BR112020024819A2

BR112020024819A2 - inibidores da diidroorotato desidrogenase humana (hdhodh) e seu uso na marcação de doenças oncológicas sensível à falta de pirimidina

Info

Publication number: BR112020024819A2
Application number: BR112020024819-3A
Authority: BR
Inventors: Donatella Boschi; Marta Giorgis; Marco Lucio Lolli; Giovanni Martinelli; Giuseppe Saglio
Original assignee: Donatella Boschi; Marta Giorgis; Marco Lucio Lolli; Giovanni Martinelli; Giuseppe Saglio
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2021-03-02
Also published as: IT201800006067A1; US20210230156A1; WO2019234186A1; EP3802527A1

Abstract

A presente invenção refere-se a compostos de fórmulas (I) e (II) que são novos inibidores de diidroorotato desidrogenase humana (hDHODH), composições farmacêuticas contendo os inibidores acima mencionados, assim como seu uso no tratamento de doenças relacionadas a tumor, em particular leucemia mielogênica aguda (AML), câncer de mama de triplo-negativo, tumores PTEN-mutantes e tumores acionados por KRAS.

Description

INIBIDORES DA DIIDROOROTATO DESIDROGENASE HUMANA (HDHODH) E SEU USO NA MARCAÇÃO DE DOENÇAS ONCOLÓGICAS SENSÍVEL À FALTA DE

PIRIMIDINA Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a novos inibidores da diidroorotato desidrogenase humana (ADHODH) e seu uso no tratamento de malignidades associadas a certos tipos de tecidos (por exemplo, leucemia mieloide aguda (AML) e câncer de mama triplo-negativo) ou carregando certos perfis mutacionais (por exemplo, perda de PTEN ou KRAS ativada) que pode ser particularmente sensível à falta de pirimidina devido à inibição de ADHODH.! No caso de leucemia mielogênica aguda (AML), o mecanismo associado à eficácia do uso de inibidores de ADHODH está relacionado especificamente à reativação da diferenciação mieloide em linhagens de células de AML, associadas a um mecanismo apoptótico. Antecedentes da Invenção

[002] A diidroorotato desidrogenase humana (hDHODH) catalisa a etapa de limitação da taxa na biossíntese de novo de pirimidina, que converte o diidroorotato (DHO) para orotato (ORO). Já validada como um alvo terapêutico para o tratamento de doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide e esclerose múltipla, a ADHODH também foi recentemente identificada como um alvo relevante no tratamento de câncer de mama triplo-negativo?, tumores PTEN-mutantes?, tumores acionados por KRAS* e com leucemia mielogênica Aguda (AML); uma doença para a qual o padrão de cuidado intensivo não mudou durante as últimas quatro décadas. A conexão com AML pavimenta a forma de perspectivas totalmente novas no tratamento da doença, bem como no campo de ADHODH. Presumivelmente, todas estas diversas malignidades convergem em uma via similar de reprogramação metabólica para conduzir a sua dependência da síntese de pirimidina e sensibilidade à inibição de DHODH. A presente invenção refere-se a uma nova classe de inibidores, com base em um bioisóstero de grupo carboxílico incomum 2-hidroxipirazol[1,5-a]piridina, que foi projetada idealmente iniciando a partir de brequinar, um dos inibidores de ADHODH conhecidos mais potentes, utilizando a técnica inovadora de substituição de reconhecimento molecular. Uma combinação de estratégias de otimização baseadas em estrutura e baseadas em ligante levou, em particular, à produção do composto 4, que mostra os níveis de potência de AhDHODH semelhantes ao brequinar /n vitro e é superior em termos de citotoxicidade e imunossupressão. O composto 4 também restaura a diferenciação mieloide em linhagens de células de leucemia em concentrações que são um dígito de um log menores do que aquelas obtidas em experimentos com brequinar.

[003] A diidroorotato desidrogenase humana (DHODH, EC 1.3.99.11) é um alvo terapêutico que foi validado para o tratamento de doenças autoimunes e câncer5*. A ADHODH está localizada na membrana mitocondrial interna e é uma enzima dependente de flavina envolvida na biossíntese de pirimidina de novo. Embora uma variedade de inibidores de ADHODH tenha sido sintetizada ao longo dos anos, a atividade interessante de leflunomida e brequinar (Figura 1) levou aos mesmos a atrair muita atenção”. Leflunomida e seu metabólito teriflunomida, os únicos fármacos com alvo em ADHODH aprovados, também foram aprovados para o tratamento de artrite reumatoide e outros distúrbios autoimunes*%º. Brequinar, um dos inibidores ADHODH mais potentes conhecidos na ciência, foi identificado durante uma pesquisa para novos inibidores de ADHODH potentes que apresentam benefícios clínicos similares àqueles da leflunomida, mas sem os efeitos colaterais associados". Infelizmente, brequinar foi descartado como um agente terapêutico quando submetido a testes clínicos para câncer"! e a prevenção de rejeição de transplante de órgão!? por causa de seus efeitos colaterais, uma janela terapêutica estreita e farmacocinética: 12-13, No outono de 2016, duas publicações**!5 demonstraram o papel central que ADHODH desempenha em leucemia mielogênica aguda (AML), uma doença para o qual cuidado intensivo padrão não mudou durante as últimas quatro décadas!6. AML, a leucemia aguda mais comum em adultos, é um câncer que afeta a linhagem mieloide de células brancas do sangue. As células leucêmicas perdem a sua capacidade de se diferenciar em células sanguíneas brancas adultas, significando que células imaturas, caracterizadas por alto potencial de proliferação, se acumulam na medula óssea e interferem com a produção de células sanguíneas normais. A doença progride rapidamente e é tipicamente fatal em semanas ou meses se deixada não tratada. Os resultados dos estudos acima sugerem que a ADHODH desempenha um papel central na regulação da diferenciação mieloide em modelos in vitro e in vivo e, assim, abre totalmente novas possibilidades para o tratamento com AML.

[004] Em um estudo publicado”, brequinar foi usado como um inibidor de ADHODH, estabelecendo como pode induzir significativamente a diferenciação mieloide, retardar o desenvolvimento da doença e reduzir a carga de células iniciadora da leucemia em vários modelos de camundongo AML, xenoenxertos de linhagem celular humana, xenoenxertos derivados do paciente e modelos de camundongo singênico. A descoberta do papel central da ADHODH na AML atraiu imediatamente o interesse de companhias farmacêuticas. Quatro inibidores de ADHODH estão atualmente (maio de 2019) sendo investigados para o tratamento de AML: o próprio brequinar, adquirido pela Clear Creek Bio da Bristol Myers Squibb em novembro de 2017 e movido para o teste clínico de Fase 1 em outubro de 2018; ASALAN 03, pela ASALAN Pharmaceuticals, entrou em teste clínico de Fase IT em novembro de 2017; BAY2402234, pela Bayer, entrou nos testes pré-clínicos de Fase I em janeiro de 2018 (NCT03404726) e PTC299, que a PTC Therapeutics moveu para teste Clínico de Fase Ib em outubro de 2018 para avaliar sua segurança, farmacocinética e evidência preliminar de atividade antitumoral em pacientes com leucemia mieloide aguda reincidente/refratária (AML). O fato de que um número de novos inibidores de ADHODH foi reportado nos últimos anos” 7: 182º e o crescente interesse das indústrias demonstram que a necessidade de desenvolver novos Inibidores de ADHODH é um problema urgente.

[005] Os presentes inventores desenvolveram recentemente uma nova geração de inibidores de ADHODH que foram projetados através da substituição de reconhecimento molecular da porção acídica de brequinar com uma variedade de azois ácidos hidroxilados!?, 23, Três destes compostos (1-3), que são baseados em hidroxitiadiazol, hidroxitriazol e hidroxipirazol, respectivamente (Figura 1), têm mostrado alta atividade inibitória de ADHODH in vitro, com o composto 1 sendo o melhor na série com um valor ICso de 16 nM. As estruturas cristalográficas de raios-X de 1-3 complexadas com ADHODH demonstraram como estes suportes ácidos, que mostram uma variedade de propriedades ácidas?!, desempenham o papel do grupo carboxílico de brequinar pela interação Com Arg136 no subsítio 2 de ADHODH?. Além disso, cada sistema apresentou a possibilidade de estabelecer interações com o pequeno bolsão lipofílico criado por Val143 e Val134, conhecido como subsítio 4. Quando testada quanto à atividade antiproliferativa, verificou-se que os compostos são eficazes na mesma faixa de concentração que o brequinar, enquanto também apresentam citotoxicidade celular mais baixa do que o líder apenas mostrando efeitos citotóxicos a 70 vezes as concentrações necessárias para inibir a proliferação celular. A presente invenção representa a etapa seguinte no processo de design pela descrição de uma nova série de inibidores de ADHODH potentes que foram concebidos utilizando-se 2- hidroxipirazol[1,5-a]piridina como o andaime ácido. Descrição Resumida da Invenção

[006] 2-Hidroxipirazol[1,5-a]piridina é um sistema que é ainda relativamente inexplorado na literatura. O presente pedido de patente relata o seu primeiro uso de reconhecimento molecular como um bioisóstero de uma função carboxílica. Na primeira série, além de investigar a própria porção (compostos 4-10, 18-22, Figura 2), os inventores também investigaram o efeito de introduzir um grupo metila no anel piridina a fim de aprimorar a sua interação lipofílica com o subsítio 4 (compostos 5 e 6, Figura 2) ou a substituição de uma piridina com uma porção piperidina alifática como no composto 30. O segundo anel do suporte bifenílico também foi submetido à investigação pela inserção de grupos polares (composto 31) ou lipofílicos (compostos 32 e 33).

[007] Na segunda série (compostos 8-10 e 29, Figura 2), os inventores substituíram o substituinte de bifenila com um éter difenílico mais flexível a fim de aprimorar suas propriedades farmacocinéticas e fornecer mais compostos semelhantes a fármaco. O design teórico, síntese, SAR, ensaios biológicos (viabilidade celular, proliferação, citotoxicidade, imunossupressão e diferenciação mieloide), caracterização fisico-química e perfis ADME preliminares dos compostos são apresentados e discutidos completamente a seguir.

[008] Consequentemente, um primeiro aspecto da presente invenção é um inibidor de AhDHODH à base de suporte 2-hidroxipirazol[1,5-ajpiridina da fórmula geral (1): AR, Re + Pr As EA x a za, Ro

Fórmula (1) em que: R!, R?à, Rê e Rº são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio, um grupo alquila C1-Ca, um grupo alquilóxi, um grupo alquiltio e um grupo haloalquila C1-Ca; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em grupo fenila, pirídila, piridinila, fenóxi, piridilóxi, piridinóxi, tiofenóxi, tiofenila, feniltio, fenilcarboxamido, fenilcarboxamido e fenilaminocarbonila. Se R3 for um grupo aromático, um substituinte independentemente selecionado a partir de átomo de halogênio, grupo alquila, trifluorometila, trifluorometóxi pode estar presente no anel. Se Rº for um grupo alifático, um substituinte independentemente selecionado a partir de grupo alquila, trifluorometila, trifluorometóxi pode estar presente no anel; R7, R$ e Rº são independentemente selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo haloalquila Ci-Ca, um grupo tioalquila C1-Ca, um grupo aminoalquila Ci-Ca, um grupo alquila C1-C4 e um grupo hidroxialquila C1-Ca; R$ é selecionado a partir de um grupo alquilóxi Ci-Ca, um grupo acilóxi, um grupo hidroxila, um grupo tiol ou um sal do mesmo; X, Y e Z são independentemente selecionados a partir um átomo de carbono ou um átomo de nitrogênio, em que, se X ou Y ou Z for nitrogênio, as outras duas posições são átomos de carbono.

[009] De acordo com uma realização preferida, pelo menos um de R!, R&, R$ e RS é ou contém um átomo de halogênio. Na presente descrição, um átomo de halogênio preferido é um átomo de flúor (F).

[0010] De acordo com uma realização particularmente preferida da invenção, cada um dentre R!, R?º, Rê e Rº é um átomo de flúor e Rê é fenila.

[0011] Na definição de R6, sais preferidos são sais de Na*, K* ou Cs?*.

[0012] Em todas as realizações acima mencionadas, um grupo alquila C1-Ca preferido é um grupo metila.

[0013] De acordo com uma realização particularmente preferida da presente invenção, X, Y e Z são átomos de carbono (sp?).

[0014] A fórmula (Ia) ilustrada abaixo no presente é uma realização preferida da presente invenção em que X= Y=Z na Fórmula (1) são átomos de carbono (sp?) e Rº é um próton: R, Re

ÃO A A, HN Re (É) RODAR, Fórmula (Ia)

[0015] Compostos preferidos que estão dentro do escopo das fórmulas (1) e (Ia) são os compostos 4-6, 8-10, 29 e 31-33 ilustrados na Figura 2.

[0016] Outro aspecto da presente invenção é um inibidor de ADHODH à base de suporte 2- hidroxipirazol[1,5-a]piridina da fórmula geral (II): R, Ra

ÃO R Rs DE.

A BR, Ro Fórmula (II) em que: Ri, R?, Rê e R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio, um grupo alquila C;1-Ca, um grupo alquilóxi, um grupo alquiltio e um grupo haloalquila Ca-Ca; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em grupo fenila, pirídila, piridinila, fenóxi, piridilóxi, piridinóxi, tiofenóxi, tiofenila, feniltio, fenilcarboxamido, fenilcarboxamido e fenilaminocarbonila. Se Rô for um grupo aromático, um substituinte independentemente selecionado a partir de átomo de halogênio, alquila, um grupo trifluorometila, um grupo trifluorometóxi pode estar presente no anel. Se Rô for um grupo alifático, um substituinte independentemente selecionado a partir de um grupo alquila, um grupo trifluorometila, um grupo trifluorometóxi pode estar presente no anel;

R7, R$ e Rº são independentemente selecionados a partir de um grupo haloalquila C1- Ca, um grupo tioalquila C1-Ca, um grupo aminoalquila C1-Ca, um grupo alquila C1-G, e um grupo hidroxialquila C1-Ca; R$ é selecionado a partir de um grupo alquilóxi Ci-Ca, um grupo acilóxi, um grupo hidroxila, um grupo tiol ou um sal do mesmo; X, Y e Z são independentemente selecionados a partir um átomo de carbono e um átomo de nitrogênio; se X ou Y ou Z for nitrogênio, as outras duas posições são átomos de carbono,

[0017] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, pelo menos um de Ri, R?, R$ e Ró é ou contém um átomo de halogênio. Um átomo de halogênio preferido é um átomo de flúor (F).

[0018] De acordo com uma realização particularmente preferida da presente invenção, cada um de R!, R?, Rº e R5 é um átomo de flúor e Rô é fenila.

[0019] Na definição de R$, sais preferidos são sais de Na*, K* ou Cs**.

[0020] Em todas as realizações acima mencionadas da presente invenção, um grupo alquila C1-C, preferido é um grupo metila.

[0021] De acordo com uma realização particularmente preferida da presente invenção, ambos X, Y e Z são átomos de carbono sp?.

[0022] A Fórmula (ITa) ilustrada abaixo no presente é uma realização preferida da presente invenção em que X=Y=Z são átomos de C sp? e Rº é um próton: RR, Re nr

EN

N Rs R7 Fórmula (Ila)

[0023] Compostos preferidos que estão dentro do escopo da Fórmula (11), bem como da Fórmula (Ila), é o composto 30 ilustrado na Figura 2.

[0024] Particularmente preferido é o composto 4, tendo a fórmula estrutural representada abaixo no presente: Q ; F ) "o F Ho oH Uh Ca Composto 4

[0025] Um terceiro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende um inibidor de ADHODH à base de suporte 2-hidroxipirazol[1,5-a]piridina da fórmula geral (1), conforme definida acima, e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0026] Um quarto aspecto da presente invenção é um inibidor de ADHODH à base de suporte 2-hidroxipirazol[1,5-a]piridina, conforme definido acima nas fórmulas gerais (1) e (II) e suas realizações específicas, para uso em um método de tratamento terapêutico de uma doença tumoral, em que a doença tumoral é um tumor sólido ou uma leucemia; exemplos não limitantes de provocadores tumorais que podem ser tratados com os inibidores da presente invenção são leucemia mielogênica aguda (AML), câncer de mama triplo-negativo, tumores PTEN-mutantes e tumores acionados por KRAS.

[0027] A parte experimental a seguir é fornecida apenas a título de ilustração e não se destina a limitar o escopo da presente invenção conforme definido pelas reivindicações anexas. Breve Descrição das Figuras

[0028] Na parte experimental, faz-se referência às seguintes figuras:

[0029] A Figura 1 mostra as estruturas dos inibidores do estado da técnica anterior leflunomida, brequinar e análogos de hidroxiazol 1-3.

[0030] A Figura 2 mostra as estruturas dos compostos 4-10, 29-33 que são baseadas no suporte 2-hidroxipirazol[1,5-a]piridina (o composto 7 não cai dentro do escopo da presente invenção).

[0031] A Figura 3 mostra as estratégias sintéticas para a preparação de pirazol[1,5- alpiridina hidroxilados substituídos: i) HOSA, H2O, 90ºC; ii) KrCO3, EtOH; iii) dietilmalonato,

etanol, 90ºC; iv) t-BuO-K*, THF seco, v) HCl a 0,1 N; vi) CsxCO3, Mel, THF seco, 40ºC; vii) Cs2CO3, BnBr, DMF seca, viii) NaOH a 5M, etanol, 70ºC (esquema 1),

[0032] A Figura 4 mostra a síntese dos alvos 4-10, 29-33: i) cloreto de oxalila, DMF seco, THF seco; ii) AlMe3z, tolueno seco, refluxo; iii) Ho, Pd/C, HCl a 37%, etanol; iv) tolueno seco, refluxo; v) Ha, Pd/C, THF seco, vi) NaOH a 5M, etanol, temperatura ambiente (Esquema 2).

[0033] A Figura 5 mostra os resultados de ensaios de citotoxicidade. A) Citotoxicidade induzida por diferentes concentrações de brequinar, composto 2 e 4 em U937 e THP1. Significância estatística: *p < 0,05; **p < 0,01 entre nossos compostos e brequinar. B) Citotoxicidade é totalmente invertida quando uridina é adicionada ao composto 4, mas não ao composto 2, ambos em U937 e THP1. Significância estatística: *p < 0,05; **p < 0,01 entre cada composto + uridina. A uridina foi adicionada a uma concentração de 100 UM. C) Inibição de proliferação exercida por diferentes concentrações de brequinar, composto 2 e 4 em U937 e THP1. Significância estatística: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 entre células tratadas e não tratadas (DMSO apenas). %p < 0,05 entre nossos compostos e brequinar. DMSO = sulfóxido de dimetila, isto é, o solvente de todos os compostos testados.

[0034] A Figura 6 mostra os resultados de ensaios de diferenciação. A) Cinética de diferenciação induzida por várias concentrações de brequinar, composto 4 e 2, em U937, expressa como a proporção de células positivas de CD11b. B) Cinética de diferenciação induzida por várias concentrações de brequinar e composto 4 em THP1, expressa como a proporção de células positivas de CD14. C) A diferenciação induzida em U937 por brequinar (painel esquerdo) e composto 4 (painel direito) é invertida quando a uridina é adicionada. A análise de diferenciação é realizada no dia 3. D) A diferenciação induzida em THP1 por brequinar (painel esquerdo) e composto 4 (painel! direito) é invertida quando a uridina é adicionada. A análise de diferenciação é realizada no dia 3. DMSO indica células tratadas com sulfóxido de dimetila. £4 = Composto 4; 42 = composto 2; BRQ = brequinar; ur = uridina. A uridina foi adicionada a uma concentração de 100 UM em todos os experimentos. Significância estatística: *p < 0,05; **p < 0,01; **p < 0,001.

[0035] A Figura 7 mostra o paralelismo entre a proporção diária de células de diferenciação e a viabilidade celular. A proporção de células de diferenciação é expressa com barras, e o eixo de referência está na esquerda; a viabilidade das células é expressa com linhas, e o eixo de referência é à direita. A seta inferior indica a concentração de fármacos. As experiências foram realizadas em ambos U937 e THP1 e a diferenciação foi avaliada, respectivamente, com expressão de CD11b e CD14. Significância estatística: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 entre células tratadas e não tratadas. DMSO = sulfóxido de dimetila. Parte Experimental Resultados e discussão Química: síntese de compostos alvo 4a 10

[0036] As estratégias químicas usadas para produzir os blocos de construção de 2- hidroxipirazol[1,5-a]piridina regiosubstituídas, protegidas 20a-c, 17a, que são úteis na síntese dos compostos 4-10, são mostradas no Esquema 1 (Figura 3). Os compostos 15a,b,c foram preparados através de uma leve modificação a um procedimento conhecido (Esquema 1)”, partindo de piridina ou das piridinas substituídas correspondentes. Os compostos 12a-c foram obtidos pela aminatação das piridinas substituídas correspondentes 11a-c, usando ácido hidroxilamina-O-sulfônico (HOSA) como reagente de aminatação. Os produtos foram tratados com K2CO;3 para produzir as ilidas correspondentes 13 que foram reagidas com malonato de dietila em EtOH para gerar os tipos intermediários 14, que, por sua vez, foram convertidos nos compostos desejados 15a-c, na presença de uma base forte (EBUO'K*), em rendimentos globais de 18-21%.

[0037] Embora alguns exemplos tenham sido relatados na literatura, o padrão de reatividade que 2-hidroxipirazol[1,5-a]piridinas mostra em direção aos agentes de alquilação nunca foi completamente investigado. Ambos os padrões de O- e N-alquilação devem sempre ser considerados!? 27, quando se considera a reatividade dos azois hidroxilados substituídos. O tipo de heteroátomo dentro do sistema heterociclo e a escolha do agente alquilante usados usualmente governam o padrão de alquilação!? 24-28, Ao se mover em diante no Esquema 1, a alquilação de 15a-c com brometo de benzila também gerou os derivados N-alquilados correspondentes 18a-c (razão de 5-29%), além de compostos O- alquilados desejados 19a-c, em cada caso. Um resultado similar foi obtido quando iodeto de metila foi usado como um agente de alquilação em 15a, produzindo os isômeros metilados 16a e 17a em rendimentos de 35% e 59%, respectivamente. Espectroscopia de RMN-2D foi usada para atribuir de forma inequívoca as estruturas isoméricas relativas (vide material Suplementar). Os ésteres 19a-c foram então hidrolisados sob condições básicas para produzir os correspondentes ácidos 20a-c em bons rendimentos, estes foram então usados para a preparação dos alvos 4-6, 8-10, conforme descrito no Esquema 2 (Figura 4). Partindo dos ácidos 20a-c (vide Esquema 1 da Figura 3), os cloretos de acila correspondentes foram obtidos via tratamento com cloreto de oxalila em diclorometano e usados diretamente após secagem sem purificação adicional. A fim de melhorar sua reatividade com cloretos de acila,y 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilaniliha (21) ou outras bifenilanilinas, foi convertida em sua amida de dimetil alumínio correspondente. As amidas 22a-c ou 36a-c desejadas foram obtidas na faixa de rendimento de 38-45%. De forma interessante, a proteção benzílica transposta do oxigênio exocíclico para o nitrogênio N1 endocíclico durante o acoplamento (vide Suplementar para os detalhes da caracterização). Os deslocamentos químicos de RMN-"3C do núcleo benzílico de CH7> foram diagnósticos para a atribuição estrutural de derivados de N-benzila ou O-benzila como para os compostos 18a e 19a). Por outro lado, o acoplamento do cloreto de acila, derivado de 20a, com fenóxi anilinas 23-25 proporcionou as amidas protegidas de O-benzila 26-28, conforme desejado. Esta diferença na reatividade levou ao fato de correlacionar a migração do grupo benzila com a presença de um ácido de Lewis na mistura de reação. Compostos tipo 22a-c e 26- 28 foram então convertidos nos compostos alvo desejados 4-6, 8-10, 29-33 por aplicação de condições de hidrogenação catalítica sob pressão ambiente. A mesma abordagem foi aplicada à preparação de 7. Neste momento, o ácido obtido da hidrólise de 17b foi um composto bem instável, significando que qualquer tentativa de isolamento resultou em sua descarboxilação. Os inventores evitaram esta decomposição isolando o intermediário como um sal de sódio e transformando-o no cloreto de acila correspondente. O cloreto de acila foi estável o suficiente para atingir com a amida de dimetil alumínio de 2,3,5,6-tetrafluoro- 4-fenilanilina gerando o composto 7 em um rendimento de 27%. Inibição de hDHODH relações estrutura-atividade (SAR)

[0038] Primeiro, os presentes inventores avaliaram a atividade de inibição de ADHODH recombinante dos compostos 4-10 e tomaram teriflunomida, brequinar e os análogos de hidroxitriazol 2!7 como referências (Tabela 1). Entre os compostos de primeira geração 1- 3, o composto 2 mostrou o melhor equilíbrio entre a potência de ADHODH e a citotoxicidade celular e, por esta razão, foi considerado o composto mais promissor e incluído neste estudo. Tabela 1 Efeitos Biológicos dos compostos 2, 4-10, brequinar e teriflunomida O efeito dos compostos (expresso como valor de ICso, exceto para citotoxicidade), em 2 ADHODH, ensaio /n vitro; º) inibição da proliferação celular (células Jurkat T); 9 citotoxicidade, concentração de compostos causando um efeito citotóxico significativo (> 30%) (células Jurkat T); º) inibição da proliferação de PBMC estimulada por PHA. A última notação “nd” indica que o composto não foi testado nesse ensaio específico. —. Proliferação Citotoxicid Imunossupr Proliferaçã Imunossup » ade“ - essão* ADHODH? o ressão* Composto ICso + SE (efeito>=30 ICso + SE ICso+ SE(UM) ICso+SE ICso + SE (UM) + %) (UM) + (pM) ” (pM) ias Uridina (UM) Uridina Brequinar — 0,0018:0,0003 — 0,91+0,07 94,17X208 482+0,8 3,74+0,06 59,642,18 Terifluno 0,388+0,064 — 43,224+1,24 nd 5343 54,343,129º nd mida 2 0,045+0,013 1,88+0,06 nd >100 8,90,7º nd 4 0,0012 + 0,0002 —0,75+0,04 6869235 60,412 0,78+0,06 57,15+2,06 0,0043:+0,0005 — 0,82+0,03 35,62+0,98 41,31,5 0,77+0,08 — 46,84+1,27 6 0,035+0,003 — 1,560,08 8BASH148 48623 1,08+0,10 52,391,46 7 >5 Nd nd nd nd nd 8 0,760+0,136 —89,661,64 95,63+2,11 >100 69,25+2,47 >100 9 0,480 + 0,031 — 67,5541,21 >100 >100 35,26+2,34 >100 0,043 +0,005 —1,47+0,06 —55,13+2,05 >100 0,84+0,16 74,69+1,63

[0039] O análogo de 2-hidroxipirazol[1,5-a]piridina 4 (ICso = 1,2 nM) foi verificado como sendo o composto mais potente na série, já que ele foi 320 vezes mais potente do que teriflunomida (ICso= 388 nM), e apenas comparável a brequinar (ICso = 1,8 nM) no ensaio enzimático, que prova a validade desta abordagem.

[0040] Além disso, os presentes inventores focalizam a sua atenção sobre a possibilidade de decorar a parte de “piridina” do suporte bioisostérico 4, para adicionar uma interação com o pequeno bolso lipofílico criado por Val134 e Val143 (subsítio 4). O estudo foi baseado em uma abordagem computacional, levou ao resultado da perturbação de energia livre (FEP)*º de Dinâmica Molecular (MD)?º. Nas quatro posições disponíveis de 4, indicadas na

Tabela 2, foram exploradas usando-se varreduras de MD/FEP de metila e cloro para identificar os sítios mais promissores para uma substituição benéfica de hidrogênio. Tabela 2 Resultados de MD/FEP da mudança na energia livre calculada de ligação (em kcal/mol), e a incerteza computada, para a introdução de substituintes de cloro e metila no motivo 2- hidroxipirazol[1,5-a]piridina do composto 4 r “ HparaclhAG HparaCH;AAG Ss FA) (kcal/mol) (kcal/mol) a OO ca -0,35 + 0,02 1,49 + 0,07 e) F cs -0,48 + 0,02 1,19 + 0,07 RO c6 0,87 + 0,02 2,59 + 0,07 c7 -1,43 + 0,02 0,15 + 0,09

[0041] Os valores de AAG obtidos indicam que o grupo cloro é geralmente preferido em relação a metila em todas as posições, uma vez que os valores negativos representam um aumento na afinidade de ligação. Dentre os quatro sítios, a posição 7 é a mais lucrativa para uma substituição como apresenta os valores de energia mais baixos, -1,43 para o cloro e apenas um efeito marginal na energia para o grupo metila (0,15). A substituição de hidrogênio na posição 6 é menos favorito de acordo com os valores de energias positiva mais altas para cloro (0,87) e metila (2,59). As posições 4 e 5 mostram comportamento comparável, a substituição em 5 é apenas uma fatia bem tolerada em 4 para ambos os grupos.

[0042] Movendo-se para experimentos experimentais e levando em conta os resultados de MD/FEP, as duas posições mais toleradas, 5 e 7, foram consideradas moduladas. Uma vez que os derivados de cloro discutidos de 4 ainda não estão acessíveis sinteticamente neste estudo, derivados com um substituinte metila nas posições 7 e 5 foram sintetizados (Esquema 1), levando aos compostos 5 e 6, respectivamente. Enquanto a substituição da posição 5 reduziu a atividade em 25 vezes (6, ICso = 35 nM), em comparação com 4, a substituição da posição 7 forneceu um perfil similar (5, ICso = 4,3 nM). Com o composto 30 (ICso = 5,9 nM) foi validada a possibilidade de substituir a pirazol-piridina com um suporte bioisostérico de pirazol piperidina sem perder a afinidade de ligação. Três compostos (31- 33) foram dedicados à decoração do segundo anel, o suporte de bifenila; em particular, a posição meta, em virtude de não estar envolvida em qualquer ligação, foi identificada para a possível introdução de substituintes capazes de aprimorar o perfil em forma de fármacos. No análogo de piridina (composto 31), foi investigada a possibilidade de aumentar a solubilidade em estrutura geral, uma fraqueza bastante problemática do composto 4. Nos compostos 32 e 33, a presença de porções lipofílicas (F e CF3) melhorou a lipofilicidade de estrutura geral (Log D > 3) sem afetar as afinidades (ICso = 2,0 e 2,3 nM, respectivamente), Isto é bastante relevante uma vez que os logs Ds superiores a 2,5 foram correlacionados com uma melhor permeação da estrutura no sentido do sítio alvo mitocondrial.

[0043] Na segunda série (compostos 8-10 e 29, Tabela 2), a substituição do substituinte bifenílico foi investigada em uma tentativa de melhorar as propriedades farmacocinéticas e obter mais compostos semelhantes a fármaco. Em nossos estudos!? ?3, a interação ótima com o subsítio lipofílico 1 foi apenas garantida com substituição de tetrafluoro no primeiro anel. As análises conformacionais?! destacaram o papel de substituição incremental de flúor no primeiro anel na estabilização do modo de ligação semelhante a brequinar, que foi descoberto estar ligado com potência inibitória mais elevada?*. Por exemplo, a remoção de dois ou três átomos de flúor do suporte bifenílico do análogo de triazol 2 resultou em uma queda dramática na atividade Inibitória. Portanto, os inventores decidiram projetar análogos que não tinham um suporte bifenílico a fim de investigar novas possibilidades. Embora uma queda dramática na atividade foi observada movendo de 4 (ICso = 1,2 nM) para 8 (ICso = 760 nM), a substituição bifenílica parece ser necessária para que a atividade ocorra. A adição de um grupo metila à posição 3 do primeiro anel (composto 9) levou à atividade mover ligeiramente em direção à faixa teriflunomida (ICso= 480 nM), enquanto adiciona uma segunda metila à posição 6 (composto 10), finalmente fazendo com que uma faixa nM fosse obtida (ICso = 43 nM). Com base nestes resultados, os inventores previram que a maior rigidez concedida pela dupla substituição de metila e aumento na hidrofobicidade pode ser crucial para a atividade. Estes resultados suportaram o design do composto 29 onde a rigidez aumentada é concedida pela dupla substituição no primeiro anel. Em particular, uma afinidade ótima para o subsítio 1 é concedida pela presença no primeiro anel de uma porção isopropila; composto 29 com ICso = 6,9 nM é o composto mais potente da série fenilfenóxi. Ensaios com base em células Proliferação, citotoxicidade e imunossupressão em células Jurkat

[0044] Depois da avaliação dos compostos 4-10 para a sua capacidade de inibir a ADHODH recombinante in vitro, os compostos ativos 4-6 e 8-10 foram testados quanto aos seus efeitos sobre a proliferação celular em células Jurkat (Tabela 1). A estabilidade dos compostos sob as condições experimentais aplicadas também foi verificada e foram todas verificadas serem estáveis. A potente atividade ADHODH in vitro observada para os compostos 4 e 5 foi traduzida em um potente efeito antiproliferativo, que foi ligeiramente superior àquele do próprio brequinar em ambos os casos. Os compostos 6 e 8-10 exibiram perfis similares, embora a potência de /ADHODH mais fraca fosse refletida em efeitos antiproliferativos mais fracos. Além de 4 e 5, 6 e 10 também ultrapassaram teriflunomida, com ambos mostrando efeitos antiproliferativos que foram 30 vezes mais potentes. À dependência do DHODH dos efeitos antiproliferativos dos compostos 4-6 e 8-10 foi testada por análise da sua atividade na presença de uridina a 100 uM??. Conforme mostrado na Tabela 1, os efeitos antiproliferativos foram revertidos pela adição de uridina exógena, que indica fortemente que os compostos agem como inibidores de biossíntese de pirimidina, e assim inibem a proliferação de células Jurkat através deste mecanismo. A exceção para isto é 8, que é provavelmente muito fraca como inibidor de ADHODH para produzir um efeito mediado por uridina inverso. A fim de avaliar se os efeitos antiproliferativos resultaram da morte celular, a citotoxicidade foi avaliada em células Jurkat T usando o ensaio verde CellITox e a concentração de compostos que foi capaz de causar a morte celular de 30% foi detectada. O composto 4 não teve efeito negativo sobre a viabilidade celular até 60 UM, enquanto 5 foi verificado ser citotóxico em uma concentração similar a brequinar. De forma intrigante, nenhum efeito negativo sobre a viabilidade celular foi observado nos compostos 8-10, para os quais um difeniléter foi usado para introduzir interações de subsítio 1, mesmo quando eles foram testados em uma concentração de 100 UM. Este resultado é bastante interessante já que mostra como os perfis promissores semelhantes a fármaco podem ser obtidos utilizando esta porção.

[0045] A fim de investigar se a atividade imunossupressora de compostos, seu efeito sobre a proliferação de células mononucleares de sangue periférico ativadas por fitohamaglutinina (PHA) (PBMCs) foi avaliada e comparada com a de brequinar. Conforme mostrado na Tabela 1, o efeito antiproliferativo de brequinar é 10 vezes maior do que o de teriflunomida (3,74 e 54,3 UM, respectivamente), que confirma a pesquisa anterior. Observou-se que a atividade potente contra o ADHODH correlaciona-se com a inibição potente da proliferação de PBMC ativada para todos os compostos testados. Esta inibição, no entanto, pode ser revertida pela adição de uridina exógena, sugerindo que a atividade imunossupressora dos compostos pode ser devido à inibição da síntese de nucleotídeo de pirimidina de novo. Proliferação, citotoxicidade e diferenciação mieloide em células de leucemia

[0046] Movendo adiante em seu estudo, os presentes inventores avaliaram os efeitos de nossos inibidores de /ADHODH em duas linhagens de células de AML (U937 e THP1). Os inventores decidiram comparar o composto 4, julgado como o melhor compromisso entre potência e citotoxicidade, triazol 2, o composto superior da primeira série que exibe citotoxicidade muito baixa, e brequinar, que foi usado como um controle positivo. Nos primeiros experimentos, os inventores avaliaram a viabilidade celular utilizando experimentos baseados em CFSE. Conforme mostrado na Figura 5A, ambos os compostos 4 e brequinar mostraram citotoxicidade dependente de concentração e forte, enquanto o composto 2 só foi capaz de induzir a morte celular em altas doses.

[0047] A citotoxicidade do composto 4 foi totalmente revertida quando a uridina foi adicionada, mas este não foi o caso com o composto 2 (Figura 5B). Isto sugere que a citotoxicidade só pode ser atribuída à inibição de ADHODH para o composto 4, enquanto 2 foi associado com a toxicidade fora-alvo em altas doses. Além disso, a citotoxicidade contra U937 foi ligeiramente mais evidente do que a contra THP1, que provavelmente reflete a heterogeneidade da AML. Ensaios de proliferação baseados em CFSE foram também realizados e, como esperado, o composto 4, brequinar e, em menor extensão, o composto 2, toda proliferação celular grandemente reduzida, como mostrado na Figura 5C. De modo interessante, o composto 4 pareceu ser mais eficaz do que o brequinar em concentrações mais baixas tanto em experimentos de proliferação como de citotoxicidade. Enquanto os resultados dos ensaios de proliferação foram esperados, os dados de citotoxicidade, na primeira vista, contradisseram as experiências de células Jurkat-T, que tinham mostrado uma toxicidade muito baixa dos compostos. Entretanto, como células maduras têm uma meia-vida muito mais curta do que as imaturas, os inventores sugeriram que a citotoxicidade considerável observada em linhagens de células de AML, mas não em células Jurkat-T, tinha que ser atribuída à diferenciação induzida em células leucêmicas por inibidores de ADHODH. Os inventores investigaram, portanto, o efeito de diferenciação induzido pelos compostos 2, 4 e brequinar em suas linhagens de células AML em várias concentrações. O processo de diferenciação foi acompanhado pela análise da expressão de CD11b e CD14, já que estes antígenos estão tipicamente presentes em células mieloides maduras. Em particular, a diferenciação celular poderia ser mais bem avaliada com CD11b em U937 e com CD14 em THP1; resultados similares, mas menos proeminentes foram obtidos com CD11b em THP1. Nossos experimentos demonstraram claramente que ambos os compostos 4 e brequinar induziram uma forte diferenciação em células U937 e THP1, conforme mostrado nas Figuras 6A, 6B. Após o tratamento com estes compostos, de fato, a expressão de CD11b e CD14 aumentou significativamente dia por dia, de acordo com as concentrações de fármaco.

[0048] Notadamente, o composto 4 induziu um efeito de diferenciação que foi comparável ao do brequinar em uma concentração inferior de 1-log. O composto 2, por outro lado, induziu apenas um aumento de CD11b brando em células U937 que ocorreram somente em altas doses (10 uM), onde foi associada com morte celular significativa. Estes dados, junto com os resultados de citotoxicidade, indicaram que o composto 2 não foi capaz de induzir a diferenciação mieloide e causou toxicidade fora do alvo em altas doses. Por esta razão, o composto 2 foi excluído de experimentos adicionais com THP1 e uridina.

[0049] A fim de demonstrar ainda mais a conexão entre a diferenciação e a inibição de ADHODH, os experimentos de diferenciação foram repetidos na presença de uridina, e a recuperação completa do fenômeno foi observada (Figura 6C, D). As experiências de diferenciação tiveram que ser interrompidas após 4 dias, pois as células diferenciadas progressivamente morreram. Com isto em mente, pode-se ver como o composto 4 e o brequinar sozinhos causaram a morte da vasta maioria das células leucêmicas in vitro, mesmo que a proporção de células diferenciadoras diárias alcançasse um máximo de 40% (Figura 7). Novamente, o composto 4 foi capaz de induzir uma morte maciça de células leucêmicas já a 0,1 UM, isto é, a uma concentração inferior de 1-log comparada com brequinar.

Citotoxicidade em linhagens de células cancerígenas humanas diferentes.

[0050] Na última fase de seu estudo, os presentes inventores avaliaram os efeitos de nossos inibidores de ADHODH em uma série de linhagens de células cancerígenas humanas. Como representativo de diferentes tipos de tumores, eles envolveram cinco linhagens de células diferentes, em particular: MDA MB231 (células de câncer de mama), A2780 (células de câncer de ovário), PANC-1 (células de câncer pancreático), HEPG2 (células de câncer hepatocelular de fígado) e HCT-116 (células de câncer de cólon). Todos os experimentos foram realizados em 72h usando-se inicialmente uma faixa de concentração de composto 4 de 0,1-100 UM. No seguinte foi necessário repetir o teste para A2780 e PANC-1 na faixa de concentração de 1-1000 nM e para HEG2 e HCT-116 na faixa de concentração de 1-10000 nM. Os resultados de tais experimentos podem ser encontrados na Tabela 3, brequinar foi usado como comparação.

Tabela 3 Citotoxicidade do composto 4 e brequinar em linhagens de células de câncer humanas diferentes Linhagem Composto 4 Composto 4 com Brequinar Brequinar celular 1C5so (UM) uridina 1Cso (UM) com uridina 1Cso (UM) 1C5so (UM) A2780 <o1 13,9 <o1 15,5 PANC-1 <o1 <o,1 0,28 <o,1 HEPG2 0,028 >10 0,046 >10 HCT-116 0,025 4,3 0,097 3

[0051] Verificou-se que ambos o composto 4 e brequinar foram citotóxicos contra todas as linhagens celulares que foram investigadas. Em cada caso, a citotoxicidade observada foi invertida quando o experimento foi realizado em presença de uridina, uma indicação de que a inibição de ADHODH está atrás do efeito biológico observado. Movendo-se para detalhes, ao lado da linhagem de câncer de mama MDA MB231, em todos os outros casos (A2780, PANC-1, HEG2 e HCT-116) verificou-se que o composto 4 foi mais eficaz para brequinar, demonstrando um comportamento superior semelhante a fármaco. Os dados mais interessantes podem ser observados em células HEG2 e HCT-116, hepatocelular do fígado e células de câncer de cólon, respectivamente, onde o composto 4 apresentou um ICso na faixa de baixa nM. Caracterização físico-química e perfil de ADME preliminar

[0052] A determinação das propriedades físico-químicas principais que governam o perfil ADME foi realizada para todos os compostos medindo a sua lipofiliidade (log D? 9), e solubilidade em pH fisiológico. Os dados são reportados na Tabela 4. A solubilidade do composto foi avaliada em pH 7,4 em solução salina tamponada com fosfato (PBS), a 37ºC para simular o fluido corporal, e em PBS com 2% v/v de DMSO para explorar os limites de solubilidade sob condições experimentais /n vitro. Infelizmente, todos os compostos mostraram uma solubilidade em torno de dez vezes mais baixa do que brequinar.

[0053] Entretanto, os valores foram suficientes para permitir que os testes /n vitro sejam realizados. Todos os compostos apresentam bom equilíbrio lipofílico-hidrofílico, com valores de log D que são ótimos para o comportamento farmacocinético favorável; a diferença observada entre o log P calculado (clogP) e o log D?:* medido estava em concordância com a presença de uma ionização de composto significante em pH fisiológico. O comportamento do soro dos compostos 2 e 4, selecionado para estudos de diferenciação em células leucêmicas, foi caracterizado por medição da estabilidade do soro humano e ligação da proteína do soro. Os compostos 2 e 4 mostraram perfil de soro que foi muito similar à do composto de referência brequinar; boa estabilidade e uma porcentagem muito alta de ligação de proteína (Tabela 5)º8 2º, Tabela 4 2) clogP calculado usando Bio-Loom para Windows, versão 1,5; ) medido utilizando-se o método de frasco de agitação. A notação “n.d.” indica que o composto não foi testado nesse ensaio específico Composto Solubilidade (uM) Solubilidade (uM) clogPº logD74+ SD" em PBS em PBS com DMSO a 2% “OBrequinar — 229 449 639 183002 Teriflunomida 2692 nad. n.d. n.d. 2 956 2169 2,59 0,98 +0,03 4 12 27 4,06 2,35 +0,02

14 3,0 4,56 2,70 +0,02 6 2,8 0,4 4,56 2,47 +0,09 8 47 90 4,92 2,30 +0,02 9 7,0 23 5,42 2,75 +0,01 2,5 27 5,27 2,93 +0,09 Tabela 5 Estabilidade de soro humano e ligação de proteína dos compostos 2 e 4, em comparação com brequinar % composto após . Composto % ligação 24 h em soro humano Brequinar 98 98,83 2 86 99,51 4 100 99,10 Conclusões

[0054] Os presentes inventores identificaram uma nova classe de inibidores que se baseiam em hidroxil-pirazol[1,5-a]piridina, um bioisóstero incomum da função de ácido carboxílico. O composto 4, um dos inibidores ADHODH mais potentes já descobertos, demonstrou induzir a diferenciação mieloide em duas linhagens de células de AML, levando à morte maciça de células leucêmicas. Notavelmente, este efeito foi obtido em uma concentração que era 1-log menor do que aquela do líder brequinar, e foi restrita a células leucêmicas sozinhas. De fato, os inventores provaram que a citotoxicidade não estava relacionada à inibição ADHODH per se, já que o composto mostrou pouca ou nenhuma toxicidade em relação às células Jurkat-T, mas, sim ao efeito de diferenciação induzido exclusivamente em células AML através da inibição ADHODH. Portanto, é aparente que o composto 4 exibe um perfil de toxicidade ótimo e atividade no alvo altamente seletiva, tornando-o um candidato ideal para estudos in vivo adicionais em modelos de AML. O composto 4 foi considerado eficaz também contra outras linhagens de células cancerosas, em particular em linhagens de tumor sólidos múltiplos, em que à ICso observada estava sempre abaixo de 100 nM estando em HEG2 e HCT-| 16 na baixa nM. Materiais e métodos Química

Métodos gerais

[0055] Todos os reagentes químicos foram obtidos a partir de fontes comerciais (Sigma Aldrich, Alfa Aesar, FluoroChem) e usados sem purificação adicional. A cromatografia de camada delgada (TLC) foi realizada para monitorar o progresso da reação. Solventes de grau analítico (acetonitrila, éter diisopropílico, éter dietílico, diclorometano [DCM], dimetilformamida [DMF], etanol 99,8% v/v, acetato de etila [EtOAc], hexano, metanol [MeOH], éter de petróleo p.e. de 40-60ºC [éter de petróleo], tolueno) foram usados sem purificação adicional. Quando necessário, os solventes foram secos em peneiras moleculares de 4 À. Tetraidrofurano (THF) foi destilado de Na e benzofenona sob N2 imediatamente antes do uso. Cromatografia de camada delgada (TLC) sobre sílica gel foi realizada em placas de 5 x 20 cm em espessura de camada de 0,25 mm. MgSO, anidro foi usado como agente secante para as fases orgânicas. A purificação do composto foi obtida usando-se cromatografia de coluna em flash em sílica gel (Merck Kieselgel 60, 230-400 mesh ASTM) e os eluentes indicados nos procedimentos para cada composto ou usando Combiflash Rf 200 (Teledyne Isco), com 5-200 ml/min, 200 psi (com válvula de injeção automática) e colunas de sílica RediSep Rf (Teledyne Isco), com os eluentes indicados nos procedimentos para cada composto. Os compostos sintetizados em nosso laboratório variaram geralmente entre 90% e 99% de pureza. Experimentos biológicos foram realizados em compostos com uma pureza de pelo menos 95%. A pureza foi verificada utilizando-se dois métodos analíticos. Análises de HPLC foram realizadas em um sistema cromatográfico UHPLC (Perkin Elmer, Flexar). A coluna analítica foi uma UHPLC Acquity de fluoro-fenila (2,1 x 100 mm, tamanho de partícula de 1,7 um, Waters). Os compostos foram dissolvidos em acetonitrila e injetados através de um circuito de 20 ul. A fase móvel consistiu em acetonitrila/água com ácido trifluoroacético a 0,1% (razão entre 60/40 e 40/60, dependendo do fator de retenção do composto). Os tempos de retenção de UHPLC foram obtidos em taxas de fluxo de 0,5 ml/min e o efluente da coluna foi monitorado a 215 e 254 nm, referenciado contra um comprimento de onda de 360 nm. Ensaios de solubilidade, em PBS a pH 7,4, e ensaios de estabilidade em condições de teste de células foram realizados em um sistema HPLC-UV (MERK-HITACHI), equipado com um auto amostrador de 60 ul de volume de injeção (MERK-HITACHI AS- 2000A), uma bomba de HPLC binária (MERK-HITACHI L-6200 IP) e um detector de arranjo de diodo (MERK-HITACHI L-4250). Análises de LC foram realizadas utilizando-se uma coluna Agilent Zorbax SB-fenila (4,6 x 250, 5 um). Os pontos de fusão (m.p.) foram medidos em um aparelho capilar (Búchi 540). A determinação de ponto de fusão final foi obtida colocando-se a amostra a uma temperatura de 10ºC abaixo do p.f. e aplicando-se uma taxa de aquecimento de 1ºC por min'!. Todos os compostos foram rotineiramente verificados por RMN-!H e -3C e espectrometria de massa. Os espectros de IR dos compostos sólidos foram registrados em FT-IR (PerkinElmer SPECTRUM BXII, dispersões de KBr), utilizando o aparelho de refletância difusa DRIFT ACCY. Os espectros de MS foram realizados em uma placa Finnigan-MAT TSQ-700 (70 eV, entrada direta para ionização química [CI]), ou uma Waters Micromass ZQ equipada com uma fonte de ESCi para espectros de massa de ionização por electrospray. Os espectros de RMN-!'H e -BC foram realizados em um instrumento Bruker Avance 300 ou um JEOL ECZR600. As seguintes abreviações são usadas para padrões de acoplamento: br = amplo, s = singlet, d = doublet, dd = doublet de doublets, t = triplet, q = quartet, m = multiplet. Os deslocamentos químicos (5) são dados em partes por milhão (ppm). Neste trabalho, prótons e carbonos são marcados (a, 4, 6 d, e fg him neo) de acordo com o Esquema 2. Os valores marcados com um asterisco são intercambiáveis. Os espectros de 3C detalhados de compostos de bifenila tetrafluorados (compostos finais 4-7 e intermediários 22a-c) não foram inteiramente relatados devido a seus padrões especialmente complicados (atribuíveis aos múltiplos acoplamentos entre átomos de flúor e carbono). Para estes espectros, apenas os sinais de !?C causados pela subestrutura heterocíclica e carbonos não aromáticos são designados. Para os intermediários 15a, 15b, 15c, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a e compostos finais 4-6 e 8-10, espectros de HRMS foram registrados em um espectrômetro de massa LTQ Orbitrap (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha), equipado com uma interface de pressão atmosférica e um instrumento de fonte de íons ESI. Os compostos 24%º e 25% foram preparados de acordo com procedimentos previamente descritos.

[0056] Procedimentos gerais para a síntese de 15a, 15b, 15c. Uma solução de ácido hidroxilamina-O-sulfônico (HOSA, 18 g, 0,16 mol) e a piridina de tipo apropriado 11 (3 eq.) foi agitada em água (150 ml), a 90ºC por 1 h. a solução foi resfriada à temperatura ambiente e K2CO;3 (21,99 g, 0,16 mol) foi então adicionado. A suspensão resultante foi concentrada sob vácuo e o resíduo absorvido com abs EtoH (200 ml). A suspensão resultante foi filtrada e malonato de dietila (50,98 g, 48,56 ml, 0,32 mol) foi adicionado ao filtrado. A solução foi agitada a 90ºC por 3 horas e, em seguida, concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtOH 9/1 v/v), para produzir um óleo pegajoso acastanhado (tipo 14), que foi usado na etapa subsequente sem qualquer purificação adicional. Terc-butóxido de potássio (17,86 g, 1 eq) foi adicionado em porções a uma solução do tipo 14 em THF seco (300 ml). A suspensão laranja-escura resultante foi agitada em temperatura ambiente por alguns minutos até que a conversão completa fosse observada, após o que foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi diluído e acidificado a pH 2 usando-se HCl a 0,5 N (250 ml) e extraído com acetato de etila (2 x 150 ml). As fases orgânicas foram coletadas, secas e evaporadas sob vácuo para produzir um óleo bruto amarelado que foi purificado por cromatografia em flash (eluente: diclorometano/MeOH 9/1 v/v), para produzir os compostos desejados como sólidos brancos.

[0057] 2-hidroxipirazol[1,5-ajpiridina-3-carboxilato de etila (15a). Sólido laranja claro (p.f.

150.0 - 151.3ºC, a de metanol). Rendimento 21 %. RMN-!'H (300 MHz, DMSO): 3 1.29 (t 3H, J = 7.0 Hz, -CH2XCAH), 4.24 (q, 2H, ] = 7.0 Hz, -CHCH3), 6,98 (t 1H, = 6,7 Hz, H-b), 7,48 (t 1H, ) = 7,5 Hz, H-o), 7,84 (a, 1H, ) = 8,8 Hz, H-d), 8,55 (d, 1H, ) = 6,7 Hz, H-a), 11,14 (s 1H, -OM); RMN-3C (75 MHz, DMSO): 614,5 (-CH2CH3), 58,9 (-OCH2CH3), 86,4 (C- A, 113,1 (Cb), 116,9 (C-d), 128,2 (C-d, 129,2 (C-a), 141,5 (C-e), 162,7 (Ch), 164,5 (C- 9)"; MS (CI) 207 (M+1), IR (KBr) u (cm-1): 3094, 2979, 1700, 1639, 1559, 1534, 1448, 1330, 1246, 1212, 1156, 1107, 1026, ESI-HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para CioHi1N2O3

207.0764, observado 207.0769.

[0058] 2-hidróxi-7-metil-pirazol[1,5-a]pirídina-3-carboxilato de etila (15b). Sólido branco (p.f. 113,8-114,6ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 19%. RMN-!H (300 MHz, DMSO): 5 1,30 (t 3H, J] = 7,0 Hz, -OCH2CA), 2,60 (s, 3H, Ar-CH;), 4,24 (q, 2H, J = 7,0 Hz, -OCH2CH3), 6,91 (d, 1H, ) = 6,9 Hz, H-b), 7,42 (t 1H,) = 7,9 Hz, H-O, 7,75 (ad, 1H, ) = 8,7 Hz, H-a), 11,20 (s, 1H, -OM); RMS-C (75 MHz, DMSO): ô 14,5 (- OCH2CH3), 17,4 (Ar- CH3), 58,9 (-O CH2CH3), 86,5 (C-f, 112,67 (C-b), 114,5 (C-d), 128,1 (C- O, 138,3 (C-a), 141,8 (C-e), 162,8 (C-h)", 164,2 (C-9)”; MS (CI) 221 (M+1). IR (KBr) u (cm- 1): 3069, 2991, 1700, 1637, 1560, 1533, 1385, 1330, 1219, 1163, 1104, 1068, 1039. ESI-

HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para Cu1H13N203 221.0921, observado 221,0926.

[0059] 2-hidróxi-5-metil-pirazol[1,5-a]pirídina-3-carboxilato de etila (15€). Sólido branco (p.f. 123,4-126,6ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 19%. RMN-!H (300 MHz, DMSO): 5 1.29 (t 3H, J] = 7,1 Hz, -OCH2CA), 2,37 (s, 3H, Ar-CH;), 4,23 (q, 2H, 3 =7,1 Hz, -OCHCH3), 6,82 (da, 1H, ) = 6,9, 1,7 Hz, H-b), 7,61 (s 1H, H-d), 8,42 (4, 1H, ) = 6,9 Hz, H-a), 11,04 (br 5, 1H, -OM); RMN-2C (75 MHz, DMSO): ô 14,5 (- OCH2CH3), 21,0 (Ar-CH3), 58,9 (-OCH2CH3), 85,6 (C-B, 115,2 (C-b)”, 115,6 (Cd, 128,5 (C-a), 139,1(C-d), 141,5 (C-e), 162,8 (C-h)”, 164,6 (C-9)"; MS (CI) 221 (M+1), IR (KBr) u (cm-1): 3064, 2986, 1654, 1561, 1498, 1435, 1305, 1250, 1211, 1185, 1112, 1029, ESI- HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para Ci1H13N203 221,0921, observado 221,0926.

[0060] N-benzil-2-oxo-pirazol[1,5-a]piridina-3-carboxilato de etila (182) e 4.14 2- benziloxipirazol[1,5-a]piridina-3-carboxilato de etila (19a) a partir de 15a. Brometo de benzila (3,0 g, 14,50 mmols) foi adicionado em gotas a uma mistura de 15a (2,74 g, 16,00 mmols) e carbonato de césio (11,85 g, 36,40 mmols), em DMF seca (50 ml). A mistura de reação foi agitada por 18 horas em temperatura ambiente e água (100 ml) foi então adicionada. A mistura foi extraída com EtOAc (3 x 100 ml), a camada orgânica combinada foi lavada com salmoura e, em seguida, seca e evaporada sob pressão reduzida para produzir um óleo incolor. Este último forneceu dois pontos em TLC (eluente: éter de petróleo/EtOAc 80/20 v/v), que foram atribuídos aos dois isômeros pirazol[1, 5-a]-piridina. A mistura foi separada utilizando-se cromatografia em flash (eluente: éter de petróleo/EtOAc 80/20 v/v, em seguida eluente: diclorometano/MeOH 9:1 v/v). As estruturas foram determinadas inequivocamente usando-se RMN-2D heteronuclear (HSQC, HMBC e NOESY, vide informações suplementares).

[0061] (19a) Primeiro isômero eluído, sólido amarelo claro (m.p.: 100,0-100,8ºC, a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 75%. RMN-!'H (300 MHz DMSO): d 1,30 (t 3H, J] = 7,1 Hz -OCH2C/A), 4,24 (q, 2H, ] = 7,1 Hz -OCACH3), 5,44 (s, 2H, - OCHPh), 7,04 (t 1H, = 6,9 Hz, H-b), 7,29 — 7,45 (m, 3H, H-o, H-n), 7,47 - 7,59 (m, 3H, H-m, H-d, 7,91 (df, 1H, ) = 8,8 Hz, H-d), 8,67 (d, 1H, ] = 6,8 Hz, Ha); RMN-BC (75 MHz DMSO): à 14,4 (-OCH2CH3), 59,0 (-OCH2CH3), 70,2 (-OCH2Ph), 87,0 (CA, 113,3 (Cb), 117,2 (Cad), 127,4 (Gm), 127,9 (Go), 128,3 (Gn), 128,9 (Co), 129,6 (Ca), 136,6 (C)),

142,0 (Ge), 161,9 (Ch), 164,3 (Gg); MS (CI) 297 (M+1), IR (KBr) u (cm-1): 3097, 3033, 2978, 1675, 1635,1530, 1515, 1440, 1364, 1251, 1208, 1141, 1053, 1021, ESI-HRMS (m/z) [M + H]J* calculado para Ci7H16N203 297,1234, observado 297,1240.

[0062] (18a) Segundo isômero eluído, sólido branco (m.p: 172,3-174,0ºC, a partir de EtOAc/éter diisopropílico 1/1 v/v). Rendimento de 21%, RMN-!H (300 MHz DMSO): ó 1,28 (4 3H, J) = 7,1 Hz -OCHXCH), 4,22 (q, 2H, J] = 7,1 Hz -OCHCH3), 5,43 (s, 2H, -NCAPh), 6,95 (ta, 1H, =7,1, 1,0 Hz, 4-5), 7,18 - 7,38 (m, 5H, H-m, H-o, H-n), 7,59 (t 1H,J=8,0 Hz, H-o), 7,92 (a, 1H, 1) = 8,8 Hz, H-d), 8,41 (a, 1H, ) = 6,9 Hz, H-a); RMN-PC (75 MHz DMSO): 5 14,4 (-OCH2CH3), 44,5 (-NCH2Ph), 59,4 (-OCH2CH3), 84,3 (CA, 113,3 (Cb), 117,2 (C-d), 126,0 (Ga), 128,0 (Cm), 128,8 (Go), 129,8 (Cn), 133,3 (Cod, 134,8 (CG), 143,6 (C- e), 160,8 (Cg)”, 164,0 (Ch); MS (CI) 297 (M+1), IR (KBr) u (cm-1): 3084, 3056, 2977, 1699, 1631, 1547, 1511, 1464, 1431, 1345, 1238, 1135, 1030. ESI-HRMS (m/2z) [M + HJ* calculado para Ci7H16N203 297,1234, observado 297,1239.

[0063] N-benzil-7-metil-2-oxo-pirazol[1,5-a]piridina-3-carboxilato de etila (18b) e 4.1.6. 2- benzilóxi-7-metil-pirazol[ 1, 5-a]Jpiridina-3-carboxilato de etila (19b) a partir de 15b. Brometo de benzila (0,85 g, 4,99 mmols) foi adicionado em gotas a uma mistura de 15b (1,00 g, 4,54 mmols) e carbonato de césio (3,70 g, 11,35 mmols), em DMF seca (25 ml). À mistura de reação foi agitada por 5 horas em temperatura ambiente e água (100 ml) foi então adicionada. A mistura foi extraída usando EtOAc (3 x 100 ml), a camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca e evaporada sob baixa pressão para produzir um óleo incolor. Este último mostrou dois pontos em TLC (eluente: éter de petróleo/EtoAc 80/20 v/v), atribuído aos dois isômeros pirazol[1,5-a]-piridina. A mistura foi separada utilizando-se cromatografia em flash (eluente: éter de petróleo/EtOAc 90/10 v/v, em seguida eluente: diclorometano/MeOH 9:1 v/v). (19b) Primeiro isômero eluído, sólido amarelo claro (p.f. 74,3-75,9ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 93%. RMN-!H (600 MHz CDCI3 ): 51,41 (t 3H, ) = 7,1 Hz -OCHxC/A4), 2,68 (s, 3H, Ar- CH), 4,37 (q, 2H, ] = 7,1 Hz -OCHCH3), 5,54 (s, 2H, -OCHPh), 6,68 (a, 1H, ) = 7,0 Hz, H-b), 7,24 — 7,32 (m, 2H, H-o, H-d, 7,37 (t 2H, = 7,6 Hz, H-n), 7,58 (a, 2H,) = 7,4 Hz, H-m), 7,89 (a, 1H, ) = 8,8 Hz, 4a); RMN-BC (151 MHz CDCI3): ô 14,7 (-OCH2CH3), 17,9 (Ar-CH3), 59,7 (-OCH2CH3), 70,8 (-OCH2Ph), 88,4 (CA, 112,2 (Gb), 115,7 (Cad), 127,7 (CG m), 127,8 (Co), 127,9 (Cd, 128,4 (Gn), 137,2 (C)), 138,9 (Ga), 143,2 (Coe), 163,6 (GH), 164,7 (Gg)"; MS (ESI) 311 (M+1). IR (KBr) u (cm-1): 3061, 3026, 2974, 1684, 1640, 1539, 1516, 1448, 1358, 1274, 1214, 1135, 1107, 1011.

[0064] (18b) Segundo isômero eluído, sólido branco (p.f. 145,0-147,8ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 5%. RMN-!'H (600 MHz DMSO): à 1,29 (é 3H, ) = 7,1 Hz -OCHxCA), 2,62 (s, 3H, Ar-CH), 4,22 (q, 2H, ) = 7,1 Hz, -OCHCH;), 5,41 (s, 2H, -NCABPh), 6,75 (a, 1H, 1 = 7,1 Hz, H-b), 6,96 (a, 2H, 1 = 7,5 Hz, H-m ), 7,22 (6 1H, =7,2 Hz, H-o), 7,27 (t 2H, ) =7,A Hz, H-n), 7,53 (é 1H, = 8,0 Hz, H-o), 7,86 (q, 1H, J) = 8,7 Hz, H-d); RMN-BC (151 MHz DMSO): 3 14,6 (-OCH>CH3), 20,0 (Ar-CH3), 50,4 (-NCH2Ph), 58,6 (-OCH2CH3), 83,8 (C-B, 114,2 (Gb)”, 114,8 (C-a)”, 126,2 (Gm), 127,8 (Go), 128,9 (Gn), 134,3 (Cd, 135,5 (C)), 140,3 (Ca), 148,5 (C-e), 163,1 (Cg)", 165,0 (GA); MS (ESI) 311 (M+1). IR (KBr) u (cm-1): 2975, 1718, 1647, 1559, 1516, 1437, 1318, 1250, 1154, 1129, 1071.

[0065] N-benzil-5-metil-2-oxo-pirazol[1,5-a]pirídin-3-carboxilato de etila (18c€) e 4.1.8. 2- benzilóxi-5-metil-pirazol[ 1, 5-a]piridina-3-carboxilato de etila (19c€) a partir de 15c. Brometo de benzila (0,85 g, 4,99 mmols) foi adicionado em gotas a uma mistura de 15c (1,00 9, 4,54 mmols) e carbonato de césio (3,70 g, 11,35 mmols), em DMF seca (25 ml). A mistura de reação foi agitada por 4 horas em temperatura ambiente e água (100 ml) foi então adicionada. A mistura foi extraída usando EtOAc (4 x 100 ml), a camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca e evaporada sob baixa pressão para produzir um óleo incolor. Este último mostrou dois pontos em TLC (eluente: éter de petróleo/EtOAc 80/20 v/v), atribuído aos dois isômeros pirazol[1,5-a]-piridina. A mistura foi separada utilizando-se cromatografia em flash (eluente: éter de petróleo/EtOAc 90/10 v/v, em seguida eluente: diclorometano/MeOH 9:1 v/v).

[0066] (19c) Primeiro isômero eluído, sólido amarelo claro (p.f. 81,5-83,0ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 58%. RMN-!H (600 MHz CDCI3 ): 51,41 (£ 3H,) =7,1 Hz -OCH2CH3), 2,42 (s, 3H, Ar-CH5), 4,37 (q, 2H, J = 7,1 Hz -OCHXCH3), 5,48 (s, 2H, -OCHZPh), 6,66 (dd, 1H, J] = 6,90 Hz, 1,9 Hz, H-b), 7,31 (t 1H, =7,4Hz,H-o), 7,38 (é 2H, =7,6 Hz, H-n), 7,55 (a, 2H, ) = 7,5 Hz, H-m), 7,79 (s 1H, H-d), 8,15 (d, 1H, J =6,9 Hz, Ha); RMN-C (151 MHz, CDCI3): 5 14,7 (-OCH2CH3), 21,7 (Ar-CH3), 59,7 (-

O CH2CH;3), 70,7 (-O CH2Ph), 87,6 (C-B, 115,0 (C-b), 117,1 (C-d), 127,3 (C-m), 127,9 (C-o), 128,1 (C-a), 128,5 (Cn), 136,9 (C-)), 139,3 (C-d), 143,1 (C-e), 163,6 (C-h)', 165,2 (C-9)'; MS (ESI) 311 (M+1). IR (KBr) u (cm-1): 3048, 2981, 1687, 1641, 1540, 1519, 1443, 1364, 1289, 1252, 1215, 1172, 1141, 1054.

[0067] (18c) Segundo isômero eluído, sólido branco (p.f. 167,1-169,5ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 29%. RMN-!H (600 MHz DMSO): 5 1,45 (£ 3H, ) = 7,1 Hz -OCHXCA), 3,53 (s, 3H, Ar-CA6), 4,38 (q, 2H, J) = 7,1 Hz, -OCACH3), 5,56 (s, 2H, -NCAHPh), 6,97 (da, 1H, ) = 7,0 Hz, 1,8 HZ, H-b), 7,37 (a, 2H,) =7,3 Hz, H- m), 7,43 (t 1H, =7,3 Hz, H-o), 7,49 (t 2H, = 7,4 Hz, H-n), 7,90 (s, 1H, H-d), 8,48 (a, 1H, =7,0 Hz, H-a); BC-NMR (151 MHz DMSO): 5 14,6 (-OCH2CH3), 21,1 (Ar- CH3), 43,7 (- NCH2Ph), 58,4 (-O CH2CH;3), 82,8 (C-f), 114,4 (C-b), 115,2 (C-d), 124,6 (C-a), 127,2 (C-m), 128,0 (C-o), 128,9 (C-n), 134,1 (C-/), 142,8 (C-c), 144,0 (C-e), 160,4 (C-9)”, 163,3 (C-h)"; MS (EST) 311 (M+1), IR (KBr) u (cm-1): 3087, 2979, 1701, 1632, 1539, 1502, 1430, 1365, 1305, 1243, 1160, 1113, 1040.

[0068] 2-metoxipipirazol[1,5-a]piridina-3-carboxilato de etila (16a) e 4.1.10 I-metil-2-0x0- 1,2-diidropirazol[1,5-a]Jpirídina-3-carboxilato de etila (17a) de 15a. Carbonato de césio (1,48 g, 10,67 mmols) foi adicionado a uma solução de 15a (1,00 g, 4,85 mmols), em THF seco (30 ml), enquanto agitado sob nitrogênio. Iodeto de metila (2,07 g, 7,28 mmols) foi em seguida adicionado à suspensão laranja escura resultante e a mistura foi agitada a 40ºC durante a noite. A suspensão foi então concentrada sob vácuo, extraída com água (100 ml!) e extraída com EtoAc (3 x 100 ml). As camadas orgânicas foram coletadas, secas e evaporadas sob vácuo para produzir um material bruto que foi purificado por cromatografia em flash (eluente: éter de petróleo/FtOAc 8/2 v/v) e, em seguida, eluente: diclorometano/MeOH 9:1 v/v). As estruturas foram determinadas inequivocamente usando- se RMN-"3C heteronuclear (HSQC, HMBC e NOESY, vide informações suplementares).

[0069] (16a). Sólido branco (p.f.: 128,9-129,4ºC, a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 59%. RMN-!'H (300 MHz DMSO): à 1,29 (t 3H, J] =7,1 Hz, - OCH2CH3), 4,00 (s, 3H, -OCAH) 4,23 (q, 2H, ] = 7,1 Hz, -OCHCH3), 7,02 (td, 1H, ) = 6,9 Hz, 1,0 Hz, H-b), 7,52 (t 1H, =7,9 Hz, 4-0, 7,88 (a, 1H, ) = 8,9 Hz, H-d), 8,65 (a, 1H, ) = 6,8 Hz, Ha); RMN-BC (75 MHz DMSO): 3 14,5(-0CH>CH3), 56,5 (-OCH3), 59,0 (-

O CH2CH;3), 86,7 (C-A, 113,2 (C-b), 117,2 (C-d), 128,8 (C-d), 129,6 (C-a), 142,1 (C-e), 162,0 (C-h)*, 165,0 (C-9)"; MS (CI) 221(M+1). IR (KBr) u (cm-1): 3085, 3042, 2990, 1691, 1517, 1449, 1407, 1300, 1245, 1157, 1105, 1023; ESI-HRMS (m/z) [M + HJ+ calculada para Cu1H13N203 221.0921, observado 221.0924.

[0070] (17a). Sólido laranja (p.f.: 217,8-224,2ºC, a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 35%. RMN-!H (300 MHz DMSO): à 1,28 (t 3H, ) =7,0 Hz, - OCH2CH), 3,58 (s, 3H, -NCAH), 4,21 (q, 2H, J = 7,0 Hz -OCHCH3), 7,10 (t 1H, J = 6,6 Hz, H-b), 7,66 (t, 1H, ) = 7,8 Hz, H-o), 7,90 (a, 1H, ) = 8,6 Hz, H-d), 8,57 (ad, 1H, ) = 6,3 Hz, H-a); PC-NMR (75 MHz DMSO): à 14,5 (-CH2CH3), 28,9 (-NCH3), 59,3 (-CH2CH3), 84,2 (C- A, 113,3 (Cb), 116,7 (C-d), 125,8 (C-a), 132,9 (Cd, 142,6 (C-e), 160,6 (C-9), 164,1 (C- A); MS(CI) 221(M+1). IR (KBr) u (cm-1): 3507, 3069, 3025, 2977, 1687, 1625, 1511, 1477, 1437, 1256, 1227, 1189, 1093, 1024; ESI-HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para C;11H13N203

221.0921, observado 221.0925.

[0071] Procedimento geral para a hidrólise de éster catalisada por base (20a-c). NaOH à 5M (5 eq.) foi adicionada a uma solução do éster apropriado em etanol. A solução foi agitada por 5 horas a 70ºC, então neutralizada com HCl a 6M e concentrada sob pressão reduzida. HCl a 2M foi adicionado a 0ºC até que o pH 2 fosse atingido e a suspensão resultante fosse filtrada para produzir o correspondente ácido.

[0072] Ácido 2 -benzoxipirazol[1,5-ajpirídina-3-carboxílico (20a). Obtido a partir de 19a. Sólido branco (p.f.: 159,9-160,5ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 99%. RMN-!H (300 MHz DMSO): à 5,43 (s, 2H, -OCHPh), 7,01 (t 1H, = 6,50 Hz H-b), 7,28 — 7,45 (m, 3H, H-o, H-n), 7,46 -7,57 (m, 3H, H-m, H-d, 7,93 (df, 1H,) = 8,80 Hz, 4-0), 8,65 (a, 1H, ) = 6,80 Hz, H-a), 12,10 (s, 1H, , COOM); SC-NMR (75 MHz, DMSO): 5 71,1 (-OCH2Ph), 88,4 (Cf), 114,0 (C-b), 118,2 (C-d), 128,6 (C-m), 128,8 (C-o), 129,2 (Cn), 129,3 (Cd), 130,3 (C-a), 137,5 (C-), 143,2 (C-e), 164,3 (C-9)", 165,2 (C-h)"; MS(CI) 225 (M-CO2+1); IR (KBr) u (cm-1): 2894, 2650, 1654, 1628, 1527, 1508, 1477, 1454, 1438, 1371, 1332, 1302, 1258, 1211, 1183, 1133, 1080, 1006; ESI-HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para CisH13N203 269.0921, observado 269,0926.

[0073] Ácido 2-benzilóxi-7-metil-pirazol[ 1, 5-a]piridin-3-carboxílico (20b). Obtido a partir de 19b. Sólido branco (p.f.: 181,1-181,8ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico).

Rendimento de 72%. RMN-!'H (600 MHz DMSO): ó 2,65 (s, 3H, Ar-CH), 5,46 (s, 2H, - OCHPh), 6,94 (a, 1H, J) = 7,0 Hz, H-b), 7,34 (t 1H, =7,3 Hz, H-d), 7,40 (t, 2H,) =7,5 Hz, H-n), 7,44 (t 1H, = 8,0 Hz, H-o), 7,55 (d, 2H, ) = 7,3 Hz H-m), 7,83 (ad 1H, =8,7 Hz, H-d), 12,10 (s, 1H, COOM); RMN-BC (151 MHz, DMSO): 5 17,8 (Ar-CH3), 70,7 (- OCH2Ph), 88,2 (Cf, 113,0 (C-b), 115,5 (C-d), 128,5 (C-o), 128,6 (C-m), 128,9 (C-n), 128,9 (Cd, 137,2 (C-), 139,1 (C-a), 143,2 (C-e), 164,2 (C-9)*, 164,4 (C-h)*; MS (EST) 283 (M+1). IR (KBr) u (cm-1):3030, 2632, 1657, 1632, 1560, 1509, 1450, 1364, 1286, 1215, 1154, 1129, 1062, 1007, 962.

[0074] Ácido 2-benzilóxi-5-metil-pirazol[1, 5-aJpirídina-3-carboxílico (20c). Obtido a partir de 19c. Sólido branco (p.f.: 174,3-174,9ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 96%. RMN-'H (600 MHz DMSO): à 2,39 (s, 3H, Ar-CH3), 5,40 (s, 2H, - OCHPh), 6,85 (a, 1H, J] = 6,9 Hz, H-b), 7,34 (é 1H, ) = 7,3 Hz, H-o), 7,40 (t 2H, =7,5 Hz, H-n), 7,50 (d, 2H, ) = 7,4 Hz, H-m), 7,71 (s, 1H, H-d), 8,52 (d, 1H, ) = 6,9 Hz, H-a), 12,01 (s, 1H, COOM); RMN-2C (151 MHz, DMSO): ó 21,0 (Ar-CH3), 70,1 (“OCH2Ph), 86,7 (CB, 115,3 (Cb), 116,0 (Cd), 127,8 (C-m), 128,0 (C-o), 128,4 (Cn), 128,8 (C-a), 136,7 (CN), 139,5 (Cc), 142,4 (C-6), 163,6 (C-h)”, 164,5 (C-9)”; MS (EST) 283 (M+1). IR (KBr) u (cm-1): 2887, 2629, 1662, 1632, 1534, 1507, 1458, 1357, 1312, 1254, 1206, 1140, 1116, 1033, 997, 962.

[0075] Procedimento geral para à síntese de amidas relacionadas com pirazol[1,5-a]pirídina 26-28. Cloreto de oxalila a 2M em diclorometano seco (1,75 ml, 3,50 mmols) e DMF seco (1 gota) foram adicionados a uma solução resfriada (0ºC), em THF seco (15 ml), sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio. A solução foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em THF seco (10 ml, esta etapa foi repetida três vezes). O cloreto de acila resultante foi dissolvido em tolueno seco (15 ml). Uma solução da anilina apropriada (1,00 mmol) e piridina seca (3,00 mmols), em tolueno seco (5 ml), foi adicionada em gotas à solução de cloreto de acila sob atmosfera de nitrogênio. A mistura resultante foi agitada em refluxo durante a noite, em seguida, resfriada à temperatura ambiente e extinta com HCl a 0,5 M (25 ml). As camadas foram resolvidas, a fase aquosa foi adicionalmente extraída com EtOAc (3 x 50 ml) e a camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca e evaporada sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado utilizando cromatografia em flash.

[0076] 2-Benzilóxi-N-(4-fenoxifenil)pirazol[ 1, 5-a]piridina-3-carboxamida (26). Obtida a partir de 20a, utilizando-se aniliha 23. Cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtOAc 98:2 v/v). Sólido branco (p.f.: 170,6-171,3ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 81%. RMN-!H (300 MHz, CDCI3): 5 5,52 (s 2H, - OCHPh), 6,80 (ta, 1H, ) = 6,9 Hz, 1,5 Hz, H-b), 6,90 (a, 4H, ) = 8,8 Hz, prótons aromáticos), 6,99 (t 1H, ] = 7,4 Hz, próton aromático), 7,16 - 7,53 (m, 11H, prótons aromáticos), 8,23 (a, 2H, ) = 8,5 Hz, prótons aromáticos), 8,62 (s, 1H, -NH); RMN-VC (151 MHz CDCI3): 6 72,2 (-OCHoPh), 90,9 (Cf, 112,9 (Cb), 118,3, 118,9 (C-d), 120,0, 121,2, 122,9, 127,7 (Co), 128,3, 128,7, 128,9 (C-a)”, 129,0, 129,8, 134,5, 135,8, 143,0, 152,7, 158,0, 161,2 (C-f)*, 162,2 (C-g)*; MS (EST) 450 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3379, 3059, 3039, 1661, 1636, 1545, 1532, 1487, 1464, 1364, 1307, 1223, 1150, 1127, 1103, 1010.

[0077] 2-Benzilóxi-N-(2-metil-4-fenóxi-fenil)pirazol[ 1, 5-a]pirídina-3-carboxamida (27). Obtido a partir de 20a, usando-se anilina 24. Eluente de cromatografia em flash: diclorometano/EtOAc 98:2 v/v). Sólido marrom (p.f.: 172,0-173,0ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 97%. RMN-!H (600 MHz, CDCI3): 62,19 (s, 3H, Ar- CH), 5,57 (s, 2H, -OCHZPh), 6,85 - 6,89 (m, 4H, prótons aromáticos), 7,01 (é 1H,)1=7,5 Hz, prótons aromáticos), 7,24 - 7,30 (m, 3H, prótons aromáticos), 7,35 - 7,49 (m, 5H, prótons aromáticos), 7,54 - 7,58 (m, 2H, prótons aromáticos), 8,29 - 8,33 (m, 2H, prótons aromáticos), 8,69 (s, 1H, -NH); RMN-C (151 MHz CDCl3): 6 16,4 (Ar- CH;3), 72,2 (-OCH2Ph), 90,9 (CA, 112,8, 116,7, 118,4, 118,9, 120,9, 122,1, 122,6, 127,6, 128,2, 128,6, 128,9, 129,0, 129,7, 131,0, 135,0, 143,0 (C-e), 149,9, 158,5, 161,2 (C-h)”, 162,2 (C-9)”; MS (ESI) 450 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3382, 3059, 3042, 1655, 1637, 1557, 1548, 1534, 1489, 1458, 1406, 1337, 1291, 1250, 1223, 1146, 1117, 997.

[0078] 2-Benzilóxi-N-(2,5-dimetil-4-fenóxi-fenil)pirazol[ 1, 5-a]piridina-3-carboxamida (28). Obtida a partir de 20a, usando-se anilina 25. Eluente de cromatografia em flash: diclorometano/EtOAc 98:2 v/v). Sólido marrom (p.f.: 212,8-213,6ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico. Rendimento de 98%. RMN-!H (600 MHz, CDCI3): 5 1,77 (s, 3H, Ar- CH), 2,18 (s, 3H, Ar-CH), 5,52 (s, 2H, -OCHZPh), 6,66 (s, 1H, próton aromático), 6,82 -

6,90 (m, 3H, prótons aromáticos), 6,98 (t, 1H, ] = 7,5 Hz, prótons aromáticos), 7,22 - 7,27 (m, 2H, prótons aromáticos), 7,34 - 7,43 (m, 4H, prótons aromáticos), 7,49 - 7,54 (m, 2H, prótons aromáticos), 8,17 (s, 1H, próton aromático); 8,29 - 8,36 (m, 2H, prótons aromáticos), 8,42 (s, 1H, -NH); RMN-C (151 MHz CDCI3): 5 16,2 (Ar- CH3), 17,1 (Ar-CH3), 72,6 (-OCH2Ph), 91,1, 112,8, 116,8, 119,0, 122,0, 122,1, 124,4, 126,6, 127,6, 128,4, 128,7, 128,9, 129,2, 129,4, 129,7, 133,2, 135,4, 143,1 (C-6), 149,8, 158,6, 161,2 (C-A)*, 162,3 (C- 9)"; MS (ESI) 464 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3392, 3059, 3044, 2923, 2854, 1658, 1638, 1586, 1532, 1486, 1462, 1402, 1361, 1292, 1223, 1148, 1079, 1000.

[0079] 2-(Benzilóxi)-N-(2-isopropil-5-metil-4-fenoxifenil)pirazol[ 1, 5-a]piridina-3-carboxamida (35). Obtida a partir de 20a, utilizando-se anilina 34. Eluente de cromatografia em flash (éter de petróleo/acetato de etila 70/30 v/v). Sólido branco (p.f.: 166,2-167,7ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 55%. RMN-!H (600 MHz, CDCI3): 3 0,84 (d, 6H, J] = 6,8 Hz, CH(CH3)2), 2,09 (s, 3H, -CH3), 2,66 (hept 1H, ) = 6,7 Hz, - CHCH3)2), 5,48 (s, 2H, -OCHZPh), 6,74 (s, 1H, próton aromático), 6,78 (a, 2H, )] = 8,0 Hz, prótons aromáticos), 6,80 (t, 1H, 3 = 6,9 Hz, 4-b), 6,91 (t 1H, = 7,3 Hz, próton aromático), 7,18 (é 2H, 3 = 7,9 Hz, prótons aromáticos), 7,36 - 7,29 (m, 4H, prótons aromáticos), 7,46 (da, 2H, J] = 6,6 Hz, prótons aromáticos), 7,95 (s, 1H, próton aromático), 8,25 (a, 1H, J) = 6,8 Hz, H-a), 8,29 (ad, 1H, J = 8,8 Hz, H-d), 8,42 (s1H, -NH), RMN-BC (151 MHz, CDC): 16,1 (-CH3), 22,7 CH(CH3)2), 27,8 (-CH(CH3)2), 72,5 (-OCH2Ph), 91,0 (CA, 112,8 (Cb), 116,3, 117,9, 119,0 (C-d), 121,8, 126,4, 127,6 (C-c), 128,3, 128,6, 129,0 (C-a), 129,1, 129,2, 129,6, 131,4, 135,5, 138,4, 143,2, 150,3, 158,7, 161,5 (C-h)*, 162,4 (C-9)*; IR (KBr) ví(cm-1): 3398, 3040, 2963, 1652, 1636, 1528, 1490, 1445, 1402, 1368, 1289, 1220, 1181, 1147, 1127, 1044, 993 ; MS (ESI) 492 (M+1).

[0080] Procedimento geral para a síntese de amíidas relacionadas com pirazol[1,5-a]pirídina 22a-c. Cloreto de oxalila a 2M em diclorometano seco (3,0 mmols) e DMF seca (1 gota) foram adicionados a uma solução resfriada (0ºC) do ácido pirazol[1,5-a]piridina relacionado (1,0 mmol) 20a-c, em THF seco (20 ml), sob uma atmosfera de nitrogênio. A solução obtida foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A solução foi então concentrada sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em THF seco (10 ml, esta etapa foi repetida três vezes). O cloreto de acila resultante foi imediatamente usado sem qualquer purificação adicional. Trimetilalumínio (2,0 M em hexano, 1,5 mmol) foi adicionado a uma solução do 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilanilihna 21 (1,1 mmol), em tolueno seco (15 ml), sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura resultante foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente produzindo uma suspensão marrom que foi, em seguida, quantitativamente transferida para uma solução de um cloreto de acila previamente descrita em tolueno seco (30 ml). A mistura foi aquecida durante a noite a 90ºC e, em seguida, resfriada para temperatura ambiente. A reação foi resfriada com HCl a 1M. As camadas foram resolvidas e a fase aquosa foi extraída exaustivamente usando EtOAc. A camada orgânica combinada foi lavada com NaOH a 1M e salmoura, seca e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna.

[0081] 1-Benzil-2-0x0-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-i1)-1,2-diidropirazol[1,5-a]piridina- 3-carboxamida (22a). Obtida a partir de 20a, cromatografia em flash (eluente: éter de petróleo/EtOAc 90:10 v/v). Sólido amarelo claro (p.f.: 223,8-225,9ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 45%. RMN-!H (300 MHz, CDCI3): ô 5,48 (s 2H, - NCAHPh), 6,76 (6 1H, = 7,0 Hz, H-b), 7,19 — 7,58 (m, 11H, prótons aromáticos e H-c), 7,73 (ad 1H, =7,0 Hz, H-d), 8,28 (ad, 1H, ) = 8,8 Hz, 4a), 9,98 (s, 1H, -NH); RMN-BC (75 MHz, CDCI3): 8 45,6 (-NCH2Ph), 87,1 (C-f), 112,9 (C-b), 118,3 (Cd), 123,0 (C-a), 127,1, 128,7, 128,9, 129,1, 129,6, 130,3, 131,8, 132,5, 142,5, 161,7 (C-g)”, 162,1 (C-h)*; MS (ESI) 492 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3227, 3101, 3063, 1667, 1628, 1519, 1484, 1438, 1313, 1239, 1172, 1152, 1113, 1076, 1004, 972.

[0082] 1-Benzil-7-metil-2-0x0-n-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-i1)-1,2-diidropirazol[1,5-a] piridina-3-carboxamida (22b). Obtida a partir de 20b, cromatografia em flash (eluente: éter de petróleo/EtOAc 95:5 v/v). Sólido amarelo claro (p.f.: 220,8-222,3ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 41%. RMN-!H (600 MHz, CDCI3): é 2,67 (s, 3H, Ar-CH), 5,58 (s, 2H, -NCA6Ph), 6,51 (4, 1H, J) = 7,1 Hz, 4-b), 6,94 (d, 2H, ) = 6/7, H-m), 7,23 — 7,31 (m, 3H, H-n, H-o), 7,38 (dd, 1H, ) = 8,8 Hz, 7,2 Hz, H-O, 7,43 — 7,53 (m, 5H, prótons aromáticos), 8,25 (a, 1H, ] = 8,50 Hz, H-d), 10,07 (s, 1H, -NH); RMN-PC (151 MHz, CDCI3): ô 20,7 (Ar-CH3), 51,8 (-NCH2Ph), 87,5 (CA, 115,2 (C-b)', 116,3 (CY, 117,7, 126,1, 127,7, 128,5, 128,7, 129,1, 129,4, 130,4, 133,7 (C-d, 134,5 (C-), 137,0, 138,9 (C-ã), 143,3, 143,7, 148,2, 161,8 (C-9)”, 167,5 (C-h)*; MS (ESI) 506 (M+1). IR (KBr)

v (cm): 3231, 3160, 3100, 3027, 2925, 1688, 1626, 1604, 1560, 1532, 1483, 1451, 1424, 1312, 1256, 1182, 1160, 1139, 1102, 1009, 982.

[0083] 1-Benzil-5-metil-2-0x0-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-i)-1,2-diidropirazol[1,5-a] piridin-3-carboxamida (22c). Obtida a partir de 20c, cromatografia em flash (eluente: éter de petróleo/EtOAc 90:10 v/v). Sólido amarelo claro (p.f.: 207-202,7ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 38%. RMN-!H (600 MHz, CDCIl3): 562,38 (s, 3H, Ar- CH), 5,44 (s, 2H, -NCABPh), 6,57 (dd, 1H, ) = 7,1 Hz, 1,7 Hz, H-b), 7,27 (d, 2H, ) = 6,9, H-m), 7,34 (t 1H, ) = 7,3 Hz, H-o), 7,38 (t, 2H, ) = 7,3 Hz, H-n), 7,43 — 7,53 (m, 5H, prótons aromáticos), 7,58 (a, 1H, ] = 7,1 Hz, H-a), 8,11 (s, 1H, H-d), 10,07 (s, 1H, -NH); RMN-83C (151 MHz, CDCI3): 621,6 (Ar- CH3), 45,6 (-NCH2Ph), 86,3 (C-AÃ, 115,0 (Cb), 116,3, 117,3 (C-d), 117,5, 122,3 (C-a), 127,0, 127,7, 128,6, 128,8, 129,0, 129,6, 130,3, 132,8 (C- D, 142,5 (CO), 143,4, 143,6, 144,0 (C-6), 161,8 (C-g)”, 162,6 (C-h)'; MS (ESI) 506 (M+1). IR (KBr) v (cm"!): 3233, 3101, 3066, 1672, 1653, 1631, 1528, 1487, 1438, 1311, 1242, 1176, 1126, 1076, 977.

[0084] 1-Benzil-2-0x0-N-(2,3,3,5,6-pentafluoro-[1,1"-bifenil]-4-11)-1, 2-diidropirazol[1,5-a] piridina-3-carboxamida (36b). Obtida a partir de 20a, cromatografia em flash (eluente: de éter de petróleo/EtOAc 80: 20 v/v a 5:5 v/v). Sólido branco. Rendimento de 40%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): 6 5,53 (s, 2H, -NCASPh), 7,04 (ta, 1H, J =7,1, 1,3 Hz, H-b), 7,24 —7,37 (m, 6H, prótons aromáticos), 7,38 (a, 1H, ] = 7,7 Hz, próton aromático), 7,46 (a, 1H, = 9,5 Hz, próton aromático), 7,58 (ta, 1H, ] = 8,0, 6,4 Hz, próton aromático), 7,65 (t 1H, J = 7,9 Hz, H-o), 8,01 (d, 1H, ) = 8,7, H-d), 8,49 (d, 1H, ) = 7,0, H-a), 10,08 (s, 1H, -NH); RMN-2C (151 MHz, CDCI3): 6 44,2 (-NCH2Ph), 85,4 (C-A, 113,3 (C-b), 115,4 (6 ) = 17,3 Hz), 116,2 (C-a), 116,4 (a, ] = 20,8 Hz), 117,1, 117,2 (a) = 23,1 Hz), 125,2, 126,5, 127,2, 128,2, 128,8 (a, ] = 9,8 Hz), 129,1, 130,9 (a, ) = 8,4 Hz), 132,9, 133,7, 142,4, 142,8, 144,1, 160,6 (C-9)”, 161,7 (C-h)”, 162,0 (d, ] = 244,3 Hz); MS (ESI) 508 (M-1).

[0085] 1-Benzil-2-0x0-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3"(trifluorometil)-[1,1=-bifenil]-4-1)-1,2-diidropirazol [1,5-a]piridin-3-carboxamida (36c). Obtida a partir de 20a, cromatografia em flash (eluente: de éter de petróleo/EtOAc 80:20 v/v a 5:5 v/v). Sólido branco. Rendimento de 40%. RMN-'H (600 MHz, CDCl3): ó 5.49 (s, 2H, -NCHPh), 6,78 (t, 1H, ) = 6,8 Hz, 4-b), 7,29 (a, 2H, J = 7,3 Hz, prótons aromáticos), 7,36 (t 1H, ) = 7,2 Hz, prótons aromáticos),

7,38 — 7,42 (m, 2H, prótons aromáticos), 7,48 (t, 1H, ] = 7,9 Hz, H-o), 7,64 (6 1H, =7,7 Hz, prótons aromáticos), 7,68 (a, 1H, ] = 7,5 Hz, prótons aromáticos), 7,72 (t 2H,) =7,6 Hz, prótons aromáticos), 7,76 (s, 1H, próton aromático), 8,31 (a, 1H, ) = 8,8, H-d), 10,08 (s, 1H, -NM); RMN-2C (151 MHz, CDCI3): 645,7 (-NOH2Ph), 87,2 (C-A, 112,9 (C-b), 116,4 (6) =17,3 Hz), 117,2 (6) =12,2 Hz), 118,5 (Cd), 123,0, 124,0 (q, ) = 272,1 Hz), 125,9 (q, ) = 3,9 Hz), 127,1, 127,2, 128,5, 129,0, 129,3, 129,7, 131,3 (q, ] = 32,4 Hz), 131,8, 132,5, 133,7, 142,7, 142,9, 144,1, 161,6 (C-9)”, 162,2 (C-h)'; MS (ESI) 560 (M+1).

[0086] 1-Metil-2-0x0-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-i1)-1,2-diidropirazol[1,5-a]piridina -3-carboxamida (7). NaOH a 5M (1 eq.) foi adicionado a uma solução do composto 17a (600 mg, 2,73 mmols), em etanol (20 ml). A solução foi agitada por 3 horas a 70ºC, então concentrada sob baixa pressão para produzir, em um rendimento quantitativo, o correspondente sal de sódio ácido 17b, que foi usado na etapa seguinte, após a desidratação, sem purificação adicional. Cloreto de oxalila a 2M em DCM seco (2,45 ml, 4,90 mmols) e DMF seca (1 gota) foram adicionados a uma solução resfriada (0ºC), de 17b (350 mg, 1,63 mmol), em THF seco (25 ml), sob uma atmosfera de nitrogênio e a solução resultante foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A solução foi então concentrada sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em THF seco (10 ml, esta etapa foi repetida três vezes), gerando o cloreto de acila correspondente, que foi imediatamente usado sem qualquer purificação adicional. Trimetilalumínio (2,0 M em hexano, 1, 86 ml, 3,72 mmols) foi adicionado a uma solução de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilanilina 21 (394 mg, 1,96 mmol), em tolueno seco (15 ml), sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura resultante foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente, resultando em uma suspensão marrom, que foi quantitativamente transferida em porções a uma solução de cloreto de acila, elevada das etapas anteriores, em tolueno seco (30 ml). A mistura foi aquecida durante a noite a 90ºC, resfriada em temperatura ambiente e em seguida resfriada com HCI a 1M. As camadas foram resolvidas e a fase aquosa extraída exaustivamente com acetato de etila. A camada orgânica combinada foi lavada com NaOH a 1M e salmoura, seca e o solvente foi concentrado evaporado sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna (éter de petróleo/EtOAc de 8:2 a 6:4 v/v), para produzir o composto título como um sólido amarelo claro. Rendimento de 27%. RMN-'H (300 MHz,

DMSO): ó 3,70 (s, 3H, -NCA), 7,22 (t 1H, J) = 6,5, H-b), 7,46 - 7,63 (m, 5H, prótons aromáticos), 7,76 (6 1H, ) = 7,9, H-o), 8,06 (a, 1H, ) = 8,7 Hz, H-d), 8,73 (a, 1H, ) = 6,9 Hz, H-a), 10,10 (s, 1H, -NH); BC NMR (75 MHz, DMSO): ó 28,5 (-NCH;3), 85,8 (CB, 113,3 (Cb), 116,1 (Cd), 117,1, 125,2 (Ca), 127,1, 129,1, 129,6, 130,4, 132,5, 140,9, 141,1, 144,2, 144,4, 161,2 (C-9)”, 161,8 (C-h)'; MS (ESI) 416 (M+1).

[0087] Procedimento de hidrogenação geral para os compostos alvo 8-10, 29. Paládio sobre carbono (Pd/C, 45 mg) foi adicionado a uma solução da amida apropriada (compostos 26-28, 0,300 mmol), em THF seco (15 ml). A mistura resultante foi vigorosamente agitada sob uma atmosfera de hidrogênio durante 3 horas. A suspensão foi filtrada através de Celite e a torta foi lavada com metanol. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Quando necessário, o sólido obtido foi adicionalmente purificado por cromatografia em flash.

[0088] 2-Hidróxi-N-(4-fenoxifenil) pirazol[1,5-a]piridina-3-carboxamida (8). Obtida a partir de 26, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtOAc/HCOOH 85:15:1 v/v/v). Sólido marrom (p.f.: 147,6-148,2ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 80%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): 56,91 — 7,05 (m, 5H, prótons aromáticos), 7,10 (é 1H, =7,3 Hz, H-b), 7,37 (t, 2H, ) = 7,9 Hz, prótons aromáticos), 7,46 (t 1H,J = 7,9 Hz, H-d), 7,70 (a, 2H, ) = 8,9 Hz, prótons aromáticos), 8,05 (a, 1H, ) = 8,7 Hz, H-d), 8,56 (a, 1H, J] = 6,8 Hz, H-a), 9,05 (s, 1H, -NH), 12,77 ( br s 1H, -OM); RMN-BC (151 MHz DMSO): 5 89,3 (C-B, 112,7 (C-b), 117,0 (Cd), 117,9, 119,5, 121,0, 122,9, 127,6 (Cd, 128,9 (C-ãa), 129,9, 134,7, 141,5 (C-e), 151,6, 157,4, 160,8 (C-h)”, 161,9 (C-9)"; MS (ESI) 346 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3370, 3036, 2571, 1661, 1602, 1544, 1505, 1490, 1449, 1335, 1260, 1231, 1124, 1103, 983. ESI-HRMS (m/z) [M + HJ]+ calculado para CaroH16N3O03

346.1186, observado 346,1184.

[0089] 2-Hidróxi-N-(3-metil -4-fenoxifenil)pirazol[1,5-a]pirídina -3-carboxamida (9). Obtida a partir de 27, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtoAc/HCOOH 80:20:1 v/v/v). Sólido marrom (p.f.: 233,7-235,9ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 85%. RMN-'H (600 MHz, DMSO): ó 2,14 (s, 3H, Ar-CH3), 6,83 — 6,94 (m, 3H, prótons aromáticos), 6,98 (ta, 1H, ] = 7,0 Hz, 1,3 Hz, H-b), 7,04 (t 1H, I =7,4 Hz, próton aromático), 7,33 (da, 2H, ] = 8,4 Hz, 7,6 Hz, prótons aromáticos), 7,47 (t 1H,J = 7,9 Hz, H-d), 7,56 (da, 1H, ) = 8,7 Hz, 2,5 Hz, próton aromático), 7,63 (a, 1H, ) = 2,2 Hz,

próton aromático), 8,06 (a, 1H, ] = 8,7 Hz, H-d), 8,57 (a, 1H, ) = 6,8 Hz, H-a), 9,04 (s, 1H, -NH), 12,82 (br s, 1H, -OH); RMN-C (151 MHz DMSO): 5 16,8 (Ar-CH3), 90,2 (Cf), 113,7 (Cb), 117,2, 117,9 (Cd), 119,3, 121,5, 123,0, 123,1, 128,6 (C-d, 129,8 (C-a), 130,7, 130,8, 136,2, 142,4 (C-e), 149,7, 158,8, 161,7 (C-h)*, 162,8 (C-g9)”; MS (ESI) 360 (M+1). IR (KBr) v (cm!):3387, 3061, 2572, 1666, 1638, 1534, 1488, 1328, 1226, 1130, 1107, 932. ESI-HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para Ca1H1gN303 360.1343, observado 360,1337.

[0090] N-(2,5-dimetil-4-fenoxifenil)-2-hidroxipirazol[1,5-a]piridina-3-carboxamida — (10). Obtida a partir de 28, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtoAc/HCOOH 80:20:1 v/v/v). Sólido marrom (p.f.: 249,1-254,2ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 67%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): 5 2,12 (s, 3H, Ar-CH), 2,24 (s, 3H, Ar-CH6),6,73 — 7,10 (m, 5H, prótons aromáticos, H-b)), 7,33 (t, 2H,] =7,7 Hz, prótons aromáticos), 7,48 (t 1H, ) = 7,4 Hz, próton aromático), 7,33 (da, 2H, ) = 8,4 Hz, 7,6 Hz, prótons aromáticos), 7,48 (t 1H, ) = 7,8 Hz, H-o), 8,08 (a, 1H, ) = 8,7 Hz, H-d), 8,19 (s, 1H, próton aromático), 8,58 (ad, 1H, ] = 6,6 Hz, H-a), 9,04 (s, 1H, -NH), 13,00 (br s 1H, -OM); RMN-BC (151 MHz DMSO): ó 16,7 (Ar-CH3), 17,9 (Ar-CH3), 90,3 (CA, 113,7 (Cb), 117,1, 117,9 (Cd), 122,9, 123,0, 124,2, 127,1(C-d), 127,9 (C-a), 128,6, 129,8, 130,7, 134,5, 142,3 (C-e), 149,4, 158,9, 161,5 (C-h)*, 162,9 (C-9)”; MS (ESI) 374 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3395, 2926, 2582, 1670, 1640, 1550, 1487, 1440, 1402, 1331, 1193, 1078. ESI- HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para Ca2H20N303 374.1499, observado 374,1501.

[0091] N-(2-isopropil-S-metil-4-fenoxifenil)-2-hidroxipirazol[1,5-ajpiridina-3-carboxamida (29). Obtida a partir de 35, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/metanol/98/2 v/v). Sólido branco (p.f.: 244,2-247,9ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 91%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): à 1,17 (a, 6H, ] = 6,8 Hz, -CH(CH)2), 2,10 (s, 3H, -CH), 3,10 (hept, 1H, ) = 6,8 Hz, -CACH3)2), 6,85 (a, 2H, ) = 8,0 Hz, prótons aromáticos), 6,89 (s, 1H, próton aromático), 6,98 (td, 1H, ) = 6,9 Hz, 1,1 Hz, 4-b), 7,03 (t 1H, =7,3 Hz, H-o), 7,33 (t 1H, ) = 7,9 Hz, próton aromático), 7,47 (t 2H, ) = 7,8 Hz, prótons aromáticos), 8,00 (s, 1H, próton aromático), 8,06 (a, 1H, ) = 8,8 Hz, H-d), 8,57 (a, J=6,8 Hz, 1H, 4-a), 8,98 (s, 1H, -NH), 12,95 (br s, 1H, -OH). RMN-C (151 MHz, DMSO): 315,7 (-CH3), 22,6 (CH(CH3)2), 27,3 (- CH(CH3)2), 89,4 (Cf), 112,8 (C-b), 115,99, 117,0 (C- q), 117,5, 122,0, 125,7, 127,0, 127,8 (C-c), 129,0 (C-a), 129,9, 131,8, 138,0, 141,5 (C-e),

149,4, 158,0, 161,0 (C-h)*, 162,1 (C-g)'*; IR (KBr) v (cm!): 3400, 2964, 2579, 1661, 1637, 1547,1492, 1446, 1404, 1332, 1228, 1185, 1130, 887; MS (ESI) 402 (M+1).

[0092] Procedimento de hidrogenação geral para os compostos alvo 4-6, 30-33. Paládio sobre carbono (Pd/c, 6% p/p), foi adicionado a uma solução da amida apropriada (compostos 22a-c, 1,0 mmol), em THF seco (15 ml) e HCI (1,0 mmol). A mistura resultante foi vigorosamente agitada sob uma atmosfera de hidrogênio durante 6 horas. A suspensão foi filtrada através de Celite e a torta foi lavada com metanol. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Quando necessário, o sólido obtido foi adicionalmente purificado por cromatografia em flash.

[0093] 2-Hidróxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1-bifenila]-4-il)pirazol[ 1, 5-a]piridina-3-carboxamida (4). Obtida a partir de 22a, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtoAc/HCOOH 80:20:1 v/v/v). Sólido amarelo claro (p.f.: 260,9-262,0ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento 87%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): 3 6,93 (6 1H,J =6,7 Hz, H- b), 7,42 (t 1H,) =7,7 Hz, H-o), 7,48 - 7,63 (m, 5H, prótons aromáticos), 7,90 (a, 1H,J = 8,6 Hz, H-a), 8,51 (a, 1H, = 6,6 Hz, Ha), 9,77 (br s, 1H, -NH). Sinais de prótons cambiáveis sobrepostos ao sinal de água. RMN-"C (151 MHz, DMSO): 35 88,9 (C-f), 112,9 (C-b), 116,6 (Cd), 117,1, 117,8, 127,3 (Cd), 127,9, 129,1 (Ca), 129,3, 129,8, 130,7, 142,1, 143,1, 143,8, 161,6 (C-h), 163,9 (C-g); MS (ESI) 402 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3383, 3360, 2577, 1676, 1642, 1518, 1492, 1437, 1330, 1269, 1214, 1128, 994. ESI-HRMS (m/2) [M + H]+ calculado para CaoH12F4N30,2 402,0860, observado 402,0861.

[0094] 2-Hidróxi-7-metil-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1"-bifenil]-4-il)pirazol[ 1, 5-aJpirídina-3- carboxamida (5) Obtida a partir de 22b, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtOAc/HCOOH 80:20:1). Sólido branco (p.f.? 285,9-286,6ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 86%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): 52,65 (s, 3H, Ar-CH), 6,96 (dd, 1H, ) = 6,9 Hz, 1,7 Hz, H-b), 7,46 (t 1H J) = 7,9 Hz, H-d, 7,53 - 7,66 (m, 5H, prótons aromáticos), 7,91 (a, 1H, ] = 8,6 Hz, H-d), 8,94 (s, 1H, -NH); 12,95 (br s 1H, -OM); RMN-BC (151 MHz, DMSO): ó 18,0 (Ar-CH;3), 88,8 (C-A, 113,3 (C-b), 115,0 (Ca), 117,6, 119,0, 127,2, 128,8 (CO, 129,4, 129,9, 130,6, 138,8 (C-a), 142,6 (Ce), 143,5, 145,4, 161,1 (Ch), 163 (C-g); MS (ESI) 416 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3379, 3012, 2600, 1697, 1644, 1574, 1548, 1526, 1493, 1439, 1311, 1245, 1167, 1131, 994. ESI-HRMS

(m/z) [M + H]+ calculado para Ca1H14F4N302 416.1017, observado 416.1018.

[0095] 2-Hidróxi-5-metil-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1"-bifenila]-4-iDpirazol[ 1, 5-aJpiridina-3- carboxamida (6). Obtida a partir de 22c, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtOAc/HCOOH 80:20:1 v/v/v). Sólido branco (p.f.: 287,1-287,5ºC; a partir de trituração com éter diisopropílico). Rendimento de 83%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): ó 2,39 (s, 3H, Ar-CH3), 6,86 (da, 1H, ] = 6,9 Hz, 1,7 Hz, H-b), 7,49 - 7,60 (m, 5H, prótons aromáticos), 7,78 (s, 1H, H-d), 8,47 (a, 1H, )] = 6,9 Hz, fa), 8,95 (s, 1H, -NH). Sinais de prótons cambiáveis sobrepostos ao sinal de água. RMN-C (151 MHz, DMSO): 5 21,0 (Ar- Ha), 87,4 (C-A, 115,3 (C-b), 115,6 (C-d), 117,0, 126,7, 128,4, 128,8, 129,4 (C-a), 130,1, 139,3 (Co), 141,7 (C-e), 144,2, 144,8, 160,4 (C-h), 163,0 (C-g); MS (EST) 416 (M+1). IR (KBr) v (cm): 3381, 3362, 2992, 2590, 1677, 1648, 1517, 1491, 1437, 1334, 1275, 1224, 1123, 993. ESI-HRMS (m/z) [M + H]+ calculado para Ca1iH14F4aN302 416,1017, observado 416,1019.

[0096] 2-hidróxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1"-bifenila]-4-11)-4,5,6, 7-tetraidropirazol[1,5-a] piridina-3-carboxamida (30). Paládio sobre carbono (Pd/C, 20% p/p) foi adicionado a uma solução do composto 4, 1,0 mmol) em THF seco (10 ml). A mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio de 40 bar, em temperatura de 65ºC durante 3 horas, utilizando-se uma onda sintática de microondas. A suspensão foi filtrada através de Celite e a torta foi lavada com metanol. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O sólido obtido foi adicionalmente purificado por cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtoOAc/HCOOH 80:20:1 v/v/wv). Sólido branco (p.f.: 270,9-272,9ºC) Rendimento 40%. RMN-!H (600 MHz, DMSO): 5 1,72-1,78 (mn, 2H), 1,91-1,98 (mm, 2H), 2,88 (t 2H, J=6,1 Hz, H-0), 3,82 (t 2H, J=5,8 Hz, H-a), 7,48 — 7,54 (m, 5H, prótons aromáticos), 9,08 (s, 1H, -N4), 11,93 (br s 1H, -OH). Sinais de prótons cambiáveis sobrepostos ao sinal de água. RMN-3C (151 MHz, DMSO): à 19,03, 22,59, 23,38, 47,04 (C-a), 96,00 (CA, 117,34, 117,53, 127,17, 129,36, 129,88, 130,62, 142,28, 142,87, 143,84, 145,63, 160,24 (C-g), 161,22 (C-h); MS (ESI) 404,3 (M-1). IR (KBr) v(cm!): 3338, 2924, 2519, 1685, 1577, 1522, 1437, 1374, 1316, 1283, 1241, 1144, 992.

[0097] 2-Hidróxi-N-(2,3,3,5,6-pentafluoro-[1,1"-bifenil]-il)pirazol[ 1, 5-a]pirídina-3-carboxamida (32. Obtidá a partir de 36b, cromatografa em flash (eluente:

diclorometano/EtOAc/HCOOH 80: 20: 1 v/v/v). Sólido branco. Rendimento de 75%. RMN- 1H (600 MHz, DMSO): 5 7,03 (6 1H, J) = 6,6 Hz, H-b), 7,33 — 7,56 (m, 4H, prótons aromáticos), 7,62 (dd, 1H, ) = 14,3, 7,5 Hz, prótons aromáticos), 7,98 (a, 1H, ) = 8,6, H- a), 8,62 (d, 1H, ) = 6,6, H-a), 8,94 (s, 1H, -NH), 12,83 (br s, 1H, -OM); RMN-BC (151 MHz, CDCI3): é 88,1 (Cf, 113,3 (C-b), 115,9 (t, ) = 17,4 Hz), 116,4 (a, ) = 20,9 Hz), 116,8 (C- q), 117,2 (ad ) = 23,0 Hz), 117,4 (4 ) = 14,8 Hz), 126,5, 128,4, 128,7 (a ) = 9,6 Hz), 129,2, 130,9 (a, ) = 8,3 Hz), 141,7, 142,7, 143,2, 160,3 (C-9)*, 162,0 (a, ] = 244,4 Hz), 162,6 (C-h)'; MS (ESI) 508 (M-1).

[0098] 2-Hidróxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3"-(trifluorometil)-[1,1"-bifenil]-4il)pirazol[1,5-a] piridina-3-carboxamida (33). Obtida a partir de 36c, cromatografia em flash (eluente: diclorometano/EtOAc/HCOOH 80:20:1 v/v/v). Sólido branco. Rendimento de 98%. RMN-!H (600 MHz, CDCIs): 67,03 (é 1H, = 6,8 Hz, H-b), 7,51 (é 1H, = 7,8 Hz, H-o), 7,82 (t 1H, 1 =7,8 Hz, prótons aromáticos), 7,89 — 8,02 (m, 4H, prótons aromáticos), 8,62 (a, 1H, = 6,8, H-a), 8,98 (s, 1H, -NH), 12,85 (br s, 1H, -OH); SC NMR (151 MHz, CDCI3): 6 88,7 (C- A, 113,8 (Cb), 116,1 (6 ) = 17,1 Hz), 117,3 (Cd), 118,2 (4 ) = 12,2 Hz), 1244 (q, ) = 271,8 Hz), 126,7 (q, ] = 3,9 Hz), 127,4, 128,4, 128,9, 129,7, 130,2 (q, ] = 32,4 Hz), 130,6, 134,9, 142,2, 143,8, 143,9, 160,8 (C-9), 163,2 (C-h)"; MS (ESI) 560 (M+1).

[0099] Expressão e purificação de proteína. O CDNA da forma N-truncada de ADHODH (aa31 - 395) foi amplificado a partir de um clone 1.M.A.G.E de ADHODH de comprimento total (ID 6064723) e inserido em um vetor pFN2A (Promega). O vetor produz ADHODH como uma proteína de fusão GST N-terminal. O plasmídeo pFN2A-/ADHODH foi transformado em células BL21 (DE3), células de £. co/ipyrD para a produção de proteínas. As células foram cultivadas a 37ºC em meio LB suplementado com mononucleotídeo de flavina a 0,1 mM. Após 20 h de crescimento, as células foram induzidas com isopropil-D-tiogalactopiranosida a 4,4 mM em um ODçoo de 0,6-0,8 a 28ºC por um adicional de 3 h. Um pellet de célula de 300 ml de cultura foi lisado em 20 ml! de PBS (Na2HPO,. a 50 MM, NaH2PO, a 50 mM, NaCl a 500 mM), que foram suplementados com 24 mg de lisozima e 0,2% v/v de coquetel inibidor de Protease (Sigma-Aldrich), incubados durante 30 minutos sobre gelo e rompidos por sonicação. Triton X-100 foi adicionado ao lisado, a uma concentração final de 1%, antes da centrifugação a 14000 x g por 40 minutos a 4ºC. O sobrenadante clarificado foi incubado com DNase 1 (Sigma Aldrich), durante 30 minutos em temperatura ambiente, suplementado com DTT a 2 mM e filtrado através de um filtro de seringa de 0,45 um. A enzima fundida GST foi purificada a partir do lisato bacteriano utilizando cromatografia de afinidade em colunas de glutationa-sefarose imobilizada e cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). A marcação GST não foi removida para estudos adicionais.

[00100] Ensaio de inibição de hDHODH. A atividade inibitória foi avaliada pelo monitoramento da redução de 2,6-dicloroindofenol (DCIP), que é associada com a oxidação de diidroorotato como catalisado pela enzima de DHODH, A enzima foi pré-incubada durante cinco minutos a 37ºC em solução de Tris-tampão (pH 8,0), com coenzima Q10 (100 UM), com os compostos a serem testados usados em diferentes concentrações (concentração final de DMSO 0,1% v/v), com DCIP (50 mM). A reação foi iniciada pela adição de DHO (500 UM) e a redução foi monitorada a À = 650 nm. A taxa inicial foi medida nos primeiros cinco minutos (e = 10400 M*! cm!) e um valor de ICso foi calculado?!, utilizando software GraphPad Prism 7. Os valores são médias + SE de três experimentos independentes.

[00101] Cultura celular e tratamento de fármacos. Células Jurkat foram cultivadas em X-VIVO 15 (BE02-060 F, Lonza), suplementada com 10% (v/v), soro bovino fetal (F -7524, Sigma Aldrich) e 1% (v/v), solução antibiótico-antimicótica (A-5955, Sigma Aldrich) (meio completo). As células foram mantidas a 37ºC em uma atmosfera umedecida com CO, à 5%. As células foram passadas a cada 2-3 dias e descartadas após 15 passagens. Células Jurkat foram rotineiramente testadas, para confirmar a ausência de micoplasma, usando o kit de detecção MycoAlert Plus (Lonza) e foram usadas para todos os experimentos quando nas passagens 5 e 10. Cada composto testado foi solubilizado em DMSO (veículo de fármaco, 41639, Fluka), em uma concentração final de 10 mM, que foi usada como a solução de estoque para todos os experimentos. Diluições finais foram feitas em meio de cultura.

[00102] Ensaio de proliferação. O crescimento de células-T de Jurkat de foi avaliado, através da quantificação do teor de DNA, utilizando-se o corante fluorescente Hoechst 33258”, Células (5 x 10º em meio de 100 ul) foram semeadas em uma placa de 96 cavidades brancas e expostas a concentrações crescentes (0,001-200 mM), de cada composto ou veículo (DMSO), por 72 horas. No final da incubação, o meio foi aspirado e os poços lavados duas vezes com solução salina de tampão fosfato 100 ul (NaCl a 137 mM,

KCl a 2,7 mM, Na2HPO,. a 8,1 mM, KH2PO, a 1,76 mM, pH 7,4). As células foram expostas a uma solução de 100 ul de SDS a 0,02% em tampão SSC (NaCl a 154 mM, citrato de sódio a 15 mM, pH 7), por 1 hora a 37ºC, com agitação ocasional. No final do processo, um volume igual de 1 ug/ml! de solução Hoechst 33258 em Tampão SSC foi adicionado a cada cavidade e fluorescência medida a 355 nm (excitação) e 460 nm (emissão), usando um fluorômetro de microplacas Thermoskan Ascent-Thermo (Thermo Fisher Scientific, MA). Os valores de ICso foram determinados usando-se plotagens de regressão não lineares em GraphPad Prism6. Os valores são médias + SE de três experimentos independentes. Quando indicado, o efeito antiproliferativo foi avaliado na presença de uridina a 100 mM?

[00103] Ensaio de citotoxicidade. Os efeitos citotóxicos que os compostos tinham em células-T de Jurkat foram avaliados usando o ensaio verde CelITox (Promega). As células (5 x 103/poço) foram semeadas em uma placa de 96 poços brancos opacos e expostas a concentrações crescentes (0,001-100 mM), de cada composto ou veículo (DMSO), por 72. Valores são médias + SE de três experimentos independentes e representam as concentrações que causam efeitos citotóxicos (> 30%) significativos.

[00104] Ensaio de imunossupressão. PBMCs foram isoladas através de Ficoll/Isopaque (Lymphoprep), centrifugação de gradiente de densidade de resíduos de leucaferese de revestimento de leucócitos a partir das amostras de sangue fresco de doadores saudáveis. Células purificadas foram cultivadas e mantidas em meio de cultura a 37ºC em uma atmosfera umedecida com CO, a 5%. As células (5 x 103/poço) foram semeadas em uma placa de 96 poços brancos opacos e expostas a concentrações crescentes (0,001-100 mM), de cada composto ou veículo (DMSO), por 2 horas e, em seguida, estimuladas com 1,25 mg/ml! de fitohemaglutinina (PHA) por 72h. A proliferação celular foi avaliada através da quantificação do teor de DNA usando-se o corante fluorescente Hoechst 33258, conforme descrito acima. Os valores de ICso foram determinados usando-se plotagens de regressão não lineares em GraphPad Prism6. Os valores são médias + SE de três experimentos independentes. Quando indicado, o efeito antiproliferativo foi avaliado na presença de uridina a 100 mM.

[00105] Linhagens de células e tratamento de fármacos. As células humanas THP1 (leucemia monocítica aguda) e U937 (leucemia mieloide pró-monocítica) foram cultivadas em RPMI 1640 completo (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD), suplementadas com soro bovino fetal inativado por calor (FBS) a 10% e penicilina/estreptomicina a 1% (GIBCO, Invitrogen, Milan, Itália).

[00106] Análise citométrica de fluxo. A expressão de CD11b (PE-conjugado BD Bioscience San Jose, CA, EUA) e CD14 (FITC-conjugado Beckam Coulter CA, USA), moléculas de superfície celular, foi determinada por análise de citometria de fluxo. As células foram lavadas e ressuspensas em tampão de coloração (solução salina tamponada com fosfato, albumina de soro bovino a 2%, EDTA a 1 mM) e incubadas com anticorpos a 4ºC por 45 minutos. As amostras foram adquiridas em um calibrador FACS e as células mortas foram excluídas das análises, de acordo com o uso de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich, Milão, Itália). Os dados foram processados utilizando o software Kaluza versão 1.2 (Beckman Coulter Fullerton, CA).

[00107] Ensaio de atividade citotóxica baseada em CFSF. Resumidamente, as linhagens de células (THP1 e U937) foram incubadas com corante de éster de succinimidila de fosfofluoresceína a 2 mM (CFSE, kit rastreador de célula Vybrant CFDA SE; Molecular Probes, Invitrogen Carlsbad, CA), em 107/ml por 20 minutos a 37ºC. No final do processo de rotulação, as células foram ressuspensas e lavadas em RPMI-1640 suplementado com soro bovino fetal a 1%. Em seguida, as células foram ressuspensas em RPMI-1640 suplementado com FBS a 10% e incubadas durante 20 minutos a 37ºC. As células foram centrifugadas e plaqueadas (1x10º* em 200 ul de meio), com concentrações crescentes de inibidores de DHODH (0,01 UM a 10 uM), durante 3 dias. Os mesmos experimentos foram repetidos na presença de uridina a 100 UM. Células foram colhidas e 1 pg/ml de iodeto de propídio foi adicionado para atribuir a relação de morte celular. A porcentagem de lise específica foi calculada como descrito e de acordo com a seguinte equação: [alvos mortos na amostra (%) - alvos espontaneamente mortos (%/)/(100-alvos espontaneamente mortos (%)] x 100. A liberação espontânea foi obtida por incubação de linhagens celulares em meio suplementado com a porcentagem correspondente de DMSO usada para a diluição de compostos, enquanto a liberação máxima foi obtida após o tratamento com solução triton.

[00108] Ensaio de proliferação. A proliferação de linhagens de células AML (THP1 E U937) foi avaliada utilizando um citômetro de fluxo. As linhagens de células foram rotuladas com corante CFSE de acordo com o protocolo descrito acima. Após a rotulação, as linhagens de células foram plaqueadas (1 x 10º) e cultivadas com moléculas inibidoras de DHODH (0,01 UM a 10 UM), durante três dias. No final das culturas, as células foram colhidas e 1 ug/ml de iodeto de propídio foi adicionado para excluir células mortas antes da aquisição. A proliferação de linhagens de células foi quantificada em células viáveis como % de células PI-CSFE.

[00109] Ensaio de diferenciação. 1 x 10º de células (THP1 E U937) foram colocadas em placas de fundo redondo de 96 poços e foram adicionados inibidores de DHODH, de 0,1 UM a 10 UM, a um volume de 200 ml de meio. A cinética de diferenciação foi monitorada do dia 1 ao dia 4 para U937, e ao dia 5 para THP1. As células foram lavadas e tingidas com CD11b (U937) ou com CD11b e CD14 (THP1), conforme descrito acima. O ensaio de diferenciação foi também realizado na presença de uridina a 100 mM e analisado no dia 3.

[00110] Análise estatística. Análises estatísticas foram executadas no software Prism, versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Os dados são reportados como meios + SD. Dois testes de t-Student pareados foram calculados para avaliar as diferenças entre valores médios e P < 0,05 foi considerado significativo.

[00111] Ensaio de solubilidade em pH 7,4. Solubilidade foi ensaiada tanto em solução salina tamponada com fosfato (PBS: 12 mM com NaCl a 137 mM e KC1 a 2,7 mM, pH 7,4), e em PBS com DMSO (2% v/v). Cada composto sólido (1 mg) foi adicionado a 1 ml! de PBS ou PBS/DMSO. As amostras foram agitadas em um agitador orbital a 25ºC durante 24 h. Estas suspensões foram filtradas através de um filtro de PTFE 0,45 um (VWR), e as soluções foram cromatograficamente analisadas. A análise quantitativa foi realizada em um sistema HPLC-UV (MEK-HITACHI), equipada com um auto amostrador de 60 ul de volume de injeção (MEK- HITACHI AS -2000 a), uma bomba de HPLC binária (MEK-HITACHI L -6200 IP) e um detector de arranjo de diodo (MEK-HITACHI L -4250). A análise LC foi realizada utilizando-se uma coluna Agilent Zorbax SB-fenil (4,6 x 250, 5 um). As análises foram realizadas em uma taxa de fluxo de 1 ml/min usando eluição gradiente com eluente A sendo ácido trifluoroacético (TFA), 0,1% em água e B TFA a 0,1% em MeOH para brequinar e compostos 4-10. As análises iniciadas com 40% de eluente B e o seguinte perfil de gradiente foram usados: (tempo min, % B) 18,0, 100%; 26,0, 100%; 28,0, 40%. Para o composto 5, o eluente A foi TFA a 0,1% em água e eluente B acetonitrila. O perfil de gradiente foi como segue: (tempo,

% B): 0, 50%; 7,5, 50%; 22,4, 100%; 32,4, 100%. A quantificação de composto único foi feita usando a curva de calibração relativa que foi obtida por análise de soluções padrão em MeOH. A solubilidade é expressa como concentração de mM da solução saturada.

[00112] Clog P e log D (pH 7,4). Os valores de ClogP foram calculados utilizando-se o programa de Bio-Loom para Windows, versão 1.5 (BioByte). Os coeficientes de partição entre n-octanol e PBS a pH 7,4 (log D7-4) foram obtidos utilizando-se a técnica de agitação- frasco à temperatura ambiente. Nas experiências de frasco de agitação, 50 mM de solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 foram usados como a fase aquosa. O orgânico (n- octanol) e as fases aquosas foram mutuamente saturados por agitação por 4 horas. Os compostos foram solubilizados na fase aquosa tamponada à concentração mais alta compatível com a solubilidade e quantidades apropriadas de n-octanol foram adicionadas. As duas fases foram agitadas por cerca de 20 minutos, em cujo momento o equilíbrio de divisão de solutos foi atingido, e então centrifugadas (10.000 rpm, 10 minutos). A concentração dos solutos foi medida na fase aquosa por espectrofotômetro UV (Varian Cary 50 BIO); valores de absorbância (registrados para cada composto no comprimento de onda da absorção máxima), foram interpolados em curvas de calibração obtidas usando soluções padrão dos compostos (r? > 0,99). Cada valor de log D é uma média de pelo menos seis medições.

[00113] Estabilidade do soro. Uma solução do composto selecionado em DMSO foi adicionada ao soro humano (estéril-filtrado de plasma AB masculino humano, Sigma-Aldrich), para obter a concentração final desejada com 2% de cossolvente. A solução resultante foi agitada em um agitador orbital a 37ºC por 24 horas em intervalos de tempo apropriados (0, 0,5, 1, 4 e 24 horas), 300 ul da mistura de reação foram retirados e adicionados a 600 ul de ácido trifluoroacético (TFA), 0,1% em acetonitrila, a fim de desproteinar o soro. As amostras foram submetidas a vórtice, sonicadas durante 3 minutos e então centrifugadas por 5 minutos a 2500 x g. o sobrenadante transparente foi filtrado e analisado por RP-HPLC. As análises de HPLC foram realizadas em um sistema de cromatografia HP 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA), equipado com uma bomba quaternária (modelo G1311A), um desgaseificador de membrana (G1379A) e um detector de arranjo de diodo (DAD) (modelo G1315B), integrado no sistema HP 1100. Análises de dados foram processadas utilizando-se um sistema HP ChemsStation (Agilent Technologies). A coluna analítica foi um

ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 pum, Agilent Technologies). A fase móvel consistiu em acetonitrila 0,1% TFA/0,1% TFA 70/30 em taxa de fluxo = 1,0 ml/min. o volume de injeção foi de 20 ul (Rheodyne, Cotati, CA). O efluente da coluna foi monitorado a 245 e 264 nm referido contra um comprimento de onda de 700 nm. Quantificação de composto único foi obtida usando curvas de calibração que foram obtidas por análise de soluções padrão. Os resultados são expressos como % do composto parente não modificado em 24 horas.

[00114] Ligação de proteína in vitro. A separação de fármaco ligada por proteína e livre de proteína foi obtida por ultrafiltração utilizando-se sistemas de membrana comercialmente disponíveis (dispositivos de ultrafiltração Centrifree com membrana ultracel YM-T, Merck). Uma solução de composto selecionado em DMSO foi adicionada ao soro humano (estéril- filtrada de plasma AB masculino humano, Sigma-Aldrich), para obter a concentração final desejada com 2% de cossolvente. 1 ml da solução obtida a partir do reservatório de amostra do dispositivo de ultrafiltração foi suavemente sacudida em um agitador orbital a 37ºC durante 1 h. O tubo foi então centrifugado a 1000 x g durante 25 min. As concentrações dos compostos no ultrafiltrado e filtrado foram determinadas usando HPLC de fase reversa e as condições cromatográficas descritas acima. A quantificação dos compostos no filtrado foi realizada usando as curvas de calibração de soluções padrão compostas (linearidade determinada em uma faixa de concentração de 1-100 mM; r? > 0,99). A quantificação de compostos no ultrafiltrado foi realizada utilizando curvas de calibração obtidas a partir do método de adição padrão (linearidade determinada em uma faixa de concentração de 0-2,5 MM; r? > 0,99). A recuperação do processo de ultrafiltração foi calculada a fim de descobrir se qualquer composto foi perdido durante a ultrafiltração, considerando a solubilidade limitada dos compostos testados. Recuperação = 100 x [ (VOl.iigado X CONC-ligada) (VOI.não ligado X. CONC-não ligada) ]/VOI. soro iniciar X CONC.inicial - vol.jigado: Calculado dividindo-se o peso da fração ligada (diferença entre os pesos do reservatório de amostra após ultrafiltração e vazio), por sua densidade (0,991 g/ml avaliado pesando cinco réplicas de um volume conhecido de fração ligada). - VOl.não ligado: Calculado dividindo-se o peso da fração não ligada (diferença entre os pesos do copo ultrafiltrado após e antes da ultrafiltração), por sua densidade (0,999 g/ml avaliado pesando cinco réplicas de um volume conhecido de fração não ligada). - CONC. ligada: Calculada usando-se o método RP-HPLC, - CONC.não ligada: Calculada usando-se o método RP-HPLC (calibração com adições padrão).

[00115] A recuperação média foi de 97% para todos os compostos testados. Bibliografia

1. Madak, J. T.; Bankhead, A., 3rd; Cuthbertson, C. R.; Showalter, H. D.; Neamati, N., Revisiting the role of dihydroorotate dehydrogenase as a therapeutic target for cancer. Pharmacol Ther 2019, 195, 111-131.

2. Brown, K. K.; Spinelli, J. B.; Asara, J. M.; Toker, A., Adaptive Reprogramming of De Novo Pyrimidine Synthesis Is a Metabolic Vulnerability in Triple-Negative Breast Cancer. Cancer Discovery 2017, 7 (4), 391-399,

3. Mathur, D.; Stratikopoulos, E.; Ozturk, S.; Steinbach, N.; Pegno, S.; Schoenfeld, S.; Yong, R.; Murty, V. V.; Asara, J. M.; Cantley, L. C.; Parsons, R., PTEN Regulates Glutamine Flux to Pyrimidine Synthesis and Sensitivity to Dihydroorotate Dehydrogenase Inhibition. Cancer Discovery 2017, 7 (4), 380-390.

4. Koundinya, M.; Sudhalter, J.; Courjaud, A.; Lionne, B.; Touyer, G.; Bonnet, L.; Menguy, L; Schreiber, L; Perrault, C.; Vougier, S.; Benhamou, B.; Zhang, B.; He, T.; Gao, Q.; Gee, P.; Simard, D.; Castaldi, M. P.; Tomlinson, R.; Reiling, S.; Barrague, M.; Newcombe, R.; Cao, H.; Wang, Y.; Sun, F.; Murtie, J.; Munson, M.; Yang, E.; Harper, D.; Bouaboula, M.; Pollard, J.; Grepin, C.; Garcia-Echeverria, C.; Cheng, H.; Adrian, F.; Winter, C.; Licht, S.; Comella-Taracido, L; Arrebola, R.; Morris, A., Dependence on the Pyrimidine Biosynthetic Enzyme DHODH Is a Synthetic Lethal Vulnerability in Mutant KRAS-Driven Cancers. Cell Chemical Biology 2018, 25 (6), 705-717. el |.

5. Vyas, V. K.; Variya, B.; Ghate, M. D., Design, Synthesis and Pharmacological Evaluation of Novel Substituted Quinoline-2-Carboxamide Derivatives as Human Dihydroorotate Dehydrogenase (hDHODH) Inhibitors and Anticancer Agents. Eur ] Med Chem 2014, 82, 385-93.

6. Leban, J.; Vitt, D., Human Dihydroorotate Dehydrogenase Inhibitors, a Novel Approach for the Treatment of Autoimmune and Inflammatory Diseases. Arzneimittelforschung 2011, 61 (1), 66-72.

7. Munier-Lehmann, H.; Vidalain, P. O.; Tangy, F.; Janin, Y. L, On Dihydroorotate Dehydrogenases and Their Inhibitors and Uses. ] Med Chem 2013, 56 (8), 3148-3167.

8. Herrmann, M. L; Schleyerbach/ R.; Kirschbaum, B. ),, Leflunomíde: an Immunomodulatory Drug for the Treatment of Rheumatoid Arthritis and other Autoimmune Diseases. Immunopharmacology 2000, 47 (2-3), 273-289,

9. Singh, A.; Singh, P., Teriflunomíde: a Novel Oral Disease-Modifying Agent Under Investigation for the Treatment of Multiple Sclerosis. ]. Drug Deliv. Ther. 2016, 6 (5), 97-102.

10. Peters, G. ).; Sharma, S. L.; Laurensse, E.; Pinedo, H. M,, Inhibition of Pyrimidine De Novo Synthesis by DUP-785 (NSC 368390). Invest New Drugs 1987, 5 (3), 235-44.

11. de Fomi, M.; Chabot, G. G.; Armand, J. P.; Fontana, X.; Recondo, G.; Domenge, C.; Carde, P.; Barbu, M.; Gouyette, A., Phase I and Pharmacokinetic Study of Brequinar (DUP 785; NSC 368390) in Cancer Patients. European journal of cancer (Oxford, England : 1990) 1993, 29A (7), 983-8.

12. Joshi, A. S.; King, S. Y.; Zajac, B. A.; Makowka, F.; Sher, F. S.; Kahan, B. D.; Menkis, A.

H.; Stiller, C. R.; Schaefle, B.; Komhauser, D. M., Phase I Safety and Pharmacokinetic Studies of Brequinar Sodium after Single Ascending Oral Doses in Stable Renal, Hepatic, and Cardiac Allograft Recipients. ] Clin Pharmaco! 1997, 37 (12), 1121-8.

13. Schwartsmann, G.; Dodion, P.; Vermorken, J. B.; ten Bokkel Huinink, W. W.; Joggi, J.; Winograd, B.; Gall, H.; Simonetti, G.; van der Vijgh, W. J.; van Hennik, M. B.; et ah, Phase I Study of Brequinar Sodium (NSC 368390) in Patients with Solid Malignancies. Cancer Chemother Pharmacol 1990, 25 (5), 345-51.

14. Sykes, D. B.; Kfoury, Y. S.; Mercier, F. E.; Wawer, M. J.; Faw, J. M.; Haynes, M.

K.; Fewis, T. A.; Schajnovitz, A.; Jain, E.; Fee, D.; Meyer, H.; Pierce, K. A.; Tolliday, N. J.; Waller, A.; Ferrara, S. J.; Eheim, A. F.; Stoeckigt, D.; Maxcy, K. F.; Cobert, J. M.; Bachand, J.; Szekely, B. A.; Mukherjee, S.; Sklar, F. A.; Kotz, J. D.; Clish, C. B.; Sadreyev, R. F; Clemons, P. A.; Janzer, A.; Schreiber, S. F.; Scadden, D. T., Inhibition of Dihydroorotate Dehydrogenase Overcomes Differentiation Blockade in Acute Myeloid Feukemia. Cell 2016, 167 (1), 171-186.

15. Fewis, T. A.; Sykes, D. B.; Faw, J. M.; Munoz, B.; Rustiguel, J. K.; Nonato, M. C.; Scadden, D. T.; Schreiber, S. F., Development of MF390: A Human DHODH Inhibitor That

Induces Differentiation in Acute Myeloid Leukemia. ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7 (12), 1112-1117,

16. Tzelepis, K.; Koike-Yusa, H.; De Braekeleer, E.; Li, Y.; Metzakopian, E.; Dovey, O. M.; Mupo, A.; Grinkevich, V.; Li, M.; Mazan, M.; Gozdecka, M.; Ohnishi, S.; Cooper, J.; Patel, M.; MckKerrell, T.; Chen, B.; Domingues, A. F.; Gallipoli, P.; Teichmann, S.; Ponstingl, H.; McDermott, U.; Saez-Rodriguez, J.; Huntly, B. J. P.; Iorio, F.; Pina, C.; Vassiliou, G. S.; Yusa, K., A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cell! Rep 2016, 17 (4), 1193-1205.

17. Sainas, S.; Pippione, A. C.; Giorgis, M.; Lupino, E.; Goyal, P.; Ramondetti, C.; Buccinna, B.; Piccinini, M.; Braga, R. C.; Andrade, C. H.; Andersson, M.; Moritzer, A. C.; Friemann, R.; Mensa, S.; Al-Kadaraghi, S.; Boschi, D.; Lolli, M. L., Design, synthesis, biological evaluation and X-ray structural studies of potent human dihydroorotate dehydrogenase inhibitors based on hydroxylated azole scaffolds. Eur ] Med Chem 2017, 129, 287-302.

18. Li, S.; Luan, G.; Ren, X.; Song, W.; Xu, L.; Xu, M.; Zhu, J.; Dong, D.; Diao, Y.; Liu, X.; Zhu, L.; Wang, R.; Zhao, Z.; Xu, Y.; Li, H., Rational Design of Benzylidenehydrazinyl- Substituted Thiazole Derivatives as Potent Inhibitors of Human Dihydroorotate Dehydrogenase with in Vivo Anti-arthriític Activity. Sci Rep 2015, 5, 14836-14855.

19. Munier-Lehmann, H.; Lucas-Hourani, M.; Guillou, S.; Helynck, O.; Zanghi, G.; Noel, A.; Tangy, F.; Vidalain, P. O.; Janin, Y. L., Original 2-(3-Alkoxy-lH-pyrazol-I-yI)pyrimidine Derivatives as Inhibitors of Human Dihydroorotate Dehydrogenase (DHODH). Journal of Medicinal Chemistry 2015, 58 (2), 860-877.

20. Zhu, J.; Han, L.; Diao, Y.; Ren, X.; Xu, M.; Xu, L.; Li, S.; Li, Q.; Dong, D.; Huang, J.; Liu, X.; Zhao, Z.; Wang, R.; Zhu, L.; Xu, Y.; Qian, X.; Li, H., Design, Synthesis, X-Ray Crystallographic Analysis, and Biological Evaluation of Thiazole Derivatives as Potent and Selective Inhibitors of Human Dihydroorotate Dehydrogenase. ] Med Chem 2015, 58 (3), 1123-1139.

21. Pippione, A. C.; Dosio, F.; Ducime, A.; Federico, A.; Martina, K.; Sainas, S.; Frolund, B.; Gooyit, M.; Janda, K. D.; Boschi, D.; Lolli, M. L., Substituted 4-Hydroxy-l, 2,3-Triazoles: Synthesis, Characterization and First Drug Design Applications Through Bioisosteric Modulation and Scaffold Hopping Approaches. MedChemComm 2015, 6 (7), 1285-1292.

22. Lucas-Hourani, M.; Munier-Lehmann, H.; El Mazouni, F.; Malmquist, N. A.; Harpon, J.; Coutant, E. P.; Guillou, S.; Helynck, O.; Noel, A.; Scherf, A.; Phillips, M. A.; Tangy, F.; Vidalain, P. O.; Janin, Y. L., Original 2-(3-Alkoxy-lH-pyrazol-I-yI)Jazines Inhibitors of Human Dihydroorotate Dehydrogenase (DHODH). ] Med Chem 2015, 58 (14), 5579-98.

23. Lolli, M. L.; Giorgis, M.; Tosco, P.; Foti, A.; Fruttero, R.; Gasco, A., New inhibitors of dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) based on the 4-hydroxy- 1,2,5-oxadiazol-3-y/ (hydroxyfurazanyl) scaffold. Eur ] Med Chem 2012, 49, 102-9.

24. Baumgartner, R.; Walloschek, M,; Kralik, M.; Gotschlich, A.; Tasler, S.; Mies, J.; Feban,

1., Dual Binding Mode of a Novel Series of DHODH Inhibitors. ] Med Chem 2006, 49 (4), 1239-1247.

25. Kakehi, A.; Ito, S.; Konno, Y.; Maeda, T., Synthesis Using PyridiniumN-Ylides. 1.

Synthesis and Some Reactions of Substituted 1 -(Acetylimino)pyridinium Ylides. Bulletin of the Chemical Society of Japan 1978, 51 (1), 251-256.

26. Ochi, H.; Miyasaka, T.; Kanada, K.; Arakawa, K., Studies of Heterocyclic Compounds.

VIII. Synthesis and Tautomerism of 2-Hydroxypyrazolof[l,5-alpyridine. Bulletin of the Chemical Society of Japan 1976, 49 (7), 1980-1984.

27. Minkin, V. F; Gamovskii, A. D.; Elguero, J.; Katritzky, A. R.; Denisko, O. V., The Tautomerism of Heterocycles: Five-membered Rings with Two or More Heteroatoms. In Advances in Heterocyclic Chemistry, Katritzky, A. R., Ed. Academic Press: 2000; Vol. 76, pp 157-323.

28. Pippione, A. C.; Federico, A.; Ducime, A.; Sainas, S.; Boschi, D.; Barge, A.; Fupino, E.; Piccinini, M.; Kubbutat, M.; Contreras, J.-M.; Morice, C.; Al-Karadaghi, S.; Folli, M.

F., 4-Hydroxy-N-[3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-I ,2, 5-thiadiazole-3-carboxamíde: a Novel Inhibitor of the Canonical NF-kB Cascade. MedChemComm 2017, 8 (9), 1850-1855.

29. Sainas, S.; Pippione, A. C.; Giorgis, M.; Fupino, E.; Goyal, P.; Ramondetti, C.; Buccinna, B.; Piccinini, M.; Braga, R. C.; Andrade, C. H.; Andersson, M.; Moritzer, A.-C.; Friemann, R.; Mensa, S.; Al-Kadaraghi, S.; Boschi, D.; Folli, M. F., Design, synthesis, biological evaluation and X-ray structural studies of potent human dihydroorotate dehydrogenase inhibitors based on hydroxylated azole scaffolds. Eur. J. Med. Chem. 2017, 129, 287-302.

30. Williams-Noonan, B. J.; Yuriev, E.; Chalmers, D. K., Free Energy Methods in Drug

Design: Prospects of "Alchemical Perturbation'" in Medicinal Chemistry. ] Med Chem 2018, 61 (3), 638-649.

31. Bonomo, S.; Tosco, P.; Giorgis, M.; Lolli, M. L.; Fruttero, R., The role of fluorine in stabilizing the bioactive conformation of dihydroorotate dehydrogenase inhibitors. ] Mol Model 2013, 19 (3), 1099-107.

32. Cherwinski, H. M.; Cohn, R. G.; Cheung, P.; Webster, D. J.; Xu, Y. Z.; Caulfield, J. P.; Young, J. M.; Nakano, G.; Ransom, J. T., The Immunosuppressant Leflunomide Inhibits Lymphocyte Proliferation by Inhibiting Pyrimidine Biosynthesis. ] Pharmacol Exp Ther 1995, 275 (2), 1043-9.

Claims

Reivindicações

1. COMPOSTO da fórmula geral (1) R, Re ÃO x Rs SA xo Be ra, Ro Fórmula (1) caracterizado por: Ri, R2?, Rê e Rº serem independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio, um grupo alquila C1-Ca, um grupo alquilóxi, um grupo alquiltio e um grupo haloalquila C1-Ca; Rô ser selecionado a partir do grupo que consiste em grupo fenila, pirídila, piridinila, fenóxi, piridilóxi, piridinóxi, tiofenóxi, tiofenila, feniltio, fenilcarboxamido, fenilcarboxamido e fenilaminocarbonila; R7, Rê e Rº serem independentemente selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo haloalquila C1-Ca, um grupo tioalquila Ci-Ca, um grupo aminoalquila C1-Ga, um grupo alquila C1-C4 e um grupo hidroxialquila C1-Ca; R$ ser selecionado a partir de um grupo alquilóxi C1-Ca, um grupo acilóxi, um grupo hidroxila, um grupo tiol ou um sal do mesmo; X, Y e Z serem independentemente selecionados a partir um átomo de carbono ou um átomo de nitrogênio, em que, se X ou Y ou Z for nitrogênio, as outras duas posições são átomos de carbono.

2. COMPOSTO da fórmula geral (II):

R; Ra e As EA xx Ea, Ra Fórmula (II) caracterizado por: R!, R?, Rº e R serem independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio, um grupo alquila C1-Ca, um grupo alquilóxi, um grupo alquiltio e um grupo haloalquila C1-Ca; Rô ser selecionado a partir do grupo que consiste em grupo fenila, piridila, piridinila, fenóxi, piridilóxi, piridinóxi, tiofenóxi, tiofenila, feniltio, fenilcarboxamido, fenilcarboxamido e fenilaminocarbonila. Se Rê for um grupo aromático, um substituinte independentemente selecionado a partir de átomo de halogênio, alquila, um grupo trifluorometila, um grupo trifluorometóxi pode estar presente no anel. Se R3 for um grupo alifático, um substituinte independentemente selecionado a partir de um grupo alquila, um grupo trifluorometila, um grupo trifluorometóxi pode estar presente no anel; R7, R&e Rº serem independentemente selecionados a partir de um grupo haloalquila C1-Ca, um grupo tioalquila C1-Ca, um grupo aminoalquila C;-C4, um grupo alquila C1-G, e um grupo hidroxialquila C1-Ca; Ró ser selecionado a partir de um grupo alquilóxi C1-Ca, um grupo acilóxi, um grupo hidroxila, um grupo tiol ou um sal do mesmo; X, Y e Z serem independentemente selecionados a partir um átomo de carbono e um átomo de nitrogênio; se X ou Y ou Z for nitrogênio, as outras duas posições são átomos de carbono.

3. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por X, Y e Z serem átomos de carbono.

4, COMPOSTO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por pelo menos um dentre R!, R?, Rº e Rº ser ou conter um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é, de preferência, um átomo de flúor (F).

5. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por R? ser um grupo fenila e cada um de R!, R?º, Rº e Rº ser um átomo de flúor.

6. COMPOSTO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o grupo alquila C1-C, ser um grupo metila.

7. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo que consiste em:

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8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um composto, conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

9. COMPOSTO, conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 7, ou composição farmacêutica, conforme descrita na reivindicação 8, caracterizado por ser para uso em um método de tratamento de uma doença tumoral,

10. COMPOSTO OU COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado(a) por a doença tumoral ser leucemia mielogênica aguda (AML), câncer de mama triplo-negativo, tumores PTEN-mutantes e tumores acionados por KRAS.

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Resumo INIBIDORES DA DIIDROOROTATO DESIDROGENASE HUMANA (HDHODH) E

SEU USO NA MARCAÇÃO DE DOENÇAS ONCOLÓGICAS SENSÍVEL À FALTA DE

PIRIMIDINA A presente invenção refere-se a compostos de fórmulas (I) e (II) que são novos inibidores de diidroorotato desidrogenase humana (ADHODH), composições farmacêuticas contendo os inibidores acima mencionados, assim como seu uso no tratamento de doenças relacionadas a tumor, em particular leucemia mielogênica aguda (AML), câncer de mama de triplo-negativo, tumores PTEN-mutantes e tumores acionados por KRAS.