IT201800006067A1 - Nuovi inibitori della diidroortato deidrogenasi umana (hDHODH) e loro uso mirato sul differenziamento mieloide. - Google Patents

Nuovi inibitori della diidroortato deidrogenasi umana (hDHODH) e loro uso mirato sul differenziamento mieloide. Download PDF

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Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titoloμ “Nuovi inibitori della diidroorotato deidrogenasi umana (hDHODH) e loro uso mirato sul differenziamento mieloide”
DESCRIZIONE
La presente invenzione è relativa a nuovi inibitori della diidroorotato deidrogenasi umana (DHODH umana) e al loro uso nel trattamento di malattie associate al blocco del differenziamento mieloide, in particolare a leucemia mieloide acuta (LMA).
La diidroorotato deidrogenasi umana (DHODH umana) catalizza lo step di regolazione della biosistesi delle pirimidine, che converte diidrorotato (DHO) a orototato (ORO). Essendo un target validato nel trattamento di malattie autoimmuni, quali l’artrite reumatoide e la sclerosi multipla, DHODH umana è stata recentemente associata alla leucemia mieloide acuta (LMA); una malattia per la quale gli standard di cura intensiva non sono mutati nelle ultime quattro decadi. La connessione con LMA ha spianato la via a prospettive totalmente nuove sia nel trattamento della malattia che nel campo associato a DHODH umana.
La presente invenzione riguarda una classe di inibitori, basata su un sistema idrossipirazolo[1,5-a]piridinico quale inusuale bioisostero del gruppo carbossilico, che è stata disegnata a partire idealmente dal brequinar, uno dei più potenti inibitori di DHODH umana conosciuti, usando una tecnica di scaffold-hopping innovativa.
Una combinazione di ottimizzazione structure-based e ligand-based hanno in particolare portato allo sviluppo del composto 4, che mostra livelli di potenza su DHODH umana in vitro simili al brequinar e che gli è superiore in termini di citotossicità e immunosoppressione. Inoltre, il composto 4 è in grado di ripristinare il differenziamento mieloide in linee cellulari leucemiche ad una concentrazione logaritmica inferiore rispetto a quella necessaria con brequinar.
SFONDO DELL’INVENZIONE
La diidroorotato deidrogenasi umana (DHODH, EC 1.3.99.11) è un bersaglio terapeutico che è stato validato per il trattamento di malattie autoimmuni e cancro.<1, 2 >Presente nella membrana mitocondriale interna, DHODH umana è un enzima flavina-dipendente che è coinvolto nella biosintesi de novo delle pirimidine.
Nell’ambito della varietà di inibitori di DHODH umana sintetizzati nel corso degli anni, l’interessante attività di leflunomide e brequinar (Figura 1) ha attratto molta attenzione.<3 >Leflunomide e il suo metabolita teriflonomide, gli unici farmaci approvati associati ad un meccanismo DHDOH umana dipendente, sono stati anche approvati per il trattamento di artrite reumatoide e malattie autoimmuni.<4, 5 >Brequinar, uno dei più potenti inhnibitori di DHODH umana conosciuti dalla scienza, è stato identificato durante la ricerca di nuovi inibitori di DHODH umana in grado di mostrare benefici clinici simili alla leflunomide ma senza gli effetti collaterali associati alla sua somministrazione.<6 >Sfortunatamente, brequinar è stato scartato come agente terapeutico per i suoi effetti collaterali, una limitata finestra terapeutica e una farmacocinetica inconsistente<2, 8, 9>quando investigato in studi clinici per cancro<7 >e per la prevenzione del rigetto d’organo.<8 >Nell’autunno del 2016, due pubblicazioni<10, 11 >hanno dimostrato il ruolo centrale che gioca DHODH umana in leucemia mieloide acuta (LMA), una malattia per la quale gli standard di cura intensiva non sono mutati nelle ultime quattro decadi.<12 >LMA, la più comune forma di leucemia acuta negli adulti è un tumore della linea mieloide dei globuli bianchi. Le cellule leucemiche perdono l’abilità di differenziarsi in globuli bianchi adulti rimanendo cellule immature, caratterizzate da un alto potenziale proliferativo, che si accumulano nel midollo osseo ed interferiscono con la normale produzione di globuli bianchi. La malattia progredisce rapidamente e se non trattata è tipicamente fatale in settimane o alcuni mesi. I risultati degli studi sopra riportati suggeriscono che la DHODH umana svolge un ruolo centrale nella regolazione del differenziamento mieloide in modelli sia in vitro sia in vivo, aprendo così prospettive totalmente nuove per il trattamento della LMA. Nello studio pubblicato,<13 >come inibitore di DHODH umana è stato utilizzato il brequinar risultato in grado di indurre significativamente differenziamento mieloide, ritardare lo sviluppo della malattia e ridurre, in vari modelli animali (LMA di topo, xenograph di linee cellulari umane e xenotrapianti derivati dal paziente e modelli di topi singenici) il carico delle cellule che sviluppano leucemia. La scoperta del ruolo centrale della DHODH umana in LMA ha immediatamente attirato l'interesse delle aziende farmaceutiche. Due inibitori di DHODH umana sono attualmente in fase di studio per il trattamento dell'LMA; ASLAN 003 (di ASLAN Pharmaceuticals), entrato in uno studio clinico di Fase II nel novembre 2017, e BAY2402234 (di Bayer) è entrato in sperimentazione preclinica di Fase I nel gennaio 2018 (NCT03404726). Sia il fatto che un numero di nuovi inibitori di DHODH umana siano stati riportati negli ultimi anni, <1, 3, 14-18 >sia il crescente interesse dell’industria dimostra come la necessità di sviluppare nuovi inibitori di DHODH umana è un urgente problema.
Gli inventori hanno recentemente introdotto una nuova generazione di inibitori di DHODH umana che sono stati disegnati tramite una sostituzione scaffold hopping della sottostruttura acida presente nel brequinar con alcuni azoli idrossilati acidi.<13, 19>
Tre di questi composti (1 - 3), basati rispettivamente su idrossitiadiazolo, idrossitriazolo e idrossipirazolo (Figura 1), hanno dimostrato di possedere alta attività inibitrice in vitro della DHODH umana, essendo il composto 1 il migliore della serie con valori di IC50 pari a 16 nM. Le strutture cristallografiche a raggi X di 1 – 3 in complesso con DHODH umana hanno dimostrato come queste sottostrutture acide, che mostrano diverse proprietà acide,<17 >giochino il ruolo del gruppo carbossilico di brequinar nell’interazione con Arg136 nel sottosito 2 di DHODH umana.<20 >Inoltre, ogni sistema presenta la possibilità di formare interazioni con la piccola tasca lipofila creata da Val143 and Val134, conosciuta come sottosito 4. Quando saggiati come attività antiproliferativa, i composti sono risultati efficaci alla stessa concentrazione di brequinar, presentando minore citossicità cellulare rispetto al riferimento mostrando effetti citotossici solo a concentrazioni 70 volte superiori a quelle necessarie per inibire la proliferazione cellulare.
La presente invenzione rappresenta il passo successivo nella progettazione descrivendo una nuova serie di potenti inibitori di DHODH umana che sono stati ottenuti usando 2-idrossipirazolo[15-a]piridina come sottostruttura acida.
SINTESI DELL’INVENZIONE
2-Idrossipirazolo[15-a]piridina è un sistema ancora relativamente inesplorato in letteratura. La presente domanda di brevetto descrive il suo primo uso in ambiti di scaffold hopping come bioisostero del gruppo carbossilico. Nella prima serie, oltre a investigare la sottostruttura tal quale (composti 4 e 7, Figura 2a), gli autori hanno anche investigato gli effetti dell’introduzione di un gruppo metilico nell’anello piridinico con l’obiettivo di incrementare le sue interazioni con il sottosito 4 (composti 5 e 6, Figura 2a). Nella seconda serie (composti 8 - 10, Figura 2b), gli inventori hanno sostituito il sostituente bifenilico con il più flessibile difeniletere in modo da incrementare le sue proprietà farmacocinetiche e ottenere composti con caratteristiche più simile a un farmaco. La progettazione teorica, la sintesi, le RSA, i saggi biologici (vitalità cellulare, proliferazione, citotossicità, immunosoppressione e differenziamento mieloide) la caratterizzazione chimico-fisica e un preliminare profilo ADME sono presentati e discussi.
Conseguentemente, un primo aspetto della presente invenzione è un inibitore di DHODH umana basato sullo scaffold 2-idrossipirazolo[15-a]piridinico avente la formula generale (I):
In cui:
R<1>, R<2>, R<4 >e R<5 >sono scelti indipendentemente fra un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, una catena alchilica C1- C4 e una catena alogenata C1- C4; R<3 >è un fenile o un gruppo fenossi;
R<7 >e R<8 >sono scelti indipendentemente fra un atomo di idrogeno o una catena alchilica C1- C4
R<6 >è un gruppo C1-C4 alchilossilico o un gruppo ossidrilico o un suo sale. Secondo una forma doi realizzazione preferita, almeno uno fra R<1>, R<2>, R<4 >e R<5 >è o contiene un atomo di alogeno.
Un atomo di alogeno preferito è un atomo di fluoro (F)
Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita, ciascuno di R<1>, R<2>, R<4 >e R<5 >è un atomo di fluoro e R<3 >è un fenile.
Nella definizione di R<6>, i sali preferiti sono Na<+>, K<+ >o Cs<2+>.
In tutte le forme di realizzazione summenzionate, un gruppo alchilico C1-C4 preferito è il gruppo metilico.
I composti preferiti che ricadono all’interno della formula generale (I) sono i composti 4-6 and 8-10 mostrati in Figura 2. Particolarmente preferito è il composto 4, che ha come struttura:
Un secondo aspetto della presente invenzione è una composizione farmaceutica comprendente un inibitore della DHODH umana basato sullo scaffold 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridinico e di formula generale (I) come sopra definito e un veicolo, eccipiente o diluente farmaceuticamente accettabile.
Un terzo aspetto della presente invenzione è un inibitore di DHODH umana basato sullo scaffold 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridinico di formula generale (I) come sopra definito per l'uso nel trattamento di una malattia correlata al blocco del differenziamento mieloide, in particolare la leucemia mieloide acuta (LMA).
La seguente parte sperimentale è fornita solo a scopo illustrativo e non intende limitare l'ambito dell'invenzione come definito dalle rivendicazioni allegate.
Nella parte sperimentale, si fa riferimento alle seguenti figure:
La figura 1 mostra le strutture di inibitori noti quali leflunomide, brequinar e idrossiazoli 1 – 3.
La Figura 2 mostra le strutture dei composti 4 - 10, che sono basate sullo scaffold 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridinico (il composto 7 non rientra nell'ambito dell'invenzione).
La figura 3 mostra le procedure di sintesi utilizzate per la preparazione di intermedi del sistema idrossil-pirazolo[1,5-a]piridinico. i) HOSA, H2O, 90 °C; ii) K2CO3, EtOH; iii) dietilmalonato, etanolo, 90 °C; iv) t-BuO-K+, dry THF v) 0.1N HCl; vi) Cs2CO3, MeI, dry THF, 40°C; vii) Cs2CO3, BnBr, dry DMF, viii) 5M NaOH, etanolo, 70°C. (Schema 1).
La figura 4 mostra la sintesi dei composti target 4 - 10: i) ossalilcloruro, dry DMF, dry THF; ii) AlMe3, dry toluene, reflusso; iii) H2, Pd/C, 37% HCl, etanolo; iv) dry toluene, reflusso; v) H2, Pd/C, dry THF, vi) 5M NaOH, etanolo, r.t. (Schema 2).
La figura 5 mostra i risultati dei test di citotossicità. A) Citotossicità indotta da diverse concentrazioni di brequinar, composto 2 e 4 su U937 e THP1. Significatività statistica: * p <0,05; ** p <0,01 tra i nostri composti e brequinar. B) La citotossicità è totalmente invertita quando l'uridina è aggiunta al composto 4, ma non al composto 2, sia in U937 che in THP1. Significatività statistica: * p <0,05; ** p <0,01 tra ciascun composto ± uridina. L'uridina è stata aggiunta alla concentrazione di 100 μM. C) Inibizione della proliferazione esercitata da diverse concentrazioni di brequinar, composto 2 e 4 su U937 e THP1. Significatività statistica: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 tra cellule trattate e non trattate (solo DMSO). # p <0,05 tra i nostri composti e brequinar. DMSO = dimetilsolfossido, cioè il solvente di tutti i composti testati.
La Figura 6 mostra i risultati dei test di differenziamento. A) Cinetica di differenziamento indotta da varie concentrazioni di brequinar, composto 4 e 2, su U937, espressa come proporzione di cellule positive CD11b. B) Cinetica di differenziamento indotta da varie concentrazioni di brequinar e composto 4 su THP1, espressa come proporzione di cellule CD14 positive. C) Il differenziamento indotta su U937 da brequinar (pannello di sinistra) e composto 4 (pannello di destra) è invertita quando si aggiunge uridina. L'analisi di differenziamento viene eseguita al giorno 3. D) Il differenziamento indotta su THP1 da brequinar (pannello di sinistra) e composto 4 (pannello di destra) viene invertita quando si aggiunge uridina. L'analisi di differenziamento viene eseguita al 3° giorno. DMSO indica solo le cellule trattate con dimetilsolfossido. # 4 = composto 4; # 2 = composto 2; BRQ = brequinar; ur = uridina. L'uridina è stata aggiunta a 100 μM di concentrazione in tutti gli esperimenti. Significatività statistica: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001.
La Figura 7 mostra il parallelismo tra la proporzione giornaliera di differenziamento delle cellule e la vitalità delle cellule. La proporzione di celle in differenziamento è espressa con barre e l'asse di riferimento è a sinistra; la vitalità delle cellule è espressa con linee e l'asse di riferimento è sulla destra. La freccia in basso indica la concentrazione dei farmaci. Gli esperimenti sono stati eseguiti su U937 e THP1 e il differenziamento è stato valutato, rispettivamente, con espressione di CD11b e CD14. Significatività statistica: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 tra cellule trattate e non trattate. DMSO = dimetilsolfossido.
Parte sperimentale
Risultati e discussione
Chimica: sintesi dei composti bersaglio 4 - 10
Le strategie chimiche utilizzate per produrre i building blocks 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina regiosostituiti e protetti 20a-c, 17a, che sono utilizzati nelle sintesi dei composti 4-10, sono mostrate nello Schema 1 (Figura 3). I composti 15a, b, c sono stati preparati, mediante una leggera modifica ad una procedura nota (Schema 1), <21 >a partire da piridina o dalle corrispondenti piridine sostituite. I composti 12a-c sono stati ottenuti amminando le corrispondenti piridine sostituite 11a-c, usando acido idrossilammina-O-solfonico (HOSA) come reagente amminante. I prodotti sono stati trattati con K2CO3 per fornire le corrispondenti ilidi 13 che sono state fatte reagire con dietilmalonato in EtOH per fornire intermedi di tipo 14, che a loro volta sono stati convertiti nei composti desiderati 15a-c, in presenza di una base forte (t -BuO-K ), con 18-21% di resa complessiva.
Sebbene alcuni esempi siano stati riportati in letteratura<22>, il pattern di reattività che le 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridine mostrato nei confronti degli agenti alchilanti non è mai stato completamente studiato. Entrambi i pattern di O- e N-alchilazione devono essere sempre tenuti in considerazione,<13, 23 >quando viene valutata la reattività di azoli idrossilati. Il tipo di eteroatomo all'interno del sistema eterociclico e la scelta dell'agente alchilante usato di solito governano il modello di alchilazione <13, 17, 24 >Muovendosi lungo lo Schema 1, in ciascun caso l'alchilazione di 15a-c con benzil bromuro ha fornito i corrispondenti derivati N-alchilati 18a-c (rapporto 5 – 29 %), oltre ai desiderati composti O-alchilati 19a-c. Un risultato simile è stato ottenuto quando il metilioduro è stato usato come agente alchilante su 15a, producendo gli isomeri metilati 16a e 17a con rese 35 % e 59 %, rispettivamente. La spettroscopia 2D-NMR è stata utilizzata per attribuire univocamente le relative strutture isomeriche (vedi Materiale supplementare). Gli esteri 19a - c sono stati quindi idrolizzati in condizioni basiche per fornire in buone rese gli acidi corrispondenti 20a - c, questi sono stati poi utilizzati per la preparazione dei composti finali 4 - 6, 8 - 10, come descritto nello Schema 2 (Figura 4). A partire dagli acidi 20a-c (vedi Schema 1 di Figura 3), i corrispondenti acilcloruri sono stati ottenuti mediante trattamento con ossalilcloruro in diclorometano e utilizzati direttamente dopo l'essiccazione senza ulteriore purificazione. Per migliorare la loro reattività con gli acilcloruri, 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilanilina (21), è stata convertita nella corrispondente dimetilalluminio ammide. Le ammidi desiderate 22a-c sono state ottenute con rese 38 – 45 %. È interessante notare che la protezione benzilica durante la reazione di accoppiamento traspone dall'ossigeno esociclico all'azoto N1 endociclico (vedere Materiale Supplementare per i dettagli sulla caratterizzazione. I Chemical shift <13>C-NMR del nucleo benzilico CH2 sono risultati diagnostici per l'attribuzione strutturale dei derivati N-benzilici o O-benzilici come per i composti 18a e 19a). D'altra parte, l'accoppiamento del cloruro acilico, derivato da 20a, con fenossianiline 23-25 portava alle ammidi protette O-benziliche 26 - 28, come desiderato. Questa differenza di reattività ci ha portato a correlare la migrazione del gruppo benzile con la presenza di un acido di Lewis nella miscela di reazione. I composti di tipo 22a - c e 26 - 28 sono stati quindi convertiti nei composti bersaglio desiderati 4 - 6, 8 - 10 applicando condizioni di idrogenazione catalitica a pressione ambiente. Lo stesso approccio è stato applicato alla preparazione di 7. In questa occasione, l'acido ottenuto dall'idrolisi di 17b è risultato abbastanza instabile, tanto che qualsiasi tentativo di isolamento ha portato alla sua decarbossilazione. Gli inventori hanno evitato questa decomposizione isolando l'intermedio come un sale di sodio e trasformandolo nel corrispondente cloruro di acile direttamente. Il cloruro di acile era abbastanza stabile per reagire con la dimetilalluminio ammide di 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilanilina fornendo il composto 7 in una resa del 27 %.
Inibizione di DHODH umana e Relazioni Struttura Attività (RSA)
In primo luogo, i presenti inventori hanno valutato l'attività di inibizione della DHODH umana ricombinante dei composti 4-10 prendendo come riferimento la teriflunomide, il bequinar e l'idrossiatriazolo 2<13 >(Tabella 1). Tra i composti di prima generazione 1 - 3, il composto 2 ha mostrato il miglior equilibrio tra potenza su DHODH umana e citotossicità cellulare e, per questo motivo, è stato considerato il composto più promettente e per questo incluso in questo studio.
Tabella 1: Effetti biologici dei composti 2, 4 - 10, brequinar e teriflunomide. L'effetto dei composti (espresso come valore di IC50, ad eccezione della citotossicità), su a) DHODH umana, saggio in vitro; b) inibizione della proliferazione cellulare (cellule Jurkat T); c) citotossicità, concentrazione di composti che causano un effetto citotossico significativo (≥ 30%) (cellule di Jurkat T); d) inibizione della proliferazione di PBMC stimolata da PHA. La notazione "nd" indica che il composto non è stato testato in quel test specifico.
L'analogo 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridinico 4 (IC50 = 1,2 nM), è risultato essere il composto più potente della serie, 320 volte più potente della teriflunomide (IC50 = 388 nM), e solo paragonabile a brequinar (IC50 = 1,8 nM) nel saggio enzimatico, dimostrando la validità di questo approccio.
Inoltre, i presenti inventori hanno focalizzato la loro attenzione sulla possibilità di decorare la parte "piridinica" dello scaffold bioisosterico 4, per aggiungere un'interazione con la piccola tasca lipofilica creata da Val134 e Val143 (sottosito 4). Lo studio è stato basato su un approccio computazionale, attraverso la valutazione della perturbazione dell’energia libera (FEP) condotta in Dinamica Molecolare (MD).<25 >Le quattro posizioni disponibili di 4, indicate nella Tabella 2, sono state esplorate utilizzando MD / FEP scansioni di metile e cloro per identificare i siti più promettenti per una sostituzione efficace dell'idrogeno.
Tabella 2. Risultati MD / FEP della variazione di energia libera calcolata di legame (in kcal / mol) e dell'incertezza computata per l'introduzione di sostituenti quali cloro e metile sulla sottostruttura 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridinica del composto 4.
I valori di ΔΔG ottenuti, poiché i valori negativi rappresentano un aumento nell'affinità di legame, indicano che il cloro è generalmente preferito rispetto al metile in tutte le posizioni. Tra i quattro siti, la posizione 7 è la più favorevole per una sostituzione in quanto presenta i valori energetici più bassi, -1,43 per il cloro e solo un effetto marginale sull'energia per il gruppo metilico (0,15). Per valori di energie positive più elevate per il cloro (0,87) e il metile (2,59), la sostituzione dell'idrogeno in posizione 6 è la meno favorita. Le posizioni 4 e 5 mostrano un comportamento comparabile, la sostituzione in 5 è solo leggermente meglio tollerata che in 4 per entrambi i gruppi.
Passando ai risultati sperimentali e tenendo conto di quanto suggerito da MD / FEP, le due posizioni più tollerate, 5 e 7, sono state considerate per una modulazione. Poiché i derivati cloro sostituiti discussi di 4 non sono ancora accessibili sinteticamente, in questo studio, i derivati con un sostituente metilico nelle posizioni 7 e 5 sono stati sintetizzati (Schema 1), portando rispettivamente ai composti 5 e 6. Mentre la sostituzione della posizione 5 ha diminuito l'attività di 25 volte (6, IC50 = 35 nM), rispetto a 4, la sostituzione della posizione 7 ha fornito un profilo simile (5, IC50 = 4,3 nM).
Nella seconda serie (composti 8 - 10 Tabella 1), è stata studiata la sostituzione del sostituente bifenilico nel tentativo di migliorare le proprietà farmacocinetiche e ottenere composti con caratteristiche più simili a un farmaco. Nei nostri precedenti studi, <13, 19 >l'interazione ottimale con il sottosito 1 lipofilo veniva garantita solo con la tetrafluoro sostituzione del primo anello. Analisi conformazionali, <26 >hanno sottolineato il ruolo della sostituzione degli atomi di fluoro sul primo anello nella stabilizzazione della modalità di legame brequinar-simile, in precedenza trovata correlata con una maggiore potenza inibitoria. <20 >Ad esempio, la rimozione di due o tre atomi di fluoro dalla sottostruttura bifenilica dell'analogo triazolico 2 ha comportato un drastico calo dell'attività inibitoria. <13 >Tuttavia, la presenza del sostituente tetrafluorobifenilico è dannosa per la solubilità dei nostri derivati. Gli inventori decisero quindi di progettare analoghi privi di uno scaffold bifenilico per studiare nuove possibilità. Sebbene sia stato osservato un drastico calo dell'attività nel passaggio da 4 (IC50 = 1,2 nM), a 8 (IC50 = 760 nM), la sostituzione della sottostruttura fenilica sembra essere possibile. L'aggiunta di un gruppo metilico alla posizione 3 del primo anello (composto 9), ha portato l'attività a muoversi leggermente verso quella della teriflunomide (IC50 = 480 nM), mentre aggiungendo un secondo metile alla posizione 6 (composto 10), un intervallo nM viene finalmente ottenuto (IC50 = 43 nM). Sulla base di questi risultati, gli inventori hanno previsto che l'aumentata rigidità garantita dalla doppia sostituzione metilica e l'aumento di idrofobicità potrebbero essere cruciali per l'attività.
Saggi basati sulle cellule
Proliferazione, citotossicità e immunosoppressione sulle cellule Jurkat
Dopo aver valutato i composti da 4 a 10 per la loro capacità di inibire la DHODH umana ricombinante in vitro, i composti attivi da 4 a 6 e da 8 a 10 sono stati testati per i loro effetti sulla proliferazione cellulare nelle cellule Jurkat T (Tabella 1). Anche la stabilità dei composti nelle condizioni sperimentali applicate è stata verificata e tutti sono risultati stabili. La potente attività in vitro osservata su DHODH umana per i composti 4 e 5 si è tradotta in un potente effetto antiproliferativo, che era leggermente superiore a quello del brequinar stesso in entrambi i casi. I composti 6 e da 8 a 10 mostravano profili simili benchè la minore potenza su DHODH umana ha portato ad effetti antiproliferativi più deboli. Inoltre 4 e 5, 6 e 10 hanno anche superato la teriflunomide, mostrando entrambi effetti antiproliferativi che erano 30 volte più potenti. La dipendenza dalla DHODH degli effetti antiproliferativi dei composti da 4 a 6 e da 8 a 10 è stata analizzata anche testando la loro attività in presenza di uridina 100 μM.<27 >Come mostrato nella Tabella 1, gli effetti antiproliferativi sono regrediti mediante l'aggiunta di uridina esogena, il che indica chiaramente che i composti agiscono come inibitori della biosintesi delle pirimidine, e che quindi inibiscono la proliferazione delle cellule Jurkat attraverso questo meccanismo. Fa eccezione il composto 8, che è probabilmente troppo debole come inibitore della DHODH umana per osservare un’inversione del suo effetto mediata dall'uridina. Al fine di valutare se gli effetti antiproliferativi derivassero dalla morte cellulare, la citotossicità è stata valutata su cellule Jurkat T utilizzando il test Green CellTox e sono state rilevate le concentrazioni di composti che erano in grado di causare il 30% di morte cellulare. Il composto 4 non ha avuto effetti negativi sulla vitalità cellulare fino a 60 μM, mentre 5 è risultato essere citotossico a una concentrazione simile a quella del brequinar. Curiosamente, non è stato osservato alcun effetto negativo sulla vitalità cellulare nei composti da 8 a 10, per i quali un difeniletere è stato utilizzato per realizzare interazioni dell'inibitore con il sottosito 1, anche quando sono stati testati ad una concentrazione di 100 μM. Questo risultato è piuttosto interessante in quanto mostra come si possano ottenere profili farmacologici promettenti usando questa sottostruttura molecolare.
Al fine di valutare l'attività immunosoppressiva dei composti, il loro effetto sulla proliferazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) attivate da fitoemoagglutinina (PHA), è stato valutato e confrontato con quello del brequinar. Come mostrato nella Tabella 1, l'effetto antiproliferativo del brequinar è 10 volte maggiore di quello della teriflunomide (3,74 e 54,3 μM, rispettivamente), il che conferma le ricerche precedenti. Per tutti i composti testati si è osservato che una potente attività contro la DHODH umana è correlata con una potente inibizione della proliferazione dei PBMC attivati. Questa inibizione, tuttavia, può essere regredita con l'aggiunta di uridina esogena, suggerendo che l'attività immunosoppressiva dei composti può essere dovuta all'inibizione della sintesi de novo dei nucleotidi pirimidinici.
Proliferazione, citotossicità e differenziamento mieloide nelle cellule leucemiche
Nell'ultima fase del nostro studio, i presenti inventori hanno valutato gli effetti dei loro inibitori di DHODH umana su due linee cellulari (U937 e THP1) di leucemia mieloide acuta (LMA). Gli inventori hanno deciso di confrontare il composto 4, giudicato il miglior compromesso tra potenza e citotossicità, il triazolo 2, il miglior composto della prima serie che mostra una citotossicità molto bassa e il brequinar, che è stato usato come controllo positivo. Nei primi esperimenti, gli inventori hanno valutato la vitalità cellulare utilizzando esperimenti basati su CFSE. Come mostrato nella Figura 5A, sia il composto 4 che il brequinar hanno mostrato una forte citotossicità concentrazione-dipendente , mentre il composto 2 è stato in grado di indurre la morte cellulare solo ad alte dosi. La citotossicità del composto 4 è stata completamente annullata in seguito all' aggiunta di uridina, questo non è stato però il caso del composto 2 (Figura 5B). Ciò suggerisce che la citotossicità per il composto 4 sia dovuta solo all'inibizione di DHODH umana, mentre quella del composto 2 sia dovuta ad una tossicità più generica che si manifesta ad alte dosi. Inoltre, la citotossicità contro le U937 è risultata leggermente più evidente di quella contro le THP1, il che probabilmente riflette l'eterogeneità della LMA. Sono stati anche eseguiti saggi di proliferazione basati sulla CFSE e, come atteso, il composto 4, il brequinar e, in misura minore, il composto 2, hanno tutti notevolmente ridotto la proliferazione cellulare, come mostrato nella Figura 5C. È interessante notare che il composto 4 sembra essere più efficace del brequinar a concentrazioni più basse sia in esperimenti di proliferazione che di citotossicità. Mentre i risultati dei saggi di proliferazione erano attesi, i dati di citotossicità, a prima vista, contraddicevano gli esperimenti sulle cellule Jurkat-T, che avevano dimostrato una bassissima tossicità dei nostri composti. Tuttavia, poiché le cellule mature hanno un'emivita molto più breve di quelle immature, gli inventori hanno ipotizzato che la notevole citotossicità osservata nelle linee cellulari di LMA, ma non nelle cellule Jurkat-T, dovesse essere ascritta al differenziamento indotto dalle cellule leucemiche da parte degli inibitori di DHODH umana. Gli inventori hanno quindi studiato l'effetto del differenziamento indotto dai composti 2, 4 e brequinar sulle linee cellulari LMA a diverse concentrazioni. Il processo di differenziamento è stato seguito analizzando l'espressione di CD11b e CD14, poiché questi antigeni sono tipicamente presenti nelle cellule mieloidi mature. In particolare, il differenziamento cellulare si evidenzia meglio su U937 con CD11b e su THP1 con CD14; risultati simili ma meno pronunciati sono stati ottenuti con CD11b su THP1. I nostri esperimenti hanno chiaramente dimostrato che sia il composto 4 che il brequinar hanno indotto un forte differenziamento nelle cellule U937 e THP1, come mostrato nella Figura 6A, 6B. Dopo il trattamento con questi composti, infatti, l'espressione di CD11b e CD14 è aumentata significativamente giorno dopo giorno, in funzione delle concentrazioni di farmaco.
In particolare, il composto 4 ha indotto un effetto di differenziamento che era paragonabile a quello del brequinar ad una concentrazione inferiore di una unità logaritmica. Il Composto 2, d'altra parte, ha indotto solo un lieve aumento di CD11b nelle cellule U937 a dosi elevate (10 μM), alle quali ha portato ad una significativa morte cellulare. Questi dati, unitamente ai risultati di citotossicità, hanno indicato che il composto 2 non era in grado di indurre il differenziamento mieloide ma che causava tossicità aspecifica ad alte dosi. Per questo motivo, il composto 2 è stato escluso da ulteriori esperimenti con THP1 e uridina.
Per dimostrare ulteriormente la connessione tra differenziamento e inibizione della DHODH umana, gli esperimenti di differenziamento sono stati ripetuti in presenza di uridina, ed è stata osservata la completa eliminazione del fenomeno (Figura 6C, D). Gli esperimenti di differenziamento si dovettero interrompere dopo 4 giorni, poichè le cellule differenziate progressivamente morivano. Tenendo a mente quanto detto, si può vedere come il composto 4 e il brequinar da soli abbiano causato la morte della stragrande maggioranza delle cellule leucemiche in vitro, anche se la proporzione delle cellule che progressivamente differenziavano ha raggiunto una percentuale massima del 40% (Figura 7). Ancora, il composto 4 è stato in grado di indurre una morte massiccia di cellule leucemiche già a 0,1 μM, cioè ad una concentrazione inferiore di una unità logaritmica rispetto al brequinar.
Caratterizzazione chimico-fisica e profilo ADME preliminare
La determinazione delle principali proprietà chimico-fisiche che governano il profilo ADME è stata effettuata per tutti i composti misurandone la lipofilia (log D<7.4>) e la solubilità a pH fisiologico. I dati sono riportati in Tabella 3. La solubilità dei composti è stata valutata a pH 7,4 in soluzione tampone fosfato (PBS), a 37 ° C per simulare i fluidi corporei, e in PBS con il 2% v / v di DMSO per esplorare i limiti di solubilità nelle condizioni sperimentali in vitro. Sfortunatamente, tutti i composti hanno mostrato una solubilità di circa dieci volte inferiore rispetto al brequinar. Tuttavia, i valori erano sufficienti per consentire che i test in vitro venissero eseguiti. Tutti i composti mostrano un buon bilancio idrofilo-lipofilo, con valori di log D ottimali per un comportamento farmacocinetico favorevole; la differenza osservata tra il log P (ClogP) calcolato e il log D<7.4 >misurato era in accordo con la presenza di una significativa ionizzazione dei composti a pH fisiologico. Il comportamento sierico dei composti 2 e 4, selezionati per gli studi di differenziazione su cellule leucemiche, è stato caratterizzato misurando la stabilità nel siero umano e il legame con le proteine sieriche. I composti 2 e 4 hanno mostrato un profilo nel siero molto simile a quello del composto di riferimento brequinar; buona stabilità e un'altissima percentuale di legame con le proteine (Tabella 4) .<28,29 >
Tabella 3. <a) >clogP calcolato usando Bio-Loom per Windows, vers.1.5; <b) >misurato usando il metodo shake flask. La notazione “n.d.” indica che il compost non è stato testato in quello specific test.
Tabella 4. Stabilità in siero umano e legame con le proteine dei composti 2 e 4, confrontati con il brequinar.
Conclusioni
I presenti inventori hanno identificato una nuova classe di inibitori basati sulla struttura idrossi-pirazol[1,5- α] piridinica, un bioisostero inusuale della funzione carbossilica. Il composto 4, uno dei più potenti inibitori della DHODH umana mai scoperto, ha chiaramente dimostrato di indurre il differenziamento mieloide in due linee cellulari di LMA, portando ad una massiccia morte di cellule leucemiche. In particolare, questo effetto è stato ottenuto con una concentrazione inferiore di una unità logaritmica rispetto a quella del composto di riferimento brequinar ed è stato limitato alle sole cellule leucemiche. Infatti, gli inventori hanno dimostrato che la citotossicità non era correlata all'inibizione della DHODH umana di per sé, in quanto il composto mostrava poca o nessuna tossicità verso le cellule T Jurkat, ma piuttosto all'effetto di differenziamento indotto esclusivamente nelle cellule di LMA attraverso l'inibizione della DHODH umana. È quindi evidente che il composto 4 mostra un profilo di tossicità ottimale e un'attività altamente selettiva per il sito d’azione, rendendolo un candidato ideale per ulteriori studi in vivo su modelli di LMA.
Materiali e metodi
Chimica
Metodi generali
Tutti i reagenti di partenza sono stati acquistati (Sigma Aldrich, Alfa Aesar, FluoroChem), e usati senza ulteriori purificazioni. La cromatografia liquida su piastra (TLC), fu utilizzata per monitorare il processo delle reazioni. I solventi acquistati con un grado di purezza “analitica” (acetonitrile, diisopropil eter, dietil eter, diclorometano [DCM], dimetilformamide [DMF], etanol 99.8 % v/v, etil acetato [EtOAc], esano, metanolo [MeOH], etere di petrolio b.p.40 - 60°C, toluene), furono usati tal quali senza ulteriori purificazioni. Quando necessario, i solventi furono essicati su setacci molecolari 4 Å. Il tetraidrofurano (THF), fu distillato su sodio e benzofenone in atmosfera di azoto immediatamente prima dell’uso. La cromatografia liquida su piastra (TLC), fu effettuata su gel di silice in piastre 5 x 20 cm e 0.25 mm di spessore. MgSO4 anidro fu usato come agente anidrificante per le fasi organiche. I composti furono purificati sia con cromatografia flash su gel di silice (Merck Kieselgel 60, 230-400 mesh ASTM) con gli eluenti indicate nelle ricette di ogni composto, sia usando l’apparecchio CombiFlash Rf 200 (Teledine Isco), con un flusso di 5–200 mL/min e 200 psi (con un iniettore automatico), e colonne RediSep Rf Silica (Teledine Isco). I composti sintetizzati nei nostri laboratori mostrarono una purezza che varia dal 90 % al 99 %. Gli esperimenti biologici furono effettuati solo su composti con una purezza di almeno il 95%. La purezza fu rivelata usando due metodi analitici. Le analisi di HPLC furono effettuate su un apparecchio cromatografico UHPLC (Perkin Elmer, Flexar). La colonna fu UHPLC Acquiti CSH Fluoro-Phenil (2.1x100 mm, dimensione particelle 1.7 µm, Acquas). I composti furono sciolti in acetonitrile e iniettati attraverso una valvola “loop” di 20 µl. La fase mobile usata fu acetonitrile / acqua con 0.1 % trifluoroacetico acido (il rapporto tra 60 / 40 e 40 / 60, dipende dal fattore di ritenzione dei composti). Il tempo di ritenzione all’ UHPLC fu ottenuto ad una velocità di flusso di 0.5 mL/min, e l’eluato fu monitorato alla lunghezza d’onda di 215 e 254 nm, riferendosi alla lunghezza d’onda di 360 nm. La solubilità in PBS al pH 7.4 e la stabilità nelle condizioni dei saggi cellulari furono effettuate con un HPLC-UV (MERK-HITACHI), fornito di autocampionatore con un volume di iniezione di 60 μL (MERK-HITACHI AS-2000A), una pompa doppio stadio (MERK-HITACHI L-6200 IP), un rilevatore diode array (MERK-HITACHI L-4250), una colonna Agilent Zorbax SB-Phenil (4.6x250, 5 ȝm). Il punto di fusione (m.p.), fu misurato in un apparecchio per capillari (Büchi 540). Il punto di fusione finale fu raggiunto introducendo il campione ad una temperature inferiore di 10° C rispetto al punto di fusione previsto e riscaldando ad una velocità di 1° C min<-1>. Tutti i composti furono routinariamente analizzati con spettroscopia <1>H- e <13>C-NMR e spettrometria di massa. Gli spettri IR furono registrati solo dei solidi sullo spettrofotometro FT-IR (PerkinElmer SPECTRUM BXII, KBr dispersione), dotato dell’accessorio per la riflattanza diffusa DRIFT ACCI. Gli MS furono effettuati sia su un apparecchio Finnigan-Mat TSQ-700 (70 eV, iniezione diretta per ionizzazione chimica [CI]), o su un apparecchio Acquas Micromass ZQ dotato di una sorgente per la ionizzazione di massa elettrosprai ESCi. Gli spettri <1>H- e <13>C-NMR furono effettuati o su uno strumento Bruker Avance 300 o su un JEOL ECZR600. Per definire gli accoppiamenti furono usate le seguenti abbreviazioni: br = segnale allargato, s = singoletto, d = doppietto, dd = doppietto di doppietti, t = tripletto, q = quartetto, m = multipletto. Gli spostamenti chimici (δ) sono riportati in parti per millione (ppm). In questo lavoro i protoni ed i carboni sono etichettati (a, b, c, d, e, f, g, h, l, m, n ed o) in accordo allo Schema 2. I valori asteriscati si intendono interscambiabili. Non sono stati riportati spettri dettagliati di <13>C dei derivati bifenilici tetrafluorurati (composti finali 4 – 7 ed intermedi 22a - c), poiché sono particolarmente complicati (a causa dell’accoppiamento multiplo tra il C e il F). Per questi spettri furono assegnati solo i picchi di <13>C dell’eterociclo e dei carboni non aromatici. Per gli intermedi 15a, 15b, 15c, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a e per i composti finali 4 – 6 e 8 – 10, gli spettri di HRMS furono registrati su uno spettrometro LTQ Orbitrap (Thermo Scientific, Bremen, Germani), fornito di una interfaccia a pressione atmosferica ed una sorgente ionica ESI. I composti 24<30 >e 25<30 >furono preparati in accordo alle procedure descritte in precedenza.
Procedura generale per la sintesi di 15a, 15b, 15c. Una soluzione di idrossilamina-O-sulfonico acido (HOSA, 18 g, 0.16 mol), e la appropriata piridina 11 (3 eq), furono agitate in acqua (150 mL), a 90 °C per 1 h. La soluzione fu raffreddata a temperatura ambiente e addizionata di K2CO3 (21.99 g, 0.16 mol). La risultante sospensione fu concentrata sotto vuoto e il residuo fu ripreso con abs EtOH (200 mL). La risultante sospensione fu filtrata e dietil malonato (50.98 g, 48.56 mL, 0.32 mol), fu aggiunto al filtrato. La soluzione fu agitata a 90 °C per 3 h e poi concentrata sotto vuoto. In residuo fu purificato attraverso flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOH 9/1 v/v), per dare un appiccicoso olio marrone (derivato di tipo 14), che fu usato nel seguente passaggio senza ulteriori purificazioni. Potassio tert-butossido (17.86 g, 1 eq), fu aggiunto a piccole porzioni alla soluzione del derivato di tipo 14 in anidro THF (300 mL). La risultante sospensione arancione scuro fu agitata a temperatura ambiente per alcuni minuti fino a completa conversione dopodichè fu concentrata sotto vuoto. Il residuo ottenuto fu diluito e acidificato a pH 2 usando 0.5 N HCl (250 mL), ed estratto con etil acetato (2 x 150 mL). Le fasi organiche furono riunite, seccate ed evaporate sotto vuoto per ottenere un olio grezzo giallo che fu purificato con una flash cromatografia (eluente: diclorometano / MeOH 9/1 v/v), per ottenere il composto desiderato come solido bianco. Etil 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina-3-carbossilato (15a). Solido arancione pallido (m.p. 150.0 - 151.3 °C, da metanolo). Resa 21 %. <1>H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 1.29 (t, 3H, J = 7.0 Hz, -CH2CH3), 4.24 (q, 2H, J = 7.0 Hz, -CH2CH3), 6.98 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.48 (t, 1H, J = 7.5 Hz, H-c), 7.84 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.55 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 11.14 (s, 1H, -OH); <13>C-NMR (75 MHz, DMSO): δ 14.5 (-CH2CH3), 58.9 (-OCH2CH3), 86.4 (C-f), 113.1 (C-b), 116.9 (C-d), 128.2 (C-c), 129.2 (C-a), 141.5 (C-e), 162.7 (C-h)<*>, 164.5 (C-g)<*>; MS (CI) 207 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3094, 2979, 1700, 1639, 1559, 1534, 1448, 1330, 1246, 1212, 1156, 1107, 1026. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C10H11N2O3207.0764, obsd.207.0769. Etil 2-idrossi-7-metil-pirazolo[1,5-a]piridina-3-carbossilato (15b). Solido bianco (m.p. 113.8 - 114.6 °C; da triturazione con diisopropil eter). Resa 19 %. <1>H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 1.30 (t, 3H, J = 7.0 Hz, -OCH2CH3), 2.60 (<s>, 3H, Ar-C<H>3), 4.24 (<q>, 2H, J = 7.0 Hz, -<OCH>2<CH>3), 6.91 (<d>, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.42 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.75 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 11.20 (s, 1H, -OH); <13>C-NMR (75 MHz, DMSO): δ 14.5 (-OCH2CH3), 17.4 (Ar-CH3), 58.9 (-OCH2CH3), 86.5 (C-f), 112.67 (C-b), 114.5 (C-d), 128.1 (C-c), 138.3 (C-a), 141.8 (C-e), 162.8 (C-h)<*>, 164.2 (C-g)<*>; MS (CI) 221 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3069, 2991, 1700, 1637, 1560, 1533, 1385, 1330, 1219, 1163, 1104, 1068, 1039. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C11H13N2O3221.0921, obsd.221.0926.
Etil 2-idrossi-5-metil-pirazolo[1,5-a]piridina-3-carbossilato (15c). Solido bianco (m.p. 123.4 - 126.6 °C; da triturazione con diisopropil eter). Resa 19 %. <1>H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 1.29 (t, 3H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 2.37 (s, 3H, Ar-CH3), 4.23 (q, 2H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 6.82 (dd, 1H, J = 6.9, 1.7 Hz, H-b), 7.61 (s, 1H, H-d), 8.42 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 11.04 (br s, 1H, -OH); <13>C-NMR (75 MHz, DMSO): δ 14.5 (-OCH2CH3), 21.0 (Ar-CH3), 58.9 (-OCH2CH3), 85.6 (C-f), 115.2 (C-b)<*>, 115.6 (C-d)<*>, 128.5 (C-a), 139.1(C-c), 141.5 (C-e), 162.8 (C-h)<*>, 164.6 (C-g)<*>; MS (CI) 221 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3064, 2986, 1654, 1561, 1498, 1435, 1305, 1250, 1211, 1185, 1112, 1029. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C11H13N2O3 221.0921, obsd.221.0926.
Etil N-benzil-2-oxo-pirazolo[1,5-a]piridina-3-carbossilato (18a) e etil 2-benzilossipirazolo[1,5-a]piridina-3-carbossilato (19a) da 15a. Benzil bromuro (3.0 g, 14.50 mmol), fu aggiunto goccia a goccia ad una miscela di 15a (2.74 g, 16.00 mmol), e cesio carbonato (11.85 g, 36.40 mmol), in DMF anidra (50 mL). La miscela di reazione fu agitata per 18 ore a temperatura ambiente e acqua (100 mL), fu quindi aggiunta. La miscela fu estratta con EtOAc (3 x 100 mL), la fasi organiche riunite furono lavate con una soluzione satura di cloruro di sodio, e quindi seccate ed evaporate per dare un olio incolore. Quest’ultimo diede due macchie alla TLC (eluente: petroleum eter /EtOAc 80/20 v/v), che furono attribuite ai due isomeri delle pirazolo[1,5-a]-piridine. La miscela fu separate usando la cromatografia flash (eluente: atere di petrolio / EtOAc 80/20 v/v, poi eluente: diclorometano / MeOH 9:1 v/v). Le strutture sono state determitate in modo inequivocabile attraverso la spettroscopia eteronucleare 2D-NMR (HSQC, HMBC e NOESI).
19a) Primo isomero eluito, solido giallo pallido. (m. p: 100.0 - 100.8 °C, dopo triturazione con diisopropil eter). Resa 75 %. <1>H-NMR (300 MHz DMSO ): δ 1.30 (t, 3H, J = 7.1 Hz -OCH2CH3), 4.24 (q, 2H, J = 7.1 Hz -OCH2CH3), 5.44 (s, 2H, -OCH2Ph), 7.04 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.29 – 7.45 (m, 3H, H-o, H-n), 7.47 - 7.59 (m, 3H, H-m, H-c), 7.91 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.67 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a); <13>C-NMR (75 MHz DMSO): δ 14.4 (-OCH2CH3), 59.0 (-OCH2CH3), 70.2 (-OCH2Ph), 87.0 (C-f), 113.3 (C-b), 117.2 (C-d), 127.4 (C-m), 127.9 (C-o), 128.3 (C-n), 128.9 (C-c), 129.6 (C-a), 136.6 (C-l), 142.0 (C-e), 161.9 (C-h)<*>, 164.3 (C-g)<*>; MS (CI) 297 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3097, 3033, 2978, 1675, 1635,1530, 1515, 1440, 1364, 1251, 1208, 1141, 1053, 1021. ESI-HRMS (m/z) [M H]<+ >calcd. per C17H16N2O3297.1234, obsd.297.1240.
18a) Secondo isomero eluito, solido bianco (m.p: 172.3 - 174.0 °C, da EtOAc / diisopropil eter 1/1 v/v). Resa 21 %.<1>H-NMR (300 MHz DMSO): δ 1.28 (<t>, 3H, J = 7.1 Hz -OCH2C<H>3), 4.22 (<q>, 2H, J = 7.1 Hz -OC<H>2CH3), 5.43 (<s>, 2H, -NC<H>2Ph), 6.95 (<td>, 1H, J = 7.1, 1.0 Hz, <H-b>), 7.18 - 7.38 (<m>, 5H, H-m, H-o, H-n), 7.59 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H-c), 7.92 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.41 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a); <13>C-NMR (75 MHz DMSO): δ 14.4 (OCH2CH3), 44.5 (-NCH2Ph), 59.4 (-OCH2CH3), 84.3 (C-f), 113.3 (C-b), 117.2 (C-d), 126.0 (C-a), 128.0 (C-m), 128.8 (C-o), 129.8 (C-n), 133.3 (C-c), 134.8 (C-l), 143.6 (C-e), 160.8 (C-g)<*>, 164.0 (C-h)<*>; MS (CI) 297 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3084, 3056, 2977, 1699, 1631, 1547, 1511, 1464, 1431, 1345, 1238, 1135, 1030. ESI-HRMS (m/z) [M H]<+ >calcd. per C17H16N2O3 297.1234, obsd.297.1239.
Etil N-benzil-7-metil-2-oxo-pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilato (18b) e etil 2-benzilossi-7-metil-pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilato (19b) da 15b. Benzil bromuro (0.85 g, 4.99 mmol), fu aggiunto goccia a goccia ad una soluzione di 15b (1.00 g, 4.54 mmol), e cesio carbonato (3.70 g, 11.35 mmol), in DMF anidra (25 mL). La miscela di reazione fu agitata per 5 ore a temperatura ambiente e quindi acqua (100 mL) fu aggiunta. La miscela fu estratta con EtOAc (3 x 100 mL), le fasi organiche riunite furono lavate con soluzione satura di cloruro di sodio, seccate ed evaporate a pressione ridotta per dare un olio incolore. Quest’ultimo rivelò due macchie su TLC (eluente: etere di petrolio / EtOAc 80/20 v/v), attribuibili ai due isomeri pirazolo[1,5-a]-piridina. La miscela degli isomeri fu separate con flash cromatografia (eluente: etere di petrolio / EtOAc 90/10 v/v, quindi: diclorometano / MeOH 9:1 v/v).
19b) Primo isomero eluito, solido giallo pallido (m.p. 74.3 – 75.9 °C; da triturazione con diisopropil eter). Resa 93 %. <1>H-NMR (600 MHz CDCl3 ): δ 1.41 (<t>, 3H, J = 7.1 Hz -OCH2C<H>3), 2.68 (<s>, 3H, Ar-C<H>3), 4.37 (<q>, 2H, J = 7.1 Hz -OCH2CH3), 5.54 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.68 (d, 1H, J = 7.0 Hz, H-b), 7.24 – 7.32 (m, 2H, H-o, H-c), 7.37 (t, 2H, J = 7.6 Hz, H-n), 7.58 (d, 2H, J = 7.4 Hz, H-m), 7.89 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d); <13>C-NMR (151 MHz CDCl3): δ 14.7 (-OCH2CH3), 17.9 (Ar-CH3), 59.7 (-OCH2CH3), 70.8 (-OCH2Ph), 88.4 (C-f), 112.2 (C-b), 115.7 (C-d), 127.7 (C-m), 127.8 (C-o), 127.9 (C-c), 128.4 (C-n), 137.2 (C-l), 138.9 (C-a), 143.2 (C-e), 163.6 (C-h)<*>, 164.7 (C-g)<*>; MS (ESI) 311 (M+1).IR (KBr) υ (cm-1): 3061, 3026, 2974, 1684, 1640,1539, 1516, 1448, 1358, 1274, 1214, 1135, 1107, 1011.
18b) Secondo isomero eluito, solido bianco (m.p. 145.0 - 147.8 °C; da triturazione con diisopropil eter). Resa 5 %.<1>H-NMR (600 MHz DMSO): δ 1.29 (t, 3H, J = 7.1 Hz -OCH2CH3), 2.62 (s, 3H. Ar-CH3), 4.22 (q, 2H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 5.41 (s, 2H, -NCH2Ph), 6.75 (d, 1H, J = 7.1 Hz, H-b), 6.96 (d, 2H, J = 7.5 Hz, H-m ), 7.22 (t, 1H, J = 7.2 Hz, H-o), 7.27 (t, 2H, J = 7.4 Hz, H-n), 7.53 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H-c), 7.86 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d); <13>C-NMR (151 MHz DMSO): į 14.6 (-OCH2CH3), 20.0 (Ar-CH3), 50.4 (-NCH2Ph), 58.6 (-OCH2CH3), 83.8 (C-f), 114.2 (C-b)<*>, 114.8 (C-d)<*>, 126.2 (C-m), 127.8 (C-o), 128.9 (C-n), 134.3 (C-c), 135.5 (C-l), 140.3 (C-a), 148.5 (C-e), 163.1 (C-g)<*>, 165.0 (C-h)<*>; MS (ESI) 311 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 2975, 1718, 1647, 1559, 1516, 1437, 1318, 1250, 1154, 1129, 1071.
Etil N-benzil-5-metil-2-oxo-pirazolo[1,5-a]piridine-3-carbossilato (18c) e etil 2-benzilossi-5-metil-pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilato (19c) da 15c. Benzil bromuro (0.85 g, 4.99 mmol), fu aggiunto goccia a goccia ad una miscela di 15c (1.00 g, 4.54 mmol), e cesio carbonato (3.70 g, 11.35 mmol), in DMF anidra (25 mL). La reazione fu agitate per 4 ore a temperatura ambiente e quindi acqua (100 mL) fu aggiunta. La miscela fu estratta con EtOAc (4 x 100 mL), le fasi organiche riunite furono lavate con soluzione satura di cloruro di sodio, seccate ed evaporate a pressione ridotta per dare un olio incolore. Quest’ultimo mostrò due macchie su TLC (eluente: petroleum eter / EtOAc 80/20 v/v), attribuibili ai due isomeri pirazolo[1,5-a]-piridinici. La miscela degli isomeri fu separate con flash cromatografia (eluente: etere di petrolio / EtOAc 90/10 v/v, quindi eluente: diclorometano / MeOH 9:1 v/v).
19c) Primo isomero eluito, solido giallo pallido (m.p. 81.5 – 83.0 °C; da triturazione con diisopropil eter). Resa 58 %. <1>H-NMR (600 MHz CDCl3 ): δ 1.41 (t, 3H, J = 7.1 Hz -OCH2CH3), 2.42 (s, 3H, Ar-CH3), 4.37 (q, 2H, J = 7.1 Hz -OCH2CH3), 5.48 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.66 (dd, 1H, J = 6.90 Hz, 1.9 Hz, H-b), 7.31 (t, 1H, J = 7.4 Hz, H-o), 7.38 (t, 2H, J = 7.6 Hz, H-n), 7.55 (d, 2H, J = 7.5 Hz, H-m), 7.79 (s, 1H, H-d), 8.15 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a); <13>C-NMR (151 MHz, CDCl3): į 14.7 (-OCH2CH3), 21.7 (Ar-CH3), 59.7 (-OCH2CH3), 70.7 (-OCH2Ph), 87.6 (C-f), 115.0 (C-b), 117.1 (C-d), 127.3 (C-m), 127.9 (C-o), 128.1 (C-a), 128.5 (C-n), 136.9 (C-l), 139.3 (C-c), 143.1 (C-e), 163.6 (C-h)<*>, 165.2 (C-g)<*>; MS (ESI) 311 (M+1).IR (KBr) υ (cm-1): 3048, 2981, 1687, 1641, 1540, 1519, 1443, 1364, 1289, 1252, 1215, 1172, 1141, 1054.
18c) Secondo isomero eluito, solido bianco (m.p. 167.1 – 169.5 °C; da triturazione con diisopropil eter).Resa 29 %.<1>H-NMR (600 MHz DMSO): δ 1.45 (<t>, 3H, J = 7.1 Hz -OCH2C<H>3), 3.53 (<s>, 3H. Ar-C<H>3), 4.38 (q, 2H, J = 7.1 Hz, -OC<H>2CH3), 5.56 (<s>, 2H, -NC<H>2Ph), 6.97 (<dd>, 1H, J = 7.0 Hz, 1.8 HZ, H-b), 7.37 (d, 2H, J = 7.3 Hz, H-m ), 7.43 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-o), 7.49 (t, 2H, J = 7.4 Hz, H-n), 7.90 (s, 1H, H-d), 8.48 (d, 1H, J = 7.0 Hz, H-a); <13>C-NεR (151 εHz DεSO)μ į 14.6 (-OCH2CH3), 21.1 (Ar-CH3), 43.7 (-NCH2Ph), 58.4 (-OCH2CH3), 82.8 (C-f), 114.4 (C-b), 115.2 (C-d), 124.6 (C-a), 127.2 (C-m), 128.0 (C-o), 128.9 (C-n), 134.1 (C-l), 142.8 (C-c), 144.0 (C-e), 160.4 (C-g)<*>, 163.3 (C-h)<*>; MS (ESI) 311 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3087, 2979, 1701, 1632, 1539, 1502, 1430, 1365, 1305, 1243, 1160, 1113, 1040.
Etil 2-metossipirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilato (16a) e etil 1-metil-2-oxo-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilato (17a) da 15a. Cesio carbonato (1.48 g, 10.67 mmol), fu aggiunto ad una soluzione di 15a (1.00 g, 4.85 mmol), in THF anidro (30 mL), agitando sotto azoto. Metil ioduro (2.07 g, 7.28 mmol), fu quindi aggiunto alla risultante soluzione arancione scura e la miscela fu agitata a 40 °C per tutta la notte. La sospensione fu allora concentrata sotto vuoto, ripresa con acqua (100 mL), e estratta con EtOAc (3 x 100 mL). Le fasi organiche riunite furono lavate con una soluzione satura di cloruro di sodio, seccate ed evaporate a pressione ridotta per dare un prodotto grezzo che fu purificato con una flash cromatografia (eluente: etere di petrolio / EtOAc 8/2 v/v e quindi eluente: diclorometano / MeOH 9:1 v/v). Le strutture furono determinate in modo inequivocabile usando la spettroscopia eteronucleare 2D-NMR (HSQC, HMBC e NOESI).
16a). Solido bianco (m.p: 128.9 - 129.4 °C, dopo triturazione con diisopropil etere). Resa 59 %.<1>H-NMR (300 MHz DMSO): δ 1.29 (<t>, 3H, J = 7.1 Hz, -OCH2C<H>3), 4.00 (<s>, 3H, -OC<H>3) 4.23 (<q>, 2H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 7.02 (td, 1H, J = 6.9 Hz, 1.0 Hz, H-b), 7.52 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.88 (d, 1H, J = 8.9 Hz, H-d), 8.65 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a); <13>C-NMR (75 MHz DMSO): į 14.5(-OCH2CH3), 56.5 (-OCH3), 59.0 (-OCH2CH3), 86.7 (C-f), 113.2 (C-b), 117.2 (C-d), 128.8 (C-c), 129.6 (C-a), 142.1 (C-e), 162.0 (C-h)<*>, 165.0 (C-g)<*>; MS (CI) 221(M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3085, 3042, 2990, 1691, 1517, 1449, 1407, 1300, 1245, 1157, 1105, 1023; ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C11H13N2O3221.0921, obsd.221.0924.
17a). Solido arancione (m.p. 217.8 - 224.2 °C dec., dopo triturazione con diisopropil etere). Resa 35 %.<1>H-NMR (300 MHz DMSO): δ 1.28 (t, 3H, J = 7.0 Hz, -OCH2CH3), 3.58 (s, 3H, -NCH3), 4.21 (q, 2H, J = 7.0 Hz -OCH2CH3), 7.10 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H-b), 7.66 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.90 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.57 (d, 1H, J = 6.3 Hz, H-a); <13>C-NMR (75 MHz DMSO): δ 14.5 (-CH2CH3), 28.9 (-NCH3), 59.3 (-CH2CH3), 84.2 (C-f), 113.3 (C-b), 116.7 (C-d), 125.8 (C-a), 132.9 (C-c), 142.6 (C-e), 160.6 (C-g), 164.1 (C-h); MS(CI) 221(M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 3507, 3069, 3025, 2977, 1687, 1625, 1511, 1477, 1437, 1256, 1227, 1189, 1093, 1024; ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C11H13N2O3221.0921, obsd.221.0925. Procedura generale per idrolisi degli esteri catalizzata da base: (20a - c).
5M NaOH (5 eq.), fu aggiunta ad una appropriata soluzione di estere in etanolo. La soluzione fu agitata per 5 ore a 70 °C, quindi neutralizzata con 6M HCl e concentrata a pressione ridotta.2M HCl fu aggiunto a 0 °C fino a raggiungere un pH 2 e la sospensione ottenuta fu filtrata per ottenere l’acido come solido.
2-Benziloxipirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilico acido (20a). Ottenuto da 19a. Solido bianco (m.p. 159.9 – 160.5 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 99 %. <1>H-NMR (300 MHz DMSO): δ 5.43 (s, 2H, -OCH2Ph), 7.01 (t, 1H, J = 6.50 Hz H-b), 7.28 – 7.45 (m, 3H, H-o, H-n), 7.46 -7.57 (m, 3H, H-m, H-c), 7.93 (d, 1H, J = 8.80 Hz, H-d), 8.65 (d, 1H, J = 6.80 Hz, H-a), 12.10 (s, 1H, , COOH); <13>C-NMR (75 MHz, DMSO): į 71.1 (–OCH2Ph), 88.4 (C-f), 114.0 (C-b), 118.2 (C-d), 128.6 (C-m), 128.8 (C-o), 129.2 (C-n), 129.3 (C-c), 130.3 (C-a), 137.5 (C-l), 143.2 (C-e), 164.3 (C-g)<*>, 165.2 (C-h)<*>; MS(CI) 225 (M-CO2+1); IR (KBr) υ (cm-1): 2894, 2650, 1654, 1628, 1527, 1508, 1477, 1454, 1438, 1371, 1332, 1302, 1258, 1211, 1183, 1133, 1080, 1006; ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C15H13N2O3269.0921, obsd. 269.0926.
2-Benziloxi-7-metil-pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilico acido (20b). Ottenuto da 19b. Solido bianco (m.p. 181.1 – 181.8 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 72 %. <1>H-NMR (600 MHz DMSO): δ 2.65 (s, 3H, Ar-CH3), 5.46 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.94 (d, 1H, J = 7.0 Hz, H-b), 7.34 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-c), 7.40 (t, 2H, J = 7.5 Hz, H-n), 7.44 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H-o), 7.55 (d, 2H, J = 7.3 Hz H-m), 7.83 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 12.10 (s, 1H, COOH); <13>C-NMR (151 MHz, DMSO): į 17.8 (Ar-CH3), 70.7 (–OCH2Ph), 88.2 (C-f), 113.0 (C-b), 115.5 (C-d), 128.5 (C-o), 128.6 (C-m), 128.9 (C-n), 128.9 (C-c), 137.2 (C-l), 139.1 (C-a), 143.2 (C-e), 164.2 (C-g)<*>, 164.4 (C-h)<*>; MS (ESI) 283 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1):3030, 2632, 1657, 1632, 1560, 1509, 1450, 1364, 1286, 1215, 1154, 1129, 1062, 1007, 962.
2-Benziloxi-5-metil-pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossilico acido (20c). Ottenuto da 19c. Solido bianco (m.p. 174.3 – 174.9°C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 96 %. <1>H-NMR (600 MHz DMSO): δ 2.39 (s, 3H, Ar-CH3), 5.40 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.85 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.34 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-o), 7.40 (t, 2H, J = 7.5 Hz, H-n), 7.50 (d, 2H, J = 7.4 Hz, H-m), 7.71 (s, 1H, H-d), 8.52 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 12.01 (s, 1H, COOH); <13>C-NMR (151 MHz, DMSO): δ 21.0 (Ar-CH3), 70.1 (–OCH2Ph), 86.7 (C-f), 115.3 (C-b)<*>, 116.0 (C-d)<*>, 127.8 (C-m), 128.0 (C-o), 128.4 (C-n), 128.8 (C-a), 136.7 (C-l), 139.5 (C-c), 142.4 (C-e), 163.6 (C-h)<*>, 164.5 (C-g)<*>; MS (ESI) 283 (M+1). IR (KBr) υ (cm-1): 2887, 2629, 1662, 1632, 1534, 1507, 1458, 1357, 1312, 1254, 1206, 1140, 1116, 1033, 997, 962.
Procedura generale per la sintesi delle amidi pirazolo[1,5-a]piridiniche 26 – 28. Una soluzione 2M di ossalil cloruro in diclorometano anidro (1.75 mL, 3.50 mmol), e DMF anidra (1 goccia), furono aggiunti ad una soluzione raffreddata (0° C), di 20a (1.00 mmol), in THF anidro (15 mL), in atmosfera di azoto. La miscela di reazione fu agitata per 2 ore a temperatura ambiente , poi fu concentrata a pressione ridotta e il residuo sciolto in THF anidro (10 mL, questo passaggio venne ripetuto per tre volte). δ’ acil cloruro fu sciolto in toluene anidro (15 mL). Una soluzione dell’appropriata anilina (1.00 mmol), e piridina anidra (3.00 mmol), in toluene anidro (5 mL), fu aggiunta goccia a goccia alla soluzione dell’ acil cloruro sotto azoto. La miscela risultante fu agitata a ricadere per tutta la notte, quindi raffreddata a temperatura ambiente e spenta con 0.5M HCl (25 mL). Le fasi furono separate e la fase acquosa fu estratta con EtOAc (3 x 50 mL), e le fasi organiche riunite furono lavate con soluzione satura di cloruro di sodio, seccate ed evaporate a pressione ridotta. Il prodotto grezzo ottenuto fu purificato per flash cromatografia.
2-Benzilossii-N-(4-fenossifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (26). Ottenuta da 20a, usando l’anilina 23. Flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOAc 98:2 v/v). Solido bianco (m.p. 170.6 - 171.3 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 81%.<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5.52 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.80 (td, 1H, J = 6.9 Hz, 1.5 Hz, H-b), 6.90 (d, 4H, J = 8.8 Hz, aromatici protoni), 6.99 (t, 1H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.16 - 7.53 (m, 11H, protoni aromatici), 8.23 (d, 2H, J = 8.5 Hz, protoni aromatici), 8.62 (s, 1H, -NH); <13>C-NMR (151 MHz CDCl3): � 72.2 (-OCH2Ph), 90.9 (C-f), 112.9 (C-b), 118.3, 118.9 (C-d), 120.0, 121.2, 122.9, 127.7 (C-c), 128.3, 128.7, 128.9 (C-a)<*>, 129.0, 129.8, 134.5, 135.8, 143.0, 152.7, 158.0, 161.2 (C-h)<*>, 162.2 (C-g)<*>; MS (ESI) 450 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3379, 3059, 3039, 1661, 1636, 1545, 1532, 1487, 1464, 1364, 1307, 1223, 1150, 1127, 1103, 1010.
2-Benzilossi-N-(2-metil-4-fenossi-fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (27). Ottenuto da 20a, usando l’anilina 24. Eluente per la flash cromatografia: diclorometano / EtOAc 98:2 v/v). Solido marrone (m.p.
172.0 – 173.0 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 97%.<1>H-NMR (600 MHz, CDCl3):� 2.19 (s, 3H, Ar-CH3), 5.57 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.85 -6.89 (m, 4H, protoni aromatici), 7.01 (t, 1H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.24 - 7.30 (m, 3H, protoni aromatici), 7.35 - 7.49 (m, 5H, protoni aromatici), 7.54 - 7.58 (m, 2H, protoni aromatici), 8.29 - 8.33 (m, 2H, protoni aromatici), 8.69 (s, 1H, -NH); <13>C-NMR (151 MHz CDCl3):� 16.4 (Ar-CH3), 72.2 (-OCH2Ph), 90.9 (C-f), 112.8, 116.7, 118.4, 118.9, 120.9, 122.1, 122.6, 127.6, 128.2, 128.6, 128.9, 129.0, 129.7, 131.0, 135.0, 143.0 (C-e), 149.9, 158.5, 161.2 (C-h)<*>, 162.2 (C-g)<*>; MS (ESI) 450 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3382, 3059, 3042, 1655, 1637, 1557, 1548, 1534, 1489, 1458, 1406, 1337, 1291, 1250, 1223, 1146, 1117, 997.
2-Benzilossi-N-(2,5-dimetil-4-fenossi-fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (28). Ottenuto da 20a, usando anilina 25. Eluente per la flash cromatografia: diclorometano / EtOAc 98:2 v/v). Solido marrone (m.p.
212.8 – 213.6 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 98%.<1>H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ 1.77 (s, 3H, Ar-CH3), 2.18 (s, 3H, Ar-CH3), 5.52 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.66 (s, 1H, protoni aromatici), 6.82 - 6.90 (m, 3H, protoni aromatici), 6.98 (t, 1H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.22 - 7.27 (m, 2H, protoni aromatici), 7.34 - 7.43 (m, 4H, protoni aromatici), 7.49 - 7.54 (m, 2H, protoni aromatici), 8.17 (s, 1H, protoni aromatici); 8.29 - 8.36 (m, 2H, protoni aromatici), 8.42 (s, 1H, -NH); <13>C-NMR (151 MHz CDCl3):� 16.2 (Ar-CH3), 17.1 (Ar-CH3), 72.6 (-OCH2Ph), 91.1, 112.8, 116.8, 119.0, 122.0, 122.1, 124.4, 126.6, 127.6, 128.4, 128.7, 128.9, 129.2, 129.4, 129.7, 133.2, 135.4, 143.1 (C-e), 149.8, 158.6, 161.2 (C-h)<*>, 162.3 (C-g)<*>; MS (ESI) 464 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3392, 3059, 3044, 2923, 2854, 1658, 1638, 1586, 1532, 1486, 1462, 1402, 1361, 1292, 1223, 1148, 1079, 1000.
Procedura generale per la sintesi delle amidi pirazolo[1,5-a]piridiniche 22a - c. Una soluzione 2M di ossalil cloruro in diclorometano anidro (3.0 mmol), e DMF anidra (1 goccia), furono aggiunti ad una soluzione raffreddata (0°C), del corrispondente pirazolo[1,5-a]piridinico acido (1.0 mmol) 20a-c, in THF anidro (20 mL), in atmosfera di azoto. La soluzione ottenuta fu agitata a temperatura ambiente per 2 ore. La soluzione fu quindi evaporata a pressione ridotta e il residuo sciolto in THF anidro (10 mL, questo passaggio fu ripetuto per tre volte). δ’acil cloruro risultante fu immediatamente usato senza ulteriori purificazioni. Trimetilalluminio (2.0 M in esano, 1.5 mmol), fu aggiunto ad una soluzione di 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilanilina 21 (1.1 mmol), in toluene anidro (15 mL), in atmosfera di azoto. La miscela risultante fu agitata per 2 ore a temperatura ambiente fornendo una sospensione marrone che fu allora trasferita quantitativamente a piccole porzioni in una soluzione dell’acil cloruro precedentemente descritto in toluene anidro (30 mL). La miscela fu riscaldata per tutta la notte a 90 °C e quindi raffreddata a temperatura ambiente. La reazione fu quindi spenta con 1M HCl. Le fasi furono separate e la fase acquosa fu estratta con EtOAc. Le fasi organiche riunite furono lavate con 1M NaOH e soluzione satura di NaCl, seccate ed evaporate a pressione ridotta. Il prodotto grezzo fu purificato attraverso flash cromatografia.
1-Benzil-2-oxo-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil] -4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (22a). Ottenuto da 20a, flash cromatografia (eluente: etere di petrolio / EtOAc 90:10 v/v). Solido giallo pallido (m.p. 223.8 – 225.9 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 45 %. <1>H NMR (300 MHz, CDCl3):� 5.48 (s 2H, -NCH2Ph), 6.76 (t, 1H, J = 7.0 Hz, H-b), 7.19 – 7.58 (m, 11H, protoni aromatici e H-c), 7.73 (d, 1H, J = 7.0 Hz, H-d), 8.28 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-a), 9.98 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 45.6 (-NCH2Ph), 87.1 (C-f), 112.9 (C-b), 118.3 (C-d), 123.0 (C-a), 127.1, 128.7, 128.9, 129.1, 129.6, 130.3, 131.8, 132.5, 142.5, 161.7 (C-g)<*>, 162.1 (C-h)<*>; MS (ESI) 492 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3227, 3101, 3063, 1667, 1628, 1519, 1484, 1438, 1313, 1239, 1172, 1152, 1113, 1076, 1004, 972.
1-Benzil-7-metil-2-oxo-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil] -4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (22b). Ottenuto da 20b, flash cromatografia (eluente: etere di petrolio / EtOAc 95:5 v/v). Solido giallo pallido (m.p. 220.8 – 222.3 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 41 %. <1>H NMR (600 MHz, CDCl3):� 2.67 (s, 3H, Ar-CH3), 5.58 (s, 2H, -NCH2Ph), 6.51 (d, 1H, J = 7.1 Hz, H-b), 6.94 (d, 2H, J = 6.7, H-m), 7.23 – 7.31 (m, 3H, H-n, H-o), 7.38 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 7.2 Hz, H-c), 7.43 – 7.53 (m, 5H, protoni aromatici), 8.25 (d, 1H, J = 8.50 Hz, H-d), 10.07 (s, 1H, -N<H>); <13>C NMR (151 MHz, CDCl3): δ 20.7 (Ar-<C>H3), 51.8 (-N<C>H2Ph), 87.5 (C-f), 115.2 (C-b)<*>, 116.3 (C-d)<*>, 117.7, 126.1, 127.7, 128.5, 128.7, 129.1, 129.4, 130.4, 133.7 (C-c), 134.5 (C-l), 137.0, 138.9 (C-a), 143.3, 143.7, 148.2, 161.8 (C-g)<*>, 167.5 (C-h)<*>; MS (ESI) 506 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3231, 3160, 3100, 3027, 2925, 1688, 1626, 1604, 1560, 1532, 1483, 1451, 1424, 1312, 1256, 1182, 1160, 1139, 1102, 1009, 982.
1-Benzil-5-metil-2-oxo-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil] -4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (22c). Ottenuto da 20c, flash cromatografia (eluente: etere di petrolio / EtOAc 90:10 v/v). Solido giallo pallido (m.p. 200.7 – 202.7 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 38 %. <1>H NMR (600 MHz, CDCl3):� 2.38 (s, 3H, Ar-CH3), 5.44 (s, 2H, -NCH2Ph), 6.57 (dd, 1H, J = 7.1 Hz, 1.7 Hz, H-b), 7.27 (d, 2H, J = 6.9, H-m), 7.34 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-o), 7.38 (t, 2H, J = 7.3 Hz, H-n), 7.43 – 7.53 (m, 5H, protoni aromatici), 7.58 (d, 1H, J = 7.1 Hz, H-a), 8.11 (s, 1H, H-d), 10.07 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, CDCl3): δ 21.6 (Ar-CH3), 45.6 (-NCH2Ph), 86.3 (C-f), 115.0 (C-b), 116.3, 117.3 (C-d), 117.5, 122.3 (C-a), 127.0, 127.7, 128.6, 128.8, 129.0, 129.6, 130.3, 132.8 (C-l), 142.5 (C-c), 143.4, 143.6, 144.0 (C-e), 161.8 (C-g)<*>, 162.6 (C-h)<*>; MS (ESI) 506 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3233, 3101, 3066, 1672, 1653, 1631, 1528, 1487, 1438, 1311, 1242, 1176, 1126, 1076, 977.
1-Metil-2-oxo-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (7). 5M NaOH (1 eq.) fu aggiunto ad una soluzione del composto 17a (600 mg, 2.73 mmol), in etanolo (20 mL). La soluzione fu agitata per 3 ore a 70 °C, quindi concentrata a pressione ridotta per dare in resa quantitativa il corrispondente sale sodico dell’acido 17b, che fu usato nel passaggio successivo dopo essiccamento, senza ulteriori purificazioni. 2M Ossalil cloruro in DCM anidro (2.45 mL, 4.90 mmol), e DMF anidra (1 goccia), furono aggiunti ad una soluzione raffreddata (0°C) di 17b (350 mg, 1.63 mmol) in THF anidro (25 mL), sotto azoto e la risultante soluzione fu agitata a temperatura ambiente per 2 ore. La soluzione fu quindi concentrata a pressione ridotta e il residuo sciolto in THF anidro (10 mL, questo passaggio fu ripetuto per tre volte), dando il corrispondente acil cloruro, che fu immediatamente usato senza ulteriori purificazioni. Trimetilalluminio (2.0 M in esano, 1.86 mL, 3.72 mmol), fu aggiunto ad una soluzione di 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilanilina 21 (394 mg, 1.96 mmol), in toluene anidro (15 mL), sotto azoto. La miscela risultante fu agitata per 2 ore a temperatura ambiente al fine di ottenere una sospensione marrone che fu quantitativamente trasferita a piccole porzioni, alla soluzione di acil cloruro, ottenuta nel precedente passaggio, in toluene anidro (30 mL). La miscela fu scaldata per tutta la notte a 90 °C, raffreddata a temperatura ambiente e spenta con 1M HCl. Le fasi furono separate e la fase acquosa estratta con etil acetate. Le fasi organiche riunite furono lavate con 1M NaOH e seccate con una soluzione satura di NaCl, il solvente fu evaporato a pressione ridotta. Il residuo grezzo ottenuto fu purificato con una flash cromatografia (eluente: etere di petrolio / EtOAc da 8:2 to 6:4 v/v), per ottenere il composto del titolo come solido bianco. Resa 27 %. <1>H NMR (300 MHz, DMSO): δ 3.70 (s, 3H, -NCH3), 7.22 (t, 1H, J = 6.5, H-b), 7.46 - 7.63 (m, 5H, protoni aromatici), 7.76 (t, 1H, J = 7.9, H-c), 8.06 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.73 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 10.10 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (75 MHz, DMSO):� 28.5 (-NCH3), 85.8 (C-f), 113.3 (C-b), 116.1 (C-d), 117.1, 125.2 (C-a), 127.1, 129.1, 129.6, 130.4, 132.5, 140.9, 141.1, 144.2, 144.4, 161.2 (C-g)<*>, 161.8 (C-h)<*>; MS (ESI) 416 (M+1).
Procedura generale di idrogenazione per i composti finali 8 – 10. Palladio su carbonio (Pd/C, 45 mg), fu aggiunto ad una soluzione della appropriata amide (composti 26 - 28, 0.300 mmol), in THF anidro (15 mL). La miscela risultante fu agitata vigorosamente sotto azoto per 3 ore. La sospensione fu filtrata su letto di Celite e quest’ultimo lavato con metanolo. Il filtrato fu concentrato sotto pressione ridotta. Quando necessario, il solido ottenuto fu purificato con flash cromatografia.
2-idrossi-N-(4-fenossifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (8). Ottenuto da 26, flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOAc / HCOOH 85:15:1 v/v/v). Solido marrone (m.p. 147.6 - 148.2°C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 80%.<1>H-NMR (600 MHz, DMSO): δ 6.91 – 7.05 (m, 5H, protoni aromatici), 7.10 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-b), 7.37 (t, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.46 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.70 (d, 2H, J = 8.9 Hz, protoni aromatici), 8.05 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.56 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 9.05 (s, 1H, -NH), 12.77 ( br s, 1H, -OH); <13>C-NMR (151 MHz DMSO): δ 89.3 (C-f), 112.7 (C-b), 117.0 (C-d), 117.9, 119.5, 121.0, 122.9, 127.6 (C-c), 128.9 (C-a), 129.9, 134.7, 141.5 (C-e), 151.6, 157.4, 160.8 (C-h)<*>, 161.9 (C-g)<*>; MS (ESI) 346 (M+1). IR (KBr) v (cm<-1>): 3370, 3036, 2571, 1661, 1602, 1544, 1505, 1490, 1449, 1335, 1260, 1231, 1124, 1103, 983. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C20H16N3O3 346.1186, obsd.346.1184.
2-idrossi-N-(3-metil-4-fenossifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (9). Ottenuto da 27, flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOAc / HCOOH 80:20:1 v/v/v). Solido marrone (m.p. 233.7 – 235.9 °C dec.; da triturazione con diisopropil etere). Resa 85%.1H-NMR (600 MHz, DMSO): δ 2.14 (s, 3H, Ar-CH3), 6.83 – 6.94 (m, 3H, protoni aromatici), 6.98 (td, 1H, J = 7.0 Hz, 1.3 Hz, H-b), 7.04 (t, 1H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.33 (dd, 2H, J = 8.4 Hz, 7.6 Hz, protoni aromatici), 7.47 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.56 (dd, 1H, J = 8.7 Hz, 2.5 Hz, protoni aromatici), 7.63 (d, 1H, J = 2.2 Hz, protoni aromatici), 8.06 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.57 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 9.04 (s, 1H, -NH), 12.82 (br s, 1H, -OH); <13>C-NMR (151 MHz DMSO): δ 16.8 (Ar-CH3), 90.2 (C-f), 113.7 (C-b), 117.2, 117.9 (C-d), 119.3, 121.5, 123.0, 123.1, 128.6 (C-c), 129.8 (C-a), 130.7, 130.8, 136.2, 142.4 (C-e), 149.7, 158.8, 161.7 (C-h)<*>, 162.8 (C-g)<*>; MS (ESI) 360 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>):3387, 3061, 2572, 1666, 1638, 1534, 1488, 1328, 1226, 1130, 1107, 932. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C21H18N3O3 360.1343, obsd.360.1337.
N-(2,5-Dimetil-4-fenossifenil)-2-idrossipirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (10). Ottenuto da 28, flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOAc / HCOOH 80:20:1 v/v/v). Solido marrone (m.p.
249.1 – 254.2 °C dec.; da triturazione con diisopropil etere). Resa 67%.<1>H-NMR (600 MHz, DMSO): δ 2.12 (s, 3H, Ar-CH3), 2.24 (s, 3H, Ar-CH3),6.73 – 7.10 (m, 5H, protoni aromatici, H-b)), 7.33 (t, 2H, J = 7.7 Hz, protoni aromatici), 7.48 (t, 1H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.33 (dd, 2H, J = 8.4 Hz, 7.6 Hz, protoni aromatici), 7.48 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 8.08 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.19 (s, 1H, protoni aromatici), 8.58 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), 9.04 (s, 1H, -NH), 13.00 (br s, 1H, -OH); <13>C-NMR (151 MHz DMSO): δ 16.7 (Ar-CH3), 17.9 (Ar-CH3), 90.3 (C-f), 113.7 (C-b), 117.1, 117.9 (C-d), 122.9, 123.0, 124.2, 127.1(C-c), 127.9 (C-a), 128.6, 129.8, 130.7, 134.5, 142.3 (C-e), 149.4, 158.9, 161.5 (C-h)<*>, 162.9 (C-g)<*>; MS (ESI) 374 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3395, 2926, 2582, 1670, 1640, 1550, 1487, 1440, 1402, 1331, 1193, 1078. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C22H20N3O3374.1499, obsd.374.1501.
Procedura generale di idrogenazione per i composti finali 4 - 6. Palladio su carbone (Pd/C, 6% w / w), fu aggiunto ad una soluzione dell’appropriata amide (composti 22a - c, 1.0 mmol), in THF anidro (15 mL), e HCl (1.0 mmol). La miscela risultante fu vigorosamente agitata in atmosfera di idrogeno per 6 ore. La sospensione fu filtrata su letto di celite e quest’ultimo lavato con metanolo. Il filtrato fu concentrato a pressione ridotta. Il solido ottenuto, quando necessario, fu purificato con flash cromatografia.
2-idrossi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil] -4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (4). Ottenuto da 22a, flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOAc / HCOOH 80:20:1 v/v/v). Solido giallo pallido (m.p.
260.9 – 262.0 °C dec.; da triturazione con diisopropil etere). Resa 87 %.<1>H NMR (600 MHz, DMSO):� 6.93 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.42 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 7.48 – 7.63 (m, 5H, protoni aromatici), 7.90 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.51 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), 9.77 (br s, 1H, -NH). I segnali dei protoni mobile cadono con i segnali dell’acqua. <13>C NMR (151 MHz, DMSO): δ 88.9 (C-f), 112.9 (C-b), 116.6 (C-d), 117.1, 117.8, 127.3 (C-c), 127.9, 129.1 (C-a), 129.3, 129.8, 130.7, 142.1,143.1, 143.8, 161.6 (C-h), 163.9(C-g); MS (ESI) 402 (ε+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3383, 3360, 2577, 1676, 1642, 1518, 1492, 1437, 1330, 1269, 1214, 1128, 994. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C20H12F4N3O2402.0860, obsd.402.0861.
2-idrossi-7-metil-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil] -4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (5). Ottenuto da 22b, flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOAc / HCOOH 80:20:1). Solido bianco (m.p.
285.9 – 286.6 °C; da triturazione con diisopropil etere). Resa 86 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO): δ 2.65 (s, 3H, Ar-CH3), 6.96 (dd, 1H, J = 6.9 Hz, 1.7 Hz, H-b), 7.46 (t, 1H J = 7.9 Hz, H-c), 7.53 – 7.66 (m, 5H, protoni aromatici), 7.91 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.94 (s, 1H, -NH); 12.95 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO):� 18.0 (Ar-CH3), 88.8 (C-f), 113.3 (Cb), 115.0 (C-d), 117.6, 119.0, 127.2, 128.8 (C-c), 129.4, 129.9, 130.6, 138.8 (C-a), 142.6 (C-e), 143.5, 145.4, 161.1 (C-h), 163 (C-g); MS (ESI) 416 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3379, 3012, 2600, 1697, 1644, 1574, 1548, 1526, 1493, 1439, 1311, 1245, 1167, 1131, 994. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C21H14F4N3O2416.1017, obsd.416.1018.
2-idrossi-5-metil-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil] -4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossamide (6). Ottenuto da 22c, flash cromatografia (eluente: diclorometano / EtOAc / HCOOH 80:20:1 v/v/v). Solido bianco (m.p.287.1 – 287.5 °C dec.; da triturazione con diisopropil etere). Resa 83 %.<1>H NMR (600 MHz, DMSO): δ 2.39 (s, 3H, Ar-CH3), 6.86 (dd, 1H, J = 6.9 Hz, 1.7 Hz, H-b), 7.49 – 7.60 (m, 5H, protoni aromatici), 7.78 (s, 1H, H-d), 8.47 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 8.95 (s, 1H, -NH). I segnali dei protoni mobile cadono con i segnali dell’acqua. <13>C NMR (151 MHz, DMSO): δ 21.0 (Ar-CH3), 87.4 (C-f), 115.3 (C-b), 115.6 (C-d), 117.0, 126.7, 128.4, 128.8, 129.4 (C-a), 130.1, 139.3 (C-c), 141.7 (C-e), 144.2, 144.8, 160.4 (C-h), 163.0 (C-g); MS (ESI) 416 (M+1). IR (KBr) Ȟ (cm<-1>): 3381, 3362, 2992, 2590, 1677, 1648, 1517, 1491, 1437, 1334, 1275, 1224, 1123, 993. ESI-HRMS (m/z) [M H]+ calcd. per C21H14F4N3O2416.1017, obsd.416.1019.
Espressione della proteina e purificazione. Il cDNA della forma N-troncata di DHODH umana (aa31 - 395), è stato amplificato da un clone, I.M.A.G.E. (ID 6064723), di lunghezza completa di DHODH umana inserito in un vettore pFN2A (Promega). Il vettore produce DHODH umana come proteina di fusione GST N-terminale. Il plasmide pFN2A-DHODH umana è stato trasformato in cellule di E. coli BL21 (DE3), pyrD per la produzione di proteine. Le cellule sono state coltivate a 37 ° C in terreno LB integrato con mononucleotide flavinico 0,1 mM. Dopo 20 ore di crescita, le cellule sono state indotte con 0,4 mM di isopropil-D-tiogalattopiranoside a un OD600 di 0,6 - 0,8 a 28 ° C per ulteriori 3 ore. Un pellet di cellule derivante da 300 ml di coltura è stato lisato in 20 ml di PBS (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl) integrato con 24 mg di lisozima e 0,2% v / v e una miscela di inibitori delle proteasi (Sigma-Aldrich), incubato per 30 minuti su ghiaccio e distrutto per sonicazione. Triton X-100 è stato aggiunto al lisato, a una concentrazione finale dell'1%, prima della centrifugazione a 14000 × g per 40 minuti a 4 ° C. Il surnatante reso limpido è stato incubato con DNasi I (Sigma Aldrich), per 30 minuti a temperatura ambiente, aggiunto di DTT 2 mM e filtrato attraverso un filtro per siringa da 0,45 ȝm. L'enzima fuso con GST è stato purificato dal lisato batterico utilizzando la cromatografia di affinità su colonne immobilizzate di glutatione-sefarosio e la cromatografia delle proteine veloci a fase mobile liquida (FPLC). Il tag GST non è stato rimosso per ulteriori studi.
Saggio di inibizione di DHODH umana. L'attività inibitoria è stata valutata monitorando la riduzione del 2,6-dicloroindofenolo (DCIP), che è associato all'ossidazione del diidroorotato (DHO) catalizzata dall'enzima DHODH. L'enzima è stato preincubato per cinque minuti a 37 ° C in soluzione tampone Tris (pH 8,0), con il coenzima Q10 (100 μM), i composti da testare utilizzati a diverse concentrazioni (concentrazione finale DMSO 0,1% v / v), il DCIP (50 μM). La reazione è stata avviata con l'aggiunta di DHO (500 μM), e la riduzione è stata monitorata a λ = 650 nm. La velocità iniziale è stata misurata nei primi cinque minuti (İ = 10400 M<-1>cm<-1>) e il valore di IC50 è stato calcolato, <31 >utilizzando il software GraphPad Prism 7. I valori sono la media ± ES (errore standard) di tre esperimenti indipendenti.
Colture cellulari e trattamenti con i composti. Le cellule Jurkat sono state coltivate in X-VIVO 15 (BE02-060F, Lonza), integrato con il 10% (v / v) di siero fetale bovino (F-7524, Sigma Aldrich) e l’1% (v / v) di soluzione antibiotica-antimicotica (A-5955, Sigma Aldrich) (terreno completo). Le cellule sono state mantenute a 37 ° C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2. Le cellule venivano sottoposte a passaggio ogni 2-3 giorni e scartate dopo 15 passaggi. Le cellule Jurkat sono state come di consueto testate per confermare l'assenza di micoplasma, utilizzando il kit di rilevamento MycoAlert Plus (Lonza) e sono state utilizzate per tutti gli esperimenti tra i passaggi 5 e 10. Ogni composto testato è stato solubilizzato in DMSO (veicolo del composto, 41639, Fluka ), ad una concentrazione finale di 10 mM, che è stata utilizzata come soluzione madre per tutti gli esperimenti. Le diluizioni finali sono state fatte in terreno di coltura.
Saggio di proliferazione. La crescita delle cellule Jurkat T è stata valutata, tramite la quantificazione del contenuto di DNA, utilizzando il colorante fluorescente Hoechst 33258.<32 >Le cellule (5 × 10<3 >in 100 μL di terreno) sono state seminate in una piastra bianca da 96 pozzetti ed esposte a concentrazioni crescenti (0,001 -200 μM) di ciascun composto o al veicolo (DMSO), per 72 ore. Al termine dell'incubazione, il mezzo è stato aspirato e i pozzetti lavati due volte con 100 μL di tampone fosfato salino (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4, Ph 7,4). Le cellule sono state esposte a 100 ȝL di soluzione di SDS 0,02% in tampone SSC (154 mM NaCl, sodio citrato 15 mM, pH 7), per 1 ora a 37 ° C con agitazioni occasionali. Alla fine del processo, un ugual volume di soluzione Hoechst 33258 (1 μg / ml) in tampone SSC è stato aggiunto a ciascun pozzetto e la fluorescenza è stata misurata a 460 nm di emissione con eccitazione a 355 nm, utilizzando un fluorimetro a micropiastra Ascent-Heat Fluoroskan (Thermo Fisher Scientific, MA). I valori di IC50 sono stati determinati utilizzando modelli di regressione non lineare con GraphPad Prism6. I valori sono la media ± ES di tre esperimenti indipendenti. Dove indicato, l'effetto antiproliferativo è stato valutato in presenza di uridina 100 μM.<28>
Saggio di citotossicità. Gli effetti citotossici che i composti hanno avuto sulle cellule Jurkat T sono stati valutati utilizzando il “CellTox green assay” (Promega). Le cellule (5X10<3 >/ pozzetto) sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti bianca opaca e esposte a concentrazioni crescenti (0,001 -100 μM), di ciascun composto o veicolo (DMSO), per 72 ore. I valori sono la media ± ES di tre esperimenti indipendenti e rappresentano le concentrazioni che causano effetti citotossici significativi (≥30%).
Saggio di immunosoppressione. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate utilizzando il Ficoll / Isopaque (Lymphoprep), mediante centrifugazione in gradiente di densità dei residui di leucoferesi del buffy coat dai campioni di sangue fresco di donatori sani. Le cellule purificate sono state coltivate e mantenute in terreno di coltura a 37 ° C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2. Le cellule (5x10<3 >/ pozzetto), sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti bianca opaca e esposte a concentrazioni crescenti (0,001 - 100 ȝM), di ciascun composto o veicolo (DMSO), per 2 ore e quindi stimolate con 1,25 mg / ml fitoemoagglutinina (PHA) per 72 h. La proliferazione cellulare è stata valutata tramite la quantificazione del contenuto di DNA usando il colorante fluorescente Hoechst 33258, come descritto sopra. I valori di IC50 sono stati determinati utilizzando modelli di regressione non lineare su GraphPad Prism6. I valori sono la media ± ES di tre esperimenti indipendenti. Dove indicato, l'effetto antiproliferativo è stato valutato in presenza di uridina 100 ȝM.
Colture cellulari e trattamenti con i composti. Le cellule umane THP1 (leucemia monocitica acuta) e U937 (leucemia mieloide pro-monocitica) sono state coltivate in RPMI 1640 completo (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD), integrato con siero fetale bovino inattivato al calore (FBS) al 10%, e 1% di penicillina / streptomicina (GIBCO, Invitrogen, Milano, Italia).
Analisi in citometria di flusso. L'espressione delle molecole di superficie cellulare CD11b (coniugato PE BD Bioscience San Jose, CA, USA) e CD14 (Beckam Coulter CA, USA coniugato con FITC), è stata determinata mediante analisi in citometria di flusso. Le cellule sono state lavate e risospese in tampone colorante (soluzione salina tamponata con fosfato, albumina di siero bovino al 2%, EDTA 1 mM) e incubate con anticorpi a 4 ° C per 45 minuti. I campioni sono stati acquisiti su un Calibur FACS e le cellule morte sono state escluse dalle analisi, second la metodica dello ioduro di propidio . I dati sono stati elaborati utilizzando il software Kaluza versione 1.2 (Beckman Coulter Fullerton, CA).
Saggio dell'attività citotossica basato sulla CFSE. In breve, le linee cellulari (THP1 e U937), sono state incubate con 2 mM di carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE, Vybrant CFDA SE kit di traccianti cellulari, Molecular Probes, Invitrogen Carlsbad, CA), a 10<7 >/ ml per 20 min a 37 ° C . Alla fine del processo di marcatura, le cellule sono state risospese e lavate in RPMI-1640 addizionato con siero bovino fetale all'1%. Quindi le cellule sono state risospese in RPMI 1640 addizionato con FBS al 10% e incubate per 20 minuti a 37 ° C. Le cellule sono state centrifugate e piastrate (1x10<4 >in 200 μl di terreno), con concentrazioni crescenti di inibitori di DHODH (da 0,01 ȝM a 10 μM), per 3 giorni. Gli stessi esperimenti sono stati ripetuti in presenza di uridina 100 μM. Le cellule sono state raccolte e 1μg / ml di ioduro di propidio è stato aggiunto per assegnare il rapporto di morte cellulare. La percentuale di lisi specifica è stata calcolata come descritto e in accordo con la seguente equazione: [cellule morte nel campione (%) – cellule morte spontaneamente (%)) / (100 – cellule morte spontaneamente (%))] × 100. La morte spontanea è stata ottenuta incubando linee cellulari in terreno addizionato con la corrispondente percentuale di DMSO utilizzato per la diluizione dei composti, mentre la morte massima è stata ottenuta dopo trattamento con soluzione di triton.
Saggio di proliferazione. La proliferazione delle linee cellulari LMA (THP1 e U937) è stata valutata utilizzando un citometro di flusso. Le linee cellulari sono state marcate con colorante CFSE secondo il protocollo sopra descritto. Dopo la marcatura, le linee cellulari sono state piastrate (1x10<4>) e coltivate con molecole di inibitori della DHODH (da 0,01 ȝM a 10 ȝM), per tre giorni. Alla fine della coltura, le cellule sono state raccolte e 1ȝg / ml di ioduro di propidio è stato aggiunto per escludere le cellule morte prima dell'acquisizione. La proliferazione delle linee cellulari è stata quantificata in cellule vitali come % di cellule PI-CSFE.
Saggio di differenziamento. 1x10<4 >cellule (THP1 e U937), sono state piastrate in piastre a fondo rotondo da 96 pozzetti e gli inibitori di DHODH sono stati aggiunti da 0,1 μM a 10 μM, in un volume di 200 μl di terreno. La cinetica di differenziamento è stata monitorata dal giorno 1 al giorno 4 per U937, e al giorno 5 per THP1. Le cellule sono state lavate e marcate per CD11b (U937), o per CD11b e CD14 (THP1), come descritto sopra. Il test di differenziamento è stato eseguito anche in presenza di uridina 100 μM e analizzato il 3 ° giorno.
Analisi statistica. Le analisi statistiche sono state eseguite con il software Prism, versione 5.0 . I dati sono riportati come medie ± DS. È stato calcolato il test t di Student a due code per dati appaiati per valutare le differenze tra i valori medi e un P <0,05 è stato considerato significativo.
Test di solubilità a pH 7.4. La solubilità è stata analizzata sia in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS: 12 mM con NaCl 137 mM e KCl 2.7 mM, pH 7.4), sia in PBS con DMSO (2% V / V). Ogni composto solido (1 mg), è stato aggiunto a 1 ml di PBS o PBS / DMSO. I campioni sono stati agitati in un agitatore orbitale a 25 ° C per 24 ore. Queste sospensioni sono state filtrate attraverso un filtro PTFE da 0,45 μm (VWR) e le soluzioni sono state analizzate cromatograficamente. L'analisi quantitativa è stata eseguita con un sistema HPLC-UV (MERK-HITACHI), dotato di un campionatore automatico con volume di iniezione di 60 ȝL (MERK-HITACHI AS-2000A), una pompa binaria da HPLC (MERK-HITACHI L-6200 IP), e un rivelatore a serie di diodi (MERK-HITACHI L-4250). L'analisi LC è stata eseguita utilizzando una colonna Agilent Zorbax SB-Phenyl (4,6 x 250, 5 μm). Le analisi sono state effettuate con una velocità di flusso di 1 ml / min usando un eluente a gradiente format da: eluente A acido trifluoroacetico (TFA), 0,1% in acqua e eluente B TFA 0,1% in MeOH per brequinar e composti 4 - 10. Le analisi sono iniziate con il 40 % di eluente B e il seguente profilo di gradiente è stato utilizzato: (tempo min,% B) 18.0, 100%; 26.0, 100%; 28,0, 40%. Per il composto 5, l'eluente A era TFA 0,1% in acqua ed eluente B acetonitrile. Il profilo del gradiente era il seguente: (tempo,% B): 0, 50%; 7,5, 50%; 22,4, 100%; 32,4, 100%. La quantificazione di singoli composti è stata effettuata utilizzando la relativa curva di calibrazione ottenuta analizzando soluzioni standard in MeOH. La solubilità è espressa come concentrazione µM della soluzione satura.
Clog P e log D (pH 7.4). I valori di ClogP sono stati calcolati utilizzando il programma Bio-Loom per Windows, versione 1.5 (BioByte). I coefficienti di ripartizione tra n-ottanolo e PBS a pH 7,4 (log D7.4), sono stati ottenuti utilizzando la tecnica dello shake-flask a temperatura ambiente. Negli esperimenti di shake-flask, come fase acquosa sono stati usati 50 mM di soluzione salina tamponata con fosfato a pH 7,4. Le fasi organiche (nottanolo) e acquose sono state saturate reciprocamente mediante agitazione per 4 ore. I composti sono stati solubilizzati nella fase acquosa tamponata alla massima concentrazione compatibile con la solubilità e sono state aggiunte quantità appropriate di n-ottanolo. Le due fasi sono state agitate per circa 20 minuti, momento in cui era stato raggiunto l'equilibrio di partizione dei soluti e quindi centrifugato (10000 rpm, 10 min). La concentrazione dei soluti è stata misurata nella fase acquosa mediante spettrofotometro UV (Varian Cary 50BIO); i valori di assorbanza (registrati per ciascun composto alla lunghezza d'onda dell'assorbimento massimo) sono stati interpolati nelle curve di calibrazione ottenute utilizzando soluzioni standard dei composti (r<2>> 0,99). Ogni valore di log D è una media di almeno sei misurazioni. Stabilità in siero. Una soluzione in DMSO del composto selezionato è stata aggiunta al siero umano (sterile e filtrato da plasma umano maschile AB, Sigma-Aldrich), per ottenere la concentrazione finale desiderata con il 2% di co-solvente. La soluzione risultante è stata agitata in un agitatore orbitale a 37 ° C per 24 ore. A intervalli di tempo appropriati (0, 0,5, 1, 4 e 24 ore), 300 μL della miscela di reazione sono stati prelevati e aggiunti a 600 μL di acido trifluoroacetico (TFA) 0,1% in acetonitrile allo scopo di denaturare le protein del siero. I campioni sono stati agitati su vortex, sonicati per 3 minuti e quindi centrifugati per 5 minuti a 2500 x g. Il surnatante trasparente è stato filtrato e analizzato in HPLC a fase inversa. Le analisi HPLC sono state eseguite con un sistema cromatografo HP 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), dotato di una pompa quaternaria (modello G1311A), un degasatore a membrana (G1379A) e un rivelatore a serie di diodi (DAD) (modello G1315B), integrato nel sistema HP1100. Le analisi dei dati sono state elaborate utilizzando un sistema HP ChemStation (Agilent Technologies). La colonna analitica utilizzata era una ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 × 150 mm, 5 μm, Agilent Technologies). La fase mobile consisteva in acetonitrile allo 0,1% di TFA / 0,1% di TFA 70/30 alla velocità di flusso = 1,0 ml / min. Il volume di iniezione era di 20 μL (Rheodyne, Cotati, CA). L'effluente della colonna è stato monitorato a 245 e 264 nm con lunghezza d'onda di riferimento di 700 nm. La quantificazione dei singoli composti è stata ottenuta utilizzando curve di calibrazione ottenute analizzando soluzioni standard. I risultati sono espressi come % del composto iniziale non modificato a 24 h
Legame con le proteine in vitro. La separazione dei farmaci liberi da quelli legati alle proteine è stata ottenuta mediante ultrafiltrazione utilizzando sistemi a membrana disponibili in commercio (dispositivi di ultrafiltrazione a centrifuga con membrana YM-T ultracel, Merck). Una soluzione in DMSO del composto selezionato è stata aggiunta al siero umano (sterile e filtrato da plasma umano maschile AB, Sigma-Aldrich), per ottenere la concentrazione finale desiderata con il 2% di co-solvente. 1 mL della soluzione ottenuta, inserito nel serbatoio del campione del dispositivo di ultrafiltrazione, è stato delicatamente agitato in un agitator orbitale a 37 ° C per 1 ora. La provetta è stata quindi centrifugata a 1000 x g per 25 minuti. Le concentrazioni dei composti nell'ultrafiltrato e nel filtrato sono state determinate usando l’HPLC a fase inversa e le condizioni cromatografiche sopra descritte. La quantificazione dei composti nel filtrato è stata eseguita utilizzando le curve di calibrazione dei composti ottenute da soluzioni standard (linearità determinata in un intervallo di concentrazione di 1-100 μM; r<2>> 0,99). La quantificazione dei composti nell'ultrafiltrato è stata eseguita utilizzando curve di calibrazione ottenute con il metodo dell'addizione standard (linearità determinata in un intervallo di concentrazione di 0-2,5 μM; r<2>> 0,99). La capacità di recupero del processo di ultrafiltrazione è staa calcolata al fine di scoprire se un qualsiasi composto potesse essere stato perso durante l'ultrafiltrazione, considerando la limitata solubilità dei composti testati.
Recupero = 100 x [(vol. legato x conc. legato) (vol. non legato x conc. non legato)] / siero vol. iniziale x conc. iniziale
vol. legato: calcolato dividendo il peso della frazione legata (differenza tra i pesi del serbatoio del campione dopo ultrafiltrazione e vuoto), per la sua densità (0,991 g / mL valutata pesando cinque repliche di un volume noto di frazione legata).
vol. non legato: calcolato dividendo il peso della frazione non legata (differenza tra i pesi del recipiente dell’ultrafiltrato dopo e prima dell'ultrafiltrazione), per la sua densità (0,999 g / mL valutata pesando cinque repliche di un volume noto di frazione non legata).
conc. legato: calcolato usando il metodo HPLC a fase inversa.
conc.non legato: calcolato usando il metodo HPLC a fase inversa (calibrazione con aggiunte standard)
Il recupero medio è stato del 97% per tutti i composti testati.
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Claims (9)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Inibitore della diidroortato deidrogenasi umana (hDHODH) di formula generale (I): in cui:
    R<1>, R<2>, R<4 >e R<5 >sono indipendentemente scelti fra un atomo di idrogeno (H), un atomo di alogeno, alchile C1- C4 e aloalchile C1-C4; R<3 >è fenile o fenossi; R<7 >e R<8 >sono indipendentemente scelti fra un atomo di idrogeno (H) e alchile C1-C4; R<6 >è scelto fra alchilossi C1-C4, un gruppo ossidrilico e un suo sale.
  2. 2. Inibitore secondo la rivendicazione 1, in cui almeno uno di R<1>, R<2>, R<4 >ed R<5 >è o contiene un atomo di alogeno.
  3. 3. Inibitore secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l’atomo di alogeno è un atomo di fluoro (F).
  4. 4. Inibitore secondo la rivendicazione 3, in cui R<3 >è fenile e ciascuno di R<1>, R<2>, R<4 >e R<5 >è un atomo di fluoro.
  5. 5. Inibitore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui l’alchile C1-C4 è un metile.
  6. 6. Inibitore secondo la rivendicazione 1, avente la formula di struttura:
  7. 7. Composizione farmaceutica comprendente un inibitore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6 e un veicolo, eccipiente o diluente farmaceuticamente accettabile.
  8. 8. Inibitore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6 o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7, per l’impiego in un metodo di trattamento di una patologia correlata al blocco del differenziamento mieloide.
  9. 9. Inibitore o composizione farmaceutica per l’impiego secondo la rivendicazione 8, in cui la patologia correlata al blocco del differenziamento mieloide è la leucemia mieloide acuta (AML).
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