BR112020022883A2 - formulação liofilizada para microvesículas preenchidas com gás - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a uma
composição de pó liofiizado, compreendendo um fosfolipídeo e um
polietileno glicol, o dito polietileno glicol tendo uma percentagem de
cadeias poliméricas dobradas, maior do que um limite predeterminado. A
composição é apropriada para preparar microvesículas preenchidas com
gás.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMU-
LAÇÃO LIOFILIZADA PARA MICROVESÍCULAS PREENCHIDAS COM GÁS". Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se a uma formulação para pre- parar microvesículas preenchidas com gás, para uso em imagem de contraste de ultrassom. Antecedentes da invenção
[0002] O rápido desenvolvimento de agentes de contraste nos úl- timos anos, tem gerado um número de composições e formulaçãos diferentes, que são úteis em imagem de contraste aprimorada, de ór- gãos e tecidos de corpo humano ou animal, como também em trata- mentos terapêuticos dos mesmos.
[0003] Uma classe de agentes de contraste particularmente útil para imagem de Ultrassom de Contraste Realçado (Enhanced Ultra- Sound /imagem de "CEUS")), inclui suspensões de bolhas de gás de tamanho nano- e/ou micrométrico, dispersas em um meio aquoso. O gás é tipicamente preso ou encapsulado em uma camada de película compreendendo, por exemplo, emulsificadores, óleos, agentes de es- pessamento ou açúcares. Essas bolhas de gás estabilizadas (disper- sas em uma solução fisiológica apropriada), são geralmente referidas na técnica com várias terminologias, dependendo tipicamente do ma- terial de estabilização empregado para a preparação das mesmas; es- tes termos incluem, por exemplo, "microesferas", "microbolhas", "mi- crocápsulas" ou "microbalões", globalmente referidos aqui como "mi- crovesículas preenchidas com gás" (ou "microvesículas").
[0004] Agentes de Imagens de Contraste de Ultrassom ("USCA'"s), são fabricados de acordo com vários métodos de fabricação. Um des- tes métodos, ver por exemplo WO 94/09829('), acarreta a dissolução de uma mistura de componentes de formação de película (tais como fosfolipídeos e/ou ácidos graxos), e de um composto de estabilização hidrofílica (por exemplo, polietilenoglicol) em um solvente orgânico; a mistura obtida é, desse modo, preenchida em vários frascos que são submetidos à secagem por congelamento (liofilização). Os frascos contendo um resíduo sólido de secagem por congelamento sólido ("bo- lo") no fundo do mesmo, são depois preenchidos com um gás apropri- ado (por exemplo um gás fluorinado), e finalmente fechados para ar- mazenamento. Antes do uso, uma suspensão aquosa de microbolhas é facilmente preparada, por injeção de um líquido apropriado no frasco (por exemplo, solução salina), e sacudindo o frasco para dissolver o resíduo sólido.
[0005] Um USCA comercialmente disponível, que pode ser fabri- cado de acordo com o método acima, é SonoVueº (ou Lumasonº nos EUA), de Bracco.
[0006] O Requerente agora observou que o polietileno glicol, em- pregado na preparação do "bolo" liofilizado, pode ter variações nas su- as características, que podem negativamente afetar o número de mi- crovesículas preenchidas com gás, obtidas mediante a reconstituição do pó liofilizado.
[0007] Em particular, o Requerente observou que lançamentos di- ferentes (mesmo de um mesmo fabricante) de PEG4000 comercial- mente disponível, pode ter quantidades diferentes de cadeias poliméri- cas dobradas, no material polimérico. Como observado pelo Reque- rente, se a percentagem de cadeias dobradas, no material polimérico é muito baixa, isto pode resultar em um número muito alto de frascos que não passam no teste de aceitabilidade em um lote de fabricação. Quando sob uma escala industrial um lote de fabricação pode com- preender algumas centenas de frascos, pode ser bem compreendido que mesmo um número relativamente baixo de frascos descarregados é altamente indesejável.
[0008] Baseado na observação acima, o Requerente determinou que o polietileno glicol, usado na formulação do pó liofilizado, para a preparação de microvesículas preenchidas com gás, deverá ter uma percentagem de cadeias poliméricas dobradas maior do que um valor predeterminado.
Sumário da invenção
[0009] Um aspecto da invenção se refere à composição de pó lio- filizado, para a preparação de microvesículas preenchidas com gás, a dita composição compreendendo um fosfolipídeo e um polietileno gli- col, e que o dito polietileno glicol tem uma percentagem de cadeias poliméricas dobradas maior do que 34%, preferivelmente maior do que 35%.
[0010] Preferivelmente, a dita percentagem de cadeias dobradas é de pelo menos 40%, mais preferivelmente de pelo menos 42%, ainda mais preferivelmente de pelo menos 44%. Em uma modalidade parti- cularmente preferida, a dita percentagem de cadeias dobradas é de pelo menos 48%.
[0011] Em uma modalidade preferida, o dito polietileno glicol tem uma massa molecular média (ou peso molecular em número, Mn) de pelo menos 4000 g/mol (ou daltons, Da), mais preferivelmente de pelo menos 4025 g/mol, e ainda mais preferivelmente de pelo menos 4050 glmol.
[0012] Em outra modalidade preferida o dito fosfolipídeo é DSPC, DPPG-Na ou (preferivelmente) uma mistura dos mesmos.
[0013] Preferivelmente, a dita composição ainda compreende um ácido graxo, preferivelmente ácido palmítico.
[0014] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um fras- co fechado contendo uma composição como definida acima, em conta- to com um gás fisiologicamente aceitável.
[0015] Preferivelmente, o dito gás é um gás fluorinado, mais prefe-
rivelmente hexafluoreto de enxofre.
[0016] De acordo com outro aspecto, a invenção se refere a uma suspensão de microvesículas preenchidas com gás, obtida pela dis- persão da dita composição de pó liofilizado, na presença de um gás, em um líquido fisiologicamente aceitável, preferivelmente em uma so- lução de 0,9% em peso/volume de NaCl.
[0017] De acordo com um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para fabricar uma composição liofilizada, compreenden- do um fosfolipídeo, um polietileno glicol e, opcionalmente, um ácido graxo, que compreende: - dissolver o dito fosfolipídeo, opcionalmente o dito ácido graxo, e o dito polietileno glicol em um solvente; - congelar a solução; e - remover o solvente por liofilização; em que o dito polietileno glicol tem uma percentagem de cadeias poliméricas dobradas de 40% ou mais.
Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método de imagem de ultrassom, que compreende: - administrar uma quantidade eficaz de uma suspensão de microvesículas preenchidas com gás, como definido acima, para um paciente; - transmitir um sinal de ultrassom para uma parte do corpo do dito paciente; - coletar um sinal ecográfico da dita parte do corpo. Figuras
[0018] A Figura 1 mostra um bolo liofilizado "macio" (1a) e um bolo liofilizado "duro" (1b)
[0019] A Figura 2 é um gráfico ilustrando a relação entre a percen- tagem de cadeias poliméricas dobradas, e a quantidade de frascos rejeitados por lote de fabricação;
[0020] A Figura 3 mostra um termograma MDSC, ilustrativo do se- gundo ciclo de aquecimento, de uma amostra de polietileno glicol. Descrição detalhada da invenção
[0021] SonoVueº (ou Lumasonº) é formulado como um pó estéril, liofiizado sem pirogênio, em um frasco de septo. O pó liofilizado con- tém polietileno glicol 4000 (PEG4000, 24,56 mg), distearoilfosfatidil- colina (DSPC, 0,19 mg), sódio de dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG-Na 0,19 mg) e ácido palmítico (0,04 mg). O espaço do cabeçote de cada frasco, é preenchido com hexafluoreto de enxofe (SFs). Mediante a reconstituição com 5 mL de solução salina estéril, SonoVue/Lumason é uma suspensão homogênea, branco leitosa contendo microvesículas (identificadas também como "microesferas" ou "microbolhas"), preen- chidas com hexafluoreto de enxofre.
[0022] A preparação do pó liofilizado pode ser realizada, de acordo com o procedimento descrito no pedido de patente citado acima WO 94/09829. Tipicamente, o processo acarreta a dissolução de PEGA4000, fosfolipídeos e ácido palmítico, em uma respectiva relação de peso, correspondendo substancialmente a um produto final liofiliza- do, em um solvente apropriado (por exemplo, dioxano, ciclohexanol, 2- metil-2-butanol, tetraclorodifluoretileno ou terc-butanol). Por exemplo, a solução pode conter de 22 a 28 partes em peso de polietileno glicol, de 0,15 a 0,25 partes em peso de DSPC, de 0,15 a 0,25 partes em peso de DPPG-Na, e de 0,02 a 0,06 partes em peso de ácido palmítico. À solução obtida é depois preenchida nos frascos de vidro, que são rapi- damente congelados (por exemplo a -45º C), e depois submetidos ao processo de liofilização. Tipicamente, de acordo com a escala industri- al, cada lote fabricado compreende alguns milhares de frascos. No fim da etapa de liofilização, o espaço superior dos frascos contendo o re- síduo liofilizado, na forma de um bolo sólido, é saturado com gás SFs e o frasco é fechado com uma rolha de borracha. Os frascos assim ob-
tidos, podem ser armazenados por um período de pelo menos dois anos.
[0023] Como observado pelo Requerente, a qualidade dos bolos liofilizados nos frascos de um lote de fabricação pode, entretanto, ser negativamente afetada pelo uso de um PEG, tendo uma quantidade de cadeias dobradas inferior a um limite predeterminado.
[0024] Como mencionado, por exemplo, por Ginés et al.,? polietile- no glicóis (PEGs) são polímeros hidrofílicos semi-cristalinos contendo, no estado sólido, fases cristalinas amorfas e ordenadas em propor- ções variadas, dependendo de suas síntese e histórico térmico. Nas regiões cristalinas, as cadeias poliméricas existem como ambas, ca- deias estendidas e dobradas, particularmente em PEGs, com um peso molecular entre cerca de 4000 e 6000 g/mol. Como observado por Gi- nés et al., a quantidade de cadeias dobradas em PEGA4000 é geral- mente maior, quando uma amostra fundida é deixada refrigerando à temperatura ambiente, em relação a uma mesma amostra fundida que é refrigerada em um banho de gelo, ou por imersão em nitrogênio lí- quido.
[0025] Como observado pelo Requerente, a quantidade de cadei- as dobradas no material de PEG, usadas como composto de estabili- zação (tipicamente PEG4000), em uma formulação para preparar mi- crovesículas preenchidas com gás, pode variar substancialmente entre os vários lotes comerciais, ainda de um mesmo fabricante, para mate- riais que têm o mesmo peso molecular nominal (isto é, 4000 g/mol).
[0026] O Requerente inesperadamente descobriu agora, que se um PEG com uma percentagem muito baixa de cadeias poliméricas dobradas é empregado, isto pode ter um impacto negativo sobre a qualidade dos bolos liofilizados, contidos nos frascos de um lote fabri- cado usando o tal PEG. Em particular, se a percentagem de cadeias poliméricas dobradas no PEG fica abaixo de um limite predeterminado,
a quantidade de frascos rejeitados em tal lote (isto é, frascos com um bolo congelado não atendendo as especificações predeterminadas), se tornará excessivamente alta.
[0027] Entre os vários critérios para determinar a qualidade de um bolo liofilizado, um importante é o aspecto físico do bolo. Em particular, o Requerente determinou uma correlação relativamente boa, entre o aspecto físico de um bolo e a qualidade da suspensão de microvesícu- las preenchidas com gás, produzidas mediante a reconstituição de tal bolo, com um líquido fisiologicamente aceitável. Como observado pelo Requerente, bolos mostrando uma aparência de superfície relativa- mente macia (ver, por exemplo, a fig. 1a), em geral, fornecem um nú- mero maior de microvesículas mediante a reconstituição, enquanto aqueles mostrando uma aparência de superfície relativamente dura (ver, por exemplo, a fig. 1b), resultam em um número de microvesícu- las substancialmente mais baixo mediante reconstituição. Além disso, como observado pelo Requerente, bolos com uma superfície relativa- mente macia, resultam em suspensões de microvesículas com mais altas MVC (Microbubbles Volume Concentration [Concentração do Vo- lume de Microbolhas], isto é, a quantidade total de gás contido nas mi- crovesículas reconstituídas, por mL de suspensão). Em geral, devido à qualidade inferior mencionada acima, as suspensões de microvesí- culas preenchidas com gás, obtidas através da reconstituição de bolos duros, são menos eficazes para realizar imagem de CEUS.
[0028] Em particular, como observado pelo Requerente, quando a percentagem de cadeias dobradas é de 34%, ou inferior à quantidade total de cadeias poliméricas, a quantidade de frascos rejeitados (com bolos "duros") é geralmente mis do que 16%, como ilustrado na Fig. 2. Desse modo o Requerente determinou que, a fim de reduzir tal núme- ro de frascos rejeitados, um PEG com uma percentagem de cadeias dobradas maior do que 34%, preferivelmente maior do que 35%, deve ser empregado. Ainda para minimizar a taxa de rejeição de frascos, a percentagem de cadeias dobradas no PEG, deve preferivelmente ser de pelo menos 40%, em relação à quantidade total de cadeias polimé- ricas. Mais preferivelmente, a percentagem de cadeias poliméricas do- bradas deve ser maior do que 42%, e ainda mais preferivelmente mai- or do que 44%, com 48% sendo particularmente preferido. Embora em princípio nenhum limite superior para a percentagem de cadeias do- bradas (tipicamente PEGs com Mn nominal de cerca de 6000 g/mol pode ter uma percentagem de cadeias dobradas de até cerca de 100%), PEGs com Mn nominal de cerca de 4000 (por exemplo, até 4600 g/mol), tipicamente têm uma percentagem de cadeias dobradas mais baixa do que 80%, tipicamente de 75% ou menos. Preferivelmen- te, a percentagem de cadeias dobradas é cerca de 70% ou mais baixa, mais preferivelmente cerca de 65% ou mais baixa, e ainda mais prefe- rivelmente de 60% ou mais baixa. Determinação da percentagem de cadeias dobradas
[0029] A percentagem de cadeias dobradas no material polimérico, pode ser determinada de acordo com os métodos conhecidos nas téc- nicas, preferivelmente por Differential Scanning Calorimetry (Calorime- tria de Varredura Diferencial) (DSC). Um método preferido (usado também nos exemplos a seguir) é Modulated Diferential Scanning Ca- lorimetry (Calorimetria de Varredura Diferencial Modulada) (MDSC), realizada, por exemplo, usando um sistema DSC-Q2000 (TA instru- ments (instrumentos TA), New Castle, DE USA).
[0030] Os detalhes do método MDSC são descritos nos exemplos de trabalho.
[0031] Resumidamente, a amostra é submetida a um ciclo de ca- lor/frio/calor, a uma taxa de temperatura constante (por exemplo, de 2ºC/min) sobre uma faixa de temperatura predeterminada (por exem- plo, de 20º C a 70º C), aplicando uma amplitude de modulação de temperatura (por exemplo, 0,16º C a cada 30 segundos).
[0032] A fração de material polimérico presente na forma dobrada, pode ser caracterizada durante o segundo ciclo de aquecimento. De fato, o polietileno glicol tem uma característica distinta para se dividir em dois picos, durante o segundo ciclo de aquecimento, o pico com a temperatura de fusão mais baixa, correspondendo à fusão do PEG com cadeias dobradas, enquanto o pico com a temperatura de fusão mais alta corresponde à fusão do PEG com cadeias não dobradas. À Figura 3 mostra um termograma de MDSC típico de PEG, em que os ditos primeiro e segundo picos de fusão, obtidos durante o dito segun- do ciclo de aquecimento, são identificados. Em particular, o pico A na fig. 3 (em cerca de 57º C) corresponde à fusão de PEG com cadeias dobradas, enquanto o pico B (em cerca de 61º C) corresponde à fusão de PEG com cadeias não dobradas. A área de cada pico corresponde às respectivas frações de PEG com cadeias dobradas e não dobradas. A fração de cadeias poliméricas dobradas, f(dobrada), é desse modo determinada de acordo com a equação 1 a seguir: Equação 71 JS Dobrada) =—— dobrada não dobrada em que Adobrada €& Anão dobrada representam os fluxos integrais de calor normalizado (entalpia de fusão, joule/gramas de amostra) para as for- mas de PEG dobradas e não dobradas, como calculado a partir das áreas sob os respectivos picos do segundo ciclo de aquecimento do termograma MDSC da amostra de PEG. A percentagem de cadeias poliméricas dobradas, em uma amostra de polietileno glicol, é desse modo: f(dobrada) x 100.
[0033] Como ilustrado na parte experimental, embora exista uma certa correlação entre a percentagem de cadeias dobradas e a massa molecular média do polietileno glicol (em geral, quanto mais alta a massa molecular do polímero, mais alta a percentagem de cadeias dobradas), tal correlação não é necessariamente contínua. Esta des- coberta mostra que, embora a massa molecular desempenhe um pa- pel na quantidade de cadeias dobradas, não é necessariamente a úni- ca determinante, pois a quantidade de cadeias dobradas pode também ser influenciada pelo histórico térmico da amostra polimérica (incluin- do, por exemplo, parâmetros do processo de fabricação/refrigeração, condições de armazenamento, ou envelhecimento da amostra). Não obstante, o Requerente observou que o polietileno glicol deve, preferi- velmente, exibir uma massa molecular média (ou peso molecular mé- dio em número, Mn) de pelo menos 4000 g/mol, mais preferivelmente de pelo menos 4025 g/mol, e ainda mais preferivelmente de pelo me- nos 4050 g/mol. Particularmente preferido é um polietileno glicol com um Mn de 4075 ou mais alta, por exemplo 4100 ou mais alta. Embora, em princípio, não exista nenhum valor mais alto de Mn, para o que diz respeito à quantidade de cadeias dobradas, o polímero deve, entretan- to, ter um peso molecular compatível com a viscosidade da suspensão final de microvesículas preenchidas com gás. Desse modo, um Mn de 6200 g/mol ou mais baixo é preferido, mais preferivelmente de 5000 g/mol ou mais baixa, e ainda mais preferivelmente de 4400 g/mol ou menos.
[0034] A massa molecular de polietileno glicol pode ser determina- da, de acordo com a metodologia convencional, preferivelmente pela titulação do valor de hidroxila (OHV), por exemplo, de acordo com o padrão de DIN53240. A massa molecular média para PEG (ou o peso molecular médio em número, Mn) é depois facilmente calculado a par- tir de OHV, por exemplo como a seguir: Mn = 112'220 /OHV. Determinação de aspecto do bolo
[0035] A verificação da aparência física do bolo, pode ser feita pe- la inspeção visual. Preferivelmente, a inspeção visual é realizada usando uma máquina de inspeção semi-automática, com um sistema de iluminação e espelho apropriado, tal como uma máquina semi- automática Seidenader M10063. Na prática, o bolo é iluminado a partir do topo, com um sistema de iluminação apropriado, enquanto o fundo do bolo é visualizado pela transparência em um espelho subjacente. O aspecto do bolo visualizado no espelho, é desse modo verificado por um operador, que determina os frascos aceitáveis ou rejeitados, com base nos critérios a seguir. Bolos liofiizados passando pelo teste de aceitabilidade, têm um aspecto substancialmente macio ("bolos maci- os"), com uma superfície homogênea, com múltiplas estruturas do tipo cristal através do bolo (ver a fig. 1a). Por outro lado, bolos sendo rejei- tados no teste de aceitabilidade, têm um aspecto substancialmente duro ("bolos duros"), com rachaduras e/ou pontos maiores aparecendo no bolo (ver por exemplo a fig 1b).
[0036] Com este teste de aceitabilidade, o Requerente determinou que a quantidade de frascos rejeitados, em um lote de fabricação, é inversamente proporcional à percentagem de cadeias dobradas no po- lietilenoglicol, empregado na preparação dos vários lotes, como ilus- trado em detalhes nos exemplos a seguir.
[0037] Quando testado mediante reconstituição com solução sali- na, os bolos macios geralmente resultaram em quantidade maior de microbolhas na suspensão, como também em um volume maior de gás contido nas microbolhas.
[0038] A suspensão reconstituída pode ser usada para a adminis- tração em um paciente, nos procedimentos CEUS convencionais, em que o paciente, ou uma parte do corpo do mesmo, é submetida à in- sonação de ultrassom, e o sinal ecográfico é coletado e analisado.
[0039] Os exemplos a seguir vão ajudar a ilustrar ainda mais a in- venção.
EXEMPLOS Exemplo 1 Determinação da percentagem de cadeias dobradas por MDSC
[0038] a. Equipamento e Calibração do sistema
[0039] Todos os experimentos de MDSC foram realizados no sis- tema DSC-Q2000 (Instrumentos TA (TA Instruments), New Castle, DE USA) equipado com tecnologia Tzero'"“ (possibilitando a medição dire- ta da capacidade de aquecimento), e com a opção ModulatedO que possibilita a sobreposição de uma oscilação de temperatura sinusoidal na rampa linear tradicional.
[0040] Um acessório de refrigeração refrigerada (RCS90), com um sistema de refrigeração de dois estágios, para convenientemente ope- rar sobre a faixa de temperatura de -90º C a 550º C, foi usado.
[0041] A aquisição e o processamento de dados foram realizados com a ajuda do pacote Universal Analysis Software (Software de Aná- lise Universal).
[0042] Cadinhos de alumínio Tzero (ref. 901683.901) e tampa de alumínio Tzero (ref 901671.901), todos de instrumentos TA, foram usados para conter a amostra a ser medida, e para lacrar o cadinho por meio de uma prensa (compressor) Tzero (ref 901600.901).
[0043] A calibragem do sistema DSC, incluindo fluxo de tempera- tura e calor, foi realizada com Índio metálico. Na prática, uma peça de índio de aproximadamente 5 mg foi pesada, achatada e transferida em um cadinho Tzero, vedado com uma tampa Tzero, por meio de uma prensa Tzero. O programa de varredura de calibragem foi realizado entre 100º C e 180º C, em uma taxa de temperatura constante de 10º C/min. As especificações do Índio foram como a seguir: entalpia de fusão e temperatura de fusão, no começo tiveram que ser 28.71 J/g +
0.5 J/g e 156.6 ºC + 0.25 ºC, respectivamente.
[0044] a. Preparação das amostras e medições de MDSC
[0045] Quatro lotes diferentes de PEG4000 foram caracterizados de acordo com o procedimento a seguir.
[0046] Flocos de PEG4000 de cada amostra foram esmagados, em pequenos pedaços por meio de um pilão, e uma massa de amostra de 5 mg + 0,1 mg foi pesada com uma microbalança XP26 (Mettler To- ledo) em cadinhos Tzero, que foram depois fechados com uma tampa Tzero, por meio de uma prensa Tzero. Um cadinho Tzero vazio, de peso similar em comparação ao cadinho de amostra vazio, foi similar- mente preparado e usado como uma referência.
[0047] A medição de MDSC foi realizada em cada cadinho con- tendo uma amostra de PEG4000, aplicando um ciclo de calor/frio/calor em taxas de temperatura constante de 2º C/min, sobre uma faixa de temperatura de 20º C a 70º C, como delineado na Tabela 1 abaixo. Um sinal somente de modulação de calor foi aplicado (0,16º C de am- plitude de modulação de temperatura cada período de 30 segundos de modulação da temperatura). Nitrogênio foi usado como gás de depu- ração, em uma taxa de fluxo de 50 mL/min. Tabela 1: ciclos de calor/frio/calor MDSC [E serasa — [E mese? — [ssa —
[0048] Os parâmetros a seguir foram determinados no termograma MDSC usando o software de Análise Universal:
[0049] - A temperatura no pico e a entalpia de fusão, durante o primeiro ciclo de aqueciento;
[0049] - A temperatura no pico e a entalpia de cristalização durante o primeiro ciclo de refrigeração;
[0050] - A temperature no pico e as entalpias de fusão de cadeias dobradas e estendidas, durante o segundo ciclo de aquecimento.
[0051] A percentagem de material polimérico presente na forma dobrada, foi caracterizada durante o segundo ciclo de aquecimento, e calculada de acordo com a Equação 1. Para cada lote de PEG4000, o procedimento foi repetido em três amostras diferentes. Detalhes das medições e os resultados, são fornecidos nas tabelas 2 a 5 a seguir.
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8.º 2 ses a E TT Ss Petição 87 | — '0201 . 10141751, de 10/11/2020, pás | | | | ), pág. 33/47
[0052] Os resultados das medições de MDSC, para os respectivos lotes de PEG, estão resumidos na tabela 6 a seguir, junto com a res- pectiva média de pesos moleculares em número (Mn), como fornecido pelo fornecedor.
TABELA 6: PEG4000 % de cadeias dobradas e média Mn Lote 1 (comp) 4 8997 Lote 2 43 4107 Lote 4 4 4154
[0053] Os resultados relatados nas tabelas 2 a 6 mostram que o lote 1 (com somente 34% de cadeias poliméricas dobradas), não cum- pre os requisitos de acordo com a invenção, enquanto os outros três lotes de PEG4000 satisfazem tais requisitos. Além disso, pode tam- bém ser observado que o Lote Nº 1 tem um Mn mais baixo que 4000, enquanto todos os outros lotes têm um Mn maior do que 4000 g/mol, em particular de pelo menos 4050 g/mol.
Exemplo 2 Preparação de bolos liofilizados
[0054] O procedimento para preparar os bolos liofilizados, segue essencialmente o ilustrado nos exemplos de trabalho de WO 94/09829. Resumidamente, DSPC, DPPG-Na e PA em uma proporção de peso de 4,75/4,75/1, são primeiro dissolvidos em hexano/etanol (8/2, v/v), em uma concentração de cerca de 5 g/L, e os solventes fo- ram evaporados sob vácuo. O resíduo é misturado com PEG4000 em uma proporção de peso de cerca de 0,017:1, a mistura é dissolvida em terc-butanol em cerca de 60º C, e a solução clara é usada para preen- cher os respectivos frascos de DIN8R (com um volume corresponden- te contendo cerca de 25 mg da mistura). Os frascos são depois rapida- mente refrigerados a -45º C, e depois submetidos à etapa de liofilização final. No fim da liofiização, o ambiente do liofilizador é saturado com SF6 na pressão atmosférica, e os frascos (contendo o bolo liofilizado sólido em contato com SFs) são fechados com uma rolha de borracha.
[0055] O procedimento de fabricação acima foi aplicado usando ca- da um dos quatro lotes de PEG4000 (lote 1 a 4), caracterizados no Exemplo 1, desse modo obtendo quatro lotes de alguns milhares de fras- cos cada (lotes 1 a 4, respectivamente), cada frasco contendo 25 mg de material sólido liofilizado, na forma de um bolo no fundo do frasco.
Exemplo 3 Verificação de frascos/bolos
[0056] Os lotes obtidos de acordo com o método de preparação ilustrado no exemplo 2, foram verificados para a presença de bolos liofilizados não aceitáveis, de acordo com o procedimento a seguir.
[0057] Os frascos de cada lote foram inspecionados e classifica- dos como "frascos aceitáveis", isto é, contendo um bolo macio (SCV, por exemplo como na fig. 1a), ou como "frascos rejeitados", isto é, con- tendo um bolo duro (RCV, por exemplo como na fig. 1b), usando uma máquina Seidenader M10063 semi-automática, de acordo com o pro- cedimento descrito antes.
[0058] Os resultados da verificação realizada, de acordo com o procedimento acima, estão ilustrados na tabela 7 a seguir e na figura 2 reportada.
Tabela 7: Quantidade de frascos rejeitados vs. % de cadeias do- bradas em PEG4000 Lote 1 (comp) 16 34 Lote 2 8,9 43 Lote 3 5,6 49 Lote 4 3,7 54
[0059] Como pode ser inferido a partir dos resultados ilustrados na tabela 7, a percentagem de frascos rejeitados no lote de fabricação Nº 1 (em que o PEG4000 da composição tem somente 34% de cadeias dobradas), é maior em relação à quantidade de rejeição dos outros lotes fabricados com um PEGA4000, que tem percentagens maiores de cadeias dobradas, de acordo com a invenção. Exemplo 4 Suspensão de microvesículas preenchidas com gás a partir de frascos reconstituídos
[0060] Seis frascos foram amostrados de cada grupo de "frascos aceitáveis" e "frascos rejeitados" (como definido no exemplo 3 acima), a fim de caracterizar as microbolhas obtidas através da reconstituição de bolos contidos nos ditos frascos.
[0061] Um Coulter Counter Multisizer 3 preparado com um tubo de abertura de 30 um, foi usado para medir vários parâmetros de suspen- são de microvesículas preenchidas com gás, tais como as MVC (Con- centração do Volume de Microvesículas (Microvesicles Volume Con- centration), e o número total de microvesículas na suspensão. Resu- midamente, 50 ul de suspensão de microbolhas foram diluídos na so- lução de 100 mL NaCl 0,9%, usando um volume analítico de 100 uL.
[0062] Os resultados das medições (valores médios para cada grupo de frascos) são reportados na tabela 8 abaixo. TABELA 8: Características de microvesículas preparadas a partir de gás de bolos macios ou duros Er Aceitos (bolos macios) E A, 38x10º Rejeitados (bolos duros) Pp? pan
[0063] Como inferido a partir dos resultados ilustrados na tabela 8, microvesículas obtidas mediante a reconstituição de bolos macios, mostram um volume mais alto de gás total, preso nas microvesículas
(o dobro em particular), como também um número mais alto de micro- vesículas na suspensão (em particular, 0,5x10º). Documentos Citados 1 Pedido de Patente Internacional (International Patent Application) WO 94/09829 (Bracco International) 1 Gines et al., "Caracterização Térmica De Polietileno Glicóis Aplicados na Tecnologia Farmacêutica Usando Calorimetria de Varredura Dife- rente e Microscopia de Estado Quente", Journal of Thermal Analysis (Diário de Análise Térmica), Vol. 46 (1996) 291-304.
Claims (15)
1. Composição de pó liofilizado para a preparação de mi- crovesículas preenchidas com gás, a dita composição compreendendo um fosfolipídeo e um polietileno glicol, caracterizada pelo fato de que o dito polietileno glicol tem uma percentagem de cadeias poliméricas dobradas maior do que 34%.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que a dita percentagem de cadeias dobradas é de pelo menos 40%.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que a dita percentagem de cadeias dobradas é de pelo menos 42%.
4. Composição de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o dito polietileno glicol é um PEG4000, que tem um peso molecular médio em número (Mn) de pelo menos 4000 g/mol.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zada pelo fato de que o dito Mn é de pelo menos 4025 g/mol.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações | a 5, caracterizada pelo fato de que o dito fosfolipídeo é DSPC, DPPG-Na, ou uma mistura dos mesmos.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a dita composição ainda compreende um ácido graxo.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zada pelo fato de que o dito ácido graxo é ácido palmítico.
9. Composição de acordo com reivindicação 8, caracteriza- da pelo fato de que compreende de 22 a 28 partes em peso de PEGA4000, de 0,15 a 0,25 partes em peso de DSPC, de 0,15 a 0,25 partes em peso de DPPG-Na, e de 0,02 a 0,06 partes em peso de áci-
do palmítico.
10. Composição de acordo com reivindicação 9, caracteri- zada pelo fato de que compreende 24,56 mg de PEGA4000, 0,19 mg de DSPC, 0,19 mg de DPPG-Na e 0,04 mg de ácido palmítico.
11. Frasco fechado contendo uma composição de pó liofili- zado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ca- racterizado pelo fato de que está em contato com um gás fisiologica- mente aceitável.
12. Frasco fechado de acordo com a reivindicação 11, ca- racterizado pelo fato de que o dito gás é um gás fluorinado.
13. Método para a fabricação de uma composição liofiliza- da, caracterizado pelo fato de que compreende um fosfolipídeo e um polietileno glicol, que compreende: - dissolver o dito fosfolipídeo e o dito polietileno glicol em um solvente, dessa maneira obtendo uma solução; - congelar a solução; e - remover o solvente por liofilização; em que o dito polietileno glicol tem uma percentagem de cadeias poli- méricas dobradas maior do que 34%.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a dita composição ainda compreende um ácido graxo, e a dita etapa a compreende adicionalmente dissolver o dito ácido graxo no dito solvente.
15. Suspensão de microvesículas preenchidas com gás, caracterizada pelo fato de que é obtida pela dispersão de uma compo- sição de pó liofilizado, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, na presença de um gás, em um líquido fisiologicamente aceitável.
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