菌及び他の微生物もまた、分離中に、及び任意に洗浄及び／又は再結晶中にも少なくとも部分的に除去されることである。したがって、本プロセスは、非常に低い細菌負荷でありながらタンパク質の熱損傷を回避する高純度のＢＬＧを生成することを可能にする。
孔径が１ミクロンを超えるフィルターを使用するもう１つの利点は、水の除去及びその後の乾燥が容易になり、エネルギー消費が少なくなることである。
ＢＬＧ結晶から分離された残りのホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質溶液の調製中にホエイタンパク質フィードにリサイクルすることができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程３）は、フィルター遠心分離機を利用する。本発明の他の好ましい実施形態では、工程３）は、デカンター遠心分離機を利用する。初期の結果は、母液からＢＬＧ結晶を分離するためにフィルター遠心分離機及び／又はデカンター遠心分離機を使用すると、例えば、真空濾過よりも堅牢なプロセスの操作が提供されることを示している。
多くの場合、形成されたフィルターケーキを乾燥ガスで乾燥させて、フィルターケーキの含水量を減らし、好ましくはフィルターケーキをフィルターから剥がすことができるようにすることが好ましい。乾燥ガスの使用は、フィルターケーキが直接乾燥食用ＢＬＧ組成物に変換される場合、分離工程の一部、或いは最終乾燥工程を形成する場合がある。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程３）は、動的クロスフロー濾過（ＤＣＦ）ユニットを利用する。
初期試験は、膜孔径が０．０３〜５ミクロンの範囲、好ましくは０．３〜１．０ミクロンの範囲のＤＣＦユニットを使用すると、ＢＬＧ結晶の効率的な分離を提供することを示し、本発明者らは、ＤＣＦユニットは、ＢＬＧ結晶を含むホエイタンパク質溶液の大きなバッチからでも結晶を分離するのに十分な時間実行することができることを観察した。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程３）は、ＢＬＧ結晶を保持することができる膜を備えたＤＣＦユニットを使用して実施され、ＤＣＦ透過物は、ホエイタンパク質溶液又はホエイタンパク質フィードの一部を形成するためにリサイクルされ、ＤＣＦ保持液は、回収され得るか、又は結晶化タンクに戻され得る。好ましくは、ＤＣＦ透過液は、ホエイタンパク質溶液又はホエイタンパク質フィードと混合する前に、ＢＬＧに対して過飽和にするために、例えば限外濾過／ダイアフィルトレーションによって処理される。
有利なことに、これらの実施形態は、液体流の温度が１５℃を超えて上昇することを必要とせず、したがって、より高い温度を必要とするプロセスの変形よりも微生物汚染を受けにくい。これらの実施形態の別の産業上の利点は、過飽和のレベルが容易に制御され、望ましくない自発的な結晶化が起こらないレベルに維持できることである。したがって、プロセスのこれらの実施形態の間の液体流の温度は、好ましくは最大１５℃、より好ましくは最大１２℃、さらにより好ましくは最大１０℃、最も好ましくは最大５℃である。
これらの実施形態は、例１０に例示され、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４５５３号の図２６に示されている。これらの実施形態を、バッチプロセス又は連続プロセスとして実施することができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、プロセスは、ＢＬＧ結晶、例えば、３）の分離されたＢＬＧ結晶を洗浄する工程４）を含む。洗浄は、単一の洗浄又は複数の洗浄工程からなり得る。
工程４）の洗浄は、好ましくは、ＢＬＧ結晶を完全に溶解することなくＢＬＧ結晶を洗浄液と接触させ、続いて残りのＢＬＧ結晶を洗浄液から分離することを含む。
洗浄液は、好ましくは、ＢＬＧ結晶の完全な溶解を回避するように選択され、例えば、冷たい脱塩水、冷たい水道水、又は冷たい逆浸透透過水を含み得るか、さらには本質的にそれらからなり得る。
洗浄液は、例えば、冷たい脱塩水、冷たい水道水、若しくは冷たい逆浸透透過水を含み得るか、又は本質的にそれらからなり得る。
洗浄液は、５〜６の範囲、好ましくは５．０〜６．０の範囲、さらにより好ましくは５．１〜６．０の範囲、例えば、５．１〜５．９等の範囲のｐＨを有し得る。
或いは、洗浄液は、６．１〜８の範囲、好ましくは６．４〜７．６の範囲、さらにより好ましくは６．６〜７．４の範囲、例えば、６．８〜７．２等の範囲のｐＨを有し得る。これは典型的には、脱塩水、水道水、又は逆浸透透過水の場合の洗浄液のｐＨである。一般に、洗浄液はミネラルが少なく、緩衝能力が低いことが好ましい。
洗浄液は、最大０．１ｍＳ／ｃｍ、好ましくは最大０．０２ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大０．００５ｍＳ／ｃｍの導電率を有し得る。
さらに低い導電率を有する洗浄液を使用することができる。例えば、洗浄液は、最大１マイクロＳ／ｃｍの導電率を有し得る。或いは、洗浄液は、最大０．１マイクロＳ／ｃｍ、例えばおよそ０．０５マイクロＳ／ｃｍ等の導電率を有し得る。
結晶化ＢＬＧの溶解を制限するために、洗浄工程を低温で実施することが好ましい。洗浄液の温度は、好ましくは最大３０℃、より好ましくは最大２０℃、さらにより好ましくは最大１０℃である。
洗浄工程は、例えば、最大５℃で、より好ましくは最大２℃、例えば、およそ０℃で行われ得る。例えば、１つ又は２つ以上の凝固点抑制剤が存在することにより、洗浄液がその温度で凍結しない限り、０℃より低い温度を使用することができる。
本発明の幾つかの実施形態では、洗浄液は、例えば、少なくとも１％重量／重量の量の、好ましくは少なくとも３％重量／重量の量の、例えば、４％重量／重量等の量のＢＬＧを含む。
工程４）の洗浄は、典型的には、ＢＬＧ結晶の初期量の最大８０％重量／重量、好ましくは最大５０％重量／重量、さらにより好ましくはＢＬＧ結晶の初期量の最大２０％重量／重量を溶解する。好ましくは、工程４）の洗浄は、ＢＬＧ結晶の初期量の最大１５％重量／重量、より好ましくは最大１０％重量／重量、さらにより好ましくはＢＬＧ結晶の初期量の最大５％重量／重量を溶解する。
洗浄液の総量と分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、しばしば少なくとも１、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも５である。例えば、洗浄液の量と分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、少なくとも１０であり得る。或いは、洗浄液の総量と分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、少なくとも２０、例えば、少なくとも５０、又は少なくとも１００等であり得る。
「洗浄液の総量」という用語は、プロセス全体で使用される洗浄液の総量に関する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、１つ又は２つ以上の洗浄シーケンスは、ＢＬＧ結晶分離と同じフィルター配置又は同様のフィルター配置で行われる。主にＢＬＧ結晶を含むフィルターケーキは、ＢＬＧ結晶の残りの部分がフィルターケーキに残っている間にフィルターを通して除去される洗浄液の１つ又は２つ以上のシーケンスが追加される。
本発明の特に好ましい実施形態では、工程３）の分離は、ＢＬＧ結晶を保持するフィルターを使用して行われる。続いて、フィルターケーキを、フィルターケーキ及びフィルターを通って移動する１つ又は２つ以上の量の洗浄液と接触させる。洗浄液の各量は、フィルターケーキの体積の最大１０倍、好ましくはフィルターケーキの体積の最大５倍、より好ましくはフィルターケーキの体積の最大１倍、さらにより好ましくはフィルターケーキの体積の最大０．５倍、例えばフィルターケーキの体積の最大０．２倍等がしばしば好ましい。フィルターケーキの体積には、フィルターケーキの固体及び流体（液体及び気体）の両方が含まれる。フィルターケーキは、好ましくは、この方法で少なくとも２回、好ましくは少なくとも４回、さらにより好ましくは少なくとも６回洗浄される。
工程４）からの使用済み洗浄液は、例えば、ホエイタンパク質フィード又はホエイタンパク質溶液にリサイクルし、洗い流したＢＬＧを再度分離することができる。
プロセスはさらに、以下を含む再結晶化工程を伴う工程５）を含み得る：
−分離したＢＬＧ結晶を再結晶液に溶解すること、
−ＢＬＧに関して過飽和になるように再結晶液を調整すること、
−過飽和で調整された再結晶液中でＢＬＧを結晶化すること、及び
−残りの調整済み再結晶液からＢＬＧ結晶を分離すること。
工程５）は、単一の再結晶化シーケンス又は複数の再結晶化シーケンスのいずれかを含み得る。
本発明の幾つかの実施形態では、工程又は３）又は４）のＢＬＧ結晶は、少なくとも２回再結晶化される。例えば、ＢＬＧ結晶は、少なくとも３回、例えば、少なくとも４回、再結晶化され得る。例。
洗浄及び再結晶化の工程は、任意の順序で組み合わせることができ、必要に応じて複数回行うことができる。
工程３）の分離されたＢＬＧ結晶は、例えば、以下のプロセスシーケンスに従う：
−１つ又は２つ以上の洗浄工程（工程４）、それに続く、
−１つ又は２つ以上の再結晶化の工程（工程５）。
或いは、工程３）の分離されたＢＬＧ結晶は、プロセスシーケンスに供され得る：
−１つ又は２つ以上の再結晶化の工程（工程５）、それに続く、
−１つ又は２つ以上の洗浄工程（工程４）。
洗浄と再結晶化の複数の工程を、例えば、以下の順序で組み合わせることができる：
−１つ又は２つ以上の洗浄工程（工程４）、
−１つ又は２つ以上の再結晶化の工程（工程５）、
−１つ又は２つ以上の洗浄工程（工程４）、及び
−１つ又は２つ以上の再結晶化の工程（工程５）。
又は例えば、以下の順序：
−１つ又は２つ以上の再結晶化の工程（工程５）、
−１つ又は２つ以上の洗浄工程（工程４）、
−１つ又は２つ以上の再結晶化の工程（工程５）
−１つ又は２つ以上の洗浄工程（工程４）。
本発明者らは、ホエイタンパク質溶液の調製を含む結晶化プロセスが微生物増殖を起こしやすいことに気づき、この問題に対処するためにプロセスを修正することが有利であることを見出した。
ホエイタンパク質フィードの供給から工程ｃ）でＢＬＧ分子が分離されるまでに、ＢＬＧ分子が１２℃を超える温度にある時間の合計は、最大２４時間、好ましくは２０時間、最大１２時間がより好ましく、さらにより好ましくは最大６時間、最も好ましくは最大３時間であることが特に好ましい。
上記期間をさらに減少させることができ、またしばしばそうすることが好ましく、そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質フィードの提供から工程ｃ）でＢＬＧ分子が分離されるまでに、ＢＬＧ分子が１２℃を超える温度にある時間の合計は、最大２時間、好ましくは１時間、より好ましくは最大０．５時間、さらにより好ましくは最大０．３時間、最も好ましくは最大０．１時間である。
本発明の幾つかの実施形態では、プロセスはさらに、分離されたＢＬＧを、例えば、クロマトグラフィー又は選択的濾過に基づく追加のＢＬＧ濃縮工程に供することを含む。しかしながら、本発明の他の好ましい実施形態では、プロセスは、工程２）の後に追加のＢＬＧ濃縮工程を含まない。「追加のＢＬＧ濃縮工程」という用語は、タンパク質の総量に対してＢＬＧを濃縮するプロセス工程を意味し、この工程は、ＢＬＧの結晶化又はＢＬＧ結晶の取り扱いとは関係がない。かかる追加のＢＬＧ濃縮工程の例は、イオン交換クロマトグラフィーである。ＢＬＧ結晶の洗浄及び／又はＢＬＧの再結晶は、「追加のＢＬＧ濃縮工程」とは見なされない。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、プロセスは、工程３）、４）、又は５）に由来するＢＬＧ濃縮組成物が乾燥組成物に変換される乾燥工程を含む。
本発明の特に好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物を調製するプロセスは、以下：
１）ＢＬＧ及び少なくとも１つの追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供する工程であって、当該ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、５〜６の範囲のｐＨを有し、当該ホエイタンパク質溶液が、以下：
−全固形分に対して７０〜１００％重量／重量タンパク質と、
−総タンパク質に対して３０〜９０％重量／重量、好ましくは３０〜７０％の非凝集性ＢＬＧと、
−総タンパク質に対して４〜５０％重量／重量、好ましくは８〜３５％の非凝集性ＡＬＡと、
−総タンパク質に対して０〜２５％重量／重量のＣＭＰと、
−ホエイタンパク質溶液の総重量に対して少なくとも１０％重量／重量のタンパク質と、を含む、工程、
２）過飽和ホエイタンパク質溶液中で、好ましくは結晶化シードを添加することにより、ＢＬＧを結晶化する工程、
３）残りのホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離する工程、
４）任意に、工程３）で得られた分離したＢＬＧ結晶を洗浄する工程、
５）任意に、工程３）又は４）から得られたＢＬＧ結晶を再結晶化する工程、を含む。
ホエイタンパク質溶液は、好ましくは脱塩ホエイタンパク質溶液であり、好ましくは、導電率とタンパク質の総量との間の比が最大０．３及び／又はＵＦ透過導電率が最大７ｍＳ／ｃｍである。
これらの実施形態は、低ミネラル及び低リンのＢＬＧ単離物を作製するために特に有用である。
幾つかの好ましい実施形態では、プロセスはバッチプロセスとして実施される。或いは、時には好ましくは、プロセスはセミバッチプロセスとして実施され得る。他の好ましい実施形態では、プロセスは、連続プロセスとして実施される。
本プロセスの利点は、先行技術のＢＬＧ結晶化のための同等のプロセスよりもはるかに速いことである。ホエイタンパク質フィードの最初の調整から工程３）の分離の完了までの期間は、最大１０時間、好ましくは最大４時間、より好ましくは最大２時間、さらにより好ましくは最大１時間であり得る。
一般に、非凝集性ＢＬＧ又はホエイタンパク質フィードの他のホエイタンパク質のどちらの栄養価も損なわない穏やかな温度を使用して、ＢＬＧ濃縮組成物を調製することが好ましい。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、非凝集性ＢＬＧは、プロセス中に９０℃を超える温度にさらされない。好ましくは、ＢＬＧは、プロセス中に８０℃を超える温度にさらされない。さらにより好ましくは、非凝集性ＢＬＧは、プロセス中に７５℃を超える温度にさらされない。噴霧乾燥はしばしば１５０℃を超える温度を使用するが、短い曝露時間及び同時の水の蒸発は、噴霧乾燥されたタンパク質が５０〜７０℃を超える温度を経験しないことを意味することに留意されたい。
ＢＬＧ濃縮組成物を調製するためにどのプロセスが使用されたとしても、それは、ＢＬＧ濃縮組成物を乾燥させる工程を含み得る。しかしながら、現在、乾燥中にタンパク質を損傷するリスクを回避するために、ＢＬＧ濃縮組成物を乾燥させずに使用することが好ましい。
液体ＢＬＧ単離物として使用するために必要な特性をまだ持っていない場合、ホエイタンパク質フィードから分離されたＢＬＧ濃縮組成物を、液体ＢＬＧ単離物を提供する一環として、以下の群から選択される１つ又は２つ以上の工程に供することができる：
−脱塩、
−ミネラルの添加、
−希釈、
−集中力、
−物理的微生物減少、及び
−ｐＨ調整。
脱塩の非限定的な例としては、例えば、透析、ゲル濾過、ＵＦ／ダイアフィルトレーション、ＮＦ／ダイアフィルトレーション、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
ミネラル添加の非限定的な例としては、例えば、例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、及び／又はＭｇの塩等の可溶性の食物製品に許容可能な塩の添加が含まれる。かかる塩は、例えば、リン酸塩、塩化物塩、又は例えば、クエン酸塩若しくは乳酸塩等の食用酸の塩であり得る。ミネラルを、固体、懸濁、又は溶解した形態で添加することができる。
希釈の非限定的な例としては、例えば、水、脱塩水、又はミネラル、酸、塩基の水溶液等の液体希釈剤の添加が挙げられる。
濃度の非限定的な例としては、例えば、蒸発、逆浸透、ナノ濾過、限外濾過及びそれらの組み合わせが挙げられる。
濃度が全固形分に対してタンパク質の濃度を増加させる必要がある場合は、限外濾過又は代わりに透析等の濃縮工程を使用することが好ましい。濃度が全固形分に対してタンパク質の濃度を増加させる必要がない場合、例えば、蒸発、ナノ濾過及び／又は逆浸透が有用である可能性がある。
物理的微生物減少の非限定的な例としては、例えば、熱処理、細菌濾過、ＵＶ照射、高圧処理、パルス電界処理、及び超音波が挙げられる。これらの方法は、当業者によく知られている。
細菌濾過は典型的には、精密濾過又は大孔径限外濾過を含み、微生物を保持できるが、タンパク質及びその他の目的の成分を通過させることができる孔径を必要とする。有用な口径は、典型的には最大１．５ミクロン、好ましくは最大１．０ミクロン、より好ましくは最大０．８ミクロン、さらにより好ましくは最大０．５ミクロン、最も好ましくは最大０．２ミクロンである。細菌濾過の孔径は通常少なくとも０．１ミクロンである。
細菌濾過は、例えば、０．０２〜１ミクロン、好ましくは０．０３〜０．８ミクロン、より好ましくは０．０４〜０．６ミクロン、さらにより好ましくは０．０５〜０．４ミクロン、最も好ましくは０．１〜０．２ミクロンの孔径を有する膜を含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、細菌濾過に供され、続いて、最大８０℃、好ましくは最大７５℃の温度を使用する熱処理に供される。この熱処理の温度と持続時間との組み合わせは、好ましくは、滅菌飲料調製物を提供するように選択される。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、細菌濾過に供され、続いて、少なくとも１５０℃の温度を使用して、最大０．２秒、好ましくは最大０．１秒の期間にわたって熱処理に供される。この熱処理の温度と持続時間との組み合わせは、好ましくは、滅菌飲料調製物を提供するように選択される。
ｐＨ調整の非限定的な例としては、例えば、塩基及び／又は酸、好ましくは食物製品に許容可能な塩基及び／又は酸の添加が挙げられる。二価金属カチオンをキレート化することができる酸及び／又は塩基を使用することが特に好ましい。かかる酸及び／又は塩基の例は、クエン酸、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、乳酸、乳酸塩、リン酸、リン酸塩、及びそれらの組み合わせである。
以下において、ＢＬＧ濃縮組成物からの工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供の幾つかの好ましい実施形態。この文脈で言及されたプロセスの工程は、ＢＬＧ濃縮組成物に続くＢＬＧ含有生成物流に適用される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、例えば、ＢＬＧ濃縮組成物が上記の塩溶プロセスに由来するＢＬＧ結晶を含む場合、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−例えば、ＢＬＧ濃縮組成物のＢＬＧ結晶を溶解するため、ｉ）２〜４．９又はｉｉ）６．１〜８．５へとｐＨ調整すること、
−任意に、脱塩又はミネラルの追加、及び
−下記のいずれか、
−目的のタンパク質含有量への濃縮とそれに続く物理的微生物減少、又は
−物理的微生物減少とそれに続く目的のタンパク質含有量への濃縮。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、例えば、ＢＬＧ濃縮組成物が上記の塩溶プロセスに由来するＢＬＧ結晶を含む場合、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−例えば、ＢＬＧ濃縮組成物のＢＬＧ結晶を溶解するため、ｉ）２〜４．９又はｉｉ）６．１〜８．５へとｐＨ調整すること、
−任意に、ミネラルの脱塩又は追加、
−物理的微生物減少とそれに続く目的のタンパク質含有量への濃縮。
本発明の他の好ましい実施形態では、例えば、ＢＬＧ濃縮組成物が上記の塩溶プロセスに由来するＢＬＧ結晶を含む場合、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−好ましくはｐＨが５．０〜６．０の間のＢＬＧ濃縮組成物のＢＬＧ結晶を溶解するためのミネラル及び好ましくは可溶性の塩の添加、及び
−下記のいずれか、
−目的のタンパク質含有量への濃縮とそれに続く物理的微生物減少、又は
−物理的微生物減少とそれに続く目的のタンパク質含有量への濃縮。
酸性の溶解したＢＬＧ濃縮組成物を取り扱う場合、単独で、又は本明細書に記載の物理的微生物減少のための他のプロセスの１つ又は２つ以上と組み合わせて、物理的微生物減少として熱処理を使用することが特に有利である。本発明者らは、酸性条件下での穏やかな熱処理の使用は、ＢＬＧがそのネイティブの折りたたまれた状態にとどまることができるが、それでも処理された流れの微生物負荷の低減に寄与するので、特に有益であることを見出した。
酸性の溶解したＢＬＧ濃縮組成物を、最大２７％重量／重量、好ましくは最大２２％重量／重量、さらにより好ましくは最大１７％重量／重量の総タンパク質の濃度する間に、細菌濾過工程に供し、続いて、細菌濾過されたＢＬＧ濃縮組成物又は液体ＢＬＧ単離物を熱処理工程に供することが特に好ましい。
酸性の溶解したＢＬＧ濃縮組成物を、５〜２７％重量／重量、好ましくは１０〜２２％重量／重量、さらにより好ましくは１２〜１７％重量／重量の総タンパク質の濃度を有する間に、細菌濾過工程に供し、続いて、細菌濾過されたＢＬＧ濃縮組成物又は液体ＢＬＧ単離物を熱処理工程に供することがさらにより好ましい。
熱処理工程は、好ましくは液体ＢＬＧ単離物に対して、好ましくは噴霧乾燥前の最終工程として実施される。
液体ＢＬＧ単離物の供給中のＢＬＧのアンフォールディングを回避するか、又は少なくとも制限することがしばしば好ましい。熱処理が２〜４．９のｐＨ範囲で使用される場合、ＢＬＧのアンフォールディングを限定するか、さらには回避するため、温度を最大８２℃、好ましくは最大８０℃、より好ましくは最大７８℃に維持することが好ましい。
熱処理は、好ましくは少なくとも低温殺菌である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、熱処理の温度は、７０〜８０℃の範囲、好ましくは７０〜７９℃の範囲、より好ましくは７１〜７８℃の範囲、さらにより好ましくは、７２〜７７℃の範囲、最も好ましくは７３〜７６℃の範囲、例えばおよそ７５℃等である。
好ましくは、熱処理の持続時間は、７０〜８０の温度範囲で実施される場合、１秒〜３０分である。最長の曝露時間は、温度範囲の最低温度に最適であり、その逆も同様である。
本発明の特に好ましい実施形態では、熱処理は、７０〜７８℃で１秒〜３０分、より好ましくは７１〜７７℃で１分〜２５分、さらにより好ましくは７２〜７６℃で２分〜２０分を提供する。
幾つかの実施形態では、特にアンフォールディングする場合、より高い温度も好ましい場合があり、任意に、乾燥前にＢＬＧの凝集も必要とされる。例えば、熱処理の温度は、少なくとも８１℃、好ましくは少なくとも９１℃、より好ましくは少なくとも１００℃、さらにより好ましくは少なくとも１２０℃、最も好ましくは少なくとも１４０℃であり得る。
熱処理は、例えば、ＵＨＴタイプの処理であってもよく、これは、典型的には、１３５〜１４４℃の範囲の温度及び２〜１０秒の範囲の持続時間を含む。
或いは、しかしまた好ましいことに、熱処理は、１４５〜１８０℃の範囲の温度及び０．０１〜１秒の範囲の持続時間を含んでもよく、より好ましくは、１５０〜１８０℃の範囲の温度及び０．０１〜０．２秒の範囲の持続時間を含み得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０の範囲にある間に熱処理による微生物減少を行うことを含む。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物からの工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０の範囲にある間の熱処理による物理的微生物減少を含む。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物からの工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ｐＨが６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．３〜８．０、より好ましくは、６．５〜７．５の範囲の範囲にある間の脱塩を含む。本発明者らは、かかる脱塩が、この方法によって調製されたＢＬＧ単離粉末の熱安定性を改善するのに有利であることを見出した。
本発明の特に好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物からの工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、以下を含む：
−ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０の範囲にある間の熱処理による物理的微生物減少、及び
−ｐＨが６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．３〜８．０の範囲、より好ましくは６．５〜７．５の範囲にある間の脱塩。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、例えば、ＢＬＧ濃縮組成物が上記の塩溶プロセスに由来するＢＬＧ結晶を含む場合、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−ＢＬＧ濃縮組成物のＢＬＧ結晶を溶解するための２〜４．９へのｐＨの調整、
−任意に、ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．０、より好ましくは３．０〜３．９にある間の所望のタンパク質含有量への濃縮、及び
−ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０にある間の熱処理による物理的微生物減少。
ＢＬＧ濃縮組成物が既に２〜４．９の範囲のｐＨを有する場合、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、好ましくは、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０にある間の脱塩、
−任意に、ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０にある間の所望のタンパク質含有量への濃縮、及び
−ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０にある間の熱処理による物理的微生物減少。
５．０〜８．５の範囲、好ましくは６．１〜８．５の範囲、より好ましくは６．５〜８．０の範囲のｐＨを有する液体ＢＬＧ単離物を提供するのに特に適している本発明の他の好ましい実施形態では、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−例えば、ＢＬＧ濃縮組成物のＢＬＧ結晶を溶解するための２〜４．９へのｐＨの調整、
−任意に、所望のタンパク質含有量への濃縮、
−ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０にある間の熱処理による物理的微生物減少、
−５．０〜８．５の範囲、好ましくは６．１〜８．５の範囲、より好ましくは６．５〜８．０の範囲のｐＨへのｐＨの調整。
６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．３〜８．０の範囲、より好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する液体ＢＬＧ単離物を提供するのに特に適している本発明の他の好ましい実施形態では、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−例えば、ＢＬＧ濃縮組成物のＢＬＧ結晶を溶解するための２〜４．９へのｐＨの調整、
−任意に、ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０にある間の所望のタンパク質含有量への濃縮、
−ｐＨが２〜４．９、好ましくは２．５〜４．７、より好ましくは２．８〜４．３、さらにより好ましくは３．２〜４．０にある間の熱処理による物理的微生物減少、
−６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．３〜８．０の範囲、より好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨへのｐＨの調整、及び
−６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．３〜８．０の範囲、より好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨでの脱塩。
６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．１〜８．５の範囲、より好ましくは６．５〜８．０の範囲のｐＨを有する液体ＢＬＧ単離物を提供するのに特に適している本発明のさらに好ましい実施形態では、工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供は、ＢＬＧ濃縮組成物を以下の順序で以下の工程に供することを含む：
−例えば、ＢＬＧ濃縮組成物のＢＬＧ結晶を溶解するための少なくともｐＨ６．１へのｐＨの調整、
−ｐＨが６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．５〜８．０の範囲、より好ましくは６．５〜７．５の範囲にある間の脱塩
−任意に、ｐＨが６．１〜８．５、好ましくは６．５〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５にある間の所望のタンパク質に対する濃縮、
−任意に、ｐＨが６．１〜８．５、好ましくは６．５〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲にある間の熱処理による物理的微生物減少。
ＢＬＧ濃縮組成物を液体ＢＬＧ単離物に変換する間の温度は、典型的には０〜８２℃の範囲であり、熱処理のためにさらに高い温度を伴う場合がある。処理中のＢＬＧ流のｐＨが４．９を超える場合、温度は、微生物の増殖を減らすため、０〜６５℃の範囲、より好ましくは、０〜１５℃の範囲又は５０〜６５℃の範囲であることが好ましい。
液体ＢＬＧ単離物のｐＨが最大４．９、さらにより好ましくは最大４．１である場合、温度は０〜８２℃の範囲であり、有利には０〜１５℃の範囲であるか、又は微生物の成長を減らすため５０〜８０℃の範囲であることが好ましい。本発明者らは、高温が濃縮工程の効率を高め、同時に微生物の減少に寄与するため、５０〜８０℃の範囲の温度で、より好ましくは６０〜８０℃の範囲、さらにより好ましくは６５〜７８℃の範囲の温度で、プロセス又は必要に応じて、少なくとも濃縮工程を実施することが特に有利であることを見出した。この実施形態は、ＢＬＧのネイティブ性を維持しながら、高含有量のＢＬＧ及び非常に低い微生物含有量を有する液体ＢＬＧ単離物を生成することを可能にする。得られた噴霧乾燥粉末は、高いかさ密度及び高レベルのネイティブ性、並びに非常に好ましい微生物プロファイルを有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物を液体ＢＬＧ単離物に変換するプロセスは、０〜１５℃の範囲、好ましくは１〜１０℃の範囲の温度で行われる。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物を液体ＢＬＧ単離物に変換するプロセスの少なくとも一部、好ましくはプロセス全体が、５０〜８２℃の範囲、好ましくは５５〜８０℃の範囲、より好ましくは６０〜７８℃の範囲の温度で行われる。これは、処理中のタンパク質ストリームのｐＨが最大４．９、好ましくは最大４．３、より好ましくは最大３．７、好ましくは３．０〜４．３の範囲である場合、特に好ましい。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物を液体ＢＬＧ単離物に変換する少なくとも幾つかのプロセス、好ましくはプロセス全体が、ｐＨが３．０〜３．７の範囲にある間に７８〜８２℃の範囲の温度で行われる。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物を液体ＢＬＧ単離物に変換する少なくとも幾つかのプロセス、好ましくはプロセス全体が、ｐＨが３．７〜４．３の範囲にある間に６０〜７８℃の範囲の温度で行われる。
ＢＬＧ濃縮組成物は、好ましくは、液体ＢＬＧ単離物と実質的に同じタンパク質組成物を有し、通常、ＢＬＧ濃縮組成物を液体ＢＬＧ単離物に変換する間に追加のタンパク質分画を適用する必要はない。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、総タンパク質に対して、少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも８８％重量／重量、より好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９２％の量のＢＬＧ、最も好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９５％重量／重量の量のＢＬＧを含む。ＢＬＧ濃縮組成物が、総タンパク質に対して少なくとも９７％重量／重量、より好ましくは少なくとも９９％重量／重量、例えば、好ましくは総タンパク質に対しておよそ１００％重量／重量の量のＢＬＧを含むことが特に好ましい場合がある。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、総タンパク質に対して、少なくとも５％重量／重量、好ましくは少なくとも１０％重量／重量、より好ましくは少なくとも１５％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも２０％の量の総タンパク質、最も好ましくは少なくとも３０％重量／重量の量の総タンパク質を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、５〜４５％重量／重量の範囲、好ましくは１０〜４０％重量／重量の範囲、より好ましくは１５〜３８％重量／重量の範囲、さらにより好ましくは２０〜３５％重量／重量の範囲の総タンパク質を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及びカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）の合計は、ＢＬＧ濃縮組成物の非ＢＬＧタンパク質の少なくとも４０％重量／重量、好ましくは、ＢＬＧ濃縮組成物の非ＢＬＧタンパク質の少なくとも６０％重量／重量、より好ましくは少なくとも７０％重量／重量、最も好ましくは少なくとも９０％重量／重量を構成する。
本発明の他の好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物の各主要な非ＢＬＧホエイタンパク質は、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。
さらに低い濃度の主要な非ＢＬＧホエイタンパク質が望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物の各主要な非ＢＬＧホエイタンパク質は、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
本発明者らは、低レベルのラクトフェリン及び／又はラクトペルオキシダーゼが、無彩色のホエイタンパク質生成物を得るのに特に有利であるという徴候を見てきた。
そのため、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ラクトフェリンは、総タンパク質に対する重量パーセンテージでＢＬＧ濃縮組成物中に存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。さらに低濃度のラクトフェリンが望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、ラクトフェリンは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
同様に、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ラクトペルオキシダーゼは、総タンパク質に対する重量パーセンテージでＢＬＧ濃縮組成物中に存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大２５％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％、さらにより好ましくは最大１０％、最も好ましくは最大６％である。さらに低濃度のラクトペルオキシダーゼが望ましい場合がある。そのため、本発明の追加の好ましい実施形態では、ラクトペルオキシダーゼは、総タンパク質に対する重量パーセンテージで存在し、これは、スイートホエイに由来する標準的なホエイタンパク質濃縮物中の総タンパク質に対するその重量パーセンテージの最大４％、好ましくは最大３％、より好ましくは最大２％、さらにより好ましくは最大１％である。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、５〜５０％重量／重量の範囲、好ましくは１０〜４５％重量／重量の範囲、より好ましくは１５〜４０％重量／重量の範囲、さらにより好ましくは２０〜３５％重量／重量の範囲の全固形分を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、５０〜９５％重量／重量の範囲、好ましくは５５〜９０％重量／重量の範囲、より好ましくは６０〜８５％重量／重量の範囲、さらにより好ましくは６５〜８０％重量／重量の範囲の含水量を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、最大６０％重量／重量、好ましくは最大５０％重量／重量、より好ましくは最大２０％重量／重量、さらにより好ましくは最大１０％重量／重量、さらにより好ましくは最大１％重量／重量、最も好ましくは最大０．１％の量の炭水化物を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、最大１０％重量／重量、好ましくは最大５％重量／重量、より好ましくは最大２％重量／重量、さらにより好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、例えば、既に望ましいｐＨと化学組成を持っている場合には、液体ＢＬＧ単離物として直接使用される。
本発明の幾つかの実施形態は、工程ｂ）の物理的微生物減少を必要とせず、したがって、工程ａ）及びｃ）のみを必要とするが、他の好ましい実施形態は物理的微生物減少を必要とするため、工程ａ）、ｂ）及びｃ）の３つ全てを含む。
したがって、本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、物理的微生物減少に供される。
物理的微生物減少の有用な例は、加熱、細菌濾過、ＵＶ照射、高圧処理、パルス電界処理、及び超音波の１つ又は２つ以上を含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、物理的微生物減少は、熱処理を含むか、さらには熱処理からなる。
好ましくは、熱処理は少なくとも低温殺菌を含む。
特定の実施形態では、熱処理は、液体ＢＬＧ単離物を７０〜８２℃の範囲の温度に加熱することを含む。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、熱処理の温度は、７０〜８０℃の範囲、好ましくは７０〜７９℃の範囲、より好ましくは７１〜７８℃の範囲、さらにより好ましくは、７２〜７７℃の範囲、最も好ましくは７３〜７６℃の範囲、例えばおよそ７５℃等である。
好ましくは、熱処理の持続時間は、７０〜８０の温度範囲で実施される場合、１秒〜３０分である。最長の曝露時間は、温度範囲の最低温度に最適であり、その逆も同様である。
本発明の特に好ましい実施形態では、熱処理は、７０〜７８℃で１秒〜３０分、より好ましくは７１〜７７℃で１分〜２５分、さらにより好ましくは７２〜７６℃で２分〜２０分を提供する。
幾つかの実施形態では、特にアンフォールディングする場合、より高い温度も好ましい場合があり、任意に、乾燥前にＢＬＧに対する凝集も必要とされる。例えば、熱処理の温度は、少なくとも８１℃、好ましくは少なくとも９１℃、より好ましくは少なくとも１００℃、さらにより好ましくは少なくとも１２０℃であり得て、少なくとも１４０℃が最も好ましい。
熱処理は、例えば、９０〜１３０℃の範囲の温度及び５秒〜３０分の範囲の持続時間を含み得る。熱処理は、例えば、９０〜９５℃の範囲の温度に１〜３０分間、例えば、およそ１２０℃でおよそ２０秒加熱することを含む。或いは、熱処理は、１１５〜１２５℃の範囲の温度に５〜３０分間、例えば、およそ１２０℃でおよそ２０秒加熱することを含む。
或いは、熱処理は、例えば、ＵＨＴタイプの処理であってもよく、これは、典型的には、１３５〜１４４℃の範囲の温度及び２〜１０秒の範囲の持続時間を含む。
或いは、しかしまた好ましいことに、熱処理は、１４５〜１８０℃の範囲の温度及び０．０１〜２秒の範囲の持続時間を含んでもよく、より好ましくは、１５０〜１８０℃の範囲の温度及び０．０１〜０．３秒の範囲の持続時間を含み得る。
熱処理の実施は、プレート若しくは管状熱交換器、かきとり式熱交換器、又はレトルトシステム等の従来の装置の使用を含み得る。或いは、特に好ましくは、９５℃を超える熱処理の場合、例えば、直接蒸気注入、直接蒸気インフュージョン、又はスプレークッキング（ｓｐｒａｙ−ｃｏｏｋｉｎｇ）を使用する、直接蒸気ベースの加熱を使用することができる。さらに、かかる直接蒸気ベースの加熱は、好ましくは、フラッシュ冷却と組み合わせて使用される。スプレークッキングの実施の適切な例は、国際公開第２００９１１３８５８号公報Ａ１に見られ、これらはあらゆる目的で本明細書に組み込まれる。直接蒸気注入及び直接蒸気インフュージョンの実施の適切な例は、国際公開第２００９１１３８５８号公報Ａ１及び国際公開第２０１０／０８５９５７公報Ａ３に見られ、これらはあらゆる目的で本明細書に組み込まれる。高温処理の一般的な態様は、例えば、「Ｔｈｅｒｍａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｆｏｏｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」ＩＳＢＮ １８５５７３５５８ Ｘに記載されており、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、工程ｂ）の物理的微生物減少は、滅菌液体ＢＬＧ単離物をもたらす滅菌である。かかる滅菌は、例えば、細菌濾過と低温殺菌とを組み合わせることによって得ることができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、好ましくは２〜４．９の範囲のｐＨを有する液体ＢＬＧ単離物は、細菌濾過に供され、続いて、最大８０℃、好ましくは最大７５℃の温度を使用する熱処理に供される。この熱処理の温度と持続時間との組み合わせは、好ましくは、液体ＢＬＧ単離物を提供するように選択される。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、細菌濾過に供され、続いて、少なくとも１５０℃の温度を使用して、最大０．２秒、好ましくは最大０．１秒の期間にわたって熱処理に供される。この熱処理の温度と持続時間との組み合わせは、好ましくは、液体ＢＬＧ単離物を提供するように選択される。
この方法の工程ｃ）は、好ましくは、噴霧乾燥又は凍結乾燥を含む。噴霧乾燥が特に好ましい。
本発明者らは、液体ＢＬＧ単離物を、かなりの量のＢＬＧをアンフォールディング又は変性させる熱処理レジームに曝露するのを回避することが特に有利であることを見出した。そのため、噴霧前に液体ＢＬＧ単離物の予熱を使用する場合は、熱負荷を注意深く制御することが好ましい。
本発明の幾つかの実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、噴霧装置（例えば、ノズル又はアトマイザー）の出口に到達するとき、最大７０℃、好ましくは最大６０℃、より好ましくは最大５０℃の温度を有する。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、スプレー装置の出口に到達するとき、最大４０℃、好ましくは最大３０℃、より好ましくは最大２０℃、好ましくは最大１０℃、最も好ましくは最大５℃の温度を有する。
噴霧乾燥機の噴霧装置は、乾燥される溶液又は懸濁液を、噴霧乾燥機の乾燥チャンバーに入る液滴に変換する装置、例えば、ノズル又はアトマイザーである。
本発明の幾つかの実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、噴霧装置の出口に到達するとき、０〜６０℃の範囲、好ましくは２〜４０℃の範囲、より好ましくは、スプレー装置の出口に到達するとき４〜３５℃の範囲、最も好ましくは５〜１０℃の範囲の温度を有することが特に好ましい。
噴霧乾燥機の気体の入口温度は、好ましくは１４０〜２２０℃の範囲、より好ましくは１６０〜２００℃の範囲、さらにより好ましくは１７０〜１９０℃の範囲であり、例えば、好ましくはおよそ１８０℃等である。噴霧乾燥機からの気体の出口温度は、好ましくは５０〜９５℃の範囲、より好ましくは７０〜９０℃の範囲、さらにより好ましくは８０〜８８℃の範囲であり、例えば、好ましくはおよそ８５℃等である。経験則として、噴霧乾燥に供される固体は、気体出口温度よりも１０〜１５℃低い温度に加熱されると言われている。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、噴霧乾燥機の出口温度は、好ましくは５０〜８５℃の範囲、より好ましくは６０〜８０℃の範囲、さらにより好ましくは６５〜７５℃の範囲であり、例えば、好ましくはおよそ７０℃である。
本方法の利点は、乾燥される液体ＢＬＧ単離物が、乾燥工程の前に非常に高い固形分を有し得るため、水を除去する必要が少なく、乾燥操作で消費されるエネルギーがより小さいことである。
本発明者らは、ＢＬＧのアンフォールディングの程度が低いほど、噴霧乾燥の前に処理できるＢＬＧの濃度が高くなることを見出した。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも１０％重量／重量の固形分を有する。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも２０％重量／重量の固形分を有する。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも２５％重量／重量の固形分を有する。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも３０％重量／重量の固形分を有する。最も好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも３５％重量／重量の固形分を有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、１０〜６０％重量／重量の範囲の固形分を有する。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、１５〜５０％重量／重量の範囲の固形分を有する。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、２０〜４５％重量／重量の範囲の固形分を有する。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、２５〜４０％重量／重量の範囲、例えばおよそ３５％重量／重量等の固形分を有する。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも１０％重量／重量の総量のタンパク質を含む。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも２０％重量／重量の総量のタンパク質を含む。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも２５％重量／重量の総量のタンパク質を含む。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも３０％重量／重量の総量のタンパク質を含む。最も好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、少なくとも３５％重量／重量の総量のタンパク質を含む。
本発明の他の好ましい実施形態では、液体ＢＬＧ単離物は、１０〜５０％重量／重量の範囲のタンパク質の総量を含む。好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、１５〜４５％重量／重量の範囲の総量のタンパク質を含む。より好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、２０〜４０％重量／重量の範囲の総量のタンパク質を含む。さらにより好ましくは、液体ＢＬＧ単離物は、２５〜３８％重量／重量の範囲、例えばおよそ３５％重量／重量等のタンパク質の総量を含む。
本発明者らは、タンパク質含有量が、液体ＢＬＧ単離物を粉末に変換するためのエネルギー消費を低減し、それが、所与の容量を有する乾燥ユニットから得られるＢＬＧ収量を増加させることを見出した。
本発明の方法は、好ましくは、非凝集性ＢＬＧ又はホエイタンパク質溶液の他のホエイタンパク質のどちらの栄養価も損なわない穏やかな温度を使用して操作される。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、非凝集性ＢＬＧは、上記方法中に９０℃を超える温度にさらされない。好ましくは、非凝集性ＢＬＧは、上記方法中に８０℃を超える温度にさらされない。さらにより好ましくは、非凝集性ＢＬＧは、上記方法中に７５℃を超える温度にさらされない。噴霧乾燥はしばしば１５０℃を超える温度を使用するが、短い曝露時間及び同時の水の蒸発は、噴霧乾燥されたタンパク質が４０〜７０℃を超える温度を経験しないことを意味することに留意されたい。
本発明者らは、乾燥工程中の長時間の加熱が、未変性の形態であるＢＬＧの量を減少させるという徴候を見てきた。本発明の幾つかの好ましい実施形態では、乾燥工程中の熱曝露は、最大５％、好ましくは最大４％、より好ましくは最大２％、さらに好ましくは最大０．５％、さらにより好ましくは最大０．１％のＢＬＧの変性度を提供するために十分に低く保たれる。最も好ましくは、乾燥工程は、ＢＬＧの検出可能な変性を全くもたらさない。
乾燥工程はさらに、例えば、噴霧乾燥装置に統合されているか、噴霧乾燥後に実行される別個のユニット操作として、流動床乾燥を含み得る。
噴霧乾燥と流体床乾燥との組み合わせにより、乾燥する液滴が噴霧乾燥チャンバーを移動する間に除去される水の量を減らすことができ、代わりに流体床乾燥によって湿った粉末から残留水を除去する。この溶液は、噴霧乾燥のみによる乾燥よりも乾燥に必要なエネルギーが少なく、さらに、例えば、インスタント化及び／又は凝集によって、粉末を修飾することを可能にする。インスタント化は、好ましくは、レシチン又は別の有用な湿潤剤を粉末の表面に適用することによって行われる。インスタント化が適用される場合、インスタント化剤、例えば、食用油に溶解したレシチンは、典型的には、最終粉末の総重量に対して０．５〜２％重量／重量の範囲、好ましくは最終粉末全体に対して１．０〜１．５％重量／重量の範囲で添加される。
この方法はさらに、好ましくは、ＢＬＧ単離粉末を包装する工程を含む。本明細書に記載のＢＬＧ単離粉末を含む容器、好ましくは密封された容器を含む、包装されたＢＬＧ単離粉末製品。
本発明の幾つかの実施形態では、ＢＬＧ単離粉末は、容器内に密閉され、任意に不活性ガスと共に包装される。
ＢＬＧ単離粉末を保管するために、様々な容器を使用できる。好ましい容器は、例えば、バッグ、バレル、ポーチ、ボックス、缶、及び小袋である。
本発明の特に好ましい実施形態は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む乾燥ＢＬＧ単離粉末を生成する方法に関し、該方法は、以下：
ａ）ｉ）２〜４．９の範囲のｐＨ
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ、又は
ｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨ、
を有する液体ＢＬＧ単離物を提供する工程であって、当該液体ＢＬＧ単離物が、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む、工程、
ｂ）任意に、液体ＢＬＧ単離物を物理的微生物減少に供する工程、
ｃ）液体ＢＬＧ単離物を、好ましくは噴霧乾燥によって乾燥させる工程、を含み、
工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供が、以下：
−次の工程、
１）非凝集性ＢＬＧ及び少なくとも１つの追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供する工程であって、当該ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、５〜６の範囲のｐＨを有する、工程
２）過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化する工程、
３）残りのホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離する工程、
４）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば、工程３）又は５）から得られた分離されたＢＬＧ結晶を洗浄する工程、並びに
５）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば工程３）又は４）で得られたＢＬＧ結晶を再結晶化する工程、を含むプロセスによってＢＬＧ濃縮組成物を調製すること、並びに
−ＢＬＧ濃縮組成物を、少なくともＢＬＧ結晶を溶解するように処理し、それによって液体ＢＬＧ単離物を得ること、を含む。
上記の実施形態では、ＢＬＧ濃縮組成物は、工程３）から分離されたＢＬＧ結晶を含み、これらは、その後、適切なｐＨ調整によって、或いは導電率を増加させ、及び／又は温度を上昇させることによって溶解される。
本発明の特に好ましい実施形態は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む乾燥ＢＬＧ単離粉末を生成する方法に関し、該方法は、以下：
ａ）２．５〜４．９、好ましくは２．５〜４．０、さらに好ましくは３．０〜３．９の範囲のｐＨを有する液体ＢＬＧ単離物を提供する工程であって、
当該液体ＢＬＧ単離物が、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む、工程、
ｂ）任意に、液体ＢＬＧ単離物を物理的微生物減少に供する工程、
ｃ）液体ＢＬＧ単離物を、好ましくは噴霧乾燥によって乾燥させる工程、を含み、
工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供が、以下：
−次の工程、
１）非凝集性ＢＬＧ及び少なくとも１つの追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供する工程であって、当該ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、５〜６の範囲のｐＨを有する、工程
２）過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化する工程、
３）残りのホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離する工程、
４）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば、工程３）又は５）から得られた分離されたＢＬＧ結晶を洗浄する工程、並びに
５）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば工程３）又は４）で得られたＢＬＧ結晶を再結晶化する工程、を含むプロセスによってＢＬＧ濃縮組成物を調製すること、並びに
−少なくとも、ＢＬＧ濃縮組成物のｐＨを２．５〜４．９、好ましくは２．５〜４．０、さらにより好ましくは３．０〜３．９の範囲のｐＨに調製すること、を含む。
本発明の別の特に好ましい実施形態は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む乾燥ＢＬＧ単離粉末を生成する方法に関し、該方法は、以下：
ａ）６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．３〜８．０の範囲、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する液体ＢＬＧ単離物を提供する工程であって、
当該液体ＢＬＧ単離物が、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む、工程、
ｂ）任意に、液体ＢＬＧ単離物を物理的微生物減少に供する工程、
ｃ）液体ＢＬＧ単離物を、好ましくは噴霧乾燥によって乾燥させる工程、を含み、
工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供が、以下：
−次の工程、
１）非凝集性ＢＬＧ及び少なくとも１つの追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供する工程であって、当該ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、５〜６の範囲のｐＨを有する、工程
２）過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化する工程、
３）残りのホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離する工程、
４）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば、工程３）又は５）から得られた分離されたＢＬＧ結晶を洗浄する工程、並びに
５）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば工程３）又は４）で得られたＢＬＧ結晶を再結晶化する工程、を含むプロセスによってＢＬＧ濃縮組成物を調製すること、並びに
−少なくとも、ＢＬＧ濃縮組成物のｐＨを６．１〜８．５の範囲、好ましくは６．３〜８．０の範囲、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨに調製すること、を含む。
本発明の代替であるが、これもまた好ましい実施形態は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む乾燥ＢＬＧ単離粉末を生成する方法に関し、該方法は、以下：
ａ）５．０〜８．５の範囲、好ましくは６．１〜８．５、より好ましくは６．３〜８．０の範囲、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する液体ＢＬＧ単離物を提供する工程であって、
当該液体ＢＬＧ単離物が、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量、好ましくは少なくとも９０％重量／重量、さらにより好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９４％重量／重量の量のＢＬＧを含む、工程、
ｂ）任意に、液体ＢＬＧ単離物を物理的微生物減少に供する工程、
ｃ）液体ＢＬＧ単離物を、好ましくは噴霧乾燥によって乾燥させる工程、を含み、
工程ａ）の液体ＢＬＧ単離物の提供が、以下の順序で、
−次の工程、
１）非凝集性ＢＬＧ及び少なくとも１つの追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供する工程であって、当該ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、５〜６の範囲のｐＨを有する、工程
２）過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化する工程、
３）残りのホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離する工程、
４）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば、工程３）又は５）から得られた分離されたＢＬＧ結晶を洗浄する工程、並びに
５）任意に、ＢＬＧ結晶、例えば工程３）又は４）で得られたＢＬＧ結晶を再結晶化する工程、を含むプロセスによってＢＬＧ濃縮組成物を調製すること、並びに
−ＢＬＧ濃縮組成物のｐＨを、２．５〜４．９、好ましくは２．５〜４．０、さらにより好ましくは３．０〜３．９の範囲のｐＨに調整する工程、
−少なくとも、好ましくは７０〜８２℃の範囲の温度、さらにより好ましくは７０〜８０℃の範囲の温度を使用する低温殺菌を含み、その間、ｐＨが２．５〜４．９の範囲、好ましくは２．５〜４．０、さらにより好ましくは３．０〜３．９の範囲である、物理的微生物減少、
−５．０〜８．５の範囲、好ましくは６．１〜８．５、より好ましくは６．３〜８．０の範囲、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨへのｐＨ調整、
−任意に脱塩、を含む。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法は、バッチプロセスとして実施される。或いは、時には好ましくは、この方法は、セミバッチプロセスとして実施され得る。他の好ましい実施形態では、この方法は、連続プロセスとして実施される。
さらに本発明の一態様は、本明細書に記載の液体ＢＬＧ単離物に関する。液体ＢＬＧ単離物は、噴霧乾燥されたＢＬＧ単離粉末を得るために特に有用であり、さらに、液体又は非液体食物製品の製造における液体原料として使用され得る。或いは、しかしまた好ましいことに、液体ＢＬＧ単離物は、それ自体が飲料として使用され得る。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、本発明のＢＬＧ単離粉末は、本明細書に記載の方法によって得ることができる。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、本発明の液体ＢＬＧ単離物は、乾燥工程が省略されることを除いて、本明細書に記載の方法によって得ることができる。
本発明の一態様は、食物製品の製造のための原料として本明細書で定義されるＢＬＧ単離粉末又は液体ＢＬＧ単離物の使用に関する。食物製品は、例えば、飲料又はインスタント飲料粉末である。
ＢＬＧ単離粉末又は液体ＢＬＧ単離物の使用は、好ましくは、以下の効果の１つ又は２つ以上を提供する：
−乾いた口当たりのレベルの低下
−ＢＬＧ単離粉末又は液体ＢＬＧ単離物を含む得られた液体の透明性の改善
−粘度の低下
−熱処理飲料である食物製品のタンパク質濃度を高める可能性
−色の寄与が低い（本発明者らは、本発明のＢＬＧ単離物が、対応するＷＰＩ溶液よりも、例えばタンパク質飲料に対して提供する色が少ないことを観察した）。
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ単離粉末の使用は、少なくとも１０〜３６％重量／重量、より好ましくは少なくとも１５〜３５％重量／重量、さらに好ましくは２０〜３４％重量／重量、最も好ましくは２５〜３３％重量／重量のタンパク質含有量を有する飲料を調製するための原料としてであり、ここで、ＢＬＧ単離粉末は、飲料の総タンパク質の少なくとも９０％重量／重量、より好ましくは少なくとも９５％重量／重量、最も好ましくは飲料の全タンパク質に寄与する。
本発明のＢＬＧ粉末が従来のＷＰＩよりも粘度に寄与しないため、本発明のＢＬＧ粉末はさらに、高タンパク質飲料、又は高タンパク質飲料を調製するためのシェイク粉末に特に適しており、したがって、より飲用可能な飲料を提供する。
食物製品は、例えば、２〜４．７の範囲のｐＨを有し、さらに、
−乾いた口当たりのレベルの低下、
−透明性の向上、及び／又は
−タンパク質含有量の増加、の１つ又は２つ以上を有する飲料又はインスタント飲料粉末であってもよく、好ましくは、少なくとも３〜４５％重量／重量、より好ましくは１１〜４０％重量／重量、さらにより好ましくは１５〜３８％重量／重量、及び最も好ましくは２０〜３６％重量／重量の量のタンパク質含有量を含む熱処理飲料であってもよい。
本発明の１つの態様の文脈で説明された実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意されたい。
本出願で引用された全ての特許及び非特許の参照は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
次に、本発明を以下の非限定的な例でさらに詳細に説明する。
例
例１：分析の方法
例１．１：内因性トリプトファン蛍光によるタンパク質のネイティブ性の決定
トリプトファン（Ｔｒｐ）蛍光分光法は、タンパク質のフォールディング及びアンフォールディングを監視するためのよく知られたツールである。ネイティブタンパク質内に埋め込まれたＴｒｐ残基は、典型的には、折りたたまれていないタンパク質等の溶媒に曝露される位置に存在する場合よりも、３３０ｎｍ付近で最も高い蛍光発光を示す。折りたたまれていないタンパク質では、Ｔｒｐ蛍光発光の波長は典型的には、より高い波長へとシフトし、３５０ｎｍ付近で測定されることがよくある。本発明者らは、ここで、この遷移を利用して、３３０ｎｍ及び３５０ｎｍでの蛍光発光の比率を計算し、加熱温度の影響を調査することにより、熱的に誘発されたアンフォールディングを監視する。
分析は以下の工程を含む：
・飲料組成物をＭＱ水で０．６ｍｇ／ｍＬに希釈した。
・３００μｌのサンプルを、気泡を避けて白色９６ウェルプレートに移すか、又は３ｍｌを１０ｍｍの石英キュベットに移した。
・３１０〜４００ｎｍのトリプトファン蛍光発光強度を、５ｎｍスリットを使用して２９５で励起することにより上部から記録した。
・サンプルを、プレートリーダーアクセサリ（Ｇ９８１０Ａ）又はシングルキュベットホルダーを備えたＣａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を使用して２２℃で測定した。
・発光強度比を、３３０ｎｍで測定された蛍光発光強度を３５０ｎｍでの発光強度で割ること、すなわちＲ＝Ｉ３３０／Ｉ３５０によって計算し、タンパク質のネイティブ率（ｎａｔｉｖｉｔｙ）の尺度として使用した。
ｏ少なくとも１．１１のＲは、優勢なネイティブＢＬＧ立体構造を表し、
ｏ１．１１未満のＲは、少なくとも部分的なアンフォールディング及び凝集を報告する。
例１．２：ＰＨ３．９での熱安定性
ｐＨ３．９での熱安定性：
ｐＨ３．９での熱安定性は、ｐＨ３．９での長時間の低温殺菌時にタンパク質組成物が透明な状態を維持する能力の尺度である。
ｐＨ３．９での熱安定性は、ｐＨ３．９の水溶液を形成し、試験する粉末又は液体のサンプルを水と混合することにより６．０％重量／重量タンパク質を含め（又は、希薄な液体の場合、代替的には、低温蒸発によって濃縮する）、最小限の０．１Ｍ ＮａＯＨ又は０．１Ｍ ＨＣｌでｐＨを３．９に調整することによって決定される。
ｐＨを調整した混合物を３０分間静置した後、２５ｍＬの混合物を３０ｍＬの薄壁ガラス試験管に移す。７５．０℃の水浴に浸漬することで３００秒間、７５．０℃に加熱する。加熱後直ちにガラス試験管を氷浴に移して１〜５℃に冷却し、熱処理されたサンプルの濁度を、例１．７に従って測定する。
例１．３：ホエイタンパク質組成物のタンパク質変性度の決定
変性ホエイタンパク質は、ｐＨ４．６未満又はｐＨ４．６超のｐＨ値よりもｐＨ４．６での溶解度が低いことが知られているため、ホエイタンパク質組成物の変性度は、溶液中のタンパク質が安定しているｐＨでのタンパク質の総量に対するｐＨ４．６での可溶性タンパク質の量を測定することによって決定される。
より具体的には、ホエイタンパク質の場合、分析されるホエイタンパク質組成物（例えば、粉末又は水溶液）は、以下に変換される：
−総タンパク質５．０％（重量／重量）を含み、ｐＨが７．０又は３．０の第１の水溶液、及び
−総タンパク質５．０％（重量／重量）を含み、ｐＨが４．６の第２の水溶液。
ｐＨ調整を、３％（重量／重量）ＮａＯＨ（水溶液）又は５％（重量／重量）ＨＣｌ（水溶液）を使用して行う。
第１の水溶液の総タンパク質含有量（ＰｐＨ７．０又は３．０）を、例１．５に従って決定する。
第２の水溶液を室温で２時間保管し、続いて３０００ｇで５分間遠心分離する。上清のサンプルを回収し、例１．５に従って分析して、上清中のタンパク質濃度（ＳｐＨ４．６）を得る。
ホエイタンパク質組成物のタンパク質変性度、Ｄを次のとおり計算する：
Ｄ＝（（ＰｐＨ７．０又は３．０−ＳｐＨ４．６）／ＰｐＨ７．０又は３．０）＊１００％
例１．４逆相ＵＰＬＣ分析を使用したタンパク質変性の決定（ＰＨ４．６酸沈殿を伴う）。
ＢＬＧサンプル（非加熱参照及び加熱ＢＬＧ飲料組成物等）をＭＱ水で２％に希釈した。５ｍｌのタンパク質溶液、１０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ、４ｍｌの１０％酢酸、及び６ｍｌの１．０Ｍ ＮａＯＡｃを混合し、２０分間攪拌して、ｐＨ４．６付近で変性タンパク質を沈殿凝集させる。溶液を０．２２μｍフィルターで濾過し、凝集物及び非ネイティブタンパク質を除去する。
全てのサンプルを、研磨水（ｐｏｌｉｓｈｅｄ ｗａｔｅｒ）を加えることによって同じ程度の希釈に供した。
各サンプルについて、ＵＰＬＣカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４；３００Å；１．７μｍ；１５０×２．１ｍｍ）を備えたＵＰＬＣシステムに同じ容量を充填し、２１４ｎｍで検出した。
サンプルを、次の条件を使用して流した：
バッファーＡ：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、０．１％重量／重量ＴＦＡ
バッファーＢ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、０．１％重量／重量ＴＦＡ
流量：０．４ｍｌ／分
勾配：０〜６．００分 ２４〜４５％Ｂ；６．００〜６．５０分 ４５〜９０％Ｂ；６．５０〜７．００分 ９０％Ｂ；７．００〜７．５０分 ９０〜２４％Ｂ、及び７．５０〜１０．００分 ２４％Ｂ。
タンパク質標準（Ｓｉｇｍａ Ｌ０１３０）に対するＢＬＧピークの面積を使用して、サンプル中のネイティブＢＬＧの濃度を決定した（５レベルの検量線）
サンプルをさらに希釈し、線形範囲外の場合は再注入した。
例１．５：総タンパク質の決定
サンプルの総タンパク質含有量（真のタンパク質）を、以下によって決定する：
１）ＩＳＯ ８９６８−１／２｜ＩＤＦ ０２０−１／２−牛乳−窒素含有量の決定−第１／２部：ケルダール法を使用した窒素含有量の決定に準拠したサンプルの全窒素の窒素含有量の決定。
２）ＩＳＯ ８９６８−４｜ＩＤＦ ０２０−４−乳−窒素含有量の決定−第４部：非タンパク質窒素含有量の決定に準拠したサンプルの非タンパク質窒素の決定。
３）タンパク質の総量を（ｍ総窒素−ｍ非タンパク質−窒素）＊６．３８として計算する。
例１．６：非凝集性ＢＬＧ、ＡＬＡ、及びＣＭＰの決定
非凝集性アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、及びカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）の含有量を、それぞれ０．４ｍｌ／分のＨＰＬＣ分析で分析した。２５マイクロＬの濾過サンプルを、溶離液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水４６５ｇ、アセトニトリル４１７．３ｇ及びトリフルオロ酢酸１ｍｌ）で平衡化したプレカラムＰＷｘｌ（６ｍｍ×４ｃｍ、Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）を取り付けて、連続して接続された２つのＴＳＫｇｅｌ３０００ＰＷｘｌ（７．８ｍｍ ３０ｃｍ、Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）カラムに注入し、２１０ｎｍのＵＶ検出器を使用した。
ネイティブアルファ−ラクトアルブミン（Ｃアルファ）、ベータ−ラクトグロブリン（Ｃベータ）、及びカゼイノマクロペプチド（ＣＣＭＰ）の含有量の定量的決定を、対応する標準タンパク質で得られたピーク面積をサンプルのピーク面積と比較することによって行った。
追加のタンパク質（非ＢＬＧタンパク質）の総量を、総タンパク質の量（例１．５に従って決定）からＢＬＧの量を差し引くことによって決定した。
例１．７：濁度の測定
濁度は、空気中の煙と同様に、一般に肉眼では見えない多数の粒子によって引き起こされる流体の曇り又はもやである。
濁度は比濁濁度単位（ＮＴＵ）で測定される。
２０ｍｌの飲料／サンプルをＮＴＵガラスに添加し、Ｔｕｒｂｉｑｕａｎｔ（登録商標） ３０００ ＩＲ濁度計に入れた。ＮＴＵ値を安定化後に測定し、２回繰り返した。
例１．８：粘度の決定
液体の粘度は、ＧｉｌｓｏｎのＶｉｓｃｏｍａｎ粘度計又は同等の粘度計を使用して測定され、３００ｓ−１の剪断速度で報告される。特に明記されていない限り、サンプルは測定前に１５℃に平衡化され、その温度で測定される。
特に明記しない限り、粘度は３００ｓ−１の剪断速度における単位センチポアズ（ｃＰ）で表される。測定されたｃＰ値が高いほど、粘度が高くなる。
例１．９：色の決定
色彩色差計（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ、ＣＲ−４００）を用いて色を測定した。１５ｇのサンプルを小さなペトリ皿（５５×１４．２ｍｍ、ＶＷＲカタログ番号３９１−０８９５）に追加して、気泡の形成を回避した。サンプルのタンパク質含有量は、６．０重量／重量％タンパク質以下に標準化した。
クロマメーターを白色の較正プレート（Ｎｏ．１９０３３１７７）に較正した。光源をＤ６５に設定し、オブザーバーを２度に設定した。色（ＣＩＥＬＡＢ色空間、ａ＊値、ｂ＊値、Ｌ＊値）を、ペトリ皿の様々な場所での３つの個別の読み取り値の平均として、懸濁液を覆う蓋をして測定した。
脱塩水基準の値は次のとおりである。
Ｌ＊３９．９７±０．３
ａ＊０．００±０．０６
ｂ＊−０．２２±０．０９
測定値を、脱塩水測定値に基づいてデルタ／差の値に変換した。
デルタＬ＊＝Ｌ６．０重量／重量％タンパク質に標準化したサンプル＊−Ｌ脱塩水＊、室温で測定。
デルタａ＊＝ａ６．０重量／重量％タンパク質に標準化したサンプル＊−ａ脱塩水＊、室温で測定。
デルタｂ＊＝ｂ６．０重量／重量％タンパク質に標準化したサンプル＊−ｂ脱塩水＊、室温で測定。
サンプルは６．０重量／重量％タンパク質以下に標準化されている。
Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間（ＣＩＥＬＡＢ空間とも称される）は、１９７６年に国際照明委員会（ＣＩＥ）によって定義された均一色空間の１つであり、明度及び色相を定量的に報告するために使用された（ＩＳＯ １１６６４−４：２００８（Ｅ）／ＣＩＥ Ｓ ０１４−４／Ｅ：２００７）。
この空間では、Ｌ＊は明度（０〜１００の値）を示し、Ｌ＊＝０で最も暗い黒、Ｌ＊＝１００で最も明るい白を示す。
カラーチャネルａ＊及びｂ＊は、ａ＊＝０及びｂ＊＝０での真のニュートラルグレー値を表す。ａ＊軸は緑と赤の成分を表し、緑は負の方向、赤は正の方向である。ｂ＊軸は青と黄色の成分を表し、負の方向が青、正の方向が黄色である。
例１．１０飲料安定性試験／不溶性タンパク質物質
３０００ｇで５分間遠心分離した際に、加熱されたサンプル中の総タンパク質の１５％未満が沈殿した場合、ホエイタンパク質飲料の組成は安定していると見なされた：
・およそ２０ｇのサンプルを遠心管に加え、３０００ｇで５分間遠心分離した。
・遠心分離前のタンパク質及び遠心分離後の上清のケルダール分析を使用して、タンパク質の回収率を定量した。例１．５を参照されたい。
タンパク質の損失を計算する：
Figure 2021530976
このパラメーターは、不溶性タンパク質物質のレベルと称されることもあり、液体サンプルと粉末サンプルの両方の分析に使用できる。サンプルが粉末の場合、１０ｇの粉末を９０ｇの脱塩水に懸濁し、２２℃で１時間穏やかに攪拌しながら水和させる。遠心管に対しておよそ２０ｇのサンプル（例えば、液体サンプル又は懸濁粉末サンプル）を３０００ｇで５分間遠心分離する。遠心分離前のタンパク質（Ｐｔｏｔａｌ）及び遠心分離後の上清（Ｐ３０００×ｇ）のケルダール分析を使用して、例１．５に従ってタンパク質の回収率を定量した。
不溶性タンパク質物質の量を計算する：
Figure 2021530976
例１．１１：官能評価
熱処理された飲料調製物は、記述的な官能評価を受けた。飲料調製物は、プレート熱交換器を使用して加熱に供した。
１容量のサンプルを１容量の水と混合し、非加熱ホエイタンパク質単離物と比較し、乳酸及びクエン酸も最終試飲セッションの前に属性リストを作成するために使用する。
Figure 2021530976
クラッカー、白茶、メロン、及び水を使用して、各サンプルの間に参加者の口を浄化した。
周囲温度（２０〜２５℃）の試験サンプル１５ｍＬを小さなカップで提供した。
試験サンプルは、無作為化された順序で３つの異なるブロックで３回にわたって１０名の個人にそれぞれ提供された。
属性（上記の表を参照）を、０＝低強度、１５＝高強度で１５ｃｍスケールで評価した。
統計分析は、「Ｐａｎｅｌｃｈｅｃｋ」ソフトウェアで、複数の反復に対して３元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して実施した。サンプルを固定し、パネルを無作為に設定した。
最小の有意差値（文字に関連付けられた群のペアワイズ比較）を意味するボンフェローニ補正を使用して、サンプル間の有意差を評価した。
例１．１２：イメージングによる透明度の決定
飲料調製物の写真を、「ｌｏｒｅｍ ｉｐｓｕｍ」のテキストが書かれた紙片に触れている濁度ＮＴＵ測定バイアルにサンプルを入れることによって行った。スマートフォンを使用してバイアルを撮影し、本発明者らは、バイアルを通してテキストがはっきりと観察できるかどうかを評価した。
例１．１３：灰分含有量の決定
食物製品の灰分を、ＮＭＫＬ １７３：２００５「食品中の灰分重量計測式決定」に従って測定する。
例１．１４：導電率の決定
水溶液の「導電率」（「比導電率」と称されることもある）は、溶液が電気を伝導する能力の尺度である。導電率は、例えば、２つの電極間の溶液のＡＣ抵抗を測定することによって決定され、結果は典型的には、ミリジーメンス／ｃｍ（ｍＳ／ｃｍ）の単位で示される。導電率は、例えば、ＥＰＡ（米国環境保護庁）の方法番号１２０．１に従って測定することができる。
本明細書に記載されている導電率の値は、別段の指定がない限り、２５℃に正規化されている。
導電率は、導電率計（テトラコン３２５電極を備えたＷＴＷ Ｃｏｎｄ ３２１０）で測定される。
システムは、使用前にマニュアルに記載されているように較正されている。電極は、局所的な希釈を避けるために、測定が行われるのと同じタイプの媒質でよくすすいでおく。測定が行われる領域が完全に水没するように、電極を媒質に下げる。次いで、電極を攪拌して、電極に閉じ込められた空気を全て除去する。次いで、電極を、安定した値が表示から取得され、記録されるまで静止状態に保つ。
例１．１５：溶液の全固形分の決定
溶液の全固形分は、ＮＭＫＬ １１０第２版、２００５（全固形分（水）−乳及び乳製品の重量分析）に従って決定することができる。ＮＭＫＬは、「ヨーロッパ標準分析法と食品分析に関する北欧委員会（Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｍｅｔｏｄｉｋｋｏｍｉｔｅ ｆｏｒ Ｎａｅｒｉｎｇｓｍｉｄｌｅｒ）」の略語である。
溶液の含水量は、１００％から全固形分の相対量（％重量／重量）を引いたものとして計算できる。
例１．１６：ＰＨの決定
全てのｐＨ値は、ｐＨガラス電極を使用して測定され、２５℃に正規化されている。
ｐＨガラス電極（温度補償付き）は、使用前に注意深くすすぎ、使用前に較正する。
サンプルが液体の場合、ｐＨは２５℃の溶液中で直接測定される。
サンプルが粉末の場合、１０グラムの粉末を９０ｍｌの脱塩水に室温で激しく攪拌しながら溶解する。次いで、溶液のｐＨを２５℃で測定する。
例１．１７：緩み密度及びかさ密度の決定
乾燥粉末の密度は、特定の条件下で特別なＳｔａｍｐｆ体積計（メスシリンダー）を使用して分析される粉末の重量と体積の関係として定義される。密度は典型的には、ｇ／ｍＬ又はｋｇ／Ｌで表される。
この方法では、乾燥粉末のサンプルをメスシリンダーに詰め込む。指定された回数のタッピングの後、製品の体積を読み取り、密度を計算する。
この方法により、以下の３種類の密度を定義ですることができる：
・充填密度、これは、指定されたメスシリンダーに移された後の粉末の体積で割った質量である。
・緩み密度、この規格で指定された条件に従って、１００回のタッピング後の粉末の体積で割った質量である。
・かさ密度、この規格で指定された条件に従って、６２５回のタッピング後の粉末の体積で割った質量である。
この方法では、０〜２５０ｍｌに目盛りを付けた、２５０ｍｌのメスシリンダー、重量１９０±１５ｇ（Ｊ．Ｅｎｇｅｌｓｍａｎｎ Ａ．Ｇ．６７０５９ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ／Ｒｈ）の特殊なメスシリンダー、及び例えば、Ｊ．エンゲルスマンＡ．Ｇ．のＳｔａｍｐｆ体積計を使用する。
乾燥製品の緩み密度及びかさ密度を、以下の手順で決定する。
前処理：
測定するサンプルを室温で保管する。
次いで、容器を繰り返し回転及び転倒させてサンプルを完全に混合する（粒子の粉砕を避ける）。容器は２／３を超えて満たされていない。
手順：
１００．０±０．１グラムの粉末を量り、メスシリンダーに移す。容量Ｖ０をｍｌで読み取る。
１００ｇの粉末がシリンダーに収まらない場合は、量を５０又は２５グラムに減らす必要がある。
メスシリンダーをＳｔａｍｐｆ体積計に固定し、これを１００回をタップする。スパチュラで表面を平らにし、容量Ｖ１００をｍｌで読み取る。
タブの数を６２５（１００タップを含む）に変更する。軽くたたいた後、表面を水平にし、容量Ｖ６２５をｍｌで読み取る。
密度の計算：
次の式に従って、ｇ／ｍＬで表される緩み密度及びかさ密度を計算する：
かさ密度＝Ｍ／Ｖ
式中、Ｍは計量されたサンプルをグラムで示し、Ｖは６２５回のタッピング後の容量をｍｌで示す。
例１．１８：粉末の含水量の決定
食物製品の含水量は、ＩＳＯ ５５３７：２００４（粉乳−含水量の測定（基準法））に従って測定される。ＮＭＫＬは、「ヨーロッパ標準分析法と食品分析に関する北欧委員会（Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｍｅｔｏｄｉｋｋｏｍｉｔｅ ｆｏｒ Ｎａｅｒｉｎｇｓｍｉｄｌｅｒ）」の略語である。
例１．１９：カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、リンの量の測定（ＩＣＰ−ＭＳ法）
カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、及びリンの総量は、サンプルを最初にマイクロ波分解を使用して分解し、次いでミネラル（複数の場合がある）の総量がＩＣＰ装置を使用して決定される手順を使用して決定される。
装置：
マイクロ波はＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ製であり、ＩＣＰはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ製のＯｐｔｉｍａ ２０００ＤＶである。
材料：
１Ｍ ＨＮＯ３
２％ＨＮＯ３中のイットリウム
５％ＨＮＯ３中のカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、及びリンの適切な標準
前処理：
一定量の粉末を量り取り、その粉末をマイクロ波分解チューブに移す。５ｍｌの１Ｍ ＨＮＯ３を添加する。電子レンジの指示に従って、電子レンジでサンプルを分解する。分解されたチューブをドラフトチャンバーに入れ、蓋を外して揮発性のヒュームを蒸発させる。
測定手順：
既知量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して、前処理したサンプルをＤｉｇｉＴＵＢＥに移す。２％ＨＮＯ３中のイットリウムの溶液を分解チューブに添加し（５０ｍｌの希釈サンプルあたり約０．２５ｍｌ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して既知の容量に希釈する。製造元が説明する手順を使用して、ＩＣＰでサンプルを分析する。
ブラインドサンプルは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して、１０ｍｌの１Ｍ ＨＮＯ３及び０．５ｍＬのイットリウム２％ＨＮＯ３溶液の混合物を最終容量１００ｍＬに希釈することによって調製される。
予想されるサンプル濃度を挟む濃度を持つ少なくとも３つの標準サンプルを調製する。
例１．２０：フロシン値の決定：
フロシン値は、“Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｕｒｏｓｉｎｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｉｎｆａｎｔ Ｃｅｒｅａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”，Ｇｕｅｒｒａ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９（１９９９）１７１−１７６に記載されるとおりに決定され、タンパク質の総量は例１．５に従って決定される。フロシン値は、タンパク質１００ｇあたりｍｇ単位のフロシンで報告される。
例１．２１：液体中のＢＬＧの結晶化度の決定
以下の方法を使用して、ｐＨが５〜６の範囲の液体中のＢＬＧの結晶化度を決定する。
ａ）問題の液体のサンプル１０ｍＬを、孔径０．４５ミクロンのＣＡメンブレンを備えたＭａｘｉ−Ｓｐｉｎフィルターに移す。
ｂ）遠心分離機を２℃に保って、直ちにフィルターを１５００ｇで５分間回転させる。
ｃ）スピンフィルターの被保持物側に２ｍｌの冷Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２℃）を加え、直ちに、遠心分離機を２℃に冷却したまま、フィルターを１５００ｇで５分間スピンし、透過液（透過液Ａ）を収集して、容量を測定し、例１．６に概説されている方法を使用してＨＰＬＣを介してＢＬＧ濃度を決定する。
ｄ）フィルターの被保持物側に４ｍＬの２Ｍ ＮａＣｌを加え、すばやく攪拌し、混合物を２５℃で１５分間放置する。
ｅ）直ちにフィルターを１５００ｇで５分間回転させ、透過液を収集する（透過液Ｂ）
ｆ）例１．６に概説されている方法を使用して、透過液Ａ及び透過液ＢのＢＬＧの総重量を決定し、その結果を重量パーセントではなくＢＬＧの総重量に変換する。透過液Ａ中のＢＬＧの重量はｍ透過物Ａと称され、透過液ＢのＢＬＧの重量はｍ透過物Ｂと称される。
ｇ）ＢＬＧに関する液体の結晶化度は、次のように決定される：
結晶化度＝ｍ透過物Ｂ／（ｍ透過物Ａ＋ｍ透過物Ｂ）＊１００％
例１．２２：乾燥粉末中のＢＬＧの結晶化度の決定
この方法は、乾燥粉末中のＢＬＧの結晶化度を決定するために使用される。
ａ）５．０グラムの粉末サンプルを２０．０グラムの冷Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２℃）と混合し、２℃で５分間放置する。
ｂ）問題の液体のサンプルを０．４５ミクロンのＣＡメンブレンを備えたＭａｘｉ−Ｓｐｉｎフィルターフィルターに移す。
ｃ）遠心分離機を２℃に保って、直ちに、フィルターを１５００ｇで５分間回転させる。
ｄ）スピンフィルターの被保持物側に２ｍＬの冷Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２℃）を添加し、直ちにフィルターを１５００ｇで５分間回転させ、透過液（透過液Ａ）を収集し、容量を測定してＢＬＧを決定する。例１．６に概説されている方法を使用してＨＰＬＣを介して濃縮し、結果を重量パーセントではなくＢＬＧの総重量に変換する。透過液ＡのＢＬＧの重量は、ｍ透過液Ａと称される。
ｆ）次いで、粉末中のＢＬＧの結晶化度を、次の式を使用して計算する：
Figure 2021530976
式中、ｍＢＬＧ合計は、工程ａ）の粉末サンプル中のＢＬＧの総量である。
粉末サンプルのＢＬＧの総量が不明な場合は、別の５ｇの粉末サンプル（同じ粉末供給源に由来する）を２０．０グラムのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に懸濁し、ＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを７．０に調整し、混合物を攪拌しながら２５℃で１時間放置し、最後に例１．６を使用して粉末サンプルのＢＬＧの総量を決定することにより、これを決定してもよい。
例１．２３：ＵＦ透過導電率の決定
１５ｍＬのサンプルを３ｋＤａカットオフ（３０００ＮＭＷＬ）のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットに移し、４０００ｇで２０〜３０分間、又は導電率を測定するのに十分な容量のＵＦ透過液がフィルターユニットの下部に蓄積するまで遠心分離する。遠心分離直後に導電率を測定する。サンプルの取り扱い及び遠心分離は、サンプルの供給源の温度で行われる。
例１．２４：粉末中の乾燥ＢＬＧ結晶の検出
粉末中の乾燥ＢＬＧ結晶の存在は、次の方法でされ得る：
分析する粉末のサンプルを再懸濁し、４℃の温度の脱塩水に２部の水及び１部の粉末の重量比で穏やかに混合し、４℃で１時間再水和させる。
再水和されたサンプルを、結晶の存在を識別するために顕微鏡検査によって調べ、好ましくは複屈折を検出するために平面偏光を使用する。
結晶様物質を分離し、結晶構造の存在を確認するためＸ線結晶構造解析に供し、また、好ましくは結晶格子（空間群及び単位格子の寸法）がＢＬＧ結晶の格子に対応していることも確認する。
分離された結晶様物質の化学組成を分析して、その固体が主にＢＬＧで構成されていることを確認する。
例１．２５：乳糖の総量の決定
乳糖の総量は、ＩＳＯ ５７６５−２：２００２（ＩＤＦ ７９−２：２００２）「粉乳、乾燥アイスミックス、及びプロセスチーズ−乳糖含有量の測定−第２部：乳糖のガラクトース部分を利用した酵素法」に従って測定される。
例１．２６：炭水化物の総量の決定：
炭水化物の量は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔｏｔａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ＭＡＫ１０４−１ＫＴ）を使用して決定され、このキットでは、炭水化物が加水分解され、フルフラール及びヒドロキシフルフラールに変換されて、これらが４９０ｎｍで分光光度的にモニターされるクロマゲンに変換される。
例１．２７：脂質の総量の決定
脂質の量は、ＩＳＯ １２１１：２０１０（脂肪含有量の決定−Ｒｏｓｅ−Ｇｏｔｔｌｉｅｂ重量分析法）に従って決定される。
例１．２８：ブリックスの決定
ブリックス測定を、研磨水（逆浸透によって濾過された水で最大０．０５ｍＳ／ｃｍの導電率が得られる）に対して較正されたＰＡＬ−αデジタル手持ち屈折計（Ａｔａｇｏ）を使用して行った。
およそ５００μｌのサンプルを装置のプリズム面に移し、測定を開始した。測定値を読み取り、記録した。
ホエイタンパク質溶液のブリックスは、全固形分（ＴＳ）の含有量に比例し、ＴＳ（％重量／重量）はおよそブリックス＊０．８５である。
ブリックスは、ブリックス（Ｂｒｉｘ）度又はＢｒｉｘと称されることがある。
例１．２９ラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼの測定
ラクトフェリンの濃度は、Ｓｏｙｅｕｒｔ ２０１２で概説されているＥＬＩＳＡイムノアッセイによって決定される（Ｓｏｙｅｕｒｔ ｅｔ ａｌ；Ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｍａｓｔｉｔｉｓ；Ａｎｉｍａｌ（２０１２），６：１１，ｐｐ１８３０−１８３８）。
ラクトペルオキシダーゼの濃度は、市販のウシラクトペルオキシダーゼキットを使用して決定される。
例１．３０：コロニー形成単位の数の決定
サンプル１グラムあたりのコロニー形成単位の数の決定は、ＩＳＯ ４８３３−１：２０１３（Ｅ）：食物製品及び動物の飼料原料の微生物学−微生物の列挙のための水平法−３０℃でのコロニーカウント手法に従って実行される。
例１．３１：ＢＬＧ、ＡＬＡ、及びＣＭＰの総量の決定
この手順は、ＡＬＡ、ＢＬＧ、ＣＭＰ等のタンパク質、及び任意に、組成物中の他のタンパク質種を定量分析するための液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法である。例１．６の方法とは反対に、本方法はまた、凝集物中に存在するタンパク質を測定し、したがって、問題の組成物中のタンパク質種の総量の測定値を提供する。
分離モードはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）であり、この方法ではサンプル溶媒及びＨＰＬＣ移動相の両方として６ＭグアニジンＨＣＩバッファーを使用する。メルカプトエタノールは、タンパク質又はタンパク質凝集物のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）を還元して、折りたたまれていない単量体構造を作成する還元剤として使用される。
サンプル前処理は、移動相に１０ｍｇ相当のタンパク質を溶解することで容易に達成される。
２つのＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．７ｍｍ×３０．０ｃｍ）カラム（ＧＰＣカラム）及びガードカラムを直列に配置して、原材料中の主要なタンパク質の適切な分離を達成する。
溶出された分析対象物を、ＵＶ検出（２８０ｎｍ）によって検出及び定量する。
機器／材料：
１．手動シールワッシャー付きＨＰＬＣポンプ５１５（Ｗａｔｅｒｓ）
２．ＨＰＬＣポンプコントローラーモジュールＩＩ（Ｗａｔｅｒｓ）
３．オートサンプラー７１７（Ｗａｔｅｒｓ）
４．デュアル吸光度検出器２４８７（Ｗａｔｅｒｓ）
５．定量的レポートを生成できるコンピュータソフトウェア（Ｅｍｐｏｗｅｒ ３、Ｗａｔｅｒｓ）
６．分析カラム：２つのＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、Ｐ／Ｎ：０８５４１）。
ガードカラム：ＴＳＫ−Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ ＳＷｘＬ（６．０×４０ｍｍ、Ｐ／Ｎ：０８５４３）。
７．超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎ ５２００）
０．２μｍ酢酸セルロースメンブレンを備えた８．２５ｍｍシリンジフィルター（５１４−００６０、ＶＷＲ）
手順：
移動相：
Ａ．ストック緩衝液。
１．１０００ｍｌのビーカーに５６．６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４、及び２．９ｇのＥＤＴＡを量り入れる。
８００ｍｌの水に溶かす。
２．ｐＨを測定し、必要に応じてＨＣｌ（ｐＨを下げる）又はＮａＯＨ（ｐＨを上げる）で７．５±０．１に調整する。
３．１０００ｍｌのメスフラスコに移し、水で希釈して容量を調整する。
Ｂ．６ＭグアニジンＨＣｌ移動相。
１．２０００ｍＬのビーカーに１１４６ｇのグアニジンＨＣｌを量り取り、２００ｍｌのストック緩衝液（Ａ）を加える。
２．マグネチックスターラー（５０℃）で混合しながら、この溶液を水で約１６００ｍｌに希釈する。
３．ＮａＯＨでｐＨを７．５±０．１に調整する。４．２０００ｍｌのメスフラスコに移し、水で希釈して容量を調整する。５．０．２２μｍメンブレンフィルターを備えた溶媒濾過装置を使用して濾過する。
較正標準。
定量する各タンパク質の較正標準を、以下の方法で調製する：
１．約２５ｍｇのタンパク質参照標準を１０ｍｌに正確に（０．０１ｍｇまで）計量し、
メスフラスコに入れ、１０ｍｌの水に溶かす。
これは、タンパク質のタンパク質ストック標準液（Ｓ１）である。
２．２００μｌのＳ１を２０ｍｌメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これは、低希釈標準溶液ＷＳ１である。
３．５００μＬのＳ１を１０ｍｌメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これは標準溶液ＷＳ２である。
４．５００μＬのＳ１を５ｍｌメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これは標準溶液ＷＳ３である。
５．７５０μＬのＳ１を５ｍｌメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これは標準ソリューションＷＳ４である。
６．１．０ｍＬのＳ１を５ｍＬメスフラスコにピペットで入れ、移動相で容量まで希釈する。
これは、高希釈標準溶液ＷＳ５である。
７．目盛り付き使い捨てピペットを使用して、１．５ｍＬのＷＳ１〜５を別々のバイアルに移す。
各バイアル及びキャップに１０μＬの２−メルカプトエタノールを加える。溶液を１０秒間ボルテックスする。
標準液を周囲温度で約１時間置く。
８．０．２２μｍの酢酸セルロースシリンジフィルターを使用して標準液を濾過する。
タンパク質の純度は、ケルダール（Ｎ×６．３８）を使用して測定し、ＨＰＬＣを使用して標準溶液ＷＳ５からの面積％を測定する。
タンパク質（ｍｇ）＝「タンパク質標準重量」（ｍｇ）×Ｐ１×Ｐ２
Ｐ１＝Ｐ％（ケルダール）
Ｐ２＝タンパク質面積％（ＨＰＬＣ）
サンプルの調製
１．元のサンプルのタンパク質２５ｍｇに相当する量を２５ｍＬメスフラスコに量り取る。
２．およそ２０ｍＬの移動相を加え、サンプルを約３０分間溶解させる。
３．移動相を容量に加え、１６７μＬの２−メルカプトエタノールを２５ｍｌのサンプル溶液に加える。
４．約３０分間超音波処理し、その後、サンプルを周囲温度で約１時間半放置する。
５．溶液を混合し、０．２２μｌの酢酸セルロースシリンジフィルターを使用して濾過する。
ＨＰＬＣシステム／カラム
カラムの平衡化
１．ＧＰＣガードカラムと２つのＧＰＣ分析カラムとを直列に接続する。
新しいカラムは通常、リン酸塩緩衝液中で出荷される。
２．新しいカラムに３０〜６０分間０．１ｍＬ／分から０．５ｍＬ／分で徐々に水を流す。
約１時間フラッシュを続ける。
３．流量を０．５ｍＬ／分から０．１ｍＬ／分に徐々に下げ、
リザーバーにおいて移動相に交換する。
４．圧力ショックを回避するために、ポンプの流量を３０〜６０分間で０．１ｍＬ／分から０．５ｍＬ／分まで徐々に増やし、０．５ｍＬ／分のままにする。
５．１０種類のサンプルを注入してカラムを飽和させ、ピークが溶出するのを待つ。
これは、カラムのコンディショニングに役立つ。
この工程は、次の注入の前に各注入が完了するのを待つ必要はなく、行われる。
６．移動相で少なくとも１時間平衡化する。
結果の計算
定量されるタンパク質、例えばアルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリン、及びカゼイノマクロペプチドの含有量の定量的決定を、対応する標準タンパク質で得られたピーク面積をサンプルのピーク面積と比較することによって行った。結果は、特定のタンパク質／１００ｇの元のサンプル、又は元のサンプルの重量に対する特定のタンパク質の重量パーセントとして報告される。
例２：噴霧乾燥された酸性ＢＬＧ単離粉末の製造
ホエイタンパク質フィード
標準的なチーズ製造プロセスからのスイートホエイに由来するラクトース枯渇ＵＦ保持液は１．２ミクロンのフィルターで濾過されており、ＢＬＧ結晶化プロセスのフィードとして使用される前にＳｙｎｄｅｒ ＦＲメンブレンにより脂肪が減少されていた。フィードの化学組成を表１に示す。本発明者らは、この例で言及されているＢＬＧ、ＡＬＡ等の特定のタンパク質の全ての重量パーセントが、総タンパク質に対する非凝集性タンパク質の重量パーセントに関係していることを認識している。
コンディショニング
スイートホエイフィードを、全固形分２１％（ＴＳ）±５のフィード濃度まで、４６ミルのスペーサー、フィード圧力１．５〜３．０バールで、Ｋｏｃｈ ＨＦＫ−３２８タイプのメンブレン（７０ｍ２メンブレン）を使用し、またダイアフィルトレーション媒質として研磨水（逆浸透によって濾過された水で、最大０．０５ｍＳ／ｃｍの導電率が得られる）を使用して、２０℃の限外濾過セットアップ上でコンディショニングした。次いで、ｐＨがおよそ５．５になるようにＨＣｌを加えることによってｐＨを調整した。保持液の導電率の低下が２０分間にわたって０．１ｍＳ／ｃｍを下回るまで、ダイアフィルトレーションを続けた次に、透過液フローが１．４３Ｌ／時／ｍ２を下回るまで、保持液を濃縮した。濃縮保持液の第１のサンプルを採取し、３０００ｇで５分間遠心分離した。第１のサンプルの上清をＢＬＧ収量の測定に使用した。
結晶化
濃縮された保持液を３００Ｌの結晶化タンクに移し、そこで再水和され噴霧乾燥されたＢＬＧ結晶から作られた純粋なＢＬＧ結晶材料と共にシードした。続いて、シードされたホエイタンパク質溶液を、２０℃からおよそ６℃まで、およそ１０時間かけて冷却し、ＢＬＧ結晶を形成して成長させた。
冷却後、結晶を含むホエイタンパク質溶液のサンプル（第２のサンプル）を採取し、３０００ｇで５分間の遠心分離によってＢＬＧ結晶を分離した。第２のサンプルに由来する上清及び結晶ペレットを以下に説明するようにＨＰＬＣ分析に供した。結晶化の収率を、以下に概説するように計算し、５７％と決定した。
Figure 2021530976
ＨＰＬＣを使用したＢＬＧ収率の決定：
第１及び第２のサンプルの上清を研磨水を加えることによって同程度に希釈し、希釈した上清を０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾過及び希釈した上清ごとに、同じ容量をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＪｕｐｉｔｅｒ（登録商標）５μｍ Ｃ４ ３００Å、ＬＣカラム２５０×４．６ｍｍ、Ｅａ．を備えたＨＰＬＣシステムに充填し、２１４ｎｍで検出した。
サンプルを、以下の条件を使用して流した：
バッファーＡ：ＭｉｌｌｉＱ水、０．１％重量／重量ＴＦＡ
バッファーＢ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、０．０８５％重量／重量ＴＦＡ
流量：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
勾配：０〜３０分 ８２〜５５％Ａ及び１８〜４５％Ｂ；３０〜３２分 ５５〜１０％Ａ及び４５〜９０％Ｂ；３２．５〜３７．５分 １０％Ａ及び９０％Ｂ；３８〜４８分 １０〜８２％Ａ及び９０〜１８％Ｂ。
データ処理：
両方の上清を同じ方法で処理したため、ＢＬＧピークの面積を直接比較して、相対収量を計算することができる。結晶にはＢＬＧのみが含まれており、サンプルは全て同じ方法で処理されているため、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）の濃度、したがってＡＬＡの面積は全てのサンプルで同じはずである。したがって、結晶化前後のＡＬＡの面積は、相対収量を計算する際の補正係数（ｃｆ）として使用される。
Figure 2021530976
相対収量を、次の式で計算する。
Figure 2021530976
ＢＬＣ結晶の酸溶解
結晶化タンクからの残りの材料を、デカンターを使用して、３５０ｇ、２７５０ＲＰＭ、６４スペーサーにより１５０ＲＰＭ差、及び７５Ｌ／時のフィードフローで分離した後、供給物を研磨水と１：２で混合した。次いで、結晶を迅速に溶解させるためリン酸を加えてｐＨをおよそ３．０に下げる前に、デカンターからのＢＬＧ結晶／固相を研磨水と混合してより薄いスラリーにした。
ＢＬＧ結晶を溶解した後、純粋なＢＬＧタンパク質液を、結晶化のためのフィードを調製するために使用したのと同じＵＦ設定で１５ブリックスに濃縮し、ｐＨをおよそ３．８の最終ｐＨに調整した。次いで、液体ＢＬＧ単離物を７５度に５分間加熱し、続いて１０℃に冷却した。熱処理により、熱処理前の１３７．０００ＣＦＵ／ｇから熱処理後の１０００ＣＦＵ／ｇ未満に微生物負荷が減少することがわかった。熱処理はタンパク質の変性を引き起こさず、固有トリプトファン蛍光発光比（３３０ｎｍ／３５０ｎｍ）は１．２０と決定され、ＢＬＧ分子のネイティブ立体構造を示している。
ＢＬＧを、１８０℃の入口温度及び７５℃の出口温度を有するパイロットプラント噴霧乾燥機で乾燥した。出口でサンプリングされた得られた粉末は、およそ４％重量／重量の含水量を有していた。粉末の化学組成を表２に示す。乾燥粉末のサンプルを溶解し、タンパク質変性度を１．５％と決定し、固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を１．２０と測定した。
Figure 2021530976
噴霧乾燥粉末のかさ密度（６２５タップ）は０．２〜０．３ｇ／ｃｍ３と推定された。
結論：
上記のプロセスを使用することにより、本発明者らは、処理中にタンパク質の変性又はタンパク質のアンフォールディングを実質的に発生させることなく熱処理できる高純度のＢＬＧ生成物を製造することができた。熱処理は、タンパク質生成物に損傷を与えることなく、細菌レベルを大幅に低下させた。
本発明者らは、噴霧乾燥の前にタンパク質含有量を増加させることにより、さらに高いかさ密度を得ることができるという徴候を見てきた。また、本発明者らは、噴霧乾燥に使用される入口及び／又は出口温度が低下した場合、さらに低い程度の変性が得られることを観察した。
例３：噴霧乾燥したＰＨ中性ＢＬＧ単離粉末の製造
例２と同じプロトコル及び実験設定を使用する場合、表３に示されるラクトース還元ホエイタンパク質単離物をコンディションし、結晶化のためのフィードに使用した。結晶化の収率を６８％と計算した。
本発明者らは、この例で言及されているＢＬＧ及びＡＬＡ等の特定のタンパク質の全ての重量パーセントが、総タンパク質に対する非凝集性タンパク質の重量パーセントに関係していることを認識している。
Figure 2021530976
結晶化タンクからの残りの材料を、デカンター上で、３５０ｇ、２７５０ＲＰＭ、６４スペーサーによる１５０ＲＰＭ差、及び７５Ｌ／時の供給流量で分離した後、供給物を研磨水と１：２で混合した。次いで、結晶を迅速に溶解させるため０．１Ｍ水酸化カリウムを加えて、ｐＨをおよそ７に調整する前に、デカンターからのＢＬＧ結晶／固相を研磨水と混合してより薄いスラリーにした。
結晶を溶解した後、純粋なＢＬＧタンパク質液を、結晶化のためのホエイタンパク質溶液を調製するために使用したのと同じＵＦ設定で１５ブリックスに濃縮し、ｐＨを７．０の最終ｐＨに調整した。ＢＬＧを、１８０℃の入口温度及び７５℃の出口温度を有するパイロットプラント噴霧乾燥機で乾燥した。出口でサンプリングして得られた粉末は、およそ４％重量／重量の含水量を有していた。粉末の組成を表４に示す。乾燥後、粉末の一部を脱塩水に溶解し、タンパク質変性度を９．０％と決定し、固有トリプトファン蛍光発光比（３３０ｎｍ／３５０ｎｍ）は１．１６であった。
Figure 2021530976
噴霧乾燥粉末のかさ密度（６２５タップ）は０．２〜０．３ｇ／ｃｍ３と推定された。
結論：
上記のプロセスを使用することにより、本発明者らは、処理中のタンパク質の変性が最小限であるか又は全くない、ｐＨ中性で高純度のＢＬＧ生成物を製造することができる。本発明者らは、噴霧乾燥の前にタンパク質含有量を増加させることにより、さらに高いかさ密度を得ることができるという徴候を見てきた。また、本発明者らは、噴霧乾燥に使用される入口及び／又は出口温度が低下した場合、さらに低い程度の変性が得られることを観察した。噴霧乾燥の前にミネラル含量を減らすことにより、変性のレベルをさらに下げることができる。
例４：噴霧乾燥したＢＬＧ単離粉末の濡れ性
例２及び例３に従って調製された酸性又はｐＨ中性の噴霧乾燥ＢＬＧ単離粉末の濡れ性を、通常の噴霧乾燥ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）の濡れ性と比較した。濡れ性は、粉末サンプル全体が濡れるまでの時間として測定された。０．５グラムの粉末を計り、直径５ｃｍの円筒形容器内の１００ｇの脱塩水（１０℃）の表面に置いた。粉末を水面に置いてから粉末が溶解するか、水面を通過するまでの時間を測定した。結果を以下に示す。
Figure 2021530976
結論：コーティングされていないＢＬＧ単離粉末（サンプル２、３）が標準のＷＰＩ（サンプル１）よりもはるかによく濡れたことは驚くべきことであった。これは、本発明のＢＬＧ単離粉末が、迅速な濡れ性及び溶解が重要であるインスタント飲料粉末の有用な原料であることを示している。ＢＬＧ単離粉末はさらに、タンパク質飲料の湿潤及び溶解がはるかに速く、したがって製造中の分散及び溶解がより容易になるため、タンパク質飲料の製造において通常のＷＰＩと比較して改善された有用性を提供する。最終的に、これにより、高タンパク飲料の製造にかかる時間が短縮され、飲料製造プラントの１時間あたりの生産能力が向上する可能性がある。
例５：乾いた口当たりのレベルが低下した酸性ＢＬＧ単離物
例２で調製した酸性の噴霧乾燥ＢＬＧ単離粉末を６．０％の総タンパク質を提供するのに十分な量で含む２つのタンパク質飲料Ａ及びＢを、ｐＨ３．７にｐＨ調整し、Ａ：７５℃で１５秒、又はＢ：１２０℃で２０秒の熱処理に供した。両方の飲料を直ちに冷却し、５℃の冷蔵庫に保管した。固有の蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を測定することにより、飲料Ａのタンパク質はまだネイティブ立体構造であるのに対し、飲料Ｂでは著しいアンフォールディング及び変性が起こったことを確認した。
飲料Ａ及びＢの濁度を、例１．７に従って測定し、いずれの飲料も、４０ＮＴＵ未満の濁度を有していたが、同等の標準ＷＰＩは、２００ＮＴＵを超える濁度を有していた。したがって、本発明の酸性ＢＬＧ単離物は、透明で酸性の高タンパク質飲料の製造に明らかに非常に適している。
製造後１週間未満で、両方の飲料を訓練された官能試験パネルにより官能試験に供し、熱処理された酸性ホエイタンパク質飲料に特徴的な乾いた口当たりが、飲料Ａ（乾いた口当たりのスコア：０〜１２のスケールでおよそ５．０）よりも飲料Ｂ（乾いた口当たりのスコア：０〜１２のスケールでおよそ１０．５）で１００％超高いことがわかった。
この知見は、タンパク質の変性が酸性タンパク質飲料の乾いた口当たりに寄与すること、及びタンパク質の変性を制限又は回避することによって乾いた口当たりを大幅に低減できることを示している。
例６：超低微生物含有量の中性ＢＬＧ単離物の製造
本発明者らは、本発明が、非常に低い細菌含有量及び高いタンパク質ネイティブ性を有するｐＨ中性のＢＬＧ粉末を得ることが可能であることを見出した。これは、製品の微生物品質に挑戦するために、コンディショニングプロセスの最終工程中に１０℃で６日間の保管を挿入することにより、総プロセス時間が延長された本発明の例で実証されている。
ホエイタンパク質フィード：
標準的なチーズ製造プロセスからのスイートホエイに由来するラクトース枯渇ＵＦ保持液は１．２ミクロンのフィルターで濾過されており、ＢＬＧ結晶化プロセスのフィードとして使用される前にＳｙｎｄｅｒ ＦＲメンブレンにより脂肪が減少されていた。フィードの化学組成を表５に示す。本発明者らは、この例で言及されているＢＬＧ、ＡＬＡ等の特定のタンパク質の全ての重量パーセントが、総タンパク質に対する非凝集性タンパク質の重量パーセントに関係していることを認識している。
Figure 2021530976
コンディショニング：
スイートホエイフィードを、全固形分２１％（ＴＳ）±５のフィード濃度まで、３０ミルのスペーサー、フィード圧力１．５〜３．０バールで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＧＲ８２ＰＥタイプのメンブレンを使用し、またダイアフィルトレーション媒質として研磨水（逆浸透によって濾過された水で、最大０．０５ｍＳ／ｃｍの導電率が得られる）を使用して、およそ１０℃の限外濾過セットアップ上でコンディショニングした。希釈塩酸を使用してｐＨを約５．９に調整し、バッチ限外濾過セットアップでダイアフィルトレーションした。保持液の導電率の低下が２０分間にわたって０．１ｍＳ／ｃｍを下回るまで、ダイアフィルトレーションを続けた
次いで、ダイアフィルトレーションされたホエイタンパク質フィードを１０℃で６日間保管し、得られた製品の微生物品質に挑戦した。
保管後、ホエイタンパク質フィードを２０℃に加熱し、次にＨＣｌを添加してｐＨを調整し、希塩酸を使用してｐＨがおよそ５．５になるようにした。
ホエイタンパク質フィードを、全固形分２１％（ＴＳ）±５のフィード濃度まで、３０ミルのスペーサー、フィード圧力１．５〜３．０バールで、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＧＲ８２ＰＥタイプのメンブレンを使用し、またダイアフィルトレーション媒質として研磨水を使用して、２０℃の限外濾過セットアップ上でコンディショニングした。限外濾過は連続限外濾過セットアップとして実行され、ダイアフィルトレーションを、エンド保持液が１．９〜２．２ｍＳ／ｃｍの導電率及び２２±５のＴＳを持つように追加した。保持液を、マンテル及び攪拌を備えた８００Ｌのタンクに収集した。タンクが一杯になると、ＨＰＬＣ分析のために濃縮保持液の第１のサンプルを採取した。この例のＨＰＬＣ分析は、例２に記載されているように行われた。
結晶化：
濃縮された保持液を８００Ｌの結晶化タンクに移し、そこで再水和され噴霧乾燥されたＢＬＧ結晶から作られた純粋なＢＬＧ結晶材料と共にシードした。結晶を１ＬのコンディショニングされたＷＰＩに加え、氷上で５℃未満に急速に冷却した。続いて、シードされたホエイタンパク質溶液を、２０℃からおよそ６℃まで、およそ４時間かけて冷却し、ＢＬＧ結晶を形成して成長させた。
冷却後、結晶を含むホエイタンパク質溶液のサンプル（第２のサンプル）を採取し、３０００ｇで５分間の遠心分離によってＢＬＧ結晶を分離した。第２のサンプルに由来する上清及び結晶ペレットを以下に説明するようにＨＰＬＣ分析に供した。結晶化の収率を、以下に概説するように計算し、％で決定した。
デカンター分離：
８００Ｌタンクで生成された結晶を、６００ｇ、６４ミルのスペーサー（ミルは１／１０００インチを意味する）により２７５０ＲＰＭ差で、デカンター（ＬＥＭＩＴＥＣＨ ＭＤ８０）上で母液から分離し、フィードフローは１５０Ｌ／時であり、１容量のタンクフィードと２容量の研磨水との比率の研磨水及びタンクからのフィードの混合物であった。
結晶の溶解：
デカンターから収集した結晶を研磨水で約１０％の全固形分濃度に希釈した後、希塩酸を使用してｐＨをｐＨ３に調整した。酸性化されたＢＬＧ溶液を、およそ６℃でおよそ１６〜４８時間、ｐＨ３に保持した。
酸性化したＢＬＧ溶液のｐＨ調整：
次いで、酸性化したＢＬＧ溶液を水酸化カリウムと水酸化ナトリウムとの希釈混合物を使用してｐＨ７に調整し、さらに３０ミルのスペーサー、フィード圧力１．５〜３．０バールのＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＧＲ８２ＰＥタイプの膜を使用しておよそ１０℃の限外濾過セットアップでおよそ１６％ＴＳの濃度までコンディショニングした。
精密濾過：
濃縮ＢＬＧ溶液の一部を、公称孔径０．８ミクロンのＭｅｍｂｒａｌｏｘ ＥＰ−１９４０−ＧＬ−ＵＴＰメンブレンを使用する精密濾過に供した。精密濾過を、３．５のフィード圧力でおよそ１０℃で操作した。ＭＦ透過液を収集し、乾燥の準備を整えた。
ＭＦ透過液のサンプルを、その化学組成（表６の結果を参照されたい）及び微生物学（例１．３０）に関して分析したところ、驚くべきことに１０ＣＦＵ／ｇ未満であることがわかった（基本的には、コロニーが識別されず、試験したサンプルは無菌に近いように見えた）。無菌は、例えば、さらに堅固な精密濾過膜を使用し、膜の透過側の無菌状態を確保することで得られる。
酸性化及び精密濾過を行わない同等のプロセスでは、１．０００．０００ ｃｆｕ／ｇを超えるＢＬＧ溶液が容易に得られた。
Figure 2021530976
結論：
重い微生物学的負荷の下であっても、本発明は、高度のタンパク質ネイティブ性を有する無菌又はほぼ無菌の、ｐＨ中性ＢＬＧ生成物を提供することを可能にする。
例７：酸性及び中性ＢＬＧの逆浸透濃縮及び粉末かさ密度を標準の中性ＷＰＩと比較する。
本発明者らは、精製されたネイティブＢＬＧの噴霧乾燥調製物が、同じ条件下で噴霧乾燥される同等のホエイタンパク質単離物よりも高いかさ密度を有する粉末を提供することが可能であることを見出した。
本発明者らはさらに、精製されたネイティブＢＬＧの液体高タンパク質調製物は、同等のホエイタンパク質単離物よりも粘度が低いことを見出した。この発見により、乾燥前にＢＬＧ単離物をより高い総タンパク質濃度（及びより低い含水量）に濃縮することが可能になり、したがって、同等のＷＰＩ粉末よりも水分の除去が少なく、したがって乾燥タンパク質１ｋｇあたりのエネルギー消費量が少なくなる。また、粘度が下がると、膜濾過に要なエネルギーが粘度の低下と共に減少するため、エネルギー消費を減らして、膜濾過、例えば精密濾過を行うこともできる。
上述の知見は、以下の実験で実証された。
逆浸透及び乾燥のための原材料：
中性ＢＬＧ：
例６で生成されたＭＦ保持液は、最大５２バールのフィード圧力でＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔ膜上に濃縮され、コンディショニングの間、温度は１５℃未満に保たれた。濃縮は３２．２のブリックスまで継続した。濃縮中、例１．８Ｂ及び１．２８に記載されているように、粘度及びブリックス測定のためにサンプルを採取した。各サンプルのブリックスを、以下の式を使用してタンパク質（重量／重量％）に変換した。
Figure 2021530976
０．８５は経験的に得られた変換であり、ブリックス度と固体の合計との間に良好な関係がある。結果を図６に示す。
ホエイタンパク質溶液の全固形分はおよそブリックス＊０．８５である。
酸性ＢＬＧ：
例６のように生成された酸性ＢＬＧ溶液（ただし、ｐＨ５．５での連続限外濾過の前にｐＨ５．９２での限外濾過は行われず、限外濾過がｐＨ３で行われたことを除く）。フィードの組成を表７に示す。例６に記載されるＭＦ工程に供された酸性ＢＬＧ透過液は、次いで、最大５２バールのフィード圧力でＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＲＯ９８ｐＨｔの逆浸透（ＲＯ）膜上に濃縮され、コンディショニングの間、温度は１５℃未満に保たれた。４０．０のブリックスが得られるまで濃縮を続けた。濃縮中、例１．８Ｂ及び１．２８に記載されているように、粘度及びブリックスの測定のためにサンプルを採取した。ブリックス値をタンパク質濃度に変換し、結果を図６に示す。乾燥する前に、ＢＬＧを研磨水でブリックス３５．５に希釈した。
Figure 2021530976
ＷＰＩ参照：
酸性ＢＬＧ生成物及びｐＨ中性ＢＬＧ生成物を従来のｐＨ中性ＷＰＩ生成物と比較するため、スイートホエイに基づく標準的な液体濃縮ＷＰＩを、Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ Ｄａｎｍａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎの製造から採取し、同じパイロットプラント噴霧乾燥機で酸性及びｐＨ中性のＢＬＧサンプルと同じ条件を使用して乾燥させた。液体濃縮ＷＰＩの組成を表８に示す。
濃縮ＷＰＩの粘度を最初に測定し、その後、濃縮ＷＰＩを研磨水で徐々に希釈して、ＢＬＧ測定値と比較するためにＷＰＩブリックスと粘度との相関関係を示した。
粘度曲線：
ＲＯ中に採取されたサンプル及び希釈されたＷＰＩ参照の温度を、例１．８Ｂで記載されているように、粘度測定（３回行われる）を行う前に１５℃に温度調整した。ブリックスを、例１．２８で説明したように測定した。
液体濃縮ＷＰＩを３６．０のブリックスで乾燥させた。
Figure 2021530976
噴霧乾燥：
逆浸透（ＲＯ）による濃縮後、全てのサンプルを、予熱せずに、入口温度が１８０℃、出口温度が８５℃のパイロットプラント噴霧乾燥機で乾燥した。全てのサンプルの温度は、噴霧乾燥するまで１２℃未満に保たれた。次いで、噴霧乾燥粉末のかさ密度を、例１．１７に記載されているように、ストンピング（ｓｔｏｍｐｉｎｇ）せずに、１００回のストンプ、及び６２５回のストンプで測定した。驚くべきことに、酸性及びｐＨ中性のＢＬＧ粉末はいずれも、ＷＰＩ参照よりもかさ密度が有意且つ一貫して高かった。平均して、ｐＨ中性ＢＬＧのかさ密度はＷＰＩ参照の粉末より１８．４パーセント高く、酸性は２２．２パーセント高かった。かさ密度測定の結果を表９に示し、図５で説明する。
Figure 2021530976
結論：
酸性及びｐＨ中性のＢＬＧ単離物はいずれのタイプも、ＷＰＩ参照と比較して粘度が低く、ＲＯで濃縮するのが容易であった。この発見により、乾燥前にＢＬＧ単離物をより高い総タンパク質濃度（及びより低い含水量）に濃縮することが可能になり、したがって、同等のＷＰＩ粉末よりも水分の除去が少なく、したがって乾燥タンパク質１ｋｇあたりのエネルギー消費量が少なくなる。また、粘度が下がると、膜濾過に要なエネルギーが粘度の低下と共に減少するため、エネルギー消費を減らして、膜濾過、例えば精密濾過を行うこともできる。
本発明のＢＬＧ粉末が従来のＷＰＩよりも粘度に寄与しないため、本発明のＢＬＧ粉末はさらに、高タンパク質飲料、又は高タンパク質飲料を調製するためのシェイク粉末に特に適しており、したがって、より飲用可能な飲料を提供する。
驚くべきことに、噴霧乾燥されたＢＬＧ粉末はさらに、ブリックス値によって説明されるとおり、ＢＬＧがわずかに少ない量の全固形分で乾燥された場合であっても、ＷＰＩ参照と比較して高いかさ密度を有していた。粉末のかさ密度が高いほど、輸送時の重量あたりの輸送量が少なくなり、粒子の密度が高いほど、取り扱い時の粉塵が少なくなる傾向がある。

Claims (18)

  1. ＢＬＧ単離粉末であって、好ましくは噴霧乾燥によって調製され、ｉ）２．５〜４．９、ｉｉ）６．１〜８．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有し、以下を含むもの：
    少なくとも３０％重量／重量の量の総タンパク質、
    総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）
    最大１０％重量／重量の量の水、
    前記ＢＬＧ単離粉末は、
    少なくとも０．２ｇ／ｃｍ３のかさ密度、
    少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）
    最大１０％のタンパク質変性度、
    ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵの熱安定性、及び
    最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、の１つ又は２つ以上を有する。
  2. ２．５〜４．９の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載のＢＬＧ単離粉末。
  3. ６．１〜８．５の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載のＢＬＧ単離粉末。
  4. ５．０〜６．０の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載のＢＬＧ単離粉末。
  5. 少なくとも４０％重量／重量、好ましくは少なくとも５０％重量／重量、少なくとも６０％重量／重量、より好ましくは少なくとも７０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも８０％重量／重量、さらにより好ましくは少なくとも９０％重量／重量、最も好ましくは少なくとも９２％重量／重量の総タンパク質を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＢＬＧ単離粉末。
  6. 総タンパク質に対して少なくとも８８％重量／重量、好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９０％重量／重量の量のＢＬＧを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＢＬＧ単離粉末。
  7. 最大１０％重量／重量、好ましくは最大５％重量／重量、より好ましくは最大２％重量／重量、さらにより好ましくは最大０．１％重量／重量の量の脂質を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のＢＬＧ単離粉末。
  8. 少なくとも０．２０ｇ／ｃｍ３、好ましくは少なくとも０．３０ｇ／ｃｍ３のかさ密度を有する、請求項１〜７のいずれかに記載のＢＬＧ単離粉末。
  9. 少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する、請求項１〜８のいずれかに記載のＢＬＧ単離粉末。
  10. 最大１０％のタンパク質変性度を有する、請求項１〜９のいずれかに記載のＢＬＧ単離粉末。
  11. 液体ＢＬＧ単離物であって、ｉ）２〜４．９、ｉｉ）６．１〜８．５、又はｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨを有する、以下を含むもの：
    少なくとも１０％重量／重量の量の総タンパク質、
    総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、

    少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）、
    最大１０％のタンパク質変性度、
    ｐＨ３．９で最大２００ＮＴＵの熱安定性、及び
    最大１５０００コロニー形成単位／ｇ、好ましくは最大１０００コロニー形成単位／ｇ、の１つ又は２つ以上を有する。
  12. 総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のＢＬＧを含む、請求項１に記載の乾燥ＢＬＧ単離粉末を製造する方法であって、以下の工程を含むもの：
    ａ）以下を有する液体ＢＬＧ単離物を提供すること
    ｉ）２〜４．９の範囲のｐＨ、
    ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ、又は
    ｉｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨ、
    前記液体ＢＬＧ単離物は、総タンパク質に対して少なくとも８５％重量／重量の量のＢＬＧを含む、
    ｂ）任意に、前記液体ＢＬＧ単離物を物理的微生物減少に供すること、
    ｃ）噴霧乾燥により前記液体ＢＬＧ単離物を乾燥させること。
  13. 液体ＢＬＧ単離物が、５〜５０％重量／重量の範囲の量の全固形分を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 液体ＢＬＧ単離物のタンパク質画分が、少なくとも１．１１の固有トリプトファン蛍光発光比（Ｉ３３０／Ｉ３５０）を有する、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 液体ＢＬＧ単離物のタンパク質が最大１０％重量／重量のタンパク質変性度を有する、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 液体ＢＬＧ単離物の提供が、ホエイタンパク質フィードからＢＬＧを単離すること、及び任意に、得られたＢＬＧ濃縮組成物を、
    脱塩、
    ミネラルの添加、
    希釈、
    物理的微生物減少、
    濃縮、及び
    ｐＨ調整、
    の群から選択される１つ又は２つ以上の工程に供することを含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 液体ＢＬＧ単離物が、好ましくは熱処理を含むか、さらには熱処理からなる物理的微生物減少に供される、請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 請求項１〜１０のいずれかに記載のＢＬＧ単離粉末又は請求項１１に記載の液体ＢＬＧ単離物の、食物製品、例えば、飲料又はインスタント飲料粉末であって、２〜４．７の範囲のｐＨを有し、さらに以下を有する、熱処理飲料の製造のための原料としての使用：
    乾いた口当たりのレベルの低下、
    透明性の向上、及び／又は
    タンパク質含有量の増加、の１つ又は２つ以上を有し、好ましくは少なくとも３〜４５％重量／重量、より好ましくは１１〜４０％重量／重量、さらにより好ましくは１５〜３８％重量／重量、最も好ましくは２０〜３６％重量／重量の量のタンパク質含有量。
JP2020573261A 2018-06-27 2019-06-26 ベータ－ラクトグロブリン単離物を製造するためのプロセス、並びに関連する方法及び使用 Active JP7467364B2 (ja)

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