RU2803236C2 - Лиофилизированный состав для заполненных газом микровезикул - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области производства контрастных средств и касается композиции для получения заполненных газом микровезикул для применения в ультразвуковой контрастной визуализации и способа ее производства, а также запечатанного флакона, содержащего такую композицию и суспензии, полученной из такой композиции. Лиофилизированная порошковая композиция для получения заполненных газом микровезикул содержит фосфолипид и полиэтиленгликоль, причем указанный полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ4000, имеющий среднечисленную молекулярную массу (Mn) по меньшей мере 4000 г/моль, и имеет процент складчатых полимерных цепей выше 35%. Предлагаются также запечатанный флакон, содержащий указанную выше композицию в контакте с физиологически приемлемым газом, и суспензия заполненных газом микровезикул, полученная путем диспергирования указанной выше лиофилизированной композиции в присутствии газа в физиологически приемлемой жидкости. Предлагается также способ производства лиофилизированной композиции, содержащей фосфолипид и полиэтиленгликоль, включающий: a. растворение указанного фосфолипида и указанного полиэтиленгликоля в растворителе, тем самым получая раствор; b. замораживание раствора; и c. удаление растворителя посредством лиофилизации; при этом указанный полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ4000, имеющий среднечисленную молекулярную массу (Mn) по меньшей мере 4000, и имеет процент складчатых полимерных цепей выше 35%, и лиофилизированная композиция, полученная указанным способом. Использование ПЭГ4000, имеющего повышенный процент складчатых полимерных цепей (выше 35%), позволяет уменьшить количество отбракованных флаконов. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл., 4 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к составу для получения заполненных газом микровезикул для применения в ультразвуковой контрастной визуализации.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Стремительная разработка контрастных средств в последние годы привела к созданию ряда различных композиций и составов, которые являются пригодными в усиленной контрастом визуализации органов и тканей организма человека или животного, а также для их терапевтического лечения.

Класс контрастных средств, особенно пригодный для визуализации посредством контрастной эхографии (визуализация "CEUS"), включает суспензии пузырьков газа нано- и/или микрометрового размера, диспергированных в водной среде. Газ, как правило, заключен или инкапсулирован в пленочный слой, содержащий, например, эмульгаторы, масла, загустители или сахара. Эти стабилизированные пузырьки газа (диспергированы в подходящем физиологическом растворе), как правило, называют в данной области с использованием различной терминологии в зависимости, как правило, от стабилизирующего материала, используемого для их получения; эти термины включают, например, "микросферы", "микропузырьки", "микрокапсулы" или "микрошарики", в совокупности называемые в настоящем описании "заполненными газом микровезикулами" (или "микровезикулами").

Эхоконтрастные средства ("USCA") производятся различными способами производства. Один из этих способов, см., например, WO 94/098290, охватывает растворение смеси пленкообразующих компонентов (таких как фосфолипиды и/или жирные кислоты) и гидрофильного стабилизирующего соединения (например, полиэтиленгликоль) в органическом растворителе; полученной таким образом смесью заполняют флаконы, которые подвергают сублимационной сушке (лиофилизация). Затем флаконы, содержащие твердый лиофилизированный остаток ("кек") на их дне, заполняют подходящим газом (например, фторсодержащим газом) и, наконец, закрывают для хранения. Перед применением без труда получают водную суспензию микропузырьков посредством инъекции подходящей жидкости во флакон (например, солевой раствор) и встряхивания флакона для растворения твердого остатка.

Коммерчески доступным USCA, которое может быть произведено описанным выше способом, является SonoVue® (или Lumason® в США), от Bracco.

Заявитель обнаружил, что полиэтиленгликоль, используемый для получения лиофилизированного "кека", может иметь варьирование характеристик, которое может негативно влиять на количество заполненных газом микровезикул, образующихся при восстановлении лиофилизированного порошка.

В частности, заявитель обнаружил, что различные партии (даже от одного производителя) коммерчески доступного ПЭГ4000 могут иметь различные количества складчатых полимерных цепей в полимерном материале. Как обнаружил заявитель, если процент складчатых цепей в полимерном материале является слишком низким, это может привести к тому, что слишком большое количество флаконов не пройдет тест приемлемости в произведенной партии. Поскольку в промышленном масштабе произведенная партия может включать несколько тысяч флаконов, хорошо понятно, что даже относительно низкое количество отбракованных флаконов является в высокой степени нежелательным.

Исходя из описанного выше наблюдения, заявитель определил, что полиэтиленгликоль, используемый для составления лиофилизированного порошка для получения заполненных газом микровезикул, имеет процент складчатых полимерных цепей, превышающий заданную величину.

Сущность изобретения

Аспект изобретения относится к лиофилизированной порошковой композиции для получения заполненных газом микровезикул, причем указанная композиция содержит фосфолипид и полиэтиленгликоль, где указанный полиэтиленгликоль имеет процент складчатых полимерных цепей выше 34%, предпочтительно выше 35%.

Предпочтительно указанный процент складчатых цепей составляет по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 42%, еще более предпочтительно по меньшей мере 44%. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанный процент складчатых цепей составляет по меньшей мере 48%.

В предпочтительном варианте осуществления указанный полиэтиленгликоль имеет среднюю молекулярную массу (или среднечисленная молекулярная, Mn) по меньшей мере 4000 г/моль (или дальтон, Да), более предпочтительно по меньшей мере 4025 г/моль и еще более предпочтительно по меньшей мере 4050 г/моль.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный фосфолипид представляет собой DSPC, DPPG-Na или (предпочтительно) их смесь.

Предпочтительно указанная композиция, кроме того, содержит жирную кислоту, предпочтительно пальмитиновую кислоту. В другом аспекте настоящее изобретение относится к запечатанному флакону, содержащему композицию, как определено выше, в контакте с физиологически приемлемым газом.

Предпочтительно указанный газ представляет собой фторсодержащий газ, более предпочтительно гексафторид серы. Согласно другому аспекту изобретение относится к суспензии заполненных газом микровезикул, полученных путем диспергирования указанной лиофилизированной порошковой композиции в присутствии газа в физиологически приемлемой жидкости, предпочтительно в 0,9% масс./об. растворе NaCl.

Согласно следующему аспекту, изобретение относится к способу производства лиофилизированной композиции, содержащей фосфолипид, полиэтиленгликоль и необязательно жирную кислоту, который включает:

- растворение указанного фосфолипида, необязательно указанной жирной кислоты, и указанного полиэтиленгликоля в растворителе;

- замораживание раствора; и

- удаление растворителя посредством лиофилизации;

где указанный полиэтиленгликоль имеет процент складчатых полимерных цепей, составляющий 40% или выше.

Следующий аспект изобретения относится к способу ультразвуковой визуализации, который включает:

- введение эффективного количества суспензии заполненных газом микровезикул, как определено выше, пациенту;

- передачу ультразвукового сигнала в часть тела указанного пациента;

- получение эхографического сигнала от указанной части тела.

Чертежи

- На фиг.1 представлен пример "гладкого" лиофилизированного кека (Ia) и "шероховатого" лиофилизированного кека (Ib)

- На фиг.2 представлен график, иллюстрирующий взаимосвязь между процентом складчатых полимерных цепей и количеством отбракованных флаконов на произведенную партию;

- На фиг.3 представлена иллюстративная термограмма MDSC для второго цикла нагревания образца полиэтиленгликоля.

Подробное описание изобретения

SonoVue® (или Lumason®) составляют в качестве стерильного свободного от пирогенов лиофилизированного порошка, хранящегося во флаконе с перегородкой. Лиофилизированный порошок содержит полиэтиленгликоль 4000 (ПЭГ4000, 24,56 мг), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC, 0,19 мг), дипальмитоилфосфатидилглицерин натрий (DPPG-Na 0,19 мг) и пальмитиновую кислоту (0,04 мг). Свободное пространство каждого флакона заполняют гексафторидом серы (SF6). После восстановления 5 мл стерильного солевого раствора SonoVue/Lumason представляет собой молочно-белую гомогенную суспензию, содержащую микровезикулы (также определяемые как "микросферы" или "микропузырьки"), заполненные гексафторидом серы.

Получение лиофилизированного порошка можно проводить по методике, описанной в цитированной выше патентной заявке WO 94/09829. Как правило, процесс охватывает растворение ПЭГ4000, фосфолипидов и пальмитиновой кислоты в соответствующем соотношении по массе относительно конечного лиофилизированного продукта в подходящем растворителе (например, диоксан, циклогексанол, 2-метил-2-бутанол, тетрахлордифторэтилен или трет-бутанол). Например, раствор может содержат от 22 до 28 частей по массе полиэтиленгликоля, от 0,15 до 0,25 части по массе DSPC, от 0,15 до 0,25 части по массе DPPG-Na и от 0,02 до 0,06 части по массе пальмитиновой кислоты. Затем полученным раствором заполняют стеклянные флаконы, которые быстро замораживают (например, при -45°C), а затем подвергают процессу лиофилизации. Как правило, в промышленном масштабе каждая произведенная партия содержит несколько тысяч флаконов. В конце стадии лиофилизации верхнее пространство флаконов, содержащих лиофилизированный остаток в форме твердого кека, насыщают газом SF6 и флакон запечатывают резиновой пробкой. Полученные таким образом флаконы можно хранить в течение по меньшей мере двух лет.

Однако, как обнаружил заявитель, на качество лиофилизированных кеков во флаконах произведенной партии может негативно влиять использование ПЭГ, имеющего количество складчатых цепей, меньшее заданного предела.

Как упоминалось, например, в Gines et al.², полиэтиленгликоли (ПЭГ) представляют собой полукристаллические гидрофильные полимеры, в твердом состоянии содержащие аморфную и упорядоченную кристаллическую фазы в различных соотношениях в зависимости от их синтеза и термической предыстории. В кристаллических областях полимерные цепи существуют в качестве как вытянутых, так и складчатых цепей, в частности, в ПЭГ с молекулярной массой приблизительно от 4000 до 6000 г/моль. Как наблюдали Gines et al. количество складчатых цепей в ПЭГ4000, как правило, является более высоким, когда расплавленный образец оставляют охлаждаться при комнатной температуре, относительно того же расплавленного образца, который тушат на ледяной бане или посредством погружения в жидкий азот.

Как выявил заявитель, количество складчатых цепей в материале ПЭГ, используемом в качестве стабилизирующего соединения (как правило, ПЭГ4000) в составе для получения заполненных газом микровезикул может существенно варьироваться среди различных коммерческих партий, даже от одного и того же производителя, для материалов, имеющих одну и ту же номинальную молекулярную массу (т.е. 4000 г/моль).

Заявитель неожиданно обнаружил, что, если использовать ПЭГ со слишком низким процентом таких складчатых полимерных цепей, это может иметь негативное влияние на качество лиофилизированных кеков, находящихся во флаконах партии, произведенной с использованием такого ПЭГ. В частности, если процент складчатых полимерных цепей в ПЭГ снижается ниже заданного передела, количество отбракованных флаконов в такой партии (т.е. флаконов с лиофилизированным кеком, не удовлетворяющим заданным характеристикам), станет чрезвычайно высоким.

Среди различных критериев для определения качества лиофилизированного кека, важным является внешний вид кека. В частности, заявитель определил относительно высокую корреляцию между внешним видом кека и качеством суспензии заполненных газом микровезикул при восстановлении такого кека физиологически приемлемой жидкостью. Как обнаружил заявитель, кеки, демонстрирующие относительно гладкую на вид поверхность (см., например, фиг.Ia) обеспечивают, как правило, более высокое количество микровезикул при восстановлении, в то время как кеки, демонстрирующие относительно шероховатую на вид поверхность (см., например, фиг.Ib), обеспечивают значительно более низкое количество микровезикул при восстановлении. Более того, как наблюдал заявитель, кеки с относительно гладкой поверхностью обеспечивают суспензии микровезикул с более высокой MVC (объемная концентрация микропузырьков, т.е. общее количество газа, содержащегося в восстановленных микровезикулах, на мл суспензии). Как правило, вследствие упомянутого выше более низкого качества, суспензии заполненных газом микровезикул, полученных посредством восстановления шероховатых кеков, являются менее эффективными для проведения визуализации посредством CEUS.

В частности, как наблюдал заявитель, когда процент складчатых цепей составляет 34% или менее от общего количества полимерных цепей, количество отбракованных флаконов (с "шероховатыми" кеками), как правило, превышает 16%, как проиллюстрировано на фиг.2. Таким образом, заявитель определил, что для уменьшения количества таких отбракованных флаконов, следует использовать ПЭГ с процентом складчатых цепей выше 34%, предпочтительно выше 35%. Для дальнейшей минимизации уровня отбраковки флаконов процент складчатых цепей в ПЭГ предпочтительно составляет по меньшей мере 40% относительно общего количества полимерных цепей. Более предпочтительно, процент складчатых полимерных цепей составляет более 42% и еще более предпочтительно более 44%, причем особенно предпочтительными являются 48%. В то время как в принципе отсутствует верхний предел для процента складчатых цепей (как правило, ПЭГ с номинальной Mn приблизительно 6000 г/моль могут иметь процент складчатых цепей вплоть до приблизительно 100%), ПЭГ с номинальной Mn приблизительно 4000 (например, вплоть до 4600 г/моль), как правило, имеют процент складчатых цепей ниже 80%, как правило, 75% или ниже. Предпочтительно, процент складчатых цепей составляет приблизительно 70% или ниже, более предпочтительно приблизительно 65% или ниже и еще более предпочтительно 60% или ниже.

Определение процента складчатых цепей

Процент складчатых цепей в полимерном материале можно определять способами, известными в данной области, предпочтительно посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Предпочтительным способом (также использованным в приведенных ниже примерах) является модулированная дифференциальная сканирующая калориметрия (MDSC), проводимая, например, с использованием системы DSC-Q2000 (TA instruments, New Castle, DE USA).

Детали способа MDSC описаны в демонстрационных примерах.

В кратком изложении, образец подвергают циклу нагревания/охлаждения/нагревания при постоянной скорости изменения температуры (например, 2°C/мин) в пределах заданного температурного диапазона (например, от 20°C до 70°C) путем применения амплитуды модулирования температуры (например, на 0,16°C каждые 30 секунд).

Фракция полимерного материала, присутствующая в складчатой форме, может быть охарактеризована в ходе второго цикла нагревания. Действительно, полиэтиленгликоль имеет характерный признак разделения на два пика в ходе цикла нагревания, пик с более низкой температурой плавления, соответствующий плавлению ПЭГ со складчатыми цепями, в то время как пик с более температурой плавления соответствует плавлению ПЭГ с нескладчатыми цепями. На фиг.3 представлена типичная термограмма MDSC для ПЭГ, где указанные первый и второй пики плавления, полученные в ходе указанного второго цикла нагревания, идентифицируют. В частности, пик A на фиг.3 (при приблизительно 57°C) соответствует плавлению ПЭГ со складчатыми цепями, в то время как пик В (при приблизительно 61°C) соответствует плавлению ПЭГ с нескладчатыми цепями. Площадь каждого пика соответствует соответствующим фракциям ПЭГ со складчатыми или нескладчатыми цепями. Таким образом, долю полимерных складчатых цепей, f(складчатые), определяют по следующему уравнению 1:

Уравнение 1

где A_{складчатые} и A_{нескладчатые} соответствуют нормализованным интегралам теплового потока (энтальпия плавления, Джоуль/граммы образца) для складчатых и нескладчатых форм ПЭГ, как вычисляют из площадей под соответствующими пиками второго цикла нагревания термограммы MDSC образца ПЭГ. Таким образом, процент складчатых полимерных цепей в образце полиэтиленгликоля: f(складчатые) × 100.

Как проиллюстрировано в экспериментальной части, в то время как существует определенная корреляция между процентом складчатых цепей и средней молекулярной массой полиэтиленгликоля (как правило, чем выше молекулярная масса полимера, тем выше процент складчатых цепей), такая корреляция не обязательно является прямой. Эти данные указывают на то, что, хотя молекулярная масса играет роль в количестве складчатых цепей, она не обязательно является единственным определяющим фактором, поскольку на количество складчатых цепей также может влиять термическая предыстория полимерного образца (включая, например, параметры процесса производства/охлаждения, условия хранения или длительность хранения образца). Тем не менее, заявитель обнаружил, что полиэтиленгликоль предпочтительно демонстрирует среднюю молекулярную массу (или среднечисловую молекулярную массу, Mn) по меньшей мере 4000 г/моль, более предпочтительно по меньшей мере 4025 г/моль и еще более предпочтительно по меньшей мере 4050 г/моль. Особенно предпочтительным является полиэтиленгликоль с Mn 4075 или выше, например 4100 или выше. В то время как в принципе нет предельной величины Mn в отношении количества складчатых цепей, полимер может иметь молекулярную массу, совместимую с вязкостью конечной суспензии заполненных газом микровезикул. Таким образом, предпочтительной является Mn 6200 г/моль или ниже, более предпочтительно 5000 г/моль или ниже, и еще более предпочтительно 4400 г/моль или ниже.

Молекулярную массу полиэтиленгликоля можно определять в соответствии с общепринятой методологией, предпочтительно посредством титрования количества гидроксилов (OHV), например, в соответствии со стандартом DIN53240. Затем из OHV без труда вычисляют среднюю молекулярную массу ПЭГ (или среднечисловая молекулярная масса, Mn), например, следующим образом: Mn=112'220 /OHV.

Определение внешнего вида кека

Проверку внешнего вида кека можно проводить путем визуального изучения. Предпочтительно визуальное изучение проводят с использованием полуавтоматического устройства для исследования с подходящей системой освещения и зеркал, такой как полуавтоматическое устройство Seidenader M10063. На практике, кек освещают сверху с использованием подходящей системы освещения, в то время как нижнюю часть кека визуализируют по просвечиваемости на нижележащем зеркале. Таким образом, сторону кека, визуализированную на зеркале, проверяет оператор, который определяет приемлемые или бракованные флаконы на основе следующих критериев. Лиофилизированные кеки, прошедшие тест приемлемости, имеют по существу гладкий вид ("гладкие кеки") с однородной поверхностью с множеством подобных кристаллам структур по всему кеку (см. фиг. Ia). С другой стороны, кеки, отбракованные в тесте приемлемости, имеют по существу шероховатый вид ("шероховатые кеки") с появлением трещин и/или более крупных пятен в кеке (см., например, фиг. Ib).

С помощью этого теста приемлемости заявитель определил, что количество отбракованных флаконов в произведенной партии обратно пропорционально проценту складчатых цепей в полиэтиленгликоле, используемом для получения различных партий, как подробно проиллюстрировано в примерах ниже.

При тестировании после восстановления солевым раствором, гладкие кеки, главным образом, приводили к более высокому количеству микропузырьков в суспензии, а также к более высокому объему газа, содержащегося в микропузырьках.

Восстановленную суспензию можно использовать для введения пациенту в общепринятых процедурах CEUS, где на пациента или его часть воздействию ультразвуковым излучением, и получают и анализируют эхографический сигнал.

Приведенные ниже примеры помогут далее проиллюстрировать изобретение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Определение процента складчатых цепей посредством MDSC

a. Оборудование и калибровка системы

Все эксперименты MDSC проводили на системе DSC-Q2000 (TA Instruments, New Castle, DE USA), оборудованной технологией Tzero™ (позволяющей прямое измерение теплоемкости) и с опцией Modulated®, которая позволяет наложение синусоидального колебания температуры на традиционное линейное изменение.

Использовали охлаждающее оборудование с замораживанием (RCS90) с системой двухстадийного охлаждения для удобной работы в диапазоне температур от -90°C до 550°C.

Получение и обработку данных проводили с помощью пакета программ Universal Analysis Software.

Алюминиевые тигли Tzero (ref 901683.901) и алюминиевую крышку Tzero (ref 901671.901), все от TA instruments, использовали для содержания образца, подлежащего измерению и для запечатывания тиглей посредством пресса Tzero (ref 901600.901).

Калибровку системы DSC, включая температуру и тепловой поток, проводили с использованием металлического индия. На практике, кусок индия приблизительно 5 мг взвешивали, спрессовывали до плоского состояния и переносили в тигель Tzero, запечатанный крышкой Tzero посредством пресса Tzero. Программу сканирования калибровки запускали между 100°C и 180°C при постоянной скорости температуры 10°C/мин. Характеристики индия были следующими: энтальпия плавления и температура начала плавления должны составлять 28,71 Дж/г ± 0,5 Дж/г и 156,6°C ± 0,25°C, соответственно.

b. Получение образцов и измерение посредством MDSC

Четыре различных партии ПЭГ4000 охарактеризовывали по следующей методике.

Хлопья ПЭГ4000 каждого образца дробили на мелкие части посредством пестика, и образец массой 5 мг ± 0,1 мг взвешивали с использованием микровесов XP26 (Mettler Toledo) в тиглях Tzero, которые затем запечатывали крышкой Tzero посредством пресса Tzero. Аналогичным образом получали пустой тигель Tzero сходной массы с тиглем с пустым образом и использовали в качестве эталона.

Измерение посредством MDSC проводили на каждом тигле, содержавшем образец ПЭГ4000, путем применения цикла нагревания/охлаждения/нагревания при постоянной скорости изменения температуры 2°C/мин на протяжении диапазона температур от 20°C до 70°C, как описано в таблице 1 ниже. Использовали сигнал модулирования только с нагреванием (амплитуда модулирования температуры 0,16°C с периодом модулирования температуры каждые 30 секунд). В качестве продувающего газа использовали азот со скоростью потока 50 мл/мин.

Таблица 1: Цикла нагревания/охлаждения/нагревания MDSC

Стадия №	Описание
1	Уравновесить при 20,00°C
2	Модулирование ± 0,16°C каждые 30 с
3	Изометрическая в течение 5,00 мин
4	Нагревание 2,00°C/мин до 70,00°C
5	Отметка о конце цикла 1
6	Изотермическая в течение 5,00 мин
7	Нагревание 2,00°C/мин до 20,00°C
8	Отметка о конце цикла 2
9	Изотермическая в течение 5,00 мин
10	Нагревание 2,00°C/мин до 70,00°C
11	Отметка о конце цикла 3
12	Конец способа

Следующие параметры определяли на термограмме MDSC с использованием программного обеспечения Universal Analysis software:

- Температура на пике и энтальпия плавления в ходе первого цикла нагревания;

- Температура на пике и энтальпия кристаллизации в ходе первого цикла охлаждения;

- Температура на пике и энтальпия плавления складчатых и вытянутых цепей в ходе второго цикла нагревания.

Процент полимерного материала, присутствующего в складчатой форме, охарактеризовывали в ходе второго цикла нагревания и вычисляли согласно уравнению 1. Для каждой партии ПЭГ4000 методику повторяли на трех различных образцах. Детали и результаты измерения приведены в следующих таблицах 2-5.

Таблица 2: Основные характеристики MDSC для партии 1 ПЭГ4000 (сравнительные)

	1-й раунд нагревания, пик плавления		1-й раунд охлаждения, пик кристаллизации		Второй раунд нагревания, пики плавления 1 и 2
	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Пик 1, % складчатых цепей
Партия 1a Партия 1b Партия 1c	60,53 60,63 60,58	205,4 199,1 206,3	43,97 43,23 43,83	196 219,4 204,2	56,71 56,89 56,89	73,52 70,33 75,26	60,87 60,97 60,91	145,1 139,5 142	34 34 35
Средний % складчатых цепей: 34%

Таблица 3: Основные характеристики MDSC для партии 2 ПЭГ4000

	1-й раунд нагревания, пик плавления		1-й раунд охлаждения, пик кристаллизации		Второй раунд нагревания, пики плавления 1 и 2
	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Пик 1, % складчатых цепей
Партия 2a Партия 2b Партия 2c	60,78 60,77 60,68	197 197,7 202,1	44,88 44,8 43,43	188,3 187,8 191,7	57,27 57,31 57,26	91,04 89,07 91,83	61,12 61,19 61,12	117,3 118,6 123,5	44 43 43
Средний % складчатых цепей: 43%

Таблица 4: Основные характеристики MDSC для партии 3 ПЭГ4000

	1-й раунд нагревания, пик плавления		1-й раунд охлаждения, пик кристаллизации		Второй раунд нагревания, пики плавления 1 и 2
	Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г		Температура °C	Тепловой поток Дж/г	Температура °C	Тепловой поток Дж/г
Партия 3a Партия 3b Партия 3c	60,89 60,93 60,89	204,7 197,3 204,8	46,37 46,27 46,24	207,2 194,5 198,1	57,34 57,35 57,33	107,8 101,3 104,6	61,18 61,2 61,17	109,2 105,5 112,7	50 49 48
Средний % складчатых цепей: 49%

Таблица 5: Основные характеристики MDSC для партии 4 ПЭГ4000

	1-й раунд нагревания, пик плавления Темпе-ратура °C		1-й раунд охлаждения, пик кристаллизации		Второй раунд нагревания, пики плавления 1 и 2 Тепловой поток Дж/г
			Тепловой поток Дж/г	Температура °C
	1-й раунд нагревания, пик плавления	1-й раунд охлаждения, пик кристаллизации	Второй раунд нагревания, пики плавления 1 и 2			1-й раунд нагревания, пик плавления	1-й раунд охлаждения, пик кристаллизации	Второй раунд нагревания, пики плавления 1 и 2
Партия 4a	60,97	201,6	48,99	330,2	57,69	112	61,18	97,34	54
Партия 4b	60,9	197,5	49,04	329,1	57,76	113,9	61,14	94,79	55
Партия 4c	60,9	200,8	49,1	356	57,76	114,6	61,13	96,62	54
Средний % складчатых цепей: 54%

Результаты измерения MDSC для соответствующих партий ПЭГ обобщенно представлены в приведенной ниже таблице 6 вместе с соответствующей среднечисленной молекулярной массой (Mn), предоставленной поставщиком.

Таблица 6: ПЭГ4000% для складчатых цепей и средняя Mn

ПЭГ4000, партия №	% складчатых цепей	Mn (г/моль)
Партия 1 (сравнительная) партия 2 Партия 3 Партия 4	34	3997
	43	4107
	49	4159
	54	4154

Результаты, показанные в таблицах 2-6, показывают, что партия 1 (с только 34% складчатых полимерных цепей), не удовлетворяет требованиям согласно изобретению, в то время как другие три партии ПЭГ4000 удовлетворяют таким требованиям. Более того, также можно наблюдать, что партия №1 имеет Mn ниже 4000, в то время как другие партии имеют Mn выше 4000 г/моль, в частности, по меньшей мере 4050 г/моль.

Пример 2

Получение лиофилизированных кеков

Методика получения лиофилизированных кеков по существу соответствует методике, проиллюстрированной в демонстрационных примерах WO 94/09829. В кратком изложении, DSPC, DPPG-Na и PA в соотношении по массе 4,75/4,75/1 сначала растворяют в гексане/этаноле (8/2, об./об.) в концентрации приблизительно 5 г/л и растворители выпаривают в вакууме. Остаток смешивают с ПЭГ4000 в соотношении по массе приблизительно 0,017:1, смесь растворяют в трет-бутаноле при приблизительно 60°C и прозрачный раствор используют для заполнения соответствующих флаконов DIN8R (с соответствующим объемом, содержащим приблизительно 25 мг смеси). Затем флаконы быстро охлаждают при -45°C, а затем подвергают конечной стадии лиофилизации. В конце лиофилизации среду лиофилизатора насыщают SF6 при атмосферном давлении и флаконы (содержащие твердый лиофилизированный кек в контакте с SF6) запечатывают резиновой пробкой.

Описанную выше методику производства выполняли с использованием каждой из четырех партий ПЭГ4000 (партии 1-4), охарактеризованных в примере 1, таким образом, получая четыре партии по несколько тысяч флаконов в каждой (партии 1-4, соответственно), причем каждый флакон содержал 25 мг лиофилизированного твердого материала в форме кека на дне флакона.

Пример 3

Проверка флаконов/кеков

Партии, полученные способом получения, проиллюстрированным в примере 2, проверяли в отношении присутствия неприемлемых лиофилизированных кеков по следующей методике.

Флаконы каждой партии исследовали и классифицировали либо как "приемлемые флаконы", т.е. содержащие гладкий кек (SCV, например, как на фиг.1a), либо как "отбракованные флаконы", т.е. содержащие шероховатый кек (RCV, например, как на фиг.1b), с использованием полуавтоматического устройства M10063 по методике, описанной выше.

Результаты проверки, проведенной согласно описанной выше методике, проиллюстрированы в таблице 7 ниже и представлены на фиг.2.

Таблица 7: Количество отбракованных флаконов против % складчатых цепей в ПЭГ4000

Произведенная партия №	% отбракованных флаконов	% складчатых цепей в ПЭГ4000
Партия 1 (сравнительная)	16	34
Партия 2	8,9	43
Партия 3	5,6	49
Партия 4	3,7	54

Как видно из результатов, проиллюстрированных в таблице 7, процент отбракованных флаконов в произведенной партии №1 (где ПЭГ4000 композиции имеет только 34% складчатых цепей) является более высоким относительно уровня отбраковки в других партиях, произведенных с ПЭГ4000, имеющим более высокий процент складчатых цепей, согласно изобретению.

Пример 4

Суспензия заполненных газом микровезикул из восстановленных флаконов

Проводили взятие образцов из каждой группы "приемлемых флаконов" и "отбракованных флаконов" (как определено в примере 3 выше) для охарактеризации микропузырьков, полученных путем восстановления кеков, содержащихся в указанных флаконах.

Для измерения различных параметров суспензии заполненных газом микровезикул, таких как MVC (объемная концентрация микровезикул) и общее количество микровезикул в суспензии, использовали Coulter Counter Multisizer 3, оборудованный трубкой с отверстием 30 мкм. В кратком изложении 50 мкл суспензии микропузырьков разбавляли в 100 мл 0,9% раствора NaCI с использованием аналитического объема 100 мкл.

Результаты измерений (средние значения для каждой группы флаконов) представлены в таблице 8 ниже.

Таблица 8: Характеристики заполненных газом микровезикул, полученных из гладких или шероховатых кеков

Тип флаконов	MVC гл/мл	Концентрация микровезикул (частицы/мл)
Приемлемые (гладкие кеки)	6,4	4,38×108
Отбракованные (шероховатые кеки)	3,2	3,87×108

Как видно из результатов, проиллюстрированных в таблице 8, микровезикулы, полученные путем восстановления гладких кеков, демонстрируют более высокий объем общего газа, заключенного в микровезикулы (в частности, в два раза), а также большее количество микровезикул в суспензии (в частности, 0,5×10⁸).

Цитированные документы

¹Международная патентная заявка WO 94/09829 (Bracco International)

² Gines et al., "Thermal Characterization Of Polyethylene Glycols Applied in the Pharmaceutical Technology Using Different Scanning Calorimetry and Hot Stage Microscopy", Journal of Thermal Analysis, Vol. 46 (1996) 291-304.

Claims (19)

1. Лиофилизированная порошковая композиция для получения заполненных газом микровезикул, причем указанная композиция содержит фосфолипид и полиэтиленгликоль, где указанный полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ4000, имеющий среднечисленную молекулярную массу (Mn) по меньшей мере 4000 г/моль, и имеет процент складчатых полимерных цепей выше 35%.

2. Композиция по п.1, где указанный процент складчатых цепей составляет по меньшей мере 40%.

3. Композиция по п.1, где указанный процент складчатых цепей составляет по меньшей мере 42%.

4. Композиция по п.1, где указанная Mn составляет по меньшей мере 4025 г/моль.

5. Композиция по любому из пп.1-4, где указанный фосфолипид представляет собой DSPC, DPPG-Na или их смесь.

6. Композиция по любому из пп.1-5, где указанная композиция дополнительно содержит жирную кислоту.

7. Композиция по п.6, где указанная жирная кислота представляет собой пальмитиновую кислоту.

8. Композиция по п.7, содержащая от 22 до 28 частей по массе ПЭГ4000, от 0,15 до 0,25 частей по массе DSPC, от 0,15 до 0,25 частей по массе DPPG-Na и от 0,02 до 0,06 частей по массе пальмитиновой кислоты.

9. Композиция по п.8, содержащая 24,56 мг ПЭГ4000, 0,19 мг DSPC, 0,19 мг DPPG-Na и 0,04 мг пальмитиновой кислоты.

10. Запечатанный флакон, содержащий лиофилизированную порошковую композицию по любому из пп.1-9 в контакте с физиологически приемлемым газом.

11. Запечатанный флакон по п.10, где указанный газ представляет собой фторсодержащий газ.

12. Суспензия заполненных газом микровезикул, полученная путем диспергирования лиофилизированной порошковой композиции по любому из пп.1-9, в присутствии газа в физиологически приемлемой жидкости.

13. Способ производства лиофилизированной композиции, содержащей фосфолипид и полиэтиленгликоль, который включает:

a. растворение указанного фосфолипида и указанного полиэтиленгликоля в растворителе, тем самым получая раствор;

b. замораживание раствора; и

c. удаление растворителя посредством лиофилизации;

где указанный полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ4000, имеющий среднечисленную молекулярную массу (Mn) по меньшей мере 4000, и имеет процент складчатых полимерных цепей выше 35%.

14. Способ по п.13, где указанная композиция дополнительно содержит жирную кислоту и указанная стадия a дополнительно включает растворение указанной жирной кислоты в указанном растворителе.

15. Лиофилизированная композиция, полученная способом по п. 13 или 14.

Images